WO2017106951A1

WO2017106951A1 - Composição farmacêutica, uso da composição farmacêutica, método de tratamento de leishmaniose e processo de preparação

Info

Publication number: WO2017106951A1
Application number: PCT/BR2016/050339
Authority: WO
Inventors: Juliana SOUZA RIBEIRO BAESSO; Paula KRELING SANTOS; Andre Arigony Souto; Elvira MARIA SARAIVA CHEQUER BOU-HABIB; Deivid COSTA SOARES; Christian FERREIRA; Carlos LUAN ALVES PASSOS
Original assignee: Uniao Brasileira De Educacao E Assistencia
Priority date: 2015-12-21
Filing date: 2016-12-20
Publication date: 2017-06-29
Also published as: BR102015032166A2

Abstract

A presente invenção descreve novos azoestilbenóides como agentes leishmanicidas. A presente invenção se situa nos campos da Síntese Orgânica e Farmacologia Clínica.

Description

Relatório Descritivo de Patente de Invenção

COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, USO DA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, MÉTODO DE TRATAMENTO DE LEISHMANIOSE E PROCESSO DE

PREPARAÇÃO

Campo da Invenção

[0001] A presente invenção descreve novos azoestilbenóides como agentes leishmanicidas. A presente invenção se situa nos campos da Síntese Orgânica e Farmacologia Clínica.

Antecedentes da Invenção

[0002] As leishmanioses são doenças consideradas negligenciadas pela OMS, de grande importância em saúde pública, sendo endémicas em 98 países, atingindo principalmente as regiões tropicais e subtropicais. A OMS estimou que no período de 2003-2007 foram diagnosticados em estabelecimentos médicos entre 200 a 400 mil casos de leishmaniose visceral e 0,7 a 1 ,2 milhões de casos de leishmaniose cutânea, com uma taxa de mortalidade em torno de 20 a 40 mil óbitos anuais. No Brasil, no mesmo período segundo a OMS, a leishmaniose tegumentar atingiu entre 72,800 a 1 19,600 pessoas por ano, enquanto, a incidência anual de leishmaniose visceral foi em torno de 4,2 a 6,3 mil casos. Segundo a Iniciativa Medicamentos para Doenças Negligenciadas (DNDi em inglês) a leishmaniose é uma doença "extremamente negligenciada", devido a sua prevalência em regiões de extrema pobreza e a falta de interesse por parte da indústria farmacêutica em desenvolver novos medicamentos para essa doença.

[0003] Leishmaniose canina é uma zoonose causada por parasitas do género Leishmania e os cães são reservatórios dos parasitos causadores da leishmaniose humana. Pelo fato de serem animais domésticos, os cães constituem uma ameaça aos humanos quando presentes em áreas endémicas. Estima-se que um terço das espécies de Leishmania pode causar leishmaniose canina sendo Leishmania infantum o principal agente etiológico, mas Leishmania amazonensis, Leishmania braziliensis, Leishmania donovani também são identificadas como potenciais agentes etiológicos da leishmaniose canina (Reguera, et al., Vet Parasito!. ; 227:98-1 14, 2016).

[0004] A transmissão é feita por flebótomos e a espécie responsável pela transmissão do parasito dependerá da região endémica. A transmissão ocorre quando o inseto vetor realiza repasto sanguíneo em cão infectado e desta forma adquire parasitos que serão transmitidos a um cão saudável em um repasto sanguíneo subsequente (Reguera, et al., 2016 e Kaszak, et al., Ann Parasito!^ (2):69-76, 2015).

[0005] A leishmaniose canina afeta 2,5 milhões de cães domésticos em 70 países dos cinco continentes e pode levar os cães ao óbito se não tratados. A patologia se caracteriza pela presença de diversas formas clínicas, incluindo as formas cutânea e visceral (Reguera, et al., 2016 e Kaszak, et al., 2015). A lesão cutânea pode se apresentar como demartite esfoliativa com ou sem alopecia não pruriginosa, dermatite ulcerosa erosiva, demartite nodular, demartite papular ou demartite pustular. A leishmaniose canina pode ainda apresentar um quadro clínico com lesões renais, oculares e articulares. Dentre as manifestações oculares podemos citar a blefarite, uveíte e queratoconjutivite. Em alguns casos de leishmaniose canina o comprometimento vascular e neurológico pode ser observado. Os sinais clínicos mencionados acima podem ser variáveis e inespecíficos, mas na maioria dos casos linfadenopatia, apatia, emaciação, caquexia, onicogrifose e atrofia muscular são sinais característicos. No entanto, a insuficiência renal é a principal causa de mortalidade da leishmaniose canina (Kaszak, et al., 2015).

