WO2017090699A1 - ピラジンカルボキサミド化合物を有効成分とするがん免疫治療用医薬組成物、及び／又は、免疫活性化用医薬組成物 - Google Patents

ピラジンカルボキサミド化合物を有効成分とするがん免疫治療用医薬組成物、及び／又は、免疫活性化用医薬組成物 Download PDF

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pharmaceutical composition
cancer
cells
compound
acceptable salt
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智史 小長井
卓 吉田
辻本　晋
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アステラス製薬株式会社
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/4965—Non-condensed pyrazines
    • A61K31/497—Non-condensed pyrazines containing further heterocyclic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology

Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for cancer immunotherapy and / or a pharmaceutical composition for immune activation comprising a pyrazinecarboxamide compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • Th cells helper T cells (Th cells), which are immune cells, are divided into Th1 type (Th1) and Th2 type (Th2) based on the types of cytokines they produce (J. Immunol.1986; 136: 2348-2357) .
  • Th1 cells secrete Th1 cytokines such as interferon-gamma (IFN- ⁇ ) and interleukin-2 (IL-2), and phagocytic cells, cytotoxic T-cell (CTL; Cytotoxic T Lymphocytes), and natural killer cells Increases cellular immunity to activate and eliminate foreign bodies in the body.
  • Th2 cells secrete Th2 cytokines such as IL-4, IL-5, IL-6, and IL-10 and activate B cells to enhance humoral immunity.
  • Th1 cytokines such as IFN- ⁇ suppress the immune activity of Th2 cells.
  • Th2 cytokines such as IL-4 also suppress the immune activity of Th1 cells. That is, Th1 and Th2 maintain an equilibrium relationship by checking each other's immune response function. This equilibrium relationship is called the Th1 / Th2 balance, and it is thought that each of these unique diseases occurs when this balance is tilted in either direction.
  • Th1 / Th2 balance This equilibrium relationship is called the Th1 / Th2 balance, and it is thought that each of these unique diseases occurs when this balance is tilted in either direction.
  • a decrease in Th1 cytokine and an increase in Th2 cytokine have been reported in gastric cancer, breast cancer and lung cancer. Therefore, activation of cellular immune function by Th1 cells is thought to be important in cancer treatment (Breast Cancer Res. Treat. 2013; 139: 477-488, Oncol. Rep. 2003; 10: 1507- 1512, Asian Pac. J. Cancer Prev. 2011; 12: 1803-18
  • Bruton's tyrosine kinase (BTK) and IL-2 inducible T cell kinase (ITK) are non-receptor type tyrosine kinases belonging to the Tec family kinases, pleckstrin homology (PH) domain, Tec homology (TH) domain, Sark homology 2 ( A protein having a SH2) domain, a Sark homology 3 (SH3) domain, and a kinase domain.
  • BTK is expressed in most hematopoietic cells except T cells and plasma cells, and is an essential molecule for B cell production (Exp. Hematol. Oncol. 2014; 3: 4, J. Hematol. Oncol. 2013; 6: 59).
  • BTK transmits B cell receptor signals to downstream phospholipase C gamma, and further mobilizes calcium ions, activates the mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway and nuclear factor ⁇ B (NF ⁇ B).
  • MAPK mitogen-activated protein kinase
  • NF ⁇ B nuclear factor ⁇ B
  • ITK is also expressed in mast cells and is responsible for the regulation of T cell receptor signaling (Curr. Top. Med. Chem. 2009; 9 (8): 690-703 Mol. Pharmacol. 2012; 82: 938-947).
  • ibrutinib administration decreased Th2 cytokines in the blood of patients with chronic lymphocytic leukemia (CLL) and increased Th1 cytokines. This is because ibrutinib is known to have BTK and ITK inhibitory action, and it is considered that ibrutinib selectively suppressed activation of human Th2 cells by this action mechanism (Blood 2013; 122: 2539-2549).
  • Compound A 5- ⁇ [(3R) -1-acryloylpyrrolidin-3-yl] oxy ⁇ -6-ethyl-3-( ⁇ 4- [4- (4-methylpiperazin-1-yl) piperidin-1-yl] phenyl ⁇ Amino) pyrazine-2-carboxamide (hereinafter sometimes referred to as “Compound A”) or a pharmaceutically acceptable salt thereof is useful as an active ingredient of a pharmaceutical composition for treating EGFR T790M mutation-positive cancer. It is known that there is (Patent Document 1). Specifically, in Patent Document 1, the free form is described in Example 54, and the monomethanesulfonate salt is described in Example 261. An anti-tumor effect is disclosed.
  • Compound A or a pharmaceutically acceptable salt thereof has an inhibitory action on BTK, ITK, and JAK3 (Janus Kinase3). And is useful as an active ingredient in a pharmaceutical composition for treating cancer involving one or more kinases of BTK, ITK, and JAK3.
  • a compound useful as an active ingredient of a pharmaceutical composition for example, a pharmaceutical composition for cancer immunotherapy and / or a pharmaceutical composition for immune activation.
  • compound A that is, 5- ⁇ [(3R) -1- Acryloylpyrrolidin-3-yl] oxy ⁇ -6-ethyl-3-( ⁇ 4- [4- (4-methylpiperazin-1-yl) piperidin-1-yl] phenyl ⁇ amino) pyrazin-2-carboxamide or its
  • a pharmaceutical composition containing a pharmaceutically acceptable salt as an active ingredient has BTK and / or ITK inhibitory activity, and suppresses Th2 cell activation without affecting Th1 cell activation.
  • the present invention was completed by discovering that the pharmaceutical composition is expected to be used as a pharmaceutical composition for cancer immunotherapy and / or a pharmaceutical composition for immune activation. That is, the present invention relates to a pharmaceutical composition for cancer immunotherapy and / or a pharmaceutical composition for immune activation containing Compound A or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • a pharmaceutical composition for cancer immunotherapy comprising Compound A or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition for cancer immunotherapy comprising Compound A or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient is a pharmaceutical composition for cancer immunotherapy for cancers other than EGFR T790M mutation-positive cancer
  • the pharmaceutical composition for cancer immunotherapy containing Compound A or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient is produced by an increase in Th2 cytokines other than EGFR T790M mutation-positive cancer. It is a pharmaceutical composition for cancer immunotherapy against cancer.
  • compositions for immune activation containing Compound A or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient are a pharmaceutical composition for immune activation against cancers other than EGFR T790M mutation-positive cancer.
  • Compound A or a pharmaceutically acceptable salt thereof is used.
  • the pharmaceutical composition for immune activation containing the salt as an active ingredient is a pharmaceutical composition for immune activation against cancer caused by an increase in Th2 cytokine other than EGFR T790M mutation-positive cancer.
  • One aspect is the use of Compound A or a pharmaceutically acceptable salt thereof for the production of a pharmaceutical composition for cancer immunotherapy against cancers other than EGFR T790M mutation-positive cancer.
  • Compound A or a pharmaceutically acceptable salt thereof for the production of a pharmaceutical composition for immune activation, and as an aspect, against cancers other than EGFR T790M mutation-positive cancer It is the use of Compound A or a pharmaceutically acceptable salt thereof for the production of a pharmaceutical composition for immune activation, and in one aspect, against cancer caused by an increase in Th2 cytokines other than EGFR T790M mutation-positive cancer Use of Compound A or a pharmaceutically acceptable salt thereof for the manufacture of a pharmaceutical composition for immune activation. (3) Use of Compound A or a pharmaceutically acceptable salt thereof for cancer immunotherapy.
  • the use of Compound A or a pharmaceutically acceptable salt thereof for cancer immunotherapy for cancers other than EGFR T790M mutation-positive cancer and in one embodiment, other than EGFR T790M mutation-positive cancer
  • Use of Compound A or a pharmaceutically acceptable salt thereof for cancer immunotherapy against cancer caused by elevated Th2 cytokines Use of Compound A or a pharmaceutically acceptable salt thereof for cancer immunotherapy against cancer caused by elevated Th2 cytokines.
  • Compound A or a pharmaceutically acceptable salt thereof for immune activation and as an aspect, for immunoactivation against cancers other than EGFR T790M mutation-positive cancer
  • Compound A or a pharmaceutically acceptable salt thereof and in one aspect, Compound A or a compound thereof for immune activation against cancer caused by an increase in Th2 cytokines other than EGFR T790M mutation-positive cancer
  • a pharmaceutically acceptable salt (4) Compound A or a pharmaceutically acceptable salt thereof for cancer immunotherapy.
  • Compound A or a pharmaceutically acceptable salt thereof for cancer immunotherapy for cancers other than EGFR T790M mutation-positive cancer and in one aspect, Th2 other than EGFR T790M mutation-positive cancer
  • Compound A or a pharmaceutically acceptable salt thereof for cancer immunotherapy against cancer caused by an increase in cytokines is the compound A for immune activation, or its pharmaceutically acceptable salt
  • a cancer immunotherapy method comprising administering an effective amount of compound A or a pharmaceutically acceptable salt thereof to a subject.
  • One embodiment is a cancer immunotherapy method for cancer other than EGFR T790M mutation-positive cancer, comprising administering an effective amount of compound A or a pharmaceutically acceptable salt thereof to a subject.
  • Is a cancer immunotherapy method for cancer caused by an increase in Th2 cytokines other than EGFR T790M mutation-positive cancer comprising administering an effective amount of Compound A or a pharmaceutically acceptable salt thereof to a subject.
  • a method for treating cancer through immune activation comprises administering to a subject an effective amount of Compound A or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • EGFR T790M A method of treating cancer through immune activation against cancers other than mutation-positive cancers, and in one aspect, comprises administering an effective amount of Compound A or a pharmaceutically acceptable salt thereof to a subject
  • This is a method for treating cancer through immune activation against cancer caused by an increase in Th2 cytokines other than EGFR T790M mutation-positive cancer.
  • the pharmaceutical composition according to (1) wherein the cancer caused by the increase in Th2 cytokine is gastric cancer, breast cancer, and / or lung cancer.
  • the pharmaceutical composition according to (1) which is used in combination with a monoclonal antibody that inhibits the binding between PD-1 and PD-L1.
  • An anti-human PD-1 antibody that binds to human PD-1, or an anti-human PD-L1 antibody that binds to human PD-L1, wherein the monoclonal antibody that inhibits the binding between PD-1 and PD-L1 The pharmaceutical composition according to (11), wherein (13) The pharmaceutical composition according to (12), wherein the anti-human PD-1 antibody is nivolumab, pembrolizumab or pidilizumab.
  • the pharmaceutical composition according to (13), wherein the anti-human PD-L1 antibody is NDPL3280A, averumab, or durvalumab.
  • any one of (1), (6), or (11) to (14) containing Compound A or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and a pharmaceutically acceptable excipient A pharmaceutical composition according to claim 1.
