WO2017132909A1 - 从血液样本中分离靶细胞的方法及其用途 - Google Patents

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blood sample
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朱珠
刘萍
顾颖
康雄斌
夏军
邱咏
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深圳华大基因研究院
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1093—General methods of preparing gene libraries, not provided for in other subgroups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles

Definitions

  • the present invention relates to the field of biotechnology, and in particular, to a method of isolating target cells from a blood sample and uses thereof.
  • the inventors have carefully studied and found that the main reasons for the current isolation method to obtain fetal cells with complete genome are: 1. lack of specific antibodies, resulting in low accuracy and purity of target cells; The fragility of the cells themselves makes it possible to damage the target cells in the separation operation even if a plurality of separation methods are combined to obtain high-purity target cells, so that the finally obtained target cells cannot contain the complete genome. Moreover, the more the separation step, the higher the probability of damage, and the difficulty in obtaining target cells having a complete genome is further increased. At present, there are no research reports indicating that high-resolution sequencing data of fetal cells isolated from maternal blood has been obtained.
  • the invention proposes a method of isolating target cells from a blood sample.
  • the target cell is in the form of a single cell, the method comprising: (1) subjecting the blood sample to immunomagnetic bead sorting to obtain a first sorting product containing the target cell; Performing flow cytometric sorting of the first sorted product to obtain a second sorting product containing the target cells; and (3) separating the second sorting product by an oral pipette method to obtain The target cells in a single cell form.
  • target cells having a complete genome can be efficiently isolated from a blood sample, and the obtained target cells are in a single cell form.
  • the inventors have unexpectedly discovered that the single cells obtained by the present invention are suitable for whole genome amplification, and the amplification products can be effectively used for database construction and sequencing, thereby enabling accurate and efficient acquisition of single-cell whole genome sequences.
  • the target cell is a fetal cell.
  • the step (3) comprises: tiling the second sorting product on the surface of the slide, and picking up a coupling dye having a complete cell morphology under the bright field and a surface antigen selected according to the staining To determine the single cells that meet the conditions under the fluorescence field.
  • the immunomagnetic bead sorting unit is configured to perform the immunomagnetic bead sorting by the following steps:
  • the flow cytometric sorting unit is configured to perform the flow cytometric sorting by the following steps:
  • the amplification is carried out in an amplification system comprising 10 ⁇ Phi29 buffer, water, 1.8-2.2 ⁇ 10 -8 mol dNTP, total primer concentration of 1.8-2.2 ⁇ 10 -11 mol N8 primers, 4.5-5.5 ⁇ 10 ⁇ 3 mg BSA, 0.0045-0.0055 ⁇ L Pluronic F68 and 9-11 U Phi29 DNA polymerase, wherein the N8 primers are random primers composed of 8 deoxyribonucleotides , A, G, C, and T are randomly arranged.
  • the cell denaturing lysate is composed of a solute and a solvent; the solvent is water; the solute and its concentration are as follows: 0.09-0.11 mM KOH, 0.9-1.1 mM EDTA, and 0.09-0.11 M DTT;
  • the neutralization buffer consists of a solute and a solvent; the solvent is water; the solute and its concentration are as follows: 54-66 mM KH 2 PO 4 and 4.5-5.5 mM K 2 HPO 4 ;
  • the neutralization buffer consists of a solute and a solvent; the solvent is water; the solute and its concentration are specifically as follows: 60 mM KH 2 PO 4 and 5 mM K 2 HPO 4 .
  • the inventors have found that the method can effectively determine the cell type of the target cell in the blood sample, and the result is accurate, reliable, and reproducible, and can be effectively used for detecting and analyzing the fetal whole genome in the peripheral blood of the pregnant woman.
  • the inventors have found that the system can effectively determine the cell types of target cells in blood samples, and the results are accurate, reliable, and reproducible, and can be effectively used for detecting and analyzing fetal whole genome in peripheral blood of pregnant women.
  • the invention provides a method of constructing a sequencing library of target cells in a blood sample.
  • the method comprises: performing genomic amplification of target cells in a blood sample according to the method of genomic amplification of target cells in a blood sample as described above to obtain a genomic amplification product;
  • the genomic amplification product is constructed to construct a sequencing library.
  • the invention provides a method of sequencing a whole genome of a target cell in a blood sample.
  • the method comprises: constructing a sequencing library according to the method of constructing a sequencing library for target cells in a blood sample as described above; and sequencing the sequencing library.
  • the method can effectively perform genome-wide sequencing of target cells with complete genomes isolated from blood samples, so as to obtain the whole genome information of the target cells (single cells), which can be determined based on the sequence information of the target cells.
  • the invention provides a method of determining whole genome sequence information of a target cell in a blood sample.
  • the method comprises: sequencing the target cells according to a method for sequencing a whole genome of a target cell in a blood sample as described above to obtain a sequencing result; and determining the site based on the sequencing result Sequence information of the whole genome of the target cell.
  • the method can effectively separate the target cells with complete genome from the blood sample, and realize the determination of the whole genome sequence information of the target cells, thereby determining the state of the fetus based on the sequence information of the whole genome of the target cells, for example: gender , kinship, chromosomal abnormalities, single nucleotide polymorphisms, microdeletions, microduplication, etc., can be effectively applied to the detection and analysis of fetal whole genome in the peripheral blood of pregnant women.
  • the method further comprises determining a state of the fetus based on sequence information of the whole genome of the target cell.
  • the invention has at least one of the following advantages:
  • the invention combines the advantages of fast and effective magnetic bead sorting and high purity of flow cytometry, and finally separates individual fetal cells through a mouth pipette.
  • prenatal diagnosis combined with single cell amplification technology, high-throughput sequencing technology and information analysis methods, the genetic variation of the fetus is effectively detected.
  • the present invention uses a non-invasive method to separate fetal cells, completely avoiding the adverse effects caused by invasive methods such as the extraction of amniotic fluid from pregnant women, such as causing abortion in pregnant women.
  • first and second are used for descriptive purposes only and are not to be construed as indicating or implying a relative importance or implicitly indicating the number of technical features indicated. Thus, features defining “first” and “second” may include one or more of the features either explicitly or implicitly. In the description of the present invention, the meaning of "a plurality" is two or more unless specifically and specifically defined otherwise.
  • the magnetic bead sorting system (Mexico) was assembled, CD45-negative efflux cells were collected, and the supernatant was centrifuged to resuspend the cell pellet in PBS containing 2% FBS. Add CD45 and incubate for 15 min at 4 degrees and then wash once by centrifugation. The cells were resuspended in PBS containing 2% FBS, and 50 ⁇ l of 1 mg/mL PI and Hoechst 33342 staining solution were added and stained for 30 min at room temperature in the dark.
