WO2017110523A1 - メタン生成抑制剤、反芻動物用飼料、メタン生成抑制方法及び蛋白質消化率改善方法 - Google Patents
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- A23K50/10—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for ruminants
Definitions
- the present invention relates to a methane production inhibitor, ruminant feed, a methane production inhibition method, and a protein digestibility improvement method.
- methane is produced by methane fermentation with methanogens (methane bacteria), and it is known that methane is generated mainly in the environment from ruminant stomachs and rice fields.
- Ruminants soften food, such as grass first in the rumen, known as the ruminant stomach, and then exhale the semi-digested mass known as the ruminant mass, and chew it again. It digests by crunching.
- Methanogens that inhabit rumen of ruminants synthesize methane under anaerobic conditions.
- organic acids are produced at the stage of digesting grass and the like, and hydrogen ions generated at this stage of production are converted to methane by the methanogen.
- Methane fermentation by microorganisms in the rumen plays an important role in stabilizing the rumen environment.
- methane when a substantial part of the energy inherent in organic matter is discharged as methane, loss from the energy that the host animal should obtain results in loss. Will be.
- finding a solution for the suppression of methane production in rumen fermentation is a problem in both environmental protection and nutrient utilization.
- Patent Document 1 a method using cysteine
- Patent Document 2 a method using Bacillus subtilis, lactic acid bacteria, bacteria, etc.
- ruminant diets such as cattle include roughage, such as pastures that ruminants normally eat, and concentrated diets that contain a large amount of protein, etc., for artificially growing ruminants efficiently. Sufficient amounts of protein were required for the proper development of meat and milk supplied by ruminants, and low-cost fish meal and meat-and-bone meal were used as the protein source.
- infectious spongiform encephalopathy such as bovine spongiform encephalopathy (BSE)
- BSE bovine spongiform encephalopathy
- ruminant feed (cow, sheep, goat, deer) feed (A feed)
- animal protein meal and bone meal, blood meal, fish meal, chicken meal, etc.
- a ruminant feed that does not contain animal protein and can efficiently supply protein to ruminants is desired.
- the present invention has been made in view of the above problems, and an object of the present invention is to provide a novel methane production inhibitor, ruminant feed, and methane production inhibition method containing Euglena as an active ingredient. . Another object of the present invention is to provide a methane production inhibitor, a ruminant feed, and a methane production inhibition method capable of suppressing methane production and improving the digestibility of ruminant rumen.
- the inventors of the present invention have repeatedly investigated the method of suppressing methane production in ruminants using various substances, and found that Euglena has an action of suppressing methane production of methanogens.
- the said subject is solved by the methane production
- it can be a methane production inhibitor for administration to ruminants.
- it can be set as the feed for ruminants containing the said methane production inhibitor. Because it is configured in this way, it can suppress the production of methane and uses Euglena that has been confirmed to be safe as human food and is distributed in the market, so it is highly safe as feed, and can be used for milk and beef. It is possible to provide a methane production inhibitor that is not affected by the accumulation of harmful substances.
- the feed for ruminants used as a digestibility improving agent which improves the digestibility of the said feed in the rumen of the ruminant.
- it can be set as the said ruminant feed containing the said Euglena more than 0 weight% and less than 20 weight%. Since it comprises in this way, the feed for ruminants which has two functions as a methane production inhibitor and a feed digestibility improving agent can be provided.
- a ruminant feed can be orally ingested by a ruminant animal to suppress methane production in the ruminant stomach of the ruminant.
- the feed for ruminants used as a protein digestibility improving agent which improves the protein digestibility of the said feed in the said ruminant.
- it can be set as the said ruminant feed containing the said Euglena more than 0 weight% and less than 20 weight%. Since it comprises in this way, the feed for ruminants which has two functions as a methane production inhibitor and a protein digestibility improvement agent of feed can be provided.
- it can be set as the protein digestibility improvement method which feeds ruminant animals orally to a ruminant and improves the digestibility of the protein in the ruminant.
- the present invention provides a methane production inhibitor containing euglena as an active ingredient, a ruminant feed, and a ruminant feed orally ingested by a ruminant to suppress methane production in the ruminant of the ruminant. It relates to a suppression method.
- a ruminant refers to food such as grass that first softens in the rumen known as the ruminant stomach, and then exhales the semi-digested mass known as the ruminant mass.
- Ruminants include cattle, goats, sheep, giraffes, American bison, European bison, yak, buffalo, deer, camel, alpaca, llama, wildebeest, antelope, pronghorn, and nilgai.
- lumen refers to the rumen of ruminants. The rumen is inhabited by bacteria, protozoa, and fungi.
- volatile fatty acids acetic acid, propionic acid, butyric acid, etc.
- DM is an abbreviation for dry matter
- food obtained by heating and drying a feed at a constant temperature is regarded as dry matter.
- OM is an abbreviation for organic matter.
- Ash refers to ash.
- CP is an abbreviation for Crude Protein and is one of the general ingredients of feed.
- the crude protein includes ammonia, amides, amino acids and the like other than proteins.
- GE is an abbreviation for Gross Energy, and is a calorific value when organic matter is completely burned in the presence of oxygen.
- EE is an abbreviation for ether extract and corresponds to crude fat.
- NDF is an abbreviation for neutral detergent fiber, and is a total fiber of lignin, cellulose, and hemicellulose left after the feed is treated with a neutral detergent. Indicates the total amount of fiber in the feed. This is a convenient index for estimating feed lumps.
- ADF is an abbreviation for acid detergent fiber, and is lignin and cellulose remaining after separation of fiber components by acid treatment of feed. It is an index useful for measuring digestibility because it contains indigestible lignin accurately.
- VFA is an abbreviation of volatile fatty acid (Volatile Fatty Acid), and is a volatile fatty acid having a low molecular weight that is produced when feed is subjected to a decomposition fermentation action by microorganisms in rumen.
- the main acids are acetic acid, propionic acid and butyric acid.
- the methanation inhibitor of this invention contains Euglena as an active ingredient.
- Euglena The “Euglena” of the present invention means a microorganism including all of the plants classified as Euglena in zoology or botany, varieties thereof, and mutants thereof.
- Euglena microorganisms are, in zoology, the protozoan Protozoa (Mastigophorea), Phytomastigophorea (Euglenida) Euglenoidina subgenus It is a microorganism belonging to the eye (Euglenoidina).
- microorganisms belonging to the genus Euglena belong to Euglenaes belonging to Euglenophyceae of Euglenophyta in botany.
- Euglena microorganisms include Euglena acus, Euglena caudata, Euglena chadefaudii, Euglena deses, Euglena gracilis, Euglena granulata, Euglena intermedia, Euglena mutabilis, Euglena oxyuris, Euglena proxima, Euglena proxima, Euglena proxima, Euglena proxima, Euglena proxima, , Euglena intermedia, Euglena piride and the like.
- Euglena gracilis which is widely used for research, is particularly suitable.
- the Euglena gracilis Z strain is mentioned.
- mutant strain SM-ZK chloroplast-deficient strain
- variant var. Bacillaris and chloroplast variants of these species May be used.
- other Euglena species such as Astaia longa may be used.
- Euglena is widely distributed in fresh water such as ponds and swamps, and may be used separately from these, or any Euglena that has already been isolated may be used.
- the Euglena genus of this invention includes all the mutants. These mutant strains also include those obtained by genetic methods such as recombination, transduction, transformation and the like.
- examples of the culture solution include a culture solution to which nutrient salts such as a nitrogen source, a phosphorus source, and a mineral are added, for example, a modified Cramer-Myers medium ((NH 4 ) 2 HPO 4 1.0 g / L.
- a modified Cramer-Myers medium ((NH 4 ) 2 HPO 4 1.0 g / L.
- KH 2 PO 4 1.0 g / L, MgSO 4 .7H 2 O 0.2 g / L, CaCl 2 .2H 2 O 0.02 g / L, Fe 2 (SO 2 ) 3 7H 2 O 3 mg / L, MnCl 2 ⁇ 4H 2 O 1.8 mg / L, CoSO 4 ⁇ 7H 2 O 1.5 mg / L, ZnSO 4 ⁇ 7H 2 O 0.4 mg / L, Na 2 MoO 4 ⁇ 2H 2 O 0.2 mg / L, CuSO 4 .5H 2 O 0.02 g / L, thiamine hydrochloride (vitamin B 1 ) 0.1 mg / L, cyanocobalamin (vitamin B 12 , (pH 3.5)) can be used.
- (NH 4 ) 2 HPO 4 can also be converted to (NH 4 ) 2 SO 4 or NH 3 aq.
- a known Hutner medium or Koren-Hutner medium prepared based on the description of Euglena Physiology and Biochemistry (Edited by Shozaburo Kitaoka, Society Publishing Center, Inc.) may be used. You may use the AY culture medium etc. which are autotrophic culture media remove
- the pH of the culture solution is preferably 2 or more, more preferably 3 or more, still more preferably 3.5 or more, and the upper limit thereof is preferably 7 or less, more preferably 6.5 or less, still more preferably 4. 5 or less.
- the photosynthetic microorganisms can grow more dominantly than other microorganisms, so that contamination can be suppressed.
- Euglena cells may be cultured by an open pond method using sunlight directly, a light collecting method in which sunlight condensed by a light concentrator is sent through an optical fiber, etc., and irradiated in a culture tank and used for photosynthesis.
- Euglena cells can be cultured using, for example, a fed-batch method, but flask culture, fermentation using a fermentor, batch culture, semi-batch culture (fed-batch culture), continuous culture (perfusion) Any liquid culture method such as a culture method may be used.
- the culture can be performed using a known culture apparatus such as an open pond type, a raceway type, a tube type or the like, or an experimental culture vessel such as a Sakaguchi flask, an Erlenmeyer flask, or a reagent bottle. Since Euglena assimilate CO 2 , it is preferable to pass air containing 1 to 5% CO 2 through the medium when culturing using the Cramer-Myers medium, which is an autotrophic medium. Furthermore, in order to sufficiently develop the chloroplast, about 1 to 5 g of ammonium phosphate may be added per liter of the medium.
- the culture temperature is usually 20 to 34 ° C., particularly preferably 28 to 30 ° C.
- Euglena Depending on the culture conditions, Euglena usually enters a logarithmic growth phase 2 to 3 days after the start of culture, and reaches a stationary phase about 4 to 5 days. Euglena may be cultured under light irradiation (light culture) or non-irradiated (dark culture).
- Euglena cells are separated by, for example, centrifugation or simple sedimentation of a culture solution, membrane filtration, or the like.
- the dried Euglena alga body is prepared by washing the separated Euglena cells and then freeze-drying them in a known manner. However, adjustment of the dried alga body may be performed by spray drying, heating vacuum drying, or the like.
- Euglena alga bodies separated from the culture solution by centrifugation, sedimentation, membrane filtration, or the like may be used as Euglena, or dried alga bodies may be used.
- the methane production inhibitor of the present invention may be mixed with other feeds using euglena as an active ingredient, or may be composed of euglena alone. Since Euglena has a function of improving the digestibility of feed in rumen of ruminants, the methanogenesis inhibitor of the present invention can be used as a digestibility improver for improving the digestibility of feed in rumen of ruminants. . Since Euglena has a function of improving the digestibility of feed protein in ruminants, the methanogenesis inhibitor of the present invention can be used as a protein digestibility improver for improving the protein digestibility of feed in ruminants. .
- the ruminant feed of the present invention contains Euglena as an active ingredient.
- Euglena Euglena alga bodies separated from the culture solution by centrifugation, sedimentation, membrane filtration or the like may be used, or dried alga bodies may be used.
- the ruminant feed of the present invention may be mixed with other feeds using euglena as an active ingredient, or may be composed only of euglena.
- Euglena can be used to replace the total or partial amount of protein-containing feed fed for the purpose of providing ruminants with proteins such as concentrated feed, cereals, and oil meal.
- Euglena can be used as a vegetable protein supplement to provide ruminants with a vegetable protein source. Since Euglena has a function of improving the digestibility of feed in rumen of ruminants, the ruminant feed of the present invention can be used as a digestibility improving agent for improving the digestibility of feed in rumen of ruminants. .
- Euglena has the function of improving the protein digestibility of feed in ruminants, so the ruminant feed of the present invention can be used as a protein digestibility improver that improves the protein digestibility of feed in ruminants. .
- the ruminant feed is orally ingested by the ruminant to suppress methane production in the ruminant stomach of the ruminant.
- Ruminant feed may be freely consumed by ruminants along with water and mineral blocks.
- Euglena has a function of improving the digestibility of feed in ruminants of ruminants. Therefore, in the method for inhibiting methane production of the present invention, the digestibility of feed in rumen of ruminants is also improved while suppressing the methane production. .
- Euglena has a function of improving the protein digestibility of feed in ruminants, so the method for inhibiting methane production of the present invention suppresses methane production and improves the protein digestibility of feed in ruminants.
- CM medium sterilized by autoclave 29 ml of CM medium sterilized by autoclave was introduced into a vial sterilized by autoclave, and 1 ml of a culture solution containing Euglena was added.
- This culture solution was cultured in a thermostatic chamber at 30 ° C. under 5000 lux (the light source was fluorescent lamp Biolux A 20W, NEC) and under air bubbling for about one week.
- the composition of the CM medium used was (NH 4 ) 2 HPO 4 1 g / L, KH 2 PO 4 1 g / L, MgSO 4 ⁇ 7H 2 O 0.2 g / L, CaCl 2 ⁇ 2H 2 O 0.02 g / L , Fe 2 (SO 4 ) 3 ⁇ 7H 2 O 3.0 mg / L, MnCl 2 ⁇ 4H 2 O 1.8 mg / L, CoSO 4 ⁇ 7H 2 O 1.5 mg / L, ZnSO 4 ⁇ 7H 2 O 0.4 mg / L, Na 2 MoO 4 ⁇ 2H 2 O 0.2 mg / L, CuSO 4 5H 2 O 0.02 mg / L, thiamine hydrochloride (vitamin B1) 0.1 mg / L, and cyanocobalamin (vitamin B12) 0.001 mg / L.
- CM medium was prepared with reference to the document of Marian et al. (1952).
- the pH was adjusted to 3.5 by adding concentrated sulfuric acid.
- the culture solution containing Euglena was centrifuged, and the precipitate was washed and lyophilized in vacuo to obtain Euglena powder of the Example.
- the chemical composition of Euglena powder of Example 1 is shown in Table 1 together with the chemical composition of the feed described below.
- the leftmost column is the chemical composition of the Euglena powder of the examples.
- ⁇ Collecting rumen fluid> Two fistula-equipped Holstein dry cows (average weight 600 kg) were used as the rumen fluid donating animals.
- Cattle are daily 10kg orchardgrass hay (OM 980g / kg, CP 132 g / kg, NDF 701 g / kg, ADF 354 g / kg, lignin 40 g / kg, and GE 18.02MJ / kgDM) daily Purified water and mineral block (Fe 1836 mg, Cu 377 mg, Co 66 mg, Mg 1046 mg, Zn 1235 mg, I 77 mg, Se 33 mg, vitamin E 5000 mg, NaCl 962g / 3kg) are free Ingested.
- Rumen fluid was collected from two cows using a vacuum line before feeding in the morning, filtered through a nylon cloth, and placed in a thermos preheated to 39 ° C with boiling water. Two cows samples were mixed in equal proportions, were run for 1 hour continuous CO 2. The animal care and collection procedures for this experiment were approved by the Obihiro University of Agriculture and Animal Care Commission on Animal Care and Use.
- Feed T1 is a control, consisting of 6g of Cranegrass hay and 4g of concentrated feed
- Feed T2 is composed of 6g of Cranegrass hay, 3.5g of concentrated diet, and 0.5g of Euglena
- Feed T3 is 6g of Cranegrass hay
- Rich Feed T4 consisted of 6g Cleingrass hay, 2g concentrated feed, 2g Euglena
- Feed T5 consisted of 6g Cranegrass hay, 4g Euglena
- feed T6 consisted of 10g Euglena.
- Feeds T2 to T6 are examples of the methane production inhibitor and ruminant feed of the present invention. Table 1 shows the chemical compositions of Euglena, Kleingrass hay and concentrated feed, and six types of feeds T1 to T6.
- a rumen liquid sample was collected from two dry cows before feeding in the morning, filtered, and mixed so that each amount was equal.
- Autoclaving and flushing with CO 2 for 1 hour Distribute to fermentation vessel. Fermentation was performed at 39 ° C. for 24 hours. Rumen fluid was added to the buffer at a ratio of 1: 4.
- the gas discharge from each fermentation vessel was measured for 10 minutes at 30 minute intervals. At the end of the incubation period (24 hours), culture fluid samples were collected and stored at ⁇ 20 ° C.
- Samples for analysis were prepared according to the aforementioned paper by Sar, C. et al. (2005).
- the pH and oxidation-reduction potential of the fermentation medium were measured every 1 minute (TS mk-250, Takasugi Seisakusho). All data was stored on the computer through the analyzer interface.
- the crude protein (CP) was estimated to be N ⁇ 6.25 by the Kjeldahl method (984.13) (AOAC, 1995).
- Neutral detergent fiber (NDF) is quantified by the procedure of Van Soest et al. (Van Soest, PJ, et al., 1991. J. Dairy Science vol. 74, pp. 3583-3597.), And amylase is excluded. Estimated and expressed as containing remaining ash.
- Acidic detergent fiber (ADF) and lignin were also quantified according to the procedure of Van Soest et al. (1991). Acid detergent fibers were also expressed as containing ash. Lignin was quantified by solubilization of cellulose with sulfuric acid.
- the total energy (GE) amount of the sample was analyzed with Shimadzu automatic cylinder calorimeter (CA-4AJ, Shimadzu Corporation).
- the ammonia nitrogen concentration was analyzed by the procedure of Conway et al. (Conway, EJ et al., 1942. Biochem. J., vol. 36, pp. 655-661.).
- total volatile fatty acid production decreased linearly (p ⁇ 0.001) with increasing Euglena replacement.
- the acetate ratio increased quadratic (p ⁇ 0.007) and cubic (p ⁇ 0.001), while the propionate ratio decreased linearly (p ⁇ 0.001) It showed a tendency to decrease functionally (p ⁇ 0.068).
- Butyrate ratio increased linearly (p ⁇ 0.022) and nonlinearly (p ⁇ 0.012).
- the valeric acid ratio increased linearly and quadratic (p ⁇ 0.001) with increasing Euglena replacement.
- the ratio of acetate to propionate increased linearly (p ⁇ 0.001) and quadratic (p ⁇ 0.002) with increasing Euglena content.
- the pH was also affected by Euglena substitution and increased linearly (p ⁇ 0.001) and quadratic (p ⁇ 0.009) with increasing Euglena substitution.
- the redox potential decreased linearly (p ⁇ 0.001) and quadratic (p ⁇ 0.003).
- the number of protozoa decreased linearly (p ⁇ 0.001) and cubically (p ⁇ 0.047) with increasing Euglena replacement.
- Table 3 shows the effect of Euglena substitution on methane emissions, DM and OM digestibility.
- Methane emissions decreased linearly and nonlinearly (p ⁇ 0.001) with increasing Euglena substitution.
- Carbon dioxide production increased linearly (p ⁇ 0.024) and quadratic (p ⁇ 0.023) when the entire amount of feed was replaced with Euglena.