  • the present invention relates to a cancer immunotherapeutic agent containing Compound A or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient, and an EGFR T790M mutation containing Compound A or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • Cancer immunotherapeutic agents for cancers other than positive cancers, and cancers caused by elevation of Th2 cytokines other than EGFR T790M mutation-positive cancers containing Compound A or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient Includes immunotherapeutic agents.
  • the present invention is an immunostimulant containing compound A or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient, EGFR T790M mutation positive containing compound A or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient
  • Immune activation against cancers caused by elevated levels of Th2 cytokines other than EGFR T790M mutation-positive cancers that contain an immunoactivator against cancers other than cancer and compound A or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient Includes agents.
  • the “subject” is a human or other animal that needs the prevention or treatment, and in one embodiment, is a human that needs the prevention or treatment.
  • Compound A or a pharmaceutically acceptable salt thereof, which is an active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention has a BTK and / or ITK inhibitory effect, and does not affect the activation of Th1 cells. Therefore, it can be expected to be used as a therapeutic agent for various cancers due to the immune activation effect by suppressing the activation of Th2 cells.
  • composition for cancer treatment of the present invention has, as an embodiment, a cancer immunotherapeutic agent for various cancers characterized by being used in combination with a monoclonal antibody that inhibits the binding between PD-1 and PD-L1. It can be expected to be used as As a monoclonal antibody that inhibits the binding between PD-1 and PD-L1, as one embodiment, an anti-human PD-1 antibody that binds to human PD-1 or an anti-human PD- that binds to human PD-L1 is used. L1 antibody.
  • the anti-human PD-1 antibody is, for example, a humanized anti-human PD-1 antibody and a human-type anti-human PD-1 antibody, which can inhibit an immunosuppressive signal of human PD-1, so-called human PD-1
  • An antagonist antibody or a human PD-1 neutralizing antibody include nivolumab, which is a human IgG4 monoclonal antibody, pembrolizumab, which is a human IgG1 monoclonal antibody, and pidilizumab, which is a human IgG1 monoclonal antibody. They can be easily obtained by the production methods disclosed in International Publication No. 2006/121168, International Publication No. 2008/156712, International Publication No. 2003/99196, or their modifications.
  • the anti-human PD-L1 antibody is, for example, a so-called human PD that is a humanized anti-human PD-L1 antibody and a human-type anti-human PD-L1 antibody that can inhibit an immunosuppressive signal of human PD-L1.
  • -L1 antagonist antibody or human PD-L1 neutralizing antibody Specifically, MDPL3280A (RG7446) which is a modified human IgG1 monoclonal antibody, averumab (avelumab) which is a human IgG1 monoclonal antibody, and durvalumab (durvalumab) which is a human IgG1 monoclonal antibody. They can be easily obtained by the production methods disclosed in International Publication No. 2010/77634, International Publication No. 2013/079174, International Publication No. 2011/66389, or their modifications.
  • FIG. 1 is a view showing the results of gating from a mouse spleen-derived CD4 positive cell group cultured in the medium 1 described in Example 4.
  • A is a two-dimensional development view in which the horizontal axis represents forward scattering (Forward Scatter: FSC) and the vertical axis represents side scattering (Side Scatter: SSC), and shows gating information of living cells.
  • B is a two-dimensional development view in which the vertical axis represents the fluorescence intensity of the antibody against mouse CD4 and the horizontal axis represents FSC, and shows the gating result of the CD4 positive cell group for the cell group gated with A.
  • IFN- ⁇ producing cells and IL-4 producing cells when anti-mouse CD3e antibody is not stimulated anti-CD3e (-)
  • anti-CD3e (-) anti-CD3e
  • the vertical axis represents the fluorescence intensity of the antibody against mouse IFN- ⁇
  • the horizontal axis represents the fluorescence intensity of the antibody against mouse IL-4.
  • FIG. 2 shows the results of gating from a mouse spleen-derived CD4 positive cell group cultured in the medium 2 described in Example 4.
  • A is a two-dimensional developed view with forward scatter (ForwardForScatter: atterFSC) on the horizontal axis and side scatter (Side Scatter: SSC) on the vertical axis, and shows gating information of living cells.
  • B is a two-dimensional development view in which the vertical axis represents the fluorescence intensity of the antibody against mouse CD4 and the horizontal axis represents FSC, and shows the gating result of the CD4 positive cell group for the cell group gated with A.
  • IFN- ⁇ producing cells and IL-4 producing cells when anti-mouse CD3e antibody is not stimulated anti-CD3e (-)
  • anti-CD3e (-) anti-CD3e
  • the vertical axis represents the fluorescence intensity of the antibody against mouse IFN- ⁇
  • the horizontal axis represents the fluorescence intensity of the antibody against mouse IL-4.
  • FIG. 3 shows staining of Th1 cells (upper) and Th2 cells (lower) stimulated with anti-mouse CD3e antibody after treatment with DMSO or test compound A with anti-mouse IFN- ⁇ antibody and anti-mouse IL-4 antibody, respectively.
  • the vertical axis represents the fluorescence intensity of the anti-mouse IFN- ⁇ antibody
  • the horizontal axis represents the fluorescence intensity of the anti-mouse IL-4 antibody.
  • the left diagram of FIG. 4 shows the two-dimensional development diagram shown in the upper part of FIG. 3, the horizontal axis represents each concentration of test compound A (Compound A [log (M)]), the vertical axis represents IFN- ⁇ positive and IL-
  • the graph shows the ratio of 4 negative Th1 cells (IFN ⁇ +, IL-4- population (% control)), and the average ⁇ standard deviation of triplicate calculated. 4 shows the two-dimensional development chart shown in the lower part of FIG. 3.
  • the horizontal axis represents each concentration of test compound A (Compound A [log (M)]), the vertical axis represents IFN- ⁇ negative and IL. -4 positive cell ratio (IFN ⁇ , IL-4 + population (% control)), and the average ⁇ standard deviation of triplicate is calculated and graphed.
  • FIG. 5 shows the results of an antitumor activity test of test compound A in a model in which 4T1-OVA cells described in Example 5 were transplanted into mouse mammary fat. Statistical analysis was performed on the tumor volume of each group, and the results were expressed as mean ⁇ standard error.
  • the vertical axis represents the tumor volume (Tumor volume (mm 3 )), and the horizontal axis represents the number of administration days (Days).
  • FIG. 6 is a graph showing changes in body weight in the antitumor activity test of test compound A in a model in which 4T1-OVA cells described in Example 5 were transplanted into mouse mammary fat.
  • the body weight of each group is shown as an average value ⁇ standard error.
  • the vertical axis represents body weight (Body weight (g)), and the horizontal axis represents days of administration (Days).
  • compound A is 5- ⁇ [(3R) -1-acryloylpyrrolidin-3-yl] oxy ⁇ -6-ethyl-3-( ⁇ 4- [4- (4-methylpiperazine-1 -Yl) piperidin-1-yl] phenyl ⁇ amino) pyrazine-2-carboxamide, the chemical structure of which is shown below.
  • Compound A or a pharmaceutically acceptable salt thereof can be obtained according to the method described in Patent Document 1 (International Publication No. 2013/108754) or by a modification thereof.
  • “Pharmaceutically acceptable salt of Compound A” means an acid addition salt of Compound A, specifically, hydrochloric acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphorus Inorganic acids such as acids, formic acid, acetic acid, propionic acid, oxalic acid, malonic acid, succinic acid, fumaric acid, maleic acid, lactic acid, malic acid, mandelic acid, tartaric acid, dibenzoyltartaric acid, ditoluoyltartaric acid, citric acid, methanesulfone Examples thereof include acid addition salts with organic acids such as acid, ethanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, aspartic acid and glutamic acid.
  • Compound A or a pharmaceutically acceptable salt thereof Compound A which is a free form can be mentioned, and as another aspect, an acid addition salt of Compound A with methanesulfonic acid can be mentioned. Examples thereof include Compound A monomethanesulfonate.
  • the active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention may be a solvate of Compound A, specifically, for example, a hydrate or ethanol solvate, and further a solvent of an acid addition salt of Compound A Japanese products may be used.
  • Cancer immunotherapy means a cancer therapy utilizing immune function, and as one aspect, the ability to activate immune cells and suppress the growth of cancer cells, or the reduction or disappearance of cancer cells It means that anticancer treatment is performed by enhancing the ability (hereinafter referred to as antitumor activity).
  • Immune activation means immune activation by enhancing the function of immune cells themselves, or immune activation by releasing a state in which the immune response of immune cells is suppressed.
  • the immune activation by canceling the state in which the immune response of the immune cell is suppressed includes, for example, the suppression of Th2 cell activation, thereby reducing the Th1 cell immune activity by Th2 cytokine (for example, IL-4). It is possible to release the suppressed state.
  • Th2 cell activation is to increase the production of Th2 cytokines (eg, IL-4), suppress the production of Th1 cytokines (eg, IFN- ⁇ ), and shift the ratio of Th1 and Th2 to Th2 dominance Means.
  • Th2 cytokines eg, IL-4
  • Th1 cytokines eg, IFN- ⁇
  • the increase in Th2 cytokine refers to a state in which the production of Th1 cytokine is suppressed by the increased production of Th2 cytokine.
  • the cancer caused by the increase in Th2 cytokine is not particularly limited as long as it is caused by this, and examples thereof include stomach cancer, breast cancer, and lung cancer.
  • An embodiment of the present invention contains Compound A or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient, which is used in combination with a monoclonal antibody that inhibits the binding between PD-1 and PD-L1.
  • a pharmaceutical composition for cancer immunotherapy and / or a pharmaceutical composition for immune activation which is a combined effect on cancer in which the monoclonal antibody that inhibits the binding between PD-1 and PD-L1 is effective It is expected to play.
  • cancers that are effective for the monoclonal antibody that inhibits the binding between PD-1 and PD-L1 include solid cancers.
  • solid cancers include malignant melanoma (eg, metastatic malignant melanoma), renal cancer (eg, renal cell carcinoma, transparent cell carcinoma), prostate cancer (eg, hormone refractory prostate adenocarcinoma), Breast cancer, lung cancer (eg, non-small cell lung cancer), pancreatic cancer, colon cancer, hepatocellular carcinoma, biliary tract cancer, stomach cancer, ovarian cancer, esophageal cancer, urothelial cancer, colon cancer, bone cancer, skin cancer, head and neck cancer, Skin or orbital malignant melanoma, uterine cancer, rectal cancer, anal cancer, testicular cancer, fallopian tube carcinoma, endometrial carcinoma, cervical carcinoma, vaginal carcinoma, vulvar carcinoma, small intestine cancer, endocrine cancer, thyroid cancer , Parathyroid cancer, adrenal cancer, soft tissue sarcoma, urethral cancer, penile cancer, childhood solid cancer, bladder cancer, renal or ureteral cancer, renal pelvic carcinoma,
  • malignant melanoma for example, metastatic malignant melanoma
  • renal cancer for example, renal cell carcinoma, transparent cell carcinoma
  • prostate cancer for example, hormone refractory prostate adenocarcinoma
  • breast cancer lung cancer (eg, non-small cell lung cancer), pancreatic cancer, colon cancer, hepatocellular carcinoma, biliary tract cancer, gastric cancer, ovarian cancer, esophageal cancer, urothelial cancer, and more promising are malignant melanoma (eg Metastatic malignant melanoma), renal cancer (eg, renal cell carcinoma, clear cell carcinoma), prostate cancer, lung cancer (eg, non-small cell lung cancer), colon cancer, hepatocellular carcinoma, biliary tract cancer.