  • the stained cells were sieved and transferred to a flow cytometer sample tube, and Hoechst-positive, PI-negative, and CD45-negative cells were sorted by flow cytometry into a PCR tube previously added to 1% BSA PBS.
  • the cell suspension in the PCR tube is plated on the surface of the slide, and the intact cell morphology is selected under the bright field, and the conditions under the fluorescence field are met (the coupling dye according to the surface antigen selected by the staining is used to determine the conditions under the fluorescence field)
  • nucleated single cells stained with PI and Hoechst 33342 and cells with "purple" under fluorescence field were used to 96-well plates, and 4 ⁇ l of PBS was added per well according to the experimental requirements.
  • a base liquid As a base liquid, after completion of the selection, centrifugation, sealing of the membrane is carried out, and a single cell amplification reaction is prepared.
  • 114 cells were picked from a common mouth pipette in a 10 mL blood sample.
  • the kit consists of a cell denaturing lysate, a neutralization buffer, and an amplification system.
  • Cell denaturing lysate consists of a solute and a solvent; the solvent is water; the solute and its concentration are as follows: 0.1 mM KOH, 1 mM EDTA, and 0.1 M DTT.
  • Neutralization buffer consists of a solute and a solvent; the solvent is water; the solute and its concentration are as follows: 60 mM KH 2 PO 4 and 5 mM K 2 HPO 4 .
  • the amplification system includes: 10 ⁇ Phi29 buffer, water, 1.8-2.2 ⁇ 10 -8 mol dNTP, total primer concentration of 1.8-2.2 ⁇ 10 -11 mol N8 primers, 4.5-5.5 ⁇ 10 -3 mg BSA, 0.0045-0.0055 ⁇ L Pluronic F68 and 9-11U Phi29 DNA polymerase.
  • 40.3 ⁇ L is used as an example, and the amplification system is: 30 ⁇ L of H 2 O, 5 ⁇ L of 10 ⁇ Phi29 buffer, 2 ⁇ L of dNTP solution, 2 ⁇ L of N8 primers solution, 0.25 ⁇ L of 20 mg/mL of BSA aqueous solution, and 0.05 ⁇ L of 10% Pluronic F68 solution.
  • Composition with 1 ⁇ L of Phi29 DNA polymerase solution is formulated with 40.3 ⁇ L.
  • N8 primers solution (N8 primers are random primers consisting of 8 deoxyribonucleotides, AGCT randomly arranged): The total concentration of primers in the N8 primers solution is 10 ⁇ M.
  • Phi29 DNA polymerase solution (Phi29 DNA polymerase concentration in Phi29 DNA polymerase solution is 10 U/ ⁇ L): Complete Genomics, article number RM00024.
  • Example 1 One single cell obtained in Example 1 was added to 3.7 ⁇ L of PBS buffer (pH 7.5, 0.1 M in PBS buffer) and 3 ⁇ L of the cell denaturing lysate in the kit prepared in the first step (the purpose was to make the cells The genomic DNA was lysed and released, and allowed to stand at 65 ° C for 10 minutes, then add 3 ⁇ L of the neutralization buffer in the kit prepared in the first step (the purpose is to terminate the cell lysis and restore the system to a neutral environment) , 9.7 ⁇ L of template solution was obtained.
  • PBS buffer pH 7.5, 0.1 M in PBS buffer
  • step 2 Take the 9.7 ⁇ L template solution obtained in step 1 (DNA content is about 6 pg), add the amplification system in the kit prepared in step 1, and let stand at 30 ° C for 3 h, then let stand at 65 ° C for 5 minutes to obtain amplification products. .
  • the amplified product can be used directly for downstream analysis or stored at -20 °C.
  • the inventors have found that the single-cell WGA product obtained by the amplification method of the present embodiment has high coverage and good amplification uniformity on the whole genome, and can be used for genes based on STR typing analysis. Identification and analysis of chromosome-based copy number variation in the genome, as well as detection and analysis of fetal whole genome in maternal peripheral blood.
  • the 114 single cell amplification products obtained by the above amplification were used. Trio DNA Quantification Kit (Applied Biosystems TM ) Q-PCR for detection.
  • the instrument uses a ViiA 7 real-time PCR instrument, and the reaction conditions for amplification are referred to the protocol provided by the kit.
  • 4 cells of the amplification product had a distinct Y amplification signal.
  • the inventors further used the ampFLSTR Identifier PCR amplification kits for the four single-cell amplification products and the parent's genome.
  • the Yfiler amplification kit performs STR detection. The results are shown in Table 1:
  • P(G/GC) The prior probability of G occurs at a certain GC content.
  • P(G) The full probability formula is the sum of the probabilities of all possible occurrences of G.
  • Paternity test select the homozygous but different SNP loci of the parents.
  • the fetus is heterozygous and bears the genotype B of the father, and the probability that the genotype B appears in the fetus. Then use the same method to analyze the data of 90 yellow people.
  • a Z-value test is performed on the ratio of the ratio obtained by the biological father to the ratio of the other 90 non-parent samples.
  • the ratio of the father's base found in the fetus is 0.516, and the Z value is 6.32.
  • the father's value can be significantly distinguished from the non-parent value, which proves that CFCCYY-F2 cells are fetal cells.