- In vitro DM digestibility increased linearly (p ⁇ 0.003) and nonlinearly (p ⁇ 0.04) with increasing Euglena replacement.
- OM digestibility increased linearly (p ⁇ 0.001) and nonlinearly (p ⁇ 0.022).
- the number of protozoa in the fourth row from the bottom of Table 2 was also affected by the replacement of Euglena, and was reduced by 14.8-44.8% when Euglena was replaced by 5-100% in the feed (Feed T2-T6). Ammonia nitrogen concentration, volatile fatty acid production, pH and redox potential were not affected when the Euglena alternative was low.
- Euglena suppresses methane production by rumen microorganisms in ruminants. Therefore, it was found that Euglena can be used as a methane production inhibitor. It has also been found that Euglena can be used as a ruminant feed to suppress methane production in rumen ruminants, either added to other feeds or by Euglena alone. Furthermore, it has been found that Euglena has a high nutritional value and digestibility and can be a substitute for a good quality protein supplement in ruminant feed. Therefore, Euglena can be used as a ruminant feed to suppress methane production in ruminant rumen and to improve nutritional value and digestibility, as a substitute for other feeds or by Euglena alone. I found out that
- Euglena when Euglena is used as a ruminant feed to suppress methane production in rumen rumen and improve nutritional value and digestibility, Euglena is 0% Substituting with more and less than 40% concentration, preferably 5-20%, more preferably 5-10% provides methane reduction and improves DM and OM digestibility I understood that.
- concentration preferably 5-20%, more preferably 5-10%
- Euglena content concentration is high, such as 100%, the effect of reducing methane becomes more prominent, but in the generation of volatile fatty acids and the number of protozoa
- Euglena is more than 0% and less than 40%. Is preferably 5-20%, more preferably 5-10%. From this experiment, when replacing Euglena in feed with low concentration (5-10%), DM and OM digestibility are greatly increased without negative effects on rumen fermentation process, and methane emission is optimized It was found that it reduced (9.1%).
- Euglena gracilis Z was used as a Euglena sample.
- Euglena was precultured by the following procedure. 29 ml of CM medium sterilized by autoclave was introduced into a vial sterilized by autoclave, and 1 ml of a culture solution containing Euglena was added. This culture solution was cultured in a thermostatic chamber at 30 ° C. under 5000 lux (the light source was fluorescent lamp Biolux A 20W, NEC) and under air bubbling for about one week.
- the composition of the CM medium used was (NH 4 ) 2 HPO 4 1 g / L, KH 2 PO 4 1 g / L, MgSO 4 ⁇ 7H 2 O 0.2 g / L, CaCl 2 ⁇ 2H 2 O 0.02 g / L , Fe 2 (SO 4 ) 3 ⁇ 7H 2 O 3.0 mg / L, MnCl 2 ⁇ 4H 2 O 1.8 mg / L, CoSO 4 ⁇ 7H 2 O 1.5 mg / L, ZnSO 4 ⁇ 7H 2 O 0.4 mg / L, Na 2 MoO 4 ⁇ 2H 2 O 0.2 mg / L, CuSO 4 5H 2 O 0.02 mg / L, thiamine hydrochloride (vitamin B1) 0.1 mg / L, and cyanocobalamin (vitamin B12) 0.001 mg / L.
- CM medium was prepared with reference to the document of Marian et al. (1952).
- the pH was adjusted to 3.5 by adding concentrated sulfuric acid.
- the culture solution containing Euglena was centrifuged, and the precipitate was washed and lyophilized in vacuo to obtain Euglena powder of the Example.
- Table 4 shows the chemical composition of Euglena powder and basic feed (Guineagrass hay and concentrated feed).
- Table 5 shows the amino acid and fatty acid profiles of Euglena.
- Purified water and mineral block (per 1kg mineral block, 1742 mg iron oxide, 196 mg ferric oxide, 377 mg copper sulfate, 66 mg cobalt sulfate, 1235 mg zinc sulfate, 1046 mg manganese carbonate, 77 mg calcium iodate, 33 mg sodium selenite, and Sodium chloride 971g) was ad libitum.
- Concentrated feed corn meal 510 g / kg, soybean oil residue 240 g / kg, rice bran 210 g / kg, mixture of molasses, calcium carbonate and salt 40 g / kg
- Table 4 shows the chemical composition of the concentrated feed.
- Control feed T2-1 (60% guineagrass hay and 40% concentrate), feed T2-2 (60% guineagrass hay, 35% concentrate and 5% Euglena), feed T2-3 (65% guineagrass hay , 25% concentrate and 10% Euglena), feed T2-4 (68% Guinea grass hay, 17% concentrate and 15% Euglena).
- The% in the feed indicates kg DM relative to the total distribution.
- Euglena powder and concentrated feed were mixed thoroughly in each feed.
- Feeds T2-2 to T2-4 are examples of the methane production inhibitor and ruminant feed of the present invention.
- Feces and urine were collected for 5 days during each cycle (20 days), and stool samples from each feed were mixed after thawing and collected as subsamples. The subsample was dried in a hot air dryer at 60 ° C. for 48 hours for subsequent laboratory analysis and ground to the extent that it passed through a 1 mm sieve.
- Urine was collected in a bucket containing 100 ml of 100 ml / l (v / v) sulfuric acid to lower the pH below 3.0 and prevent the degradation of nitrogen-containing compounds by bacteria. Approximately 50 ml / l urine samples were subsampled and stored at -20 ° C. until nitrogen and GE analysis.
- the crude protein (CP) was estimated to be N ⁇ 6.25 by the Kjeldahl method (984.13) (AOAC, 1995).
- Neutral detergent fiber (NDF), acidic detergent fiber (ADF) and lignin (sa) are obtained from Van Soest et al. (Van Soest, PJ, et al., 1991. J. Dairy Science, vol.74, pp.3583- 3597.) and quantified according to the procedure described in the paper, and the rest was shown as ash.
- the total energy (GE) amount of the sample was analyzed by Shimadzu automatic cylinder calorimeter (CA-4AJ, Shimadzu Corporation).
- the ammonia nitrogen concentration was analyzed by the procedure of Conway et al. (Conway, EJ et al., 1942. Biochem. J., vol. 36, pp. 655-661.).
- ⁇ Amino acid and fatty acid analysis of Euglena> The amino acid and fatty acid profiles of Euglena samples were analyzed at the Japan Food Analysis Center.
- the amino acid composition was measured with an automatic amino acid analyzer (JLC-500 / V, JEOL Ltd., column: LCR-6, 4 mm ⁇ 120 mm ID, JEOL Ltd.) except for tryptophan. Tryptophan is a high performance liquid chromatography (HPLC, LC-20AD, Shimadzu Corporation, column: CAPCELL PAK C18 AQ, 4.6 mm ID x 250 mm, Shiseido Co., Ltd., detector: fluorescence detector, RF-20Axs, ( (Shimadzu Corporation).
- a mixture of perchloric acid and methanol (80:20) was used as mobile phase.
- the flow rate was 0.7 ml / min, and the fluorescence excitation was 285 nm and 40 ° C.
- Euglena fatty acid composition was determined by gas chromatography (GC-1700, Shimadzu Corporation) equipped with a flame ionization detector (FID). Fatty acids were separated with a 30 m ⁇ 0.25 mm ID, DB-23 capillary column.
- Helium was used as the carrier gas, splitlessly injected at 250 ° C, with a flow rate of 1.5 ml / min, and the detector temperature was 250 ° C.
- the test area was considered fixed, while the sheep and period were considered random variables.
- the total number of observations for intake and digestibility is 320 (test section (4) x test animals (4) x period (4) x days of data collection (5)), and the total number of observations for protozoa count is 192 (test Section (4) ⁇ test animal (4) ⁇ period (4) ⁇ data collection days (1) ⁇ repetition (3)). Ruminal pH, ammonia nitrogen, and volatile fatty acids (VFA) were analyzed by repeated measurements using a 4 ⁇ 4 Latin square method. Here, the effect of sampling time and the interaction between test plot and sampling time were included in the model.
- the concentrations of total essential amino acids and total non-essential amino acids in Euglena were 14.3 g / 100 g DM and 14.1 g / 100 g DM, respectively.
- the concentrations of total long chain fatty acids and total medium chain fatty acids contained in Euglena were 13.0 g / 100 g DM and 0.3 g / 100 g DM, respectively.
- the concentrations of total saturated fatty acids and total unsaturated fatty acids in Euglena are 7.4 g / 100 g DM (53 g per 100 g total fatty acids in Euglena) and 5.9 g / 100 g DM (42 g per 100 g total fatty acids in Euglena), respectively. there were.
- the concentrations of total monounsaturated fatty acids and total polyunsaturated fatty acids in Euglena were 4.3 g / 100 g DM and 1.6 g / 100 g DM, respectively.
- DM and OM intake increased linearly (P ⁇ 0.01) and quadratic (P ⁇ 0.01) as the alternative amount of Euglena in sheep diet increased (Table 6).
- Crude protein intake (g / d) increased linearly (P ⁇ 0.01), while NDF intake did not change between Euglena alternative and non-Euglena non-payers (P ⁇ 0.05).
- 150g / kg DM salvage led to significantly lower NDF intake compared to 50g / kg DM and 100g / kg DM (P ⁇ 0.01) (Table 6) .
- ADF intake (g / d) increased linearly and quadraticly (P ⁇ 0.01) with increasing Euglena feeding in sheep feed.
- Apparent CP digestibility increased linearly (P ⁇ 0.01).
- CP loss in urine (as a percentage of total CP intake) was not affected even at high Euglena replacement (150 g / kg DM) (P> 0.05).
- CP loss in feces (as a percentage of total CP intake) decreased linearly (P ⁇ 0.01) with increasing Euglena replacement (Table 8).
- Accumulated CP (g / d) increased linearly (P ⁇ 0.01) and quadratic (P ⁇ 0.05) with increasing Euglena feed (Table 8).
- Euglena has an attractive nutritional profile and can serve as an alternative rich feed in ruminant feed.
- feed containing Euglena up to 150 g / kg DM intake
- DM intake dry matter
- OM intake increased to a maximum of 7.2% and 7.6%, respectively.
- Ruminal ammonia nitrogen concentration is the result of the production, absorption and utilization of ammonia nitrogen by microorganisms (Fiorentini et al., 2015, J. Anim. Sci., Vol.28 (11), pp. 1583-1591.).
- rumen ammonia nitrogen concentration increased by 47.9% and 58.3%, respectively, when Euglena was fed at a dose of 100 g / kg and 150 g / kg of feed.
- This result showed that Euglena feeding increased ammonia nitrogen concentration by 2-4 times when the Euglena alternative was an intake of 100 g / kg DM or more. Consistent with test results. This may be related to Euglena's high nitrogen content and digestibility.
- CP intake was 0.14-0.15 of total DM intake and increased with increasing Euglena replacement.
- Total CP loss was 0.57-0.65 of total CP intake, indicating that most of CP intake was lost via feces.
- CP loss in urine was 0.40-0.46 of total CP intake.
- the data showed that at the highest level of Euglena feeding (150 g / kg DM), the CP loss in urine was 41%, which was unaffected compared to 40% of the control urine CP loss. This indicates that a high level of Euglena replacement (150 g / kg DM) improved the efficiency of CP utilization downstream of the gastrointestinal tract.
- Euglena amino acid and fatty acid profile A well-balanced Euglena amino acid profile enhanced nutrient utilization and absorption efficiency in addition to promoting rumen fermentation.
- a continuous supply of sufficient nitrogen to synthesize other amino acids is essential for maintenance and production (Boisen et al., 2000).
- the Euglena lysine to methionine ratio (7.25: 2.39) was consistent with the ideal amino acid profile (6.7: 2.0) ratio shown by Boisen et al. (2000).
- Euglena has a variety of n-6 and n-3 unsaturated fatty acids (25.9% and 5.1% of total fatty acids in Euglena), which play an important role in improving the nutritional value of livestock products. It has been shown to contain types of fatty acids.
- Euglena has a high nutritional value and protein digestibility and can be a substitute for a good quality protein supplement in ruminant feed.
- Euglena can be used as a ruminant feed to improve nutritional value and protein digestibility in ruminants, either as a substitute for other feeds or by Euglena alone.
- Euglena is preferably used at a concentration of more than 0% and not more than 40%. It was found that substitution with 5-20%, more preferably 5-10%, improved CP digestibility.
- Euglena gracilis Z was used as a Euglena sample.
- Euglena was precultured by the following procedure. 29 ml of CM medium sterilized by autoclave was introduced into a vial sterilized by autoclave, and 1 ml of a culture solution containing Euglena was added. This culture solution was cultured in a thermostatic chamber at 30 ° C. under 5000 lux (the light source was fluorescent lamp Biolux A 20W, NEC) and under air bubbling for about one week.
- the composition of the CM medium used was (NH 4 ) 2 HPO 4 1 g / L, KH 2 PO 4 1 g / L, MgSO 4 ⁇ 7H 2 O 0.2 g / L, CaCl 2 ⁇ 2H 2 O 0.02 g / L , Fe 2 (SO 4 ) 3 ⁇ 7H 2 O 3.0 mg / L, MnCl 2 ⁇ 4H 2 O 1.8 mg / L, CoSO 4 ⁇ 7H 2 O 1.5 mg / L, ZnSO 4 ⁇ 7H 2 O 0.4 mg / L, Na 2 MoO 4 ⁇ 2H 2 O 0.2 mg / L, CuSO 4 5H 2 O 0.02 mg / L, thiamine hydrochloride (vitamin B1) 0.1 mg / L, and cyanocobalamin (vitamin B12) 0.001 mg / L.
- CM medium was prepared with reference to the document of Marian et al. (1952). The pH was adjusted to 3.5 by adding concentrated sulfuric acid. After culturing, the culture solution containing Euglena was centrifuged, and the precipitate was washed and lyophilized in vacuo to obtain Euglena powder of the Example. Table 10 shows the chemical composition of Euglena powder and basic feed (Guinea grass hay and concentrated feed).
- the control feed was 70% guineagrass hay and 30% concentrated feed, and the test feed was 70% guineagrass hay, 15% concentrated feed and 15% euglena.
- The% in feed indicates kg in dry matter relative to the total ration.
- Euglena powder and concentrate were mixed thoroughly in each feed.
- Table 11 shows the effect of Euglena feeding on methane emissions from sheep. Methane emissions from sheep were 31.83 L per day in the control plot and 23.95 L in the test plot. These values were significantly different at a risk rate of 1%. The replacement of 15% concentrate and Euglena per dry matter in the feed would reduce methane emissions from sheep by 18% compared to concentrate alone.
