WO2017072374A1 - Derivados de 5-nitroindazol y su uso como agentes antiprotozoarios - Google Patents

Derivados de 5-nitroindazol y su uso como agentes antiprotozoarios Download PDF

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José Antonio ESCARIO GARCÍA-TREVIJANO
Alicia GÓMEZ BARRIO
Juan José NOGAL RUÍZ
Alejandra IBÁÑEZ ESCRIBANO
Cristina Rosa FONSECA BERZAL
Vicente Jesús ARÁN REDÓ
Felipe REVIRIEGO PICÓN
José María CUMELLA MONTÁNCHEZ
Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic) (33,3%)
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Universidad Complutense de Madrid
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    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
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    • A61K31/416—1,2-Diazoles condensed with carbocyclic ring systems, e.g. indazole
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D231/00—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazole or hydrogenated 1,2-diazole rings
    • C07D231/54—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazole or hydrogenated 1,2-diazole rings condensed with carbocyclic rings or ring systems
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    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to two families of compounds derived from 5- nitroindazole, their preparation process and their use for the manufacture of medicaments for the treatment of infections, particularly those caused by protozoa of the Trypanosomaiidae and Tichichadidae families. .
  • the invention therefore, falls within the pharmaceutical sector.
  • Protozoa are the etiologic agents of several of the main parasitic diseases. Many of these infections are concentrated in the poorest areas of the planet and are considered "neglected tropical diseases". The existing pharmacological treatments for many of these protozoosis are far from satisfactory and the development of a vaccine is still a successful goal. Currently existing therapies are not adequate due essentially to several factors, such as low therapeutic rates that lead to high toxicities and unacceptable side effects, the emergence of resistant parasites, the difficulty of treatment compliance due to complex protocols, the high prices that are beyond the reach of patients in the affected countries, etc.
  • Chagas disease has an initial acute phase between 1-2 months long, usually asymptomatic or mild and with detective parasi ⁇ ernia. After an undetermined phase, between 30-40% of patients evolve into a chronic phase that manifests 10-30 years after infection. This is characterized by the presence of irreversible cardiac and digestive lesions, which arise as a result of inflammatory lesions (Rassi ir., A, e ⁇ al .., Lances 2010, 375, 1388-1402) produced by the persistence of the parasite along with reactions Automatically (Marin-Ne ⁇ o, JA et al., Circulatkm 2007, ii 5. 1 109- 123).
  • the activity against Trypanosoma hrucei rhodesiense, an etiological agent of African sleeping sickness, of various derivatives of 5- nitroindazoi is also known; 1-alkyl- and l-arylindazol-3 ⁇ oles, 2 ⁇ alki lindazo Hn-3 ⁇ ones, 3- alcoximdazo.es, 3-alkoxy- 1 -alkiiindazoles, indazolin-3-ones 1, 2-condensed, and 1, 3 '- hydrocarbi3enbis (3-alcaxiindazoks) ( ⁇ rán, VJ, et al., Sioorg. Med. Chem. Let ⁇ .
  • 1,2-disubstituted 5-nitroindazalin-3-ones are proposed as aniich agási eos agents.
  • n-2-disubstituted NH-3-one and 2-disubstituted linkers have in position] simple alkyl groups (methyl, propyl, isopropyl, butyl and pendium) or benzyl.
  • these groups can be substituted by complex alkyl groups, containing unsaturations or various varied functionalities (halogen, carboxyl, ester, ether, alcohol, amide, etc.) or by adi or sulfonyl groups, being able to obtain more compounds active and less toxic than previously known, in addition to increasing the water solubility of the compounds by introducing polar groups, thus being able to exhibit a more appropriate pharmacokinetic behavior.
  • Trichomonas vagin s (fam. Trichomonadidae) is the causative agent of trichonosis, a sexually transmitted infection (STI) responsible for more than 50% of all curable STIs in the world. According to the latest data estimated by the World Health Organization and published in 2012, more than 276 million infections occur each year (WHO, Global incidence and prevalence of selected curable sexually transmitted diseases ⁇ 2008, 201).
  • This protozoan is transmitted only through sexual contact. It is characterized by showing a wide range of clinical manifestations that can cause severe cases of inflammation of the genitourinary ducts accompanied by a characteristic leucorrhoea, erythema, pruritus, dysuria, infertility or the formation of small lesions called "colpilis macularis" in the cervix. In man, this infection can lead to non-gonococcal urethritis and impaired sperm viability and mobility (Swygard, H. et ai., Sex. Transm. Ittfect. 20 ⁇ 4, 80, 91-95; Lewis, DA, Medicine (Bal ⁇ imore) 2010, 38, 291-293). However, epidemiological studies reveal that at least half of women as well as 80% of infected men have no symptoms, becoming asymptomatic carriers and potential transmitters of this infection.
  • Trichomonosis is preferably treated with the metronidazole nitroheterocycle, introduced in the market around 1960.
  • metronidazole and tinidazole both from the same family of S-nitroimidazoies, are the only two drugs accepted by the Food and Drug Administration (FDA) for treat this STI (Croweli, AL et al., Antimicrob. Agents Che o ⁇ her. 2003, 47, 1407-1409),
  • FDA Food and Drug Administration
  • it is estimated that approximately 5% of cases diagnosed with trichonosis are caused by a nitroimidazole-resistant isolate (Vázquez, F. e ⁇ al., Enferm. Fafecc. Microbio !. Clin. 2001, 19, 1 14- 124).
  • 5-nitroindazole derivatives and their use as antriprotozoal agents.
  • the present invention relates to two groups of compounds derived from 5- nitroindazole, easily available, which have biological activity against certain pathogenic protozoa.
  • a first aspect of the invention relates to two different types of compounds, of general formulas (I) and (II).
  • Compounds of type (I) are 5 ⁇ nitroindazolin-3-ones 1,2-disubstituted and have, in general, activity against Tr panosoma cruzi, while those of type (II) are 3 ⁇ alkoxy-2 ⁇ alkyl- 2 ' -indazois who have activity against Tric omonas vaginaik.
  • hydrophilic from I to 5 carbon atoms
  • aromatic benzoyl or benzoyl or benzoyl differently substituted positions in positions 2, 3 or 4 with g such as F, C% Br, OH, OR, N3 ⁇ 4 N0 2 or CN.
  • the present invention relates to a compound [Formula (I)] that is selected from the following list;
  • the present invention relates to a compound (Formula (II)) that is selected from the following lysia:
  • the present invention relates to the process of obtaining a compound of general formula (I) or (II); as a consequence of the tautomeric character of 5-nitroindazoin-3-one (1 ), some of these compounds are obtained at the same time by reacting the starting product under various conditions with appropriate alkylating, acylating or sulfonilanising agents, as shown in Scheme 1.
  • a fourth aspect is related to the preparation of other compounds of general formula (I) by chemical transformation of the chains in position 1 of the previous products resulting from the alkylation, using varied procedures (dehydrohalogenation, hydrolysis or aminelisis of esters, e ⁇ eri ⁇ cation of pulls of alkyl or aethylation of alcohols), as shown in Scheme 2.
  • a fifth aspect of this invention is repeated to the bear of a compound of general formula (I) or (II) for the preparation of a medicament for the treatment of diseases caused by pathogenic protozoa of the Trypanosomatidae (Trypanosoma, Leishmamá) and Trichomonadidae ( Trichomonas), preferably American trypanosomiasis (C do disease) and tricornonosis, caused by the T. cruzi T. vag ⁇ is parasites, respectively.
  • Trypanosoma, Leishmamá Trypanosomatidae
  • Trichomonadidae Trichomonas
  • C do disease American trypanosomiasis
  • tricornonosis caused by the T. cruzi T. vag ⁇ is parasites, respectively.
  • a sixth aspect of the present invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a compound of general formula (I) or (II) and at least one pharmaceutically acceptable excipient (adjuvants or acceptable pharmaceutical vehicles); optionally said composition may also contain other active ingredients.
  • a pharmaceutically acceptable excipient adjuvants or acceptable pharmaceutical vehicles
  • Alkylation reactions generally lead to mixtures of the corresponding indazo3in-3 ⁇ 1, 2-disubstituted [241; type (I)] compounds and 3-alkoxy-2-alkyl-2H-indazoes [17-23; compounds dpo (II)];
  • the latter compounds are generally minor reaction products that in some cases were not isolated (Vega, MC et al, Etir. J. Mea ', Ch m. 2 (112, 58, 214-227).
  • Many of the alkylation reactions were carried out in K2CO3 / DF at 100 ° C.
  • Example i a Preparation of the 3 ⁇ (eioxycarbonU) prapü (8), 2 ⁇ hydroxyeül ⁇ 9/21), 3- hydroxypropyl ⁇ 10/22 ⁇ and 2-meloxietii (11/23) derivatives.
  • the concentrated chloroform phase was applied to a chromatography column that was eluted with chloroform / acetone mixtures (50: 1 to 25: 1) (for 8 and 11/23) or with the same mixtures (10: 1 to 5: 1 ) and then chloroform / methanol (50: 1 to 25: 1) (for 9/2 ⁇ and 10/22).
  • chloroform / acetone mixtures 50: 1 to 25: 1
  • chloroform / methanol 50: 1 to 25: 1
  • the 3-aicoxy-2 ⁇ benzyl-2H ⁇ indazo.es (21-23) eluted first, followed by the corresponding 1-substituted 2-benzylindazolinones (8-11).
  • Example Ib Preparation of propargyl derivative 2.
  • a stirred mixture of 2- benzylindazoiinone 1 (1.00 g, 3.71 rmol), propargyl bromide (80% by weight in toluene) (4.00 bouquet!) And 2CO3 (0, 55 g, 4.00 mmol) in acetone (50 ml) was refluxed for 32 h.
  • the mixture was evaporated to dryness and, after the addition of water (200 raL), extracted with CHCb (3 x 50 mL).
  • the concentrated chloroform phase was applied to a chromatography column which was eluted 'with mixtures of chloroform / acetone (50: 1 to 30: 1) to give compound 2.
  • Example Id Preparation of the ( ' methoxycarboml) metii derivatives 5/19 and the derived ciartomeiyl 6.
  • the filtered solid was washed with acetone (2 x 5 mL) to provide pure compound 5 (1.03 g).
  • the filtrate was concentrated to dryness, dissolved in chloroform and eomatographed on a column that was ek-yo with chloroform and a mixture of chloroform / acetone (50: 1) to give, in this order of elution, compound 19 [0, 04 g (3%) j and then an additional amount of compound 5 [total yield: 1.18 g (93%)].
  • Example Jf. A ⁇ coxkarbonilaáén, acil tion and s lfomlaci ⁇ n from ⁇ 2-benál-5 ⁇ mtroindazolin-3' ⁇ ⁇ : preparation of aicoxycarbonyl (12. 13), acil (14. 15) and tos ⁇ ! (16) derivatives.
  • 2-benzylindazo Hn-3-one 1 (1.00 g; 3.71 min!)
  • pyridine 15 mL
  • the required alkyl chloroformate (4.00 mmol) was slowly added (for 12 , 13), acetic anhydride (2.0 mL, excess) (for 1) or the corresponding acid chloride (3.90 mmol) (for 15, 16).
  • the reaction mixture was heated at 100 ° C for 3 h (for 14), or stirred at room temperature for I h (for 12, 13, 15 and 16), and then poured into water (100 mL).
  • the precipitated solid was collected by filtration, washed with 2% aqueous HCI (50 mL) and with plenty of water, and air dried.
  • Example 1 compound 25 its origin, compound 25 is described in Example 1.
  • the butyric acid derivative 26 was obtained by hydrolysis (LiOH) of the corresponding ester 8.
  • Butyraraide 21 and A'-methylbutyramide 28 were obtained by treatment of ethyl ester 8 with ammonia or methylamine, respectively; ⁇ / V-dimetHbuyramide 29 was prepared from acid chloride 26 (SOCb) and di methylamine.
  • SOCb acid chloride 26
  • the 3-ethoxypropyl derivative 30 was isolated " from an attempt to prepare the 3-hydroxypropyl derivative 10 from the bromide 4 and NaOH in elanol water.
  • the 2-acetoxyethyl derivative 31 was prepared by acetylation (Ac;? Q) of the corresponding 2-hydroxyetii derivative 9.
  • Example 2a Preparation of the derived vinii 24.
  • a solution of the! - (2-bromoethyl) ninzoHonone 3 (0.56 g, 1.49 mmol) and piperidine (0.35 g, 4 , 1 1 mmol) in ethanol (20 mL.) was heated under reflux for 48 h.
  • the solution was evaporated to dryness and, after the addition of 2% aqueous HC1 (50 mL), extracted with chloroform (3 x 50 mL.)
  • the organic phase was dried (MgSOi) and evaporated to dryness to provide the desired compound; similar results were obtained using methylamine (33% w / w in ethanol solution).
  • Example 2c Preparation of amide 27 and N-meiiamide 28.
  • compound 27 a mixture of ethyl ester 8 (0.50 g, 1.30 mmol) and a saturated solution of ammonia in me ⁇ anol (15 mL) It was allowed to stand at room temperature for 10 days. After removing the solvent and ammonia, in order to eliminate some by-products, the residue was chromatographed on a column that was eluted with a chloroform / methane mixture! (25: 1) to provide the required product.
  • Example 2á Preparation of / N-dimethylamide 29, A suspension of acid 26 (0.53 g, 1.49 mmol) and SOCb (1.00 mL) in CHCh (30 mL) was heated at reflux for 1 h. After evaporation of the solvent and the excess of SGC1 ⁇ 2, a solution of dimethylamine hydrochloride (1.63 g, 19.99 mmol) and K2CO3 (2.80 g, 20.26 mmol) in water was added to the oily residue. 20 mL) The mixture was stirred vigorously for 12 h and then the precipitated product 29 was collected by filtration, washed with water (3 x 5 m.L) and air dried.
  • Activity tests against T. cruzl are carried out in accordance with a sequential protocol for in-vitro drug screening in which, in the first place, simultaneous tests of activity against epimastigotes (extracellular form) and nonspecific cytotoxicity in L929 fibroblasts are performed. (host cells of the amastigotes. intraceluSar form of the parasite). Epimastigotes are extraeular forms present only in vector insects (triatomines), but since they are easily cultivated in viral in the laboratory, they are used for initial screening of anti-gastric activity.
  • amastigotes are intraceluous parasites of the affected mammalian cells, so the results obtained on them are much more significant from the point of view of human disease.
  • Actsidase by the parasite results in the reduction of the red chromogenic substrate of chlorophenol ⁇ -D-galactopyranoside (CP G) to phenol red.
  • Said colorimetric reaction is directly proportional to the number of live parasites, which allows estimating the percentages of activity of the compounds by spectrophotometry.
  • the epimastigote cultures are maintained at 28 * C in LIT medium supplemented with 10% (v / v) with fetal bovine serum inactivated (56 ° C, 30 min.), Penicillin ⁇ 100 IU / mL) and streptomycin (100 ⁇ ig / mL), performing weekly subcultures to keep them continuously in exponential growth phase.
  • EXAMPLE 4 A Viral Study of Non-specific Haemoxies of Indazol Fren Derivatives and L929 Died Fibroblasts and Determines of Indices of Selectivity Indices (IS).
  • Chs epimas- CL ; e L929 SS 3 Clss amas ⁇ i- is
  • the L929 cultures are maintained at 37 at C and 5% CO2 in bottles of 75 cra ⁇ surface, using MEM medium without phenol red, supplemented 10% (v / v) with inactivated fetal bovine serum (56 ° C, 30 min.), Penicillin (100 Ul / mL) and streptomycin (100 ⁇ «/ ⁇ ..).
  • the kyphotoxicity in L929 fibroblasts was determined by luorimetry in the presence of the resazurin substrate, a redox indicator that at the same time undergoes a color change and emits fluorescence in the presence of metabolically active cells (AlamarBIue ® Assay, US Patent No. 5,501, 959).
  • L929 cells were detached from the culture flask by trypsinization. To do this, after removing the culture medium, an EDTA-trypsin solution was added to the bottle and incubated for 5 min at 37 ° C and 5% CO2.
  • the plates were incubated for 48 h at 37 ° C and 5% CG 2 . Each concentration was evaluated in triplicate and growth controls, medium and compound blanks were included, as well as an internal control with benznidazole in each plate. Finally, 20 nL / well of a 1% PBS resazurin solution (2 mM, pH 7) was added and the plates were incubated for 3 h at 37 ° C and 5% CO2. Fluorescence intensity was determined 'at 535 nro (excitation) and 590 nm (emission) on a spectrofluorimeter plate (Infinite 200, Tecan).
  • the percentage of cytotoxicity was calculated by comparing the fluorescence signal emitted by the treated cells with respect to to that emitted by untreated cells (Fonseca-BerzaL C. et al., Bioorg. Meé. Ckem. Leit 2013, 23, 4851-4856).
