WO2017106983A1 - Vacuna contra isav con dicho virus inactivado y un adyuvante basado en cuerpos celulares la que potencia la respuesta inmune - Google Patents

Vacuna contra isav con dicho virus inactivado y un adyuvante basado en cuerpos celulares la que potencia la respuesta inmune Download PDF

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WO2017106983A1
WO2017106983A1 PCT/CL2016/050074 CL2016050074W WO2017106983A1 WO 2017106983 A1 WO2017106983 A1 WO 2017106983A1 CL 2016050074 W CL2016050074 W CL 2016050074W WO 2017106983 A1 WO2017106983 A1 WO 2017106983A1
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fish
isav
vaccine
virus
cell bodies
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Marcelo Cortez San Martin
Claudio ACUÑA CASTILLO
Margarita MONTOYA KUNSTING
Daniela TORO ASCUY
Yesseny VASQUEZ MARTINEZ
Alvaro Eugenio SANTIBAÑEZ VARGAS
Sebastian Alberto GONZALEZ CATRILELBUN
Nicolas Pablo SANDOVAL ASTUDILLO
Luis Eduardo COTTET BUSTAMANTE
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Universidad De Santiago De Chile
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Definitions

  • the present invention relates to vaccines aimed at aquaculture. Particularly, in salmon farming. Specifically, the present invention relates to a vaccine adjuvant based on cell bodies and to the vaccine comprising said adjuvant to enhance the immune response of fish, preferably salmonids, against infection caused by the Infectious Salmon Anemia Virus (ISAV ).
  • ISAV Infectious Salmon Anemia Virus
  • the virus induces cell death by apoptosis, showing a clear response to this type of death (caspase activity 3/7, mitochondrial morphology, induction of genes that respond to type I FN) [Schi0tz, B. L, Baekkevold , ES, Poulsen, L. C, Mjaaland, S., & Gj0en, T. (2009). Analysis of host- and strain-dependent cell death responses during infectious salmon anemia virus infection in vitro. Virology journal, 6, 91].
  • the virulence of a virus is defined by its comparative capacity to generate the disease.
  • host genetic factors are the major susceptibility determinants in infectious diseases in humans [KL Tyler and N. Nathanson, Fields Virology 4th edition (Lippincott, Williams and Wilkins, Philadelphia, (2001), pp. 199-243]
  • ISAV Orthomyxoviridae
  • Immunotherapy is a treatment focused on stimulating the cell's immune system, reprogramming its response to various diseases [Spetz, A.-L., Sórensen, AS, Walther-Jallow, L., Wahren, B., Andersson, J ., Holmgren, L., & Hinkula, J. (2002). Induction of HIV-1-specific immunity after vaccination with apoptotic HIV-1 / murine leukemia virus-infected cells. Journal of immunology (Baltimore, Md.: 1950), 169 (10), 5771-9; Mégret, F., Prehaud, C, Lafage, M., Batejat, C, Escriou, N., Lay, S., Lafon, M. (2005).
  • cell bodies would correspond to the portion of the cell that contains the nucleus and the surrounding cytoplasm without its extensions (for example, in the case of a dendrite, does not include the axon), and therefore, corresponds to the area of greater volume of the cell that is actively involved in cellular metabolism rather than in performing the specific function recognized for the cell (for example, the neuron has as its main function, the reception of stimuli and the axon conduction of the nerve impulse).
  • WO9903499 [Laurence Zitvogel, Graca Raposo, Armelle Regnault, Sebastian Amigorena. (1999) Vesicule cellulaire called "exosome", leur preparation et utilization dans the stimulation d'une reponse immunitaire.
  • Inst Nat Sante Rech Med protects a method to sensitize antigen-presenting cells, using membrane vesicles with immunogenic properties. Particularly, it teaches compositions comprising texosomes (vesicles derived from tumor cells) and dexosomes (vesicles derived from dendritic cells loaded with antigens or not), useful for treating cancer and infectious, parasitic or autoimmune diseases.
  • salmon have a recognizable adaptive immune system, identifying conserved cell types between teleosts and mammals.
  • a controlled and protective immune response that is not harmful and only limited to the antigens present in conventional vaccines in the salmon industry, is what is sought with the present invention.
  • the present invention relates to a vaccine adjuvant comprising cell bodies and to the vaccine comprising said adjuvant to enhance the immune response of salmonids against infection caused by ISAV.
  • the vaccine of the present invention comprises inactivated ISA virus and cell bodies generated from cells from the previous kidney (ASK) of Salmo salar, a co-formulation that improves the immune response of salmonids against infection with ISA virus and gives protection to the fish after the challenge with the virus under controlled conditions.
  • ASK previous kidney
  • cell death is induced by heat treatment and nutrient deprivation on cells derived from Atlantic salmon macrophages.
  • ASK cells are grown to a confluence of 90 to 100%, and then subjected to thermal shock for a short period of time.
  • the vaccine described in the present application comprises an isolate of the ISA virus - predominant in fish farmers, inactivated by chemical methods (Binary Ethylene Imine (BEI)), and cellular bodies in saline buffer, which are capable of stimulating the formation of interferon gamma (IFN- ⁇ ) promoting antiviral status in the cell, which is estimated without supporting any particular theory, which is presumably due to the presence of the inactivated virus.
  • BEI Binary Ethylene Imine
  • IFN- ⁇ interferon gamma
  • the use of vaccines with cell bodies allows the cell to be programmed to generate a response.
  • This response is corroborated by observing an increase in regulatory T lymphocytes (CD4 +) involved in the maturation of memory cells, effectors and cytotoxic T cells (CD8 +), among others.
  • This programming in the cell has an immunomodulatory function, which is observed in the increase of markers such as IL-10 and TGF- ⁇ , which are responsible for modulating the proinflammatory processes and uncontrolled cell proliferation caused by infections Pathogen mediated.
  • the present vaccine with cell bodies is capable of activating the cell's defenses by means of a pro-inflammatory state elicited by IFN- ⁇ , and at the same time controlling the response by increasing the levels of IL-10 and TGF- ⁇ , cytokines with anti-inflammatory function capable of modulating the pro-inflammatory response in an autocrine and paracrine manner. All this, together, produces in the fish a controlled, protective and limited immune response to the antigens present in conventional vaccines used in the salmon industry.
  • the vaccine of the present invention was tested by generating a vaccine consisting of inactivated ISA virus co-formulated with cell bodies (CelIVac-ISAv), inactivated ISA virus (ISAv nact) and a commercial vaccine against ISAV (Commercial Vaccine ).
  • the different vaccines allowed to evaluate the effect of cell bodies in the generation of specific antibodies against ISAV and in the induction of cytokines as a result of vaccination to finally provide protection to fish after a challenge with the virus under controlled conditions.
  • vaccines were developed that have different cell body formulations, in addition to controls such as inactivated ISA virus and a conventional formulation vaccine (Commercial Vaccine).
  • the different vaccines allowed to evaluate the effect of cell bodies in the generation of specific antibodies against ISAV and in the induction of cytokines resulting from vaccination.
  • the formulations were evaluated in fish arranged in different ponds with specimens of Atlantic salmon.
  • IgM immunoglobulin M
  • the total heart RIMA was extracted, an organ recommended by the World Organization for Animal Health for the diagnosis of ISAV (OIE, 2009, http: //www.oie. Int / fileadmin / Home /eng/Health_standards/aahm/current/2.3.05_IS A.pdf); and on the other hand, to evaluate the induction of cytokines product of the Vaccination and / or infection, the total RIMA was extracted from the spleen, an important lymphoid organ in the fish's immune response.
  • the viral titer was determined by real-time one-step RT-PCR quantifying the number of copies of segment 8 of ISAV, F5: 5'- GAAGAGTCAGGATGCCAAGACG-3 'and R5: 5'- GAAGTCGATGAACTGCAGCGA-3' that generate a product of 196 base pairs (bp).
  • the first strand of cDNA was synthesized by reverse transcription.
  • the quantification of the transcripts encoding the cytokines was carried out by real-time PCR using as a template the cDNAs generated from the mRNAs.
  • the relative quantification method described by Pfaffl was used, using the elongation factor eFl- ⁇ as the reference gene for the normalization of the expression of the analyzed genes.
  • the differences between the concentration values (Ct) of the amplicons of the analyzed genes and the Ct corresponding to the reference gene were expressed as ACt.
  • the differences between the ACt of each treatment were compared with the ACt of the control groups (vaccinated with PBS) and this difference was expressed as 2 "( ⁇ ⁇ ⁇ > 'representing the change in the levels of expression or relative normalized expression (NRE) [Pfaffl MW. (2001)
  • NRE relative normalized expression
  • RPS relative survival rate
  • the viral titer of the "Control”, “Cell Bodies”, “Commercial Vaccine”, “CellVac-ISAv” and “ISAv nact” groups was determined at 21, 41 , 63 and 90 dpv. It is important to note that the challenge with ISAV was performed on day 42 post vaccination. It is shown that at day 63 post vaccination, there is an increase in viral titer in all groups of challenged fish, however, only the fish in the control group have a viral titer over 100,000 copies / mL. On day 90 post vaccination, all groups show an increase in viral titer when compared with unchallenged fish, however this titer is lower than that observed on day 63.
  • the serum of the fish corresponding to the preimmune sera (-1 dpv) was determined as control, observing samples with absorbances of the order of 0.5, considering this value as the cut line. Values above the cut-off line propose the presence of anti-ISAV antibodies produced by vaccination and / or challenge.
  • IFN- ⁇ In fish vaccinated with the Commercial Vaccine, an increase is observed for IFN- ⁇ at day 21 due to vaccination, subsequently an increase is observed at day 63 of 25 times compared to the control.
  • CD4 In the case of CD4, there is an increase at day 21 due to vaccination, and a subsequent increase at day 63 of 5 times is observed in comparison to the control.
  • IL-10 there is an increase at day 21 due to vaccination, a 63 day increase is observed 5 times compared to the control and for TGF- ⁇ a decrease in expression at day 21 is observed compared to the control.
  • the viral load observed on day 63 is less than that of the control.
  • IgM shows an increase to day 63 and 90 possibly generated by the challenge with ISAV.
  • Figures 1A and IB Visualization of cell bodies derived from ASK cells by phase contrast. ASK cells were subjected to a process of heat death and nutrient deprivation in order to generate cell bodies; and then 100 ⁇ of suspension of these were fixed. The images were acquired by confocal microscopy in 40X.
  • FIGS 2A-2C Analysis of the levels of INF- ⁇ transcripts in ASK cells.
  • the relative expression of transcripts was determined by qRT-PCR in the treated cells and normalized with respect to the relative expression of transcripts in cells stimulated with PBS. The results are shown as the average of the relative and normalized expression + ES.
  • (*) Indicates that the values have statistical significance with respect to the cells treated with PBS. Statistical differences were obtained by ANOVA of a non-parametric route (Kruskal Wallis) together with Dunn's post test, * p ⁇ 0.05.
  • FIG. 3A-3C Analysis of IL-10 transcript levels in ASK cells.
  • the relative expression of transcripts was determined by qRT-PCR in the treated cells and normalized with respect to the relative expression of transcripts in cells stimulated with PBS. The results are shown as the average of the relative and normalized expression ⁇ ES.
  • (*) Indicates that the values have statistical significance with respect to the cells treated with PBS.
  • Statistical differences were obtained by ANOVA of a non-parametric route (Kruskal Wallis) together with Dunn's post test, * p ⁇ 0.05.
  • FIG 4A-4C Analysis of TGF- ⁇ transcript levels in ASK cells.
  • the relative expression of transcripts was determined by qRT-PCR in the treated cells and normalized with respect to the relative expression of transcripts in cells stimulated with PBS. The results are shown as the average of the relative and normalized expression + ES.
  • (*) Indicates that the values have statistical significance with respect to the cells treated with PBS. Statistical differences were obtained by ANOVA of a non-parametric route (Kruskal Wallis) together with Dunn's post test, * p ⁇ 0.05.
  • FIG. 7 Serum IgM levels induced by ISAV.
  • the graph on the left indicates the groups of fish without challenge.
  • the graphic on the right indicates the challenged groups.
  • FIG. 8 Viral titer of ISAV over time in the trial with vaccinal prototypes (CelIVac-ISAv), inactivated ISA virus (ISAv nact) and commercial vaccine against ISAV (Commercial Vaccine).
  • the viral titer of the vaccinated fish is shown at 21 and 41 days after the start of the test. It also shows the viral titer of vaccinated fish at 63 and 90 days without challenging and comparing their levels with fish challenged at 63 and 90 days post vaccination.
  • the number of copies / mL of segment 8 of ISAV was determined by qRT-PCR from 200ng of total RNA extracted from the heart of the fish and the value was interpolated to the data of the calibration curve obtained.
  • Figure 9 Variation of mNA levels of IFN- ⁇ , CD4, IL-10 and TGF- ⁇ in spleen depending on the different vaccine formulations.
  • the transcript level expression of IFN- ⁇ , CD4, IL-10 and TGF- ⁇ was evaluated by real-time PCR.
  • the relative and normalized expression (NRE) of IFN- ⁇ , CD4, IL-10 and TGF- ⁇ of the vaccinated fish groups before the challenge and of the vaccinated and challenged fish groups is shown and compared with the relative expression of the group of untreated fish. Values are shown as the average normalized relative expression (NRE) + SE.
  • Statistical differences were determined by a statistical significance test of non-parametric (Mann-Whitney) between groups of vaccinated fish and untreated fish. *, p ⁇ 0.05.
  • the present invention relates to a vaccine adjuvant comprising cell bodies and to the vaccine comprising said adjuvant to enhance the immune response of salmonids against infection caused by ISAV.
  • the vaccine of the present invention comprises inactivated ISA virus and cell bodies generated from cells from the previous kidney (ASK) of Salmo salar, a co-formulation that improves the immune response of salmonids against infection with ISA virus and gives protection to the fish after the challenge with the virus under controlled conditions.
  • the vaccine comprises an amount in the range of lxlO 5 to lxlO 7 virus / dose of ISA virus inactivated with BEI and an amount in the range of lxlO 4 to lxlO 6 cell body / dose.