[0006] O tratamento das leishmanioses humanas é realizado com alguns fármacos disponíveis no mercado, que possuem alta toxicidade e administração por via parenteral, o que exige a colaboração do paciente. No entanto, muitos abandonam o tratamento, favorecendo o aparecimento de cepas resistentes. Os antimoniais pentavalentes, como Pentostam® (estibogluconato de sódio, Wellcome Foundation, UK) e Glucantime® (meglumina antimoniato, Rhône Polenc, França), são os medicamentos de primeira escolha para o tratamento das leishmanioses. Os tratamentos de segunda escolha incluem o antibiótico anfotericina B, a paromomicina, a pentamidina, a miltefosina e o cetoconazol, utilizado nos casos em que os antimoniais não surtem efeito; entretanto estes fármacos também possuem toxidez elevada e alto custo.

[0007] Já as estratégias de combate à leishmaniose canina consistem do controle da proliferação de vetores ou suas picadas e o tratamento dos animais infectados. O uso de inseticidas e repelentes é uma medida profilática. A maioria das formulações de inseticidas baseia-se na administração de piretróides semisintéticos isoladamente ou em associação com outros inseticidas que aumentam sua eficácia. Inseticidas tópicos para proteger os cães dos vetores da leishmaniose demonstraram que a taxa de sobrevivência dos flebotomos alimentados e não alimentados foi significantemente reduzida pelos tratamentos com permetrina, deltametrina e fenthion.Deltametrina tem sido recomendado aos donos de cães, uma vez que apresenta atividade anti- repasto e induz a morte do flebótomo. Duas semanas após aplicação de deltametrina o efeito anti-repasto foi maior que 90% após os primeiros 4 meses e decaiu para 84% após 6 meses. A morte dos flebotomos foi de 76% após 2 semanas e caiu para 42% após 6 meses (Reithinger et al., 2001 ).

[0008] O alopurinol representa o fármaco mais utilizado contra leishmaniose canina por ser utilizado em combinação com outros fármacos. Quimicamente, o alopurinol é um análogo da hipoxantina que é metabolizado pelo parasita a trifosfato de nucleotídeo amino pirazol pirimidina, o qual se integra à síntese proteica inibindo a síntese de RNA da Leishmania (Nelson et al., 1979). Como consequência, a carga parasitária diminui com baixa toxicidade (Torres et al., 201 1 ), embora alopurinol induza a formação de cristais de xantina em quase todos os cães tratados e, ocasionalmente, urólitos (Torres, et al., 201 1 ; Noli e Saridomichelakis, 2014), que podem secundariamente induzir azotemia pós-renal e ocasionalmente disfunção renal.

[0009] Existem vários protocolos de tratamento, mas a associação de fármacos anti-Leishmania como o antimoniato de meglumina e alopurinol é frequentemente utilizada como primeira escolha. A duração do tratamento depende da gravidade da doença e da tolerância individual aos fármacos. A cura parasitológica é raramente alcançada e há ocorrência de efeitos secundários como urolitíase xantina em caso de tratamento prolongado com alopurinol e nefrotoxidade, desordens intestinais, hipersensibilidade e carência de ferro induzida pelo antimoniato de meglumina (Kaszak, et al., 2015).

[0010] Miltefosina, uma hexadecilfosfocolina, é utilizada como monoterapia ou associada à alopurinol como opção ao tratamento de primeira escolha. O produto farmacêutico para utilização veterinária é uma solução líquida para administração oral. A miltefosina originalmente foi desenvolvida como um fármaco antitumoral para o tratamento tópico de metástases de pele no cancro de mama humano e, posteriormente, foi demonstrado sua atividade anti-Leishmania contra leishmaniose visceral humana. Recentemente, a Food and Drug Administration (FDA) aprovou miltefosina para o tratamento de qualquer forma de leishmaniose e tornou-se o primeiro fármaco aprovado tanto para leishmanioses cutâneas humanas como mucosas. Efeitos adversos como dor intestinal, náuseas, diarréia, anorexia e a diminuição do hematócrito e dos glóbulos brancos são obsevados em cães tratados com miltefosina (Mateo, et al., 2009; Manna et al., 2009 e Woerly et al., 2009). A toxicidade reprodutiva em animais e humanos induzida por miltefosina limita sua utilização em animais grávidos (Sindermann and Engel, 2006).