  • trypomastigotes derived from cell culture were obtained by infecting cultures of L929 cells with epimastigotes in the stationary phase of growth. The cultures were incubated together with the infective forms for 24 h at 33 ° and 5% CC1 ⁇ 4 to favor cell invasion. After this time, those parasites that had not infected the cells were removed by washing the cultures with PBS. After adding fresh MEM medium, the infected cultures were incubated under similar conditions of temperature and humidity for 7 days, at which time TDC was obtained in the supernatant.
  • the tests were carried out in 48-well cell culture plates (Fonseca-Berza !, C, et al ,, Parasite !. Res. 2014, / / J. 1 049-1056), after detaching the L929 cells from their phrasing of Cell culture by triplication, 10,000 L929 in 120 ⁇ of MEM were distributed per well and plates 2 were incubated at 37 ° C and 5% C ⁇ ) 2 , Once the cells were attached, they were infected with TDC in proportion 1: 6 (cell: parasite) and incubated for 24 hours at .13 ° C and 5% CO2.
  • the culture medium was removed, PBS washes were washed to remove TDCs "that did not penetrate the cells and dilutions of the compounds to be tested in fresh MEM in a final volume of 450 [/ well] were added. They were incubated for 7 days at 33 ° C and 5% CCh and each concentration was evaluated in triplicate, including infection controls, cell growth, media and compound targets, as well as an internal control with benznidazole. incubation time with the compounds, the assay was revealed by the addition of 50 pL / well of a solution of CPRG in 3% Triton X-lüü (final concentration 400 ⁇ 7.4, H 7.4) and subsequent incubation of the plates for 3 has 37 "C.
  • the absorbency at 595 nm was determined in a plate spectrofluorimeter (Infinite 200, Tecan).
  • the activity percentages were estimated by comparing the average absorbance value obtained in the treated wells, with respect to the average absorbency of the infection controls.
  • the absorbance corresponding to the cell growth controls (L929 cells only) was subtracted in the experimental and infection control groups.
  • indazole derivatives are evaluated against the isolate of T. vaginal ⁇ s JH31A4, from the American Type Culture Collection (ATCC), sensitive to the reference drug metronidazole. This remains isolated cultured in TY medium (trypticase yeast extract, .. maltose), supplemented with L-cysteine, aseórbieo acid and 10% decomplemented fetal calf serum. The parasite cultures are kept in an oven at 37 ° C and 5% Cih, with passes being made every 48 hours.
  • ATCC American Type Culture Collection
  • Viral screening is carried out by evaluating the growth percentage of a controlled culture after 24 hours in contact with increasing concentrations of the compound to be evaluated.
  • To determine the inhibitory concentration 50 (Bear) a stock solution of the compounds in diraethyl oxide (DMSO) is prepared, and tested in a range of six different concentrations in successive serial double dilutions, starting from a maximum concentration of 300 ⁇ .
  • DMSO diraethyl oxide
  • cultures are prepared in glass tubes with 100,000 mL trophozoi in a final volume of 2 mL. After 5 h of incubation in an oven, 4 pL of the compounds dissolved in DMSO (final solvent volume ⁇ 0.2%) are added. After 24 h of incubation at 37 ° C and 5% CCh, 200 pL of each culture are distributed in sterile flat-bottom plates of 96 wells f unc). The culture medium is then removed after centrifuging the plates at 2,000 rpm for 5 min and the irophozoifos are resuspended in the same volume of sterile phosphate buffer supplemented with 0.1% glucose.
  • Adiendo 20 pL test of a 3 mfvl resazurin stock solution to each well is revealed.
  • This substrate is a redox dye capable of being reduced to resorufin by viable cells.
  • the resorufma unlike the resazurina. emits fluorescence being able to determine the percentage of cell viability through fluorometric reading. After one hour of incubation at 37 ° C, the fluorescence intensity is determined on an INFINITE ⁇ * xc fluorometer ( ⁇ » ⁇ ! ⁇ a 535 nm and?
  • Vero CCL-81 cell line ATCC
  • the cells are kept in horizontal cell culture boats, in RPM1-1460 medium (Sigma-Aldrich) supplemented with 10% fetal bovine serum and antibiotic solution.
  • the cells are detached using a sterile EDTA-ipsipsin solution.
  • a blood count with Trypan blue is then made, adding a concentration of 50,000 cells / 100 ⁇ to sterile 96-well plates, ⁇ ⁇ .
  • the plates are kept in an oven at 37 ° C and 5% COa to favor the adhesion of the cells to the plastic. After incubation, the compounds are added at the same concentrations that were tested against T. vaginalis.
  • the test is developed by adding 20 ⁇ .. of the resazurine dye prepared at a stock concentration of 1 mM in sterile PBS solution. Fluorimetric readings are carried out after 3 hours of incubation with the redox substrate. As in the in vitro tests against T. vaginalis, the results are calculated from the average obtained after at least two independent experiments. Each concentration is evaluated in triplicate obtaining a DS below 10%, there is also a growth control that assumes a 0% non-specific cytotoxic activity. The results obtained in this study are shown in Tables. 3 and 4, where s show the values necessary to inhibit 50% of the growth of Vero cells (CC50).
  • the selectivity indices (SI) that determine the selective toxicity of the molecule from the relationship between CCso and Bear have been estimated.
  • the six compounds tested (9. 18, 20, 21, 22 and 29) showed a low unspecific cytotoxic activity, with percentages of growth inhibition of Yero cells ⁇ 20% at 300 ⁇ and values of the IS between 6.0 and> 4 L4.
  • the compounds of type (II) 21 and 22 stand out, which showed percentages of cytotoxicity (% C) at the maximum concentration tested (300 ⁇ 300) very low (VoCn - 14.7 ⁇ 4.3; 1 ⁇ 4CM « 14, 5 ⁇ 3.2).
  • the IS values are between 6.0 and> 32.9, with compound 22 once again presenting the maximum value, so it is promising as an alternative to the drug reference.

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Abstract

La presente invención se refiere a dos familias de derivados de 5-nitromdazol que poseen propiedades antiparasitarias y a su empleo para la fabricación de un medicamento, preferentemente para el tratamiento de infecciones causadas por protozoos patógenos de las familias Trypanosomatidae y Trichomonadidae, tales como la enfermedad de Chagas, la leishnianiosis y la tricomonosis.

Description

Titula
DERIVADOS DE 5-NITROÍNDAZOL Y SU USO COMO AGENTES ANTIPROTOZOARIOS
Sector de la Técnica
I..a presente invención se refiere a dos familias de compuestos derivados de 5- nitroindazol, a su procedimiento de preparación y a su uso para la fabricación de medicamentos para el tratamiento de infecciones, particularmente las provocadas por protozoos de las familias Trypanosomaiidae y T ichomonadidae. La invención, por tanto, se engloba dentro del sector farmacéutico.
Estado de la técrsica
Los protozoos son los agentes etiológicos de varias de las principales enfermedades parasitarias. Muchas de estas infecciones se concentran en las zonas más pobres del planeta y se consideran "enfermedades tropicales desatendidas". Los tratamientos farmacológicos existentes para muchas de estas protozoosis están lejos de ser satisfactorios y el desarrollo de una vacuna es un objetivo todavía inaleanzado. Las terapias existentes en ia actualidad no son adecuadas debido esencialmente a varios factores, tales como los índices terapéuticos bajos que conducen a altas toxicidades y efectos secundarios inaceptables, la aparición de parásitos resistentes, la dificultad de cumplimiento del tratamiento debido a protocolos complejos, los altos precios que están fuera del alcance de los pacientes en los países afectados, etc.
La enfermedad de C hagas (tripanosomiasis americana), ocasionada por el protozoo hemoflagelado Trypanosoma cr zi (fam. Trypanosomaiidae), es una antropozoonosis transmitida principalmente a través de las heces contaminadas de chinches hematófagas. Se estima que en todo el mundo hay unos 7 millones de personas infectadas y alrededor de 25 millones más en riesgo de contraer la enfermedad, que provoca más de 7.000 muertes anuales, principalmente en 21 países latinoamericanos donde es endémica (WHO, ImesS g ta overeóme the global impact qf N gleaed Tropical Diseases. Tkird WHO repon on Neglected Tropical Diseases, 2015). Sin embargo, la existencia de otras rutas de transmisión alternativas a la vectorial (transfusión de sangre contaminada, trasplante de Órganos infectados o por vía congénita), junto con tes migraciones internacionales producidas en las ultimas décadas, han hecho de la enfermedad de Chagas una patología emergente en diversos países desarrollados; en España, se estima que puede haber unas 85.000 personas infectadas, principalmente de origen boliviano (Sehmunis, G.A. y Yadon, Z.E., Acta Trop. 2010, 1L 14-21 ).
La enfermedad de Chagas presenta una fase aguda inicial de entre 1-2 meses de duración, generalmente asintomática o leve y con parasiíernia detectante. Tras una fase indeterminada, entre el 30-40% de los pacientes evolucionan hacia una fase crónica que se manifiesta 10-30 años después de la infección. Esta se caracteriza por la presencia de lesiones cardiacas y digestivas irreversibles, que surgen como consecuencia de lesiones inflamatorias (Rassi ir,. A, eí al.., Lances 2010, 375, 1388- 1402) producidas por la persistencia del parásito junto con reacciones de carácter automtrmne (Marin-Neío, J.A. et al., Circulatkm 2007, i i 5. 1 109- i 123).
Actualmente no se dispone de vacuna ni tratamiento completamente eficaz para la enfermedad de Chagas, Los dos únicos f rmacos hasta hoy disponibles, los nitraheterociclos nifurtimox y benznidazol, se desarrollaron hace más de cuarenta años (Coura, J.R. et al, Mem. !nst. Oswaldo Cruz 2009. 104, 549-554), Ambos son bastante efectivos en la fase aguda, pero su eficacia en la fase crónica es muy limitada. Por otra pa e, la aparición de cepas de 7'. cruzi resistentes a estos fármacos ha dado lugar a variaciones en su eficacia ligadas a la zona geogr fica. Además, ambos compuestos presentan efectos secundarios de carácter severo, pero el benznidazol es mejor tolerado por los pacientes y generalmente se considera el tratamiento de elección para la enfermedad de Chagas (Urbina, J.A., Acta Trop. 2010, 115, 55-68; Rassi ir„ A. et al., Lances 2010, 375, 1388- 1402).
En los últimos alos se han descrito muchos compuestos con actividad antiehagásiea, asi como diferentes dianas moleculares potenciales del parásito (Quedes, P.M.M. et al, Expert Rev. Anti-lnfect. Ther. 2011, 9. 609-620; Urbina, J.A., Acta Trop. 2010, 115, 55-68: Cerecetto, H. v González, M, Pkarmace ticals 2010, J, 810-838; Sánchez-Sancho, F, et ai., C rr. Med. Chem. 2010, 77, 423-452; Soeiro, M.N.C. y de
Castro S.L., £ r Opin. Ther. Targets 2009, /i, 105 - 121 ).
Especial interés han despertado los azoles antifüngieos inhibidores de la síntesis de esteróles, pero estudios clínicos recientes han resultado muy decepcionantes, mostrando que estos compuestos son bastante menos efectivos que el benznidazol. a! menos como quimioterapia ünica (Chateiain, E., J. Biomol. Screen. 20 IS, 20, 22-35).
Todos estos hechos ponen de manifiesto la necesidad de desarrollar nuevas alternativas terapéuticas para el tratamiento de la enfermedad de Chagas y, por otra parte, se ha señalado recientemente que los derivados nitroheíeroeíclicos siguen representando la única alternativa real en la lucha antichagásica (Moraes, C.B. et al., Sci. Rep. 2014, 4, 4703; DO¡: 10. Í Q38/srep04?G3). Se ha descrito también la actividad antichagásica de diversos 5-mtroindazoIes con estructuras y patrones de sustitución completamente diferentes de los que poseen los compuestos incluidos en esta invención: 1 -alquil indazol-3-oles (Arán, VJ. et al., Bioorg. Med Chem. 2005, 13, 3197-3207; Boiani, L. et al, Eur. J. Med Chem. 2009. 44, Ϊ 034-1040), 3-alcoxiindazoles (Montero-Torres, A. et al., Bioorg. Med, Che . 2005, 13. 6264-6275), 3-aicoxi-í-alquiHndazoles (Arán. V.J. et al.. Bioorg. Med Chem. 2005, 13, 3197-3207; Boiani, L. et al., Eur. J. Med. Chem. 2009, 44, 1034- 1040; Rodríguez. J. et ai.. Eur. J. Med. Chem. 2009, 44, 1545- 1553 ; Rodríguez, J. et al., Bioorg. Med. Chem. 2009, i 7, 8186-8196; Vega, M.C, et al, i¾r. J *?Í¿ Chem. 2012, 5β, 214-227; Muro, B. et al., Eur. J. Med Chem. 2014, 7 , 124-134), indazolin- 3-onas 1 ,2-condensadas (Díaz-Urrutia, C,A. et al., Spectrochim. Acta A 2012, 95, 670- 678) y 1 , 3 '-hidrocarbi)enbis(3-aicoxi- y 3-hidroxiindazoles) (Aguilera- Venegas, B. et al., Int. J. Etecirochem. Sci. 2012. 7, 5837-5863 ).
También se conoce la actividad frente a Trypanosoma hrucei rhodesiense, agente etiológico de la enfermedad del sueño africana, de diversos derivados de 5- nitroindazoí; 1 -alquil- y l ~arilíndazol-3~oles, 2~alqui lindazo Hn-3~onas, 3- alcoximdazo.es, 3-alcoxí- 1 -alquiiindazoles, indazolin-3-onas 1 ,2-condensadas, y 1 ,3 '- hidrocarbi3enbis(3-alcaxiindazoks) (Árán, V.J, et al., Sioorg. Med. Chem. Letí. 2012, 22, 4506-4516), así como las propiedades leishmanicidas de algunos 3-alcoxi-l- aiquilínda2oles (Boiani. L, et al., £«r. J. Med. Chem. 2009. 1034-1040; Marín, C. eí al., Acia Trop, 2015, 170-178) que habían mostrado previamente actividad frente a T. cruzi.
En la presente invención se proponen 5-nitroindazalin-3-onas 1 ,2-disustituidas como agentes aniich agási eos .
En este contexto, se ha descrito en los últimos años la síntesis y propiedades antichagásicas de algunas índazoünonas relacionadas (Montero-Torres, A. et al., Bioorg. Med. Chem. 2005, U. 6264-6275; Vega, M.C. et al, Eur. J. Med Chem. 2012, 55, 214-227; Mura, F. eí al., J. Specírosc. Dytt. 2013, 5, artículo 8; Fonseca- Berzal, C. í al, Parasilol. Res. 2014, 113, 1049- 1056), así como la escasa actividad anti-Γ, ermi de ios 3-alcoxi-2-aIquilindazo!es isómeros (Vega, M.C. et al., Eur. J. Med. Chem. 2012, 58, 214-227; Mura, F. eí al., J. Specírosc. D n. 2013, i, 8; Fonseca-Berzal, C. et al, Parásito!. Res 2014 iii, 1049-1056),
También se conoce la actividad frente a T. hr cei rhodesieme (Arán, V.J. et. a!., Bioorg. Med. Chem. Letí. 2012, 22, 4506-4516) de algunas 5-nitroindazoIinonas 1 ,2- disustituidas, así como sus propiedades antiinflamatorias (Marrero-Ponce, Y. ef. al., Eur. J. Med Chem. 2011, 46, 5736-5753).
Las índazoHn-3-onas i ,2-disustituidas previamente publicadas presentan en posición ] grupos alquilo simples (metilo, propilo, isopropilo, butilo y pendió) o bencilo. En la presente invención se muestra cómo estos grupos pueden ser sustituidos por grupos alquilo complejos, conteniendo insaturaciones o diversas funcionalidades variadas (halógeno, carboxilo, éster, éter, alcohol, amida, etc.) o por grupos adi o sulfonilo, pudiéndose obtener compuestos más activos y menos tóxicos que los previamente conocidos además de aumentar la solubilidad en agua de los compuestos mediante la introducción de grupos polares pudiendo presentar, así, un comportamiento farmacocinético más apropriado. Por otra parte, Trichomonas vagin s (fam. Trichomonadidae) es el agente causal de la tricomonosis, una infección de transmisión sexual (ITS) responsable de más del 50% de todas las ITS curables del mundo. Según los últimos datos estimados por la Organización Mundial de la Salud y publicados en 2012, se producen más de 276 millones de infecciones cada año (WHO, Global incidence and prevalence of selected curable sexually transmiííed diseases ···· 2008, 201 ).