  • ASK cells induced to cell death by heat treatment and nutrient deprivation were grown to a confluence of 90 to 100%, and subjected to thermal shock at 37 ° C for 30 min, and the medium was discarded. of culture and washed the monolayer with three volumes of phosphate buffered saline (PBS), removing all trace of nutrients. Subsequently, the cells are subjected to a deprivation process, incubating them for one week in 10ml PBS IX for a T175 culture bottle or until the monolayer detached, and the suspended cell bodies were stored at 4 ° C, see Fig. 1.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the vaccine described in the present application comprises an inactivated ISAV isolate (lxlO 6 inactive virus / dose) in conjunction with a certain amount of cell bodies in saline buffer (lxlO 5 cell./dose), which are capable of stimulating the formation of interferon gamma (INF- ⁇ ) to promote antiviral status in the cell.
  • This programming in the cell has an immunomodulatory function, which is observed in the increase of markers such as IL-10 and TGF- ⁇ .
  • the vaccine with cell bodies is able to activate the cell's defenses through a pro-inflammatory state elicited by IFN- ⁇ , and at the same time, it is able to control the response by raising the levels of IL-10 and TGF- ⁇ , cytokines with anti-inflammatory function capable of modulating in an autocrine way as to neighboring cells. All this together produces a controlled, protective and bounded immune response to the antigens present in conventional vaccines used in the salmon industry, see Figures 2A-2C, 3A-3B and 4A-4C.
  • the technology of the present invention was tested by generating vaccines constituted of inactivated ISA virus co-formulated with cell bodies (CelIVac-ISAv), inactivated ISA virus (ISAv nact) and a commercial vaccine against ISAV (Commercial Vaccine) .
  • the tests were carried out in the laboratory, where different freshwater ponds with specimens of Atlantic salmon were available. Spleen, heart and kidney were removed, in addition to a blood sample from each population to assess the level of cytokines, viral load and antibodies before starting the assay.
  • the fish were immunized on day 21 with different vaccines to study, and on day 22 blood and organ samples were taken again.
  • the fish were challenged 42 days post vaccination with ISAV through cohabitation and the next day new blood and organ samples were taken.
  • the trial was extended 90 days post vaccination and during this period two samples were made to study the evolution of the immune response in fish. In addition, mortality was recorded throughout the trial. (Fig. 5 and Fig. 6).
  • the viral titer was evaluated on days 21 and 41 post vaccination (dpv). On day 42, the salmon were challenged by cohabitation with ISAV HP _7b (European Genotype highly prevalent in Chile between 2008-2009) after being inoculated intraperitoneally in Trojan salmon, and at 63dpv and 90dpv, the viral titer was determined again to compare with groups vaccinated not challenged.
  • ISAV HP _7b European Genotype highly prevalent in Chile between 2008-2009
  • the vaccine formulation of the present invention may comprise a vial comprising 1x10 s inactive virus / dose mixed with 10 5 Cell bodies / dose using phosphate buffered saline (PBS) as diluent solution.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the inactivated viruses are mixed under sterile conditions with the suspension of cells already quantified until reaching the concentrations indicated previously using autoclaved PBS.
  • the formulation may also comprise a kit of two bottles that i) comprises the inactivated and lyophilized virus and ii) suspension in PBS of cell bodies.
  • the reconstitution of i) using ii) as Diluent makes it possible to have the aqueous formulation sufficient in quantity and quality to be used as a vaccine in salmonid species to be administered intraperitoneally.
  • Example 1 Ex vivo evaluation of cell bodies.
  • the ASK cell line, ATCC N Q C L-2747, macrophage type, from salmo salar L. (Atlantic salmon) was grown in Leibovitz's 15 culture medium (L-15, Gibco ® , Invitrogen ® , Carlsbad, CA, USA), supplemented with 4mM L-glutamine (Corning cellgro ® , Mediatech), 10% v / v inactivated Bovine Fetal Serum (SFB) (Hyclone ® , Thermo Fischer Scientific, Logan, Utah, USA), 50 ug / mL of gentamicin (US Biological, Swampscott, MA, USA), 200 IU penicillin / 200 ⁇ g / mL streptomycin (Corning cellgro ® , Mediatech) and 40 ⁇ ⁇ -mercaptoethanol (Gibco ® , Life Technologies). The cells were incubated at 18
  • Salmon cells derived from the anterior kidney were subjected to a process of cell death by nutrient deprivation to obtain cell bodies.
  • the procedure is based on growing ASK cells to a confluence of 90 to 100%. Then, they are subjected to thermal shock at 37 ° C for 30 min. Subsequently, the culture medium is discarded and the monolayer is washed with three volumes of PBS, removing any trace of nutrients. Once the washes are finished, the cells are subjected to a process of deprivation, for which the cells are incubated for one week in 10 ml of PBS IX for a T175 culture bottle or until the monolayer is detached. Subsequently, the suspended cell bodies are stored at 4 ° C.
  • ASK cells with 80-90% confluence were analyzed by confocal microscopy which were subjected to deprivation to generate cell bodies.
  • the cells were seeded in 8-well plates Nunc TM Lab-Tek TM II Chamber Slide TM System (Thermo Scientific), the cell supernatant was removed, the cells were washed twice with PBS and then fixed with 100 ⁇ 100 of solution of 4% paraformaldehyde in PBS for 10 min, thereafter the cells were treated with propidium iodide to mark the nuclei.
  • Example 2 In vivo assay with salmon cell bodies
  • vaccines were developed that possess different formulations of cell bodies, in addition to controls such as virus inactivated with BEI at 1x10 s virus / dose and commercial vaccines composed of ISAV Ixl0 7 -7.5xl0 7 TCI D 50 in liquid paraffin.
  • the different vaccines will evaluate the effect of cell bodies on the generation of specific antibodies against ISAV and in the induction of cytokines product of vaccination.
  • the formulations were evaluated in fish arranged in different ponds with specimens of Atlantic salmon. Spleen, heart and anterior kidney were removed, in addition to a blood sample from each population to assess the level of cytokines, viral load and antibodies before starting the assay, respectively.
  • the vaccinated fish of the 13 groups destined to the potency study were visually analyzed to determine unwanted effects [Red, PHV and D. d. P. and. MP University of Concepconstru. Faculty of Veterinary Medicine (2006). Evaluation of the safety of application of an injectable commercial vaccine against I NP-VI DRIO in Atlantic salmon, for four months after vaccination, Universidad de Concepconstru] and randomly sampled in the order of 5 specimens per group. After the challenge, the other 13 challenged groups were also sampled to determine the effect of the infection on the humoral response. The analyzes were done at 3 fish per group and the data treated statistically.
  • the vaccine testing process was carried out in freshwater fish maintenance systems and they have the corresponding permits to work with ISAV.
  • 400 Atlantic salmon (Salmo salar) with an average weight of 86.5 g and an average length of 20 cm were used, which were transferred from fresh water to salt water to promote esmoltification.
  • the vaccination was carried out.
  • the fish were anesthetized by immersion with 40mg / mL of benzocaine, then they were manually immobilized and injected intraperitoneally using 0.1 ⁇ L of the corresponding formulation.
  • 120 fish were used per vaccine formulation, which in turn were divided into two groups, one to be used in the challenge and the other as a control of vaccinated without challenging, those that were kept in fresh water, containing 60 fish per pond of 200 L of water each. For each pond, 5 fish corresponding to the controls (PBS) were added. Prior to vaccination, Sampled 3 fish to be used as controls (healthy and unvaccinated fish) in subsequent analyzes. The organs selected were heart and spleen, stored at -80 Q C in later RNA (Ambion, Life Technologies), to later be used in the determination of viral load and for the analysis of the transcript profile of immunological markers in salmon, respectively.
  • Blood samples were also taken from the same fish, which after coagulation, was centrifuged at 3000 xg for 10 minutes to separate the serum from the clot. The serum was aliquoted and stored at -80 Q C for later use in ELISA assays.
  • Mortality Analysis The fish were monitored daily in the different groups of fish. Mortality data were analyzed under survival analysis using the non-parametric estimator of survival function. by Kaplan-Meier [Kaplan EL, Meier P. (1958) Nonparametric estimation from incomplete observations. J Am Stat Assoc 1958; 53: 457-81].
  • viral particles were purified for indirect ELISA assays. Purification was performed from ASK cells infected with ISAV 752 (lxlO 7 copies / mL) after 14 days post infection. The cell supernatant was taken and clarified at 5000 rpm in SS-34 rotor (Sorvall) for 20 minutes at 4 ° C. The pellet obtained was discarded and the supernatant was ultracentrifuged at 33,000rpm in 70 Ti rotor
  • pellet was resuspended and deposited on 5 mL of a 20% sucrose mattress in cold TNE buffer.
  • the preparation was ultracentrifuged in a 55 Ti rotor (Beckman) at 32000rpm for 2 hours at 4 ° C.
  • the pellet is resuspended in TNE buffer.
  • the quantification of viral proteins was performed using the Bradford method and the interpolation of data with a calibration curve with BSA (Table I). After quantification, it is quickly stored at -80 ° C until it is used. A total of 240 ⁇ g of viral antigen was obtained from 6 bottles T-175 with 10 dpi Each of the 96 wells was seeded with 1 ⁇ g of viral antigen in 100 ⁇ of PBS and incubated overnight at 4 Q C to form a sieve at the bottom of the well.
  • IgM immunoglobulin M
  • Mouse-generated Atlantic salmon monoclonal IgM primary antibody (GrupoBios) was used in a 1: 500 dilution (in PBS / 1% BSA) for 90 minutes at 16 ° C and a 1: 2000 goat-generated secondary antibody (in PBS / 1% BSA) conjugated to HRP for one hour at room temperature that allows, through a colorimetric reaction, the indirect detection of IgM.
  • the plates were washed with PBST (0.5% Tween 20 V / V in PBS).
  • PBST 0.5% Tween 20 V / V in PBS
  • KPL 3,3 ', 5,5'-Tetramethyl benzidine
  • RNA extraction To assess the viral titer present in fish, total heart RNA was extracted, an organ recommended by the World Organization for Animal Health for the diagnosis of ISAV (OIE, 2009, http: //www.oie. Int / fileadmin / Home / eng / Health_standards / aahm / current / 2.3.05_IS A.pdf); and on the other hand, to evaluate the induction of cytokines resulting from vaccination and / or infection, total RNA was extracted from the spleen, an important lymphoid organ in the fish's immune response.
  • a piece of heart or spleen was placed in a 2mL microtube and lmL of Trizol ® was added where it was homogenized in the cold with a rotor-stator.
  • the homogenized tissue was treated with 200 ⁇ of chloroform and mixed vigorously (vortex) for 20 ° C at room temperature. Then the sample was centrifuged at 13,200pm for 15 minutes at 4 ° C.
  • the aqueous phase obtained was collected in a volume of cold isopropanol, where it was mixed by immersion and incubated 30 minutes at room temperature to precipitate the RNA.
  • RNA obtained is dissolved in 40 ⁇ of pre-heated nuclease-free water that is subsequently incubated at 65 ° C for 10 minutes for quantification by absorbance at 260/280 nm by the Nanoquant Infinite M200 pro equipment (TECAN, Austria).
  • RNA quantification data see annex 1
  • 1 ⁇ g of RNA was considered as starting material.
  • the RNA was quantified, it was stored at -80 ° C until it was used.
  • RT-PCR in real time. The viral titer was determined by real-time one-step RT-PCR quantifying the number of copies of segment 8 of ISAV, F5: 5'- GAAGAGTCAGGATGCCAAGACG-3 'and R5: 5'- GAAGTCGATGAACTGCAGCGA-3' that generate a 196pb product.
  • RNA from the heart is treated with DNAse I according to the manufacturer's recommendations.
  • the KAPA SYBR FAST One-Step qRT-PCR kit (Kapa Biosystems) was used in the Eco TM Real-Time PCR System (lllumina, San Diego, CA, USA) with the Eco 5.0 software.
  • the reaction mixture was: 5 ⁇ of Master mix 2X, 1 ⁇ of F5 splitter (10 ⁇ ), 1 ⁇ of R5 splitter (10 ⁇ ), 1 ⁇ of nuclease-free water and 2 ⁇ of RNA (200ng).
  • the thermal profile used to amplify segment 8 was: 12 minutes at 42 Q C, an initial denaturation step at 95 Q C for 3 minutes followed by 40 cycles of amplification (10 seconds at 95 ° C, 20 seconds at 60 Q C and 15 seconds at 72 Q C) and a final extension at 72 ° C for 5 minutes.
  • a dissociation cycle was performed at the end of the qRT-PCR (1 minute at 95 ° C, 30 seconds at 55 ° C and 30 seconds at 95 ° C).
  • Reverse transcription mixing was performed in a final volume of 25 ⁇ according to the manufacturer's specifications: 5 ⁇ of 5x buffer, 1 ⁇ of oligo dT (500 ng / ⁇ ), ⁇ of dNTPs (10 ⁇ M), 0 , 5 ⁇ of reverse transcriptase enzyme MM LV PROM EGA ® (Moloney Murine Leukemia Virus), 6.5 ⁇ of nuclease-free water and 11 ⁇ of treated RNA. The reaction mixture was incubated for 1 hour at 42 ° C and then 15 minutes at 65 ° C to inactivate the enzyme. The cDNA was stored at -20 ° C until use. Real time PCR.
  • the quantification of the transcripts encoding the cytokines was carried out by real-time PCR using as a template the cDNAs generated from the mRNAs. Briefly, ⁇ g of RNA purified from spleen is treated with DNAse I according to the manufacturer's recommendations.
  • the KAPA SYBR FAST qPCR kit (Kapa Biosystems) was used in the Eco TM Real-Time PCR System (lllumina, San Diego, CA, USA) with the Eco 5.0 software.
  • the reaction mixture was: 5 ⁇ of Master mix 2X, 1 ⁇ of forward splitter (10 ⁇ ) (table II), 1 ⁇ of reverse (10 ⁇ ) (table II), 1 ⁇ of nuclease-free water and 2 ⁇ of cDNA
  • the thermal profile used to amplify the cytokines is indicated in Table III.
  • the relative quantification method described by Pfaffl was used, using the elongation factor eFla as a reference gene for the normalization of the expression of the analyzed genes.