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Abstract

提供了从血液样本中获得靶细胞的方法及其用途。该方法包括：（1）将血液样本进行免疫磁珠分选，以便获得含有该靶细胞的第一分选产物；（2）将该第一分选产物进行流式细胞分选，以便获得含有该靶细胞的第二分选产物；以及（3）采用口吸管法分离该第二分选产物，以便获得呈单细胞形式的该靶细胞。

Description

从血液样本中分离靶细胞的方法及其用途
优先权信息
无。
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及从血液样本中分离靶细胞的方法及其用途。
背景技术
近年来，随着高通量测序技术的发展，利用高通量测序方法通过对孕妇外周血中胎儿游离DNA的检测来判断胎儿染色体数目的异常已经越来越得到广泛地认可。但是利用胎儿游离DNA有其自身的缺陷，首先母血中除了胎儿来源的游离DNA，还有存在大量母源DNA；同时，母血中胎儿游离DNA是片段化的，以不完整的基因组存在的，所以目前主要是针对于染色体数目异常的检测，对于特定基因位点的检测存在较大的困难。
因而，目前针对孕妇外周血中胎儿DNA检测的研究仍有待加强。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一或至少提供一种有用的商业选择。为此，本发明的一个目的在于提出一种能有效地从血液样本中分离具有完整基因组的靶细胞的手段，以用于孕妇外周血中胎儿全基因组的检测与分析。
需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
虽然目前已有文章和专利报道成功从母亲外周血中分离出胎儿细胞，但是此类分离出来的胎儿细胞在产前诊断的应用方面，主要是通过PCR和FISH等方法对胎儿性别进行鉴定，或者进行染色体数目异常的诊断，如21三体、13三体、18三体等。而此类分离出的胎儿细胞由于其具有的基因组并不完整，无法用于特定基因位点的检测(例如单基因疾病的检测)。
发明人经过仔细研究发现，目前的分离方法无法获得具有完整基因组的胎儿细胞的主要原因在于：1.缺乏特异性较高的抗体，导致靶细胞获取的准确度和纯度不高；2.由于胎儿细胞自身的脆弱性，使得即使组合多种分离方法得到高纯度的靶细胞，但在分离操作中对靶细胞产生的损伤使得最终获得的靶细胞无法含有完整的基因组。并且，分离步骤越多，损伤的概率越高，进而造成获得具有完整基因组的靶细胞的难度进一步加大。而目前的确尚无研究报道表明已获得高深度的从母血中分离出胎儿细胞的全基因组测序数据。
进而，发明人通过一系列研究，意外发现了一种能有效地从血液样本中分离出具有完整基因组的靶细胞的手段，进而可以有效地应用于孕妇外周血中胎儿全基因组的检测与分析。
因而，在本发明的第一方面，本发明提出了一种从血液样本中分离靶细胞的方法。根据本发明的实施例，所述靶细胞呈单细胞形式，所述方法包括：(1)将血液样本进行免疫磁珠分选，以便获得含有所述靶细胞的第一分选产物；(2)将所述第一分选产物进行流式细胞分选，以便获得含有所述靶细胞的第二分选产物；以及(3)采用口吸管法分离所述第二分选产物，以便获得呈单细胞形式的所述靶细胞。
利用该方法能够有效地从血液样本中分离获得具有完整基因组的靶细胞，并且所得到的靶细胞是单细胞形式的。另外，发明人意外地发现，通过本发明所得到的单细胞适于进行全基因组扩增，且扩增产物能够有效用于建库和测序，进而能够准确有效地获得单细胞的全基因组的序列信息(例如通过构建测序文库和全基因组测序)，进一步基于获得的靶细胞全基因组的序列信息，能够准确地确定所述胎儿的状态，例如：性别、亲缘关系、染色体异常、单核苷酸多态性、微缺失、微重复等，也即本发明所得到的单细胞能够有效地应用于孕妇外周血中胎儿全基因组的检测与分析。
其中，需要说明的是，本文中所使用的表达方式“具有完整基因组的靶细胞”中所述的“完整基因组”是相对的完整，不是绝对的，具体地，在本技术领域，分离的靶细胞用于全基因组扩增与高深度测序后，可获得高质量的全基因组测序数据，进而能够用于高深度测序分析，并最终有效用于特定基因位点的检测，则认为该细胞具有完整基因组。
根据本发明的实施例，所述血液样本来自于孕妇。
根据本发明的实施例，所述靶细胞为胎儿细胞。
根据本发明的实施例，在步骤(1)之前，进一步包括：除去所述血液样本中的红细胞。
根据本发明的一些实施例，在存在抗凝血剂的条件下，使所述血液样本与红细胞裂解液接触，以便除去所述血液样本中的所述红细胞。
根据本发明的实施例，所述抗凝血剂为选自肝素、乙二胺四乙酸、枸橼酸盐、草酸盐和ACD抗凝剂的至少一种。
根据本发明的一些具体示例，通过以下步骤除去所述血液样本中的所述红细胞：
将所述血液样本加入预先稀释的BD裂红液中，进行反应至血液透亮后离心，弃上清；然后使用含FBS的缓冲液反复清洗细胞沉淀以充分去除残留的BD裂红液。所述反复清洗是指清洗次数为两次以上，可以是两次、三次、四次、五次、六次或更多次。
根据本发明的实施例，所述免疫磁珠分选采用携带抗体的磁珠；优选地，所述抗体为靶细胞非特异性的阴性抗体。
根据本发明的实施例，所述抗体针对选自CD45、CD14、CD56、CD19和CD20的至少一种。
根据本发明的实施例，步骤(1)包括：
将血液样本与携带抗体的磁珠混合后，依次进行孵育离心，然后弃上清，将沉淀重悬；润洗分选柱，待流空后，将待分选的细胞上柱，待细胞液流出后，润洗两次分选柱，并收集全部流出液，然后离心、去上清，并将将细胞沉淀进行重悬，以便获得所述第一分选产物。
根据本发明的实施例，步骤(2)包括：使用抗体对所述第一分选产物进行表面抗原染色，所述表面抗原包括选自CD45、CD14、CD56、CD19和CD20的至少一种。
根据本发明的一些具体示例，步骤(2)包括：
按1:50的抗体比例，对所述第一分选产物表面抗原染色，所述表面抗原包括选自CD45、CD14、CD56、CD19和CD20的至少一种，然后依次进行孵育、离心、洗涤，并将得到的细胞进行重悬，然后加入PI和Hoechst 33342染色液，室温下避光染色；将经过染色的细胞转移至流式细胞仪的上样管中，并将细胞悬液进行稀释，然后利用流式细胞仪分选出Hoechst阳性，PI阴性，CD45阴性的细胞，以便获得所述第二分选产物。
根据本发明的实施例，步骤(3)包括：将所述第二分选产物平铺于载玻片表面，挑取明场下有完整细胞形貌以及依据染色所选择的表面抗原的耦合染料来确定荧光场下符合条件的单细胞。
根据本发明的一些具体示例，步骤(3)包括：