Este protozoo es transmitido únicamente mediante contacto sexual. Se caracteriza por mostrar un amplio rango de manifestaciones clínicas que pueden ocasionar casos graves de inflamación de conductos genitourinarios acompañados de una leucorrea característica, eritema, prurito, disuria, infertilidad o la formación de pequeñas lesiones denominadas "colpilis macularis" en el cuello uterino. En el hombre, esta infección puede derivar en una uretritis no gonocócica y la alteración de la viabilidad y movilidad espermáttca (Swygard, H. et ai., Sex. Transm. Ittfect. 20Θ4, 80, 91-95; Lewis, D.A., Medicine (Balíimore) 2010, 38, 291 -293). Sin embargo, los estudios epidemiológicos revelan que al menos la mitad de las mujeres así como el 80% de los varones infectados no presentan síntomas, convirtiéndose en portadores asintomáticos y potenciales transmisores de esta infección.
La tricomonosis urogenital humana se ha asociado a distintas complicaciones como problemas durante la gestación o neonatos con bajo peso, partos prematuros, etc. (Cotch, M.F. et al., Sex. Tramm. Dis. Í997, 24, 353-360). Asimismo, esta ITS también aumenta el riesgo de desarrollo de neoplasia cervical (Viikki, . et ai.. Acia Oncoi 2000, 39, 71 -75) y de próstata (Sutcliffe, S. et al., Cáncer Epidemial. Biomarkers Prev. 2006. 15, 939-945), asi como una mayor predisposición a la coinfección con otras ITS de origen bacteriano, vírico, etc. (Schwebke, J.R. y Burgess, D., Clin. Microbio!, Rev. 2004. i 7, 794-803; Cherpes, T.L. et al., Sex. Tramm, Dis. 2006, 33, 747-752; Allsworífa, J.E. et al., Sex. Tramm. Dis. 2009, 36, 738-744; McClelland. .S. et aL J infecí, Dis. 2007. 195, 698-702). La tricomonosis se trata preferentemente con ei nítroheíerociclo metronidazol, introducido en ei mercado hacia 1960. Actualmente, ei metronidazol y el tinidazol ambos de la misma familia de S-nítroimidazoies, son los dos únicos medicamentos aceptados por la Food and Drug Adminisiraiion (FDA) para tratar esta ITS (Croweli, A.L. et al., Antimicrob. Agents Che oíher. 2003, 47, 1407- 1409), Sin embargo, no existen alternativas eficaces para aquellos pacientes que desarrollen efectos secundarios, que muestren hipersensibilidad o en los que su uso esté contraindicado. Por otra parte, se estima que aproximadamente el 5% de los casos diagnosticados de tricomonosis son causados por un aislado resistente a nitroimidazoles (Vázquez, F. eí al., Enferm. fafecc. Microbio!. Clin. 2001, 19, 1 14-124).
Por todo ello, es necesaria la búsqueda de alternativas farmacológicas para el tratamiento de esta enfermedad. En la presente invención se proponen 3-alcoxi~2- aíquil--2H--indazo!es.
Se ha estudiado ia actividad íricomonicida de ciertas indazolin-3-onas 1 ,2- disusíituidas (Iháriez Escribano, A. ei al., Mem. Ínst. Qmaldo Cruz 2012, 107 637- 643), asi como la de diversos derivados de 5-nitroindazol con estructuras y patrones de sustitución completamente diferentes de ios que poseen los compuestos objeto de esta invención; 1 -alquilindazol-3-oles (Marrero-Ponce, Y. et al., Curr. Drug Discov. Technol 2005, 2, 245-265; Marrero-Ponce, Y. et al., Bioorg. Med. Chem. 2006, 14, 6502-6524), 2-alquüindazoI~3-onas, 3-a3coxiindazoles, indazol-3-onas 1 ,2- condensadas y 1 , i '-hidrocarbilenbis(3-hidroxiindazoles) (Marrero-Ponce, Y. et al., Curr. Drug Discov. Technol 2005, 2, 245-265), y 3-alcoxi-1-alquiiindazoles (Aráis, VJ. et al, Bioorg. Med Chem. 2005. /.?, 3197-3207). Pero la actividad frente a T. vaginalis de ios 3-alcoxi-2-alquiiindazoles, objeto de esta invención, no se encuentra descrita en ¡a literatura.
Descripción detallada de ta ínversdéri
Derivados de 5-nitroindazol y su uso como agentes antriprotozoarios. La presente invención se refiere a dos grupos de compuestos derivados de 5- nitroindazol, fácilmente asequibles, que poseen actividad biológica frente a determinados protozoos patógenos.
Un primer aspecto de la invención se refiere a dos diferentes tipos de compuestos, de formulas generales (I) y (II). Los compuestos de tipo (I) son 5~nitroindazolin-3-onas 1 ,2-disusíituidas y presentan, en general, actividad frente a Tr panosoma cruzi, mientras que los de tipo (II) son 3~alcoxi-2~alquil-2 '-indazoíes que presentan actividad frente a Tric omonas vaginaik.
Figure imgf000008_0001
*ν^«;* i fórmula (i; donde puede ser:
- un grupo alquenilo o alquinilo de 2-6 átomos de carbono y con el enlace múltiple en las diversas posiciones posibles; se excluye específicamente la l-aH!-2-bencil-5~ ntiroindazolinona [compuesto tipo (I)] descrita como intermedio sintético en una patente Qin, D. et al (GSK), WO2012162129 Al ].
~ un grupo polimetílénico de longitud variable {CH2)ES, n 1-6] con susiituyeiites termínales de tipo Br, OH, COOR (R. =· H o alquilo de 1 -5 carbonos), CON *!R2 <R! y/o 2 H o alquilo de 1 -5 carbonos), CN u OR (R = grupos alquilo o aeilo de 1-5 carbonos).
- un grupo aleoxicarbonílo con el grupo aieoxilo de 1 -5 átomos de carbono.
- un grupo aeilo aHfltíco (de I a 5 átomos de carbono) u aromático (benzoilo o benzoilo o benzoÜos diferentemente sustituidos en las posiciones 2, 3 o 4 con g tales como F, C% Br, OH, OR, N¾ N02 o CN). - un grupo sulfonilo alifátieo o aromático, y X puede ser cualquier sustituyante de los que pueden encontrarse habitual mente en las posiciones 2, 3 o 4 de un grupo bencílo, tales como grupos alquilo sencillos o ramificados de 1 -5 átomos de carbono, grupos trifluorometilo (CFj), átomos de halógeno (F, CL B), grupos hidroxilo o alcoxilo (OH y OR; R = alquilo), grupos amino primario, secundario o terciario (NH2, NH , NR2; R alquilo), nitro (NO2) o cia.no (CN).
En compuestos de tipo (I), cuando R = CH2COOH, se excluyen específicamente derivados con dos átomos de halógeno en el sustituyeme bencílico que han sido estudiados como inhibidores de aldosa reducíasa (Malamas, M.S. y Millen, J., J. Med. Chem. 1991, 34, 1492-1503).
En una realización más preferida, la presente invención se refiere a un compuesto [Fórmula (I)] que se selecciona de la lista siguiente;
Figure imgf000009_0001
1- Aceíii-2-benciI-5-nitro-l ,2-dihidro-3H-inda?.oS-3-ona (14)
2- Bencsl-d --benzcul"5"nitro-l ,2 lihIdro-3i/-índa ol-3-ona (15) 2-Beneil-5-nii.ro- 3 -tosil- 1 ,2~dihidrQ~3 /~mdazol~3-ona (16)
2-Benci!-5-nitro- l -vinii- í ,2-dihidro-3H-indazoi-3-ona (24)
2"Bencil~l-(2-carboxíeiil)-5-n!tro-{ «2-dÍhidro-3H-inda20i-3~ona (25)
2-Bencü~l
Figure imgf000010_0001
l ,2-dihidro-3//'-3ndazol~3'-ona (26)
2-Benci!-l -(3-carbamoilpropil)-5~nitro- 1 ,2-dihidro-3//-indazol-3~ona {27}
2-Bencil- l -[3-(meiilcarbarnoil)propil]-5-nitro- 152-dihidro-3/-/~inda2ol-3-ona (28) 2-Bencil- l -[3-(dimeii[carbamoiI)propil]-S-nitro- l ,2-dihidro-3H-indazo!-3-ona (29) 2-Bencíl~l ~(3~eloxipfopíl}"5~niíTO" l ,2-dihidro-3H- indazol-3- na {30}
1 - (2-AceioxieiiV)-2-bencil-5-niiro-l ,2-dihidro-3//-indazol-3-ona (31 ) o sus solvaíos o profárroaeos.
En otra realización más preferida, la presente invención se refiere a un compuesto (Fórmula (II)] que se selecciona de la lisia siguiente:
2- Beneil-3-{2-bromGetoxi )-S-nitro-2H-indazol (17)
2-Bencil-3-{3-bromopropoxi)-5-nitro-2H-mdazol (18}
2-Bencil-3~(metoxicarbonil)metoxi-5-nítro~2j¥-indazol (19)
2-Bencíl-3-[2-(irietoxicarbonií)eíoxí]-5-niíro-2H-índazoi (2Θ)
2-Bencil-3-(2-hidroxietoxi)-5-niiro~2/f-indazol (21 )
2~Bencii~3-(3-hidraxipropoxi)-5-rjiíro~2//-indazo[ (22)
2~Benci!~3-(2-metoxieíoxi)-5-nitro-2H-indazol (23) o sus solvatos o profarmacos.
En ·.;·"; tercer aspecto, la presente invención se refiere al procedimiento de obtenci n de un compuesto de formula general (I) o (II); como consecuencia del carácter tautómero de la 5-nitroindazoíin-3-ona (1 ), algunos de estos compuestos se obtienen a la vez al hacer reaccionar el producto de partida bajo condiciones diversas con agentes alquilantes, acilantes o sulfonilaníes apropiados, tal como se muestra en el Esquema 1 . A partir de la forma tautémera l a (forma "indazolin-S-ona") se obtienen los compuestos de formula general (I), mientras que la forma tautémera ib (forma "3- hidroxi~2H-indazol) conduce a los compuestos de formula general (II), Las condiciones concretas para cada reacción dependen de los reactivos alquilantes, acílantes o sulfonilantes concretos, ta! como se describe en los ejemplos l a-f.
Figure imgf000011_0001
Esquema 1. Ruta sintética para la preparación de los compuestos 2-16 [tipo {!)] y 17- 23 [tipo íll)] a partir de ia 2-bencÍ[-5-nitroinda o!inona l a,b.
Un cuarto aspecto está relacionado con la preparación de otros compuestos de formula general (I) por transformación química de las cadenas en posición 1 de los productos anteriores resultantes de ia alquilaeión, utilizando procedimientos variados (deshídrohalogenacién. hidrólisis o aminélísis de esteres, eíeriíkación de halaros de alquilo o aeilaeion de alcoholes), tal como se muestra en el Esquema 2.
Figure imgf000012_0001
, 7, § f. 2441
Compuesto ^ R_ _____ Compuesto
3 íCH^Br — -— *» 24 CH-CH2
7 CH2]2COO e »- 26 (CH2]2COOH
8 [CH2j3COOEi »* 28 [Ch i3CGQH
8 ÍCH2]-¾COOEi *· 27 iCH,]aCONH5
S [CH2]3COGEt -~→» 28
26 [CH ]3COOH 2S [CH2]3CONMe2
4 iCH2]3Br <- 30 ICH2:3OEt
§ iCHyhOH * 31 CH2i2OAc
Esquema 2. Rotas sintéticas para ¡a preparación de los compuestos 24-31 [tipo (II } a partir de los compuestos 3, 4, 7-9 y 26 [tipo (II)],
Un quinto aspecto de esta invención se reitere al oso de un compuesto de formóla general (I) o (II) para la elaboración de un medicamento para eí tratamiento de enfermedades causadas por protozoos patógenos de las familias Trypanosomatidae (Trypanosoma, Leishmamá) y Trichomonadidae (Trichomonas), preferiblemente tripanosomiasis americana (enfermedad de C hagas) y tricornonosis, causadas por los parásitos T. cruzi T. vag íis, respectivamente.
Un sexto aspecto de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprenda un compuesto de fórmula general (I) o (I I) y, al menos, un excipiente farmacéuticamente aceptable (adyuvantes o vehículos farmacéuticos aceptables); opcionaimente dicha composición puede contener también otros principios activos. Modo de realizados de la ínvenciS»
La presente invención se ilustra adicionairaente mediante ios siguientes ejemplos, ios cuales no pretenden ser limitativos de su alcance. EJEMPLO L PreparacMss de ios com est s 2-16 {tipa y 17-23 ftipo (II) j a partir de la 2~bersdI~5-&itrek&da;2ol!S3íHía h
Los compuestos recogidos en Ía Tabla 1 se obtuvieron mediante la alquilación, aleoxiearbonilaeión, aeilación o sulfonilación de la 2-beneiL5-nitroíndazolin~3~Gna 1 con los reactivos requeridas, que se mencionan en cada caso concreto.
Figure imgf000013_0001
¾mpues' o R Compuesto R
2 CH2C~CH 14 Ac
3 ,17 [CHj Br 15 Bz
4. 18 |GH233Br 16 Ts
5 19 CH2CCCMe 24 CH=CH2
β CH2CN 2S ÍCH2]2C0CH
?, 20 [CH2]2COOMe 28 [CH ];ÍCOOH
8 fCH2]3CQOEf 2? [CH2]3CONH2
§: 21 fCH?]2OH 28 [CH2]3COMHMe
10, 22 [CH2j3OH 29 [CH2]3CON s2
11 , 23 [CH2]2OMe 30 [CH2]3OEt
12 COOEí 31 CH2]2OAe
13 COGBn
Las reacciones de alquilación conducen por lo general a mezclas de las correspondientes indazo3in-3~onas 1 ,2-disu.stituídas [241 ; compuestos tipo (I)] y de los 3-alcoxi-2-alquil-2H-indazo3es [17-23; compuestos dpo (II)]; estos últimos compuestos son generalmente productos minoritarios de reacción que en algunos casos no fueron aislados (Vega, M.C. et al, Etir. J. Mea', Ch m. 2(112, 58, 214-227). Muchas de ias reacciones de alquilacién se llevaron a cabo en K2CO3/D F a 100 °C. Sin embargo, la reacción de propargílación que conduce al compuesto 2 dio mejores resultados utilizando K2CO3 en acetona a reflujo, y la alquilacién del compuesto 1 con bromoacetato de metilo o bromoaceíonitriío para conducir a ios compuestos 5/19 y 6, respectivamente, se llevó a cabo utilizando bicarbonato sódico en acetona a 35 °C. Por otra parte, durante la alquilacién del compuesto 1 a los derivados 7/20 con 3- bromopropionato de metilo en DMF a 100 °C se observó intensa deshidrogenación de este último a acrilato de metilo; mejores resultados se obtuvieron llevando a cabo la reacción con 2CO3 en tolueno/agua utilizando catálisis de transferencia de fase; sin embargo, también se obtuvieron notables cantidades del correspondiente ácido 25, procedente de la hidrólisis del resto éster del compuesto 7 en las condiciones básicas utilizadas.
Por otra paite, el tratamiento del compuesto í con los cloroformiatos de alquilo requeridos o con los correspondientes cloruros de acilo o suifonilo en piridina proporcionó las 1 -alcoxicarbonil (12, 13), ! -benzoil {15} o 1 -tosilindazolmona (16) deseadas. El 1-acetil derivado 14 fue obtenido por tratamiento de 1 con anhídrido acético en piridina. De acuerdo con algunos resultados publicados con anterioridad, en estos procesos sólo pudieron ser aislados ios correspondientes derivados 1,2- disustituidos (Baiocchi, L. et al, Synthesis 1978, 633-648).
Ejemplo i a. Preparación de los 3~(eioxicarbonU)prapü (8), 2~hidroxieül {9/21), 3- hidroxipropil {10/22} y 2-meloxietii (11/23) derivados. Una mezcla agitada de la 2- bencílindazoimona de partida 1 ( 1 ,00 g, 3,71 mmol), el bromuro requerido (4,00 m ol) y K2CO3 (0,55 g, 4,00 mmol) en DMF (20 mL) se calentó a 100 °C hasta la finalización de la reacción [CCF; 12 h (para .1 1/23); 12 h seguidas de 1 -3 adiciones de cantidades adicionales del bromuro requerido (0.3 mmol) y, eventualmente, si es necesario, base (0,3 mmol) cada 6 h (para 8, 9/21 y 10/22)]. La mezcla se evaporó a secuedad y, después de la adición de agua (200 mL), se extrajo con CHCb (3 x 50 niL). La fase clorofórmica concentrada se aplicó a una columna de cromatografía que se eluyó con mezclas de cloroformo/acetona (50: 1 a 25: 1) (para 8 y 11/23) o con las mismas mezclas (10:1 a 5:1) y a continuación cloroformo/metanol (50:1 a 25: 1 ) (para 9/2 Ϊ y 10/22). En todos ios casos, los 3-aicoxi-2~bencil-2H~indazo.es (21-23) eluyeron en primer lugar, seguidos por las correspondientes 2-bencilindazolinonas 1 -sustituidas (8-11 ).