  • the differences between the Ct values of the amplicons of the analyzed genes and the Ct corresponding to the reference gene were expressed as ACt.
  • the differences between the ACt of each treatment were compared with the ACt of the control groups (vaccinated with PBS) and this difference was expressed as 2 ⁇ ( ⁇ ⁇ ct> 'which represents the change in the levels of expression or relative normalized expression (NE) [Pfaffl MW. (2001)
  • Efficacy (Mortality) and potency (immune response induction) were determined in the fish that were vaccinated with the different formulations and subsequently challenged with ISAV.
  • the fish were immunized with the different vaccines and at 42 days post vaccination, the fish were challenged with ISAV through cohabitation and the next day samples were taken again, the trial was extended 90 days post vaccination. Throughout the trial, the mortality of each of the groups analyzed was measured.
  • to perform the potency tests they were shown on days 21, 41, 63 and 90 post vaccination of spleen, heart and kidney and blood sample of each population to assess the level of cytokines, viral load and antibodies, So with these parameters to study the evolution of the immune response in fish.
  • the serum of the fish corresponding to the preimmune sera (-1 dpv) was determined as control, observing samples with absorbances of the order of 0.5, considering this value as the cut line. Values above the cut-off line propose the presence of anti-ISAV antibodies produced by vaccination and / or challenge.
  • Control vaccine For IFN- ⁇ no changes are observed in the course of the challenge, a decrease in the marker at day 90 is observed in CD4, for IL-10 no changes are observed in the course of the challenge and for TGF- ⁇ an increase is shown to dial 63. On the other hand in Viral load is shown to increase to dial 63, decrease to day 90 (it is attributed that the fish analyzed on day 90 are the fish that were alive so they correspond to the survivors of the challenge). See Figure 9.
  • IFN- ⁇ there is an increase at day 21 product of the vaccine, subsequently an increase is observed at day 63 of 25 times compared to the control
  • CD4 there is an increase at day 21 product of the vaccine
  • a 63-day increase is observed 5 times compared to the control
  • IL-10 there is an increase at day 21 due to the vaccine
  • a 63-day increase is observed 5 times compared to the control
  • TGF- ⁇ a decrease in expression is observed at day 21 compared to the control.
  • the viral load observed on day 63 is less than that of the control.
  • IgM shows an increase to day 63 and 90 possibly generated by the challenge with ISAV.

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Abstract

La presente invención se relaciona con vacunas dirigidas a la acuicultura. Particularmente, en el cultivo de salmones. Específicamente, la presente invención se refiere a un adyuvante de vacuna basado en cuerpos celulares y a la vacuna que comprende dicho adyuvante para potenciar la respuesta inmune de peces, 5 preferentemente, salmónidos - frente a la infección por Virus de la Anemia Infecciosa de Salmón (ISAV).

Description

VACUNA CONTRA ISAV CON DICHO VIRUS INACTIVADO Y UN ADYUVANTE BASADO EN CUERPOS CELULARES LA QUE POTENCIA LA RESPUESTA INMUNE
CAMPO DE LA INVENCION
La presente invención se relaciona con vacunas dirigidas a la acuicultura. Particularmente, en el cultivo de salmones. Específicamente, la presente invención se refiere a un adyuvante de vacuna basado en cuerpos celulares y a la vacuna que comprende dicho adyuvante para potenciar la respuesta inmune de peces, preferentemente salmónidos, frente a la infección producida por el Virus de la Anemia Infecciosa de Salmón (ISAV). ARTE PREVIO
En los últimos años Chile se ha destacado a nivel internacional en el área de la acuicultura, posicionándose como el segundo país productor a nivel mundial del salmón del Atlántico y la trucha arcoíris, después de Noruega. Como en toda industria de producción animal, uno de los principales problemas a los que se ve enfrentada la acuicultura es el desarrollo de enfermedades de origen viral, las cuales son una de las principales causas de pérdidas económicas del sector. La forma más efectiva de combatir estas enfermedades infecciosas es a través de acciones preventivas que impidan que la enfermedad ocurra. La aplicación de vacunas, especialmente dirigidas a aquellas patologías de origen viral, es una forma efectiva de prevenirlas. El uso de vacunas en peces, hasta la fecha, no ha demostrado ser suficiente para generar protección, ya que el funcionamiento de su sistema inmune es menos conocido, menos eficiente y tiene una memoria inmune limitada en el tiempo [Gomez-Casado El, Estepa A, Coll JM. Vaccine. (2011) A comparative review on European-farmed finfish RNA viruses and their vaccines. Mar 24;29( 15):2657-71. doi: 10.1016/j.vaccine.2011.01.097]. Debido al enorme impacto que el virus de la Anemia Infecciosa de Salmón (ISAV) ha tenido sobre la salmonicultura y en la economía de nuestro país es primordial enfocar los esfuerzos en contener y minimizar toda posibilidad de brote de este virus [Asche F, Hansen H, Tveteras .(2009) The Salmón Disease Crisis in Chile. Marine Resource Economics 24(4):405-411]. En el caso del virus ISA, ha sido demostrado que la infección de células derivadas de salmón del Atlántico tales como células ASK - de sus siglas en inglés, Atlantic Salmón Kidney, células CHSE-214 y células SHK-1 (Salmón Head Kidney-1), el virus induce muerte celular por apoptosis, mostrando una clara respuesta a este tipo de muerte (actividad de caspasa 3/7, morfología mitocondrial, inducción de genes que responden a I FN de tipo I) [Schi0tz, B. L, Baekkevold, E. S., Poulsen, L. C, Mjaaland, S., & Gj0en, T. (2009). Analysis of host- and strain-dependent cell death responses during infectious salmón anemia virus infection in vitro. Virology journal, 6, 91]. También ha sido demostrado que la infección induce autofagia en células ASK, mediante la observación por microscopía electrónica de la formación del autofagosoma y del análisis de marcadores específicos para autofagia (ATG 3, 5, 6, 7, 8, 10, 12) [Schi0tz, B. L, Roos, N., Rishovd, A. L, & Gj0en, T. (2010). Formation of autophagosomes and redistribution of LC3 upon in vitro infection with infectious salmón anemia virus. Virus research, 151(1), 104-107].
La generación de una vacuna protectora contra patógenos virales en salmónidos implica un gran desafio debido principalmente al poco conocimiento existente de su respuesta inmune antiviral. La presencia de estos patógenos conlleva al reconocimiento de proteínas exógenas y la generación de una respuesta humoral orquestada por la producción de anticuerpos, mayormente contra las proteínas de superficie. Sin embargo, los títulos de anticuerpos generados no alcanzan los niveles necesarios para proteger, sugiriendo que existe una estimulación insuficiente para prevenir la enfermedad [Hetron Mweemba Munang'andu B0rge Nilsen Fredriksen, Stephen Mutoloki, Roy Ambli Dalmo, and 0ystein Evensen (2013). Antigen dose and humoral immune response correspond with protection for inactivated infectious pancreatic necrosis virus vaccines in Atlantic salmón (Salmo salar L) Vet Res. 2013; 44(1): 7].
La virulencia de un virus esta definida por su capacidad comparativa de generar la enfermedad. En general, los factores genéticos del hospedero son los mayores determinantes de susceptibilidad en enfermedades infecciosas en humanos [K. L. Tyler and N. Nathanson, Fields Virology 4th edition (Lippincott, Williams and Wilkins, Philadelphia, (2001), pp. 199-243]. En el caso de infecciones generadas por el virus Influenza A, virus perteneciente a la misma familia que ISAV (Orthomyxoviridae), éste ha demostrado la capacidad de generar en el hospedero, anticuerpos neutralizantes capaces de generar protección. Sin embargo, en el caso de ISAV se ha observado que el efecto de las inmunizaciones con el antisuero de peces infectados con este virus solo es parcialmente protector [Falk K, Dannevig BH (1995). Demonstration of a protective immune response in infectious salmón anaemia (ISA)-infected Atlantic salmón Salmo salar. Dis Aquat Organ;21:l-5.]. Se ha sugerido que para un exitoso clearence del virus influenza A, es central el rol de la respuesta inmune adaptativa, donde, no solo es necesaria la generación de anticuerpos específicos contra el virus (respuesta inmune humoral), sino que también es fundamental la participación del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase I y II, capaz de activar linfocitos T citotóxicos (CTL) y linfocitos T cooperadores (CD4+ secretoras de IFN-γ, respuesta inmune celular) [Kreijtz JH1, Fouchier RA, Rimmelzwaan GF (2011). Immune responses to influenza virus infection. Virus Res. 2011 Dec;162(l- 2):19-30]. Existe evidencia que vincula el tipo de MHC con la resistencia/susceptibilidad por infecciones de ISAV, demostrando que en salmo salar, tanto los MHC clase I como MHC clase II proporcionan una resistencia sustancial en la infección, posicionando a la respuesta inmune a nivel celular sobre la respuesta humoral en la supervivencia de salmones frente a desafíos con ISAV [Kj0glum SI, Larsen S, Bakke HG, Grimholt U.(2006) How specific MHC class I and class II combinations affect disease resistance against infectious salmón anaemia in Atlantic salmón (Salmo salar). Fish Shellfish Immunol. Oct;21(4):431-41].
Una de las mayores complicaciones presentes en los desafíos por ISAV es la excesiva activación de una respuesta inmune pro-inflamatoria [Schi0tz BL1, J0rgensen SM, Rexroad C, Gj0en T, Krasnov A. (2008). Transcriptomic analysis of responses to infectious salmón anemia virus infection in macrophage-like cells. Virus Res.l36(l-2):65-74]. La mayoría de las estrategias terapéuticas y preventivas para mejorar el clearence de patógenos y células infectadas mediante la estimulación del sistema inmune, llegan en algunos casos a exacerbar el daño tisular a un nivel tal que causan aumento de la mortalidad [Mjaaland SI, Markussen T, Sindre H, Kj0glum S, Dannevig BH, Larsen S, Grimholt U. (2005). Susceptibility and immune responses following experimental infection of MHC compatible Atlantic salmón (Salmo salar L.) with different infectious salmón anaemia virus isolates.Arch Virol. 150(11):2195-216]. Los estudios demuestran que el máximo control de patógenos no necesariamente conduce a minimizar la enfermedad y destacan el rol esencial de los componentes inmunoregulatorios del sistema inmune en limitar o acabar con la patología [Li MOl, Flavell RA. (2008). Contextual regulation of inflammation: a duet by transforming growth factor-beta and interleukin-10. lmmunity.28(4):468-76]. Estos antecedentes nos han llevado a plantear nuevas estrategias de vacunación utilizando cuerpos celulares como inmunoterapia en salmónidos.
La inmunoterapia es un tratamiento enfocado en estimular el sistema inmune de la célula, reprogramando su respuesta frente a diversas enfermedades [Spetz, A.-L., Sórensen, A. S., Walther-Jallow, L., Wahren, B., Andersson, J., Holmgren, L., & Hinkula, J. (2002). Induction of HIV-1-specific immunity after vaccination with apoptotic HIV- 1/murine leukemia virus-infected cells. Journal of immunology (Baltimore, Md. : 1950), 169(10), 5771-9; Mégret, F., Prehaud, C, Lafage, M., Batejat, C, Escriou, N., Lay, S., Lafon, M. (2005). Immunopotentiation of the antibody response against influenza HA with apoptotic bodies generated by rabies virus G-E A protein-driven apoptosis. Vaccine, 3(46-47), 5342-50]. Actualmente el desarrollo de la inmunoterapia celular ha cobrado una gran relevancia debido a los promisorios resultados que se han obtenido en el desarrollo de vacunas contra el cáncer. Para ello, antígenos tumorales específicos presentes en la superficie de la célula son enfrentados a células presentadoras de antígenos (APC), específicamente a células dendríticas (DCs), para que estas sean re- administradas al paciente y puedan activar la respuesta inmune contra el tumor [Salman, B., Zhou, D., Jaffee, E. M., Edil, B. H., & Zheng, L. (2013). Vaccine therapy for pancreatic cáncer. Oncoimmunology, 2(12), e26662; Radford, K. J., Tullett, K. M., & Lahoud, M. H. (2014). Dendritic cells and cáncer immunotherapy. Current opinión in immunology, 27C(DC), 26-32].
Existen fuertes evidencias que indican que una infección por patógenos intracelulares como el virus influenza, VIH-1 y CMV induciría muerte celular en sus células blanco [Zhao, X. Q., Huang, X. L, Gupta, P., Borowski, L, Fan, Z., Watkins, S. C, Rinaldo, C. R. (2002). Induction of anti-human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) CD8+ and CD4+ T-cell reactivity by dendritic cells loaded with HIV-1 X4-infected apoptotic cells. Journal of virology, 76(6), 3007-3014; Arrode, G., C. Boccaccio, J. Lule, S. Allart, N. Moinard, J. P. Abastado, A. Alam, and C. Davrinche. 2000. Incoming human cytomegalovirus pp65 (UL83) contained in apoptotic infected fibroblasts is cross-presented to CD8+ T cells by dendritic cells. J. Virol. 74:10018]. Los cuerpos celulares producidos por estas infecciones presentan antígenos en su superficie, los que en mamíferos son procesados por el MHC de clase I con la posterior activación de las células T CD8+ antígeno-específicas. La utilización de cuerpos celulares ya ha demostrado tener la capacidad de producir una respuesta inmune más eficiente frente a VIH-1 que la exposición misma al virus inactivado [Maranon C, Desoutter JF, Hoeffel G, CohenW, Hanau D, Hosmalin A. (2004). Dendritic cells cross-present HlVantigens from live as well as apoptotic infected CD4+ T lymphocytes. Proc Natl Acad Sci USA;101:6092-7].