将所述第二分选产物平铺于载玻片表面，挑取明场下有完整细胞形貌及荧光场下符合条件的有核单细胞至孔板，在孔板的每孔中添加底液，挑选完成后，离心，以便获得所述靶细胞。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种用于从血液样本中分离靶细胞的装置。根据本发明的实施例，所述靶细胞呈单细胞形式，所述装置包括：免疫磁珠分选单元，所述免疫磁珠分选单元用于将血液样本进行免疫磁珠分选，以便获得含有所述靶细胞的第一分选产物；流式细胞分选单元，所述流式细胞分选单元与所述免疫磁珠分选单元相连，用于将所述第一分选产物进行流式细胞分选，以便获得含有所述靶细胞的第二分选产物；以及口吸管法分离单元，所述口吸管法分离单元与所述流式细胞分选单元相连，用于将所述第二分选产物进行口吸管法分离，以便获得呈单细胞形式的所述靶细胞。
利用该装置能够有效地实施前面所述的方法，从而能够有效地从血液样本中分离出具有完整基因组的靶细胞，并且所得到的靶细胞是单细胞形式的，尤其适于进行全基因组扩增，且扩增产物能够有效地用于建库和测序，进而能够准确有效地获得单细胞的全基因组的序列信息(例如通过构建测序文库和全基因组测序)，进一步基于获 得的靶细胞全基因组的序列信息，能够准确地确定所述胎儿的状态，例如：性别、亲缘关系、染色体异常、单核苷酸多态性、微缺失、微重复等，也即本发明所得到的单细胞能够有效地应用于孕妇外周血中胎儿全基因组的检测与分析。
根据本发明的一个实施例，所述血液样本来自于孕妇。
根据本发明的一个实施例，所述靶细胞为胎儿细胞。
根据本发明的一个实施例，进一步包括：红细胞去除单元，所述红细胞去除单元用于除去所述血液样本中的红细胞。
根据本发明的一个具体示例，所述红细胞去除单元被配置为通过下列步骤除去所述血液样本中的所述红细胞：
在存在抗凝血剂的条件下，使所述血液样本与红细胞裂解液接触，以便除去所述血液样本中的所述红细胞。
根据本发明的一个实施例，所述抗凝血剂为选自肝素、乙二胺四乙酸、枸橼酸盐、草酸盐和ACD抗凝剂的至少一种。
根据本发明的一个具体示例，所述红细胞去除单元被配置为通过下列步骤除去所述血液样本中的所述红细胞：
将所述血液样本加入预先稀释的BD裂红液中，进行反应至血液透亮后离心，弃上清；然后使用含FBS的缓冲液反复清洗细胞沉淀以充分去除残留的BD裂红液。所述反复清洗是指清洗次数为两次以上，可以是两次、三次、四次、五次、六次或更多次。
根据本发明的一个实施例，所述免疫磁珠分选单元采用携带抗体的磁珠；优选地，所述抗体为靶细胞非特异性的阴性抗体。
根据本发明的一个实施例，所述抗体针对选自CD45、CD14、CD56、CD19和CD20的至少一种。
根据本发明的一个实施例，所述免疫磁珠分选单元被配置为通过下列步骤进行所述免疫磁珠分选：
将血液样本与携带抗体的磁珠混合后，依次进行孵育离心，然后弃上清，将沉淀重悬；润洗分选柱，待流空后，将待分选的细胞上柱，待细胞液流出后，润洗两次分选柱，并收集全部流出液，然后离心、去上清，并将将细胞沉淀进行重悬，以便获得所述第一分选产物。
根据本发明的一个实施例，所述流式细胞分选单元被配置为通过下列步骤进行所述流式细胞分选：使用抗体对所述第一分选产物进行表面抗原染色，所述表面抗原包括选自CD45、CD14、CD56、CD19和CD20的至少一种。
根据本发明的一个具体示例，所述流式细胞分选单元被配置为通过下列步骤进行所述流式细胞分选：
按1:50的抗体比例，对所述第一分选产物表面抗原染色，所述表面抗原包括选自 CD45、CD14、CD56、CD19和CD20的至少一种，然后依次进行孵育、离心、洗涤，并将得到的细胞进行重悬，然后加入PI和Hoechst 33342染色液，室温下避光染色；将经过染色的细胞转移至流式细胞仪的上样管中，并将细胞悬液进行稀释，然后利用流式细胞仪分选出Hoechst阳性，PI阴性，CD45阴性的细胞，以便获得所述第二分选产物。
根据本发明的一个实施例，所述口吸管法分离单元被配置为通过下列步骤进行所述口吸管法分离：将所述第二分选产物平铺于载玻片表面，挑取明场下有完整细胞形貌以及依据染色所选择的表面抗原的耦合染料来确定荧光场下符合条件的单细胞。
根据本发明的一个具体示例，所述口吸管法分离单元被配置为通过下列步骤进行所述口吸管法分离：
将所述第二分选产物平铺于载玻片表面，挑取明场下有完整细胞形貌及荧光场下符合条件的有核单细胞至孔板，在孔板的每孔中添加底液，挑选完成后，离心，以便获得所述靶细胞。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种对血液样本中靶细胞进行基因组扩增的方法，包括：按照前面所述的从血液样本中分离靶细胞的方法，从所述血液样本中分离靶细胞，所述靶细胞呈单细胞的形式；对所述靶细胞进行裂解处理，以便得到裂解液，所述裂解液含有所述靶细胞的全基因组；采用聚合酶对所述靶细胞的全基因组进行扩增。
根据本发明的实施例，所述聚合酶为Phi29 DNA聚合酶。
根据本发明的一个具体示例，所述扩增在扩增体系中完成，所述扩增体系包括10×Phi29 buffer、水、1.8-2.2×10-8mol dNTP、引物总浓度为1.8-2.2×10-11mol N8primers、4.5-5.5×10-3mg BSA、0.0045-0.0055μL Pluronic F68和9-11U Phi29 DNA聚合酶，其中，所述N8 primers为随机引物，由8个脱氧核糖核苷酸组成，A、G、C和T随机排列。
根据本发明的实施例，本发明的对血液样本中靶细胞进行基因组扩增的方法可以包括以下步骤：
(1)按照前面所述的从血液样本中分离靶细胞的方法，从所述血液样本中分离靶细胞，所述靶细胞呈单细胞的形式；
(2)取所述单个靶细胞，加入3.7μL PBS缓冲液和3μL细胞变性裂解液，65℃静置10分钟，然后加入3μL中和缓冲液，得到9.7μL模板溶液；
(3)取步骤(2)得到的9.7μL模板溶液，加入单份扩增体系乙，30℃静置3h，随后65℃静置5分钟，得到扩增产物，
其中，单份扩增体系乙为40.3μL，由30μL H2O、5μL 10×Phi29buffer、2μL dNTP溶液、2μL N8 primers溶液、0.25μL 20mg/mL的BSA水溶液、0.05μL 10％Pluronic F68溶液和1μL Phi29 DNA聚合酶溶液组成；
所述dNTP溶液中，dATP/dTTP/dCTP/dGTP的浓度均为10mM；所述N8 primers溶液中，引物总浓度为10μM；所述10％Pluronic F68溶液中，10％代表体积比；所述Phi29 DNA聚合酶溶液中Phi29 DNA聚合酶的浓度为10U/μL；