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Abstract
ユーグレナを有効成分とする新規なメタン生成抑制剤、反芻動物用飼料及びメタン生成抑制方法を提供する。 ユーグレナを有効成分として含むメタン生成抑制剤である。また、反芻動物に投与するためのユーグレナを有効成分として含むメタン生成抑制剤である。ユーグレナを有効成分として含むメタン生成抑制剤を含む反芻動物用飼料であり、反芻動物のルーメンにおける前記飼料の消化率を改善する消化率改善剤としても用いることができる。
Description
本発明は、メタン生成抑制剤、反芻動物用飼料、メタン生成抑制方法及び蛋白質消化率改善方法に関する。
近年、家畜のメタン及び二酸化炭素等の温室効果ガスの排出による環境汚染が重要な関心事の一つになっている。
これらの温室効果ガスのうちメタンは、メタン生成菌（メタン菌）によるメタン発酵によって生成し、主に環境中では、反芻動物の胃（ルーメン）や水田からメタンが発生することが知られている。
反芻動物は、草等の食物を、最初に、反芻胃として知られている第一胃内で軟化して、次に反芻食塊として知られている半消化塊を吐き戻し、それを再度噛みくだくことで消化する。
反芻動物のルーメン内等に生息するメタン生成菌は、嫌気条件下でメタンを合成する。反芻動物の胃では草などを消化する段階で有機酸が生成し、この生成段階で発生する水素イオンがメタン生成菌によってメタンに変換される。
これらの温室効果ガスのうちメタンは、メタン生成菌（メタン菌）によるメタン発酵によって生成し、主に環境中では、反芻動物の胃（ルーメン）や水田からメタンが発生することが知られている。
反芻動物は、草等の食物を、最初に、反芻胃として知られている第一胃内で軟化して、次に反芻食塊として知られている半消化塊を吐き戻し、それを再度噛みくだくことで消化する。
反芻動物のルーメン内等に生息するメタン生成菌は、嫌気条件下でメタンを合成する。反芻動物の胃では草などを消化する段階で有機酸が生成し、この生成段階で発生する水素イオンがメタン生成菌によってメタンに変換される。
ルーメン内の微生物によるメタン発酵はルーメン環境を安定させる重要な役割があるが、有機物が本来持つエネルギーの相当部分がメタンとして排出されることは、宿主動物が得られるはずのエネルギーから損失が生じていることになる。
以上のように、反芻胃発酵におけるメタン生成抑制に対して解決策を見つけることが、環境保護及び栄養利用の両面において課題となっている。
以上のように、反芻胃発酵におけるメタン生成抑制に対して解決策を見つけることが、環境保護及び栄養利用の両面において課題となっている。
そこで反芻動物のメタン生成を抑制する技術が種々開発されており、これまで、システインを用いる方法（特許文献１）、枯草菌，乳酸菌，細菌などを利用する方法（特許文献２）などが報告されている。
また、牛などの反芻動物の食餌には、反芻動物が本来食する牧草などである粗飼料と、反芻動物を人工的に効率よく生育させるために蛋白質等が多く含まれた濃厚飼料がある。反芻動物が供給する肉や乳の適切な発育のために、十分な量の蛋白質が必要であり、蛋白質源として、低コストな魚粉や肉骨粉が使用されていた。しかし、牛海綿状脳症（BSE）等の伝染性海綿状脳症の発生を予防するため、「反すう動物用飼料への動物由来たんぱく質混入に関するガイドライン」が制定された（非特許文献１）。
このガイドラインでは、反芻動物（牛、めん羊、山羊、鹿）用飼料（Ａ飼料）について、動物性の蛋白質（肉骨粉、血粉、魚粉、チキンミール等）が含まれないように製造、輸入、流通、保管、管理されなければならないことが規定されている。
従って、動物性の蛋白質を含まず、反芻動物に対して効率よく蛋白質を供給可能な反芻動物用飼料が望まれている。
従って、動物性の蛋白質を含まず、反芻動物に対して効率よく蛋白質を供給可能な反芻動物用飼料が望まれている。
「反すう動物用飼料への反すう動物等由来たん白質の混入防止に関するガイドライン」、平成15年9月16日付15消安第1570号
しかし、ユーグレナを反芻動物に摂取させることにより、反芻胃におけるメタン生成を抑制する技術は知られていない。
本発明は、上記の課題に鑑みてなされたものであり、本発明の目的は、ユーグレナを有効成分とする新規なメタン生成抑制剤、反芻動物用飼料及びメタン生成抑制方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、メタン生成を抑制すると共に、反芻動物のルーメンにおける消化率を改善可能なメタン生成抑制剤、反芻動物用飼料及びメタン生成抑制方法を提供することにある。
本発明は、上記の課題に鑑みてなされたものであり、本発明の目的は、ユーグレナを有効成分とする新規なメタン生成抑制剤、反芻動物用飼料及びメタン生成抑制方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、メタン生成を抑制すると共に、反芻動物のルーメンにおける消化率を改善可能なメタン生成抑制剤、反芻動物用飼料及びメタン生成抑制方法を提供することにある。
本発明者らは、反芻動物のメタン生成を抑制する方法について、種々の物質を用いて検討を重ねていたところ、ユーグレナに、メタン生成菌のメタン生成を抑制する作用があることを見出し、本発明をするに至った。
つまり、前記課題は、本発明によれば、ユーグレナを有効成分として含むメタン生成抑制剤により解決される。
このとき、反芻動物に投与するためのメタン生成抑制剤とすることができる。
また、前記メタン生成抑制剤を含む反芻動物用飼料とすることができる。
このように構成しているため、メタンの生成を抑制できると共に、ヒトの食品として安全性が確認されて市場に流通されているユーグレナを用いるため、飼料としての安全性が高く、牛乳や牛肉への有害物質の蓄積等の影響もないメタン生成抑制剤を提供できる。
つまり、前記課題は、本発明によれば、ユーグレナを有効成分として含むメタン生成抑制剤により解決される。
このとき、反芻動物に投与するためのメタン生成抑制剤とすることができる。
また、前記メタン生成抑制剤を含む反芻動物用飼料とすることができる。
このように構成しているため、メタンの生成を抑制できると共に、ヒトの食品として安全性が確認されて市場に流通されているユーグレナを用いるため、飼料としての安全性が高く、牛乳や牛肉への有害物質の蓄積等の影響もないメタン生成抑制剤を提供できる。
また、前記反芻動物のルーメンにおける前記飼料の消化率を改善する消化率改善剤として用いられる反芻動物用飼料とすることができる。
また、前記ユーグレナを、０重量％より多く、かつ２０重量％未満含有する前記反芻動物用飼料とすることができる。
このように構成しているため、メタン生成抑制剤及び飼料の消化率改善剤としての二つの機能を併せ持った反芻動物用飼料の提供が可能となる。
また、反芻動物用飼料を、反芻動物に経口的に摂取させて、前記反芻動物の反芻胃内のメタン生成を抑制するメタン生成抑制方法とすることができる。
また、前記ユーグレナを、０重量％より多く、かつ２０重量％未満含有する前記反芻動物用飼料とすることができる。
このように構成しているため、メタン生成抑制剤及び飼料の消化率改善剤としての二つの機能を併せ持った反芻動物用飼料の提供が可能となる。
また、反芻動物用飼料を、反芻動物に経口的に摂取させて、前記反芻動物の反芻胃内のメタン生成を抑制するメタン生成抑制方法とすることができる。
また、前記反芻動物における前記飼料の蛋白質消化率を改善する蛋白質消化率改善剤として用いられる反芻動物用飼料とすることができる。
また、前記ユーグレナを、０重量％より多く、かつ２０重量％未満含有する前記反芻動物用飼料とすることができる。
このように構成しているため、メタン生成抑制剤及び飼料の蛋白質消化率改善剤としての二つの機能を併せ持った反芻動物用飼料の提供が可能となる。
また、反芻動物用飼料を、反芻動物に経口的に摂取させて、前記反芻動物における蛋白質の消化率を改善する蛋白質消化率改善方法とすることができる。
また、前記ユーグレナを、０重量％より多く、かつ２０重量％未満含有する前記反芻動物用飼料とすることができる。
このように構成しているため、メタン生成抑制剤及び飼料の蛋白質消化率改善剤としての二つの機能を併せ持った反芻動物用飼料の提供が可能となる。
また、反芻動物用飼料を、反芻動物に経口的に摂取させて、前記反芻動物における蛋白質の消化率を改善する蛋白質消化率改善方法とすることができる。
本発明によれば、メタンの生成を抑制できると共に、ヒトの食品として市場に流通されているユーグレナを用いるため、飼料としての安全性が高く、牛乳や牛肉への有害物質の蓄積等の影響もないメタン生成抑制剤を提供できる。
本発明は、ユーグレナを有効成分として含むメタン生成抑制剤、反芻動物用飼料及び反芻動物用飼料を反芻動物に経口的に摂取させて、前記反芻動物の反芻胃内のメタン生成を抑制するメタン生成抑制方法に関する。以下、本発明に係るメタン生成抑制剤、反芻動物用飼料及びメタン生成抑制方法について、詳細に説明する。
本明細書において反芻動物とは、草等の食物を、最初に、反芻胃として知られている第一胃内で軟化して、次に反芻食塊として知られている半消化塊を吐き戻し、それを再度噛みくだくことで消化する偶蹄目の哺乳類である。反芻食塊を再度噛みくだいて植物材料をさらに分解し、消化を促進する過程は、「反芻」と称される。反芻哺乳類としては、畜牛、ヤギ、ヒツジ、キリン、アメリカバイソン、ヨーロッパバイソン、ヤク、水牛、シカ、ラクダ、アルパカ、ラマ、ヌー、カモシカ、プロングホーン、およびニルガイが挙げられる。
本明細書においてルーメンとは、反芻動物の第一胃をいう。第一胃には、細菌、原虫、真菌が生息している。細菌は飼料中の糖やデンプンそして繊維を分解し、その代謝産物として生成される揮発性脂肪酸（酢酸、プロピオン酸、酪酸など）がルーメン壁から吸収され、それが牛の主要なエネルギー源として利用される。
本明細書において反芻動物とは、草等の食物を、最初に、反芻胃として知られている第一胃内で軟化して、次に反芻食塊として知られている半消化塊を吐き戻し、それを再度噛みくだくことで消化する偶蹄目の哺乳類である。反芻食塊を再度噛みくだいて植物材料をさらに分解し、消化を促進する過程は、「反芻」と称される。反芻哺乳類としては、畜牛、ヤギ、ヒツジ、キリン、アメリカバイソン、ヨーロッパバイソン、ヤク、水牛、シカ、ラクダ、アルパカ、ラマ、ヌー、カモシカ、プロングホーン、およびニルガイが挙げられる。
本明細書においてルーメンとは、反芻動物の第一胃をいう。第一胃には、細菌、原虫、真菌が生息している。細菌は飼料中の糖やデンプンそして繊維を分解し、その代謝産物として生成される揮発性脂肪酸（酢酸、プロピオン酸、酪酸など）がルーメン壁から吸収され、それが牛の主要なエネルギー源として利用される。
ルーメン内のような高度な嫌気環境では酸素などの電子受容体が十分に存在しないため、ルーメン微生物による有機物分解（嫌気発酵）では通常の酸素呼吸と異なり、有機物が完全に二酸化炭素と水まで分解されない。嫌気発酵における炭水化物の酸化過程で生じる還元等量（電子）は2e- + 2H+→H2の反応によって処理され、生じたH2の大部分はすみやかにメタン発酵に用いられて処理される。
この結果ルーメン内H2分圧は非常に低く抑えられるため、メタン発酵は嫌気発酵プロセスを効率的に進めるために重要な意味を持っている。
ルーメン発酵におけるメタン生成を抑制する技術が種々提案されているが、上述のように単にメタンの生成を抑えるだけではルーメン内の水素の行き場がなくなり、せっかく精密に制御されている発酵が円滑に進まなくなってかえって効率が悪くなる場合も少なくない。
この結果ルーメン内H2分圧は非常に低く抑えられるため、メタン発酵は嫌気発酵プロセスを効率的に進めるために重要な意味を持っている。
ルーメン発酵におけるメタン生成を抑制する技術が種々提案されているが、上述のように単にメタンの生成を抑えるだけではルーメン内の水素の行き場がなくなり、せっかく精密に制御されている発酵が円滑に進まなくなってかえって効率が悪くなる場合も少なくない。
本明細書においてDMとは、乾物（Dry Matter）の略語であり、飼料を一定温度で加熱乾燥したものを乾物とみなす。
本明細書においてOMとは、有機物（Organic Matter）の略語である。
本明細書においてAshとは、灰分をいう。
本明細書においてCPとは、粗蛋白質（Crude Protein）の略語であって、飼料の一般成分の一つである。粗蛋白質には蛋白質以外のアンモニア、アミド、アミノ酸なども含まれる。
本明細書においてGEとは、総エネルギー（Gross Energy）の略語であって、有機物を酸素の存在下で完全に燃焼したときの発熱量である。
本明細書においてOMとは、有機物（Organic Matter）の略語である。
本明細書においてAshとは、灰分をいう。
本明細書においてCPとは、粗蛋白質（Crude Protein）の略語であって、飼料の一般成分の一つである。粗蛋白質には蛋白質以外のアンモニア、アミド、アミノ酸なども含まれる。
本明細書においてGEとは、総エネルギー（Gross Energy）の略語であって、有機物を酸素の存在下で完全に燃焼したときの発熱量である。
本明細書においてEEとは、エーテル抽出物（Ether Extract）の略語であり、粗脂肪に該当する。
本明細書においてNDFとは、中性デタージェント繊維（Neutral Detergent Fiber）の略語であって、飼料を中性洗剤で処理して残ったリグニン,セルロース,ヘミセルロースの全繊維である。飼料中の繊維の総量を示す。飼料のガサを推定するのに都合の良い指標である。
本明細書においてADFとは、酸性デタージェント繊維（acid detergent fiber）の略語であって、飼料を酸性処理して繊維成分を分離して残ったリグニン,セルロースである。不消化のリグニンが正確に含まれるので消化率の測定に役立つ指標である。
本明細書においてNDFとは、中性デタージェント繊維（Neutral Detergent Fiber）の略語であって、飼料を中性洗剤で処理して残ったリグニン,セルロース,ヘミセルロースの全繊維である。飼料中の繊維の総量を示す。飼料のガサを推定するのに都合の良い指標である。
本明細書においてADFとは、酸性デタージェント繊維（acid detergent fiber）の略語であって、飼料を酸性処理して繊維成分を分離して残ったリグニン,セルロースである。不消化のリグニンが正確に含まれるので消化率の測定に役立つ指標である。
本明細書においてVFAとは、揮発性脂肪酸（Volatile Fatty Acid）の略語であり、飼料がルーメン内で微生物による分解発酵作用を受けたときに生成する揮発性で分子量の小さい脂肪酸である。主要な酸は、酢酸、プロピオン酸、酪酸である。
文中で特に断らない限り、本明細書で用いるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解される意味と同様の意味を有する。本明細書に記載されたものと同様又は同等の任意の方法及び材料は、本発明の実施又は試験において使用することができるが、好ましい方法及び材料を以下に記載する。
文中で特に断らない限り、本明細書で用いるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解される意味と同様の意味を有する。本明細書に記載されたものと同様又は同等の任意の方法及び材料は、本発明の実施又は試験において使用することができるが、好ましい方法及び材料を以下に記載する。
●メタン生成抑制剤
本発明のメタン生成抑制剤は、ユーグレナを有効成分として含む。
＜ユーグレナ＞
本発明の「ユーグレナ」とは、動物学や植物学の分類でユーグレナ属（Euglena）に分類される植物、その変種、その変異種のすべてを含む微生物を意味する。
本発明のメタン生成抑制剤は、ユーグレナを有効成分として含む。
＜ユーグレナ＞
本発明の「ユーグレナ」とは、動物学や植物学の分類でユーグレナ属（Euglena）に分類される植物、その変種、その変異種のすべてを含む微生物を意味する。
ここで、ユーグレナ属（Euglena）の微生物とは、動物学では原生動物門（Protozoa）の鞭毛虫綱（Mastigophorea）、植物鞭毛虫亜綱（Phytomastigophorea）に属するミドリムシ目（Euglenida）のユーグレノイディナ亜目（Euglenoidina）に属する微生物である。一方、ユーグレナ属の微生物は、植物学ではミドリムシ植物門（Euglenophyta）のミドリムシ藻類綱（Euglenophyceae）に属するミドリムシ目（Euglenales）に属している。
ユーグレナ属の微生物としては、具体的には、Euglena acus、Euglena caudata、Euglena chadefaudii、Euglena deses、Euglena gracilis、Euglena granulata、Euglena intermedia、Euglena mutabilis、Euglena oxyuris、Euglena proxima、Euglena spirogyra、Euglena viridis、Euglena vermiformis、Euglena intermedia, Euglena pirideなどが挙げられる。このうち特に、広く研究に利用されているユーグレナ グラシリス（Euglena gracilis）が好適である。特に、ユーグレナ・グラシリス（E. gracilis）Ｚ株が挙げられる。
また、そのほか、ユーグレナ・グラシリス（E. gracilis）Ｚ株の変異株ＳＭ－ＺＫ株（葉緑体欠損株）や変種のvar. bacillaris、これらの種の葉緑体の変異株等の遺伝子変異株を用いてもよい。また、その他のユーグレナ類、例えばAstaia longaを用いてもよい。
ユーグレナ属は、池や沼などの淡水中に広く分布しており、これらから分離して使用してもよく、また、すでに単離されている任意のユーグレナ属を使用してもよい。
本発明のユーグレナ属は、その全ての変異株を包含する。また、これらの変異株の中には、遺伝的方法、たとえば組換え，形質導入，形質転換等により得られたものも含有される。
また、そのほか、ユーグレナ・グラシリス（E. gracilis）Ｚ株の変異株ＳＭ－ＺＫ株（葉緑体欠損株）や変種のvar. bacillaris、これらの種の葉緑体の変異株等の遺伝子変異株を用いてもよい。また、その他のユーグレナ類、例えばAstaia longaを用いてもよい。
ユーグレナ属は、池や沼などの淡水中に広く分布しており、これらから分離して使用してもよく、また、すでに単離されている任意のユーグレナ属を使用してもよい。
本発明のユーグレナ属は、その全ての変異株を包含する。また、これらの変異株の中には、遺伝的方法、たとえば組換え，形質導入，形質転換等により得られたものも含有される。
ユーグレナ細胞の培養において、培養液としては、例えば、窒素源，リン源，ミネラルなどの栄養塩類を添加した培養液、例えば、改変Cramer-Myers培地（（ＮＨ４）２ＨＰＯ４ １．０ｇ／Ｌ，ＫＨ２ＰＯ４ １．０ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．２ｇ／Ｌ，ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．０２ｇ／Ｌ，Ｆｅ２（ＳＯ２）３・７Ｈ２Ｏ ３ｍｇ／Ｌ，ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ １．８ｍｇ／Ｌ，ＣｏＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １．５ｍｇ／Ｌ，ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．４ｍｇ／Ｌ，Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ ０．２ｍｇ／Ｌ，ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０．０２ｇ／Ｌ，チアミン塩酸塩（ビタミンＢ１） ０．１ｍｇ／Ｌ，シアノコバラミン（ビタミンＢ１２）、（ｐＨ３．５））を用いることができる。なお、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４は、（ＮＨ４）２ＳＯ４やＮＨ３ａｑに変換することも可能である。また、そのほか、ユーグレナ 生理と生化学（北岡正三郎編、株式会社学会出版センター）の記載に基づき調製される公知のHutner培地，Koren-Hutner培地を用いてもよい。ユーグレナの従属栄養培地として一般的に使用されるKoren-Hutner培地からグルコース、リンゴ酸、アミノ酸等の従属栄養成分を除いた独立栄養培地であるＡＹ培地等を用いてもよい。