En este sentido, cuerpos celulares corresponderían a la porción de la célula que contiene el núcleo y el citoplasma circundante sin sus extensiones (por ejemplo, en el caso de una dendrita, no incluye el axón), y por ello, corresponde a la zona de mayor volumen de la célula que interviene activamente en el metabolismo celular más que en realizar la función específica reconocida para la célula (por ejemplo, la neurona tiene como función principal, la recepción de estímulos y la axón conducción del impulso nervioso). En particular, la patente WO9903499 [Laurence Zitvogel, Graca Raposo, Armelle Regnault, Sebastian Amigorena. (1999) Vesicule cellulaire denommee "exosome", leur preparation et utilisation dans la stimulation d'une reponse immunitaire. Inst Nat Sante Rech Med] protege un método para sensibilizar células que presentan antígeno, mediante vesículas de membranas con propiedades inmunogénicas. Particularmente, enseña composiciones que comprenden texosomas (vesículas derivadas de células tumorales) y dexosomas (vesículas derivadas de células dendríticas cargadas con antígenos o no), útiles para tratar cáncer y enfermedades infecciosas, parasíticas o autoinmunes.
Por otra parte, los salmones poseen un sistema inmune adaptativo reconocible, identificándose tipos celulares conservados entre teleósteos y mamíferos. Una respuesta inmune controlada y protectora que no sea nociva y solamente acotada a los antígenos presentes en las vacunas convencionales en la industria del salmón, es lo que se busca con la presente invención.
Breve Descripción de la Invención La presente invención se refiere a un adyuvante de vacuna que comprende cuerpos celulares y a la vacuna que comprende dicho adyuvante para potenciar la respuesta inmune de salmónidos frente a la infección generada por ISAV.
La vacuna de la presente invención comprende virus ISA inactivado y cuerpos celulares generados desde células provenientes de riñon anterior (ASK) de Salmo salar, co- formulación que mejora la respuesta inmune de salmónidos frente a la infección con virus ISA y que le otorga protección al pez tras el desafío con el virus en condiciones controladas.
Para obtener los cuerpos celulares, se induce la muerte celular por tratamiento con calor y deprivación de nutrientes sobre las células derivadas de macrófagos de salmón del Atlántico. Para esto, se hacen crecer, células ASK hasta una confluencia del 90 al 100%, y luego, se las somete a shock térmico por un período breve de tiempo.
De esta forma, la vacuna descrita en la presente solicitud comprende un aislado del virus ISA - predominante en los piscicultivos, inactivado por métodos químicos (Etilenimina Binaria (BEI)), y cuerpos celulares en tampón salino, los cuales son capaces de estimular la formación de interferón gama (IFN-γ) promoviendo el estado antiviral en la célula, la cual se estima sin respaldar ninguna teoría particular, que se debe presumiblemente a la presencia del virus inactivado.
La utilización de vacunas con cuerpos celulares, permite programar a la célula para que genere una respuesta. Esta respuesta es corroborada al observar un aumento de linfocitos T reguladores (CD4+) involucrados en la maduración de células de memoria, efectoras y células T citotóxicas (CD8+), entre otras. Esta programación en la célula presenta una función inmunomoduladora, la cual es observada en el aumento de marcadores como IL-10 y TGF-β, los cuales son los encargados de modular los procesos proinflamatorios y de proliferación celular descontrolada producidos por infecciones mediadas por patógenos. Por lo tanto, la presente vacuna con cuerpos celulares es capaz de activar las defensas de la célula por medio de un estado proinflamatorio elicitado por IFN-γ, y al mismo tiempo controlar la respuesta al aumentar los niveles de IL-10 y TGF-β, citoquinas con función anti-inflamatoria capaces de modular la respuesta pro- inflamatoria de forma autocrina como paracrina. Todo esto, en conjunto logra producir en el pez una respuesta inmune controlada, protectora y acotada a los antígenos presentes en las vacunas convencionales utilizadas en la industria del salmón.
La vacuna de la presente invención fue puesta a prueba mediante la generación de una vacuna constituidas de virus ISA inactivado co-formulado con cuerpos celulares (CelIVac- ISAv), virus ISA inactivado (ISAv ¡nact) y una vacuna comercial contra ISAV (Vacuna Comercial). Las distintas vacunas permitieron evaluar el efecto de los cuerpos celulares en la generación de anticuerpos específicos contra ISAV y en la inducción de citoquinas producto de la vacunación para finalmente entregar protección a los peces tras un desafío con el virus en condiciones controladas. Con la presente tecnología, se desarrollaron vacunas que poseen distintas formulaciones de los cuerpos celulares, además de controles como virus ISA inactivado y una vacuna con formulación convencional (Vacuna Comercial). Las distintas vacunas permitieron evaluar el efecto de los cuerpos celulares en la generación de anticuerpos específicos contra ISAV y en la inducción de citoquinas producto de la vacunación. Las formulaciones fueron evaluadas en peces dispuestos en distintos estanques con ejemplares de salmón del Atlántico.
El análisis de las diferentes formulaciones de vacunas en relación a los peces controles (PBS), se llevó a cabo calculando el porcentaje de supervivencia relativa ( PS) [Amend D F. (1981). Potency testing of fish vaccines. International Symposium on Fish Biologics: serodiagnostics and vaccines. Dev Biol Stand. 49:447-454] mediante la fórmula siguiente:
(mortalidad acumulada del grupo de vacuna)/) mortalidad acumulada del grupo control) x 100 - 1 = RPS (I)
Para evaluar la inducción de IgM específica contra ISAV en los peces vacunados y/o desafiados se purificaron partículas virales para los ensayos de ELISA indirecto.
La cuantificación de proteínas virales se realizó mediante el método de Bradford y la interpolación de datos con una curva de calibración con BSA (Tabla I y figura 11). Se evaluaron los niveles de inmunoglobulina M (IgM) específicos contra ISAV mediante ELISA (de sus siglas en inglés, Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) indirecto para determinar el efecto de cada formulación en la respuesta humoral de los peces frente a la vacunación y a la infección. El diagnóstico de IgM se realizó desde el suero de tres ejemplares obtenidos por cada estanque un día antes de la vacunación, denominado como suero preinmune (-ldpv), además de sueros colectados 21dpv, 42dpv, 63dpv y 90dpv.
Una vez adquiridos los valores de absorbancia de cada suero evaluado, estos fueron normalizados entre distintas placas; posteriormente se eliminó la señal de base restando a cada valor obtenido la absorbancia mostrada en los pocilios sin suero. Para comparar los datos se utilizó el programa GraphPad versión 5 (GraphPad Software) con la herramienta de ANOVA no paramétrico (Mann-Whitney) de una cola con un intervalo de confianza de 95% (p<0,005). Para evaluar si los resultados presentaron diferencias significativas se realizaron ensayos de t-student.
Para evaluar el título viral presente en los peces, se extrajo el RIMA total de corazón, órgano recomendado por la Organización mundial de sanidad animal para el diagnóstico de ISAV (OIE, 2009, http://www.oie. int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/aahm/current/2.3.05_IS A.pdf); y por otro lado, para evaluar la inducción de citoquinas producto de la vacunación y/o infección se extrajo el RIMA total desde bazo, un órgano linfoide importante en la respuesta inmune del pez.
La determinación del título viral se llevó a cabo mediante RT-PCR en tiempo real de un solo paso cuantificando el número de copias del segmento 8 de ISAV, F5: 5'- GAAGAGTCAGGATGCCAAGACG-3' y R5: 5'- GAAGTCGATGAACTGCAGCGA-3' que generan un producto de 196 pares de bases (pb).
Para la cuantificación relativa de los mRNAs que codifican para las citoquinas se sintetizó la primera hebra de cDNA mediante transcripción reversa.
La cuantificación de los transcritos que codifican para las citoquinas se llevó a cabo mediante PCR en tiempo real utilizando como plantilla los cDNAs generados desde los mRNAs.
Para la cuantificación de los transcritos relacionados a la respuesta inmune, se utilizó el método de cuantificación relativa descrito por Pfaffl, utilizando el factor de elongación eFl-α como gen de referencia para la normalización de la expresión de los genes analizados. Las diferencias entre los valores de concentración (Ct) de los amplicones de los genes analizados y los Ct correspondientes al gen de referencia se expresaron como ACt. Las diferencias entre los ACt de cada tratamiento se compararon con los ACt de los grupos control (vacunados con PBS) y esta diferencia se expresó como 2 "(Δ Δ α>' lo que representa el cambio en los niveles de expresión o expresión relativa normalizada (NRE) [Pfaffl MW. (2001) A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res. May l;29(9):e45.] esta fue comparada con la expresión relativa de estos genes del grupo de peces no tratados, para determinar las diferencias en la expresión respecto a este grupo de peces.
Una vez establecido el protocolo para la generación de cuerpos celulares, se realizó una cinética de expresión en células ASK nativas a la 0, 6, 12, 18, 24 horas post tratamiento (h.p.t). Se analizó el perfil de expresión de transcritos de citoquinas producidos por las células en respuesta a PBS (Control), al prototipo vaccinal de cuerpos celulares sumado a virus inactivados (CellVac-ISAv) a una concentración de lxlO7 virus inact./ml en CelIVac- ISAv, y ademas con poly l:C.
Al realizar el análisis de expresión relativa a nivel de transcritos de IFN-γ en el curso de tiempo, los resultados en células ASK tratadas con Poli l:C muestran que los niveles de IFN-γ aumentan a las 6 h.p.t, observándose una disminución a las 12 h.p.t. Para las células ASK tratadas con el prototipo vaccinal de cuerpos celulares (CellVac-ISAv) se muestra que los niveles de IFN-γ aumentan a las 6 h.p.t, observándose una disminución gradual entre las 12 y 18 h.p.t.. Al realizar el análisis de expresión relativa a nivel de transcritos de IL-10, no muestran diferencias para ninguno de los tratamientos utilizados.
Finalmente, al realizar el análisis de expresión relativa a nivel de transcritos de TGF-β, los resultados en células ASK tratadas con Poli l:C muestran que los niveles de TGF-β aumentan a las 6 h.p.t, observándose un nivel basal a las 12 h.p.t.. Para las células ASK tratadas con el prototipo vaccinal de cuerpos celulares (CellVac-ISAv) muestran que los niveles de IFN-γ aumentan a las 12 h.p.t, observándose una disminución a las 18 h.p.t., sin embargo se observa nuevamente un aumento a las 24 h.p.t..
Evaluación de prototipo vaccinal de cuerpos celulares (CellVac-ISAv) en peces desafiados con ISAV. Se determinó la eficacia (Mortalidad) y potencia (inducción de respuesta inmune) en los peces que fueron vacunados con las distintas formulaciones y posteriormente desafiados con ISAV. Los peces fueron inmunizados con las distintas vacunas y a los 42 dpv, los peces fueron desafiados con ISAV por medio de cohabitación y al día siguiente se tomaron muestras nuevamente, el ensayo se extendió 90 días post vacunación. Durante todo el ensayo se registró la mortalidad de cada uno de los grupos analizados. Por otro lado, para realizar los ensayos de potencia se hicieron muéstreos a los días 21, 41, 63 y 90 post vacunación de bazo, corazón, riñon y muestra de sangre de cada población para evaluar los niveles de citoquinas, carga viral y anticuerpos, los cuales permiten estudiar la evolución de la respuesta inmune en los peces. Los resultados de eficacia muestran que el menor porcentaje de mortalidad acumulada corresponde a los peces que fueron vacunados con el prototipo CellVac-ISAv (cuerpos celulares más virus ISA inactivado). Lo cual puede ser observado mejor con el porcentaje de sobrevida relativa (RPS), donde se muestra que los peces vacunados solo con ISAv ¡nact (lxlO6 virus/dosis de virus ISA inactivado con BEI) presentan un RPS de 20%, y los peces vacunados con la vacuna comercial (vacuna comercial compuesta por ISAV lxlO7- 7,5xl07 TCID50 en Parafina líquida) y Cuerpos Celulares (solo cuerpos celulares) presentan un RPS del 40%, siendo los peces vacunados con el prototipo vaccinal CelIVac- ISAv los que presentan un mayor RPS (80%).
Evaluación de la potencia producida en peces desafiados y vacunados con el prototipo vaccinal de cuerpos celulares (CellVac-ISAv) y comparación con otras formulaciones.
Durante el ensayo de vacunación y posterior desafío, se determinó el título viral de los peces de los grupos "Control", "Cuerpos celulares", "Vacuna Comercial", "CellVac-ISAv" y "ISAv ¡nact" a los 21, 41, 63 y 90 dpv. Es importante señalar que el desafío con ISAV fue realizado el día 42 post vacunación. Se muestra que al día 63 post vacunación, hay un aumento del título viral en todos los grupos de peces desafiados, sin embargo solo los peces del grupo control presentan un título viral sobre las 100.000 copias/mL. En el día 90 post vacunación, todos los grupos presentan un aumento del título viral al compararlos con los peces no desafiados, sin embargo este título es menor que el observado al día 63. Se determinó como control el suero de los peces correspondiente a los sueros preinmunes (-1 dpv) observándose muestras con absorbancias del orden de 0,5, considerándose este valor como la línea de corte. Valores superiores a la línea de corte proponen la presencia de anticuerpos anti-ISAV producidos por la vacunación y/o desafío.
En los peces vacunados se puede observar que a los 21dpv, la totalidad de los grupos presenta niveles de anticuerpos anti-ISAV bajos, lo mismo ocurre a los 41dpv excepto para los peces vacunados con el prototipo "CelIVac-ISAv" donde se observa un aumento de IgM específicos contra ISAV. Se observar que a los 63dpv hay un aumento en los niveles de anticuerpo de los grupos "Control", "Cuerpos Celulares", "Vacuna Comercial" y "ISAv inact" probablemente debido a la propia infección viral, sin embargo es interesante observar que el grupo "CelIVac-ISAv" muestra una disminución de anticuerpos en comparación a los peces no desafiados. Posteriormente, a los 90dpv se detecta un aumento general del título de anticuerpos en los peces evaluados, sin embargo, se observa que en el grupo "CelIVac-ISAv" estos anticuerpos solo se mantienen.
Al realizar el análisis de expresión relativa a nivel de transcritos de IFN-γ en los días post vacunación; no se observa cambios de expresión en el grupo "Control", para los grupos de "Cuerpos Celulares" y "ISAv inact" se produce un aumento de la expresión de 12 veces al día 63. Para el grupo de la vacuna "comercial" se observa un aumento de la expresión IFN-γ a los días 21 y 63 de 5 y 25 veces respectivamente. Para el grupo de peces vacunados con el prototipo de "CelIVac-ISAv" se observa un aumento de la expresión IFN-γ a los días 41 y 63 de 7 y 32 veces respectivamente.