2-8enál~¡-[3-(et0xwarhonii)propil]-5~mtro~i ^M (8). Rendimiento: 1 ,00 g (70%). Aceite que solidifica con el tiempo; pf 51-53 °C. Ή RMN [300 MHz, (CD. )2SOJ: S 8,52 (d. J - 2,1 Hz, I R 4-H), 8.38 (dd. J - 9,0, 2,1 Hz, 1 H, 6-H), 7,62 (d, J = 9,0 Hz, 1 H, 7-H), 7,25 (ni, 5H, H aromát. Bn), 5,39 (s, 2H, CH2 Bn), 4,06 (t, J - 7,2 Hz, 2H, 1 '-Η), 3,99 (c, J - 7,0 Hz, CH2 Et), 2,2 i (t, J - 7,2 Hz, 2H, 3'~H), L53 (m, 2R 2'-H), 1 ,13 (t, J - 7,0 Hz,€¾}; i3C RMN [75 MHz, (CD3)2SOj: ó 172,00 (C-4'). 160,88 (C-3), 148,56 (C-7a), 141 ,32 (C-5), 136,1 1 (C-l Bn), 128,70 (C-3, -5 Bn), 127,81 (C-4 Bn), 127,26 (C-2, -6 Bn), 127,19 (C-6), 120,54 (C-4), 1 15,62 (C-3a), 1 1 1,88 (C-7), 59,99 (CH2 Et), 45,86 (C-Γ), 44,70 (CH2 Bn), 30,1 1 (C-3'), 21,40 (C-2'), 14,00 {€¾); EM (ES*): m¡z (%) 789 (29) ([2M+Na]*), 767 (64) ([2M÷H]" 406 (37) ([M+Naf ), 384 (100) í[MtHj+). Añil. cale, para C2SH2 3O5 (383,40): C 62,65; H 5,52; N 10,96. Encontrado: C 62,50; H 5,72; N 1 1 ,1 ?.
2~B cilA-(2-hidroxteül)-5-mtroA3^ (9), Rendimiento:
0,91 g (78%). Pf 137-139 °C (2-PrOH). Ή RMN [300 MHz, (CD3)jSO]: S 8,49 (d, J- 2,1 Hz, 1H, 4-H), 8,31 (dd, J :::: 9,3, 2,1 Hz, 1 H. 644), 7,60 (d, J = 9,3 Hz, 1 H, 7-H), 7,29 (m, 3H) y 7,20 (m, 2H) (H aromát. Bn), 5,20 (s, 2H, C¾ Bn), 4.73 (t, J - 5, 1 Hz, 1H, OH), 4, 12 (t, J - 4,9 Hz, 2H, l '-H), 3,45 (m, 2H, 2'-H); °C RMN [75 MHz, (CD3)2SOJ: δ 160,88 (C-3), 149,23 (C-7a), 140,66 (C-5), 136, 15 (C-l Bn), 128,72 (C- 3, -5 Bn), 127,78 (C-4 Bn), 127,20 (C-2, -6 Bn), 326,43 (C-6), 120,29 (C-4), 1 14,65 (C-3a), 1 12,42 (C-7), 58,39 (C-2*), 49, 17 (C-Γ), 44,78 (CH2 Bn); EM (IE): mfz (%) 333 ( 100) (M+), 282 ( 1 3 ), 236 (6). 192 (1 1 ), 177 (9), 162 (5), 1 6 (8), 331 (1 1), 103 (7). Anal. cale, para CiéHisNjO* (313,31 ): C 61 ,34; H 4,83; N 13,41. Encontrado: C 63 ,57; H 4,69; N 13,68. 13
2-Bencil-l-{3~hi koxipropil)-5-Miro-] ~dihidro-3^^^ (10), Rendimiento;
0,58 g (48%). Pf 141-143 °C (2-PrOH). Ή RM [300 Hz, (CD3)2SO]: S 8,52 (i J - 2,4 Hz, 1H, 4-H), 8.36 (dd, J - 9,3, 2,4 Hz, 1 H, 6-H), 7,62 (d, J » 9,3 Hz, 1 H, 7-H), 7,26 (m, 5H, H aromál. Bn), 5, 18 (s, 2H, CH2 Bn), 4,58 (t, J - 4,8 Hz, 1 H. OH), 4,09 (i, J = 7,0 H¾ 2H, Γ-Η), 3,23 (m, 2H, 3'-H), 1 ,45 (m, 2H, 2'-H); i3C RMN [75 MHz, (CDjfcSO]: S 160,88 (C-3), 148,64 (C-7a), 141,19 (C-5), 136,12 (C-l Bn), 328,71 (C- 3, -5 Bn), 127,81 (C-4 Bn), 327,24 (C-2, -6 Bn), 327,05 (C-6), 120,47 (C-4), 1 35,46 (C-3a), 1 1 3 ,97 (C-7), 57,50 (C-3'), 44,77 (CH2 Bn), 44,08 (C-Γ), 29,26 (C-2'); EM (ES*): m z (%) 350 (40) ([M+Naf), 328 (100) ([M+H]+). Anál. cale, para CnHnNjQ* (327,33): C 62,38; H 5,23; N 12,84. Encontrado: C 62,19; H 5,57; N 13,09.
2-B nc\l-¡-(2'metoxietñ)-5-mtro- 2-áihidro- {11). Rendimiento:
0,78 g (64%). Pf 3 36-3 38 (2-PrOH). !H RMN [300 MHz.
Figure imgf000016_0001
S 8.50 (d, J - 2,3 Hz, 1H, 4-H), 8,32 (dd. J ~ 9,3, 2,1 Hz, 1H, 6-H), 7,62 (d, J - 9,3 Hz, 1 H, 7-H), 7,25 (m, 5H, H aromát. Bn), 5,18 (s, 2H, CH2 Bn), 4,23 (t, J - 5,0 Hz, 2H, 1 '-Η), 3,35 (t, J™ 5,0 Hz, 2Ϊ-1, 2'-H), 2,98 (s, 3H, CHj); !3C RMN [75 MHz, (CDjfeSO]: S 161,10 (C-3), 349,54 (C-7a), 143 ,05 (C-5), 136,13 (C-i Bn), 328,76 (C-3, -5 Bn), 127,86 (C- 4 Bn), 127,27 (C-2, -6 Bn), 126,73 (C-6), 120,35 (C-4), 1 14,92 (C-3a), 1. 12.45 (C-7), 68,92 (C-2'), 58,35 (CH3), 47,67 (C-Γ), 44,94 (CH2 Bn); EM (ÍE): m/z (%) 327 (100) (M÷), 282 (21 ), 250 (4), 236 (4), 206 (2), 177 (9), 331 (7), 1 3 (4). Anál. cale, para G7H17N3Q4 (327,33): C 62,38; H 5,23; N 12,84, Encontrado: C 62,57; H 5,37; N 12,57. 2-Benci¡-3-{2-hidroxieíoxi)-5-niíro-2H-md zo¡ (21). Rendimiento: 0,23 g (38%), Pf 167-169 °C (2-PrOH). Ή RMN [300 MHz, (CDj)2SOj: S 8,90 (d, 2, 1 Hz, 1 H, 4- H), 7,93 (dd, J = 9,6, 2,3 Hz, 1 H. 6-H), 7,53 (d, J -~ 9,6 Hz. 3 H. 7-H), 7.31 (m, 5H, H aromát. Bn), 5,50 (s, 2H, C¾ Bn), 5,36 (í, J = 5,5 Hz, OH), 4,72 (t, J == 4,5 Hz, 2H, Γ-Η), 3.83 (m. 2H, 2'-H): °C RMN [75 MHz, (CD^SOJ: S 149,99 (C-3), 146,92 (C- 7a), 140,39 (C-5), 335,93 (C-l Bn), 328,61 (C-3, -5 Bn), 328,03 (C-2, -6 Bn), 127,88 (C-4 Bn), 120,86 (C-4), 1 19,91 (C-6), 1 18,03 (C-7), 105,33 (C-3a), 76,43 (C-Γ), 59,77 (C-25), 53 ,49 (Oh Bn); EM (ÍE): m z (%) 313 ( 100) (M+), 269 (58), 252 (34), 222 (7), ¡ 91 (41 ), 164 (7), 149 (4), 103 (14). Anal. cale, para ^His ^ (313,31 ): C 61 ,34; H 4,83; N 13,41. Encontrado: C 61 ,49; H 5,97; N 13,55.
2-Bericil-3-(3- idroxipropoxi)-5~ íro~2H-ifidazol (22). Rendimiento: 0,12 g (10%). Pf 122-124 T (2-PrOH). Ή RM'N [300 MHz, (CD3)2SO.]: δ 8,89 (d, J ' = 2, 1 Hz, Ϊ Η, 4-H), 7,90 (dd, is 9,6, 2,1 Hz, 1 H, 6-H), 7,53 (d, J - 9,6 Hz, 1 H, 74-1), 7,32 (ra, 5H, H aroroát. Bn), 5,44 (s, 2H, C¾ Bn), 4,80 (t, J - 6,1 Hz, 2H, Γ-Η), 4,68 (t, J - 5,2 Hz. 1 H, OH), 3,60 (m, 2H, 3'-H), 1,97 (ra, 2H, 2'-H); C RMN [75 MHz, (CDs^SOj: S 149,82 (C-3), 146,84 (C-7a), 140,14 (C-5), 135,81 (C-1 Bn), 128,64 (C-3, -5 Bn), 127,90 (C~4 Bn), 327,82 (C-2, -6 Bn), 121,00 (C-4), 1 19,90 (C-6), 1 18,02 (C~7), 104,94 (C-3a), 71, 16 (C-Γ), 56,75 (C-3'), 51 ,64 (C¾ Bn), 32,36 (C-2'); EM (ES+): m z (%) 350 (27) ([M+Naf), 328 (100) {[M+H]*). AnáL cale, para CnH^NaOi (327,33): C 62,38; H 5,23; N 12.84. Encontrado: C 62,09; H 5,52; N 13,09. -^nd/-i-f2-/we oxi tóJc/i-5-m7ro-2H-m^í/ (23). Rendimiento: 0,39 g (32%). Pf 109-1 1 1 °C (2-PrOH). !H RMN [300 MHz, (CD3)jSOj : <5 8,88 (d, 2, 1 Hz, 1 H, 4- H), 7,90 (dd, J - 9,6, 2,1 Hz, I R 6-H), 7,53 (d. J === 9,6 Hz, 3 H, 7-H), 7,30 (m, 5H. H aromát. Bn), 5,45 (ss 2H, CH2 Bn), 4,82 (m, 2H, Γ-Η), 3,74 (m, 2H, 2'-H), 3,32 (s, 3H, CH3); i3C RMN [75 MHz, (CDjfcSO]: 6 149,70 (C-3), 146,89 (C-7a), 140,28 (O 5), 135,82 (C-1 Bn), 128,62 (C-3, -5 Bn), 127,91 (C-2, -4, -6 Bn), 120,75 (C-4), 1 1 ,92 (C-6), 1 18.07 (C-7), 105,36 (C-3a), 73,70 (C-Γ), 70,38 (C-2'), 58,22 (C¾), 53 ,61 (CH2 Bn); EM (ΪΕ): m/z (%) 327 (100) (M*), 269 (7), 252 (4), 222 (5), !93 (4), 164 (7), 349 (4), 103 ( 33). Añil. cale, para CnHr; ¾(> (327,33): C 62.38; H 5,23; N 12,84. Encontrado: C 62,50; H 4,97; N 12,63.
Ejemplo Ib. Preparación del propargil derivado 2. Una mezcla agitada de la 2- bencilindazoiinona 1 (1,00 g, 3,71 rnmol), bromuro de propargilo (80% en peso en tolueno) (4,00 ramo!) y 2CO3 (0,55 g, 4,00 mmol) en acetona (50 mi) se refluyó durante 32 h. La mezcla se evaporé a sequedad y, después de la adicién de agua (200 raL), se extrajo con CHCb (3 x 50 mL). La fase clorofórmica concentrada se aplicó a una columna de cromatografía que se eluyó' con mezclas de cloroformo/acetona (50:1 a 30: 1 ) para proporcionar el compuesto 2. 2~Ben !-5-ntiro~ i~pmpargii~i, 2~dihidro~3H-indazol~3-ona (2). Rendimiento: 0,62 g (54%). Pf 163- 165 °C (EtOH). Ή RMN [300 MHz, (CD3)2SO]: ó 8,52 (d. 2,1 Hz, ! H, 4-H), 8,47 (dd, J » 9,0, 2, 1 Hz, 1 H, 6-H), 7,80 (d, J - ,0 Hz, 1 H, 7-H), 7,27 (m, 5H, H aroraát Bn), 5,12 (s, 2H, CH2 Bn), 4,96 (d, J - 2,1 Hz, 2H, Γ-Η), 3, 16 (í, J - 2,1 Hz, I H, 3'-H); f 3C RM [75 MHz, (CDÍ'JJSO] : S 161 ,48 (C-3), 151 ,61 (C-7a), 143,1 1 (C-5), 136,09 (C- l Bn), 128,56 (C-3, -5 Bn), 127,75 (C-4 Bn), 127,60 (C-6 y C-2, -6 Bn), 1 19,89 (C-4), 1 18,77 (C-3a), 1 14,02 (C-7), 76,58 (C-2'), 75,95 (C-3!), 44,69 (Cl¾ Bn), 38,52 (C-Γ); EM (1E): mfe (%) 307 (100) (M*), 268 ( 13), 249 (5), 230 (3), 203 (4), 128 (5), 1 15 (4). 103 (1 1 ). Anái. cale, para C^Hu sOi (307.30): C 66,44; H 4,26; N 13,67. Encontrado: C 66,58; H 4,47; N 13,59.
Ejemplo le. Preparación de ios 2-bromoeiil (3/17) y 3-bromopropii (4/18) derivados. Una mezcla agitada de ía 2-bencilindazolinona de partida 1 (2,00 g, 7,43 mmei), el α,ω-dibronioalcano requerido (40,00 mniol) y K2CO3 ( 1 ,10 g, 8,00 mmol) en DMF (50 mi.) se calentó a 100 °C durante 3 h. La mezcla se evaporó a sequedad y. después de la adición de agua (200 mL), se extrajo con CHCh (3 x 50 mL). La fase orgánica se secó (MgS;), se concentró y se aplicó a una columna de cromatografía que se eluyó con mezclas de cloroformo/acetona (50:1 a 25: 1 ).
A partir de 1,2-dibromoetano se obtuvieron, en este orden de elución, el indazoS 2,3- disustituido Π, el 1 -vinilindazol 24 [70 mg (3%)) y la indazoiinona 1,2-disustkuida 3. Análogamente, a partir de 1 ,3-dibromopropano, se obtuvieron el correspondiente indazol 2.3-disustituido 18 v ¡a indazoiinona 1 ,2-disustituida 4.
2~Bencil-l'(2-bromoetü)~5-fíitro-lJ~dihidro-3\\-itá^ (3). Rendimiento:
1 ,20 g (43%). Pf 172-174 *C (2-PrOH). >H RMN [300 MHz, (C¾)?SO]: S 8,52 (d, J - 2,4 Hz, 1H, 4-H), 8,37 (dd, 9,0, 2,4 Hz, 1 H, 6-H), 7,75 (d, J = 9,0 Hz, 1 H, 7-H), 7,26 (ra, 5H, H aromát. Bn), 5, 19 (s, 2H. CH2 Bn), 4,53 (t, J - 6,3 Hz, 2H, 1 "-H), 3,51 (t, 6.3 Hz, 2H, 2'-H); BC RMN [75 MHz, (CDjfcSO]: d" 161,39 (C-3), 149,28 (C- 7a), 141 ,46 (C-5), 135,95 (C-l Bn), 128,75 (C-3, -5 Bn), 127,87 (C-4 Bn), 127,26 (C- 2, -6 Bn), 127,02 (C-6), 120,36 (C-4), 1 15,43 (C-3a), 1 12,59 (C-7), 47,67 (C-Γ), 45,23 (Clh Bn), 29,17 (C-2'); EM (IE): m/z (%) 377 (99) ([M- 2f), 375 ( 100) (M*), 361 (5), 359 (5), 347 (7). 345 (7), 256 (9), 254 (9), 192 (8), 177 (9), 164 (9), 145 (8), 131 ( 17), 103 (36). Anal cale, para CieH uBrNjOj (376,20): C 51 ,08; H 3,75; N 3 1 ,17. Encontrado: C 50,90; H 3,69; N 1 1 ,46. 2~BencH-l-(3-brom p^U)~5-míro-i ^hidro-31A-indazo¡-3~ona (4). Rendimiento: 0,90 g (31%). Pf 1 1 1- 1 13 °C (2-PrOH). Ή RMN (300 MHz, (CDsfcSO]: S 8,52 (d, J~ 2,5 Hz, 1 H, 4-H), 8.39 (dd, 9,1, 2,5 Hz, 111, 641), 7,65 (d, J :::: 9,1 Hz, 3 H, 7-H), 7,28 (m. 5H, H aromát. Bn), 5,38 (s, 2H, CH2 Bn), 4,14 (t, J- 7,3 Hz, 2H, i '-H), 3,36 (t, J « 6,6 Hz, 211 3'-H), 1,80 (m, 2R 2'-H); C RMN [75 MHz, (CDjfcSO]: Ó 160,98 (C-3). 148,73 (C~7a), 141,52 (C-5), 136,01 (C-l Bn), 128,72 (C-3, -5 Bn), 127,84 (C-4 Bn), 327,27 (C-6 y C-2, -6 Bn), 120,48 (C-4), 1 ! 5,87 (C-3a), 1 12,02 (C- 7), 45,52 (C-Γ), 44,89 (C¾ Bn), 30,83 (C-3'), 29,19 (C-2'); EM (ΪΕ): miz (%) 391 (98) (ίΜ 2Γ), 389 ( 100) (ίΜΊ), 361 (4), 359 (4), 345 (6), 314 (6), 332 (6), 282 (7), 192 (27), 149 (23), 146 (21), 331 (25), 103 (26). Anal. cale, para Ci7H i6Br 303 (390,23): C 52,32; H 4,13; N 10.77. Encontrado: C 52,58; H 4,37; 10,73.