培養液のｐＨは好ましくは２以上、より好ましくは３以上、更に好ましくは３．５以上であり、また、その上限は、好ましくは７以下、より好ましくは６．５以下、更に好ましくは４．５以下である。ｐＨを酸性側にすることにより、光合成微生物は他の微生物よりも優勢に生育することができるため、コンタミネーションを抑制することができる。
ユーグレナ細胞の培養は、太陽光を直接利用するオープンポンド方式、集光装置で集光した太陽光を光ファイバー等で送り、培養槽で照射させ光合成に利用する集光方式等により行ってもよい。
また、ユーグレナ細胞の培養は、例えば供給バッチ法を用いて行われ得るが、フラスコ培養や発酵槽を用いた培養，回分培養法，半回分培養法（流加培養法），連続培養法（灌流培養法）等、いずれの液体培養法により行ってもよい。
ユーグレナ細胞の培養は、太陽光を直接利用するオープンポンド方式、集光装置で集光した太陽光を光ファイバー等で送り、培養槽で照射させ光合成に利用する集光方式等により行ってもよい。
また、ユーグレナ細胞の培養は、例えば供給バッチ法を用いて行われ得るが、フラスコ培養や発酵槽を用いた培養，回分培養法，半回分培養法（流加培養法），連続培養法（灌流培養法）等、いずれの液体培養法により行ってもよい。
培養は、オープンポンド型，レースウェイ型，チューブ型等の公知の培養装置や、坂口フラスコ、三角フラスコ、試薬ビンなどの実験用の培養容器を用いて行うことができる。ユーグレナはＣＯ２を資化するため、独立栄養培地であるCramer-Myers培地を用いて培養する場合は１～５％ＣＯ２を含む空気を培地中に通過させることが好ましい。また、さらに、葉緑体を十分に発達させるために、培地１リットルあたり１～５ｇ程度のリン酸アンモニウムを加えるとよい。培養温度は、通常２０～３４℃で、特に２８～３０℃が好適である。また、培養条件にもよるが、ユーグレナは通常、培養開始後２～３日で対数増殖期となり、４～５日程度で定常期に到達する。
ユーグレナは、光照射下で培養（明培養）されてもよく、無照射で培養（暗培養）されてもよい。
ユーグレナは、光照射下で培養（明培養）されてもよく、無照射で培養（暗培養）されてもよい。
ユーグレナ細胞の分離は、例えば、培養液の遠心分離または単純な沈降，膜濾過等によって行われる。
ユーグレナの藻体乾燥物は、分離されたユーグレナ細胞を洗浄後、公知の方法で真空凍結乾燥することにより調製される。但し、藻体乾燥物の調整は、噴霧乾燥、加熱真空乾燥等により行ってもよい。
本発明のメタン生成抑制剤は、ユーグレナとして、遠心分離，沈降，膜濾過等により培養液から分離したユーグレナの藻体を用いてもよいし、藻体乾燥物を用いてもよい。また、藻体乾燥物を、公知の粉砕機で粉砕したユーグレナの乾燥粉砕物を用いてもよい。
本発明のメタン生成抑制剤は、ユーグレナを有効成分として、他の飼料に混合されていてもよいし、ユーグレナのみから構成されていてもよい。
ユーグレナは、反芻動物のルーメンにおける飼料の消化率を改善する機能を有するため、本発明のメタン生成抑制剤は、反芻動物のルーメンにおける飼料の消化率を改善する消化率改善剤として用いることができる。
ユーグレナは、反芻動物における飼料の蛋白質の消化率を改善する機能を有するため、本発明のメタン生成抑制剤は、反芻動物における飼料の蛋白質消化率を改善する蛋白質消化率改善剤として用いることができる。
ユーグレナの藻体乾燥物は、分離されたユーグレナ細胞を洗浄後、公知の方法で真空凍結乾燥することにより調製される。但し、藻体乾燥物の調整は、噴霧乾燥、加熱真空乾燥等により行ってもよい。
本発明のメタン生成抑制剤は、ユーグレナとして、遠心分離，沈降，膜濾過等により培養液から分離したユーグレナの藻体を用いてもよいし、藻体乾燥物を用いてもよい。また、藻体乾燥物を、公知の粉砕機で粉砕したユーグレナの乾燥粉砕物を用いてもよい。
本発明のメタン生成抑制剤は、ユーグレナを有効成分として、他の飼料に混合されていてもよいし、ユーグレナのみから構成されていてもよい。
ユーグレナは、反芻動物のルーメンにおける飼料の消化率を改善する機能を有するため、本発明のメタン生成抑制剤は、反芻動物のルーメンにおける飼料の消化率を改善する消化率改善剤として用いることができる。
ユーグレナは、反芻動物における飼料の蛋白質の消化率を改善する機能を有するため、本発明のメタン生成抑制剤は、反芻動物における飼料の蛋白質消化率を改善する蛋白質消化率改善剤として用いることができる。
●反芻動物用飼料
本発明の反芻動物用飼料は、ユーグレナを有効成分として含む。
ユーグレナとして、遠心分離，沈降，膜濾過等により培養液から分離したユーグレナの藻体を用いてもよいし、藻体乾燥物を用いてもよい。また、藻体乾燥物を、公知の粉砕機で粉砕したユーグレナの乾燥粉砕物を用いてもよい。
本発明の反芻動物用飼料は、ユーグレナを有効成分として、他の飼料に混合されていてもよいし、ユーグレナのみから構成されていてもよい。
ユーグレナは、濃厚飼料，穀物，油粕等の蛋白質を反芻動物に与えることを目的として給餌される蛋白質含有飼料の全量又は一部の量を代替するために用いることができる。
ユーグレナは、植物性の蛋白質源を反芻動物に与えるための、植物性の蛋白質サプリメントとして利用することができる。
ユーグレナは、反芻動物のルーメンにおける飼料の消化率を改善する機能を有するため、本発明の反芻動物用飼料は、反芻動物のルーメンにおける飼料の消化率を改善する消化率改善剤として用いることができる。
ユーグレナは、反芻動物における飼料の蛋白質の消化率を改善する機能を有するため、本発明の反芻動物用飼料は、反芻動物における飼料の蛋白質消化率を改善する蛋白質消化率改善剤として用いることができる。
本発明の反芻動物用飼料は、ユーグレナを有効成分として含む。
ユーグレナとして、遠心分離，沈降，膜濾過等により培養液から分離したユーグレナの藻体を用いてもよいし、藻体乾燥物を用いてもよい。また、藻体乾燥物を、公知の粉砕機で粉砕したユーグレナの乾燥粉砕物を用いてもよい。
本発明の反芻動物用飼料は、ユーグレナを有効成分として、他の飼料に混合されていてもよいし、ユーグレナのみから構成されていてもよい。
ユーグレナは、濃厚飼料，穀物，油粕等の蛋白質を反芻動物に与えることを目的として給餌される蛋白質含有飼料の全量又は一部の量を代替するために用いることができる。
ユーグレナは、植物性の蛋白質源を反芻動物に与えるための、植物性の蛋白質サプリメントとして利用することができる。
ユーグレナは、反芻動物のルーメンにおける飼料の消化率を改善する機能を有するため、本発明の反芻動物用飼料は、反芻動物のルーメンにおける飼料の消化率を改善する消化率改善剤として用いることができる。
ユーグレナは、反芻動物における飼料の蛋白質の消化率を改善する機能を有するため、本発明の反芻動物用飼料は、反芻動物における飼料の蛋白質消化率を改善する蛋白質消化率改善剤として用いることができる。
●メタン生成抑制方法
本発明のメタン生成抑制方法では、前記反芻動物用飼料を、反芻動物に経口的に摂取させて、前記反芻動物の反芻胃内のメタン生成を抑制する。反芻動物用飼料は、水やミネラルブロックと共に、反芻動物に自由摂取させてもよい。
また、ユーグレナは、反芻動物のルーメンにおける飼料の消化率を改善する機能を有するため、本発明のメタン生成抑制方法では、メタン生成を抑制すると同時に、反芻動物のルーメンにおける飼料の消化率も改善する。
さらに、ユーグレナは、反芻動物における飼料の蛋白質の消化率を改善する機能を有するため、本発明のメタン生成抑制方法では、メタン生成を抑制すると同時に、反芻動物における飼料の蛋白質消化率も改善する。
本発明のメタン生成抑制方法では、前記反芻動物用飼料を、反芻動物に経口的に摂取させて、前記反芻動物の反芻胃内のメタン生成を抑制する。反芻動物用飼料は、水やミネラルブロックと共に、反芻動物に自由摂取させてもよい。
また、ユーグレナは、反芻動物のルーメンにおける飼料の消化率を改善する機能を有するため、本発明のメタン生成抑制方法では、メタン生成を抑制すると同時に、反芻動物のルーメンにおける飼料の消化率も改善する。
さらに、ユーグレナは、反芻動物における飼料の蛋白質の消化率を改善する機能を有するため、本発明のメタン生成抑制方法では、メタン生成を抑制すると同時に、反芻動物における飼料の蛋白質消化率も改善する。
以下、具体的実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
＜＜実験例１：メタン生成抑制試験＞＞
実験例１では、ユーグレナ含有飼料を牛のルーメン液サンプルと共にインキュベートし、メタン生成，栄養消化率等に対するユーグレナを代替した際の効果についてin vitroにて確認した。
＜ユーグレナ粉末の調製＞
実験例１のユーグレナ粉末を得るために、ユーグレナの試料として、Euglena gracilis Zを用いた。まず、次の手順により、ユーグレナの前培養を行った。
オートクレーブにより滅菌したＣＭ培地29mlを、同じくオートクレーブにより滅菌済みのバイアルに導入し、ユーグレナを含む培養液1mlを加えた。この培養液を、30℃恒温槽中にて、5000lux下（光源は蛍光灯ビオルックスA 20W,NEC）、空気バブリング下にて１週間程度培養した。
使用したＣＭ培地の組成は、(NH4)2HPO4 1 g/L，KH2PO4 1 g/L，MgSO4・7H2O 0.2 g/L，CaCl2・2H2O 0.02 g/L，Fe2(SO4)3・7H2O 3.0 mg/L，MnCl2・4H2O 1.8 mg/L，CoSO4・7H2O 1.5 mg/L，ZnSO4・7H2O 0.4 mg/L，Na2MoO4・2H2O 0.2 mg/L，CuSO45H2O 0.02 mg/L，チアミン塩酸塩（ビタミンB1）0.1 mg/L，シアノコバラミン(ビタミンB12)0.001 mg/Lであった。CM培地はMarianら(1952)の文献を参考にして作製した。また、濃硫酸を加えることによってpHを3.5に調整した。
培養後、ユーグレナを含む培養液を、遠心分離し、沈殿物を洗浄、真空凍結乾燥して、実施例のユーグレナ粉末を得た。
＜＜実験例１：メタン生成抑制試験＞＞
実験例１では、ユーグレナ含有飼料を牛のルーメン液サンプルと共にインキュベートし、メタン生成，栄養消化率等に対するユーグレナを代替した際の効果についてin vitroにて確認した。
＜ユーグレナ粉末の調製＞
実験例１のユーグレナ粉末を得るために、ユーグレナの試料として、Euglena gracilis Zを用いた。まず、次の手順により、ユーグレナの前培養を行った。
オートクレーブにより滅菌したＣＭ培地29mlを、同じくオートクレーブにより滅菌済みのバイアルに導入し、ユーグレナを含む培養液1mlを加えた。この培養液を、30℃恒温槽中にて、5000lux下（光源は蛍光灯ビオルックスA 20W,NEC）、空気バブリング下にて１週間程度培養した。
使用したＣＭ培地の組成は、(NH4)2HPO4 1 g/L，KH2PO4 1 g/L，MgSO4・7H2O 0.2 g/L，CaCl2・2H2O 0.02 g/L，Fe2(SO4)3・7H2O 3.0 mg/L，MnCl2・4H2O 1.8 mg/L，CoSO4・7H2O 1.5 mg/L，ZnSO4・7H2O 0.4 mg/L，Na2MoO4・2H2O 0.2 mg/L，CuSO45H2O 0.02 mg/L，チアミン塩酸塩（ビタミンB1）0.1 mg/L，シアノコバラミン(ビタミンB12)0.001 mg/Lであった。CM培地はMarianら(1952)の文献を参考にして作製した。また、濃硫酸を加えることによってpHを3.5に調整した。
培養後、ユーグレナを含む培養液を、遠心分離し、沈殿物を洗浄、真空凍結乾燥して、実施例のユーグレナ粉末を得た。
実施例1のユーグレナ粉末の化学的組成を、後述する飼料の化学的組成と共に、表1に示す。表1中、左端欄が、実施例のユーグレナ粉末の化学的組成である。
＜ルーメン液の採取＞
ルーメン液提供動物として、2頭のフィステル装着ホルスタイン乾乳牛（平均体重600kg）を使用した。牛は、一日あたり10kgのオーチャードグラス乾草（OM 980g/kg, CP 132 g/kg, NDF 701 g/kg, ADF 354 g/kg,リグニン 40 g/kg,及びGE 18.02MJ/kgDM）が毎日給与され、清浄水及びミネラルブロック(Fe 1836 mg, Cu 377 mg, Co 66 mg, Mg 1046 mg, Zn 1235 mg, I 77 mg, Se 33 mg, ビタミンE 5000 mg, NaCl 962g/3kg)は、自由摂取とした。ルーメン液は、朝の飼料給与前に、真空ラインを用いて二頭の牛から採取し、ナイロン布で濾過し、沸騰水で39℃に予熱した魔法瓶に入れた。二頭の牛のサンプルは、均等な割合で混合し、１時間連続的にCO2を流した。本実験の動物管理及び採取の処置は、帯広畜産大学の動物の管理及び使用に関する委員会により承認された。
ルーメン液提供動物として、2頭のフィステル装着ホルスタイン乾乳牛（平均体重600kg）を使用した。牛は、一日あたり10kgのオーチャードグラス乾草（OM 980g/kg, CP 132 g/kg, NDF 701 g/kg, ADF 354 g/kg,リグニン 40 g/kg,及びGE 18.02MJ/kgDM）が毎日給与され、清浄水及びミネラルブロック(Fe 1836 mg, Cu 377 mg, Co 66 mg, Mg 1046 mg, Zn 1235 mg, I 77 mg, Se 33 mg, ビタミンE 5000 mg, NaCl 962g/3kg)は、自由摂取とした。ルーメン液は、朝の飼料給与前に、真空ラインを用いて二頭の牛から採取し、ナイロン布で濾過し、沸騰水で39℃に予熱した魔法瓶に入れた。二頭の牛のサンプルは、均等な割合で混合し、１時間連続的にCO2を流した。本実験の動物管理及び採取の処置は、帯広畜産大学の動物の管理及び使用に関する委員会により承認された。
＜実験処理及びin vitro発酵＞
実験試料は60℃のオーブンで48時間乾燥し、乾燥低温下、密閉容器内で貯蔵した。
一方、異なる量のユーグレナ，クレイン(Panicum coloratum)グラス乾草及び濃厚飼料を含む6種類の飼料Ｔ１～Ｔ６を準備した。
飼料Ｔ１は、コントロールであって、クレイングラス乾草6g，濃厚飼料4gからなり、飼料Ｔ２は、クレイングラス乾草6g，濃厚飼料3.5g，ユーグレナ0.5gからなり、飼料Ｔ３は、クレイングラス乾草6g，濃厚飼料3g，ユーグレナ1gからなり、飼料Ｔ４は、クレイングラス乾草6g，濃厚飼料2g，ユーグレナ2gからなり、飼料Ｔ５は、クレイングラス乾草6g，ユーグレナ4gからなり、飼料Ｔ６は、ユーグレナ10gからなっていた。飼料Ｔ２～Ｔ６が、本発明のメタン生成抑制剤及び反芻動物用飼料の実施例である。
ユーグレナ，クレイングラス乾草及び濃厚飼料と、６種類の飼料Ｔ１～Ｔ６の化学組成は、表１に示す。
実験試料は60℃のオーブンで48時間乾燥し、乾燥低温下、密閉容器内で貯蔵した。
一方、異なる量のユーグレナ，クレイン(Panicum coloratum)グラス乾草及び濃厚飼料を含む6種類の飼料Ｔ１～Ｔ６を準備した。
飼料Ｔ１は、コントロールであって、クレイングラス乾草6g，濃厚飼料4gからなり、飼料Ｔ２は、クレイングラス乾草6g，濃厚飼料3.5g，ユーグレナ0.5gからなり、飼料Ｔ３は、クレイングラス乾草6g，濃厚飼料3g，ユーグレナ1gからなり、飼料Ｔ４は、クレイングラス乾草6g，濃厚飼料2g，ユーグレナ2gからなり、飼料Ｔ５は、クレイングラス乾草6g，ユーグレナ4gからなり、飼料Ｔ６は、ユーグレナ10gからなっていた。飼料Ｔ２～Ｔ６が、本発明のメタン生成抑制剤及び反芻動物用飼料の実施例である。
ユーグレナ，クレイングラス乾草及び濃厚飼料と、６種類の飼料Ｔ１～Ｔ６の化学組成は、表１に示す。
本実験では、Sar, C.らの論文（Sar, C. et al., 2005. Anim. Feed Sci. Technol., vol.118, pp.295-306.）で記述された連続ガス定量化システムを用いて、39℃で24時間in vitroにて、DM基準で10gの飼料Ｔ１～Ｔ６がメタン生成，揮発性脂肪酸濃度，アンモニア態窒素（NH3-N）濃度，pH，酸化還元電位（ORP）及びプロトゾア数に与える影響について、試験を行った。
つまり、ルーメン液サンプルを、朝の飼料給与前に二頭の乾乳牛から採取し、濾過して、それぞれが同量になるように混合した。McDougallの論文（McDougall, E. I., 1948. Biochem. J, vol. 43, pp. 99-109.）に記述された手順に従ってバッファーを調整し、オートクレーブで滅菌し、CO2を１時間流したのち、発酵容器に分配した。
発酵は、39℃で、24時間行った。ルーメン液は、1:4の比率で、バッファーに添加した。
それぞれの発酵容器からのガス排出を、30分間隔で、10分間測定した。インキュベーション期間の終点（24時間時点）で、培養液サンプルを回収し、アンモニア態窒素分析及び揮発性脂肪酸分析のために、-20℃で保存した。24時間インキュベーション期間のそれぞれの終点において、すべてのインキュベーションを終了し、内容物を排出し、発酵槽をよく洗浄し、オートクレーブ処理した。その後発酵槽には、新しいバッファーと接種材料を再び満たし、次の24時間のインキュベーション期間を開始した。
それぞれのインキュベーション期間において、飼料Ｔ１～Ｔ６を、４つの発酵容器に無作為に割り当て、異なる日に４回実験を繰り返した。
発酵は、39℃で、24時間行った。ルーメン液は、1:4の比率で、バッファーに添加した。
それぞれの発酵容器からのガス排出を、30分間隔で、10分間測定した。インキュベーション期間の終点（24時間時点）で、培養液サンプルを回収し、アンモニア態窒素分析及び揮発性脂肪酸分析のために、-20℃で保存した。24時間インキュベーション期間のそれぞれの終点において、すべてのインキュベーションを終了し、内容物を排出し、発酵槽をよく洗浄し、オートクレーブ処理した。その後発酵槽には、新しいバッファーと接種材料を再び満たし、次の24時間のインキュベーション期間を開始した。
それぞれのインキュベーション期間において、飼料Ｔ１～Ｔ６を、４つの発酵容器に無作為に割り当て、異なる日に４回実験を繰り返した。
＜メタン,二酸化炭素及び揮発性脂肪酸分析＞
それぞれの発酵容器からのメタン生成を、in vitro連続式ガス定量化システム（（株）高杉製作所）に取付けられた自動赤外線メタン分析計（赤外線ガス分析計EXA IR,横河電機（株）)，CO2分析計（Model RI-555,理研計器（株））で、連続的に測定した。総揮発性脂肪酸及びその成分を、2-エチル酪酸を内部標準として用いた水素炎イオン化検出器及び毛管（ULBON HR-52, 0.53mm ID×30m,3.0μm）を装備したガスクロマトグラフィ（GC-2014，（株）島津製作所）で測定した。
分析用サンプルは、前述のSar, C.らの論文（2005）に従い調製した。それぞれの容器について、発酵培地のpH及び酸化還元電位を1分おきに測定した（TS mk-250，（株）高杉製作所）。全データを、分析計のインターフェースを通じてコンピュータに保存した。
それぞれの発酵容器からのメタン生成を、in vitro連続式ガス定量化システム（（株）高杉製作所）に取付けられた自動赤外線メタン分析計（赤外線ガス分析計EXA IR,横河電機（株）)，CO2分析計（Model RI-555,理研計器（株））で、連続的に測定した。総揮発性脂肪酸及びその成分を、2-エチル酪酸を内部標準として用いた水素炎イオン化検出器及び毛管（ULBON HR-52, 0.53mm ID×30m,3.0μm）を装備したガスクロマトグラフィ（GC-2014，（株）島津製作所）で測定した。