El análisis de expresión relativa a nivel de transcritos de CD4 en los días post vacunación; se observa una disminución de expresión de CD4 en el grupo "Control" el día 90, para el grupo de "Cuerpos Celulares" se produce un aumento de la expresión de 16 veces al día 63 y 3 veces el día 90.
Para el grupo de la "Vacuna Comercial" se observa un aumento de la expresión CD4 a los días 21 y 63 de 1,5 y 5 veces respectivamente. Para el grupo de peces vacunados con el prototipo de "CelIVac-ISAv" se observa un aumento de la expresión CD4 solo al día 63 de 32 veces, y en el caso del grupo vacunado con "IV" no se observaron cambios en la expresión de CD4.
El análisis de expresión relativa a nivel de transcritos de IL-10 en los días post vacunación; no se observa cambios de expresión en el grupo "Control", para el grupo de "Cuerpos Celulares" se produce una disminución de 2 veces el día 21 y luego se observa un aumento de la expresión de IL-10 de 5 veces a los días 63 y 90. Para el grupo de la "Vacuna Comercial" se observa un aumento de la expresión IL-10 a los días 21 y 63 de 5 veces. Para el grupo de peces vacunados con el prototipo de "CelIVac-ISAv" se observa un aumento de la expresión IL-10 los días 41, 63 y 90 el cual es de 2, 7 y 14 veces respectivamente, y en el caso del grupo vacunado con "ISAv inact" se observa un aumento de la expresión IL-10 a los días 21 y 63 de 6 y 7 veces respectivamente.
Finalmente, el análisis de expresión relativa a nivel de transcritos de TGF-β en los días post vacunación; se observa un aumento de la expresión de TGF-β en el grupo "Control" el día 63, para el grupo de "Cuerpos Celulares" se produce una disminución de 1,2 veces el día 41 y luego se observa un aumento de la expresión de TGF-β de 14 y 8 veces al día 63 y el día 90 respectivamente. Para el grupo de la "Vacuna Comercial" se observa una disminución de 14 veces el día 21 y luego un aumento de la expresión TGF-β el día 63 de 11 veces. Para el grupo de peces vacunados con el prototipo de "CelIVac-ISAv" se observa un aumento de la expresión TGF-β los días 63 y 90, este aumento es de 16 y 6 veces respectivamente, y en el caso del grupo vacunado con "ISAv inact" solo se observa un aumento de la expresión TGF-β al día 90 de 9 veces.
Para poder comparar los efectos que tiene la formulación del prototipo vaccinal "CelIVac-ISAv" y determinar si protege mejor a los peces que la vacuna comercial, se realizó un panel en el cual se incluyen todos los parámetros analizados tal como estos se mencionan en la Figura 10. Si se compara el conjunto de parámetros obtenidos para el grupo de peces control, vacuna comercial y vacuna prototipo "CelIVac-ISAv".
En los peces control para IFN-γ no se observan cambios en el transcurso del desafío, en CD4 se observa una disminución del marcador al día 90, para IL-10 no se observan cambios en el transcurso del desafío y para TGF-β se muestra aumento al día 63. Por otro lado en carga viral se muestra aumento al día 63, disminución al día 90 (se atribuye que los peces analizados el día 90 son los peces que se encontraban vivos por lo que corresponden a los sobrevivientes del desafío). Finamente para IgM se observa un aumento al día 63 y 90 producto del desafío con ISAV. Por lo tanto, se puede concluir que se produce una respuesta inmune humoral, pero esta respuesta no es capaz de proteger a los salmones.
En los peces vacunados con la Vacuna Comercial se aprecia para IFN-γ un aumento al día 21 producto de la vacunación, posteriormente se observa un aumento al día 63 de 25 veces en comparación al control. En el caso de CD4 hay un aumento al día 21 producto de la vacunación, observándose posteriormente un aumento al día 63 de 5 veces en comparación al control. Para IL-10 hay un aumento al día 21 producto de la vacunación, observándose un aumento al día 63 de 5 veces en comparación al control y para TGF-β se observa una disminución de la expresión al día 21 en comparación al control. Por otro lado, la carga viral observada en el día 63 es menor que la del control. Finalmente, IgM muestra un aumento al día 63 y 90 generado posiblemente por el desafío con ISAV. Por lo tanto, se puede concluir que hay una respuesta inmune celular temprana (día 21) producto de la vacunación. Se produce una respuesta inmune humoral al igual que los peces controles desafiados, por lo que este tipo de respuesta no es capaz de proteger. Además, se observa una respuesta inmune celular (por la inducción de IFN-γ y CD4) la cual se intenta regular con citoquinas antiinflamatorias disminuyendo la mortalidad de los peces, sin embargo la inducción de estas citoquinas (IL-10 y TGF-β) no es suficiente, ya que no es sostenida en el tiempo.
En los peces vacunados con vacuna prototipo "CelIVac-ISAv" para I FN-γ hay un aumento al día 41 producto de la vacunación, posteriormente se observa un aumento al día 63 de 32 veces en comparación al control. En el caso de CD4 se observa un aumento al día 63 de 32 veces en comparación al control, para IL-10 hay un aumento al día 21 producto de la vacunación, posteriormente se observa un aumento a los días 63 y 90 de 7 y 14 veces respectivamente en comparación al control y TGF-β muestra un aumento de 6 y 16 veces a los días 63 y 90 respectivamente en comparación al control. Por otro lado la carga viral observada en el día 63 es menor que la del control. Finalmente, IgM muestra un aumento al día 63 y 90 producto del desafío con ISAV. Por lo tanto, se puede concluir que hay respuesta inflamatoria tardía (día 41) producto de la vacunación, compensada con la inducción de IL-10. Se produce una respuesta inmune humoral producto de la vacunación antes del desafío y se produce una disminución de anticuerpos específicos contra ISAV cuando los peces son desafiados. Por otro lado, se observa una respuesta inmune celular (por la inducción de IFN-γ y CD4) la cual se intenta regular con la expresión de citoquinas antiinflamatorias (IL-10 y TGF-β) sostenida hasta el día 90. La disminución de anticuerpos específicos contra ISAV en el desafío y la expresión de citoquinas antiinflamatorias podría estar provocando la disminución de la mortalidad de los peces de este grupo, de esta manera modulando la respuesta inmune del pez produciendo una protección contra la infección con ISAV. Breve Descripción de las Figuras
Figuras 1A y IB. Visualización de cuerpos celulares derivados de células ASK mediante contraste de fase. Células ASK fueron sometidas a un proceso de muerte por calor y deprivación de nutrientes con el fin de generar cuerpos celulares; y luego 100 μί de suspensión de estos fueron fijadas. Las imágenes fueron adquiridas por microscopía confocal en 40X.
Figuras 2A-2C. Análisis de los niveles de transcritos de INF-γ en células ASK. La expresión relativa y normalizada (NRE) de INF-γ en células ASK tratadas con PBS (A), cuerpos celulares (CC) + virus inactivado (B) y poli l:C (C) en los tiempos señalados. La expresión relativa de transcritos se determinó mediante qRT-PCR en las células tratadas y se normalizó respecto a la expresión relativa de transcritos en las células estimuladas con PBS. Los resultados son mostrados como el promedio de la expresión relativa y normalizada + ES. (*) Indica que los valores presentan significancia estadística respecto de las células tratadas con PBS. Las diferencias estadísticas se obtuvieron por ANOVA de una vía no paramétrico (Kruskal Wallis) junto al post test de Dunn, * p<0,05.
Figura 3A-3C. Análisis de los niveles de transcritos de IL-10 en células ASK. La expresión relativa y normalizada (NRE) de IL-10 en células ASK tratadas con PBS (A), cuerpo celular (CC) + virus inactivado (B) y poli l:C (C) en los tiempos señalados. La expresión relativa de transcritos se determinó mediante qRT-PCR en las células tratadas y se normalizó respecto a la expresión relativa de transcritos en las células estimuladas con PBS. Los resultados son mostrados como el promedio de la expresión relativa y normalizada ± ES. (*) Indica que los valores presentan significancia estadística respecto de las células tratadas con PBS. Las diferencias estadísticas se obtuvieron por ANOVA de una vía no paramétrico (Kruskal Wallis) junto al post test de Dunn, * p<0,05. Figura 4A-4C. Análisis de los niveles de transcritos de TGF-β en células ASK. La expresión relativa y normalizada (NRE) de TGF-β en células ASK tratadas con PBS (A), cuerpo celular (CC) + virus inactivado (B) y poli l:C (D) en los tiempos señalados. La expresión relativa de transcritos se determinó mediante qRT-PCR en las células tratadas y se normalizó respecto a la expresión relativa de transcritos en las células estimuladas con PBS. Los resultados son mostrados como el promedio de la expresión relativa y normalizada + ES. (*) Indica que los valores presentan significancia estadística respecto de las células tratadas con PBS. Las diferencias estadísticas se obtuvieron por ANOVA de una vía no paramétrico (Kruskal Wallis) junto al post test de Dunn, * p<0,05. Figura 5. Efecto del cuerpo celular en la eficacia de una virina (lxlO6 virus/dosis inactivado con BEI)
Figura 6. Porcentaje de sobrevida relativa (RPS) de los peces vacunados con los prototipos vaccinales.
Figura 7. Niveles de IgM en suero inducidos por ISAV. El gráfico de la izquierda indica los grupos de peces sin desafiar. El gráfico de la derecha indica los grupos desafiados.
Figura 8. Título viral de ISAV a través del tiempo en el ensayo con los prototipos vaccinales (CelIVac-ISAv), virus ISA inactivado (ISAv ¡nact) y vacuna comercial contra ISAV (Vacuna Comercial). Se muestra el titulo viral de los peces vacunados a los 21 y 41 días luego de iniciado el ensayo. Además se muestra el titulo viral de los peces vacunados a los 63 y 90 días sin desafiar y comparando sus niveles con los peces desafiados a 63 y 90 días post vacunación. El número de copias/mL del segmento 8 de ISAV fue determinado mediante qRT-PCR desde 200ng de RNA total extraído de corazón del pez y el valor fue interpolado a los datos de la curva de calibración obtenida. Los resultados son mostrados como el promedio de los valores obtenidos ± ES. (*) Indica que los valores presentan significancia estadística respecto de los peces control. Para comparar los datos fue realizado un análisis de un test de significancia estadística no paramétrico (Mann-Whitney) de una cola con un intervalo de confianza de 95% (p<0,05).
Figura 9. Variación de los niveles de m NA de IFN-γ, CD4, IL-10 y TGF-β en bazo en función de las distintas formulaciones de vacuna. La expresión a nivel de transcrito de IFN-γ, CD4, IL-10 y TGF-β se evaluó mediante PCR en tiempo real. Se muestra la expresión relativa y normalizada (NRE) de IFN-γ, CD4, IL-10 y TGF-β de los grupos de peces vacunados previo al desafío y de los grupos de peces vacunados y desafiados y se comparó con la expresión relativa del grupo de peces sin tratar. Los valores son mostrados como el promedio de expresión relativa normalizada (NRE) + SE. Las diferencias estadísticas se determinaron mediante un test de significancia estadística de no paramétrico (Mann-Whitney) entre los grupos de peces vacunados y los peces no tratados. *, p<0,05.
Figura 10. Síntesis de resultados comparativos.
Figura 11. Curva de calibración con BSA para determinar la cantidad de proteína viral en los pellet obtenido de la centrifugación, ver Tabla I.
Descripción Detallada de la Invención
La presente invención se refiere a un adyuvante de vacuna que comprende cuerpos celulares y a la vacuna que comprende dicho adyuvante para potenciar la respuesta inmune de salmónidos frente a la infección generada por ISAV. La vacuna de la presente invención comprende virus ISA inactivado y cuerpos celulares generados desde células provenientes de riñon anterior (ASK) de Salmo salar, co- formulación que mejora la respuesta inmune de salmónidos frente a la infección con virus ISA y que le otorga protección al pez tras el desafío con el virus en condiciones controladas. La vacuna comprende de una cantidad en el rango de lxlO5 a lxlO7 virus/dosis de virus ISA inactivado con BEI y una cantidad en el rango de lxlO4 a lxlO6 cuerpo celular/dosis.
Para obtener cuerpos celulares, células ASK inducidas a muerte celular por tratamiento con calor y deprivación de nutrientes se hicieron crecer hasta una confluencia del 90 al 100%, y se sometieron a shock térmico a 37°C por 30 min, y se descartó el medio de cultivo y lavó la monocapa con tres volúmenes de tampón fosfato salino (PBS), removiendo toda traza de nutrientes. Posteriormente, las células son sometidas a un proceso de deprivación, incubándolas por una semana en lOmL de PBS IX para una botella de cultivo T175 o hasta que la monocapa se desprendió, y se almacenaron los cuerpos celulares en suspensión, a 4°C, ver Fig. 1.