所述N8 primers为随机引物，由8个脱氧核糖核苷酸组成，A、G、C和T随机排列；
所述PBS缓冲液具体可为pH7.5、0.1M的PBS缓冲液；
所述细胞变性裂解液由溶质和溶剂组成；溶剂为水；溶质及其浓度如下：0.09-0.11mM KOH、0.9-1.1mM EDTA和0.09-0.11M DTT；
所述中和缓冲液由溶质和溶剂组成；溶剂为水；溶质及其浓度如下：54-66mM KH2PO4和4.5-5.5mM K2HPO4；
所述细胞变性裂解液由溶质和溶剂组成；溶剂为水；溶质及其浓度具体如下：0.1mM KOH、1mM EDTA和0.1M DTT；
所述中和缓冲液由溶质和溶剂组成；溶剂为水；溶质及其浓度具体如下：60mM KH2PO4和5mM K2HPO4。
由此，所得到的单细胞WGA产物在全基因组上具有很高的覆盖率和良好的扩增均一性，并且能够用于基于STR分型分析的基因身份鉴定和分析基因组中以染色体为单位的拷贝数变异情况，以及孕妇外周血中胎儿全基因组的检测与分析。
利用该方法能够有效地从血液样本中分离具有完整基因组的靶细胞，并实现靶细胞的全基因组扩增，且扩增产物能够有效用于建库和测序，进而能够准确有效地获得单细胞的全基因组的序列信息(例如通过构建测序文库和全基因组测序)，进一步基于获得的靶细胞全基因组的序列信息，能够准确地确定所述胎儿的状态，例如：性别、亲缘关系、染色体异常、单核苷酸多态性、微缺失、微重复等，也即本发明所得到的单细胞能够有效地应用于孕妇外周血中胎儿全基因组的检测与分析。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种确定血液样本中靶细胞的细胞种类的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：按照前面所述的对血液样本中靶细胞进行基因组扩增的方法，对血液样本中靶细胞进行基因组扩增，以便获得基因组扩增产物；以及基于所述扩增产物，对所述靶细胞进行细胞种类鉴定。
发明人发现，利用该方法能够有效地确定血液样本中靶细胞的细胞种类，且结果准确可靠，重复性好，能够有效地用于后续孕妇外周血中胎儿全基因组的检测与分析。
根据本发明的一些实施例，通过将所述扩增产物进行Q-PCR、STR分析实现所述细胞种类鉴定。
在本发明的第五方面，本发明提出了一种对血液样本中靶细胞进行基因组扩增的设备。根据本发明的实施例，该设备包括：靶细胞分离装置，所述靶细胞分离装置为前面所述的用于从血液样本中分离靶细胞的装置；裂解装置，所述裂解装置与所述靶细胞分离装置相连，用于对所述靶细胞进行裂解处理，以便得到裂解液，所述裂解液 含有所述靶细胞的全基因组；以及全基因组扩增装置，所述全基因组扩增装置与所述裂解装置相连，用于采用聚合酶对所述靶细胞的全基因组进行扩增。利用该设备能够有效地实施前面所述的对血液样本中靶细胞进行基因组扩增的方法，从而能够有效地从血液样本中分离具有完整基因组的靶细胞，并实现靶细胞的全基因组扩增，并且，扩增产物能够有效用于建库和测序，进而能够准确有效地获得单细胞的全基因组的序列信息(例如通过构建测序文库和全基因组测序)，进一步基于获得的靶细胞全基因组的序列信息，能够准确地确定所述胎儿的状态，例如：性别、亲缘关系、染色体异常、单核苷酸多态性、微缺失、微重复等，也即本发明所得到的单细胞能够有效地应用于孕妇外周血中胎儿全基因组的检测与分析。
在本发明的第六方面，本发明提出了一种确定血液样本中靶细胞的细胞种类的系统。根据本发明的实施例，该系统包括：前面所述的对血液样本中靶细胞进行基因组扩增的设备，所述对血液样本中靶细胞进行基因组扩增的设备用于对血液样本中靶细胞进行基因组扩增，以便获得基因组扩增产物；以及细胞种类鉴定装置，所述细胞种类鉴定装置与所述全基因组扩增装置相连，用于基于所述扩增产物，对所述靶细胞进行细胞种类鉴定。
发明人发现，利用该系统能够有效地确定血液样本中靶细胞的细胞种类，且结果准确可靠，重复性好，能够有效地用于孕妇外周血中胎儿全基因组的检测与分析。
根据本发明的一些实施例，所述细胞种类鉴定装置被配置为通过将所述扩增产物进行Q-PCR、STR分析实现所述细胞种类鉴定。
在本发明的第七方面，本发明提出了一种对血液样本中靶细胞构建测序文库的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：按照前面所述的对血液样本中靶细胞进行基因组扩增的方法，对血液样本中靶细胞进行基因组扩增，以便获得基因组扩增产物；以及基于所述基因组扩增产物，构建测序文库。利用该方法能够有效地从血液样本中分离具有完整基因组的靶细胞，并实现靶细胞的测序文库构建，从而能够方便地用于全基因组测序，以便获得单细胞的全基因组序列信息，进而能够基于靶细胞全基因组的序列信息，确定所述胎儿的状态，例如：性别、亲缘关系、染色体异常、单核苷酸多态性、微缺失、微重复等，也即能够有效地应用于孕妇外周血中胎儿全基因组的检测与分析。
在本发明的第八方面，本发明提出了一种对血液样本中的靶细胞全基因组进行测序的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：按照前面所述的对血液样本中靶细胞构建测序文库的方法，构建测序文库；以及对所述测序文库进行测序。利用该方法能够有效地对血液样本中分离获得的具有完整基因组的靶细胞进行全基因组测序，以便获得该靶细胞(单细胞)的全基因组信息，进而能够基于靶细胞全基因组的序列信息，确定所述胎儿的状态，例如：性别、亲缘关系、染色体异常、单核苷酸多态性、微缺失、微重复等，也即能够有效地应用于孕妇外周血中胎儿全基因组的检测与分析。
根据本发明的一个实施例，所述测序是利用选自Illumina-Solexa、ABI-Solid、Roche-454和单分子测序装置的至少一种进行的。
在本发明的第九方面，本发明提出了一种确定血液样本中靶细胞全基因组序列信息的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：按照前面所述的对血液样本中靶细胞全基因组进行测序的方法，对所述靶细胞进行测序，以便获得测序结果；基于所述测序结果，确定所述靶细胞全基因组的序列信息。利用该方法能够有效地从血液样本中分离具有完整基因组的靶细胞，并实现靶细胞全基因组序列信息的确定，进而能够基于靶细胞全基因组的序列信息，确定所述胎儿的状态，例如：性别、亲缘关系、染色体异常、单核苷酸多态性、微缺失、微重复等，也即能够有效地应用于孕妇外周血中胎儿全基因组的检测与分析。