  • malignant melanoma eg Metastatic malignant melanoma
  • renal cancer eg, renal cell carcinoma, clear cell carcinoma
  • prostate cancer eg, non-small cell lung cancer
  • colon cancer hepatocellular carcinoma, biliary tract
  • Such blood cancers include follicular lymphoma, chronic lymphocytic leukemia, small lymphocytic lymphoma, multiple myeloma, mantle cell lymphoma, diffuse large B cell lymphoma, B cell prolymphocytic Leukemia, acute lymphocytic leukemia, histiocytic lymphoma, acute myeloid leukemia, acute megakaryoblastic leukemia, anaplastic large cell lymphoma, acute T cell lymphoma, lymphoblastic leukemia, chronic myelogenous leukemia.
  • the pharmaceutical composition containing Compound A or a pharmaceutically acceptable salt thereof may further contain an excipient as an optional additive, and an excipient commonly used in the art, for example, It can be prepared by a commonly used method using a pharmaceutical excipient or a pharmaceutical carrier. Administration is oral by tablet, pill, capsule, granule, powder, liquid, etc. Any form of parenteral administration using a patch, a transmucosal liquid, a transmucosal patch, an inhalant or the like may be used.
  • a solid composition for oral administration tablets, powders, granules and the like are used.
  • one or more active ingredients are mixed with at least one inert excipient.
  • the composition may contain an inert additive such as a lubricant, a disintegrant, a stabilizer and a solubilizing agent according to a conventional method. If necessary, tablets or pills may be coated with a sugar coating or a film of a gastric or enteric substance.
  • Liquid compositions for oral administration include pharmaceutically acceptable emulsions, solutions, suspensions, syrups or elixirs and the like, and commonly used inert diluents such as purified water. Or it contains ethanol.
  • the liquid composition may contain solubilizers, wetting agents, auxiliaries such as suspending agents, sweeteners, flavors, fragrances and preservatives in addition to the inert diluent.
  • the injection for parenteral administration contains a sterile aqueous or non-aqueous solution, suspension or emulsion.
  • aqueous solvent include distilled water for injection or physiological saline.
  • Non-aqueous solvents include alcohols such as ethanol.
  • Such compositions may further contain isotonic agents, preservatives, wetting agents, emulsifiers, dispersants, stabilizers, or solubilizing agents. These are sterilized by, for example, filtration through a bacteria-retaining filter, blending with a bactericide or irradiation. These can also be used by producing a sterile solid composition and dissolving or suspending it in sterile water or a sterile solvent for injection before use.
  • the appropriate daily dose is about 0.001 to 100 mg / kg, preferably 0.01 to 30 mg / kg, more preferably 0.1 to 10 mg / kg per body weight. Or in 2 to 4 divided doses.
  • the appropriate daily dose is about 0.0001 to 10 mg / kg per body weight, and is administered once to several times a day.
  • a transmucosal agent about 0.001 to 100 mg / kg per body weight is administered once to several times a day. The dose is appropriately determined according to individual cases in consideration of symptoms, age, sex, and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is 0.01 to 99% by weight, and in one embodiment 0.01 to 50% by weight of Compound A or its pharmaceutical preparation. Containing an acceptable salt as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be used in combination with various therapeutic agents.
  • the combination may be administered simultaneously, separately separately, or at desired time intervals.
  • simultaneous administration it may be a combination drug or separately formulated.
  • Drugs that can be used in combination include platinum preparations such as cisplatin and carboplatin, antimetabolites such as gemcitabine, pemetrexed, 5-fluorouracil, capecitabine, bendamustine, microtubule polymerization inhibitors such as paclitaxel and vinorelbine, and angiogenesis such as bevacizumab Inhibitors, topoisomerase inhibitors such as irinotecan and etoposide, cytokine preparations such as interferon, kinase inhibitors such as sunitinib, pazopanib, sorafenib and axitinib, antiandrogens such as enzalutamide, temozolomide, dacarbazine, cycl
  • BTK kinase inhibitory activity was evaluated using a QSS Assist TM Mobility Shift Assay kit (Karna Bioscience).
  • Compound A Monomethanesulfonate (hereinafter referred to as test compound A) was dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) to prepare a solution having a concentration 100 times the test concentration.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the solution was further diluted 25-fold with the attached assay buffer to give a 4-fold concentration test compound A solution.
  • BTK kinase attached to the kit was used for the reaction.
  • BTK kinase activity was calculated by quantifying the conversion rate of the product obtained from the peak height of the substrate peptide and the peak height of the product (phosphorylated substrate peptide) using LabChip EZ Reader II (PerkinElmer).
  • the average conversion rate of control wells containing all reaction components was inhibited by 0%
  • the average conversion rate of background wells containing all reaction components other than BTK kinase was 100% inhibition
  • each concentration of test compound A was calculated from the average conversion rate of the wells to which was added.
  • the 50% inhibitory concentration (IC 50 ) value was obtained from nonlinear regression based on a plot of test compound A concentration and inhibition rate. As a result, test compound A inhibited BTK kinase activity, and its IC 50 value was 0.17 nM.
  • Example 2 Evaluation of ITK Kinase Inhibitory Activity ITK kinase inhibitory activity was evaluated using a Mobility Shift Assay system.
  • Test compound A was dissolved in DMSO to prepare a solution having a concentration 100 times the test concentration.
  • the solution was further diluted 25-fold with assay buffer (20 mM HEPES, 0.01% Triton X-100, 1 mM DTT, pH 7.5) to obtain a 4-fold concentration test compound A solution.
  • 5 ⁇ L of 4 ⁇ concentration test compound A solution prepared in the above assay buffer and 10 ⁇ L of 2 ⁇ concentration ITK kinase solution were mixed in the wells of a 384 well plate and left at room temperature for 30 minutes.
  • a 4-fold substrate peptide (Srctide, Peptide Institute # AD-995) / ATP / MgCl 2 solution was added and reacted at room temperature for 1 hour.
  • the substrate peptide was used at a final concentration of 1000 nM, ATP at a final concentration of 1000 ⁇ M, and MgCl 2 at a final concentration of 5 mM.
  • 60 ⁇ L of termination buffer (127 mM HEPES, 0.01% Triton X-100, 26.7 mM EDTA, 1% DMSO, pH 7.5) was added to stop the reaction.
  • the ITK kinase activity was calculated by quantifying the conversion rate of the product obtained from the peak height of the substrate peptide and the peak height of the product (phosphorylated substrate peptide) with LabChip3000 (PerkinElmer). In the data analysis, the average conversion rate of control wells containing all reaction components was inhibited by 0%, the average conversion rate of background wells containing all reaction components other than ITK kinase was 100% inhibition, and each concentration of test compound A The inhibition rate was calculated from the average conversion rate of the wells to which was added. As a result, test compound A inhibited ITK kinase activity, and the inhibition rates at 1 nM and 10 nM were 29.5% and 92.6%, respectively.
  • Example 3 Intracellular inhibitory activity against human and mouse ITK Human or mouse ITK was transiently expressed in HEK293 cells and seeded in a 96-well plate. Test compound A was treated at a maximum common concentration of 10 ⁇ M with a triple ratio of 8 concentrations and DMSO final concentration of 0.5% at 37 ° C. for 2 hours. Cells were then lysed and phosphorylated ITK levels were measured by sandwich ELISA. The% inhibition rate was calculated by the following formula based on the absorbance value at 450 nm of each sample, and the IC 50 value was calculated using GraphPad Prism software (GraphPad Software).
  • positive control is the absorbance value of DMSO-treated samples expressing human or mouse ITK
  • negative control is the absorbance value of DMSO-treated samples of human or mouse ITK kinase-dead expressing cells
  • sample is the test It means the absorbance value of each compound-treated sample.
  • test compound A inhibits human and mouse ITK kinase activities in cells, and the IC 50 values thereof were 73 nM and 89 nM, respectively. From this result, it became clear that the test compound A has equivalent inhibitory activity against human and mouse ITK.
  • Example 4 Action on Th1 cells and Th2 cells 1) Induction of CD4 positive cells and differentiation of Th1 and Th2 cells From the spleen of an 11-week-old male C57BL / 6J mouse (Charles River Japan), CD4 (L3T4) MicroBeads mouse CD4 positive cells were isolated using (Miltenyi Biotec: 130-049-201), and 3 ⁇ g / mL anti-mouse CD3e antibody (eBioscience: 16-0031-85) / phosphate-buffered saline (PBS, WAKO: 045-29795) And suspended in the following medium 1 or 2 in a 24-well plate coated at room temperature for 1 hour.
  • Mouse IL-2 (6.25 ng / mL (R & D Systems: 402-ML-020)), mouse IL-12 (10 ng / mL (PEPROTECH: 210-12)) and anti-mouse IL- Medium supplemented with 4 antibodies (10 ⁇ g / mL (eBioscience: 14-7041-85)).
  • Mouse IL-2 (6.25 ng / mL), mouse IL-4 (100 ng / mL (R & D Systems: 404-ML-010)), and anti-mouse IFN- ⁇ antibody (10 ⁇ g / mL) in T-cell medium (eBioscience: 14-7312-85)) added medium
  • anti-mouse IL-4 antibody and anti-mouse IFN- ⁇ antibody were added only at the time of seeding.
  • the cells were cultured in a medium excluding anti-mouse IL-4 antibody and anti-mouse IFN- ⁇ antibody.
  • T-cell medium 10% Fetal Bovine Serum (FBS, SIGMA: 172012-500ML), penicillin streptomycin (Gibco: 15070-063, stock solution added to 1/100), monothioglycerol (WAKO: 195 -15791, stock solution added to 1/100), non-essential amino acids (SIGMA: M7145, stock solution added to 1/100), pyruvic acid (SIGMA: S8636, stock solution to 1/200) And RPMI1640 medium (SIGMA: R8758) containing GlutaMAX (GIBCO: 35050-061, stock solution added to 1/100).