La vacuna descrita en la presente solicitud comprende un aislado ISAV inactivado (lxlO6 virus inact./dosis) en conjunto con una cantidad determinada de cuerpos celulares en tampón salino (lxlO5 cel./dosis), los cuales son capaces de estimular la formación de interferón gama (INF-γ) para promover el estado antiviral en la célula. Se confirma un aumento de linfocitos T reguladores (CD4+), los que están involucrados en la maduración de células de memoria, efectoras y células T citotóxicas (CD8+). Esta programación en la célula presenta una función inmunomoduladora, la cual es observada en el aumento de marcadores como IL-10 y TGF-β. Por lo tanto, la vacuna con cuerpos celulares es capaz de activar las defensas de la célula por medio de un estado proinflamatorio elicitado por IFN-γ, y al mismo tiempo, es capaz de controlar la respuesta al levantar los niveles de IL-10 y TGF-β, citoquinas con función antiinflamatoria capaces de modular de forma autocrina como a células vecinas. Todo esto en conjunto logra producir en el pez una respuesta inmune controlada, protectora y acotada a los antígenos presentes en las vacunas convencionales utilizadas en la industria del salmón, ver Figuras 2A-2C, 3A-3B y 4A-4C. La tecnología de la presente invención fue puesta a prueba mediante la generación de vacunas constituidas de virus ISA inactivado co-formulado con cuerpos celulares (CelIVac-ISAv), virus ISA inactivado (ISAv ¡nact) y una vacuna comercial contra ISAV (Vacuna Comercial). Las pruebas fueron realizadas en laboratorio, donde se dispuso de distintos estanques de agua dulce con ejemplares de salmón del Atlántico. Se extrajo bazo, corazón y riñon, además de una muestra de sangre de cada población para evaluar el nivel de citoquinas, carga viral y anticuerpos antes de iniciar el ensayo. Los peces fueron inmunizados el día 21 con distintas vacunas a estudiar, y el día 22 se tomaron nuevamente muestras de sangre y órganos. Los peces fueron desafiados 42 días post vacunación con ISAV por medio de cohabitación y al día siguiente se tomaron nuevas muestras de sangre y órganos. El ensayo se extendió 90 días post vacunación y durante este período se hicieron dos muéstreos para estudiar la evolución de la respuesta inmune en los peces. Además se registró la mortalidad a lo largo de todo el ensayo. (Fig. 5 y Fig. 6). Se evaluó el título viral a los días 21 y 41 post vacunación (d.p.v). El día 42, los salmones fueron desafiados por cohabitación con ISAV HP _7b (Genotipo Europeo altamente prevalente en Chile entre 2008-2009) tras ser inoculado intraperitonealmente en salmones troyanos, y a los 63dpv y 90dpv, se determinó nuevamente el título viral para compararlo con grupos vacunados no desafiados.
Asimismo, la formulación de vacuna de la presente invención, cuya dosificación es lOOul por dosis, puede comprender un frasco que comprende 1x10s virus inact./dosis mezclado con lxlO5 Cuerpos celulares/dosis utilizando tampón fosfato salino (PBS) como solución diluyente. Para ello los virus inactivados se mezclan en condiciones estériles con la suspensión de células ya cuantificadas hasta llegar a las concentraciones indicadas previamente utilizando PBS autoclavado. La formulación también puede comprender un kit de dos frascos que i) comprende el virus inactivado y liofilizado y ii) suspensión en PBS de cuerpos celulares. La reconstitución de i) utilizando ii) como diluyente permite contar con la formulación acuosa suficiente en cantidad y calidad para ser utilizada como vacuna en especies salmonideas para ser administradas intraperitonealmente.
Ejemplo 1: Evaluación ex vivo de cuerpos celulares. Línea celular y condiciones de cultivo. La línea celular ASK, ATCC NQ C L-2747, tipo macrófago, proveniente de salmo salar L. (salmón del Atlántico) se cultivó en medio de cultivo Leibovitz's 15 (L-15, Gibco®, Invitrogen®, Carlsbad, CA, USA), suplementado con 4mM de L-glutamina (Corning cellgro®, Mediatech), 10% v/v de Suero Fetal Bovino (SFB) inactivado (Hyclone®, Thermo Fischer Scientific, Logan, Utah, USA), 50 ug/mL de gentamicina (US Biological, Swampscott, MA, USA), 200 I U penicilina/200 μg/mL estreptomicina (Corning cellgro®, Mediatech) y 40 μΜ β-mercaptoetanol (Gibco®, Life Technologies). Las células fueron incubadas a 18°C.
Generación de cuerpos celulares. Células de salmón derivadas de riñon anterior (ASK) fueron sometidas a un proceso de muerte celular por deprivación de nutrientes para la obtención de cuerpos celulares. El procedimiento se basa en crecer células ASK hasta una confluencia del 90 al 100%. Luego, éstas son sometidas a un shock térmico a 37°C por 30 min. Posteriormente, se descarta el medio de cultivo y la monocapa es lavada con tres volúmenes de PBS, removiendo toda traza de nutrientes. Una vez concluidos los lavados las células son sometidas a un proceso de deprivación, para ello las células son incubadas por una semana en lOmL de PBS IX para una botella de cultivo T175 o hasta que la monocapa se desprenda. Posteriormente, los cuerpos celulares en suspensión son almacenados a 4°C.
Cinética de expresión de citoquinas. Para evaluar la respuesta que inducen los cuerpos celulares, se realizó una cinética a 24h sobre células ASK naive co-incubadas con los cuerpos celulares, para luego determinar el aumento en la expresión de IL-10, IFN-γ, TGF-β a nivel de transcrito. La cinética se realizó en placas de 6 pocilios (SPL) con 100.000 células, a las cuales se realizó 3 tratamientos: poli l :C (^g/mL), 100 μί cuerpos celulares sumado a virus inactivado (sobrenadantes desde un pocilio con 50.000 células y MOI 0,1), además como control se utilizó 100 μΐ PBS IX. Obtención de RNA. Para realizar la determinación de la respuesta inmune, se extrajo el RIMA total
0, 6, 12, 18 y 24h post tratamiento con el uso del kit comercial E.Z. N.A. Total RNA Kit II (Omega) según las recomendaciones del fabricante para los posteriores análisis.
Microscopía confocal. Para la detección de cuerpos celulares se analizó por microscopía confocal células ASK con un 80-90% de confluencia las cuales fueron sometidas a deprivación para generar cuerpos celulares. Las células fueron sembradas en placas de 8 pocilios Nunc™ Lab-Tek™ I I Chamber Slide™ System (Thermo Scientific), el sobrenadante de las células fue removido, las células se lavaron dos veces con PBS y luego se fijaron con 100 μί de solución de paraformaldehído al 4% en PBS durante 10 min, posterior a ello las células fueron tratados con yoduro de propidio para marcar los núcleos. Rápidamente la solución fue removida lavando con agua tres veces, se secaron por 10 min, y fueron montadas con DABCO (Sigma-Aldrich) y selladas en porta objetos para ser observadas al microscopio confocal Cari Zaiss LSM 510 (Zeiss, Oberkochen, Alemania), con el uso del software LSM image browser. Ejemplo 2: Ensayo in vivo con cuerpos celulares en salmón
Aplicación de la tecnología. Con la tecnología generada se desarrollaron vacunas que poseen distintas formulaciones de los cuerpos celulares, además de controles como virus inactivados con BEI a 1x10s virus/dosis y vacunas comerciales compuesta por ISAV Ixl07-7,5xl07 TCI D50 en parafina líquida. Las distintas vacunas permitirán evaluar el efecto de los cuerpos celulares en la generación de anticuerpos específicos contra ISAV y en la inducción de citoquinas producto de la vacunación. Las formulaciones fueron evaluadas en peces dispuestos en distintos estanques con ejemplares de salmón del Atlántico. Se extrajo bazo, corazón y riñon anterior, además de una muestra de sangre de cada población para evaluar el nivel de citoquinas, carga viral y anticuerpos antes de iniciar el ensayo, respectivamente. Los peces vacunados de los 13 grupos destinados al estudio de potencia fueron analizados visualmente para determinar efectos no deseados [Rojas, P. H. V. and D. d. P. y. M. P. Universidad de Concepción. Facultad de Medicina Veterinaria (2006). Evaluación de la seguridad de aplicación de una vacuna comercial inyectable contra I NP-VI DRIO en salmón del atlántico, durante cuatro meses post vacunación, Universidad de Concepción] y muestreados aleatoriamente en el orden de 5 ejemplares por grupo. Luego del desafío, los otros 13 grupos desafiados también fueron muestreados para determinar el efecto de la infección en la respuesta humoral. Los análisis fueron hechos a 3 peces por grupo y los datos tratados estadísticamente.
Vacunación y desafío. El proceso de pruebas de la vacuna se realizó en sistemas de mantención de peces en agua dulce y tienen los permisos correspondientes para el trabajo con ISAV. Para este fin se utilizaron 400 salmones del Atlántico (Salmo salar) con un peso promedio de 86,5 g y una longitud promedio de 20 cm los que fueron transferidos desde agua dulce hacia agua salada para promover la esmoltificación. Ocurrido este proceso se procedió a realizar la vacunación. Para ello, los peces fueron anestesiados por inmersión con 40mg/mL de benzocaína, luego fueron inmovilizados manualmente e inyectados por vía intraperitoneal aplicando 0,1 m L de la correspondiente formulación. Se utilizaron 120 peces por formulación de vacuna, los cuales a su vez fueron divididos en dos grupos, uno para ser utilizado en el desafío y el otro como control de vacunados sin desafiar, los que se mantuvieron en agua dulce, conteniendo 60 peces por estanque de 200 L de agua cada uno. Por cada estanque se adicionaron 5 peces correspondientes a los controles (PBS). Previo a la vacunación se tomaron muestras de 3 peces para ser utilizados como controles (peces sanos y sin vacunar) en los posteriores análisis. Los órganos seleccionados fueron corazón y bazo, almacenados a -80QC en RNA later (Ambion, Life Technologies), para posteriormente ser utilizados en la determinación de carga viral y para el análisis del perfil de transcritos de marcadores inmunológicos en salmones, respectivamente. También se tomaron muestras de sangre de los mismos peces, la que después de coagular, fue centrifugada a 3000 x g por 10 minutos para separar el suero del coágulo. El suero se alicuotó y se almacenó a -80QC para ser utilizado posteriormente en ensayos de ELISA.
Previo al desafío, se tomaron muestras de bazo, corazón y sangre a 3 peces por grupo experimental, para ser utilizados en los análisis posteriores. Transcurridos 42 días post vacunación se procedió a realizar el desafío con virus ISAV. Para el desafío se utilizó virus obtenido de infección de células de riñon anterior de salmón (SHK-1, del inglés Salmón Head Kidney). El desafío se realizó utilizando peces troyanos. Para esto, los salmones a ser utilizados como troyanos fueron anestesiados con benzocaína e inyectados intraperitonealmente con 0,2 m L de inoculo viral (Ixl05-lxl06 virus/dosis). Para el desafío se adicionaron 40 peces troyanos por estanque, quedando una cantidad de 99 peces por estanque incluyendo los 54 peces vacunados y 5 controles.
Posterior al desafío se realizaron dos muéstreos 63 días post vacunación (dpv) y 90dpv. El proceso se efectuó de la misma forma como se indicó anteriormente, colectando corazón, bazo y sangre de tres peces por grupo experimental y grupo control de vacuna. Durante todo el proceso de prueba de la vacuna, se monitoreó la mortalidad para los análisis de supervivencia.
Análisis de mortalidad. Los peces fueron monitoreados diariamente en los distintos grupos de peces. Los datos de mortalidad fueron analizados bajo el análisis de supervivencia mediante el estimador no paramétrico de la función de supervivencia de Kaplan-Meier [Kaplan EL, Meier P.(1958) Nonparametric estimation from incomplete observations. J Am Stat Assoc 1958; 53:457-81].
El análisis de las diferentes formulaciones de vacunas en relación a los peces controles (PBS), se llevó a cabo calculando el porcentaje de supervivencia relativa ( PS) [Amend D F. (1981). Potency testing of fish vaccines. International Symposium on Fish Biologics: serodiagnostics and vaccines. Dev Biol Stand. 49:447-454] mediante la fórmula siguiente:
(mortalidad acumulada del grupo de vacuna)/) mortalidad acumulada del grupo control) x 100 - 1 = RPS (I)
Ejemplo 3: Determinación de los niveles de anticuerpos específicos contra ISAV
Purificación de partículas virales. Para evaluar la inducción de IgM en los peces vacunados y/o desafiados se purificaron partículas virales para los ensayos de ELISA indirecto. La purificación se realizó a partir de células ASK infectadas con ISAV 752 (lxlO7 copias/mL) tras 14 días post infección. Se tomó el sobrenadante celular y se clarificó a 5000rpm en rotor SS-34 (Sorvall) durante 20 minutos a 4°C. El pellet obtenido se descartó y el sobrenadante se ultracentrifugó a 33.000rpm en rotor 70 Ti
(Beckman) durante 2 horas a 4°C. El pellet colectado se hidrató con 100 μί de tampón TNE (Tris HCI 10 mM, NaCI 0,1 M, EDTA lmM, pH 7,5) toda la noche a 4°C. Luego, el
pellet fue resuspendido y se depositó sobre 5 mL de un colchón de sacarosa al 20% en tampón TNE frió. La preparación fue ultracentrifugada en rotor 55 Ti (Beckman) a 32000rpm por 2 horas a 4°C.
Finalmente, el pellet es resuspendido en tampón TNE. La cuantificación de proteínas virales se realizó mediante el método de Bradford y la interpolación de datos con una curva de calibración con BSA (Tabla I). Posterior a la cuantificación se almacena rápidamente a -80°C hasta su uso. Se obtuvo un total de 240 μg de antígeno viral desde 6 botellas T-175 con 10 d.p.i. Cada uno de los 96 pocilios fue sembrado con 1 μg de antígeno viral en 100 μί de PBS e incubado toda la noche a 4QC para que al fondo del pocilio formen un tamiz.
Tabla I. Curva de calibración con BSA para determinar la cantidad de proteína viral en los pellet obtenido de la centrifugación. Se indica la cantidad de BSA en μg y los valores de absorbancia respectivos para estimar la cantidad.
Figure imgf000028_0001
Elisa indirecto. Se evaluaron los niveles de inmunoglobulina M (IgM) específicos contra ISAV mediante ELISA indirecto para determinar el efecto de cada formulación en la respuesta humoral de los peces frente a la vacunación y a la infección. La valoración de IgM se realizó desde el suero de tres ejemplares obtenidos por cada estanque un día antes de la vacunación, denominado como suero preinmune (-ldpv), además de sueros colectados 21dpv, 42dpv, 63dpv y 90dpv. El suero obtenido de cada pez fue colectado en tubos eppendorf para ser congelados con nitrógeno líquido y transportados en hielo seco hasta ser almacenados a -80°C. Para los ensayos de ELISA se descongelaron los sueros en hielo y se incubaron en una dilución 1:25 por triplicado (1) por 90min a 16^C en placas de ELISA de 96 pocilios (NUNC Maxisorp) activadas el día anterior (O.N 4QC) con 1 μg de partícula viral purificada por pocilio. Se dejaron pocilios de la placa sin suero para eliminar posteriormente el ruido de la técnica. Para eliminar la unión inespecífica de los anticuerpos se bloquearon los pocilios con PBS/BSA 2% por lh a temperatura ambiente. Se utilizó anticuerpo primario IgM monoclonal anti-lgM de salmón del Atlántico generado en ratón (GrupoBios) en una dilución 1:500 (en PBS/BSA 1%) por 90 minutos a 16°C y un anticuerpo secundario generado en cabra 1:2000 (en PBS/BSA 1%) conjugado a HRP por una hora a temperatura ambiente que permite, mediante una reacción colorimétrica, la detección indirecta de IgM. Después de cada paso las placas se lavaron con PBST (Tween 20 al 0.5 % V/V en PBS). Finalmente se agregó 3,3',5,5'- Tetrametil benzidina (SureBlue TMB Microwell Peroxidase Substrate, KPL) como sustrato de la peroxidasa. Se incubó por 5 minutos a temperatura ambiente y posteriormente se determinó la aparición de color mediante la medición de la absorbancia a 650nm utilizando el equipo Nanoquant Infinite M200 pro (TECAN, Austria). Los valores de absorbancia del sustrato de la peroxidasa fueron correlacionados con los niveles de IgM presente en el suero de los diferentes grupos de peces para dar origen al gráfico de barras correspondiente a los niveles de IgM logrados tras la vacunación (Figura 7).