根据本发明的一个实施例，所述血液样本来自孕妇，所述靶细胞为胎儿的单细胞。
根据本发明的一个实施例，进一步包括：基于所述靶细胞全基因组的序列信息，确定所述胎儿的状态。
根据本发明的一个实施例，所述胎儿的状态包括：性别、亲缘关系、染色体异常、单核苷酸多态性、微缺失、微重复。
根据本发明的实施例，本发明具有下列优点的至少之一：
1、在抗体标记方面，本发明完全基于阴性抗体(这里所述“阴性抗体”是指非胎儿细胞表达的表面抗原所对应的抗体，例如针对白细胞CD45的抗体等)标记，避开了胎儿细胞阳性抗体的非特异性缺点，同时不针对特定的胎儿细胞类型，尽可能多地分离到稀有的胎儿细胞。
2、在分离方法上，本发明结合了磁珠分选的快速有效及流式细胞仪的高纯度的优点，最后再通过口吸管实现单个胎儿细胞的分离。在产前诊断的应用方面，结合单细胞扩增技术、高通量测序技术和信息分析方法对胎儿的遗传变异进行有效的检测。
3、在产前诊断应用方面，本发明采用无创的方式分离胎儿细胞，完全避免了因抽取孕妇羊水等有创方式而造成的不利影响，如导致孕妇流产等。
4、本发明分离的胎儿细胞具有完整基因组，可用于特定基因位点的检测，特别适用于胎儿的单基因疾病检测。
5、需要强调的是，目前的分离方法无法获得具有完整基因组的胎儿细胞，且由于每个分离步骤都会对细胞产生破坏，因此采用多步骤结合分离出完整单细胞的难度非常大，也即分离步骤越多，损伤的概率越高，进而造成获得具有完整基因组的靶细胞的难度进一步加大。然而，本发明却有效分离获得了具有完整基因组的靶细胞，其可用于高深度测序分析。这实际上是发明人多次实验中意外获得的，且并不符合前述的一般常识“分离步骤越多，损伤的概率越高，进而造成获得具有完整基因组的靶细胞的难度进一步加大”，效果令人惊喜，完全不可预期。
发明详细描述
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，可以参照《分子克隆实验指南》第三版或者相关产品进行，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明。
实施例1 孕妇外周血的前处理及单细胞的分选
在本实施例中采用来自正常男胎的孕妇样品，样品标号：CFCCYY；男胎；血量：10mL；孕周：13周。
用肝素管取10mL孕妇外周血，将血样加入预先稀释至1X的100mL的BD裂红液中，轻柔混匀后，在室温条件下，进行裂红，至血液透亮后，离心吸去上清，轻柔吹吸细胞沉淀，用含2％FBS的PBS洗两次后，将细胞沉淀重悬于80微升含2％FBS的PBS中，吹匀。加入CD45抗体磁珠，4℃孵育15min后300g离心10min，弃上清，沉淀重悬于含2％FBS的PBS中。组装磁珠分选系统(美天旎)，收集CD45阴性的流出细胞，离心去上清后将细胞沉淀重悬于含2％FBS的PBS中。加入CD45于4度下孵育15min后离心洗涤一次。将细胞重悬于含2％FBS的PBS中，加入50微升1mg/mL的PI和Hoechst 33342染色液，室温下避光染色30min。将染好色的细胞过筛后转移至流式细胞仪的上样管中，利用流式细胞仪分选Hoechst阳性，PI阴性，CD45阴性的细胞至预先加入1％BSA PBS的PCR管中。将PCR管内的细胞悬液平铺于载玻片表面，挑取明场下有完整细胞形貌，以及荧光场下符合条件(依据染色所选择的表面抗原的耦合染料来确定荧光场下的条件，在本发明的实施例中，使用的是PI和Hoechst 33342染色，荧光场下选择呈现“紫色”的细胞)的有核单细胞至96孔板，根据实验要求，每孔添加4微升PBS作为底液，挑选完成后，离心，封膜密闭后准备进行单细胞扩增反应。在本实施例中，10mL血样中一共用口吸管挑取了114个细胞。
实施例2 单细胞的全基因组扩增
将实施例1中得到的单细胞进行全基因组扩增，具体如下：
一、制备用于进行单细胞全基因组扩增的试剂盒
试剂盒由细胞变性裂解液、中和缓冲液和扩增体系组成。
细胞变性裂解液：由溶质和溶剂组成；溶剂为水；溶质及其浓度如下：0.1mM KOH、1mM EDTA和0.1M DTT。
中和缓冲液：由溶质和溶剂组成；溶剂为水；溶质及其浓度如下：60mM KH2PO4和5mM K2HPO4。
扩增体系包括：10×Phi29 buffer、水、1.8-2.2×10-8mol dNTP、引物总浓度为1.8-2.2×10-11mol N8 primers、4.5-5.5×10-3mg BSA、0.0045-0.0055μL Pluronic F68和9-11U Phi29 DNA聚合酶。具体的，以40.3μL为例，扩增体系：由30μL H2O、5μL 10×Phi29 buffer、2μL dNTP溶液、2μL N8 primers溶液、0.25μL 20mg/mL的BSA水溶液、0.05μL 10％Pluronic F68溶液和1μL Phi29 DNA聚合酶溶液组成。
10×Phi29 buffer：Complete Genomics，货号MP00012。
dNTP溶液(dNTP溶液中，dATP/dTTP/dCTP/dGTP的浓度均为10mM)：FERMENTAS，货号R0193。
N8 primers溶液(N8 primers为随机引物，由8个脱氧核糖核苷酸组成，AGCT随机排列)：N8 primers溶液中引物总浓度为10μM。
10％Pluronic F68溶液(10％代表体积比)：sigma，货号P5556。
Phi29 DNA聚合酶溶液(Phi29 DNA聚合酶溶液中，Phi29 DNA聚合酶的浓度为10U/μL)：Complete Genomics，货号RM00024。
二、制备单细胞基因组的扩增产物
利用上述步骤一制备获得的试剂盒，按照以下步骤，分别将实施例1中得到的114个单细胞进行全基因组扩增：
1、将实施例1中得到的一个单细胞，加入3.7μL PBS缓冲液(pH7.5、0.1M的PBS缓冲液)和3μL步骤一制备的试剂盒中的细胞变性裂解液(目的是使细胞裂解并释放出其中的基因组DNA)中，65℃静置10分钟，然后加入3μL步骤一制备的试剂盒中的中和缓冲液(目的是使细胞裂解终止，并且使体系恢复到中性环境)，得到9.7μL模板溶液。
2、取步骤1得到的9.7μL模板溶液(DNA含量约为6pg)，加入步骤一制备的试剂盒中的扩增体系，30℃静置3h，随后65℃静置5分钟，得到扩增产物。
扩增产物可直接用于下游分析或置于-20℃保存。
并且，发明人发现，使用本实施例的扩增方法所得到的单细胞WGA产物在全基因组上具有很高的覆盖率和良好的扩增均一性，并且能够用于基于STR分型分析的基因身份鉴定和分析基因组中以染色体为单位的拷贝数变异情况，以及孕妇外周血中胎儿全基因组的检测与分析。