[0011] Outros fármacos são estudados para elaboração de um regime eficiente no tratamento da leishmniose canina. Vários testes clínicos demonstraram que o tratamento com anfotericina B leva a uma melhora clinica significativa, mas falha na cura parasitológica apresenta alta taxa de relapso e requer o monitormento renal durante o tratamento. Estes fatores impedem a recomendação da utilização deste fármaco em cães (Noli and Auxilia, 2005). Há escassos testes clínicos envolvendo pentamidina no tratamento de leishmaniose canina, mas estes estudos demonstraram melhora do quadro clínico levando os cães a um estado assintomático sem apresentar relapso 6 meses após o tratamento (Rhalem et al., 1999). Marbofloxacina, uma fluorquinolona utilizada na veterinária para o tratamento de infecções bacterianas foi usada em teste clínico realizado em cães infectados naturalmente com leishmaniose canina. Os resultados demonstraram remissão dos sinais clínicos como linfadenopatia, onicogrifose e esplenomegalia em 70% dos casos, mas mesmo assim as recidivas ocorreram em 50% dos cães (Rougier et al., 2008).

[0012] A leishmaniose é um problema de saúde pública, portanto a redução significativa no risco desta enfermidade inicia com um tratamento eficaz dos cães que são hospedeiros reservatórios. A busca de novos medicamentos eficazes e seguros nos tratamentos destes hospedeiros vai interromper o ciclo biológico da leishmaniose.

[0013] Como reportado acima os fármacos utilizados atualmente para leishmaniose canina não são eficientes, pois melhoram os sinais clínicos sem cura parasitológica e causam efeitos tóxicos importantes nos animais. Esforços são feitos para introduzir um novo regime de tratamento com novos fármacos, entretanto, os testes clínicos realizados demonstram melhora clínica dos animais tratados e elevada taxa de relapso. Todos esses fatores mencionados anteriormente somados ao fato dos cães serem reservatórios naturais para o parasito e desta forma constituírem um fator ponteciador da transmissão tanto da leishmaniose canina quanto da leishmaniose humana estimulam o estudo de novas substâncias com atividade em leishmaniose canina para elaboração de novas terapias eficazes.

[0014] Além disso, como mencionado anteriormente, os fármacos utilizados para tratamento da leishmaniose humana apresentam toxidez elevada e alto custo. Dessa forma, todos esses fatos, associado aos poucos avanços em relação ao desenvolvimento de novas drogas e abordagens terapêuticas para esta doença, estimulam a busca de novas alternativas para o tratamento das leishmanioses. Estilbenos constituem uma potencial fonte de novas moléculas ativas, e podem fornecer um modelo estrutural para o desenvolvimento de novos medicamentos.

[0015] Assim, do que se depreende da literatura pesquisada, não foram encontrados documentos antecipando ou sugerindo os ensinamentos da presente invenção, de forma que a solução aqui proposta possui novidade e atividade inventiva frente ao estado da técnica.

Sumário da Invenção

[0016] Dessa forma, a presente invenção tem por objetivo resolver os problemas constantes no estado da técnica a partir de compostos azoestilbenóides como agentes leishmanicidas. Composições farmacêuticas em que esse composto está presente apresentam como vantagem um efeito superior ao encontrado em outros compostos análogos, como o resveratrol. Além disso, o processo pelo qual esse composto é formado é mais simples e permite a formação de tal composto a partir dos fenóis correspondentes.

[0017] Ainda, o conceito inventivo comum a todos os contextos de proteção reivindicados são os compostos azoestilbenóides.

[0018] Estes e outros objetos da invenção serão imediatamente valorizados pelos versados na arte e pelas empresas com interesses no segmento, e serão descritos em detalhes suficientes para sua reprodução na descrição a seguir.

Breve Descrição das Figuras

[0019] Com o intuito de melhor definir e esclarecer o conteúdo do presente pedido de patente, as seguintes figuras são apresentadas:

[0020] A figura 1 mostra o efeito dos REDRESVs na produção de óxido nítrico (NO) em macrófagos peritoneais murinos. Macrófagos (105) infectados com Leishmania amazonensis em uma proporção de 10:1 , ativados ou não com 0.5 μς/ιη.- IFN-γ e 0.1 pg/mL de LPS, foram incubados na presença ou ausência de 27,65 μΜ de REDRESV005 e 6,66 μΜ de REDRESV006. A produção de NO foi avaliada após 48 horas de tratamento pelo método de Griess. Os resultados de 3 experimentos independentes realizados em triplicata são apresentados como média ± SEM da concetração de nitrito. (^*** P <0,0001 em relação ao IFN-γ e LPS, e # P <0,05 em relação ao controle não tratado).

[0021] A figura 2 mostra um gráfico da citotoxicidade dos derivados RedResveratrol (R) para macrófagos peritoneais murinos in vitro através do teste de exclusão do corante azul de Trypan.