  • FBS Fetal Bovine Serum
  • SIGMA penicillin streptomycin
  • Gibco 15070-063
  • monothioglycerol WAKO: 195 -15791, stock solution added to 1/100
  • non-essential amino acids SIGMA: M7145, stock solution added to 1/100
  • pyruvic acid SIGMA: S8636,
  • CD4 positive cells are cultured in medium 1 and medium 2 for 6 days, respectively, and induced to differentiate into Th1 cells and Th2 cells.
  • the cells were suspended at 4 ⁇ 10 5 cells / 90 ⁇ L / well and seeded in a 96-well round bottom plate (Greiner: 650185). Each was treated with DMSO or test compound A (10, 30, 100, 300, or 1000 nM) at 37 ° C. for 30 minutes (prepared so that the final DMSO concentration was 0.1%).
  • DMSO-treated cells were also seeded in a 96-well round-bottom plate that was not coated with anti-mouse CD3e antibody / PBS, and used as a sample without anti-mouse CD3e antibody stimulation.
  • a protein transport inhibitor (BD GolgiStop (trade name)) (1 reagent in the kit of BD Biosciences: Catalog No.
  • Live cells were gated based on the distribution of FSC and SSC (Fig. 1A, Fig. 2A). Furthermore, CD4 positive cells were gated (FIGS. 1B and 2B) and used for analysis.
  • the ratio of IFN- ⁇ producing cells as an indicator of Th1 cell activation, the ratio of IFN- ⁇ positive and IL-4 negative cells when anti-mouse CD3e antibody stimulation is not performed (anti-CD3e (-)) 0% and the ratio of IFN- ⁇ positive and IL-4 negative cells when stimulated with anti-mouse CD3e antibody (anti-CD3e (+)) as 100%, after each concentration of test compound A The percentage (%) of IFN- ⁇ positive and IL-4 negative cells was evaluated.
  • the percentages of IFN- ⁇ negative and IL-4 positive cells were 87.8%, 76.8%, 69.3%, 55.8%, and 43.6%, respectively (right side of FIG. 4).
  • the average value of the ratio of IFN- ⁇ positive and IL-4 negative cells after treatment with a test compound A DMSO solution (10, 30, 100, 300, or 1000 nM) is only DMSO as a control.
  • the proportions of IFN- ⁇ negative and IL-4 positive cells when treated were 99.1%, 97.6%, 97.9%, 95.1%, and 89.3%, respectively (left side of FIG. 4). From the above, it was clarified from this study that test compound A selectively inhibits Th2 cell activation without affecting Th1 cell activation.
  • Example 5 Antitumor activity test in a model in which 4T1-OVA cells were transplanted into mouse mammary fat 1)
  • 4T1-OVA cells which are mouse breast cancer cells, were purchased from ATCC (CRL-2539) and 10% bovine. Cultured in serum (CCB) and penicillin / streptomycin (Invitrogen) -containing RPMI-1640 medium (Gibco) at 37 ° C. with 5% CO 2 .
  • PcDNA TM 3.1 / Zeo with ovalbumin (OVA, accession number NM_205152.2) (GPI-OVA; SEQ ID NO: 1) with glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchor sequence added to EcoRI and Xho1 restriction enzyme sites +)
  • a vector (Invitrogen) was prepared. The vector was transfected into 4T1 cells using Lipofectamine (registered trademark) 2000 (Invitrogen) according to the protocol of the product instructions. Thereafter, the cells were cultured in the presence of Zeocin (Invitrogen) 800 ⁇ g / mL, and 4T1-OVA cells were established over about 2 months.
  • Anti-tumor test 4T1-OVA cells were transplanted into 6-week-old female BALB / c mice (Charles River Japan) mammary fat suspended in 20 ⁇ L of PBS with 1.5 ⁇ 10 4 cells per mouse. did. When tumor cells were engrafted and the average tumor volume reached about 50 mm 3 , the tumor volume was used as an index for grouping (10 mice in each group).
  • Test compound A was dissolved in 0.5% methylcellulose (Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.) and orally administered at a dose of 50 mg / kg or 100 mg / kg once a day for 14 days (as shown in FIGS. 5 and 6). Compound A 50mg / kg, Compound A 100mg / kg).
  • test compound A transplanted 4T1-OVA cells in which GPI-OVA (SEQ ID NO: 2) was expressed in 4T1 cells, which are mouse breast cancer cells, into BALB / c mouse mammary fat with normal immune function It was confirmed that the same kind model exhibited an antitumor effect.
  • Compound A or a pharmaceutically acceptable salt thereof which is an active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention, has BTK and / or ITK inhibitory action, and does not affect the activation of Th1 cells. Therefore, a pharmaceutical composition containing Compound A or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient is expected to be used as a cancer immunotherapeutic agent and / or an immune activator. it can.
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing is the base sequence of OVA (referred to as GPI-OVA) to which a GPI anchor sequence is added
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is the sequence It is the amino acid sequence of GPI-OVA encoded by the base sequence of No. 1.

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Abstract

【課題】医薬組成物、例えば、がん免疫治療用医薬組成物、及び／又は、免疫活性化用医薬組成物の有効成分として有用な化合物を提供する。 【解決手段】本発明者らは、がん免疫治療用医薬組成物、及び／又は、免疫活性化用医薬組成物の創製を目的に鋭意検討した結果、5-{[(3R)-1-アクリロイルピロリジン-3-イル]オキシ}-6-エチル-3-({4-[4-(4-メチルピペラジン-1-イル)ピペリジン-1-イル]フェニル}アミノ)ピラジン-2-カルボキサミド又はその製薬学的に許容される塩に優れたBTK及び／又はITK阻害作用を有し、Th1細胞の活性化を抑制することなく、Th2細胞の活性化を抑制することから、該化合物又はその製薬学的に許容される塩を有効成分として含有する医薬組成物が、がん免疫治療用医薬組成物、及び／又は、免疫活性化用医薬組成物としての使用が期待されることを知見して本発明を完成した。

Description

ピラジンカルボキサミド化合物を有効成分とするがん免疫治療用医薬組成物、及び／又は、免疫活性化用医薬組成物