分析用サンプルは、前述のSar, C.らの論文（2005）に従い調製した。それぞれの容器について、発酵培地のpH及び酸化還元電位を1分おきに測定した（TS mk-250，（株）高杉製作所）。全データを、分析計のインターフェースを通じてコンピュータに保存した。
＜in vitro栄養消化率及び分解性＞
in vitro栄養消化率は、Tilleyらの論文（Tilley, J. M. A. et al., 1963. J.Br. Grassland Soc., vol.18, pp.104-111.）に記載されたTilley and Terryの方法により、推定した。クレイングラス乾草0.3g＋濃厚飼料0.2g（コントロール，Ｔ１）、クレイングラス乾草0.3g＋濃厚飼料0.175g＋ユーグレナ0.025g（Ｔ２）、クレイングラス乾草0.3g＋濃厚飼料0.15g＋ユーグレナ0.05g（Ｔ３）、クレイングラス乾草0.3g＋濃厚飼料0.1g＋ユーグレナ0.1g（Ｔ４）、クレイングラス乾草0.3g＋ユーグレナ0.2g（Ｔ５）、ユーグレナ0.5g（Ｔ６）サンプルをそれぞれ複数計り、100mLのプラスチック容器に入れ、各容器に40mLのMcDougallバッファー（McDougall, E. I., 1948. Biochem. J, vol.43, pp.99-109.）を入れて、39℃に予熱した。その後、濾過したルーメン液10mLを、CO2ガスの連続供給下、それぞれの容器に分配し、密閉した。注意深く震盪されていることを時々確かめながら、混合物を、39℃で48時間インキュベートした。その後、酸－ペプシン溶液を加え、内容物を39℃で更に48時間インキュベートした。インキュベーション終了後、予め重量を測定したグーチるつぼで濾過し、残渣のDMを測定した。重量減少分は、IVDMD（in vitro乾物消化率）とした。次いで、残渣を灰にして、IVOMD（in vitro有機物消化率）を推定した。
in vitro栄養消化率は、Tilleyらの論文（Tilley, J. M. A. et al., 1963. J.Br. Grassland Soc., vol.18, pp.104-111.）に記載されたTilley and Terryの方法により、推定した。クレイングラス乾草0.3g＋濃厚飼料0.2g（コントロール，Ｔ１）、クレイングラス乾草0.3g＋濃厚飼料0.175g＋ユーグレナ0.025g（Ｔ２）、クレイングラス乾草0.3g＋濃厚飼料0.15g＋ユーグレナ0.05g（Ｔ３）、クレイングラス乾草0.3g＋濃厚飼料0.1g＋ユーグレナ0.1g（Ｔ４）、クレイングラス乾草0.3g＋ユーグレナ0.2g（Ｔ５）、ユーグレナ0.5g（Ｔ６）サンプルをそれぞれ複数計り、100mLのプラスチック容器に入れ、各容器に40mLのMcDougallバッファー（McDougall, E. I., 1948. Biochem. J, vol.43, pp.99-109.）を入れて、39℃に予熱した。その後、濾過したルーメン液10mLを、CO2ガスの連続供給下、それぞれの容器に分配し、密閉した。注意深く震盪されていることを時々確かめながら、混合物を、39℃で48時間インキュベートした。その後、酸－ペプシン溶液を加え、内容物を39℃で更に48時間インキュベートした。インキュベーション終了後、予め重量を測定したグーチるつぼで濾過し、残渣のDMを測定した。重量減少分は、IVDMD（in vitro乾物消化率）とした。次いで、残渣を灰にして、IVOMD（in vitro有機物消化率）を推定した。
＜化学分析＞
ユーグレナ，クレイングラス乾草及び濃厚飼料は、AOAC（AOAC, 1995. Official Methods of Analysis, vol 1, 16th ed. Association of Official Analytical Chemists, Arlington, VA, USA.）の手順に従って、135℃2時間乾燥によるDMの分析（930.15）、OM及び粗灰分（942.05）、及びエーテル抽出物（EE）（920.39）の分析を行った。
窒素（N）は、電気加熱分解装置（FOSS Tecator(登録商標) Digester，フォス・ジャパン（株））、及び自動分配装置(FOSS Kjeltec(登録商標) 2100, フォス・ジャパン（株））を用いて、ケルダール法(984.13) (AOAC, 1995)により測定し、粗蛋白質（CP）は、N × 6.25と推定した。
中性デタージェント繊維（NDF）は、Van Soestら（Van Soest, P.J, et al., 1991. J. Dairy Science vol.74, pp.3583-3597.）の手順により定量し、アミラーゼを除いて推定し、残りの灰分を含むものとして表した。
酸性デタージェント繊維（ADF）及びリグニンも、Van Soestら（1991）の手順に従って定量した。酸性デタージェント繊維も、灰分を含むものとして表した。リグニンは、硫酸によるセルロースの可溶化により定量した。サンプルの総エネルギー（GE）量は、島津自動ボンベ熱量計（CA-4AJ,（株）島津製作所）で分析した。アンモニア態窒素濃度は、Conwayら（Conway, E.J. et al., 1942. Biochem. J., vol.36, pp.655-661.）の手順により分析した。
ユーグレナ，クレイングラス乾草及び濃厚飼料は、AOAC（AOAC, 1995. Official Methods of Analysis, vol 1, 16th ed. Association of Official Analytical Chemists, Arlington, VA, USA.）の手順に従って、135℃2時間乾燥によるDMの分析（930.15）、OM及び粗灰分（942.05）、及びエーテル抽出物（EE）（920.39）の分析を行った。
窒素（N）は、電気加熱分解装置（FOSS Tecator(登録商標) Digester，フォス・ジャパン（株））、及び自動分配装置(FOSS Kjeltec(登録商標) 2100, フォス・ジャパン（株））を用いて、ケルダール法(984.13) (AOAC, 1995)により測定し、粗蛋白質（CP）は、N × 6.25と推定した。
中性デタージェント繊維（NDF）は、Van Soestら（Van Soest, P.J, et al., 1991. J. Dairy Science vol.74, pp.3583-3597.）の手順により定量し、アミラーゼを除いて推定し、残りの灰分を含むものとして表した。
酸性デタージェント繊維（ADF）及びリグニンも、Van Soestら（1991）の手順に従って定量した。酸性デタージェント繊維も、灰分を含むものとして表した。リグニンは、硫酸によるセルロースの可溶化により定量した。サンプルの総エネルギー（GE）量は、島津自動ボンベ熱量計（CA-4AJ,（株）島津製作所）で分析した。アンモニア態窒素濃度は、Conwayら（Conway, E.J. et al., 1942. Biochem. J., vol.36, pp.655-661.）の手順により分析した。
＜統計分析＞
ユーグレナがin vitroメタン生成，DM及びOMの消化率及びルーメン発酵に及ぼす効果を、SAS統計ソフトウェアバージョン9.3（SAS Inst. Inc.）を用いて、多項回帰分析を行った。in vitro消化率およびin vitroガス生成の測定は、同一の工程で4回繰り返した。それぞれの消化率およびガス生成量の平均値を比較した。それぞれの変数のモデルに含まれる総合的な効果は、4回分の測定値と6種の飼料から求めた。飼料の平均値の線形、二次関数的及び三次関数的相違を評価した。各平均値間の相違は、Tukeyの多重比較により確認した。p<0.05を有意とし、p＜0.10のときに傾向ありとした。
ユーグレナがin vitroメタン生成，DM及びOMの消化率及びルーメン発酵に及ぼす効果を、SAS統計ソフトウェアバージョン9.3（SAS Inst. Inc.）を用いて、多項回帰分析を行った。in vitro消化率およびin vitroガス生成の測定は、同一の工程で4回繰り返した。それぞれの消化率およびガス生成量の平均値を比較した。それぞれの変数のモデルに含まれる総合的な効果は、4回分の測定値と6種の飼料から求めた。飼料の平均値の線形、二次関数的及び三次関数的相違を評価した。各平均値間の相違は、Tukeyの多重比較により確認した。p<0.05を有意とし、p＜0.10のときに傾向ありとした。
●実験例１の結果
＜ユーグレナの化学組成＞
本実験の実験飼料の化学組成は、表１に示すように、ユーグレナのOM，粗蛋白質（CP）及びエーテル抽出物（EE）が、乾草及び濃厚飼料に比較して高いことが示された。ユーグレナの総エネルギー（GE）及び灰分は、濃厚飼料及び乾草より低いが、繊維成分がないために、ユーグレナの栄養分の大部分が消化可能で利用可能である。表１のデータはまた、ユーグレナのDM及びOM消化率が、濃厚飼料及び乾草よりもはるかに高いことを示している。このことは、ユーグレナを反芻動物の飼料に含有させることで、栄養分の利用可能性及び利用効率が改善することを示している。
＜ユーグレナの化学組成＞
本実験の実験飼料の化学組成は、表１に示すように、ユーグレナのOM，粗蛋白質（CP）及びエーテル抽出物（EE）が、乾草及び濃厚飼料に比較して高いことが示された。ユーグレナの総エネルギー（GE）及び灰分は、濃厚飼料及び乾草より低いが、繊維成分がないために、ユーグレナの栄養分の大部分が消化可能で利用可能である。表１のデータはまた、ユーグレナのDM及びOM消化率が、濃厚飼料及び乾草よりもはるかに高いことを示している。このことは、ユーグレナを反芻動物の飼料に含有させることで、栄養分の利用可能性及び利用効率が改善することを示している。
＜in vitro アンモニア態窒素，揮発性脂肪酸の生成量及びプロトゾア数に対するユーグレナの代替効果＞
表2に示すように、ユーグレナを代替することにより、ユーグレナ量の増加に応じてアンモニア態窒素生成は、線形（p<0.001）及び非線形（p<0.024）に、増加した。
表2に示すように、ユーグレナを代替することにより、ユーグレナ量の増加に応じてアンモニア態窒素生成は、線形（p<0.001）及び非線形（p<0.024）に、増加した。
一方、総揮発性脂肪酸生成は、ユーグレナの代替量の増加に応じて線形（p<0.001）に減少した。酢酸塩比率は、二次関数的（p<0.007）及び三次関数的（p<0.001）に増加したのに対し、プロピオン酸塩比率は、線形（p<0.001）に減少し、更に、二次関数的（p<0.068）に減少する傾向を示した。酪酸塩比率は、線形（p<0.022）及び非線形（p<0.012）に、増加した。同様に、ユーグレナの代替量の増加に伴い、吉草酸比率は、線形及び二次関数的（p<0.001）に増加した。プロピオン酸塩に対する酢酸塩の割合は、ユーグレナ量の増加に伴い、線形（p<0.001）及び二次関数的（p<0.002）に増加した。pHも、ユーグレナの代替の影響を受け、ユーグレナの代替量の増加に伴い、線形（p<0.001）及び二次関数的（p<0.009）に上昇した。他方、酸化還元電位は、線形（p<0.001）及び二次関数的（p<0.003）に低下した。プロトゾア数は、ユーグレナの代替量の増加に伴い、線形（p<0.001）及び三次関数的（p<0.047）に減少した。
＜in vitroメタン生成及び栄養消化率に対するユーグレナの代替効果＞
ユーグレナの代替量がメタン排出，DM及びOM消化率に及ぼす影響を、表3に示す。
ユーグレナの代替量がメタン排出，DM及びOM消化率に及ぼす影響を、表3に示す。
メタン排出は、ユーグレナの代替量の増加に伴い、線形及び非線形（p<0.001）に、減少した。二酸化炭素生成は、飼料の全量をユーグレナで代替した際に、線形（p<0.024）及び二次関数的（p<0.023）に増加した。in vitro DM消化率は、ユーグレナの代替量の増加に伴い、線形（p<0.003）及び非線形（p<0.04）に、増加した。同様に、OM消化率も、線形（p<0.001）及び非線形（p<0.022）に、増加した。
●実験例１の考察
＜in vitroメタン生成及び栄養消化率に対するユーグレナの代替効果＞
本実験では、表３の最上行のCH4の行で示すように、Ｔ２（5％代替），Ｔ３（10％代替），Ｔ４（20％代替），Ｔ５（40％代替），Ｔ６（100％代替）において、メタン生成が、それぞれ、Ｔ１よりも、9%,9%,9%,20%,48%削減されており、メタン生成が飼料の5-100%をユーグレナで代替した場合に、メタン排出が9-48%の範囲で削減されることが分かった。
＜in vitroメタン生成及び栄養消化率に対するユーグレナの代替効果＞
本実験では、表３の最上行のCH4の行で示すように、Ｔ２（5％代替），Ｔ３（10％代替），Ｔ４（20％代替），Ｔ５（40％代替），Ｔ６（100％代替）において、メタン生成が、それぞれ、Ｔ１よりも、9%,9%,9%,20%,48%削減されており、メタン生成が飼料の5-100%をユーグレナで代替した場合に、メタン排出が9-48%の範囲で削減されることが分かった。
また、表1の下2行にあるNDF,ADFと、表１の下から第3行の粗脂肪を示すエーテル抽出物（EE）の測定結果から分かるように、低濃度の代替（5及び10％）では、コントロールと比較して、繊維（NDF及びADF）及び脂肪（EE）の含有量に顕著な相違はなかったが、高濃度の代替（40及び100％）では、繊維の含有量は顕著に減少し、脂肪の含有量は、顕著に増加した（p<0.001）。
高濃度のユーグレナ代替時にメタン生成が減少するのは、ユーグレナ中の油の高い含有量が、メタン生成プロセスに関与するルーメンの微生物の活性に影響を及ぼしたためと思われる。
本実験例では、飼料Ｔ５において、飼料中の脂肪含有量が、6.4%まで達していた。飼料Ｔ５において、ユーグレナ代替により飼料中の脂肪含有量を6.4%まで高めたときの、メタン削減は20.3%であった。
また、高濃度ユーグレナ代替飼料において、食物繊維含有量が減少していることも、メタン排出の削減に寄与していると思われる。
高濃度のユーグレナ代替時にメタン生成が減少するのは、ユーグレナ中の油の高い含有量が、メタン生成プロセスに関与するルーメンの微生物の活性に影響を及ぼしたためと思われる。
本実験例では、飼料Ｔ５において、飼料中の脂肪含有量が、6.4%まで達していた。飼料Ｔ５において、ユーグレナ代替により飼料中の脂肪含有量を6.4%まで高めたときの、メタン削減は20.3%であった。
また、高濃度ユーグレナ代替飼料において、食物繊維含有量が減少していることも、メタン排出の削減に寄与していると思われる。
表３の下２行に示すように、in vitro DM及びOM消化率は、ユーグレナを代替することにより、上昇した。飼料Ｔ２，Ｔ３において、飼料に5-10%のユーグレナを代替することで、DM及びOMの消化率が、それぞれ、8.3-15.26%及び10.18-18.21%改善した。しかし、ユーグレナの代替量が飼料の20%（飼料Ｔ４）及び40%（飼料Ｔ５）に高まると、反応は、5%（飼料Ｔ２）及び10%（飼料Ｔ３）代替の場合よりも低かった（p<0.05）。これは、ユーグレナの代替量の増加により飼料中の脂肪含有量が増加し、発酵過程で関与する微生物の活性に影響を及ぼしたためと考えられる。
＜in vitro アンモニア態窒素，揮発性脂肪酸生成及びプロトゾア数に対するユーグレナの代替効果＞
本実験において、表２の下から第３行に示すように、in vitro アンモニア態窒素濃度は、飼料中にユーグレナを20%（飼料Ｔ４）から100%（飼料Ｔ６）含有したときに、コントロール（飼料Ｔ１）の2から4倍に増加していた。アンモニア態窒素生成の増加は、ユーグレナの代替量の上昇に伴う飼料中の窒素含有量の増加により生じた。
本実験において、表２の下から第３行に示すように、in vitro アンモニア態窒素濃度は、飼料中にユーグレナを20%（飼料Ｔ４）から100%（飼料Ｔ６）含有したときに、コントロール（飼料Ｔ１）の2から4倍に増加していた。アンモニア態窒素生成の増加は、ユーグレナの代替量の上昇に伴う飼料中の窒素含有量の増加により生じた。
また、表２の下２行に示すように、ユーグレナを高濃度で含む場合には、pH値が上昇し、酸化還元電位値が減少していた。
表２の下から第５行の総揮発性脂肪酸濃度は、ユーグレナを代替（DM基準で飼料の5-40%）する（飼料Ｔ２～Ｔ５）ことによって影響を受けなかったが、飼料の全量をユーグレナで代替した場合（飼料Ｔ６）には、53%削減された。これは、ユーグレナが脂肪酸を高濃度で含むため、発酵過程に関与するルーメンの微生物の活性が抑制されたためと考えられる。表２の上から第1行～第4行に示すそれぞれの揮発性脂肪酸のモル比も、ユーグレナを含有させることによって影響された。ユーグレナで飼料を20,40及び100%代替した場合（飼料Ｔ４～Ｔ６）に、プロピオン酸塩の比率は、11,18及び24%削減された。他方、ユーグレナで飼料を全量代替した場合（飼料Ｔ６）に、酢酸塩の比率は、5%上昇した。同様に、ユーグレナを飼料中に20-40%含む場合（飼料Ｔ４，Ｔ５）に、酪酸の比率は、31-32%上昇した。
表２の下から第５行の総揮発性脂肪酸濃度は、ユーグレナを代替（DM基準で飼料の5-40%）する（飼料Ｔ２～Ｔ５）ことによって影響を受けなかったが、飼料の全量をユーグレナで代替した場合（飼料Ｔ６）には、53%削減された。これは、ユーグレナが脂肪酸を高濃度で含むため、発酵過程に関与するルーメンの微生物の活性が抑制されたためと考えられる。表２の上から第1行～第4行に示すそれぞれの揮発性脂肪酸のモル比も、ユーグレナを含有させることによって影響された。ユーグレナで飼料を20,40及び100%代替した場合（飼料Ｔ４～Ｔ６）に、プロピオン酸塩の比率は、11,18及び24%削減された。他方、ユーグレナで飼料を全量代替した場合（飼料Ｔ６）に、酢酸塩の比率は、5%上昇した。同様に、ユーグレナを飼料中に20-40%含む場合（飼料Ｔ４，Ｔ５）に、酪酸の比率は、31-32%上昇した。
表２の下から第4行のプロトゾア数もまた、ユーグレナの代替により影響を受け、ユーグレナを飼料中に5-100%代替した場合（飼料Ｔ２～Ｔ６）に、14.8-44.8%削減された。
アンモニア態窒素濃度，揮発性脂肪酸生成，pH及び酸化還元電位は、ユーグレナの代替量が低い場合には影響を受けなかった。
アンモニア態窒素濃度，揮発性脂肪酸生成，pH及び酸化還元電位は、ユーグレナの代替量が低い場合には影響を受けなかった。
●実験例１のまとめ
本実験の結果より、ユーグレナは、反芻動物のルーメン内微生物によるメタン生成を抑制することが分かった。
従って、ユーグレナは、メタン生成抑制剤として用いることができることが分かった。また、ユーグレナは、他の飼料に添加されて、又は、ユーグレナ単独で、反芻動物のルーメン内でのメタン生成を抑制するための反芻動物用飼料として用いることができることが分かった。
更に、ユーグレナは、高い栄養価と消化率を有し、反芻動物の飼料において質の良い蛋白質サプリメントの代替となり得ることが分かった。従って、ユーグレナは、他の飼料に代替されて、又は、ユーグレナ単独で、反芻動物のルーメン内でのメタン生成を抑制すると共に、栄養価及び消化率を改善するための反芻動物用飼料として用いることができることが分かった。
本実験の結果より、ユーグレナは、反芻動物のルーメン内微生物によるメタン生成を抑制することが分かった。
従って、ユーグレナは、メタン生成抑制剤として用いることができることが分かった。また、ユーグレナは、他の飼料に添加されて、又は、ユーグレナ単独で、反芻動物のルーメン内でのメタン生成を抑制するための反芻動物用飼料として用いることができることが分かった。
更に、ユーグレナは、高い栄養価と消化率を有し、反芻動物の飼料において質の良い蛋白質サプリメントの代替となり得ることが分かった。従って、ユーグレナは、他の飼料に代替されて、又は、ユーグレナ単独で、反芻動物のルーメン内でのメタン生成を抑制すると共に、栄養価及び消化率を改善するための反芻動物用飼料として用いることができることが分かった。