[0022] A figura 3 mostra um gráfico da citotoxicidade dos derivados

RedResveratrol (R) para macrófagos peritoneais murinos in vitro com 2,3-Bis-

(2-Methoxy-4-Nitro-5-Sulfophenyl)-2H-Tetrazolium-5-Carboxanilide.

[0023] A figura 4 mostra um gráfico da avaliação do ciclo cellular pela análise do conteúdo de DNA de promastigotas de L. amazonensis.

[0024] A figura 5 mostra um gráfico do efeito de RedResveratrol no potencial de membrana mitocondrial.

[0025] A figura 6 mostra um gráfico da expressão de Anexina V. Descrição Detalhada da Invenção

[0026] Em um primeiro objeto, a presente invenção apresenta uma composição farmacêutica compreendendo:

- pelo menos um composto de fórmula:

em que R1 é OAc; R2 e R3 são selecionados independentemente entre OAc e OH; e - pelo menos um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0027] Em um segundo objeto, a presente invenção apresenta uso da dita composição farmacêutica por ser na fabricação de um medicamento para o tratamento de doenças associadas a Leishmaniose.

[0028] Em um terceiro objeto, a presente invenção apresenta método de tratamento de Leishmaniose compreendendo a aplicação da dita composição farmacêutica em um indivíduo compreendendo Leishmaniose.

[0029] Em um quarto objeto, a presente invenção apresenta um método de tratamento de Leishmaniose compreendendo a aplicação da dita composição farmacêutica em um animal compreendendo Leishmaniose.

[0030] Em um quinto objeto, a presente invenção apresenta um processo de preparação do dito composto compreendendo as etapas de:

a) Condensação de um fenol adequado com um nitrito de sódio;

b) Acetilação das hidroxilas.

[0031] Composições farmacêuticas em que esse composto azoestilbenoide como agente leishmanicida está presente apresentam como vantagem um efeito superior ao encontrado em outros compostos análogos, como o resveratrol. Além disso, o processo pelo qual esse composto é formado é mais simples e permite a formação de tal composto a partir dos fenóis correspondentes.

Exemplos - Concretizações

[0032] Os exemplos aqui mostrados têm o intuito somente de exemplificar uma das inúmeras maneiras de se realizar a invenção, contudo sem limitar, o escopo da mesma

[0033] A síntese do Redresv001 tem como base a síntese descrita por Tedder JM e Theaker G (89); os compostos metilados conforme descrito por Snyder AS et al (93) e Norikane Y (94); os acetilados seguindo a proposta de Pujic MG et al (95) e Acerson MJ (96). Os compostos sintetizados estão representados abaixo (Tabela 1 ), diferenciados pelos grupamentos presentes nas posições R1 , R2 e/ou R3 (Esquema 1 ).

Esquema 1. Grupamentos R1 , R2 e R3 (adaptado de Roberti M, 2003) (92) Tabela 1. Novos azoestilbenóides sintetizados

Azo composto R1 R2 R3

RedresvOOl ÕH ÕH ÕTT

Redresv002 CH₃ CH₃ OH

Redresv005 O Ac O Ac O Ac

Redresv006 OAc OH OH

Composto Redresv 001

[0034]Seguindo o método geral, esse composto foi obtido a partir da dissolução do Fenol (0,01 mol) em uma mistura de Acetona e Água (1 :2). Adicionado Nitrito de sódio (0,145 mol) à solução, seguido de Ácido Clorídrico 2N (0,1 mol) e agitação mantida a 0^QC por 24hs. A solução foi tratada com excesso de Ácido Sulfâmico e neutralizada com Bicarbonato de Sódio. Adicionado excesso de Resorcinol solubilizado em solução de Hidróxido de Sódio 1 M. Após agitação por 2hs à temperatura de 25^QC adicionado Ácido Clorídrico p.a até precipitação. Após resfriamento, o composto foi isolado por filtração e recristalizado; rendimento: 72%; composto colorido; ponto de fusão: 220^QC; IR (KBr): Ό = 3425,80, 3201 ,83, 1592,19, 1251 ,51 ; UV-vis: λ (acetonitrila/água) = 230nm; RMN ¹ H (400 MHz, CD₃OD): δ = 13.363 (s, 1 H, OH), 9.951 (s, 1 H, OH), 9.737 (s, 1 H, OH), 7.690-7.579 (m, 3H, Ar-H), 6.902- 6.864 (m, 2H, Ar-H), 6.489-6.461 (m, 2H, Ar-H), 6.303-6.297 (m, 1 H, Ar-H); RMN ¹³C (100 MHz, CD₃OD): δ = 163.03, 161 .16, 156.64, 145.30, 134.66, 133.45, 124.37, 1 16.94, 109.46, 104.02. Composto Redresv002