　本発明は、ピラジンカルボキサミド化合物又はその製薬学的に許容される塩を有効成分とする、がん免疫治療用医薬組成物、及び／又は、免疫活性化用医薬組成物に関する。
　免疫細胞であるヘルパーT細胞（Th細胞）は、その産生するサイトカインの種類の違いから、Th1型（Th1）とTh2型（Th2）に分けられる（J. Immunol.1986;136:2348-2357）。Th1細胞はインターフェロンガンマ(IFN-γ)や インターロイキン-2（IL-2）等のTh1サイトカインを分泌して、食細胞、細胞傷害性T細胞 (CTL;Cytotoxic T Lymphocytes)、及びナチュラルキラー細胞を活性化し、体内の異物を排除する細胞性免疫を増強する。一方、Th2細胞はIL-4、IL-5、IL-6、及びIL-10等のTh2サイトカインを分泌してB細胞を活性化して液性免疫を増強する。Th1サイトカイン、例えば、IFN-γはTh2細胞の免疫活性を抑制する。また、Th2サイトカイン、例えば、IL-4はTh1細胞の免疫活性を抑制する。つまり、Th1及びTh2はそれぞれ互いの免疫応答機能を牽制しあうことで平衡関係を保っている。この平衡関係はTh1/Th2バランスと称され、このバランスがどちらかに傾くことによりそれぞれに特有の疾患が生じると考えられている。例えば、癌では胃癌、乳癌、肺癌においてTh1サイトカインの低下及びTh2サイトカインの上昇が報告されている。そのため、癌治療においてはTh1細胞による細胞性免疫機能の活性化が重要であると考えられている（Breast Cancer Res. Treat. 2013;139:477-488、Oncol. Rep. 2003;10:1507-1512、Asian Pac. J. Cancer Prev. 2011;12:1803-1806、Oncol. Lett. 2014;8:1682-1686）。
　Bruton's tyrosine kinase(BTK）及びIL-2 inducible T cell kinase(ITK）はTecファミリーキナーゼに属する非受容体型チロシンキナーゼであり、プレクストリン相同(PH)ドメイン、Tec相同(TH)ドメイン、サーク相同2(SH2)ドメイン、サーク相同3(SH3)ドメイン、およびキナーゼドメインを有するタンパク質である。BTKはT細胞と形質細胞を除く大部分の造血細胞に発現し、B細胞産生に必須な分子である(Exp. Hematol. Oncol. 2014;3:4、J. Hematol. Oncol. 2013;6:59)。B細胞においてBTKはB細胞受容体シグナルを下流のホスフォリパーゼCガンマに伝達し、さらにカルシウムイオン動員、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ(MAPK)経路や核内因子κB(NFκB)の活性化を引き起こす(Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 2010;107:13075-13080)。また、ITKは主にT細胞に発現するほか、マスト細胞に発現し、T細胞受容体シグナル伝達の調節を担っている（Curr. Top. Med. Chem. 2009;9(8):690-703、Mol. Pharmacol. 2012;82:938-947）。
　最近になって、イブルチニブ投与により慢性リンパ球性白血病 (CLL)患者の血液中のTh2サイトカインが減少し、Th1サイトカインが上昇することが報告された。これは、イブルチニブが、BTK及びITK阻害作用を有することが知られており、当該作用機序によりイブルチニブがヒトTh2細胞の活性化を選択的に抑制したためと考えられている（Blood 2013;122:2539-2549）。
　5-{[(3R)-1-アクリロイルピロリジン-3-イル]オキシ}-6-エチル-3-({4-[4-(4-メチルピペラジン-1-イル)ピペリジン-1-イル]フェニル}アミノ)ピラジン-2-カルボキサミド（以下、「化合物A」と言うことがある。）又はその製薬学的に許容される塩は、EGFR T790M変異陽性癌治療用医薬組成物の有効成分として有用であることが知られている（特許文献１）。
　具体的には、特許文献１において、実施例５４にそのフリー体が、実施例２６１にそのモノメタンスルホン酸塩が記載されており、EGFR変異キナーゼ阻害作用、及びEGFR変異発現細胞担癌マウスに対する抗腫瘍作用が開示されている。
　また、本出願が優先権を主張する基礎出願の出願後に公開された特許文献２において、化合物A又はその製薬学的に許容される塩は、BTK、ITK, 及びJAK3 (Janus Kinase3)に阻害作用を有し、BTK、ITK, 及びJAK3のうち1種又は複数のキナーゼが関与するがんの治療用医薬組成物の有効成分として有用であることが開示されている。
国際公開第2013/108754号 国際公開第2015/182628号
　医薬組成物、例えば、がん免疫治療用医薬組成物、及び／又は、免疫活性化用医薬組成物の有効成分として有用な化合物を提供する。
　本発明者らは、がん免疫治療用医薬組成物、及び／又は、免疫活性化用医薬組成物の創製を目的に鋭意検討した結果、化合物A、即ち5-{[(3R)-1-アクリロイルピロリジン-3-イル]オキシ}-6-エチル-3-({4-[4-(4-メチルピペラジン-1-イル)ピペリジン-1-イル]フェニル}アミノ)ピラジン-2-カルボキサミド又はその製薬学的に許容される塩を有効成分とする医薬組成物が、BTK及び／又はITK阻害作用を有し、Th1細胞の活性化に影響を与えることなく、Th2細胞の活性化を抑制することを見出し、当該医薬組成物が、がん免疫治療用医薬組成物、及び／又は、免疫活性化用医薬組成物としての使用が期待されることを知見して本発明を完成した。
　すなわち、本発明は、化合物A又はその製薬学的に許容される塩を有効成分として含有するがん免疫治療用医薬組成物、及び／又は、免疫活性化用医薬組成物に関する。
　本発明のある態様を以下に示す。
（１）化合物A又はその製薬学的に許容される塩を有効成分として含有するがん免疫治療用医薬組成物。ある態様としては、化合物A又はその製薬学的に許容される塩を有効成分として含有するがん免疫治療用医薬組成物が、EGFR T790M変異陽性癌以外のがんに対するがん免疫治療用医薬組成物であり、ある態様としては、化合物A又はその製薬学的に許容される塩を有効成分として含有するがん免疫治療用医薬組成物が、EGFR T790M変異陽性癌以外のTh2サイトカインの上昇により生じるがんに対するがん免疫治療用医薬組成物である。またある態様としては、化合物A又はその製薬学的に許容される塩を有効成分として含有する免疫活性化用医薬組成物であり、ある態様としては、化合物A又はその製薬学的に許容される塩を有効成分として含有する免疫活性化用医薬組成物が、EGFR T790M変異陽性癌以外のがんに対する免疫活性化用医薬組成物であり、ある態様としては、化合物A又はその製薬学的に許容される塩を有効成分として含有する免疫活性化用医薬組成物が、EGFR T790M変異陽性癌以外のTh2サイトカインの上昇により生じるがんに対する免疫活性化用医薬組成物である。
（２）がん免疫治療用医薬組成物の製造のための化合物A又はその製薬学的に許容される塩の使用。ある態様としては、EGFR T790M変異陽性癌以外のがんに対するがん免疫治療用医薬組成物の製造のための化合物A又はその製薬学的に許容される塩の使用であり、ある態様としては、EGFR T790M変異陽性癌以外のTh2サイトカインの上昇により生じるがんに対するがん免疫治療用医薬組成物の製造のための化合物A又はその製薬学的に許容される塩の使用である。またある態様としては、免疫活性化用医薬組成物の製造のための化合物A又はその製薬学的に許容される塩の使用であり、ある態様としては、EGFR T790M変異陽性癌以外のがんに対する免疫活性化用医薬組成物の製造のための化合物A又はその製薬学的に許容される塩の使用であり、ある態様としては、EGFR T790M変異陽性癌以外のTh2サイトカインの上昇により生じるがんに対する免疫活性化用医薬組成物の製造のための化合物A又はその製薬学的に許容される塩の使用である。
（３）がん免疫治療のための化合物A又はその製薬学的に許容される塩の使用。ある態様としては、EGFR T790M変異陽性癌以外のがんに対するがん免疫治療のための化合物A又はその製薬学的に許容される塩の使用であり、ある態様としては、EGFR T790M変異陽性癌以外のTh2サイトカインの上昇により生じるがんに対するがん免疫治療のための化合物A又はその製薬学的に許容される塩の使用である。またある態様としては、免疫活性化のための化合物A又はその製薬学的に許容される塩の使用であり、またある態様としては、EGFR T790M変異陽性癌以外のがんに対する免疫活性化のための化合物A又はその製薬学的に許容される塩の使用であり、またある態様としては、EGFR T790M変異陽性癌以外のTh2サイトカインの上昇により生じるがんに対する免疫活性化のための化合物A又はその製薬学的に許容される塩の使用である。
（４）がん免疫治療のための化合物A又はその製薬学的に許容される塩。ある態様としては、EGFR T790M変異陽性癌以外のがんに対するがん免疫治療のための化合物A又はその製薬学的に許容される塩であり、ある態様としては、EGFR T790M変異陽性癌以外のTh2サイトカインの上昇により生じるがんに対するがん免疫治療のための化合物A又はその製薬学的に許容される塩である。またある態様としては、免疫活性化のための化合物A又はその製薬学的に許容される塩であり、ある態様としては、EGFR T790M変異陽性癌以外のがんに対する免疫活性化のための化合物A又はその製薬学的に許容される塩であり、ある態様としては、EGFR T790M変異陽性癌以外のTh2サイトカインの上昇により生じるがんに対する免疫活性化のための化合物A又はその製薬学的に許容される塩である。
（５）化合物A又はその製薬学的に許容される塩の有効量を対象に投与することからなるがん免疫治療方法。ある態様としては、化合物A又はその製薬学的に許容される塩の有効量を対象に投与することからなる、EGFR T790M変異陽性癌以外のがんに対するがん免疫治療方法であり、ある態様としては、化合物A又はその製薬学的に許容される塩の有効量を対象に投与することからなる、EGFR T790M変異陽性癌以外のTh2サイトカインの上昇により生じるがんに対するがん免疫治療方法である。またある態様としては、化合物A又はその製薬学的に許容される塩の有効量を対象に投与することからなる免疫活性化を介したがんの治療方法であり、ある態様としては、EGFR T790M変異陽性癌以外のがんに対する免疫活性化を介したがんの治療方法であり、ある態様としては、化合物A又はその製薬学的に許容される塩の有効量を対象に投与することからなる、EGFR T790M変異陽性癌以外のTh2サイトカインの上昇により生じるがんに対する免疫活性化を介したがんの治療方法である。
（６）Th2サイトカインの上昇により生じるがんが、胃癌、乳癌、及び／又は肺癌である（１）に記載の医薬組成物。
（７）Th2サイトカインの上昇により生じるがんが、胃癌、乳癌、及び／又は肺癌である（２）に記載の使用。
（８）Th2サイトカインの上昇により生じるがんが、胃癌、乳癌、及び／又は肺癌である（３）に記載の使用。
（９）Th2サイトカインの上昇により生じるがんが、胃癌、乳癌、及び／又は肺癌である（４）に記載の化合物A又はその製薬学的に許容される塩。
（１０）Th2サイトカインの上昇により生じるがんが、胃癌、乳癌、及び／又は肺癌である（５）に記載の治療方法。
（１１）　PD-1とPD-L1との結合を阻害するモノクローナル抗体と併用することを特徴とする、（１）に記載の医薬組成物。
（１２）前記PD-1とPD-L1との結合を阻害するモノクローナル抗体が、ヒトPD-1に結合する抗ヒトPD-1抗体、又は、ヒトPD-L1に結合する抗ヒトPD-L1抗体である、（１１）に記載の医薬組成物。
（１３）前記抗ヒトPD-1抗体が、ニボルマブ、ペンブロリツマブ、又は、ピディリズマブである、（１２）に記載の医薬組成物。
（１４）前記抗ヒトPD-L1抗体が、NDPL3280A、アヴェルマブ、又は、デュルバルマブである、（１３）に記載の医薬組成物。