更に、本実験の結果より、ユーグレナを、反芻動物のルーメン内でのメタン生成を抑制すると共に、栄養価及び消化率を改善するための反芻動物用飼料として用いる場合には、ユーグレナを、0%より多く、かつ、40%以下の濃度、好適には、5-20%、より好適には、5-10％で代替すると、メタン削減効果が得られると共に、DM及びOM消化率が改善されることが分かった。
100%など、ユーグレナの含有濃度が高い場合、メタン削減効果は更に顕著となるが、揮発性脂肪酸の生成とプロトゾア数においては、ユーグレナを、0%より多く、かつ、40%以下の濃度、好適には、5-20%、より好適には、5-10％で代替すると好適である。
本実験より、飼料中にユーグレナを低濃度（5-10%）で代替するとき、ルーメン発酵プロセスにネガティブな効果を及ぼすことなく、DM及びOMの消化率が大幅に上昇し、メタン排出を最適に削減（9.1%）することが分かった。
100%など、ユーグレナの含有濃度が高い場合、メタン削減効果は更に顕著となるが、揮発性脂肪酸の生成とプロトゾア数においては、ユーグレナを、0%より多く、かつ、40%以下の濃度、好適には、5-20%、より好適には、5-10％で代替すると好適である。
本実験より、飼料中にユーグレナを低濃度（5-10%）で代替するとき、ルーメン発酵プロセスにネガティブな効果を及ぼすことなく、DM及びOMの消化率が大幅に上昇し、メタン排出を最適に削減（9.1%）することが分かった。
＜＜実験例２：蛋白質の消化率改善試験＞＞
実験例２では、羊の飼料中にユーグレナを給与し、蛋白質消化率等に対するユーグレナ給与の効果についてin vivoにて確認した。
実験例２では、羊の飼料中にユーグレナを給与し、蛋白質消化率等に対するユーグレナ給与の効果についてin vivoにて確認した。
＜ユーグレナ粉末の調製＞
実験例２のユーグレナ粉末を得るために、ユーグレナの試料として、Euglena gracilis Zを用いた。まず、次の手順により、ユーグレナの前培養を行った。
オートクレーブにより滅菌したＣＭ培地29mlを、同じくオートクレーブにより滅菌済みのバイアルに導入し、ユーグレナを含む培養液1mlを加えた。この培養液を、30℃恒温槽中にて、5000lux下（光源は蛍光灯ビオルックスA 20W,NEC）、空気バブリング下にて１週間程度培養した。
使用したＣＭ培地の組成は、(NH4)2HPO4 1 g/L，KH2PO4 1 g/L，MgSO4・7H2O 0.2 g/L，CaCl2・2H2O 0.02 g/L，Fe2(SO4)3・7H2O 3.0 mg/L，MnCl2・4H2O 1.8 mg/L，CoSO4・7H2O 1.5 mg/L，ZnSO4・7H2O 0.4 mg/L，Na2MoO4・2H2O 0.2 mg/L，CuSO45H2O 0.02 mg/L，チアミン塩酸塩（ビタミンB1）0.1 mg/L，シアノコバラミン(ビタミンB12)0.001 mg/Lであった。CM培地はMarianら(1952)の文献を参考にして作製した。また、濃硫酸を加えることによってpHを3.5に調整した。
培養後、ユーグレナを含む培養液を、遠心分離し、沈殿物を洗浄、真空凍結乾燥して、実施例のユーグレナ粉末を得た。
実験例２のユーグレナ粉末を得るために、ユーグレナの試料として、Euglena gracilis Zを用いた。まず、次の手順により、ユーグレナの前培養を行った。
オートクレーブにより滅菌したＣＭ培地29mlを、同じくオートクレーブにより滅菌済みのバイアルに導入し、ユーグレナを含む培養液1mlを加えた。この培養液を、30℃恒温槽中にて、5000lux下（光源は蛍光灯ビオルックスA 20W,NEC）、空気バブリング下にて１週間程度培養した。
使用したＣＭ培地の組成は、(NH4)2HPO4 1 g/L，KH2PO4 1 g/L，MgSO4・7H2O 0.2 g/L，CaCl2・2H2O 0.02 g/L，Fe2(SO4)3・7H2O 3.0 mg/L，MnCl2・4H2O 1.8 mg/L，CoSO4・7H2O 1.5 mg/L，ZnSO4・7H2O 0.4 mg/L，Na2MoO4・2H2O 0.2 mg/L，CuSO45H2O 0.02 mg/L，チアミン塩酸塩（ビタミンB1）0.1 mg/L，シアノコバラミン(ビタミンB12)0.001 mg/Lであった。CM培地はMarianら(1952)の文献を参考にして作製した。また、濃硫酸を加えることによってpHを3.5に調整した。
培養後、ユーグレナを含む培養液を、遠心分離し、沈殿物を洗浄、真空凍結乾燥して、実施例のユーグレナ粉末を得た。
ユーグレナ粉末と基礎飼料（ギニアグラス乾草と濃厚飼料）の化学組成を表4に示す。
ユーグレナのアミノ酸及び脂肪酸プロファイルを表5に示す。
＜実験動物、飼料と給与飼料＞
フィステルが装着された4頭の去勢された9歳のコリデール種雄羊（体重44.25±3.86 kg）を4×4ラテン方格法で用いた。去勢された羊を、個々の代謝ケージに入れ、ギニアグラス（Panicum maximum）乾草と濃厚飼料の基礎飼料を維持レベル（55g DM/kg BW0.75/日）で、1日2回（午前8時30分と午後4時30分）給餌した。ユーグレナを濃厚飼料に混合し、朝（午前8時30分）にのみ給餌した。ギニアグラス乾草はユーグレナを給餌した15分後に提供した。0時間のサンプルは朝の給餌におけるギニアグラス乾草の給餌直前に採取した。24時間のサンプルは朝のユーグレナの給餌直前に採取した。清浄水及びミネラルブロック（ミネラルブロック1kgあたり、酸化鉄1742mg,酸化第二鉄196mg,硫酸銅377 mg,硫酸コバルト66mg,硫酸亜鉛1235mg,炭酸マンガン1046mg,ヨウ素酸カルシウム77mg,亜セレン酸ナトリウム33mg,及び塩化ナトリウム971g）は自由摂取とした。濃厚飼料（コーンミール510g/kg,大豆油かす240g/kg,米ぬか210g/kg,糖蜜と炭酸カルシウムと塩の混合物40g/kg）は日本の動物飼料製造会社(中部飼料株式会社)から得た。濃厚飼料の化学組成を表4に示す。本実験で用いられたユーグレナ、濃厚飼料、及びギニアグラス乾草の粗蛋白質（CP）、総エネルギー（GE）、及び繊維の含有量は異なっており、比較できなかった。その結果、窒素及びエネルギー含有量を各飼料処理の間で調整する必要があった。従って、去勢された成熟の羊の維持要求を満たすカロリー、窒素とするために、食餌のユーグレナの代替量を0,50,100,150g/kg DMへとする際にはギニアグラス乾草及び濃厚飼料の成分割合の調節を行った。
各飼料処理は、以下の通りであった。コントロールの飼料Ｔ２－１（60%ギニアグラス乾草及び40%濃厚飼料）、飼料Ｔ２－２（60%ギニアグラス乾草、35%濃厚飼料及び5%ユーグレナ）、飼料Ｔ２－３（65%ギニアグラス乾草、25%濃厚飼料及び10%ユーグレナ）、飼料Ｔ２－４（68%ギニアグラス乾草、17%濃厚飼料及び15%ユーグレナ）。飼料における%は、全配給量に対するkg DMを示している。摂取を容易にし、嗜好を避けるために、各飼料でユーグレナ粉末と濃厚飼料を十分に混合した。飼料Ｔ２－２～Ｔ２－４が、本発明のメタン生成抑制剤及び反芻動物用飼料の実施例である。
フィステルが装着された4頭の去勢された9歳のコリデール種雄羊（体重44.25±3.86 kg）を4×4ラテン方格法で用いた。去勢された羊を、個々の代謝ケージに入れ、ギニアグラス（Panicum maximum）乾草と濃厚飼料の基礎飼料を維持レベル（55g DM/kg BW0.75/日）で、1日2回（午前8時30分と午後4時30分）給餌した。ユーグレナを濃厚飼料に混合し、朝（午前8時30分）にのみ給餌した。ギニアグラス乾草はユーグレナを給餌した15分後に提供した。0時間のサンプルは朝の給餌におけるギニアグラス乾草の給餌直前に採取した。24時間のサンプルは朝のユーグレナの給餌直前に採取した。清浄水及びミネラルブロック（ミネラルブロック1kgあたり、酸化鉄1742mg,酸化第二鉄196mg,硫酸銅377 mg,硫酸コバルト66mg,硫酸亜鉛1235mg,炭酸マンガン1046mg,ヨウ素酸カルシウム77mg,亜セレン酸ナトリウム33mg,及び塩化ナトリウム971g）は自由摂取とした。濃厚飼料（コーンミール510g/kg,大豆油かす240g/kg,米ぬか210g/kg,糖蜜と炭酸カルシウムと塩の混合物40g/kg）は日本の動物飼料製造会社(中部飼料株式会社)から得た。濃厚飼料の化学組成を表4に示す。本実験で用いられたユーグレナ、濃厚飼料、及びギニアグラス乾草の粗蛋白質（CP）、総エネルギー（GE）、及び繊維の含有量は異なっており、比較できなかった。その結果、窒素及びエネルギー含有量を各飼料処理の間で調整する必要があった。従って、去勢された成熟の羊の維持要求を満たすカロリー、窒素とするために、食餌のユーグレナの代替量を0,50,100,150g/kg DMへとする際にはギニアグラス乾草及び濃厚飼料の成分割合の調節を行った。
各飼料処理は、以下の通りであった。コントロールの飼料Ｔ２－１（60%ギニアグラス乾草及び40%濃厚飼料）、飼料Ｔ２－２（60%ギニアグラス乾草、35%濃厚飼料及び5%ユーグレナ）、飼料Ｔ２－３（65%ギニアグラス乾草、25%濃厚飼料及び10%ユーグレナ）、飼料Ｔ２－４（68%ギニアグラス乾草、17%濃厚飼料及び15%ユーグレナ）。飼料における%は、全配給量に対するkg DMを示している。摂取を容易にし、嗜好を避けるために、各飼料でユーグレナ粉末と濃厚飼料を十分に混合した。飼料Ｔ２－２～Ｔ２－４が、本発明のメタン生成抑制剤及び反芻動物用飼料の実施例である。
＜実験手順＞
実験は、14日間の順化、5日間の消化試験、最終日のルーメン液サンプルの収集からなる各20日間を1サイクルとして、4サイクル繰り返して、80日間行った。提供飼料、残餌、糞便及び尿のサンプルを採取し、後述の標準的な手順を用いて、栄養素含有量を分析した。ルーメン液サンプルを、朝のユーグレナ給餌後0時間、2時間、4時間、6時間、8時間および24時間の時点で回収し、アンモニア態窒素分析及び揮発性脂肪酸分析のために－20℃で保存した。それぞれのサンプル回収時の第一胃のpHを、ルーメン液サンプルを採取した直後に測定した。ルーメン液サンプルを、原生動物の集団（protozoan population）をOgimotoらの論文（Atlas of rumen microbiology. Japan scientific societies press,Tokyo. 1981）に記述された手順に従って、計数するために保存した。プロトゾア数（protozoa count）のデータは、正常値を得るために、対数の形態(LOG form)に変換した。
実験は、14日間の順化、5日間の消化試験、最終日のルーメン液サンプルの収集からなる各20日間を1サイクルとして、4サイクル繰り返して、80日間行った。提供飼料、残餌、糞便及び尿のサンプルを採取し、後述の標準的な手順を用いて、栄養素含有量を分析した。ルーメン液サンプルを、朝のユーグレナ給餌後0時間、2時間、4時間、6時間、8時間および24時間の時点で回収し、アンモニア態窒素分析及び揮発性脂肪酸分析のために－20℃で保存した。それぞれのサンプル回収時の第一胃のpHを、ルーメン液サンプルを採取した直後に測定した。ルーメン液サンプルを、原生動物の集団（protozoan population）をOgimotoらの論文（Atlas of rumen microbiology. Japan scientific societies press,Tokyo. 1981）に記述された手順に従って、計数するために保存した。プロトゾア数（protozoa count）のデータは、正常値を得るために、対数の形態(LOG form)に変換した。
＜揮発性脂肪酸の分析＞
揮発性脂肪酸及びその成分を、2-エチル酪酸を内部標準として用いた水素炎イオン化検出器及び毛管（ULBON HR-52,0.53mm ID×30m,3.0μm）を装備したガスクロマトグラフィ(GC-2014,(株)島津製作所)で測定した。分析用サンプルは、Sar,C.らの論文（2005 Anim. Feed Sci. Technol., vol.118, pp.295-306.）に従い調製した。
揮発性脂肪酸及びその成分を、2-エチル酪酸を内部標準として用いた水素炎イオン化検出器及び毛管（ULBON HR-52,0.53mm ID×30m,3.0μm）を装備したガスクロマトグラフィ(GC-2014,(株)島津製作所)で測定した。分析用サンプルは、Sar,C.らの論文（2005 Anim. Feed Sci. Technol., vol.118, pp.295-306.）に従い調製した。
＜糞便および尿の収集と準備＞
糞便及び尿を、各1サイクル(20日間)の期間中にそれぞれ5日間ずつ回収し、各飼料からの糞便サンプルを、解凍後混合し、サブサンプルとして採取した。サブサンプルを、その後の実験室分析のために、熱風乾燥器中で、60℃、48時間乾燥し、1mmの篩を通過する程度まで粉砕した。尿を、pHを3.0未満に下げ、細菌による窒素含有化合物の分解を防ぐために、100ml/l（v/v）の硫酸100mlが入ったバケツに集めた。約50ml/lの尿サンプルを、サブサンプリングして、窒素及びGE分析まで‐20℃で保存した。
糞便及び尿を、各1サイクル(20日間)の期間中にそれぞれ5日間ずつ回収し、各飼料からの糞便サンプルを、解凍後混合し、サブサンプルとして採取した。サブサンプルを、その後の実験室分析のために、熱風乾燥器中で、60℃、48時間乾燥し、1mmの篩を通過する程度まで粉砕した。尿を、pHを3.0未満に下げ、細菌による窒素含有化合物の分解を防ぐために、100ml/l（v/v）の硫酸100mlが入ったバケツに集めた。約50ml/lの尿サンプルを、サブサンプリングして、窒素及びGE分析まで‐20℃で保存した。
＜化学組成分析＞
実験飼料は、AOAC（AOAC, 1995. Official Methods of Analysis, vol.1, 16th ed. Association of Official Analytical Chemists, Arlington, VA, USA）の手順に従って、135℃で2時間乾燥によるDMの分析(930.15)、OM及び粗灰分(942.05)、及びエーテル抽出物(EE)(920.39)の分析を行った。窒素(N)は、電気加熱分解装置（FOSS Tecator(登録商標) Digester,フォス・ジャパン(株)）、及び自動分配装置（FOSS Kjeltec(登録商標) 2100,フォス・ジャパン(株)）を用いて、ケルダール法（984.13）（AOAC, 1995）により測定し、粗蛋白質（CP）は、N×6.25と推定した。中性デタージェント繊維（NDF）、酸性デタージェント繊維（ADF）及びリグニン（sa）はVan Soestら（Van Soest, P.J, et al., 1991. J. Dairy Science, vol.74, pp.3583-3597.）の論文に記述された手順により定量し、残りは灰分として結果に示した。サンプルの総エネルギー（GE）量は、島津自動ボンベ熱量計（CA-4AJ,(株)島津製作所）で分析した。アンモニア態窒素濃度は、Conwayら（Conway, E.J. et al., 1942. Biochem. J., vol.36, pp.655-661.）の手順により分析した。
実験飼料は、AOAC（AOAC, 1995. Official Methods of Analysis, vol.1, 16th ed. Association of Official Analytical Chemists, Arlington, VA, USA）の手順に従って、135℃で2時間乾燥によるDMの分析(930.15)、OM及び粗灰分(942.05)、及びエーテル抽出物(EE)(920.39)の分析を行った。窒素(N)は、電気加熱分解装置（FOSS Tecator(登録商標) Digester,フォス・ジャパン(株)）、及び自動分配装置（FOSS Kjeltec(登録商標) 2100,フォス・ジャパン(株)）を用いて、ケルダール法（984.13）（AOAC, 1995）により測定し、粗蛋白質（CP）は、N×6.25と推定した。中性デタージェント繊維（NDF）、酸性デタージェント繊維（ADF）及びリグニン（sa）はVan Soestら（Van Soest, P.J, et al., 1991. J. Dairy Science, vol.74, pp.3583-3597.）の論文に記述された手順により定量し、残りは灰分として結果に示した。サンプルの総エネルギー（GE）量は、島津自動ボンベ熱量計（CA-4AJ,(株)島津製作所）で分析した。アンモニア態窒素濃度は、Conwayら（Conway, E.J. et al., 1942. Biochem. J., vol.36, pp.655-661.）の手順により分析した。
＜ユーグレナのアミノ酸及び脂肪酸分析＞
ユーグレナサンプルのアミノ酸及び脂肪酸プロファイルは、日本食品分析センターで分析した。アミノ酸組成は、トリプトファンを除き、自動アミノ酸分析機（JLC-500/V、日本電子(株)、カラム：LCR-6、4mm×120mm ID、日本電子(株)）で測定した。トリプトファンは、高速液体クロマトグラフィー（HPLC、LC-20AD、(株)島津製作所、カラム：CAPCELL PAK C18 AQ、4.6mm ID×250mm、(株)資生堂、検出器：蛍光検出器、RF-20Axs、(株)島津製作所）を用いて分析した。移動相として、過塩素酸及びメタノール（80:20）の混合物を用いた。流速は、0.7ml/分で、蛍光励起は285nm、40℃とした。ユーグレナの脂肪酸組成は、水素炎イオン化型検出器（FID）を装備したガスクロマトグラフィ（GC-1700、(株)島津製作所）により決定した。脂肪酸は、30m×0.25mm ID、DB-23キャピラリーカラムで分離した。250℃でスプリットレス注入される、流量1.5ml/分のヘリウムがキャリアガスとして使用され、検出器温度は250℃だった。
ユーグレナサンプルのアミノ酸及び脂肪酸プロファイルは、日本食品分析センターで分析した。アミノ酸組成は、トリプトファンを除き、自動アミノ酸分析機（JLC-500/V、日本電子(株)、カラム：LCR-6、4mm×120mm ID、日本電子(株)）で測定した。トリプトファンは、高速液体クロマトグラフィー（HPLC、LC-20AD、(株)島津製作所、カラム：CAPCELL PAK C18 AQ、4.6mm ID×250mm、(株)資生堂、検出器：蛍光検出器、RF-20Axs、(株)島津製作所）を用いて分析した。移動相として、過塩素酸及びメタノール（80:20）の混合物を用いた。流速は、0.7ml/分で、蛍光励起は285nm、40℃とした。ユーグレナの脂肪酸組成は、水素炎イオン化型検出器（FID）を装備したガスクロマトグラフィ（GC-1700、(株)島津製作所）により決定した。脂肪酸は、30m×0.25mm ID、DB-23キャピラリーカラムで分離した。250℃でスプリットレス注入される、流量1.5ml/分のヘリウムがキャリアガスとして使用され、検出器温度は250℃だった。
＜統計分析＞
データの検証及び外れ値の分析にはREGプロシージャ（SAS Institute Inc., Cary, NC, USA）を用いた。In vivoでの試験で得られたデータ（DM摂取量、栄養摂取量、消化率、プロトゾア数）を、REGプロシージャ（SAS Inst.Inc.,2010）を用い、4×4ラテン方格法にて分散分析（ANOVA）した。REGプロシージャにおけるモデルは、Yij =μ+Ti+Ai+Pi+eij、ここで、Yijは従属変数であり、μは全体平均（overall mean）で、Tiは固定処置効果（fixed treatment effect）、Aiはランダムな動物効果（random animal effect）、Piはランダムな期間効果（random period effect）、そして、eijは残差である。試験区は固定であると考え、一方、羊と期間はランダム変数（random variable）であると考えた。摂取量と消化率に対する観測の総数は320（試験区(4)×供試動物(4)×期間(4)×データ収集日数(5)）であり、プロトゾア数に対する観測の総数は192（試験区(4)×供試動物(4)×期間(4)×データ収集日数(1)×反復(3)）であった。第一胃のpH、アンモニア態窒素、揮発性脂肪酸（VFA）は反復で測定したデータを4×4ラテン方格法にて分析した。ここで、サンプリング時間の効果、及び、試験区とサンプリング時間との間の相互作用をモデルに含めた。第一胃のpH、アンモニア態窒素、揮発性脂肪酸（VFA）に対する観測の総数は1152（試験区(4)×供試動物(4)×期間(4)×サンプリング頻度(6)×反復(3)）であった。平均（means）間の差は、Tukeyの多重比較により確認した。P<0.05を有意とし、0.05<P<0.10で傾向を論じた。標本平均の標準誤差（standard error of the means:SEM）は、SAS（2010）の最小二乗法手続き（LSMEANSオプション）を用いて決定した。