[0035]Seguindo o método geral, esse composto foi obtido a partir da solubilização do RedresvOOl (4,38 mmol) em Acetona (20 mL). Após solubilização, foi adicionado Carbonato de Potássio (5,45g) e mantido em agitação por 5 min a temperatura de 25^QC, protegido da luz. Finalizado o tempo, adicionou-se lodeto de Metila (3 mL) gota a gota, por aproximadamente 5 min. Agitação mantida a 25^QC por 24hs. À solução, adicionou-se lodeto de Metila (3 mL) conforme procedido anteriormente e agitação mantida por mais 24hs à 25^QC. Acrescentado Cloreto de Amónio saturado (25 mL) e o produto foi extraído com Acetato de Etila (3 x 30 mL). A fase orgânica foi lavada com Água destilada (5 x 30 mL), solução de Hidróxido de Sódio 1 M (6 x 30 mL) e Cloreto de Sódio saturado (3 x 30 mL). Finalizado, Sulfato de Magnésio foi colocado em excesso na solução, sendo esta filtrada e concentrada; rendimento: 77%; composto colorido; ponto de fusão: 1 1 0-1 20^QC; IR (KBr): Ό = 2928,37, 2930,46, 3306,50, 1580,93, 1 596,60, 1 250,90; UV-vis: λ (acetonitrila/água) = 226nm; RMN ¹ H (400 MHz, CDCI₃): δ = 13.352 (s, 1 H, OH), 7.795-7.736 (m, 3H, Ar-H), 7.003-6.981 (m, 2H, Ar-H), 6.61 0-6.582 (m, 1 H, Ar-H), 6.470-6.474 (m, 1 H, Ar- H), 3.983-3.857 (d, 6H, CH₃); RMN ¹³C (100 MHz, CDCI₃): δ = 163.21 , 161 .46, 1 55.67, 144.46, 134.09, 132.77, 1 23.36, 1 14.51 , 1 07.77, 101 .44, 55.64, 55.61 . Composto RedresvOOõ

[0036] Seguindo o método geral (95), esse composto foi obtido a partir da solubilização de RedresvOOl (4,38 mmol) em Anidrido Acético (120 mL) sob agitação a temperatura ambiente. Foi adicionado Piridina (1 mL) sendo uma gota a cada 5 min e agitado por 30 min após toda a adição. O produto foi precipitado após adição de Água Destilada a 1 0^QC, filtrado e lavado com Água (3 x 30mL) e Ácido Clorídrico a 5% (500 mL); rendimento: 98,3%; composto colorido; ponto de fusão: 1 1 5-122°C; IR (KBr): o = 3065,77, 1760,37, 1588,21 , 1 1 91 ,01 ; UV-vis: λ (acetonitrila/água) = 355nm; RMN ¹ H (400 MHz, CDCI₃): δ = 7.876-7.821 (m, 3H, Ar-H), 7.259-7.224 (m, 2H, Ar-H), 7.1 59-7.021 (m, 2H, Ar- H), 2.380-2.262 (m, 7H, COCH₃); RMN ¹³C (1 00 MHz, CDCI₃): δ = 169.12, 168.58, 153.21, 150.40, 149.44, 141.63, 124.16, 122.27, 119.74, 118.27, 116.80, 21.17, 20.69.

Composto Redresv006

[0037] Seguindo o método geral (96), esse composto foi obtido a partir da adição do Dimetilsulfóxido anidro (10ml_) com RedresvOOl (500 mg) e mantido sob agitação em sistema fechado até solubilização. Após, adicionou- se Trietilamina (306 μΙ_) e a agitação foi mantida por 20 minutos, acrescentando Anidrido Acético (206 μΙ_) e agitação por mais 1h. O produto foi separado através de passagem por coluna cromatográfica com sílicagel 60 (0,2-0,5mm) empacotada e utilizando como solvente o clorofórmio; rendimento: 8%; composto colorido; ponto de fusão: 130-145°C; IR (KBr): o = 3495,94, 1760,37, 1371,79, 1191,01; UV-vis: λ (acetonitrila/água) = 272nm; RMN 1H (400 MHz, CDCI3): δ = 13.362 (s, 1H, OH), 13.156 (s, 1H, OH), 7.798-7.648 (m, 3H, Ar-H), 7.260-7.185 (m, 1H, Ar-H), 6.814-6.723 (m, 2H, Ar-H), 6.276-6.271 (m, 1H, Ar- H), 2.411-2.334 (d, 3H, CH3); RMN 13C (100 MHz, CDCI3): δ = 169.79, 158.85, 154.01, 152.98, 144.26, 133.59, 132.96, 123.83, 122.45, 116.16, 115.83, 113.43, 108.91, 21.24.