实施例3 单细胞的Q-PCR检测及STR位点检测
将上述扩增得到的114个单细胞扩增产物采用
Figure PCTCN2016073375-appb-000001
Trio DNA Quantification Kit (Applied BiosystemsTM)进行Q-PCR检测。仪器采用ViiA 7实时荧光定量PCR仪，扩增的反应条件参照试剂盒所提供的规程。在114个产物中，有4个细胞的扩增产物有明显的Y扩增信号。
发明人进一步将这4个单细胞扩增产物及父母的基因组使用ampFLSTR Identifier PCR扩增试剂盒以及
Figure PCTCN2016073375-appb-000002
Yfiler扩增试剂盒进行STR检测，结果如表一所示：
表一：常规STR和Y染色体STR位点情况
Figure PCTCN2016073375-appb-000003
注：*1:ampFLSTR Identifier PCR扩增试剂盒可以实现对16个STR位点同时扩增同时检测，故试剂盒能检测到的总的位点数为16，由于是单细胞扩增产物，部分位点会缺失，实际扩增并且检测到的位点数目不到16个。实际扩增且检测到的位点数定义为覆盖到的位点数。在这些覆盖到的位点数中，进一步和父母的位点进行比对，比对成功的位点则定义为匹配到的位点数。
*2:
Figure PCTCN2016073375-appb-000004
Yfiler扩增试剂盒可以实现对Y染色体上的16个STR位点同时扩增同时检测，故试剂盒能检测到的总的位点数为16，同样由于是单细胞扩增产物，部分位点会缺失，实际扩增并且检测到的位点数目不到16个，实际扩增且检测到的位点数定义为覆盖到的位点数。在这些覆盖到的位点数中，进一步和父亲的位点进行比对，比对成功的位点我们则定义为匹配到的位点数。
从表中可以看到，所挑选的4个Y阳性细胞的扩增产物均有一定的覆盖度，同时在所覆盖的位点均与父母的STR位点相匹配。特别是CFCCYY-F2这个样品，在所分析的16个常规STR位点中，单细胞扩增产物有14个位点与父母的基因组相匹配，而在Y染色体的16个常规STR位点中有14个与父亲一致，表明所分选的细胞确实是来自于胎儿。同时，发明人发现分选到的细胞有部分STR位点丢失，这主要是由于细胞自身核的不完整造成的。而这种不完整的细胞核的产生主要有两种原因：一方面胎儿细胞在母血中存在一定的凋亡现象；另一方面分离的过程中对靶细胞具有一定的损坏。这也正是获得具有完整基因组的胎儿细胞的困难所在。其次，从扩增角度而言，由于单细胞扩增的偏向性导致其扩增覆盖度不能达到100％。因此扩增产物必然会存在一些位点无法覆盖的现象。另外，发明人发现，扩增产物存在较多的纯合位点，产生这种现象的原因，这一方面是由于父母的相同位点较多，胎儿有可能确实为纯合；另一方面是可能是由于单细胞扩增所带来的等位基因脱扣(ADO)现象。
实施例4 单细胞全基因组扩增产物低深度高通量测序分析
具体的分析过程步骤：第一，将全基因组MDA扩增产物经过建库利用HiSeq2500进行PE90测序。第二，利用Soap2比对软件以Hg19为参考基因组进行比对分析。然后统计比对效率，错配，GC含量，覆盖度等参数，结果如表二所示。
表二 全基因组MDA扩增产物低深度高通量测序数据的统计结果
Figure PCTCN2016073375-appb-000005
从表二的结果可以看出，在获得基本相同的数据总量情况下，4个样本表现出不同的覆盖度以及reads重复率。4个样本均可进一步用于高深度测序分析，优选具有较高的覆盖度以及较低的reads重复率的样本。
实施例5 单细胞全基因组扩增产物高深度高通量测序分析
使用上述样本CFCCYY-F2进行高深度测序分析，主要分析流程：1、基础信息分析；2、ADO校正；3、亲子鉴定；4、疾病分析，具体如下：
(1)基础信息分析：第一，MDA扩增产物经过建库利用HiSeq2500进行PE90测序。第二，利用BWA比对软件以Hg19为参考基因组进行比对分析。然后统计比对效率，错配，GC含量，覆盖度等参数。第三，利用GATK进行SNP和INDEL检测。
(2)ADO校正：采用公式
Figure PCTCN2016073375-appb-000006
P(GC/G)：一个位点出现G但这个位点为GC杂合的概率。
P(G/GC)：在一定的GC含量下出现G的先验概率。
P(GC)：GC这个基因型在此处出现的概率。
P(G)：全概率公式即所有出现G的可能情况的概率总和。
先假设GC含量为41％，那么GG的先验概率就为(0.41/2)^2＝0.042025，也就是P(G/GC)＝0.04205，这个位点的父母基因型分别为GG,GC，因此该位点的释然值P(GC)＝0.5， 最后通过该方法校正GATK进行SNP calling的结果。表三为所有可能的先验概率。
表三 先验概率统计结果
Figure PCTCN2016073375-appb-000007
(3)亲子鉴定：选取父母纯合但是不一样的SNP位点，理论上胎儿为杂合且带有父亲的基因型B，统计B这个基因型在胎儿中出现的概率。然后用相同方法使用90个黄种人的数据进行排父分析。将生物学上的父亲得到的比率值跟其他90个非父样本的比率值进行Z值检验。父亲的碱基在胎儿中找到的比率为0.516，Z值结果为6.32，父亲的值可以跟非父的值显著区分开来，证明CFCCYY-F2细胞为胎儿细胞。
(4)疾病分析：先从CGD(Clinical Genomic Database)疾病库中提取与疾病相连锁的基因的区域，然后计算这些区域在胎儿数据当中的覆盖度，接着过滤出覆盖度高于70％的基因统计可检测疾病的位点一共有1046种。然后根据GATK以及ADO校正以后的基因型信息进行无创单基因病检测，发现CFCCYY-F2样本所对应的胎儿1携带有输精管发育缺陷和免疫缺陷两种单基因病的突变基因，前者可能致病，后者致病。这两种单基因疾病的具体信息如表四所示。
表四 单基因病检测结果
Figure PCTCN2016073375-appb-000008
Figure PCTCN2016073375-appb-000009
工业实用性
本发明的从血液样本中获得靶细胞的方法，所得到的靶细胞是单细胞形式的，适于进行全基因组扩增，且扩增产物能够有效用于建库和测序，进而能够准确有效地获得单细胞的全基因组的序列信息(例如通过构建测序文库和全基因组测序)，进一步基于获得的靶细胞全基因组的序列信息，能够准确地确定所述胎儿的状态，也即本发明所得到的单细胞能够有效地应用于孕妇外周血中胎儿全基因组的检测与分析。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