データの検証及び外れ値の分析にはREGプロシージャ（SAS Institute Inc., Cary, NC, USA）を用いた。In vivoでの試験で得られたデータ（DM摂取量、栄養摂取量、消化率、プロトゾア数）を、REGプロシージャ（SAS Inst.Inc.,2010）を用い、4×4ラテン方格法にて分散分析（ANOVA）した。REGプロシージャにおけるモデルは、Yij =μ+Ti+Ai+Pi+eij、ここで、Yijは従属変数であり、μは全体平均（overall mean）で、Tiは固定処置効果（fixed treatment effect）、Aiはランダムな動物効果（random animal effect）、Piはランダムな期間効果（random period effect）、そして、eijは残差である。試験区は固定であると考え、一方、羊と期間はランダム変数（random variable）であると考えた。摂取量と消化率に対する観測の総数は320（試験区(4)×供試動物(4)×期間(4)×データ収集日数(5)）であり、プロトゾア数に対する観測の総数は192（試験区(4)×供試動物(4)×期間(4)×データ収集日数(1)×反復(3)）であった。第一胃のpH、アンモニア態窒素、揮発性脂肪酸（VFA）は反復で測定したデータを4×4ラテン方格法にて分析した。ここで、サンプリング時間の効果、及び、試験区とサンプリング時間との間の相互作用をモデルに含めた。第一胃のpH、アンモニア態窒素、揮発性脂肪酸（VFA）に対する観測の総数は1152（試験区(4)×供試動物(4)×期間(4)×サンプリング頻度(6)×反復(3)）であった。平均（means）間の差は、Tukeyの多重比較により確認した。P<0.05を有意とし、0.05<P<0.10で傾向を論じた。標本平均の標準誤差（standard error of the means:SEM）は、SAS（2010）の最小二乗法手続き（LSMEANSオプション）を用いて決定した。
●実験例２の結果
＜実験飼料の化学組成＞
DM、OM、CP、GE、繊維成分の含有量は、各々の処理区で類似した値となった（表4）。エーテル抽出物の含有量は、コントロールの飼料が27.2g/kg DMであったのに対して、ユーグレナ配合区（150g/kg DM）では40.4g/kgへと線形的（P<0.001）に増加した（表4）。食餌中の総灰分含有量は、ユーグレナの割合が増加するにつれて、線形的（P<0.001）に減少した（表4）。表4に示すように、ユーグレナはわずかな量の繊維成分（6.5g/kg DMのNDF、2.8g/kg
DMのADF、0.8g/kg DMのリグニン）を含む。本実験では、ユーグレナ中の総必須アミノ酸及び総非必須アミノ酸の濃度は、それぞれ14.3g/100g DM及び14.1g/100g DMであった。ユーグレナに含まれる総長鎖脂肪酸及び総中鎖脂肪酸の濃度は、それぞれ13.0g/100g DM及び0.3g/100g DMであった。また、ユーグレナ中の総飽和脂肪酸及び総不飽和脂肪酸の濃度は、それぞれ7.4g/100g DM（ユーグレナ中の総脂肪酸100g当り53g）及び5.9g/100g DM（ユーグレナ中の総脂肪酸100g当り42g）であった。さらに、ユーグレナ中の総単価不飽和脂肪酸及び総多価不飽和脂肪酸の濃度は、それぞれ4.3g/100g DM及び1.6g/100g DMであった。
＜実験飼料の化学組成＞
DM、OM、CP、GE、繊維成分の含有量は、各々の処理区で類似した値となった（表4）。エーテル抽出物の含有量は、コントロールの飼料が27.2g/kg DMであったのに対して、ユーグレナ配合区（150g/kg DM）では40.4g/kgへと線形的（P<0.001）に増加した（表4）。食餌中の総灰分含有量は、ユーグレナの割合が増加するにつれて、線形的（P<0.001）に減少した（表4）。表4に示すように、ユーグレナはわずかな量の繊維成分（6.5g/kg DMのNDF、2.8g/kg
DMのADF、0.8g/kg DMのリグニン）を含む。本実験では、ユーグレナ中の総必須アミノ酸及び総非必須アミノ酸の濃度は、それぞれ14.3g/100g DM及び14.1g/100g DMであった。ユーグレナに含まれる総長鎖脂肪酸及び総中鎖脂肪酸の濃度は、それぞれ13.0g/100g DM及び0.3g/100g DMであった。また、ユーグレナ中の総飽和脂肪酸及び総不飽和脂肪酸の濃度は、それぞれ7.4g/100g DM（ユーグレナ中の総脂肪酸100g当り53g）及び5.9g/100g DM（ユーグレナ中の総脂肪酸100g当り42g）であった。さらに、ユーグレナ中の総単価不飽和脂肪酸及び総多価不飽和脂肪酸の濃度は、それぞれ4.3g/100g DM及び1.6g/100g DMであった。
＜摂取量および消化率におけるユーグレナ給与の効果＞
羊の飼料中のユーグレナの代替量が増加するのに応じて、DM及びOMの摂取量は線形（P<0.01）及び二次関数的（P<0.01）に増加した（表６）。粗蛋白質摂取量（g/d）が線形的に増加した（P<0.01）が、一方、NDF摂取量はユーグレナ代替区と、ユーグレナ非給与区の間で変化しなかった（P<0.05）。しかし、ユーグレナ代替区では、150g/kg DMの給与では、50g/kg DM及び100g/kg DM給与した区と比較して、有意に低いNDF摂取量につながった（P<0.01）（表6）。ADF摂取量（g/d）は、羊の飼料中のユーグレナ給与量が増加するのに伴って線形的及び二次関数的に（P<0.01）に増加した。見かけのCP消化率は線形的に増加した（P<0.01）。
羊の飼料中のユーグレナの代替量が増加するのに応じて、DM及びOMの摂取量は線形（P<0.01）及び二次関数的（P<0.01）に増加した（表６）。粗蛋白質摂取量（g/d）が線形的に増加した（P<0.01）が、一方、NDF摂取量はユーグレナ代替区と、ユーグレナ非給与区の間で変化しなかった（P<0.05）。しかし、ユーグレナ代替区では、150g/kg DMの給与では、50g/kg DM及び100g/kg DM給与した区と比較して、有意に低いNDF摂取量につながった（P<0.01）（表6）。ADF摂取量（g/d）は、羊の飼料中のユーグレナ給与量が増加するのに伴って線形的及び二次関数的に（P<0.01）に増加した。見かけのCP消化率は線形的に増加した（P<0.01）。
＜エネルギー摂取量およびエネルギー損失におけるユーグレナ給与の効果＞
羊の飼料中のユーグレナの配合割合が増加するのに応じて、総エネルギー摂取量（MJ/d）は線形的及び二次関数的に（P<0.01）に増加した。一方、総エネルギー量（GE）は羊の飼料中のユーグレナの割合が増加しても影響を受けなかった（P>0.05）（表7）。可消化エネルギー摂取量は、ユーグレナの代替量が増加するのに応じて二次関数的（P<0.05）に増加した（表7）。エネルギーは糞便及び尿の両方を経由して失われた。糞便エネルギー損失（MJ/d）はユーグレナ給与量の増加に伴って有意に増加した（P<0.05）（表7）。同様に、GE摂取量に対する糞便エネルギーの割合は、二次関数的（P<0.05）及び三次関数的（P<0.01）に影響を受けた一方、尿中のエネルギー濃度（MJ/d）は、ユーグレナ給与によって影響されなかった（表7）。
羊の飼料中のユーグレナの配合割合が増加するのに応じて、総エネルギー摂取量（MJ/d）は線形的及び二次関数的に（P<0.01）に増加した。一方、総エネルギー量（GE）は羊の飼料中のユーグレナの割合が増加しても影響を受けなかった（P>0.05）（表7）。可消化エネルギー摂取量は、ユーグレナの代替量が増加するのに応じて二次関数的（P<0.05）に増加した（表7）。エネルギーは糞便及び尿の両方を経由して失われた。糞便エネルギー損失（MJ/d）はユーグレナ給与量の増加に伴って有意に増加した（P<0.05）（表7）。同様に、GE摂取量に対する糞便エネルギーの割合は、二次関数的（P<0.05）及び三次関数的（P<0.01）に影響を受けた一方、尿中のエネルギー濃度（MJ/d）は、ユーグレナ給与によって影響されなかった（表7）。
＜CPバランスと糞便及び尿におけるCP損失におけるユーグレナ給与の効果＞
尿におけるCP損失（g/d）は、表8に示すようにユーグレナの代替量の増加とともに線形的及び二次関数的に増加し（P<0.01）、また、三次関数的を増加する傾向もあった（P=0.07）。（総CP摂取量に対する割合としての）尿におけるCP損失は、高いユーグレナの代替量（150g/kg DM）においても、影響を受けなかった（P>0.05）。糞便におけるCP損失（総CP摂取量に対する割合としての）は、ユーグレナの代替量の増加に伴って線形的（P<0.01）に減少した（表8）。蓄積されたCP（g/d）はユーグレナ給与量の増加に伴って、線形的（P<0.01）及び二次関数的（P<0.05）に増加した（表8）。
尿におけるCP損失（g/d）は、表8に示すようにユーグレナの代替量の増加とともに線形的及び二次関数的に増加し（P<0.01）、また、三次関数的を増加する傾向もあった（P=0.07）。（総CP摂取量に対する割合としての）尿におけるCP損失は、高いユーグレナの代替量（150g/kg DM）においても、影響を受けなかった（P>0.05）。糞便におけるCP損失（総CP摂取量に対する割合としての）は、ユーグレナの代替量の増加に伴って線形的（P<0.01）に減少した（表8）。蓄積されたCP（g/d）はユーグレナ給与量の増加に伴って、線形的（P<0.01）及び二次関数的（P<0.05）に増加した（表8）。
＜ルーメン発酵に対する効果＞
第一胃のpHは、ユーグレナの代替量の増加と共に（線形及び三次関数的、P<0.01）増加した。図1に示されるように、第一胃のpHに対する試験区とサンプリング時間の交互作用は、二次関数的に影響された（P=0.015）。アンモニア態窒素濃度は、線形的（P<0.01）に増加及び三次関数的（P=0.06）に増加する傾向となった。第一胃のアンモニア態窒素濃度に対する試験区とサンプリング時間の交互作用も、ユーグレナ給与の増加に伴って、二次関数的（P<0.01）及び三次関数的（P<0.05）に影響された（図2）。総VFA濃度及び個々の脂肪酸の割合は、ユーグレナ給与により影響を受けなかった（P>0.05）（表9）。図3に示すように、第一胃のVFA濃度に対する試験区とサンプリング時間の交互作用は、線形的、二次関数的、および三次関数的（P<0.05）態様で影響を受けた。プロトゾアの総数はユーグレナの代替量の増加に伴って著しく（P<0.01）減少した（表9）。
第一胃のpHは、ユーグレナの代替量の増加と共に（線形及び三次関数的、P<0.01）増加した。図1に示されるように、第一胃のpHに対する試験区とサンプリング時間の交互作用は、二次関数的に影響された（P=0.015）。アンモニア態窒素濃度は、線形的（P<0.01）に増加及び三次関数的（P=0.06）に増加する傾向となった。第一胃のアンモニア態窒素濃度に対する試験区とサンプリング時間の交互作用も、ユーグレナ給与の増加に伴って、二次関数的（P<0.01）及び三次関数的（P<0.05）に影響された（図2）。総VFA濃度及び個々の脂肪酸の割合は、ユーグレナ給与により影響を受けなかった（P>0.05）（表9）。図3に示すように、第一胃のVFA濃度に対する試験区とサンプリング時間の交互作用は、線形的、二次関数的、および三次関数的（P<0.05）態様で影響を受けた。プロトゾアの総数はユーグレナの代替量の増加に伴って著しく（P<0.01）減少した（表9）。
●実験例２の考察
＜DM,OM,CP及び繊維成分摂取量に対するユーグレナ給与の効果＞
ユーグレナは、魅力的な栄養プロファイルを有しており、反芻動物の飼料中の代替的濃厚給与物として役立つことができる。本実験では、ユーグレナを含む飼料（最大150g/kg DMの摂取）は、DM摂取量の線形的増加に示されるように、容易に消費されたことが観察された。ユーグレナが150g/kg DMの用量で飼料に含まれたとき、乾物及びOMの摂取量は、それぞれ、最大で7.2%と7.6%まで増加した。
＜DM,OM,CP及び繊維成分摂取量に対するユーグレナ給与の効果＞
ユーグレナは、魅力的な栄養プロファイルを有しており、反芻動物の飼料中の代替的濃厚給与物として役立つことができる。本実験では、ユーグレナを含む飼料（最大150g/kg DMの摂取）は、DM摂取量の線形的増加に示されるように、容易に消費されたことが観察された。ユーグレナが150g/kg DMの用量で飼料に含まれたとき、乾物及びOMの摂取量は、それぞれ、最大で7.2%と7.6%まで増加した。
本実験にて、中鎖飽和脂肪酸は、ユーグレナに含まれる脂質により優先されるものであった。我々のデータは、栄養摂取量がユーグレナの代替量の増加に伴って増えることを示した。ユーグレナの代替量の増加（50～150g/kg DM摂取量）に伴って、粗蛋白質の摂取量は9.2%から21%に増加した。これは、ユーグレナ給与によって促進された乾物摂取量の増加に関連付けられている可能性がある。
本実験では、ユーグレナ給与群における中性デタージェント繊維の摂取量は、対照群と比較して変化しなかった。しかし、処置群内では、ユーグレナの代替量が増加するほどNDF摂取量が低かった。
＜栄養消化率に対するユーグレナ給与の効果＞
我々のデータは、見かけの粗蛋白質消化率が、0.69（T2-1、対照群）から0.72（T2-4、150g/kg DM給与群）に増加したことを示した。実験例1のin vitro試験に示されているように、これは、ユーグレナの高い消化率に関連している可能性がある。総エネルギーは、飼料中のユーグレナ又は脂肪酸濃度によって影響されなかった。脂肪酸（オレイン酸、リノール酸とアルファ‐リノレン酸）の効果に関する従来の研究では、80%のルーサン（Lucerne）と20%の大麦を含む混合飼料に対する、35g/kg w/w用量の給与で、DM、NDF及びADFの分解に影響を与えなかったことが示されている（Jalc et al., 2007, Veterinarni Medinina, vol.52(3), pp.87-94.）。
我々のデータは、見かけの粗蛋白質消化率が、0.69（T2-1、対照群）から0.72（T2-4、150g/kg DM給与群）に増加したことを示した。実験例1のin vitro試験に示されているように、これは、ユーグレナの高い消化率に関連している可能性がある。総エネルギーは、飼料中のユーグレナ又は脂肪酸濃度によって影響されなかった。脂肪酸（オレイン酸、リノール酸とアルファ‐リノレン酸）の効果に関する従来の研究では、80%のルーサン（Lucerne）と20%の大麦を含む混合飼料に対する、35g/kg w/w用量の給与で、DM、NDF及びADFの分解に影響を与えなかったことが示されている（Jalc et al., 2007, Veterinarni Medinina, vol.52(3), pp.87-94.）。
＜第一胃発酵に対するユーグレナの効果＞
本実験では、24時間インキュベーション後の第一胃内のpHは、ユーグレナの代替量が増加するにつれて、7.13から7.23まで増加することを示した。異なるサンプリング時間（0,2,4,6,8,24）のうち、第一胃のpHは24時間後で最も高かった。これは、朝の給餌からルーメン液の採取の時間が進行するにつれてVFA濃度が減少したことが関連していると考えられる。
本実験では、24時間インキュベーション後の第一胃内のpHは、ユーグレナの代替量が増加するにつれて、7.13から7.23まで増加することを示した。異なるサンプリング時間（0,2,4,6,8,24）のうち、第一胃のpHは24時間後で最も高かった。これは、朝の給餌からルーメン液の採取の時間が進行するにつれてVFA濃度が減少したことが関連していると考えられる。
第一胃でのアンモニア態窒素濃度は、微生物によるアンモニア態窒素の生産、吸収及び利用の結果である（Fiorentini et al., 2015, J. Anim. Sci., vol.28(11), pp.1583-1591.）。本実験では、飼料の100g/kg及び150g/kgの用量でユーグレナが給与されたときに、第一胃のアンモニア態窒素濃度は、それぞれ47.9%及び58.3%増加した。この結果は、ユーグレナの代替量が100g/kg DM以上の摂取量のときに、ユーグレナの給与が、アンモニア態窒素濃度を2-4倍に増加させたことを示した、実験例1のin vitro試験結果と一致している。これは、ユーグレナの高い窒素含有量および消化率に関係している可能性がある。炭水化物の利用効率を増加させることによって、第一胃で放出されたアンモニアの微生物による捕捉効率を改善することは、尿による窒素損失を低減する可能性がある（Agle et al., 2010; Hristov et al., 2005）。我々の実験から、ユーグレナの代替量を高くした条件下（150g/kg DM）において、アンモニア態窒素濃度が高いにもかかわらず、尿からの窒素損失は影響を受けなかったことが示された。このことは、下部消化管における窒素利用効率が増加したことによるものであると考えられる。そうでなければ、微生物のタンパク質の合成に利用されていない第一胃のアンモニア態窒素は、尿中に排泄される可能性があり、動物に対する純損失を表すとともに、環境汚染に影響を与えるものである（Tamminga,1992）。異なるインキュベーション時間における試験区とサンプリング時間の交互作用は、第一胃のアンモニア態窒素濃度が、長いインキュベーション時間と比べて、早い時期（0時間及び2時間）でより高かったことを示していた。
24時間インキュベーション後の第一胃の総VFA濃度のデータは、ユーグレナ給与によって第一胃総VFA濃度が影響を受けなかったことを示した。実験例１のin vitroでの実験でも、400g/kg DMまでのユーグレナ代替が、総VFA濃度に影響を及ぼさないことが確認された。Patra（2013）によるメタ分析の研究では、総VFA濃度及び酢酸のモル比は、飼料中の脂肪濃度の増加に影響を受けないことを示した。酢酸、プロピオン酸、及び酪酸のモル比、酢酸：プロピオン酸の比も、ユーグレナの代替によって影響を受けなかった。しかし、高レベルのユーグレナ給与（150g/kg）により、有意には変化しなかった対照と比べて、酢酸は6.7%減少し、プロピオン酸は10.7%増加し、酢酸とプロピオン酸の比は16.3％減少した。試験区とサンプリング時間の交互作用として、朝の給餌から24時間後に採取されたルーメン液では第一胃のVFA濃度が最も低くなることが示された。第一胃の原生動物集団（protozoa population）は、ユーグレナの代替量の増加に伴い、7.0%減少した。この結果は、原生動物集団がユーグレナの代替量の増加に伴い減少し、この減少が、微生物活性に影響を与えた、飼料中により高い割合で存在する飽和中鎖脂肪酸の負の効果に関連していると述べた実験例１のin vitroの実験と一致する。
＜エネルギー摂取および損失に対するユーグレナ給与の効果＞
本実験では、総エネルギー摂取量はユーグレナ給与量の増加（50-150g/kg DM摂取量）に応じて5.5-9.9％増加した。これは、ユーグレナ給与に影響を受けたDM摂取量の増加に関連している可能性がある。見かけの総エネルギー消化率は0、50、100および150g/kgのユーグレナ給与に対して、影響を受けず、それぞれ、0.53、0.53、0.50、0.54だった。エネルギー損失の大部分は、糞便を介しており、GE摂取量の0.46-0.51までを占めていた。GE摂取量と比較した、一日平均の糞便エネルギー損失は100g/kg DMのユーグレナ給与で高かった（50.5g/100g GE摂取量）。ユーグレナの代替量が150g/kg DMまで増加したとき、糞便におけるエネルギー損失（GE摂取量に対する割合）は、コントロールと比較して、影響を受けなかった。これは、高レベルのユーグレナ（150g/kg DM）を給与することによりエネルギーの利用効率が改善される可能性があることを示している。この実験では、全体的な尿のエネルギー損失は、非常に小さく、ユーグレナ給与によって影響を受けないことが観察された。