Atividade Leishmanicida

[0038] Inicialmente testamos a atividade dos Redresvs em formas promastigotas de Leishmania amazonensis. Nossos resultados demonstraram que os compostos RedresvOOl , Redresv002, RedresvOOõ e Redresv006 foram capazes de diminuir o crescimento de formas promastigotas de L. amazonensis in vitro após 48 horas, com um IC50 (Concentração inibitória para 50% da população), 32, >160, 33 e 18 μΜ, respectivamente, em meio de cultura/DMSO.

[0039] Uma vez que os Redresvs foram ativos contra promastigotas, nos interessamos em testar sua atividade contra as formas amastigotas do parasito que são as que mantêm a infecção no hospedeiro vertebrado. Assim, a sobrevivência de amastigotas foi avaliada em macrófagos infectados in vitro, após 24 horas de um único tratamento. Nossos resultados demonstraram que o IC50 obtido para RedresvOOl , Redresv002, RedresvOOõ e Redresv006 foi de 27,6, >80, 12,9 e 6,7 μΜ, respectivamente.

[0040] É sempre importante verificar a citotoxidade de compostos também para as células do hospedeiro, o que pode inviabilizar seu uso se o composto for muito tóxico. Assim, testamos esse parâmetro avaliando a capacidade dos Redresvs de afetar a atividade mitocondrial de macrofagos utilizando o método do XTT, que mede a atividade das desidrogenases mitocondriais. Nossos resultados mostram que o CC50 (Concentração inibitória para õ0% da população) para os RedresvOOl , Redresv002, RedresvOOõ e Redresv006 foi de 1 35,8, >1 60, 80 e 54,3 μΜ, respectivamente.

Tabela 2. Atividade Leishmanicida dos Redresvs.

REDRESV IC50 IC50 CCso índice de

Promastigotas Amastigotas Macrofagos Seletividade

001 32 μΜ 27,6 μΜ 13õ,8 μΜ 4,9 μΜ

002 >1 60 μΜ >80,0 μΜ >1 60 μΜ >2 μΜ

00Õ 33 μΜ 1 2,9 μΜ 80,0 μΜ 6,2 μΜ

006 1 8 μΜ 6,7 μΜ 04,3 μΜ 8,1 μΜ

[0041 ] Avaliamos ainda se os derivados possuem a capacidade de modular funções celulares testando a modulação de óxido nítrico (NO) em macrofagos, um importante mediador leishmanicida. Assim, demonstramos que os Redresvs são capazes de induzir a produção de NO nos macrofagos, tratando macrofagos murinos com 27,6 μΜ de RedresvOOl , 12,9 μΜ de RedresvOOõ e 6,7 μΜ de RedresvOOõ por 48 horas. Nossos resultados demonstram que nenhum dos compostos induziu a produção de NO em macrofagos (Figura 1 ). Além disso, o RedresvOOõ diminuiu cerca de 1 ,4 vezes a produção de NO em macrofagos infectados. O RedresvOOl , RedresvOOõ e Redresv006 diminuíram cerca de 1 ,6õ, 1 ,63 e 1 ,8 vezes a produção de NO em macrofagos infectados e ativados com IFN-γ e LPS, respectivamente (Figura 1 ), indicando que o efeito leishmanicida dos Redresvs não foram mediado pela indução de NO. Considerações Finais

[0042] Os Redresvs apresentam efeito anti- Leishmania amazonensis para as formas promastigotas e amastigotas intracelulares, sendo RedresvOOl , 005 e 006, os que apresentaram melhor efeito leishmanicida. 18/021966

Metodologia

[0043] Parasitas - Formas promastigotas de Leishmania amazonensis (WHOM/BR/75/Josefa) foram mantidas em meio Schneider^'s (Sigma) pH 7.4 contendo 10 % de soro fetal bovino (SFB; Cripion) a 26 °C.

[0044] Animais - Camundongos BALB/c foram obtidos do Biotério Central de Criação de Camundongos do Centro de Ciências e Saúde, para a realização dos experimentos, utilizados animais de 4 a 8 semanas de idade. Os protocolos de experimentação foram aprovados pela Comissão para uso de animais da UFRJ (Número: IMPPG 024).

[0045] Atividade anti-promastigotas - Formas promastigotas de L. amazonensis foram incubadas em meio Schneider suplementado com 10 % de SFB a 26 °C na presença ou não dos compostos, que foram adicionados no primeiro dia de cultivo. A sobrevivência dos parasitas foi avaliada através do método de XTT após 48 horas.