Una vez registrados los valores de absorbancia de cada suero evaluado, estos fueron normalizados entre distintas placas; posteriormente se eliminó la señal de base restando a cada valor obtenido la absorbancia mostrada en los pocilios sin suero. Para comparar los datos se utilizó el programa GraphPad versión 5 (GraphPad Software) con la herramienta de ANOVA no paramétrico (Mann-Whitney) de una cola con un intervalo de confianza de 95% (p<0,005). Para evaluar si los resultados presentaron diferencias significativas se realizaron ensayos de t-student. Ver figura 7. Ejemplo 4: Determinación de la carga viral y transcritos relacionados a la respuesta inmune inducidos en el pez frente a desafíos con ISAV mediante RT-PCR en tiempo real
Extracción de RNA. Para evaluar el título viral presente en los peces se extrajo el RNA total de corazón, órgano recomendado por la Organización mundial de sanidad animal para el diagnóstico de ISAV (OIE, 2009, http://www.oie. int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/aahm/current/2.3.05_IS A.pdf); y por otro lado, para evaluar la inducción de citoquinas producto de la vacunación y/o infección se extrajo el RNA total desde bazo, un órgano linfoide importante en la respuesta inmune del pez. Se dispuso un trozo de corazón o bazo en un microtubo de 2mL y se agregó lmL de Trizol® donde fue homogenizado en frió con un rotor-estator. El tejido homogenizado fue tratado con 200μί de cloroformo y mezclado vigorosamente (vortex) por 20°C a temperatura ambiente. Luego la muestra fue centrifugada a 13.200rpm por 15 minutos a 4°C. La fase acuosa obtenida fue colectada en un volumen de isopropanol frió, donde fue mezclada por inmersión e incubada 30 minutos a temperatura ambiente para precipitar el RNA. Posteriormente, se centrifuga a 13.200rpm por 10 minutos a 4°C y el pellet obtenido es lavado con un volumen de etanol absoluto al 70% en agua libre de nucleasas y finalmente centrifugado a 7600rpm por 5 minutos a 4°C. El RNA obtenido es disuelto en 40μί de agua libre de nucleasas pre-calentada que posteriormente es incubada a 65°C por 10 minutos para la cuantificación por absorbancia a 260/280 nm mediante el equipo Nanoquant Infinite M200 pro (TECAN, Austria). Desde cada purificación de RNA desde tejido se obtuvo entre 0,3 ng/μί a 3,0 ng/μί desde tejido equivalente a dos-tres cabezas de fósforo aproximadamente (datos de cuantificación de RNA ver anexo 1). Para los ensayos de cuantificación relativa se consideró como material de partida 1 μg de RNA. Una vez cuantificado el RNA se almacenó a -80°C hasta su uso. RT-PCR en tiempo real. La determinación del título viral se llevó a cabo mediante RT- PCR en tiempo real de un solo paso cuantificando el número de copias del segmento 8 de ISAV, F5: 5'- GAAGAGTCAGGATGCCAAGACG-3' y R5: 5'- GAAGTCGATGAACTGCAGCGA-3' que generan un producto de 196pb. Brevemente, l^g de RNA purificado desde corazón es tratado con DNAsa I según las recomendaciones del fabricante. Para la cuantificación del RNA viral se utilizó el kit KAPA SYBR FAST One-Step qRT-PCR (Kapa Biosystems) en el equipo Eco™ Real-Time PCR System (lllumina, San Diego, CA, USA) con el software Eco 5.0. La mezcla de reacción fue: 5 μί de Master mix 2X, 1 μί de partidor F5 (10 μΜ), 1 μΐ de partidor R5 (10 μΜ), 1 μΐ de agua libre de nucleasas y 2μΙ de RNA (200ng). El perfil térmico utilizado para amplificar el segmento 8 fue: 12 minutos a 42QC, un paso de desnaturalización inicial a 95QC por 3 minutos seguido de 40 ciclos de amplificación (10 segundos a 95°C, 20 segundos a 60QC y 15 segundos a 72QC) y una extensión final a 72°C por 5 minutos. Para obtener la curva de melting se realizó al final del qRT-PCR un ciclo de disociación (1 minuto a 95°C, 30 segundos a 55°C y 30 segundos a 95°C).
Transcripción reversa. Para la cuantificación relativa de los m RNAs que codifican para las citoquinas se sintetizó la primera hebra de cDNA mediante transcripción reversa. Brevemente, se trató ^g de RNA de bazo con DNAsa I (PROM EGA) siguiendo las indicaciones del fabricante. La mezcla de transcripción reversa se realizó en un volumen final de 25 μί de acuerdo a las especificaciones del fabricante: 5 μί de tampón 5x, 1 μΐ de oligo dT (500 ng/ μί), Ιμί de dNTPs (10 m M), 0,5 μΐ de enzima transcriptasa reversa M-M LV PROM EGA® (Moloney Murine Leukemia Virus), 6,5 μΐ de agua libre de nucleasas y 11 μί de RNA tratado. Se incubó la mezcla de reacción por 1 hora a 42°C y luego 15 minutos a 65°C para inactivar la enzima. El cDNA se almacenó a -20°C hasta su uso. PCR en tiempo real. La cuantificación de los transcritos que codifican para las citoquinas se llevó a cabo mediante PCR en tiempo real utilizando como plantilla los cDNAs generados desde los mRNAs. Brevemente, ^g de RNA purificado desde bazo es tratado con DNAsa I según las recomendaciones del fabricante. Para la cuantificación del RNA viral se utilizó el kit KAPA SYBR FAST qPCR (Kapa Biosystems) en el equipo Eco™ Real-Time PCR System (lllumina, San Diego, CA, USA) con el software Eco 5.0. La mezcla de reacción fue: 5 μί de Master mix 2X, 1 μί de partidor forward (10 μΜ) (tabla II), 1 μΐ de reverse (10 μΜ) (tabla II), 1 μΐ de agua libre de nucleasas y 2μί de cDNA. El perfil térmico utilizado para amplificar las citoquinas se indica en la tabla III.
Tabla II. Secuencia nucleotídica de genes evaluados para estudiar el efecto de los prototipos vaccinales en la respuesta inmune de salmones vacunados y desafiados.
Figure imgf000032_0001
Tabla I II. Perfil térmico utilizado para amplificar los genes evaluados en la respuesta inmune de
salmones vacunados y desafiados. Gen Desnaturalización 40 Ciclos Extensión inicial Desnaturalización Apareamiento Extensión final bases
IL-10 90aC x 3min 90aC x 30s 60aC x 30s 72aC x 72aC x
30s 10min
IFNY 90aC x 3min 90aC x 30s 60aC x 30s 72aC x 72aC x
30s 10min
TGF-p 90aC x 3min 90aC x 30s 60aC x 30s 72aC x 72aC x
30s 10min
CD4 90aC x 3min 90aC x 30s 60aC x 30s 72aC x 72aC x
30s 10min eF1a 90aC x 3min 90aC x 30s 60aC x 30s 72aC x 72aC x
30s 10min
Para la cuantificacion de los transcritos relacionados a la respuesta inmune se utilizó el método de cuantificacion relativa descrito por Pfaffl, utilizando el factor de elongación eFla como gen de referencia para la normalización de la expresión de los genes analizados. Las diferencias entre los valores Ct de los amplicones de los genes analizados y los Ct correspondientes al gen de referencia se expresaron como ACt. Las diferencias entre los ACt de cada tratamiento se compararon con los ACt de los grupos control (vacunados con PBS) y esta diferencia se expresó como 2 ~(Δ Δ ct>' lo que representa el cambio en los niveles de expresión o expresión relativa normalizada (N E) [Pfaffl MW. (2001) A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res. May l;29(9):e45.] y esta fue comparada con la expresión relativa de estos genes del grupo de peces no tratados, para determinar las diferencias en la expresión respecto a este grupo de peces. Análisis de los niveles de mRNA de citoquinas en células ASK tratadas con prototipo vaccinal de cuerpos celulares.
Una vez establecido el protocolo para la generación de cuerpos celulares, se realizó una cinética de expresión en células ASK nativas a la 0, 6, 12, 18, 24h post tratamiento (h.p.t). Se analizó el perfil de expresión de transcritos de citoquinas producidos por las células en respuesta a PBS (control), al prototipo vaccinal de cuerpos celulares sumado a virus inactivados (CelIVac-ISAv) a un MOI de 0,1 UFP/mL, con poly l:C (Fig.2A-2C; Fig.3A-3B y Fig. 4A-4C).
Al realizar el análisis de expresión relativa a nivel de transcritos de IFN-γ en el curso de tiempo, los resultados en células ASK tratadas con Poli l:C muestran que los niveles de IFN-γ aumentan a las 6 h.p.t, observándose una disminución a las 12 h.p.t. (Figura 2C). Para las células ASK tratadas con el prototipo vaccinal de cuerpos celulares (CelIVac-ISAv) muestran que los niveles de IFN-γ aumentan a las 6 h.p.t, observándose una disminución gradual entre las 12 y 18 h.p.t. (Figura 2B). Al realizar el análisis de expresión relativa a nivel de transcritos de IL-10 no muestran diferencias para ninguno de los tratamientos utilizados (Figuras 3A-3B).
Finalmente, al realizar el análisis de expresión relativa a nivel de transcritos de TGF-β, los resultados en células ASK tratadas con Poli l:C muestran que los niveles de TGF-β aumentan a las 6 h.p.t, observándose un nivel basal a las 12 h.p.t. (Figura 4C). Para las células ASK tratadas con el prototipo vaccinal de cuerpos celulares (CelIVac-ISAv) muestran que los niveles de IFN-γ aumentan a las 12 h.p.t, observándose una disminución a las 18 h.p.t. (Figura 4B), sin embargo se observa nuevamente un aumento a las 24 h.p.t. (Figura 4B). Evaluación de prototipo vaccinal de cuerpos celulares (CelIVac- ISAv) en peces desafiados con ISAV. Se determinó la eficacia (Mortalidad) y potencia (inducción de respuesta inmune) en los peces que fueron vacunados con las distintas formulaciones y posteriormente desafiados con ISAV. Los peces fueron inmunizados con las distintas vacunas y a los 42 días post vacunación, los peces fueron desafiados con ISAV por medio de cohabitación y al día siguiente se tomaron muestras nuevamente, el ensayo se extendió 90 días post vacunación. Durante todo el ensayo se midió la mortalidad de cada uno de los grupos analizados. Por otro lado, para realizar los ensayos de potencia se hicieron muéstreos a los días 21, 41, 63 y 90 post vacunación de bazo, corazón y riñon y muestra de sangre de cada población para evaluar el nivel de citoquinas, carga viral y anticuerpos, así con estos parámetros poder estudiar la evolución de la respuesta inmune en los peces.
Evaluación de eficacia de prototipo vaccinal de cuerpos celulares (CelIVac-ISAv) y comparación con otras formulaciones.
Los resultados de eficacia se muestran en la figura 5 y 6. Es posible observar que el menor porcentaje de mortalidad acumulada corresponde a los peces que fueron vacunados con el prototipo "CelIVac-ISAv" (cuerpos celulares más virus inactivado) (Figura 5). Esto puede apreciarse de mejor forma al observar el porcentaje de sobrevida relativa ( PS) en la figura 6, donde se muestra que los peces vacunados solo con ISAv inact (virus ISA) presentan un RPS de 20%, y los peces vacunados con "Vacuna Comercial" (compuesta por ISAV Ixl07-7,5xl07 TCID50 en adjuvante de parafina líquida) y "Cuerpos Celulares" (solo cuerpos celulares) presentan un RPS del 40%, siendo los peces vacunados con el prototipo vaccinal "CelIVac-ISAv" los que presentan un mayor RPS (80%). Evaluación de la potencia producida en peces desafiados y vacunados con el prototipo vaccinal de cuerpos celulares (CelIVac-ISAv) y comparación con otras formulaciones. Determinación de título viral de peces desafiados Durante el ensayo de vacunación y posterior desafío, se determinó el titulo viral de los peces de los grupos "Control", "Cuerpos Celulares", "Vacuna Comercial", "CelIVac-ISAv" y "ISAv inact" a los 21, 41, 63 y 90 dpv. Es importante señalar que el desafío con ISAV fue realizado el día 42 post vacunación. La Figura 7 muestra que el día 63 post vacunación hay un aumento del título viral en todos los grupos de peces desafiados, sin embargo solo los peces del grupo control presentan un título viral sobre las 100.000 copias/mL. En el día 90 post vacunación todos los grupos presentan un aumento del título viral al compararlos con los peces no desafiados, sin embargo este título es menor que el observado al día 63. Determinación de respuesta inmune humoral
Se determinó como control el suero de los peces correspondiente a los sueros preinmunes (-1 dpv) observándose muestras con absorbancias del orden de 0,5, considerándose este valor como la línea de corte. Valores superiores a la línea de corte proponen la presencia de anticuerpos anti ISAV producidos por la vacunación y/o desafío.