本実験では、総エネルギー摂取量はユーグレナ給与量の増加（50-150g/kg DM摂取量）に応じて5.5-9.9％増加した。これは、ユーグレナ給与に影響を受けたDM摂取量の増加に関連している可能性がある。見かけの総エネルギー消化率は0、50、100および150g/kgのユーグレナ給与に対して、影響を受けず、それぞれ、0.53、0.53、0.50、0.54だった。エネルギー損失の大部分は、糞便を介しており、GE摂取量の0.46-0.51までを占めていた。GE摂取量と比較した、一日平均の糞便エネルギー損失は100g/kg DMのユーグレナ給与で高かった（50.5g/100g GE摂取量）。ユーグレナの代替量が150g/kg DMまで増加したとき、糞便におけるエネルギー損失（GE摂取量に対する割合）は、コントロールと比較して、影響を受けなかった。これは、高レベルのユーグレナ（150g/kg DM）を給与することによりエネルギーの利用効率が改善される可能性があることを示している。この実験では、全体的な尿のエネルギー損失は、非常に小さく、ユーグレナ給与によって影響を受けないことが観察された。
＜CP摂取量と損失に対するユーグレナ給与の効果＞
CPの摂取量は、総DM摂取量の0.14-0.15であり、ユーグレナの代替量の増加にともない増加した。総CP損失は、総CP摂取量の0.57-0.65であり、CP摂取量の大部分が糞尿を介して失われたことを示していた。尿におけるCP損失は、総CP摂取量の0.40-0.46だった。この実験では、最高レベルのユーグレナ給与（150g/kg DM）で尿におけるCP損失が41%であり、コントロールの尿CP損失の40%と比較して影響を受けなかったことをデータは示した。これは、高レベルのユーグレナの代替量（150g/kg DM）が、消化管の下流におけるCPの利用効率を改善したことを示している。総CP摂取量の割合としての糞便におけるエネルギー損失は、22%（コントロール）から18%(150g/kg DM補給群)に減少した。本実験の知見は、ユーグレナの給与は糞便におけるCP損失を減少させ、窒素の利用効率を増加させることを示している。その結果、CP蓄積量（g/d）は、ユーグレナを150g/kg DMの用量で給与した場合、コントロールと比較して31.4％増加した。
CPの摂取量は、総DM摂取量の0.14-0.15であり、ユーグレナの代替量の増加にともない増加した。総CP損失は、総CP摂取量の0.57-0.65であり、CP摂取量の大部分が糞尿を介して失われたことを示していた。尿におけるCP損失は、総CP摂取量の0.40-0.46だった。この実験では、最高レベルのユーグレナ給与（150g/kg DM）で尿におけるCP損失が41%であり、コントロールの尿CP損失の40%と比較して影響を受けなかったことをデータは示した。これは、高レベルのユーグレナの代替量（150g/kg DM）が、消化管の下流におけるCPの利用効率を改善したことを示している。総CP摂取量の割合としての糞便におけるエネルギー損失は、22%（コントロール）から18%(150g/kg DM補給群)に減少した。本実験の知見は、ユーグレナの給与は糞便におけるCP損失を減少させ、窒素の利用効率を増加させることを示している。その結果、CP蓄積量（g/d）は、ユーグレナを150g/kg DMの用量で給与した場合、コントロールと比較して31.4％増加した。
＜ユーグレナのアミノ酸及び脂肪酸プロファイル＞
バランスのとれたユーグレナのアミノ酸プロファイルは、第一胃内発酵の促進に加えて、栄養の利用効率と吸収効率を高めた。必須アミノ酸に加えて、他のアミノ酸を合成するための十分な窒素の連続的な供給は、維持及び生産のために欠かせない（Boisen et al.,2000）。ユーグレナのリジンとメチオニンの割合（7.25:2.39）は、Boisenら（2000）が示した理想的なアミノ酸プロファイル（6.7:2.0）の割合と一致した。また、我々の実験より、ユーグレナは畜産物の栄養価の改善に重要な役割を果たすn-6及びn-3不飽和脂肪酸（ユーグレナ中の総脂肪酸の25.9%及び5.1%）を含む、多様なタイプの脂肪酸を含有することが示された。
バランスのとれたユーグレナのアミノ酸プロファイルは、第一胃内発酵の促進に加えて、栄養の利用効率と吸収効率を高めた。必須アミノ酸に加えて、他のアミノ酸を合成するための十分な窒素の連続的な供給は、維持及び生産のために欠かせない（Boisen et al.,2000）。ユーグレナのリジンとメチオニンの割合（7.25:2.39）は、Boisenら（2000）が示した理想的なアミノ酸プロファイル（6.7:2.0）の割合と一致した。また、我々の実験より、ユーグレナは畜産物の栄養価の改善に重要な役割を果たすn-6及びn-3不飽和脂肪酸（ユーグレナ中の総脂肪酸の25.9%及び5.1%）を含む、多様なタイプの脂肪酸を含有することが示された。
●実験例２のまとめ
本実験の結果から、飼料にユーグレナを代替すると、全消化管の見かけの消化率に影響を与えることなく、DM、OM、およびGEの摂取量が増加することが分かった。また、高レベル（150g/kg DM）のユーグレナ給与により、CP（粗蛋白質）の摂取量と消化率が増加し、それに付随してCPの蓄積が増加することが分かった。従って、飼料に対して150g/kg DMまでのユーグレナ給与が、良質な蛋白質の代替、及びエネルギー補助サプリメントとなり得る。
本実験の結果から、飼料にユーグレナを代替すると、全消化管の見かけの消化率に影響を与えることなく、DM、OM、およびGEの摂取量が増加することが分かった。また、高レベル（150g/kg DM）のユーグレナ給与により、CP（粗蛋白質）の摂取量と消化率が増加し、それに付随してCPの蓄積が増加することが分かった。従って、飼料に対して150g/kg DMまでのユーグレナ給与が、良質な蛋白質の代替、及びエネルギー補助サプリメントとなり得る。
更に、ユーグレナは、高い栄養価と蛋白質消化率を有し、反芻動物の飼料において質の良い蛋白質サプリメントの代替となり得ることが分かった。従って、ユーグレナは、他の飼料に代替されて、又は、ユーグレナ単独で、反芻動物における栄養価及び蛋白質消化率を改善するための反芻動物用飼料として用いることができることが分かった。
更に、本実験の結果より、ユーグレナを、反芻動物における蛋白質消化率を改善するための反芻動物用飼料として用いる場合には、ユーグレナを、0%より多く、かつ、40%以下の濃度、好適には、5-20%、より好適には、5-10％で代替すると、CP消化率が改善されることが分かった。
更に、本実験の結果より、ユーグレナを、反芻動物における蛋白質消化率を改善するための反芻動物用飼料として用いる場合には、ユーグレナを、0%より多く、かつ、40%以下の濃度、好適には、5-20%、より好適には、5-10％で代替すると、CP消化率が改善されることが分かった。
＜＜実験例３：ユーグレナと濃厚飼料との代替が羊からのメタン排出量に及ぼす影響＞＞
実験例３では、羊の飼料中にユーグレナを給与し、メタン排出量に対するユーグレナ給与の効果についてin vivoにて確認した。
実験例３では、羊の飼料中にユーグレナを給与し、メタン排出量に対するユーグレナ給与の効果についてin vivoにて確認した。
＜ユーグレナ粉末の調製＞
実験例３のユーグレナ粉末を得るために、ユーグレナの試料として、Euglena gracilis Zを用いた。まず、次の手順により、ユーグレナの前培養を行った。
オートクレーブにより滅菌したＣＭ培地29mlを、同じくオートクレーブにより滅菌済みのバイアルに導入し、ユーグレナを含む培養液1mlを加えた。この培養液を、30℃恒温槽中にて、5000lux下（光源は蛍光灯ビオルックスA 20W,NEC）、空気バブリング下にて１週間程度培養した。
使用したＣＭ培地の組成は、(NH4)2HPO4 1 g/L，KH2PO4 1 g/L，MgSO4・7H2O 0.2 g/L，CaCl2・2H2O 0.02 g/L，Fe2(SO4)3・7H2O 3.0 mg/L，MnCl2・4H2O 1.8 mg/L，CoSO4・7H2O 1.5 mg/L，ZnSO4・7H2O 0.4 mg/L，Na2MoO4・2H2O 0.2 mg/L，CuSO45H2O 0.02 mg/L，チアミン塩酸塩（ビタミンB1）0.1 mg/L，シアノコバラミン(ビタミンB12)0.001 mg/Lであった。CM培地はMarianら(1952)の文献を参考にして作製した。また、濃硫酸を加えることによってpHを3.5に調整した。
培養後、ユーグレナを含む培養液を、遠心分離し、沈殿物を洗浄、真空凍結乾燥して、実施例のユーグレナ粉末を得た。
ユーグレナ粉末と基礎飼料（ギニアグラス乾草と濃厚飼料）の化学組成を表１０に示す。
実験例３のユーグレナ粉末を得るために、ユーグレナの試料として、Euglena gracilis Zを用いた。まず、次の手順により、ユーグレナの前培養を行った。
オートクレーブにより滅菌したＣＭ培地29mlを、同じくオートクレーブにより滅菌済みのバイアルに導入し、ユーグレナを含む培養液1mlを加えた。この培養液を、30℃恒温槽中にて、5000lux下（光源は蛍光灯ビオルックスA 20W,NEC）、空気バブリング下にて１週間程度培養した。
使用したＣＭ培地の組成は、(NH4)2HPO4 1 g/L，KH2PO4 1 g/L，MgSO4・7H2O 0.2 g/L，CaCl2・2H2O 0.02 g/L，Fe2(SO4)3・7H2O 3.0 mg/L，MnCl2・4H2O 1.8 mg/L，CoSO4・7H2O 1.5 mg/L，ZnSO4・7H2O 0.4 mg/L，Na2MoO4・2H2O 0.2 mg/L，CuSO45H2O 0.02 mg/L，チアミン塩酸塩（ビタミンB1）0.1 mg/L，シアノコバラミン(ビタミンB12)0.001 mg/Lであった。CM培地はMarianら(1952)の文献を参考にして作製した。また、濃硫酸を加えることによってpHを3.5に調整した。
培養後、ユーグレナを含む培養液を、遠心分離し、沈殿物を洗浄、真空凍結乾燥して、実施例のユーグレナ粉末を得た。
ユーグレナ粉末と基礎飼料（ギニアグラス乾草と濃厚飼料）の化学組成を表１０に示す。
＜実験動物、飼料と給与飼料＞
4頭の去勢されたコリデール種雄羊(体重68.13±7.20 kg)を、クロスオーバー法で呼吸試験に用いた。供試羊を個々の代謝ケージに入れ、ギニアグラス（Panicum maximum）乾草と濃厚飼料を混合した基礎飼料(表10)を、維持レベル（55g DM/kg BW0.75/日）で1日2回（午前8時30分と午後4時30分）給与し、水及びミネラルブロック（ミネラルブロック1kgあたり、酸化鉄1742mg,酸化第二鉄196mg,硫酸銅377 mg,硫酸コバルト66mg,硫酸亜鉛1235mg,炭酸マンガン1046mg,ヨウ素酸カルシウム77mg,亜セレン酸ナトリウム33mg,及び塩化ナトリウム971g）は自由摂取とした。対照区の飼料は、70%ギニアグラス乾草及び30%濃厚飼料とし、試験区の飼料は70%ギニアグラス乾草、15%濃厚飼料及び15%ユーグレナとした。飼料における%は、全配給量に対する乾物中のkgを示している。摂取を容易にし、選択採食を避けるために、各飼料でユーグレナ粉末と濃厚飼料を十分に混合した。
4頭の去勢されたコリデール種雄羊(体重68.13±7.20 kg)を、クロスオーバー法で呼吸試験に用いた。供試羊を個々の代謝ケージに入れ、ギニアグラス（Panicum maximum）乾草と濃厚飼料を混合した基礎飼料(表10)を、維持レベル（55g DM/kg BW0.75/日）で1日2回（午前8時30分と午後4時30分）給与し、水及びミネラルブロック（ミネラルブロック1kgあたり、酸化鉄1742mg,酸化第二鉄196mg,硫酸銅377 mg,硫酸コバルト66mg,硫酸亜鉛1235mg,炭酸マンガン1046mg,ヨウ素酸カルシウム77mg,亜セレン酸ナトリウム33mg,及び塩化ナトリウム971g）は自由摂取とした。対照区の飼料は、70%ギニアグラス乾草及び30%濃厚飼料とし、試験区の飼料は70%ギニアグラス乾草、15%濃厚飼料及び15%ユーグレナとした。飼料における%は、全配給量に対する乾物中のkgを示している。摂取を容易にし、選択採食を避けるために、各飼料でユーグレナ粉末と濃厚飼料を十分に混合した。
＜実験手順＞
実験は、12日間の馴致、3日間の呼吸試験からなる各15日間を1サイクルとして、2サイクル繰り返して、30日間行った。給与飼料、残飼料、呼気ガスのサンプルを採取し、メタン濃度を分析した。呼気中のメタンガスは、ヘッドフードを備えた開放型呼吸試験装置(Takahashi et al., 1999, Small Ruminant Research, vol.32, pp.31-36.)によって1分間隔で分析し、0℃，1気圧に換算して発生量を求めた。
実験は、12日間の馴致、3日間の呼吸試験からなる各15日間を1サイクルとして、2サイクル繰り返して、30日間行った。給与飼料、残飼料、呼気ガスのサンプルを採取し、メタン濃度を分析した。呼気中のメタンガスは、ヘッドフードを備えた開放型呼吸試験装置(Takahashi et al., 1999, Small Ruminant Research, vol.32, pp.31-36.)によって1分間隔で分析し、0℃，1気圧に換算して発生量を求めた。
●実験例３の結果と考察
ユーグレナの給与が羊からのメタン排出量に及ぼす影響を、表11に示す。
羊からのメタン排出量は、対照区では1日当たり31.83Lであり、試験区では23.95Lであった。これらの値は、危険率1%で有意な差であった。飼料中乾物当たり15%の濃厚飼料とユーグレナの代替は、濃厚飼料のみの場合と比較して、羊からのメタン排出量を18%減少させるものといえる。
ユーグレナの給与が羊からのメタン排出量に及ぼす影響を、表11に示す。
羊からのメタン排出量は、対照区では1日当たり31.83Lであり、試験区では23.95Lであった。これらの値は、危険率1%で有意な差であった。飼料中乾物当たり15%の濃厚飼料とユーグレナの代替は、濃厚飼料のみの場合と比較して、羊からのメタン排出量を18%減少させるものといえる。
Claims (9)
- ユーグレナを有効成分として含むメタン生成抑制剤。
- 反芻動物に投与するための、請求項１に記載のメタン生成抑制剤。
- 請求項１又は２に記載のメタン生成抑制剤を含む反芻動物用飼料。
- 前記反芻動物のルーメンにおける前記飼料の消化率を改善する消化率改善剤として用いられることを特徴とする請求項３に記載の反芻動物用飼料。
- 前記ユーグレナを、０重量％より多く、かつ２０重量％未満含有する請求項４に記載の反芻動物用飼料。
- 請求項３乃至５いずれかに記載の反芻動物用飼料を、反芻動物に経口的に摂取させて、前記反芻動物の反芻胃内のメタン生成を抑制するメタン生成抑制方法。
- 前記反芻動物における前記飼料の蛋白質消化率を改善する蛋白質消化率改善剤として用いられることを特徴とする請求項３に記載の反芻動物用飼料。
- 前記ユーグレナを、０重量％より多く、かつ２０重量％未満含有する請求項７に記載の反芻動物用飼料。
- 請求項７又は８に記載の反芻動物用飼料を、反芻動物に経口的に摂取させて、前記反芻動物における蛋白質の消化率を改善する蛋白質消化率改善方法。
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|---|---|---|---|
| JP2015254567 | 2015-12-25 | ||
| JP2015-254567 | 2015-12-25 | ||
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|---|---|
| WO2017110523A1 true WO2017110523A1 (ja) | 2017-06-29 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PCT/JP2016/086721 WO2017110523A1 (ja) | 2015-12-25 | 2016-12-09 | メタン生成抑制剤、反芻動物用飼料、メタン生成抑制方法及び蛋白質消化率改善方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| WO (1) | WO2017110523A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108813157A (zh) * | 2018-08-14 | 2018-11-16 | 仁怀市刘祥养殖场 | 一种促进牛消化吸收的饲料添加剂 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60196184A (ja) * | 1984-03-16 | 1985-10-04 | Amano Pharmaceut Co Ltd | ユ−グレナの培養法 |
| JP2004008063A (ja) * | 2002-06-06 | 2004-01-15 | Osaka Prefecture | 鶏の肉質及び鶏卵の品質を改良するためユーグレナ培養液を給餌する養鶏方法 |
| JP2014027929A (ja) * | 2012-07-06 | 2014-02-13 | Euglena Co Ltd | 生物用飼料添加剤 |
| EP2803275A1 (en) * | 2013-05-15 | 2014-11-19 | Friesland Brands B.V. | A process for supplementary feeding of animals, a process for adjusting the milk composition of a mammal, and uses of an Euglenida biomass |
-
2016
- 2016-12-09 WO PCT/JP2016/086721 patent/WO2017110523A1/ja active Application Filing
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60196184A (ja) * | 1984-03-16 | 1985-10-04 | Amano Pharmaceut Co Ltd | ユ−グレナの培養法 |
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| EP2803275A1 (en) * | 2013-05-15 | 2014-11-19 | Friesland Brands B.V. | A process for supplementary feeding of animals, a process for adjusting the milk composition of a mammal, and uses of an Euglenida biomass |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ASHAGRIE AEMIRO, THE JAPANESE SOCIETY ZOOTECHNICAL SCIENCES, 11 September 2015 (2015-09-11), pages 49 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108813157A (zh) * | 2018-08-14 | 2018-11-16 | 仁怀市刘祥养殖场 | 一种促进牛消化吸收的饲料添加剂 |
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