[0046] Infecção de macrófagos in vitro - Macrófagos de camundongos BALB/c estimulados com 3% de tioglicolato (Vetec) foram cultivados em placas de 24 poços contendo lamínulas redondas de vidro a 34 °C com atmosfera contendo 5 % CO₂. As células não aderentes foram removidas com meio RPMI livre de soro e as culturas foram incubadas com formas promastigotas de Leishmania amazonensis em uma proporção de 10:1 . Após 1 hora, os parasitas não aderidos foram removidos através de duas lavagens com PBS (0,01 M tampão fosfato - 0,85% salina, pH 7,2) e as culturas foram incubadas com RPMI com 10 % de soro fetal bovino (Hyclone). Após 24 horas de interação, a cultura foi tratada com diferentes concentrações dos compostos testados, e incubados por mais 24 horas. Ao final do experimento, as células foram lavadas, fixadas e coradas com Giemsa (Merk) diluído 1 :6 em água bidestilada. A percentagem de morte de amastigota por macrófago foi determinado microscopicamente através da contagem de no mínimo 200 células em triplicatas.

[0047] Ensaio citotóxico - Macrófagos estimulados com tioglicolato obtidos como descrito acima foram tratados com os compostos nas concentrações indicadas por 24 horas a 37 °C com atmosfera contendo 5 % CO₂. Dois métodos foram usados para testar a citotoxicidade dos compostos: 2,3-Bis-(2-Methoxy-4-Nitro-5-Sulfophenyl)-2H-Tetrazolium-5-Carboxanilide (XTT, Sigma) e azul de Trypan (Sigma). Após os tratamentos, os macrófagos foram lavados e incubados com PBS contendo 0,5 mg/ml_ XTT ativado com 10 μΜ de PMS. Após 2-4 horas de incubação, os valores de densidade óptica foram determinados a 450 nm (Microplate Reader Mod. 3550-UV, Bio-Rad Laboratories). O Azul de Trypan a 0,03 % foi adicionado as culturas e o número de células viáveis foi estimado pela contagem de no mínimo 200 células em triplicatas.

[0048] Análise do ciclo celular - Promastigotas foram incubados em meio Schneider's suplementado com 10 % de SFB, contendo os compostos por 48 horas. As células foram fixadas em etanol (Grupo Química Industrial S.A.) gelado a 70 % e incubados a 4 °C por 30 min. As células foram lavadas duas vezes com PBS e o pellet ressuspenso em 1 ml_ de solução contendo 0,1 % (v/v) Triton X-100 (Sigma) em PBS, 2 mg RNAse A livre de DNase (Sigma) e 200 μΙ_ de 1 mg/ml iodeto de propídio (PI) (Sigma). Foram adquiridos 10000 eventos em cada amostra em FACScalibur (Becton e Dickson), utilizando o filtro FL-2 e analisados utilizando o software CelIQuest.

[0049] Ensaio de ligação a Anexina V: A marcação por anexina V- isotiocianato de fluoresceína (FITC) foi realizada com o kit de detecção de apoptose Anexina-V (Molecular Probes). Promastigotas foram tratados ou não com 32μΜ de Redresv001 , 33μΜ de Redresv005 e 18μΜ de Redresv006 por 48 h. Após esse período as células foram lavadas duas vezes no tampão de anexina V e centrifugadas durante 10 min. Os pellets foram ressuspensos em 20 uL de anexina V-FITC, e após 15 minutos de incubação, foram adicionados 480 uL de tampão de acordo com as instruções do fabricante. Foram adquiridos 10000 eventos em cada amostra em FACScalibur (Becton e Dickson), utilizando o filtro FL-1 e analisados utilizando o software CelIQuest.

[0050] Avaliação do potencial de membrana mitocondrial {N m): A avaliação do ΔΨΓΠ foi realizada com o kit mitochondria staining (Sigma-Aldrich). O corante JC-1 acumula-se na matriz mitocondrial sob a influência de ΔΨΓΠ e aumenta a sua forma monomérica em células não viáveis ou apoptóticas. Promastigotas (10⁶) foram tratados ou não com 100 μΜ de resveratrol, 0, 1 μΜ de AMB e com a associação de 13 μΜ de resveratrol e 0,01 μΜ de AMB por 4 h. Solução de JC-1 5 pg/mL (preparado de acordo com as instruções do fabricante) foi adicionada às células por 20 min a 37 °C. ΔΨΓΠ foi medido em fluorimetro (Spectramax Gemini XPS, Molecular Device) em placa escura de 96 poços utilizando comprimentos de onda de 490 nm para excitação e 530 nm para emissão.