2-Bemü-3~(2-bromoeiox¡)-5-mtro-2\\-indazol (17). Rendimiento: 0,84 g (30%). Pf 140-142 °C (2-PrOH). Ή RMN [300 MHz, (CD SOJ; S 8,88 (d, J - 2, 1 Hz, 1 H, 4- H), 7,91 (dd, J - 9,6, 2,1 Hz, 3H, 6-H), 7,56 (d, J - 9,6 Hz, I R 7-H), 7,32 (m, 5H, H aromát. Bn), 5,50 (s, 2H. CH2 Bn), 5,05 (m, 2H, Γ-Η), 3,93 te, 2H, 2'-H); °C RMN [75 MHz, (C1¾)2SC)]: Ó 148,91 (C-3), 146,86 (C-7a), 140,46 (C-5), 135.65 (C-3 Bn), 128,63 (C-3, -5 Bn), 328,03 (C-2, -6 Bn), 127,97 (C-4 Bn), 120,50 (C-4), 1 19,97 (C- 6), 3 38,16 (C-7), 305,33 (C-3a), 73,84 (C-F), 51,80 (CH2 Bn), 31,43 (C-2'); EM (IE): miz <%) 377 (60) {[M+2]*), 375 (61 ) (M÷), 268 (31 ), 252 (58), 222 (10), 199 (65), 397 (67), 191 (47), 164 ( 14), 349 (7), 1 17 (53 ), 109 (97), 307 ( 100). Anál cale, para CifJIsíBrNjC (376,20): C 51 ,08; H 3,75; N 1 1 ,37. Encontrado: C 50,91 ; H 3,70; N 1 ,47.
2~Bemil~3-{3-bromopropoxi)-5-mtro~2H~mda∑o! (IB). Rendimiento; 0,84 g (29%). Pf 124- 326 °C (2-PrOH). H RM R [300 MHz. (CDi^SO] : ó 8,88 (d, J - 2,4 Hz, i H, 4- H), 7,90 (dd, 9,6, 2,4 Hz, 3H, 6-H), 7,54 (d, J - 9,6 Hz, 311 7-H), 7,31 (m, 5H, H aromát. Bn), 5,4? (s, 2H, CH Bn), 4,82 (i, J - 5,8 Hz, 2H, Γ-Η), 3,66 (L 6,6 Hz, 2H, y-H), 2,35 {m, 2H, 2'-H); °C RMN [75 MHz, (CD. 2SO] : ¿ 149,37 (C-3), 146,81 (C-7a), 140,28 (C-5), 135,82 (C-l Bn), 128.63 (C-3, -5 Bn), 127.88 (C-4 Bn), 127,74 (C-2, -6 Bn), 120,76 (C-4), 1 19,91 (C-6), 1 18,09 (C-7), 104,92 (C-3a), 71 ,75 (C-Γ), 51,76 (CH2 Bn), 32,02 (C-2'), 30, 1 (C-3*); EM (IE): m z (%) 391 (99) ([M+2f), 389 (100) (M+), 280 (7), 269 (98), 252 (43), 222 ( 12), 191 (38), 164 ( 14), 123 (48), 121 (50), 103 (27). Anái, cale, para Cr H ;sBrN3; (390,23): C 52,32; H 4, 13; N 10.77. Encontrado: C 52,51 ; H 4.36; N 10.57.
Ejemplo Id. Preparación de los ('meíoxicarboml)metii derivados 5/19 y del ciartomeiil derivado 6. Una mezcla agitada de la 2-beneilindazolinona 1 ( 1 ,00 g, 3,73 mmol), bromoacetaío de metilo o bromoacetonitrilo (4,5 mmol) y N H O . (0,42 g, 5,00 mmol) en acetona (30 mL) se calenté a 35 °C durante 5 días. La mezcla se evaporó a sequedad y, después de la adición de agua {50 mL), el sólido precipitado se recogió por filtración. Para los compuestos 5/19, el sólido filtrado se lavó con acetona (2 x 5 mL) proporcionando el compuesto 5 puro (1,03 g). El filtrado se concentró a sequedad, se disolvió en cloroformo y eomatografió en una columna que se ek-yo con cloroformo y una mezcla de cloroformo/acetona (50:1 ) para dar, siguiendo este orden de elución, el compuesto 19 [0,04 g (3%)j y luego una cantidad adicional del compuesto 5 [rendimiento total: 1 ,18 g (93%)].
Para el compuesto 6, el solido filtrado se cromatografió directamente con mezclas de cloroformo/acetona (50: 1 a 30: 1 ) para proporcionar el l -cianomeíil derivado puro [0,84 g (73%)].
2-Bencil- 1 -{meíoxicarkaml)metil-5-nitra- 1.2-dihidra~3Yi-mda7.al-3~ona (S). Los cristales (2-PrQH) de este compuesto reblandecen a 150-170 °C; a continuación el producto vuelve a solidificar mostrando un pf posterior a 195-1 7 *€. Ή RMN [300 MHz, (CD3)2SO|: δ 8.54 (d. 2, 1 Hz, 1H, 4-H), 8,40 (dd, J- ,3, 2,1 Hz, IR ó-H), 7,67 (d, J - 9,3 Hz, 1 H, 7-H), 7,27 (m, 5R H aromát Bn), 5,15 (s, 2H, C% Bn), 5,09 (s, 2H, l'-H), 3,41 (s, 3H, C¾); nC RMN [75 MHz, (CD3)2SO]: δ 167,27 (C-2 160,83 (C-3), 150,13 (C-7a), 141 ,79 (C-5), 135,94 (C-l Bn), 128,55 (C-3, -5 Bn), 127,72 (C-4 Bn), 127,45 (C-2, -6 Bn), 127,30 (C-6), 120,10 (C-4), 1 16,30 (C-3a), 1 12,00 (C-7), 52,00 (C¾), 47,77 (C-1 44,87 (C¾ Bn); EM (ESI: miz (%) 705 (23) ([2 -;-Naf), 683 (25) {[2M-¡-H]÷), 364 (34) ([M+Na] ' ), 342 ( 100) ([M+Hf). Anál, cale, para ?H; 5N305 (341,32): C 59.82; H 4,43; N 12,31 - Encontrado: C 60,1 1 ; H 4,71 ; 12,59. 2-Bencil-! imometii~5 mtro-IJ-dihi&o-3K-m (6). Pf 146-148 *C (2-
PrOH). Ή RMN [300 MHz, (CD.v)2SO]: δ 8,57 (m, 2H, 4-, 6-H), 7,89 (d, J - 9.9 Hz, 1H, 7-H), 7,27 fm, 5H, H aromát. Bn), 5,43 (s, 2H, -Η), 5,1 (ss 2H, CH2 Bn); i3C RMN [75 MHz, (CDj SO] δ 161,86 (C-3), 151 ,58 (C~7a), 144,08 (C-5), 135,71 (C-l Bn), 128,66 (C-3, -5 Bn), 128,48 (C-6), 127,92 (C-4 Bn), 127,66 (C-2, -6 Bn), 120,14 (C-4), 1 19, 15 (C-3a), 1 14,23 (C-7), 1 14.04 (C-2'), 45, 13 (C¾ Bn), 38.00 {C-Γ); EM (!E): (%) 308 (87) (M+), 281 (100), 264 (3), 251 (4), 234 (4), 231 (5), 1 5 (14), 149 (6), 131 (5), 129 (5), 103 (19). Anál. cale, para C-Í&Hr . 03 (308,29): C 62,33; H 3,92; N 18,1 ?. Encontrado: C 62,45; H 3,72; N 18,01. 2-BencU-3-(metoxicarbonil)meioxi-S-mtro-2 \-mdazol (19). Pf 94-96 °C (2-PrOH). ! H
RMN [300 MHz, (CDi)2SOj: δ 8,83 (d, J » 2,2 Hz, 1 H, 4-H), 7, í (dd, J = 9,6, 2,2 Hz, I R 641), 7,57 (d, 9,6 Hz, 1H, 7-H), 7,33 (m, 511 H aromat. Bn), 5,54 (s, 2H, CHi Bn), 5,49 (s, 2H, i '-H), 3,74 (s, 3H, CH3); S3C NMR [75 MHz, (CD3) SO]: S 168,38 {C-2'), 148,71 (C-3), 146,80 (C-7a)> 140,56 (C-5), 135,63 (C-l Bn), 128,58 (C-3, -5 Bn), 127.87 (C-2, -4, -6 Bn), 120,15 (C-4), 1 19,88 (C-6), 1 18,20 (C-7), 105,15 (C-3a), 69,52 (C-Γ), 52,22 (C¾), 51 ,84 (C¾ Bn); EM (IE): miz (%) 341 ( 100) (M , 325 (1 ), 282 (2), 268 ( 16), 252 (2), 236 (2), 222 (2), 191 (2), 164 (2), 103 (3). Anál. cale, para C S ?HÍ S 305 (341,32); C 59,82; H 4,43; N 12,31. Encontrado: C 59,53; H 4,67; N 12,57.
Ejemplo le. Preparación de ¡os 2-(metoxicarboml)etU derivadas 7/20 y del 2- carboxieül derivada 25. Una solución agitada de la 2-bencilindazolinona 1 (1,00 g, 3,71 mmol), K2CO3 (1 ,38 g, 10,00 mmol) y bromuro de benciítributilarnonio (OJO g) en una mezcla de agua (20 mL) y tolueno (20 mL) se calentó a 100 °C durante 30 min y, a continuación, se añadió 3-bromoproptonato de metilo (0,84 g, 5,03 mmol), Cantidades adicionales de 3-bromopropionato de metilo (ca. 10 x 0,25 g) y, eventualmente, si fuera necesario, .2CG3 para mantener el pH básico, se fueron añadiendo durante 2 días cada 5-10 h. La mezcla de reacción se dejó: alcanzar la temperatura ambiente y luego se separó la fase de tolueno, se seco ( gSC ) y se evaporó a sequedad. El residuo obtenido se sometíd a cromatografía en una columna usando mezclas de cloroformo/acetona (50: 1 a 10:1 ) para dar, siguiendo este orden de elución, eí compuesto 20 [0, 15 g (1 !%)] y luego el compuesto 7 [0,56 g (42%)].
La fase acuosa restante se acidificó con HCi acuoso conc. ( H 1) y el sólido precipitado se recogió por filtración, se secó y se aplicó a una columna de cromatografía que se eluyó primero con cloroformo/metanol (50:1 a 10:1 ) y luego con cloroformo/metanol ( 10:1) conteniendo leído acético (0,5%), para obtener, en este orden de elución, la indazolinona de partida 1 recuperada [0,07 g (7%)] y después el ácido 25 [0.33 g (26%)].
2~Bencil-l-[2-(metox¡carhonil}eti!]-5-n!^ (7). Pf 127- 29 °C (2-PrOH). ¾H RMN [300 MHz, (CDjhSC)]: δ 8,50 (d. J = 2, 1 Hz, 114, 444), 8.37 (dd. J = 9,0, 2,1 Hz, 1H, 6-H), 7,68 (d, J - 9,0 Hz, 1 H. 741), 7,25 (m, 5H, H aromát. Bn ), 5,16 (s, 2H, CH2 Bn), 4,32 (i, 6,5 Hz, 2H, -Η), 3,43 (s, 3Ii C¾), 2,36 (t, J- 6,5 Hz, 2H, 2*-H); °C RMN [75 MHz, (CD. 2SO]: 5 170,82 (C~3!), 161,31
Figure imgf000022_0001
2-Bencil-3'[2-(metex¡carhenü)eíoxi]-5-nitro~2 ^ (20). Pf 130432 °C (2- PrGH). ¡H RMN [300 MHz, (CD^sSO]: δ 8,90 (d, J- 2,1 Hz, 1 H, 444), 7,91 (dd, » 9,6, 2,1 Hz, I H, 6-H), 7,55 (d, J - 9.6 Hz, 3 H, 7-H), 7,30 (m, 5ÍL H aromát. Bn), 5,42 (s, 2H, CH2 Bn), 4,90 (t, J~ 5,7 Hz, 2H, -Η}, 3,64 (s, 3H, CHj), 2,95 (t, J - 5,7 Hz, 2'-H); Í3C RMN [75 MHz, (CD3)2SOj : δ 170,83 (C-3*), 149,22 (C-3), 146,85 (C-7a), 140,42 (C-5), 135,69 (C-l Bn), 128,61 (C-3, -5 Bn), 127,90 (C-2, -4, -6 Bn), 120.51 (C-4), 1 19,95 (C-6), 1 18, 14 (C-7), 105,34 (C~ 3a), 70.38 (C-Γ), 51.68 (C¾ Bn, CHj), 34, 10 (C-2'); EM (ÍE): miz (%) 355 (22) (M+), 324 (3), 91 ( 100). Anal. cale, para CssHs-NjOs (355,34): C 60,84; H 4,82; N 1 1,83. Encontrado: C 60,99: H 5,1 1 : N
1 1,53.
2-Bemif-l-(2~carhoxieril)~5~mtro-lJ-dmdro^ (25). Pf 224-226 °C (EiOH/I-hO). !H RMN [300 MHz, (CD^SOJ: δ 12,39 (s, 1 H, COOH), 8,50 (d, J -
2.1 Hz, 1H, 4-H), 8,37 (dd, 9,3, 2,1 Hz, 1 H, 6-H), 7,69 (d, ,3 Hz, I B, 7-H), 7,26 (m, 5H, H aromit. Bn), 5,17 (s, 2H, CHi Bn), 4,27 (t, 6.9 Hz, 2H, 3 !-H), 2,26 (t, J - 6,9 Hz, 2H, 2*-H); ,JC 11MN [75 Hz, (CDjfcSO]: δ 171 ,87 (C-3*), 161,27 (C- 3), 149,01 (C-7a), 141,64 (C-5), 136,05 (C-l Bn), 128,73 (C-3, -5 Bn). 127,83 (C-4 Bn), 127,29 (C-2, -6 Bn), 127,14 (C-6), 120,29 (C-4), 1 16,22 (C-3a), 1 12,68 (C~7), 44,96 (C¾ Bn), 43,07 (C-Γ), 30,48 (C-2'); E (ES+): m z (%) 705 (5 ! ) ([2 -t-Naj+), 683 (35) ([2M Hf), 364 (65) ([M÷Na]+), 342 (100) {[M+Hf). Anál. cale, para CI?H ISN3QS (341.32): C 59,82; H 4,43; N 12,31 , Encontrado: C 59,60; H 4.66; N 12,60.
Ejemplo Jf. Aícoxkarbonilaáén, acil ción y s lfomlaciún de ¡a 2-benál-5~ mtroindazolin-3'θηα í: preparación de aicoxicarbonil (12. 13), acil (14. 15) y tosí! (16) derivados. A una solución agitada de la 2-bencilindazoHn-3-ona 1 (1,00 g; 3,71 mino!) en píridina ( 15 mL), se añadieron lentamente el cloroformiato de alquilo requerido (4,00 mmol) (para 12, 13), anhídrido acético (2,0 mL, exceso) (para 1 ) o el correspondiente cloruro de ácido (3,90 mmol) (para 15, 16). La mezcla de reacción se calentó a 100 °C durante 3 h (para 14), o se agitó a temperatura ambiente durante I h (para 12, 13, 15 y 16), y después se vertió en agua (100 mL). El solido precipitado se recogió por filtración, se lavé con HCI acuoso al 2% (50 mL) y con agua abundante, y se secó al aire.