（１５）化合物A又はその製薬学的に許容される塩、及び製薬学的に許容される賦形剤を含有する、（１）、（６）、又は、（１１）～（１４）のいずれかに記載の医薬組成物。
（１６）化合物A又はその製薬学的に許容される塩が化合物A モノメタンスルホン酸塩である（１）、（６）、又は、（１１）～（１５）のいずれかに記載の医薬組成物。
（１７）化合物A又はその製薬学的に許容される塩が化合物A モノメタンスルホン酸塩である（２）又は（７）に記載の使用。
（１８）化合物A又はその製薬学的に許容される塩が化合物A モノメタンスルホン酸塩である（３）又は（８）に記載の使用。
（１９）化合物A又はその製薬学的に許容される塩が化合物A モノメタンスルホン酸塩である（４）又は（９）に記載の化合物A又はその製薬学的に許容される塩。
（２０）化合物A又はその製薬学的に許容される塩が化合物A モノメタンスルホン酸塩である（５）又は（１０）に記載の治療方法。
　なお、本発明は化合物A又はその製薬学的に許容される塩を有効成分として含有するがん免疫治療剤、化合物A又はその製薬学的に許容される塩を有効成分として含有するEGFR T790M変異陽性癌以外のがんに対するがん免疫治療剤、及び、化合物A又はその製薬学的に許容される塩を有効成分として含有するEGFR T790M変異陽性癌以外のTh2サイトカインの上昇により生じるがんに対するがん免疫治療剤を包含する。また、本発明は化合物A又はその製薬学的に許容される塩を有効成分として含有する免疫活性化剤、化合物A又はその製薬学的に許容される塩を有効成分として含有するEGFR T790M変異陽性癌以外のがんに対する免疫活性化剤、及び、化合物A又はその製薬学的に許容される塩を有効成分として含有するEGFR T790M変異陽性癌以外のTh2サイトカインの上昇により生じるがんに対する免疫活性化剤を包含する。
　「対象」とは、その予防若しくは治療を必要とするヒト又はその他の動物であり、ある態様としては、その予防若しくは治療を必要とするヒトである。
　本発明の医薬組成物の有効成分である化合物A又はその製薬学的に許容される塩は、BTK及び／又はITK阻害作用を有し、Th1細胞の活性化に影響を与えることなく、Th2細胞の活性化を抑制することから、Th2細胞の活性化を抑制することによる免疫活性化作用により各種がんに対する治療剤としての使用が期待できる。
　また、本発明のがん治療用組成物は、ある態様としては、PD-1とPD-L1との結合を阻害するモノクローナル抗体と併用することを特徴とする各種がんに対するがん免疫治療剤としての使用も期待できる。PD-1とPD-L1との結合を阻害するモノクローナル抗体としては、ある態様としては、ヒトPD-1に結合する抗ヒトPD-1抗体、又は、ヒトPD-L1に結合する抗ヒトPD-L1抗体である。抗ヒトPD-1抗体とは、例えば、ヒト化抗ヒトPD-1抗体およびヒト型抗ヒトPD-1抗体であって、ヒトPD-1の免疫抑制シグナルを阻害し得る、いわゆるヒトPD-1アンタゴニスト抗体あるいはヒトPD-1中和抗体である。具体的には、ヒトIgG4モノクローナル抗体であるニボルマブ（nivolumab）、ヒト型IgG1モノクローナル抗体であるペンブロリツマブ（pembrolizumab）、ヒト型IgG1モノクローナル抗体であるピディリズマブ（pidilizumab）が挙げられる。各々、国際公開第2006/121168号、国際公開第2008/156712号、国際公開第2003/99196号に開示される製造方法又はそれらの変法によって容易に入手可能である。また、抗ヒトPD-L1抗体とは、例えば、ヒト化抗ヒトPD-L1抗体およびヒト型抗ヒトPD-L1抗体であって、ヒトPD-L1の免疫抑制シグナルを阻害し得る、いわゆるヒトPD-L1アンタゴニスト抗体あるいはヒトPD-L1中和抗体である。具体的には、改変型ヒトIgG1モノクローナル抗体であるMDPL3280A（RG7446）、ヒトIgG1モノクローナル抗体であるアヴェルマブ（avelumab）、ヒトIgG1モノクローナル抗体であるデュルバルマブ（durvalumab）が挙げられる。各々、国際公開第2010/77634号、国際公開第2013/079174号、国際公開第2011/66389号に開示される製造方法又はそれらの変法によって容易に入手可能である。
図１は、実施例４記載の培地１で培養したマウス脾臓由来CD4陽性細胞群からのゲーティング結果を示す図である。Aは、横軸を前方散乱（Forward Scatter: FSC）及び縦軸に側方散乱（Side Scatter: SSC）をとった2次元展開図であり、生細胞のゲーティング情報を示す。Bは、縦軸にマウスCD4に対する抗体の蛍光強度を、横軸にFSCをとった2次元展開図であり、Aでゲーティングした細胞群について、CD4陽性細胞群のゲーティング結果を示す。C上は、BのCD4陽性細胞群のゲーティング後の細胞群についての、抗マウスCD3e抗体による刺激を行わない（anti-CD3e(-)）ときのIFN-γ産生細胞とIL-4産生細胞をフローサイトメーターで測定した結果の2次元展開図である。縦軸は、マウスIFN-γに対する抗体の、横軸はマウスIL-4に対する抗体の蛍光強度をそれぞれ示す。また、C下は、BのCD4陽性細胞群のゲーティング後の細胞群についての、抗マウスCD3e抗体による刺激を行った（anti-CD3e(+)）ときのIFN-γ産生細胞とIL-4産生細胞をフローサイトメーターで測定した結果の2次元展開図である。縦軸は、マウスIFN-γに対する抗体の、横軸はマウスIL-4に対する抗体の蛍光強度をそれぞれ示す。 図２は、実施例４記載の培地２で培養したマウス脾臓由来CD4陽性細胞群からのゲーティング結果を示す図である。Aは、横軸を前方散乱（Forward Scatter: FSC）及び縦軸に側方散乱（Side Scatter: SSC）をとった2次元展開図で、生細胞のゲーティング情報を示す。Bは、縦軸にマウスCD4に対する抗体の蛍光強度を、横軸にFSCをとった2次元展開図であり、Aでゲーティングした細胞群について、CD4陽性細胞群のゲーティング結果を示す。C上は、BのCD4陽性細胞群のゲーティング後の細胞群についての、抗マウスCD3e抗体による刺激を行わない（anti-CD3e(-)）ときのIFN-γ産生細胞とIL-4産生細胞をフローサイトメーターで測定した結果の2次元展開図である。縦軸は、マウスIFN-γに対する抗体の、横軸はマウスIL-4に対する抗体の蛍光強度をそれぞれ示す。また、C下は、BのCD4陽性細胞群のゲーティング後の細胞群についての、抗マウスCD3e抗体による刺激を行った（anti-CD3e(+)）ときのIFN-γ産生細胞とIL-4産生細胞をフローサイトメーターで測定した結果の2次元展開図である。縦軸は、マウスIFN-γに対する抗体の、横軸はマウスIL-4に対する抗体の蛍光強度をそれぞれ示す。 図３は、DMSO又は被験化合物A処理後に抗マウスCD3e抗体による刺激を実施したTh1細胞（上段）及びTh2細胞（下段）を、それぞれ抗マウスIFN-γ抗体及び抗マウスIL-4抗体で染色した2次元展開図である。縦軸は、抗マウスIFN-γ抗体の、横軸は抗マウスIL-4抗体の蛍光強度をそれぞれ示す。 図４の左図は、図３上段で示した2次元展開図について、横軸を被験化合物Aの各濃度(Compound A[log(M)］)、縦軸をIFN-γ陽性でかつIL-4陰性のTh1細胞の割合(IFNγ+, IL-4- population(% control))とし、トリプリケート（triplicate）の平均±標準偏差を算出してグラフ化したものである。また図４の右図は、図３下段で示した2次元展開図について、横軸を被験化合物Aの各濃度(Compound A [log(M)］)、縦軸をIFN-γ陰性でかつIL-4陽性の細胞の割合(IFNγ-, IL-4+ population(% control))とし、トリプリケート（triplicate）の平均±標準偏差を算出してグラフ化したものである。 図５は、実施例５に記載の4T1-OVA細胞をマウス乳腺脂肪へ移植したモデルにおける被験化合物Aの抗腫瘍活性試験の結果を示す図である。各群の腫瘍体積について統計解析を実施し，平均値±標準誤差で示した。縦軸は腫瘍体積（Tumor volume(mm3)）を、横軸は投与日数（Days）を示す。また、図中の***は、 p<0.001 vs. Control group (Dunnett's test, n=10)を意味する。 図６は、実施例５に記載の4T1-OVA細胞をマウス乳腺脂肪へ移植したモデルにおける被験化合物Aの抗腫瘍活性試験における体重の変化を示す図である。各群の体重を平均値±標準誤差で示す。縦軸は体重（Body weight(g)）を、横軸は投与日数（Days）を示す。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　上述の通り、化合物Aの化学名は5-{[(3R)-1-アクリロイルピロリジン-3-イル]オキシ}-6-エチル-3-({4-[4-(4-メチルピペラジン-1-イル)ピペリジン-1-イル]フェニル}アミノ)ピラジン-2-カルボキサミドであり、その化学構造は以下に示すとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　化合物A又はその製薬学的に許容される塩は、特許文献１（国際公開第2013/108754号）に記載の方法に従って、あるいはその変法によって入手することができる。
　また、「化合物Aの製薬学的に許容される塩」とは、化合物Aの酸付加塩を意味し、具体的には、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の無機酸や、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、乳酸、リンゴ酸、マンデル酸、酒石酸、ジベンゾイル酒石酸、ジトルオイル酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸等の有機酸との酸付加塩が挙げられる。
　なお、「化合物A又はその製薬学的に許容される塩」のある態様としては、フリー体である化合物Aが挙げられ、別の態様としては、化合物Aのメタンスルホン酸との酸付加塩が挙げられ、例えば、化合物A モノメタンスルホン酸塩が挙げられる。
　また、本発明の医薬組成物の有効成分としては、化合物Ａの溶媒和物、具体的には、例えば水和物やエタノール和物であってもよく、さらに、化合物Ａの酸付加塩の溶媒和物であってもよい。
　がん免疫治療とは、免疫機能を利用したがん治療法のことを意味し、ある態様としては、免疫細胞を活性化し，がん細胞の増殖を抑制する能力又はがん細胞の縮小若しくは消滅させる能力（以下、抗腫瘍活性）を亢進させることにより、抗がん治療を行うことを意味する。 
　免疫活性化とは、免疫細胞自体の機能を亢進することによる免疫活性化、又は、免疫細胞の免疫応答が抑制された状態を解除することによる免疫活性化を意味する。免疫細胞の免疫応答が抑制された状態を解除することによる免疫活性化としては、例えば、Th2細胞の活性化を抑制することにより、Th2サイトカイン(例えば、IL-4)によるTh1細胞の免疫活性が抑制された状態を解除することが挙げられる。
　Th2細胞の活性化とは、Th2サイトカイン(例えば、IL-4)の産生を亢進させ、Th1サイトカイン（例えばIFN-γ）の産生を抑制し、Th1とTh2の割合をTh2優位へとシフトさせることを意味する。
　Th2サイトカインの上昇とは、Th2サイトカインの産生亢進によりTh1サイトカインの産生が抑制された状態を指す。またTh2サイトカインの上昇により生じるがんとしてこれに起因するがんであれば特に限定はされないが、例えば、胃癌、乳癌、及び肺癌を挙げることができる。