[0051 ] Produção de óxido nítrico - Macrófagos estimulados com tioglicolato foram ativados ou não com 1 pg/mL de IFN-γ (Sigma) e tratados simultaneamente com os compostos. Após 48 horas, os sobrenadantes foram coletados e avaliados pela concentração de nitrito através da reação de Griess (Sigma). Os valores de densidade óptica foram determinados a 540 nm (Microplate Reader Mod. 3550-UV, Bio-Rad Laboratories), e a concentração de nitrito foi determinada usando como referência uma curva padrão de nitrito de sódio (Sigma).

[0052] Análise estatística - Os dados foram analisados pelo teste t de Student para comparação de dois grupos ou análise de variância (one-way ANOVA), para mais de dois grupos. As análises foram feitas utilizando o software GraphPad Prism 5.0. O valor de P foi considerado significante quando menor ou igual a 0,05.

[0053] Citotoxicidade dos derivados RedResveratrol (R) para macrófagos perítoneais murinos in vitro. Monocamadas de células foram incubadas com as concentrações indicadas dos derivados RedResveratrol ou do veículo (DMSO 1 %) por 24 horas a 37°C, 5% CO2. A viabilidade foi medida através do teste de exclusão do corante azul de Trypan (Figura 2) e do ensaio de 2,3-Bis-(2- Methoxy-4-Nitro-5-Sulfophenyl)-2H-Tetrazolium-5-Carboxanilide (XTT, Figura 3 Os resultados são representativos de três experimentos realizados em triplicatas e expressos como percentagem de células viáveis ± SEM.

[0054] Avaliação do ciclo cellular pela análise do conteúdo de DNA de promastigotas de L. amazonensis. Parasitas foram cultivados ou não com os compostos indicados na concentração determinada de IC₅₀ (32 μΜ, 33 μΜ e 18 μΜ respectivamente para RedResv 5 e 6) por 48h, corados com iodeto de propidium e analisados por citometria de fluxo. Miltefosina 30 μΜ foi utilizada como controle positivo. Resultados representam a media ± SEM de 3 experimentos independentes. ^**P<0.001 , ^***P<0.0001 .

[0055] Efeito de RedResveratrol no potencial de membrana mitocondrial. Promastigotas foram incubados na presença de RedResveratrol (RedResv), nas concentrações de seus IC50 (33 μΜ e 18 μΜ respectivamente para RedResv 5 e 6), do veículo (DMSO 1 %) por 4 horas. Miltefosina 30 μΜ foi usada como controle positivo e parasitas não tratados (CT) como controle negativo. O potencial de membrana mitocondrial (ΔΨΓΠ) foi avaliado através do kit de detecção de potenciais de membrana mitocondrial JC-1 . Os valores representam a média de dois experimentos independentes ± SEM. ^**P<0.001 , ^*** P <0.0001 .

[0056] Expressão de Anexina V. Promastigotas foram tratados com os respectivos IC₅₀ dos RedResveratrol (32 μΜ, 33 μΜ e 18 μΜ respectivamente para RedResv 5 e 6) ou 1 % DMSO (veiculo) por 48h. Resultados representam a media ± SEM de 3 experimentos independentes. ^**P<0.001 , ^*** P <0.0001 , compared to control. Miltefosine 30μΜ foi usada como controle positivo.

[0057] Os versados na arte valorizarão os conhecimentos aqui apresentados e poderão reproduzir a invenção nas modalidades apresentadas e em outras variantes, abrangidas no escopo das reivindicações anexas.

Claims

Reivindicações

1 . Composição farmacêutica, caracterizado por compreender:

- pelo menos um composto de fórmula:

em que R1 é OAc; R2 e R3 são selecionados independentemente entre OAc e OH; e

- pelo menos um veículo farmaceuticamente aceitável.

2. Uso de uma composição farmacêutica, conforme definido na reivindicação 1 caracterizado por ser na fabricação de um medicamento para o tratamento de doenças associadas a Leishmaniose.

3. Método de tratamento de Leishmaniose caracterizado por compreender a aplicação de uma composição farmacêutica conforme definida na reivindicação 1 em um indivíduo compreendendo Leishmaniose.

4. Método de tratamento de Leishmaniose caracterizado por compreender a aplicação de uma composição farmacêutica conforme definida na reivindicação 1 em um animal compreendendo Leishmaniose.

5. Processo de preparação de um composto conforme definido na reivindicação 1 , caracterizado por compreender as etapas de:

a) Condensação de um fenol adequado com um nitrito de sódio;

b) Acetilação das hidroxilas.