2~Bencii-!~eMxtearboml~5~mtro-l ^ihidro-3H-w^ (12). Rendimiento:
1,20 g (95%). Pf 135-137 °C (EtOH). Ή RMN [300 MHz, (CD^SOJ: Ó 8,56 (d, J -
2.2 Hz, 11-i 4-H), 8,52 (dd, J - 9,0., 22 Hz, !H, 6-H), 8,00 (d, J = 9,0 Hz, 1H, 7-H), 7,26 (m, 3H) y 7,1 1 (m, 2H) (H arornSí. Bn), 5,33 (s, 2H, CH2 Bn), 4.39 (c, J - 7,0
Hz, 2H, CH2 Et), 130 (t, J = 7,0 Hz, 3H, C¾); l3C RMN [75 MHz, (CD3)2SO]; δ 162,58 (C-3), 149,48 (COO), 145,57 (C-7a), 144.18 (C-5), 135,33 (C-l Bn), 128,88 (C -6), 128.66 (C-3, ~5 Bn), 127,96 (C-4 Bn), 127,41 (C-2, -6 Bn), 119.63 (C-4), 118,19 (C-3a), i 16,35 (C-7), 64,75 (CH2 Et), 49,98 (C¾ Bn), 13.83 (CH3); EM (ES+): m/z {%) 705 (39) (pM+Naf), 683 (75) ([2M+H]*), 364 (15) ([M+Naf), 342 (100) ( -Hf). Anál. cale, para STHSSNJOS (341,32): C 59,82; H 4,43; N 12,31. Encontrado: C 60.04; H 4,17; N 12,1.9.
2-Bmcil-l-bencilox¡carbonil'5' íro-l -díhidm-3ll- (¡3), Rendimiento: 1,45 g (97%). Pf 143-145 °C (2-PrOH). SH RMN [300 MHz, (CDjfeSO]: δ 8,56 (d, J = 2,1 Hz, IH, 4-H), 8,51 (dd. J» 8,9, 2,1 Hz, 1H, 6-H), 7,99 (d, J - 8,9 Hz, 1H, 7-H), 7,42 (ni, 6H), 7,23 (m, 2H) y 7,00 (m, 2H) (H aromát. O- y NBn), 5,44 (s, 2H. C¾ OBn ), 5,30 (s, 2H, C\ NBn); nC RMN [75 MHz, (CD SO]: δ 362,66 (C-3), 149,44 (COO), 145,56 (C~7a), 144,27 (C-5), 135,05, 134,47 (C-I, y O- y NBn), 128,95 (C-6), 128,81, 128,78, 328,64 (2 señales superpuestas), 128,01, 127,49 (O- y NBn, y C-2, -3, -4, -5, -6), 119.70 (C-4), 118,29 (C-3a), 116,30 (C-7), 69,67 (OCH2), 49,95 (NCH2); EM (ES+): m/z {%) 829 (68) (2M+Na]+), §07 (36) ([2M+H]*), 426 (22) ([M-Na]+), 404 (100) ([Μ+Hf)· Anal caíc. para C22H17N3O5 (403,39): C 65,50; H 4,25; N 10,42. Encontrado: C 65,59; H 4,06; N 10,16. !-Ace ¡-2~bencU-S-m(ro-L2-dihidro~3H ndazoi~3-ona (14). Rendimiento: 1,03 g (89%). Pf 165-367 °C (2-PrOH). >H RMN [300 MHz, (CDjkSOj: δ 8.56 (d, 2,1 Hz, 1H, 4-H), 8.50 (dd. i - 9,3, 2,1 Hz, 1H, 6-H), 8,30 (d, J ==== 9,3 Hz, 1H, 7-H), 7,25 (m, 3H) y 7,11 (m.2H) (Ή aromát. Bn), 5,33 (s, 2H, CI-h), 2,57 (s, 3H, CH3); °C RMN [75 MHz, (CDjkSO]: δ 168,37 (CO Ac), 164.05 (C-3), 145,89 <C-7a), 144,11 (C-5), 135,12 (C-3 Bn), 128,92 (C-6), 128,67 (C-3, -5 Bn), 128,02 (C-4 Bn), 127,57 (C-2, -6 Bn), 119.69 (C-4), 118,52 (C-3a), 116,18 (C-7), 51,14 (CH2), 24.98 (CH3); E (ES"): m/z (%) 645 (44) ([2M÷Naf), 623 (3) ([2M÷Hf), 334 (62) ([M+Naf), 312 (100) ([M+Hf). Anál. caíc, para C½HB 30 (333,29): C 61,73; H 4,21; N 13,50. Encontrado: C 61,50; 114,47; N 13,59.
2'Bencil-¡-benzoil-5-mírO'l -dihidrO"3\i~mda∑oí-3-ona (JS). Rendimiento: 1,36 g
(98%). Pf 164-166 °C (2-PrOH).5H RMN [300 MHz, (CDsfcSGj: β 8,59 (d, 2,4 Hz, 1 H, 4-H), 8,28 (dd, J -· 9,3, 2,4 Hz, 1 H, 6-H), 7,76 (dd, J - 7,6, 7,6 Hz. 1 H« 4-H Bz), 7,57 (dd, J - 7,6, 7,6 Hz, 2H. 3-, 5-H Bz), 7,41 (d, 7,6 Hz, 2H, 2-, 6-H Bz),
7.27 (ra, 3H) y 7,08 (ra, 2H) (H aromát. Bn), 6,48 (d, J :::: 9,3 Hz. 1 H, 7-H), 5,27 (s, 2R CH2); °C RMN [75 MHz, (CD3}2SO.]: δ 164,76 (CO Bz), 162.18 (C-3), 145,08 (C-7a), 144,03 (C-5), 134,84 (C-l Bn), 134, 18 (C-4 Bz). 132,62 (C-l Bz), 129,51 (C- 3, ~5 Bz), 129, 15 (C-2, -6 Bz), 128.84 (C-3, -5 Bn), 128,53 (C-4 Bn), 128.29 (C-6), 127,72 (C-2, -6 Bn), 120.1 1 (C~4), 1 17,85 (C-3a), 1 14,09 (C-7), 48,84 (C¾); E (ES*): m/z (%) 769 (72) ([2M- Na]+X 747 (44) ([2M+Hf), 396 (26) ([M+Na]*), 374 ( 100) ί[Μ-¾~ΗΓ). Anál. cale, para C- Hss jO* (373,36): C 67,56; H 4,05; N 1 1,25. Encontrado: C 67,40; H 4,27; N 10,97.
2~BencU-5-n ro~!~íosU-¡ -díhidro-3\-l-indazol-3-ona (16). Rendimiento: 1.54 g (98%). Pf 162-164 ; C ( 1-PrOH). Ή RMN [300 MHz, (CDs^SO]: δ 8,58 (dd, i - 9,0, 2,1 Hz, 1H, 6-H), 8,40 (d, J 2, 1 Hz, 1H. 4-H), 8,14 (d, J - 9,0 Hz, 1 H, 7-H), 7.44 (d, ,1 - 8,4 Hz, 2H), 7,29 (m, 5H) y 7,20 (m, 2H) (H arornát. Bn y Ts), 5,34 (s, 2H, CH2),
2.28 (s, 3H, CHi); i3C RMN [75 MHz, (CD3)2SOj: δ 163,57 (C-3), 147,75 (C-7a), 147,23 (C-4 Ts), 146,29 (C-5), 135,1 1 (C-l Bn), 130,04 (C-3, -5 Ts), 129,36 (C-6), 128,69 (C-3, -5 Bn), 128.60 (C-2, -6 Ts), 128,20 (C-2, -6 Bn), 128, 12 (C-4 Bn), 126,74 (C- l Ts), 121 ,33 (C-3a), 1 19,91 (C-4), 1 19,08 (C-7), 50,19 (CH2), 21 .1 1 (CHj); EM (IE): m/z (%) 423 (4) (M+), 268 (41 ), 155 (4), 91 (100). AnáL cale, para C21H17N3OSS (423.44): C 59,57; H 4,05; N 9.92. Encontrado; C 59,50; H 4,17; N 10,09
EJKMPLO 2. Preparación úe los compuestos 24-31 [tipo (I)] a partir de los comp est s 3, 4, 7-9 y 26 ¡tipo (I)],
Los compuestos 24-31 se obtuvieron (Esquema 2) a partir de algunas de las indazo Uñonas 1,2-disustituidas incluidas en el Esquema 1, siguiendo diferentes procedimientos. Asi. el -vinil derivado 24 se preparó a partir del 2-bromoetil derivado 3 a través de una reacción de deshidrohalogenaeión. El derivado de ácido propióniec 25 se obtuvo, junto con el éster 7, en la alquiíación de la indazolinona 1 con 3-bromopropionaío de metilo segón el procedimiento del Ejemplo le, por hidrólisis parcial del éster inicialmenie formado en el medio básico de reacción; dado ,
25 su origen, el compuesto 25 se describe en el Ejemplo 1 . El derivado de ácido butírico 26 se obtuvo por hidrólisis (LiOH) del correspondiente éster 8. La butiraraida 21 y la A'-metiibutíramida 28 se obtuvieron por tratamiento del éster etílico 8 con amoniaco o metilamina, respectivamente; la ^/V-dimetHbuíiramida 29 se preparé a partir del cloruro del ácido 26 (SOCb) y di metilamina. El 3-etoxipropil derivado 30 se aisló" de un intento de preparación del 3-hidroxipropü derivado 10 a partir del bromuro 4 y NaOH en elanol agua. Por último, el 2-acetoxietil derivado 31 se preparó por acetilación (Ac;?Q) del correspondiente 2-hidroxietii derivado 9. Ejemplo 2a, Preparación del vinii derivado 24. Una solución de la ! -(2- bromoeíil)índazoHnona 3 (0,56 g, 1 ,49 mmol) y piperidina (0,35 g, 4,1 1 mmol) en etanol (20 mL.) se calentó a reflujo durante 48 h. La solución se evaporó a sequedad y, después de la adición de HC1 acuoso ai 2% (50 mL), se extrajo con cloroformo (3 x 50 mL). La fase orgánica se secó (MgSOí) y se evaporó a sequedad para proporcionar el compuesto deseado; resultados similares se obtuvieron usando metilamina (33% p/p en solución etanólica}.
El compuesto 24 también se obtuvo como un subproducto en la aiquilación de la 2- bencilindazolinona 1 con 1 ,2-dibromoeíano (véase más arriba. Ejemplo 1 c), 2-Bencii-5-nitro-l-vinil-I -dihidro-3 -mdazol-3-ona (24). Rendimiento: 0.41 g (93%). Pf 1 Í 6-1 18 °C (2-PrOH). JH RM [300 MHz, {CD^bSO]: 8 8,53 (d, «/ « 3,0 Hz, ÍH, 4-H), 8,40 (dd, 9,3, 3,0 Hz, 1 H, 6-H), 7,71 (d, J - 9,3 H¾ 1 H, 74-1), 7,26 (m, 3H) y 7, 1 5 (m, 2H) (H aromát. Bn), 7,08 (dd, J - 14,7, 9,0 Hz, !H, -Η), 5,25 (dd, J - 14,7, 1 ,4 Hz. I H, 2'-H^), 5,20 (s, 2Ii CH2 Bn), 5,10 (dd, J - 9,0, 1,4 Hz, 1 H, 2' Í ); °C RMN [75 MHz, (CDjfcSO]: δ 162,05 (C-3), 146,73 (C~7a), 142,10 (C-5), 135,48 (CM Bn), 129,93 (C- Γ), 128,66 (C-3, -5 Bn), 128,07 (C-6), 127,90 (C-4 Bn), 127,38 (C-2, -ó Bn), 120.43 (C-4), 1 15,46 (C-3a), 1 12,13 (C-7), 104,68 (C-2'), 47,00 <CH2 Bn); E (ΪΕ): miz (%) 295 ( 100) (ϊνΓ), 280 (2), 265 (2), 218 (2), 158 (3), 145 (3 ), 1 16 (7), 104 (9). Anal, cale, para CieHuNjOs (295,29): C 65,08: H 4,44; N 14,23. Encontrado: C 65,30; H 4,46; N 14,07. Ejemplo 2b. Preparación del ácido 4~(m' dazol-}-il)butirico 26. Una mezcla de! ésíer etílico § (0,50 g, 1 ,30 mmol) y LiOH (0,16 g, 6,68 mmol) en THF H20 (1 : 1 , 20 mL) se agitó a temperatura ambiente durante 12 h, A continuación, el THF se evaporé y la solución acuosa se acidificó con HC1 acuoso conc. ( H 1 ), El sólido precipitado se recogió por filtración, se lavó con HCl acuoso ( ! ; 3 x 3 mí.) y se secó al aire.
2~Bencil-l~(3~carboxipropil)-5-niiro~j,2-dihidro-3H-! (26). Rendimiento: 0,42 g (91%). Pf 202-204 «C (EtOH/HbO). Ή R (300 MHz, (CD3)2SO]: 8 12,20 (s, 1H. COOH), 8,52 (d, J = 2,4 Hz, 1H, 4-H), 8.37 (dd, J - ,3, 2,4 Hz, 1 H, 6-H), 7,62 (d, J = 9,3 Hz, 1 H, 7-H), 7,27 (m, 5H, H aromát. Bn), 5,20 (s, 2H, C¾ Bn), 4,05 (t, 7.5 Hz, 2H, Γ-Η), 2,15 (t, J - 7,2 Hz, 2H, 3'-H), 1 ,50 (m, 2H, 2'-H); !3C RMN [75 MHz, (CD3¾SO]: δ 173,61 (C-4'), 160,81 (C-3), 148,53 (C- 7a), 141,31 (C-5), 136,13 (C-l Bn), 128,72 {C-3, -5 Bn), 127,83 (C-4 Bn), 127,27 (C- 2, ~6 Bn), 127,17 (C-6), 120,55 (C-4), 1 15,62 (C-3a), 1 1 1,89 (C-7), 45,95 (C-Γ), 44,66 (C¾ Bn), 30, 15 (C-3'), 21,40 (C-2'); EM ÍES"): miz (%) 378 (20) {[M+Na]*), 356 (100) ([Μ+ΗΓ). Anal cale, para CnHnNjOs (355,34): C 60,84; H 4,82; N 1 1,83. Encontrado: C 60,59; H 4,97; N 1 1 ,68.
Ejemplo 2c Preparación de la amida 27 y de la N-meíiiamida 28. Para obtener el compuesto 27, una mezcla de ésíer etílico 8 (0,50 g, 1 ,30 mmol) y una solución saturada de amoníaco en meíanol ( 15 mL) se dejó en reposo a temperatura ambiente durante 10 días. Tras eliminar el disolvente y el amoníaco, con objeto de eliminar algunos subproductos, el residuo se eromatografió en una columna que se eluyÓ con una mezcla de cloroformo/metano! (25: 1) para proporcionar el producto requerido. Para obtener el compuesto 28, una mezcla de ésíer etílico 8 (0,50 g, 1 ,30 mmol) y metiiamina 8 M en etanol (20 mL) se dejó en reposo a temperatura ambiente durante 24 h. La mezcla de reacción se evaporó a sequedad, proporcionando la amida deseada.