　本発明のある態様としては、PD-1とPD-L1との結合を阻害するモノクローナル抗体と併用することを特徴とする、化合物A又はその製薬学的に許容される塩を有効成分として含有するがん免疫治療用医薬組成物、及び／又は、免疫活性化用医薬組成物であり、当該PD-1とPD-L1との結合を阻害するモノクローナル抗体が効果を奏するがんに対して併用効果を奏することが期待される。当該PD-1とPD-L1との結合を阻害するモノクローナル抗体が効果を奏するがんとしては、例えば、固形癌を挙げることができる。そのような固形癌としては、例えば、悪性黒色腫（例えば、転移性悪性メラノーマ）、腎癌（例えば、腎細胞癌、透明細胞カルシノーマ）、前立腺癌（例えば、ホルモン難治性前立腺アデノカルシノーマ）、乳癌、肺癌（例えば、非小細胞肺癌）、膵癌、大腸癌、肝細胞癌、胆道癌、胃癌、卵巣癌、食道癌、尿路上皮癌、結腸癌、骨癌、皮膚癌、頭頚部癌、皮膚若しくは眼窩内悪性メラノーマ、子宮癌、直腸癌、肛門部癌、精巣癌、卵管のカルシノーマ、子宮内膜カルシノーマ、子宮頚部カルシノーマ、膣カルシノーマ、外陰部カルシノーマ、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、柔組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、小児固形癌、膀胱癌、腎臓若しくは尿管の癌、腎盂カルシノーマ、中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍、腫瘍新脈管形成、脊椎腫瘍、脳幹グリオーマ、下垂体アデノーマ、カポシ肉腫、扁平上皮癌、扁平細胞癌、アスベスト誘発癌を含む環境誘発癌が挙げられる。より適用が期待できる固形癌としては、悪性黒色腫（例えば、転移性悪性メラノーマ）、腎癌（例えば、腎細胞癌、透明細胞カルシノーマ）、前立腺癌（例えば、ホルモン難治性前立腺アデノカルシノーマ）、乳癌、肺癌（例えば、非小細胞肺癌）、膵癌、大腸癌、肝細胞癌、胆道癌、胃癌、卵巣癌、食道癌、尿路上皮癌であり、さらに期待できるのは、悪性黒色腫（例えば、転移性悪性メラノーマ）、腎癌（例えば、腎細胞癌、透明細胞カルシノーマ）、前立腺癌、肺癌（例えば、非小細胞肺癌）、大腸癌、肝細胞癌、胆道癌である。また、固形癌の患者以外にも血液がんの患者に対しても効果が期待できる。そのような血液がんとしては、濾胞性リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、小リンパ球性リンパ腫、多発性骨髄腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞性リンパ腫、B細胞前リンパ球性白血病、急性リンパ球性白血病、組織球性リンパ腫、急性骨髄性白血病、急性巨核芽球性白血病、未分化大細胞リンパ腫、急性T細胞性リンパ腫、リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病である。
　化合物A又はその製薬学的に許容される塩を含有する医薬組成物は、さらに任意の添加剤として賦形剤を含んでいても良く、当分野において通常用いられている賦形剤、例えば、薬剤用賦形剤や薬剤用担体等を用いて、通常使用されている方法によって調製することができる。
　投与は錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤等による経口投与、又は、関節内、静脈内、筋肉内等の注射剤、坐剤、経皮用液剤、軟膏剤、経皮用貼付剤、経粘膜液剤、経粘膜貼付剤、吸入剤等による非経口投与のいずれの形態であってもよい。
　経口投与のための固体組成物としては、錠剤、散剤、顆粒剤等が用いられる。このような固体組成物においては、１種又は２種以上の有効成分が、少なくとも１種の不活性な賦形剤と混合される。組成物は、常法に従って、不活性な添加剤、例えば滑沢剤や崩壊剤、安定化剤、溶解補助剤を含有していてもよい。錠剤又は丸剤は必要により糖衣又は胃溶性若しくは腸溶性物質のフィルムで被膜してもよい。
　経口投与のための液体組成物は、薬剤的に許容される乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤又はエリキシル剤等を含み、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば精製水又はエタノールを含む。当該液体組成物は不活性な希釈剤以外に可溶化剤、湿潤剤、懸濁剤のような補助剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、防腐剤を含有していてもよい。
　非経口投与のための注射剤は、無菌の水性又は非水性の溶液剤、懸濁剤又は乳濁剤を含有する。水性の溶剤としては、例えば注射用蒸留水又は生理食塩液が含まれる。非水性の溶剤としては、例えばエタノールのようなアルコール類がある。このような組成物は、さらに等張化剤、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、又は溶解補助剤を含んでもよい。これらは例えばバクテリア保留フィルターを通す濾過、殺菌剤の配合又は照射によって無菌化される。また、これらは無菌の固体組成物を製造し、使用前に無菌水又は無菌の注射用溶媒に溶解又は懸濁して使用することもできる。
　通常経口投与の場合、1日の投与量は、体重当たり約0.001～100 mg/kg、好ましくは0.01～30 mg/kg、更に好ましくは0.1～10 mg/kgが適当であり、これを1回であるいは2回～4回に分けて投与する。静脈内投与される場合は、1日の投与量は、体重当たり約0.0001～10 mg/kgが適当で、1日1回～複数回に分けて投与する。また、経粘膜剤としては、体重当たり約0.001～100 mg/kgを1日1回～複数回に分けて投与する。投与量は症状、年令、性別等を考慮して個々の場合に応じて適宜決定される。
　投与経路、剤形、投与部位、賦形剤や添加剤の種類によって異なるが、本発明の医薬組成物は0.01～99重量%、ある態様としては0.01～50重量%の化合物A又はその製薬学的に許容される塩を有効成分として含有する。
　本発明の医薬組成物のある態様としては、種々の治療剤と併用することができる。当該併用は、同時投与、あるいは別個に連続して、若しくは所望の時間間隔をおいて投与してもよい。同時投与の場合には、配合剤であっても別個に製剤化されていてもよい。特に併用することができる薬剤として、シスプラチン、カルボプラチンなどのプラチナ製剤、ゲムシタビン、ペメトレキセド、5-フルオロウラシル、カペシタビン、ベンダムスチンなどの代謝拮抗剤、パクリタキセル、ビノレルビンなどの微小管重合阻害剤、ベバシズマブなどの血管新生阻害剤、イリノテカン、エトポシドなどのトポイソメラーゼ阻害剤、インターフェロンのようなサイトカイン製剤、スニチニブ、パゾパニブ、ソラフェニブ、アキシチニブなどのキナーゼ阻害剤、エンザルタミドなどの抗アンドロゲン剤、テモゾロミド、ダカルバジン、シクロホスファミドやイホスファミドなどのアルキル化剤が挙げられる。
　本発明の医薬組成物の薬理的効果は、以下の実施例により確認した。
実施例１　BTKキナーゼ阻害活性評価
　BTKキナーゼ阻害活性についてはQSS AssistTM Mobility Shift Assay キット（カルナバイオサイエンス）を用いて評価した。
　化合物A モノメタンスルホン酸塩（以下、被験化合物A）をジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解し、試験濃度の100倍濃度の溶液を調製した。その溶液をさらに付属のアッセイバッファーにて25倍希釈して4倍濃度被験化合物A溶液とした。なお、反応にはキットに付属しているBTKキナーゼを用いた。
　上記のアッセイバッファーにて調製した5μLの4倍濃度被験化合物A溶液及び10μLの2倍濃度BTKキナーゼ溶液を384ウェルプレートのウェル内で混合し、室温にて30分間放置した。続いて、5μLの4倍濃度基質ペプチド/ATP/MgCl2溶液を添加し、室温にて1時間反応させた。基質ペプチドは終濃度1000nM、ATPは終濃度1mM、MgCl2は終濃度5mMにて使用した。その後、付属のターミネーションバッファー60μLを添加して反応を停止させた。BTKキナーゼ活性は基質ペプチドのピーク高さと生産物（リン酸化基質ペプチド）のピーク高さから求められる生成物の変換率をLabChip EZ Reader II（PerkinElmer）で定量して算出した。
　データ解析は、全ての反応コンポーネントを含むコントロールウェルの平均変換率を0%阻害、BTKキナーゼ以外の全ての反応コンポーネントを含むバックグランドウェルの平均変換率を100%阻害とし、各濃度の被験化合物Aを添加したウェルの平均変換率から阻害率を計算した。50%阻害濃度(IC50)値は被験化合物A濃度と阻害率によるプロットを基に非線形回帰から求めた。
　その結果、被験化合物AはBTKキナーゼ活性を阻害し、そのIC50値は0.17nMであった。
実施例２　ITKキナーゼ阻害活性評価
　ITKキナーゼ阻害活性についてはMobility Shift Assay系を用いて評価した。
　被験化合物AをDMSOに溶解し、試験濃度の100倍濃度の溶液を調製した。その溶液をさらにアッセイバッファー（20mM HEPES, 0.01% Triton X-100, 1mM DTT, pH 7.5）にて25倍希釈して4倍濃度被験化合物A溶液とした。
　上記のアッセイバッファーにて調製した5μLの4倍濃度被験化合物A溶液及び10μLの2倍濃度のITKキナーゼ溶液を384ウェルプレートのウェル内で混合し、室温にて30分間放置した。続いて、5μLの4倍濃度基質ペプチド（Srctide, ペプチド研究所 #AD-995）/ATP/MgCl2溶液を添加し、室温にて1時間反応させた。基質ペプチドは終濃度1000nM、ATPは終濃度1000μM、MgCl2は終濃度5mMにて使用した。その後、ターミネーションバッファー(127mM HEPES, 0.01% Triton X-100, 26.7mM EDTA, 1% DMSO, pH 7.5)60μLを添加して反応を停止させた。ITKキナーゼ活性は基質ペプチドのピーク高さと生産物（リン酸化基質ペプチド）のピーク高さから求められる生成物の変換率をLabChip3000（PerkinElmer）で定量して算出した。
　データ解析は、全ての反応コンポーネントを含むコントロールウェルの平均変換率を0%阻害、ITKキナーゼ以外の全ての反応コンポーネントを含むバックグランドウェルの平均変換率を100%阻害とし、各濃度の被験化合物Aを添加したウェルの平均変換率から阻害率を計算した。
　その結果、被験化合物AはITKキナーゼ活性を阻害し、1nM、10nMにおける阻害率はそれぞれ29.5%、92.6%であった。
実施例３　ヒト及びマウスITKに対する細胞内阻害活性
　HEK293細胞にヒトまたはマウスITKを一過的に発現させ、96ウェルプレートに播種した。被験化合物Aを最高濃度10μMから3倍公比で8濃度、DMSO終濃度0.5%で37℃、2時間処理した。その後細胞を溶解し、サンドイッチELISAにより、リン酸化ITKレベルを測定した。%阻害率はそれぞれのサンプルの450nmの吸光度の値を基に以下の式によって算出し、GraphPad Prismソフト(GraphPad Software社)を用いてIC50値を算出した。
(([positive control] － [sample])/([positive control] － [negative control])) × 100
　上記式中、positive controlとはヒトまたはマウスITK発現のDMSO処理サンプルの吸光度の値を、negative controlとはヒトまたはマウスITK kinase-dead発現細胞のDMSO処理サンプルの吸光度の値を、sampleとは被験化合物処理サンプルの吸光度の値をそれぞれ意味する。
　試験の結果、被験化合物Aはヒト及びマウスITKキナーゼ活性を細胞内で阻害することが確認され、そのIC50値はそれぞれ73nM、89nMであった。本結果から、被験化合物Aはヒト及びマウスITKに対して同等の阻害活性を有することが明らかとなった。
実施例４　Th1細胞、Th2細胞に対する作用
１）CD4陽性細胞の分離とTh1細胞、Th2細胞分化誘導
　11週令の雄性C57BL/6Jマウス（日本チャールス・リバー）の脾臓から、CD4 (L3T4) MicroBeads mouse (Miltenyi Biotec:130-049-201)を用いてCD4陽性細胞を分離し、3μg/mL抗マウスCD3e抗体（eBioscience:16-0031-85）/phosphate-buffered saline(PBS, WAKO: 045-29795)で室温にて1時間コートした24ウェルプレートに下記の培地１又は２で懸濁し播種した。