Claims (11)

  1. 一种从血液样本中分离靶细胞的方法，其特征在于，所述靶细胞呈单细胞形式，所述方法包括：
    (1)将血液样本进行免疫磁珠分选，以便获得含有所述靶细胞的第一分选产物；
    (2)将所述第一分选产物进行流式细胞分选，以便获得含有所述靶细胞的第二分选产物；以及
    (3)采用口吸管法分离所述第二分选产物，以便获得呈单细胞形式的所述靶细胞。
  2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述血液样本来自于孕妇，
    任选地，所述靶细胞为胎儿细胞，
    任选地，在步骤(1)之前，进一步包括：除去所述血液样本中的红细胞，
    任选地，在存在抗凝血剂的条件下，使所述血液样本与红细胞裂解液接触，以便除去所述血液样本中的所述红细胞，
    任选地，所述抗凝血剂为选自肝素、乙二胺四乙酸、枸橼酸盐、草酸盐和ACD抗凝剂的至少一种，
    任选地，所述免疫磁珠分选采用携带抗体的磁珠，
    任选地，所述抗体针对选自CD45、CD14、CD56、CD19和CD20的至少一种，
    任选地，步骤(2)包括：
    使用抗体对所述第一分选产物进行表面抗原染色，所述表面抗原包括选自CD45、CD14、CD56、CD19和CD20的至少一种，
    任选地，步骤(3)包括：
    将所述第二分选产物平铺于载玻片表面，挑取明场下有完整细胞形貌以及依据染色所选择的表面抗原的耦合染料来确定荧光场下符合条件的单细胞。
  3. 一种用于从血液样本中分离靶细胞的装置，其特征在于，所述靶细胞呈单细胞形式，所述装置包括：
    免疫磁珠分选单元，所述免疫磁珠分选单元用于将所述血液样本进行免疫磁珠分选，以便获得含有所述靶细胞的第一分选产物；
    流式细胞分选单元，所述流式细胞分选单元与所述免疫磁珠分选单元相连，用于将所述第一分选产物进行流式细胞分选，以便获得含有所述靶细胞的第二分选产物；以及
    口吸管法分离单元，所述口吸管法分离单元与所述流式细胞分选单元相连，用于将所述第二分选产物进行口吸管分离，以便获得呈单细胞形式的所述靶细胞。
  4. 根据权利要求3所述的装置，其特征在于，所述血液样本来自于孕妇，
    任选地，所述靶细胞为胎儿细胞，
    任选地，进一步包括：红细胞去除单元，所述红细胞去除单元用于除去所述血液样本中的红细胞，
    任选地，所述红细胞去除单元被配置为通过下列步骤除去所述血液样本中的所述红细胞：
    在存在抗凝血剂的条件下，使所述血液样本与红细胞裂解液接触，以便除去所述血液样本中的所述红细胞，
    任选地，所述抗凝血剂为选自肝素、乙二胺四乙酸、枸橼酸盐、草酸盐和ACD抗凝剂的至少一种，
    任选地，所述免疫磁珠分选单元采用携带抗体的磁珠，
    任选地，所述抗体针对选自CD45、CD14、CD56、CD19和CD20的至少一种，
    任选地，所述流式细胞分选单元被配置为通过下列步骤进行所述流式细胞分选：
    使用抗体对所述第一分选产物进行表面抗原染色，所述表面抗原包括选自CD45、CD14、CD56、CD19和CD20的至少一种，
    任选地，所述口吸管法分离单元被配置为通过下列步骤进行所述口吸管法分离：
    将所述第二分选产物平铺于载玻片表面，挑取明场下有完整细胞形貌以及依据染色所选择的表面抗原的耦合染料来确定荧光场下符合条件的单细胞。
  5. 一种对血液样本中靶细胞进行基因组扩增的方法，其特征在于，包括：
    按照权利要求1或2所述的方法，从所述血液样本中分离靶细胞，所述靶细胞呈单细胞的形式；
    对所述靶细胞进行裂解处理，以便得到裂解液，所述裂解液含有所述靶细胞的全基因组；以及
    采用聚合酶对所述靶细胞的全基因组进行扩增。
  6. 一种确定血液样本中靶细胞的细胞种类的方法，其特征在于，包括：
    按照权利要求5所述的方法，对血液样本中靶细胞进行基因组扩增，以便获得基因组扩增产物；以及
    基于所述扩增产物，对所述靶细胞进行细胞种类鉴定，
    任选地，通过将所述扩增产物进行Q-PCR、STR分析实现所述细胞种类鉴定。
  7. 一种对血液样本中靶细胞进行基因组扩增的设备，其特征在于，包括：
    靶细胞分离装置，所述靶细胞分离装置为权利要求3或4所述的用于从血液样本中分离靶细胞的装置；
    裂解装置，所述裂解装置与所述靶细胞分离装置相连，用于对所述靶细胞进行裂解处理，以便得到裂解液，所述裂解液含有所述靶细胞的全基因组；以及
    全基因组扩增装置，所述全基因组扩增装置与所述裂解装置相连，用于采用聚合酶对所述靶细胞的全基因组进行扩增。
  8. 一种确定血液样本中靶细胞的细胞种类的系统，其特征在于，包括：
    权利要求7所述的对血液样本中靶细胞进行基因组扩增的设备，所述对血液样本中靶细胞进行基因组扩增的设备用于对血液样本中靶细胞进行基因组扩增，以便获得基因组扩 增产物；以及
    细胞种类鉴定装置，所述细胞种类鉴定装置与所述全基因组扩增装置相连，用于基于所述扩增产物，对所述靶细胞进行细胞种类鉴定，
    任选地，所述细胞种类鉴定装置被配置为通过将所述扩增产物进行Q-PCR、STR分析实现所述细胞种类鉴定。
  9. 一种对血液样本中靶细胞构建测序文库的方法，其特征在于，包括：
    按照权利要求5所述的方法，对血液样本中靶细胞进行基因组扩增，以便获得基因组扩增产物；以及
    基于所述基因组扩增产物，构建测序文库。
  10. 一种对血液样本中的靶细胞全基因组进行测序的方法，其特征在于，包括：
    按照权利要求9所述的方法，构建测序文库；以及
    对所述测序文库进行测序。
  11. 一种确定血液样本中靶细胞全基因组序列信息的方法，其特征在于，包括：
    按照权利要求10所述的方法，对所述靶细胞进行测序，以便获得测序结果；以及
    基于所述测序结果，确定所述靶细胞全基因组的序列信息，
    任选地，所述血液样本来自孕妇，所述靶细胞为胎儿的单细胞，
    任选地，进一步包括：
    基于所述靶细胞全基因组的序列信息，确定所述胎儿的状态，
    任选地，所述胎儿的状态包括：性别、亲缘关系、染色体异常、单核苷酸多态性、微缺失、微重复。
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