2-Bencü-i '{3-carbamoilpropil)-5~mlrc } ~dihidro-$\\-irid^ (27). Rendimiento: 0,45 g (98%). Aceite que solidifica tras trituración con 2-PrOH; pf 106- 108 °C Ή RMN [300 MHz, (CDjfcSO]: δ 8,52 (d, J™ 2,1 Hz, 1H, 4-H), 8,36 (dd, J - 9,0, 2,1 Hz, 1H, 6-H), 7,62 (d. J ::: 9,0 Hz, 1 H, 7-H), 7,25 (m, 6H, H aromát. Bn y NHA), 6,79 (s ancho, 1 H, NHB), 5,21 (s, 2H, CH2 Bn), 4,03 (t, 7,3 Hz, 2H, 1 -H), 1,98 (t, J ::: 7,1 Hz, 2H. 3*-H), 1 ,51 (rn, 2H, 2*-H); i3C RMN [75 MHz, (O¾¾50]: δ 173,16 (C-4'), 160,73 (C-3), 148,40 <C-7a), 141,20 (C-5), 136,16 (C-ί Bn), 128,72 (C- 3, ~5 Bn), 127,82 (C-4 Bn), 127,25 (C-2, -6 Bn), 127,09 (C~6), 120,54 (C~4), Í 15,49 (C-3a), 1 1 1 ,87 (C-7), 46.18 (C-1 44,61 (CH2 Bn), 31 ,04 (C-3'), 21 ,77 (C-2'); EM (ES : m/z (%) 731 (15) ([2M+Naf), 709 (40) ([2M+H]+)> 377 (12) ([M+Naf), 355 ( 100) ([M÷H] - Anal. cale, para 08Ι½Ν4<>4 (354,36): C 61 ,01 ; H 5,12; N 15,81. Encontrado: C 61 ,30; H 4,92; N 15,57. 2-Bemil-l-{3~(meülcarbamoit)propil}-5-mtro-l,2~dihi& (28), Rendimiento; 0,45 g (94%). Pf 159-161 °C (2-PrOH). Ή RMN [300 MHz, (CQjfcSO]: δ 8,52 (d, = 2,1 Hz, 1H, 4-H), 8,36 (dd, J ~ 9,3, 2,1 Hz, 1 H, 64-1), 7,67 (c ancho, J :::: 4,5 Hz, 1H, NH), 7,6 (d, J ::: 9,3 Hz, 1 H, 7-H), 7,25 (m, 5H, H aromát. Bn), 5,20 (s, 2H, C\ Bn), 4.03 (í, 7,4 Hz, 2H, Γ-Η), 2,52 (d, 4,5 Hz, 3H, CH3), 1 ,97 (L J - 7,2 Hz. 2H, 3*-H), 1 ,53 (m, 2H, 2'-H); ,3C RMN [75 MHz, (CD3)2SO]: δ 171 ,32 (C«4!), 160,77 (C-3), 148,45 (C-7a), 141 , 19 (C-5), 136,15 (C-l Bn), 128,71 (C-3, -5 Bn), 127,81 (C-4 Bn), 127.24 (C-2, -6 Bn), 127,07 (C-6), 120,53 (C-4), 1 15,47 (C-3a), 1 1 1.87 (C-7), 46.16 (C-Γ), 44.63 (CH2 Bn), 31.27 (C-31), 25.40 (C¾), 22.01 (C-2!); EM (ES*): m/z (%) 759 (17) ([2M-Na]+), 737 (53) ([2M+H]*), 391 (22) ([M+Na]), 369 ( 100) ([M÷Hf). Ana!, cale, para C^H2oN 0 (368.39): C 61 ,95; H 5,47; N 15,21. Encontrado: C 61 ,75; H 5,77; N 15,50.
Ejemplo 2á. Preparación de la /N-dimetilamida 29, Una suspensión del ácido 26 (0,53 g, 1 ,49 mmol) y SOCb (1,00 mL) en CHCh (30 mL) se calentó a reflujo durante 1 h. Después de la evaporación del disolvente y del exceso de SGC½, se añadió al residuo aceitoso una solución de clorhidrato de dimetilamina (1 ,63 g, 19,99 mmol) y K2CO3 (2,80 g, 20,26 mmol) en agua (20 mL). La mezcla se agité vigorosamente durante 12 h y después el producto precipitado 29 se recogió por filtración, se lavé con agua (3 x 5 m.L) y se seco al aire.
2~Benai-l-[3-(dimetilcarhamoil)propi!]-5-nilro- (29), Rendimiento; 0,51 g (90%). Pf 144-146 *C (2-PrOH). Ή RMN [300 MHz, (CD3)jSO]: 58,52 (d, J - 2,1 Hz, 1H, 4-H), 8,37 (dd, J= 9.0, 2,1 Hz, 1H, 6-H), 7,60 {d, i - 9,0 Hz, 1 H, 7-H), 7,25 (m, 5R H aromát. Bn), 5,23 (s, 21L C¾ Bn), 4,04 (t, J - 7,5 Hz, 2H, Γ-Η), 2,80 (s, 3H, CH3 trarn), 2,78 (s, 3H, Ctfc e¿s), 2,19 (l, J - 6,6 Hz, 2H, 3'-H), í,51 (rn, 2H, 2'-H); , C RMN [75 MHz, (CD3)2SO]: δ 170,80 (C-4')t 160,69 (C-3), 148,39 (C-7a), 141,19 (C-5), 136,20 (C-l Bn), 128,71 (C-3, -5 Bn), 127,79 (C- 4 Bn)f 127,26 (C-2, -6 Bn), 127,04 (C-6), 120,53 (C-4), 115,51 (C-3a), 111.79 (C-7), 46.19 (C-Γ), 44,57 (C¾ Bn), 36.39 (Cl tram), 34.79 (C\h cu), 28.61 (C-3'), 21.47 (C-2'); EM (ÍE): miz (%) 382 (41) (NT), 337 (32), 310 (10), 291 (19), 282 (23), 268 (25), 246 (64), 232 (9), 21 (49), 192 (1 ), 172 (21), 128 (47), 114 (100), 106 (27). Anal cale, para C20H22N4O4 (382,4 i): C 62.82; H 5,80; N 14,65. Encontrado; C 62,99; H 5,96; N 14,51.
Ejemplo 2e. Preparación de! 3-eíoxipropil derivado 3Θ. A una solución del 1-Í3- bromopropíl) derivado 4 (0,59 g, 1,51 rnmol) en etanol (100 mL), se anadió NaOH (0,40 g, exceso) en agua (20 mL), y la mezcla se agitó a temperatiita ambiente durante 3 días. A continuación, se evaporó el etanol y la solución básica se extrajo con CHC'b (3 x 50 mL). La fase orgánica se secó (MgSO-s), se concentró y se eromaíografíó en columna con mezclas de cloroformo/acetona (50:1 a 25:1) para proporcionar el éter 30.
2~Be ü-¡--{3~eíoxipropti)--5-mtro-l -dihidm- (30). Rendimiento;
0,38 g (71%). Pf 93-95 °C (2-PrOH), Ή RMN [300 MHz, (CD&SOJ: δ 8,51 (d, J- 2,1 Hz, 1H.4-H), 8,36 (dd, J- 9,0, 2,1 Hz, 1H, 6·Η,\ 7,61 (d../ - 9,0 Hz, IR 7-H), 7,26 (m, 5H, H aromát. Bn), 5,17 (s, 2H, C¾ Bn), 4,09 (i, = 6,8 Hz, 2H, l'-H), 3,17 (c, J - 7, 1 Hz, CH2 Et), 3,09 (t, J === 6,0 Hz, 2H, 3*-H), 1 ,56 (m, 2H, 2'-H), 1 ,02 (t, J = 7,1 Hz, 3H, CHj); Í3C RMN [75 MHz, (CDjfcSO]: δ 160,94 (C-3), 148,64 (C-7a), 141,11 (C-5), 136,11 (C-l Bn), 128,71 (C-3, - 5 Bn), 127,80 (C-4 Bn), 127,21 (C-2, -6 Bn), 126,93 (C-6), 120,44 (C-4), 115,34 (C-3a), 111,88 (C-7), 66,16 (C-3'), 65.19 (CVÍ2 Et), 44.S7 (CH2 Bn), 44.09 (C-1'), 26.56 (C-2 1 ,90 (C¾); EM (IE): miz (¾) 355 (100) (Μ , 282 (3), 278 (4), 268 (4), 220 (4), 192 (13), 146 (7), 131 (4), 106 (4), 103 (4). Anal, cale, para CÍSHZIKICH (355,39): C 64,21; H 5,96; N 11,82. Encontrado: C 63,92; H 5,77; N 11,98. Ejemplo 2f, Preparación del 2-acetoxielil derivado 31. Una suspensión del l-(2- hidr xietil) derivado 9 (0,47 g. 1,50 raraol) en anhídrido acético (5 mL) se calentó a 100 eC durante 2 h. La reacción se evaporó a sequedad y el residuo se trituró con 2- PrOH (2 mL); el compuesto insoluble se recogió por filtración, se lavó con 2-PrOH (2 x 2 mL) y se secó al aire. l-(2~Aceíoxieííl)~2-ber¡cil-5-nílro~l -dihídro-3H- da (31). Rendimiento;
0,47 g (88%), Pf 168-170 °C (2-PrOH), j H RMN [300 MHz. (CDíbSOj: 5 8,51 (d. J- 2,4 Hz, 1H, 4-H), 8,38 (di J - 9,0, 2,4 Hz, 1 H, 6-H), 7,66 (d, J - 9,0 Hz, I H, 7-H), 7,25 (m, 5H, H aromát. Bn), 5,19 (s, 2H, CH2 En), 4,36 (t, J- 4,8 Hz. 2H, -Η), 4,07 (t, J ~ 4,8 Hz, 2H, 2'-H), 1,57 (s, 3H, CHj); ÜC RMN [75 MHz, (CDa.hSO]: δ 169,53 (CO Ac), 161.19 (C-3), 149,90 (C-7a), 14132 (C-5), 136,04 (C-l Bn), 128,73 ( C-3, - 5 Bn), 127,86 (C-4 Bn), 127,32 (C-2, -6 Bn), 126,84 (C-6), 120,33 (C»4), 1 15,51 (O 3a), 1 12,48 (C-7), 60,22 (C-2'}, 45,95 (C-1 44,81 (CH2 Bn), 20.08 (C¾>; EM (IE): m/z (%} 355 ( 100) (M÷), 325 (2), 295 (5), 2S2 (6), 204 (6), 177 (9), 131 (10), 103 (7), Anál. cale, para CuHn jOs (355,34): C 60,84; H 4,82; N 1 1 ,83. Encontrado: C 60,60; H 5,03; N 1 1 ,57. EJEMPLO 3. Estudio m vitro de la actividad de Sos derivados de indszol sobre epimastigotes de Trypanosoma cr zL
Los ensayos de actividad frente T. cruzl se llevan a cabo de acuerdo con un protocolo secueneial de cribado farmacológico in viíro en el que, en primer lugar, se realizan ensayos simultáneos de actividad frente a epimastigotes (forma extracelular) y citotoxicidad inespecííica en fibroblastos L929 (células hospedadoras de ios amastigotes. forma intraceluSar del parásito). Los epimastigotes son formas extraeelulares presentes solo en los insectos vectores (triatominos), pero dado que son fácilmente cultivables in viíro en el laboratorio, se usan para los cribados iniciales de actividad antichagásíca. Aquellos compuestos que resultan con una selectividad en epimastigotes igual o superior a la del benznidazo!, son seleccionados para un posterior ensayo de actividad sobre amastigotes (Fonseca-Berzal, C. eí ah, Bioorg. Med. Chem. Lea. 2013, 23. 48 1 -4856). Los amastigotes son parásitos íntraceluiares de las células de mamífero afectadas, por lo que los resultados obtenidos sobre ellos son mucho más significativos desde el punto de vista de la enfermedad de€ hagas en humanos.
Para evaluar ¡a actividad in vitro en. epimastigotes, se utilizaron cultivos a énicos de T. cr zi, cepa CL clon B5 transfectada de manera estable con el gen de la β- galacíosidasa (lacZ) de Escherickia coli (Buckner, F. et al, Arttimicrob. Agenis Chemoíher. 1996, 40, 2592-2597). Esta cepa presenta un comportamiento biológico similar ai de ia cepa CL parental que la hace id nea para el cribado farmacológico in vitro (Le-Senne, A. et al ., Mem. Inst Oswalda Cruz 2002, 97, 1 101 -1 105). La expresión de la enzima β-ga!actosidasa por el parásito da lugar a la reducción del sustrato cromogénico rojo de clorofenol β-D-galactopiranosido (CP G) a rojo de fenol. Dicha reacción colorímétrica es directamente proporcional al número de parásitos vivos, lo que permite estimar los porcentajes de actividad de les compuestos mediante espeetrofotometría.
Los cultivos de epimastigotes se mantienen a 28 *C en medio LIT suplementado al 10% (v/v) con suero bovino fetal ínactivado (56 °C, 30 min.), penicilina {100 UI/mL) y estreptomicina (100 ^ig/mL), realizando subcultivos semanalmente para mantenerlos continuamente en fase de crecimiento exponencial.
De acuerdo con el protocolo estandarizado por Vega, M. C. et al {Par sitoi. Res. 2005, 95, 296-298), posteriormente modificado por Fonseca-Berzai, C. et ai. (Bioorg. Med. Che . Lett. 2013, 23, 4851 -4856), los cultivos en fase de crecimiento exponencial se distribuyeron en placas de 96 pocilios a razón de 250.000 epimastigot.es/mi.. en volúmenes de 200 μΙ,/ροοί Πο y se incubaron junto con los compuestos a ensayar durante 72 h a 28 °C. Todos los compuestos se disolvieron en sulíoxido de dimetilo (DMSO) y se añadieron extemporáneamente a los respectivos medios de cultivo en concentraciones finales de 256-0, 125 μΜ La concentración final de DMSO en los cultivos nunca superó el 0,2% (v/v), no presentando a esta concentración efecto tóxico para células y parásitos. En cada placa se ensayó cada concentración por triplicado y se incluyeron controles de crecimiento, blancos de medio y de compuesto, así como un control interno con benznidazol, f!rmaco de referencia. Una vez transcurridas las 72 h, se procedió a revelar el ensayo mediante la adición de 50 μί/ρο ΐΐο de una solución de CPRG en 0,9% Tritón X-100
(concentración final 200 μΜ, H 7,4) y posterior incubación de las placas durante 3 h a 3? °C Finalmente, se determinó la absorbencia a 595 nm en un espectrofotómetro de placas {ELx808 ELISA reader, Biotek Instruments ínc.) y se estimaron los porcentajes de actividad mediante comparación del valor medio obtenido en los pocilios tratados con el valor medio de absorbencia que presenta el control de crecimiento.
Para cada compuesto, se estimé ía concentración necesaria para inhibir el 50% del crecimiento de los epimastigotes (O«o epimastigotes) a partir de la correspondiente curva dosis-respuesta (concentración ensayada vs porcentaje de actividad en epimastigotes). Los resultados de actividad se expresan corno la media de la Oso en epimastigotes ± desviación estándar (SD), a partir de los valores obtenidos en tres experimentos realizados de manera independiente (n ~ 3). Los resultados obtenidos se recogen en la Tabla 2. Puede observarse que los 3 -alco i -2-benci Hndazoles [compuestos de la serie (II)] presentan escasa actividad, mientras que muchas de las indazoiinonas 1 ,2-disusíituidas [compuestos de la serie (I)] presentan actividades, expresadas como Ose, muy superiores a la del benznidazol, fármaco de referencia (Oso :::: 22,73 μΜ). Destacan las indazoiinonas conteniendo en posición 1 grupos alquilo sustituidos tales como 2-bromocíilo 0). 3-bromopropilo (4), 2-hidroxietílo (9), 3-hidroxipropilo (10) o grupos alqueniío como vinilo (24), con valores de Cl<¾ ~ 1.58 - 2,90 μΜ. Los derivados con una cadena lateral de cido carboxilico (25, 26) así como los compuestos acilados en posición 1 (14, 15), al contrario, no presentan actividad.
EJEMPLO 4. Estudio m viíro de Ha ciíetoxiesdad inespeeífiea de los derivados de indazol fren e a fibroblastos murióos L929 y deter sínaeíórs de ím índices de selectividad (IS).
Con el fin de descartar cualquier efecto tóxico de los compuestos sobre células de mamífero, así como para determinar la selectividad de los mismos hacía T. cruzi se evaluó su citotoxicidad inespecífica en fibroblastos L 2 . Tabla 2. Actividad i» vííro frente a formas extraeelulares (epímastigoíes) e Intracdularex (amasttgoíes) de T. cmzi y ciiotoxicidad inespecífíca en fibroblastos murinos L929, expresadas como Cha y CL«¾. respectivamente.
Chs epimas- CL;e L929 SS3 Clss amasíi- is
Compuesto
tigotes ( ) (μΜ) epimastigoíes goíes(.u ) aniastigctes
2 10,79 ±4,80 1 5,27.±9,70 18,10 3,02 * 0,55 64,66
3 2,13*0,72 > 256 > 120,19 1,14*0.14 > 224,56
4 2,90* 0,37 25,19*3,16 8,69 -
5 26,171- i 1,3 i 128,89 ± 10,32 4,92 -
6 11,66*2,13 > 256 > 21,95 3,50 * 0,83 > 73,14
7 9,19 ± 1,20 > 256 > 27,86 2,93* 1,68 > 87,37
8 í 1,1 * 0,59 78,07 ± 8,02 7,01 - -
9 1,58*0,06 > 256 > 162,02 0,22 * 0,06 > 1.163,64
10 t,68-±0,36 > 256 152,38 0,25*0,12 > 1.024,00
11 6,56*0,87 > 256 > 39,02 2,29 ± 0,79 > 111,79
12 49,01 * 14,58 122,03 * 15,98 2,49
13 43,59* 5,4] 86,06* 1 ,66 L97 - -
14 >256 > 256 Dd - -
15 >256 145,52 *.6J0 < 0,57 - -
16 28,76*2,67 > 256 8,90 - -
17 > 256 256 TND - -
18 39,04 ± 13,42 59,04*4,61 3,51 - -
19 144,71 * 9,30 > 256 > 1,77 - -
20 > 256 > 256 ND -
21 > 256 > 256 ND -
22 64, 1 ± 8,34 > 256 > 3,94 - -
23 > 256 > 256 D -
24 2,75 ± 0,09 160,46* 14,89 58,35 0,47* OJO 341,40
25 > 256 > 256 ND -
26 .- 256 > 256 D - -
27 30,98 ± 3,94 256 > 8,26 -
28 13,29 * 0,92 > 256 > 19,26 1,50*0,23 > 170,6?