培地１:T-cell培地にマウスIL-2（6.25ng/mL (R&D Systems:402-ML-020)）、マウスIL-12(10ng/mL(PEPROTECH:210-12))及び抗マウスIL-4抗体（10μg/mL(eBioscience:14-7041-85)）を添加した培地。
培地２:T-cell培地にマウスIL-2（6.25ng/mL）、マウスIL-4（100ng/mL(R&D Systems:404-ML-010)）、及び抗マウスIFN-γ抗体（10μg/mL(eBioscience:14-7312-85)）を添加した培地
なお、抗マウスIL-4抗体、抗マウスIFN-γ抗体は播種時のみ添加した。継代時には抗マウスIL-4抗体、抗マウスIFN-γ抗体を除いた培地で培養した。
T-cell培地: 10% Fetal Bovine Serum (FBS、SIGMA:172012-500ML)、並びにペニシリン・ストレプトマイシン(Gibco:15070-063、原液を1/100となるように添加)、モノチオグリセロール(WAKO:195-15791、原液を1/100となるように添加)、非必須アミノ酸(SIGMA:M7145、 原液を1/100となるように添加)、ピルビン酸(SIGMA:S8636、原液を1/200となるように添加)、及びGlutaMAX (GIBCO:35050-061、原液を1/100となるように添加)を含有するRPMI1640培地(SIGMA:R8758)。
２）Th1細胞及びTh2細胞に対する被験化合物Aの作用
　CD4陽性細胞を培地１及び培地２でそれぞれ6日間培養し，Th1細胞及びTh2細胞に分化誘導させた後、T-cell培地でTh1細胞、Th2細胞をそれぞれ4×105cells/90μL/wellとなるように懸濁し、96ウェル丸底プレート(Greiner: 650185)に播種した。DMSOもしくは被験化合物A（10、30、100、300、又は1000nM）でそれぞれ37℃にて30分間処理した（DMSO終濃度は全て0.1%となるように調製）。その後薬剤を除去し、T-cell培地で懸濁し、3 μg/mL抗マウスCD3e抗体/PBSで室温にて1時間コートした96ウェル丸底プレート(Greiner #650185)にそれぞれ播種し、37℃で60分間培養した。また，DMSO処理細胞については，抗マウスCD3e抗体/PBSでコートしていない96ウェル丸底プレートにも播種し，抗マウスCD3e抗体刺激なしサンプルとした。その後、蛋白質輸送阻害剤(BD GolgiStop（商品名）)(BD Biosciences: カタログNo. 554715のキット中の1試薬)を加えさらに37℃で60分間培養した。その後、抗マウスCD16/CD32抗体(2.4G2)（BD Biosciences: カタログNo. 553142）で氷冷下15分間ブロッキング処理後に，BD Cytofix/Cytoperm Plus Fixation/Permeabilization Solution Kit with BD GolgiStop（商品名）（BD Biosciences: カタログNo. 554715）を用いて膜透過し、Pacific Blue標識抗マウスCD4抗体（BD Biosciences: カタログNo. 558107）、Allophycocyanin(APC)標識抗マウスIFN-γ抗体（BD Biosciences: カタログNo. 554413）、Phycoerythrin(PE)標識抗マウスIL-4抗体（eBioscience: カタログNo. 12-7041-82）を用いて染色し、フローサイトメーター（BD FACSVerse）を用いて解析した。
３）解析方法
　FSC及びSSCの分布（図１A、図２A）を基に生細胞をゲーティングした。さらにCD4陽性細胞をゲーティングし（図１B及び図２B）、解析に使用した。
　IFN-γ産生細胞の割合をTh1細胞活性化の指標とし、抗マウスCD3e抗体による刺激を行わないとき(anti-CD3e(-))のIFN-γ陽性でかつIL-4陰性の細胞の割合を0％と、抗マウスCD3e抗体による刺激を行ったとき(anti-CD3e(+))のIFN-γ陽性でかつIL-4陰性の細胞の割合を100%とし、被験化合物A の各濃度処理後におけるIFN-γ陽性でかつIL-4陰性の細胞の割合（%）を評価した。また、IL-4産生細胞の割合をTh2細胞活性化の指標として、抗マウスCD3e抗体による刺激を行わないとき(anti-CD3e(-))のIFN-γ陰性でかつIL-4陽性の細胞の割合を0％と、抗マウスCD3e抗体による刺激を行ったとき(anti-CD3e(+))のIFN-γ陰性でかつIL-4陽性の細胞の割合を100%とし、被験化合物A の各濃度処理後のIFN-γ陰性でかつIL-4陽性の細胞の割合（%）について評価した。試験はトリプリケート(triplicate)で実施し、平均±標準偏差で示した。
４）結果
　Th1細胞について、IFN-γ陽性でかつIL-4陰性の細胞の割合は、抗マウスCD3e抗体による刺激で2.6%から61%に増加した（図１C）。Th2細胞については、IFN-γ陰性でかつIL-4陽性の細胞の割合は、抗マウスCD3e抗体による刺激(anti-CD3e(+))で0.79%から7.9%に増加した（図２C）。以上の結果から、抗マウスCD3e抗体による刺激(anti-CD3e(+))でTh1細胞群ではIFN-γ産生細胞数が、Th2細胞群ではIL-4産生細胞数がそれぞれ増加することが確認された。
　被験化合物AのDMSO溶液（10、30、100、300、又は1000nM）で処理した後のIFN-γ陰性でかつIL-4陽性の細胞の割合の平均値は、controlであるDMSOのみで処理したときのIFN-γ陰性でかつIL-4陽性の細胞の割合のそれぞれ87.8%、76.8%、69.3%、55.8%、及び、43.6%であった（図４右）。一方、被験化合物AのDMSO溶液（10、30、100、300、又は1000nM）で処理した後のIFN-γ陽性でかつIL-4陰性の細胞の割合の平均値は、controlであるDMSOのみで処理したときのIFN-γ陰性でかつIL-4陽性の細胞の割合のそれぞれ99.1%、97.6%、97.9%、95.1%、及び、89.3%であった（図４左）。
　以上から、被験化合物A は、Th1細胞の活性化に影響を与えることなく、Th2細胞の活性化を選択的に抑制することが本検討から明らかとなった。
実施例５　4T1-OVA細胞をマウス乳腺脂肪へ移植したモデルにおける抗腫瘍活性試験
１）4T1-OVA細胞の作製
　マウス乳癌細胞である4T1細胞は、ATCCから購入し（CRL-2539）、10％ウシ血清（CCB）、ペニシリン・ストレプトマイシン（Invitrogen）含有RPMI-1640培地（Gibco）で5% CO2、37℃で培養した。グリコシルホスファチジルイノシトール（glycosylphosphatidylinositol、GPI）アンカー配列を付加した卵白アルブミン（OVA、アクセッション番号NM_205152.2）（GPI-OVA; 配列番号1）をEcoRI及びXho1制限酵素サイトに組み込んだpcDNATM3.1/Zeo (+)ベクター（Invitrogen）を作製した。そのベクターを4T1細胞にLipofectamine（登録商標）2000（Invitrogen）を用いて製品説明書のプロトコールに従ってトランスフェクションした。その後、Zeocin（Invitrogen）800μg/mL存在下で培養し、約2か月かけて4T1-OVA細胞を樹立した。
２）抗腫瘍試験
　4T1-OVA細胞は、6週令の雌性BALB/cマウス（日本チャールス・リバー）の乳腺脂肪に、1匹あたり1.5×104 個の細胞を20μLのPBSに懸濁して移植した。腫瘍細胞が生着し、平均腫瘍体積が約50mm3になった時点で腫瘍体積を指標に群分けを行った（各群10匹）。被験化合物Aを0.5%メチルセルロース（信越化学工業株式会社）に溶解し、フリー体換算で50mg/kgまたは100mg/kgの用量で1日1回、14日間経口投与した（図５及び図６中のCompound A 50mg/kg、Compound A 100mg/kg）。被験化合物Aの対照として0.5%メチルセルロースを同様に投与した(Control)。また、全てのマウスにRat IgG2a抗体（Bio X Cell:BE0089）を1匹あたり100μgの用量で1週間に2回の頻度で合計4回静脈内投与した。腫瘍径を週2回、体重を週1回の頻度で測定した。腫瘍体積は（[短径]2 x長径/ 2）の計算式より算出して決定した。
　結果を図５及び図６に示す。被験化合物A投与群では対照群と比較して有意に腫瘍増殖が抑制された（Dunnett's test）（図５）。一方、体重への影響は無かった（図６）。
　以上のことから、被験化合物Aは、マウス乳癌細胞である4T1細胞にGPI-OVA（配列番号２）を発現させた4T1-OVA細胞を、正常な免疫機能を有するBALB/cマウス乳腺脂肪に移植した同種モデルにおいて、抗腫瘍効果を発揮することが確認された。
　本発明の医薬組成物の有効成分である、化合物A又はその製薬学的に許容される塩はBTK及び／又はITK阻害作用を有し、Th1細胞の活性化に影響を与えることなく、Th2細胞の活性化を抑制することから、化合物A又はその製薬学的に許容される塩を有効成分とする医薬組成物は、がん免疫治療剤、及び／又は、免疫活性化剤としての使用が期待できる。
　以下の配列表の数字見出し＜２２３＞には、「Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」の説明を記載する。具体的には配列表の配列番号１で表される塩基配列は、GPIアンカー配列を付加したOVA(GPI-OVAと称する)の塩基配列であり、配列番号２で表されるアミノ酸配列は、配列番号１の塩基配列によりコードされるGPI-OVAのアミノ酸配列である。

Claims (8)

  1. 　5-{[(3R)-1-アクリロイルピロリジン-3-イル]オキシ}-6-エチル-3-({4-[4-(4-メチルピペラジン-1-イル)ピペリジン-1-イル]フェニル}アミノ)ピラジン-2-カルボキサミド又はその製薬学的に許容される塩を有効成分として含有するがん免疫治療用医薬組成物。
  2. 　がん免疫治療用医薬組成物が、EGFR T790M変異陽性癌以外のがんに対するがん免疫治療用医薬組成物である、請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 　がん免疫治療用医薬組成物が、Th2サイトカインの上昇により生じるがんに対するがん免疫治療用医薬組成物である、請求項２に記載の医薬組成物。
  4. 　5-{[(3R)-1-アクリロイルピロリジン-3-イル]オキシ}-6-エチル-3-({4-[4-(4-メチルピペラジン-1-イル)ピペリジン-1-イル]フェニル}アミノ)ピラジン-2-カルボキサミド又はその製薬学的に許容される塩を有効成分として含有する免疫活性化用医薬組成物。
  5. 　免疫活性化用医薬組成物が、EGFR T790M変異陽性癌以外のがんに対する免疫活性化用医薬組成物である、請求項４に記載の医薬組成物。
  6. 　免疫活性化用医薬組成物が、Th2サイトカインの上昇により生じるがんに対する免疫活性化用医薬組成物である、請求項５に記載の医薬組成物。
  7. 　更に製薬学的に許容される賦形剤を含有する、請求項１乃至６のいずれか1項に記載の医薬組成物。
  8. 　5-{[(3R)-1-アクリロイルピロリジン-3-イル]オキシ}-6-エチル-3-({4-[4-(4-メチルピペラジン-1-イル)ピペリジン-1-イル]フェニル}アミノ)ピラジン-2-カルボキサミド又はその製薬学的に許容される塩が、5-{[(3R)-1-アクリロイルピロリジン-3-イル]オキシ}-6-エチル-3-({4-[4-(4-メチルピペラジン-1-イル)ピペリジン-1-イル]フェニル}アミノ)ピラジン-2-カルボキサミド　モノメタンスルホン酸塩である、請求項１乃至７のいずれか1項に記載の医薬組成物。
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