En los peces vacunados se puede observar que a los 21dpv (Figuras 8), la totalidad de los grupos presenta niveles de anticuerpos anti-ISAV bajos, lo mismo ocurre a los 41dpv (Figuras 8) excepto para los peces vacunados con el prototipo "CelIVac-ISAv" donde se observa un aumento de IgM específicos contra ISAV. Se observar que a los 63dpv (Figuras 8) hay un aumento en los niveles de anticuerpo de los grupos "Control", "Cuerpos Celulares", "Vacuna Comercial" y "ISAv inact" probablemente debidos a la propia infección viral, sin embargo es interesante observar que el grupo "CelIVac-ISAv" muestra una disminución de anticuerpos en comparación a los peces no desafiados. Posteriormente, a los 90dpv se detecta un aumento general del título de anticuerpos en los peces evaluados, sin embargo, se observa que en el grupo "CelIVac-ISAv" estos anticuerpos solo se mantienen.
Determinación de respuesta inmune celular
Al realizar el análisis de expresión relativa a nivel de transcritos de IFN-γ en los días post vacunación; no se observa cambios de expresión en el grupo "Control", para los grupos de "Cuerpos Celulares" y "ISAv inact" se produce un aumento de la expresión de 12 veces al día 63. Para el grupo de la "Vacuna Comercial" se observa un aumento de la expresión IFN-γ a los días 21 y 63 de 5 y 25 veces respectivamente. Para el grupo de peces vacunados con el prototipo de "CelIVac-ISAv" se observa un aumento de la expresión IFN-γ a los días 41 y 63 de 7 y 32 veces respectivamente (Figura 9 panel IFN-γ).
El análisis de expresión relativa a nivel de transcritos de CD4 en los días post vacunación; se observa una disminución de expresión de CD4 en el grupo "Control" el día 90, para el grupo de "Cuerpos Celulares" se produce un aumento de la expresión de 16 veces al día 63 y 3 veces el día 90. Para el grupo de la "Vacuna Comercial" se observa un aumento de la expresión CD4 a los días 21 y
63 de 1,5 y 5 veces respectivamente. Para el grupo de peces vacunados con el prototipo de "CelIVac-ISAv" se observa un aumento de la expresión CD4 solo al día 63 de 32 veces, y en el caso del grupo vacunado con "ISAv inact" no se observaron cambios en la expresión de CD4 (Figura 9 panel CD4).
El análisis de expresión relativa a nivel de transcritos de IL-10 en los días post vacunación; no se observa cambios de expresión en el grupo "Control", para el grupo de "Cuerpos Celulares" se produce una disminución de 2 veces el día 21 y luego se observa un aumento de la expresión de IL-10 de 5 veces a los días 63 y 90. Para el grupo de la "Vacuna Comercial" se observa un aumento de la expresión IL-10 a los días 21 y 63 de 5 veces. Para el grupo de peces vacunados con el prototipo de "CelIVac-ISAv" se observa un aumento de la expresión IL-10 los días 41, 63 y 90 el cual es de 2, 7 y 14 veces respectivamente, y en el caso del grupo vacunado con "ISAv inact" se observa un aumento de la expresión IL-10 a los días 21 y 63 de 6 y 7 veces respectivamente (Figura 9 panel IL-10).
Finalmente, el análisis de expresión relativa a nivel de transcritos de TGF-β en los días post vacunación; se observa un aumento de la expresión de TGF-β en el grupo "Control" el día 63, para el grupo de "Cuerpos Celulares" se produce una disminución de 1,2 veces el día 41 y luego se observa un aumento de la expresión de TGF-β de 14 y 8 veces al día 63 y el día 90 respectivamente. Para el grupo de la "Vacuna Comercial" se observa una disminución de 14 veces el día 21 y luego un aumento de la expresión TGF-β el día 63 de 11 veces. Para el grupo de peces vacunados con el prototipo de "CelIVac-ISAv" se observa un aumento de la expresión TGF-β los días 63 y 90, este aumento es de 16 y 6 veces respectivamente, y en el caso del grupo vacunado con "ISAv inact" solo se observa un aumento de la expresión TGF-β al día 90 de 9 veces (Figura 9 panel TGF-β).
Para poder comparar los efectos que tiene la formulación del prototipo vaccinal "CelIVac-ISAv" y determinar si protege mejor a los peces que la vacuna comercial, se realizó un panel en el cual se incluyen todos los parámetros analizados en este trabajo (Figura 10). Si se compara el conjunto de parámetros obtenidos para el grupo de peces control, vacuna comercial y vacuna prototipo "CelIVac-ISAv". Se obtiene el análisis que ilustra la Figura 10.
Vacuna control: Para IFN-γ no se observan cambios en el transcurso del desafío, en CD4 se observa una disminución del marcador al día 90, para IL-10 no se observan cambios en el transcurso del desafío y para TGF-β se muestra aumento al dial 63. Por otro lado en carga viral se muestra aumento al dial 63, disminución al día 90 (se atribuye que los peces analizados el día 90 son los peces que se encontraban vivos por lo que corresponden a los sobrevivientes del desafío). Ver Figura 9.
Finamente para IgM se observa un aumento al día 63 y 90 producto del desafío con ISAV. Por lo tanto, se puede concluir que se produce una respuesta inmune humoral, pero esta respuesta no es capaz de proteger a los salmones.
Vacuna comercial: Para IFN-γ hay un aumento al día 21 producto de la vacuna, posteriormente se observa un aumento al día 63 de 25 veces en comparación al control, el caso de CD4 hay un aumento al día 21 producto de la vacuna, posteriormente se observa un aumento al día 63 de 5 veces en comparación al control, para IL-10 hay un aumento al día 21 producto de la vacuna, posteriormente se observa un aumento al día 63 de 5 veces en comparación al control y para TGF- β se observa una disminución de la expresión al día 21 en comparación al control. Por otro lado, la carga viral observada en el día 63 es menor que la del control. Finalmente, IgM muestra un aumento al día 63 y 90 generado posiblemente por el desafío con ISAV. Por lo tanto, se puede concluir que hay una respuesta inmune celular temprana (día 21) producto de la vacunación. Se produce una respuesta inmune humoral al igual que los peces controles desafiados, por lo que este tipo de respuesta no es capaz de proteger. Además, se observa una respuesta inmune celular (por la inducción de IFN-γ y CD4) la cual se intenta regular con citoquinas antiinflamatorias disminuyendo la mortalidad de los peces, sin embargo la inducción de estas citoquinas (IL-10 y TGF-β) no es suficiente, ya que no es sostenida en el tiempo.
Vacuna prototipo CellVac-ISAv: Para IFN-γ hay un aumento al día 41 producto de la vacuna, posteriormente se observa un aumento al día 63 de 32 veces en comparación al control. En el caso de CD4 se observa un aumento al día 63 de 32 veces en comparación al control, para IL-10 hay un aumento al día 21 producto de la vacuna, posteriormente se observa un aumento a los días 63 y 90 de 7 y 14 veces respectivamente en comparación al control y TGF-β muestra un aumento de 6 y
16 veces a los días 63 y 90 respectivamente en comparación al control. Por otro lado la carga viral observada en el día 63 es menor que la del control. Finalmente, IgM muestra un aumento al día 63 y 90 producto del desafío con ISAV. Por lo tanto, se puede concluir que hay respuesta inflamatoria tardía (día 41) producto de la vacunación, compensada con la inducción de IL-10. Se produce una respuesta inmune humoral producto de la vacunación antes del desafío y se produce una disminución de anticuerpos específicos contra ISAV cuando los peces son desafiados. Por otro lado, se observa una respuesta inmune celular (por la inducción de IFN-γ y CD4) la cual se intenta regular con la expresión de citoquinas antiinflamatorias (IL-10 y TGF-β) sostenida hasta el día 90. La disminución de anticuerpos específicos contra ISAV en el desafío y la expresión de citoquinas antiinflamatorias podría estar provocando la disminución de la mortalidad de los peces de este grupo, de esta manera modulando la respuesta inmune del pez produciendo una protección contra la infección con ISAV.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Adyuvante para vacuna contra infección de Virus de la Anemia Infecciosa de Salmón (ISAV) en peces CARACTERIZADO porque comprende cuerpos celulares.
2. El adyuvante de la reivindicación 1 CARACTERIZADO porque dichos cuerpos celulares son cuerpos celulares generados desde células provenientes de riñon anterior de Salmo salar (ASK).
3. Vacuna contra infección de Virus de la Anemia Infecciosa de Salmón ( ISAV) en peces CARACTERIZADA porque comprende el adyuvante de la reivindicación 1 y virus de la anemia infecciosa del salmón (ISA) inactivado.
4. La vacuna de la reivindicación 3 CARACTERIZADA porque comprende una cantidad en el rango de lxlO5 a lxlO7 de virus ISA inactivado/dosis mezclado con una cantidad en el rango de lxlO4 a lxlO6 de cuerpos celulares/dosis en tampón fosfato salino (PBS) como solución diluyente.
5. La vacuna de la reivindicación 3 CARACTERIZADA porque comprende una cantidad de lxlO6 de virus ISA inactivado/dosis mezclado con una cantidad de lxlO5 de cuerpos celulares/dosis en tampón fosfato salino (PBS) como solución diluyente.
6. La vacuna de la reivindicación 1 CARACTERIZADA porque sirve para producir en el pez, una respuesta inmune controlada, protectora y acotada a disminuir la mortalidad causada por infección de ISAV.
7. La vacuna de la reivindicación 1 CARACTERIZADA porque se administra intraperitonealmente.
8. Procedimiento para obtener cuerpos celulares CARACTERIZADO porque comprende inducir muerte celular por tratamiento con calor y deprivación de nutrientes de células provenientes de riñon anterior de Salmo salar para luego someterlas a shock térmico a 37°C, y luego incubarlas en tampón fosfato salino (PBS) hasta que la monocapa se desprenda, y opcionalmente, almacenar los cuerpos celulares en suspensión a 4°C.
9. Método para producir en el pez, una respuesta inmune controlada, protectora y acotada a disminuir la mortalidad causada por infección de Virus de la Anemia Infecciosa de Salmón (ISAV), caracterizado porque comprende administrar al pez una formulación de vacuna como la descrita en cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6 en una cantidad de lOOul por dosis.
10. El método de la reivindicación 9, caracterizado porque la formulación de vacuna se administra intraperitonealmente.
11. Kit para producir en el pez, una respuesta inmune controlada, protectora y acotada a disminuir la mortalidad causada por infección de Virus de la Anemia Infecciosa de Salmón (ISAV), caracterizado porque comprende un frasco que comprende una cantidad en el rango deelxlO5 a lxlO7 de virus inactivado/dosis mezclado con una cantidad en el rango de lxlO5 a lxlO6 cuerpos celulares/dosis utilizando tampón fosfato salino (PBS) como solución diluyente.
12. El kit de la reivindicación 11, caracterizado porque comprende un frasco que comprende lxlO6 virus inactivado/dosis mezclado con lxlO5 cuerpos celulares/dosis utilizando tampón fosfato salino (PBS) como solución diluyente.
13. Kit de dos frascos para producir en el pez, una respuesta inmune controlada, protectora y acotada a disminuir la mortalidad causada por infección de Virus de la Anemia Infecciosa de Salmón (ISAV), caracterizado porque comprende un primer frasco que comprende el virus inactivado y liofilizado y un segundo frasco que comprende una suspensión en tampón fosfato salino (PBS) de cuerpos celulares.
14. El kit de la reivindicación 13, caracterizado porque el primer frasco comprende una cantidad en el rango de lxlO5 a lxlO7 de virus ISA inactivado/dosis y el segundo frasco comprende una cantidad en el rango de lxlO4 a lxlO6 de cuerpos celulares/dosis en tampón fosfato salino (PBS) como solución diluyente.
15. Método para preparación de la vacuna de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque comprende mezclar en condiciones estériles, el virus de la Anemia Infecciosa de Salmón (ISAV) inactivado con una suspensión de cuerpos celulares en tampón fosfato salino (PBS) como solución diluyente.
PCT/CL2016/050074 2015-12-22 2016-12-21 Vacuna contra isav con dicho virus inactivado y un adyuvante basado en cuerpos celulares la que potencia la respuesta inmune WO2017106983A1 (es)

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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CL2014003615A1 (es) * 2014-12-31 2015-10-09 Univ Santiago Chile Generacion de cuerpos celulares a través de deprivación de nutrientes y su uso para generar inmunidad antitumoral

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CL2014003615A1 (es) * 2014-12-31 2015-10-09 Univ Santiago Chile Generacion de cuerpos celulares a través de deprivación de nutrientes y su uso para generar inmunidad antitumoral

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CORTEZ-SAN MARTIN, M. ET AL.: "P212. The adjuvants have a key role improving the protection and immune response induced by recombinant protein vaccine against infectious salmon anemia virus ISAV in Atlantic salmon", FISH & SHELLFISH IMMUNOLOGY, vol. 34, no. 6, June 2013 (2013-06-01), pages 1701, XP055393536, Retrieved from the Internet <URL:http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1050464813002970> *
DEVOLD, M. ET AL.: "Use of RT-PCR for diagnosis of infectious salmon anaemia virus (ISAV) in carrier sea trout Salmo trutta after experimental infection", DIS AQUAT ORGAN, vol. 40, no. 1, 2000, pages 9 - 18, XP000864789 *
FENG, H. ET AL.: "Exogenous stress proteins enhance the immunogenicity of apoptotic tumor cells and stimulate antitumor immunity", BLOOD, vol. 101, no. 1, 1 January 2003 (2003-01-01), pages 245 - 252, XP002398537 *
KONO, H ET AL.: "How dying cells alert the immune system to danger", NATURE REVIEWS IMMUNOLOGY, vol. 8, no. 4, 2008, pages 279 - 289, XP055393984 *
MERCILLE, S. ET AL.: "Induction of apoptosis in nutrient- deprived cultures of hybridoma and myeloma cells", BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING, vol. 44, no. 9, 5 November 1994 (1994-11-05), pages 1140 - 1154, XP055393986 *
TAFALLA, C ET AL.: "Adjuvants and immunostimulants in fish vaccines: Current knowledge and future perspectives", FISH & SHELLFISH IMMUNOLOGY, vol. 35, no. 6, December 2013 (2013-12-01), pages 1740 - 1750, XP055393527 *

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