29 3,86*0,37 > 256 > 66,32 0,54 * 0,04 > 474,0?
38 6,57 ±0,2? i 70,41 *9,94 25,94 3,31 * 0,52 51,48
31 5,43 ± 1,89 > 256 >47,14 0,25*0,14 > 1 ,024
22,73 ± 3,33 > 256 11,26 0,68 * 0,08 > 376,47 índices de selectividad para epimastigotes (IS ~ CL.¾ L929 CIso epimastigotes).
índices de selectividad para amastigotes (IS ::: CL» L929 CIss amasiigotes).
¾o determinado.
° o evaluado en amastigotes por no alcanzar en epimastigotes el mín mo de selectividad establecido por ei fármaco de referencia (IScompu**. < l$8es∞»ítaa!)-
Los cultivos de L929 se mantienen a 37 aC y 5% CO2 en frascos de 75 cra^ de superficie, utilizando medio MEM sin rojo de fenol, supleraentado al 10% (v/v) con suero bovino fetal inactivado (56 °C, 30 min.), penicilina ( 100 Ul/mL) y estreptomicina ( 100 μ«/ηιΙ..).
La cifotoxicidad en fibroblastos L929 se determinó medíante íluorimetria en presencia del sustrato resazurina, indicador redox que al mismo tiempo sufre un cambio de color y emite fluorescencia en presencia de células metabólicamente activas (AlamarBIue® Assay, U.S. Patent No. 5,501 ,959).
Para la realización del ensayo, las células L929 se despegaron del frasco de cultivo mediante tripsinización. Para ello, tras retirar el medio de cultivo, se adicionó al frasco una solución de EDTA-tripsina y se incubó durante 5 min a 37 °C y 5% CO2. Esta mezcla se centrifugó 5 min a 1.500 rpm, se retiró el sobrenadante y se resuspendieron las células en medio MEM a una concentración de 15* 10* L929/mL, que se distribuyó en placas de 96 pocilios colocando 100 .uL/poeilío, Tras incubar las placas 3 h a 37 °C y 5% CO2 para favorecer la adhesión de las células, se descartó el medio de cultivo y se añadieron 200 μΙ7ροαϋο de los compuestos a ensayar diluidos en MEM fresco.
Las placas se incubaron durante 48 h a 37 °C y 5% CG2. Cada concentración se evaluó por triplicado y se incluyeron controles de crecimiento, blancos de medio y de compuesto, así como un control interno con benznidazol en cada placa. Finalmente, se añadieron 20 nL/pocillo de una solución de resazurina en 1% PBS (2 mM, pH 7) y se incubaron las placas durante 3 h a 37 °C y 5% CO2. La intensidad de fluorescencia se determinó' a 535 nro (excitación) y 590 nm (emisión) en un espectrofluorímetro de placas (Infinite 200, Tecan). El porcentaje de citotoxicidad se calculó mediante comparación de la señal de fluorescencia emitida por las células tratadas con respecto a la emitida por las células sin tratar (Fonseca-BerzaL C. et al., Bioorg. Meé. Ckem. Leit 2013, 23, 4851 -4856).
Para cada compuesto se estimó la concentración necesaria para inhibir el 50% del crecimiento celular (CL?o L929) a partir de la correspondiente curva dosis-respuesta (concentración ensayada vs porcentaje de citotoxicidad en fibroblastos). Los resultados de actividad se expresan como la media de la CLso -· SD, a partir de los valores obtenidos en tres experimentos independientes (n - 3). Los resultados obtenidos se recogen en la Tabla 2. Puede observarse que la mayor parte de ios compuestos activos frente a epimasíigotes (3, 9, 10 y 24) presentan mucha menor toxicidad que ei benznidazol frente a fibroblastos, por lo que sus 1S para epimastigotes son muy superiores a ios del fármaco de referencia.
EJEMPLO 5. Estudio r¿¾ vííro de la actividad de ios derivados de áw l sobre amasflgoíes de Trypenosoma cruzL
De la misma manera que las pruebas de actividad en epimastigotes, estos ensayos se realizaron sobre la cepa CL-B5 iransfectada con el gen de la β-galactosidasa (lacZ) de Esch richia coit y se determinó ía actividad de los compuestos mediante reducción del sustrato CP G (Buckner, F. et al, Anümlcr b. Agenís Chemoíher. 1996, 40, 2592- 2597),
Para evaluar 3a actividad in viiro en amastigotes, forma parasitaria clínicamente relevante en la enfermedad de Chagas, se obtuvieron tripomastigotes derivados de cultivo celular (TDC) mediante la infección de cultivos de células L929 con epimastigotes en fase estacionaria de crecimiento. Los cultivos se incubaron junto con las formas infectivas durante 24 h a 33 ° y 5% CC¼ para favorecer la invasión celular. Transcurrido este tiempo, aquellos parásitos que no habían infectado a las células se retiraron mediante lavado de los cultivos con PBS. Tras adicionar medio MEM fresco, los cultivos infectados se incubaron en similares condiciones de temperatura y humedad durante 7 días, momento en el cual se obtuvieron TDC en ei sobrenadante. Las pruebas se realizaron en placas de cultivo celular de 48 pocilios (Fonseca-Berza!, C, et al,, Parásito!. Res. 2014, / / J. 1 049-1056), Tras despegar las células L929 de sus fraseos de cultivo celular mediante trípsinizacíon, se distribuyeron por cada pocilio 10.000 L929 en 120 μΐ de MEM y se incubaron las placas 2 h a 37 °C y 5% C<)2, Una vez adheridas las células, éstas se infectaron con TDC en proporción 1 :6 (célula: parásito) y se incubaron durante 24 h a .13 °C y 5% CO2. A continuación, se retiró el medio de cultivo, se realizaron lavados con PBS para eliminar los TDC" que no penetraron en las células y se añadieron diluciones de los compuestos a ensayar en MEM fresco en u volumen final de 450 [/pocilio. Las placas se incubaron durante 7 días a 33 °C y 5% CCh y en ellas se evaluó cada concentración por triplicado, incluyéndose controles de infección, crecimiento celular, blancos de medio y de compuesto, asi como un control interno con benznidazol. Una vez finalizado el tiempo de incubación con los compuestos, se procedió a revelar el ensayo mediante la adición de 50 pL/pocillo de una solución de CPRG en 3% Tritón X-lüü (concentración final 400 μΜ, H 7.4) y posterior incubación de las placas durante 3 h a 37 "C. Finalmente, se determinó la absorbencia a 595 nm en un espectrofluorímetro de placas (Infinite 200, Tecan). Los porcentajes de actividad se estimaron mediante comparación del valor medio de absorbancia obtenido en los pocilios tratados, con respecto a la absorbencia media que presentan ¡os controles de infección. La absorbancia correspondiente a los controles de crecimiento celular (sólo células L929) fue restada en los grupos experimental y de control de infección.
Para cada compuesto se estimó la concentración necesaria para inhibir el 50% del crecimiento de los amastigotes (OJO amastigotes) a partir de la correspondiente curva dosis-respuesta (concentración ensayada vs porcentaje de actividad en amastigotes). Los resultados de actividad se expresan como la media de la Oso para amastigotes ± SD, a partir de los valores enconírados en tres experimentos independientes (n ~ 3), Los resultados obtenidos se recogen en la Tabla 2. Puede observarse que varias indazolinonas 1 ,2-disustituidas [compuestos de la serie (I)] son también superiores ai benznidazol (Oso ::: 0,68 μΜ; IS > 376,47) en cuanto a actividad e índice de selectividad frente a amastigotes, destacando los productos 9. 10, 29 y 31 (Osa ~ 0,22-0.54 μΜ; 1S > 474,G7-> 1.163,64). EJEMPLO 6. Estadio m viiro de la actividad de los derivados de sn a?.o§ sob e írofoioitos de Ttichamonas vagin lís.
La búsqueda de nuevos agentes íriccmonicidas sigue un modelo secuencia] de cribado basando en varias tases que, a modo de filtro, permiten pasar al siguiente nivel de estudio soto aquellos productos que muestran determinados valores significativos de actividad (IbáSez-Escribano, A. et al., J. Microbiol. Meíhods 2014, i 05, 162- 167).
En primer lugar, los derivados de indazol son evaluados frente al aislado de T. vaginalís JH31A4, de la colección de la American Type Culture Collection (ATCC), sensible al fármaco de referencia metronidazol. Este aislado se mantiene en cultivo en medio TY (tripticasa, extracto de levadura, .. maltosa), suplementado con L-cisteína, ácido aseórbieo y un 10% de suero bovino fetal descomplementado. Los cultivos del parásito se mantienen en estufa a 37 °C y 5% Cih, realizándose pases cada 48 h.
El cribado in viíro se lleva a cabo evaluando el porcentaje de crecimiento de un cultivo controlado tras 24 h en contacto con concentraciones crecientes del compuesto a evaluar. Para determinar la concentración inhibitoria 50 (Oso), se prepara una solución stock de los compuestos en sul oxido de diraetilo (DMSO), y se ensayan en un rango de seis concentraciones distintas en diluciones dobles seriadas sucesivas, partiendo de una concentración máxima de 300 μ .
En primer lugar se preparan los cultivos en tubos de vidrio con 100.000 trofozoiios mL en un volumen final de 2 mL. Tras 5 h de incubación en estufa, se añaden 4 pL de ios compuestos disueltos en DMSO (volumen final del disolvente < 0,2%). Tras 24 h de incubación a 37 °C y 5% CCh, se reparten 200 pL de cada cultivo en placas estériles de fondo plano de 96 pocilios f unc). A continuación se retira el medio de cultivo tras centrifugar las placas a 2,000 rpm durante 5 min y se resuspenden ios irofozoifos en el mismo volumen de tampón fosfato estéril suplementado con 0,1 % de glucosa. Finalmente, se revela la prueba Adiendo 20 pL de una solución stock de resazurina 3 mfvl a cada pocilio. Este sustrato es un colorante redox capaz de ser reducido a resorufína por células viables. La resorufma, a diferencia de la resazurina. emite fluorescencia pudiéndose determinar el porcentaje de viabilidad celular medíante lectura fluorimétrica. Tras una hora de incubación a 37 °C la intensidad de fluorescencia es determinada en un fluorímetro INFINITE {Á*xc(í»í!óa 535 nm y ?*«mís¾« 590 nm), siguiendo el protocolo previamente descrito por el grupo de investigación (lbáñez Escribano, A, et al., Mem. insi. Oswaido Cruz 2012, 107, 637-643). En todos los ensayos se incluye un control de metronidazoí 25 μΜ y tres controles de crecimiento a los que se les añade el mismo volumen de disolvente (DMSO). Los resultados se calculan a partir de la media obtenida de al menos dos experimentos independientes. Todos ios compuestos son evaluados por triplicado en cada ensayo, obteniéndose una DS por debajo del 10%.
Los compuestos que muestran una actividad relevante frente al aislado parasitario se sometieron también a evaluación frente al cultivo de T. vaginalis metronidazol- resi siente IR 78. El procedimiento de cribado in viíro es idéntico al descrito para el aislado JH3 J A4.
Los resultados obtenidos para el aislado de T. vaginalis JH31 A4 sensible a metronidazoí se recogen en la Tabla 3, donde se muestran los valores de concentración que producen una inhibición del 50% del crecimiento del parásito (C½). Los compuestos que pasaron el primer filtro de evaluación en T. vaginalis, presentando valores de CIso < 50 μΜ, fueron las indazolinonas 1 ,2-disustítuidas [compuestos tipo (I)] 9 y 29. y los 3~alcoxi~2-alquílindazoles [compuestos tipo (II)] 18. 20. 2! y 22. Cabe destacar los compuestos de tipo (II) 21 y 22 [3-(2-hidroxietoxi)- y 3-(3-hidroxipropoxi)indazoles], que presentaron una actividad relevante frente al parásito con valores de Oso de 9,82 y 7,25 μΚΊ, respectivamente. El derivado 22 mostró la actividad anti arasitaria más elevada logrando una inhibición de crecimiento de más del 90% a la máxima concentración evaluada, siendo superior a la actividad mostrada a la misma concentración por el metronidazoí, fármaco de referencia.
El resto de moléculas ensayadas resultaron poco activas o incluso no mostraron nirsgün efecto sobre el crecimiento de los parásito, no pudiéndose calcular en estos casos sus valores de Clso. La Tabla 4 muestra ios resultados obtenidos frente al aislado de T, vaginalis resistente a metronidazol IR 78. El valor de Ose correspondiente al compuesto 22 es muy similar al obtenido con el aislado sensible a metronidazoí, lo que pone en evidencia la falta de resistencia cruzada entre este compuesto y el fármaco de referencia. De este modo, el compuesto 22 puede considerarse un buen prototipo para el desarrollo de fármacos utilizabíes en los casos de resistencia a los 5-nitroimidazoles, para los cuales no existe un medicamento alternativo aceptado por ios organismos de salud internacional,
EJEMPLO 7, Estudie in vit de ta esfetoxkidad «rsespedfksi de los derivados de snda ol íresite a cIMas Vero y determío&dosi de los sndkes de selectividad (IS), En este estudio se analizan sólo aquellas moléculas que han mostrado una actividad significativa in vitro frente a T. vaginalis (Oso < 50 μ ).
Este ensayo se lleva a cabo sobre la línea celular Vero CCL-81 (ATCC); las células son mantenidas en botes de cultivo celular horizontal, en medio RPM1-1460 (Sigma- Aldrich) suplementado con 10% de suero bovino fetal y solución de antibióticos. Las células se despegan empleando una solución estéril de EDTA-íripsina. A continuación se hace un recuento hemocitoméírico con azul Tripán, añadiéndose a placas estériles de 96 pocilios una concentración de 50.000 células/ 100 μί, ρο ϋο. Se mantienen las placas en estufa a 37 °C y 5% COa para favorecer la adhesión de las células al plástico. Tras ía incubación se añaden los compuestos a las mismas concentraciones que fueron ensayadas frente a T. vaginalis. Tras mantener en contacto las células con los compuestos durante 24 h, se procede al revelado de la prueba añadiendo 20 μΐ.. del colorante resazurina preparado a una concentración stock de 1 mM en solución PBS estéril. Las lecturas fluorimétricas se llevan a cabo tras 3 horas de incubación con el sustrato redox. Al igual que en los ensayos in vitro frente a T. vaginalis, ios resultados se calculan a partir de la media obtenida tras la realización de al menos dos experimentos independientes. Cada concentración se evalúa por triplicado obteniéndose una DS por debajo del 10%, existiendo además un control de crecimiento al que se le asume un 0% de actividad citotóxica inespecífica. Los resultados obtenidos en este estudio se recogen en la Tablas .3 y 4, donde s muestran los valores necesarios para inhibir un 50% del crecimiento de las células Vero (CC50). Igualmente, se han estimado los índices de selectividad (IS) que determinan la toxicidad selectiva de la molécula a partir de la relación entre la CCso y la Oso. Los seis compuestos ensayados (9. 18, 20, 21, 22 y 29) mostraron una actividad citotóxica inespecífica baja, con porcentajes de inhibición del crecimiento de células Yero < 20% a 300 μ y unos valores del ÍS eníre 6,0 y > 4 L4. Nuevamente hay que destacan los compuestos de tipo (II) 21 y 22, que mostraron porcentajes de citotoxicidad (%C) a la máxima concentración ensayada (300 μΜ) muy bajas (VoCn - 14,7 ± 4,3; ¼CM « 14,5 ± 3,2).
Tabla 3, Actividad bi viiro frente a T. vagmaiis JH31 A4 y citotoxicidad inespecifíca frente célalas Vero, expresadas como Ciso y CC$s respectivamente.
Figure imgf000040_0001
347,74 17 64,75
80,21 18 1 8,57 538,85 29,0 534,57 20 43,02 > 300 > 7 0
21 9,82 > 00 > 30,5
375,54 7,25 > 300 > 1 ,4 192,42 23 107,45 1 7,94 24 258,43 128,44 W Di
1 1 284,62 21 ! 04, n
418,86 28 182,01 588.88 29 48,94 300 > 6,1 212,91 30 362, 1 8
197,42 31 265,63
Metronidazo 600 1 00
ND: o determinado por ausencia de actividad anti aras liaría
Tabla 4. Actividad in viiro frente a T. vagmaiis ÍR 78 y citotoxicidad inespecifíca frente células Vero, expresadas corno Cija y CCsn, respectivamente. Compuesto Cl¾ (μ ) CC$e (μΜ) 1S
.....
39, 1 2
21 49,82 :·· 300 > 6,0
22 9, Π > 300 > 2 9
íefronidazoi ___ > 600 > 100
En ei caso del aislado de T. vaginalis resistente a rneíronídazol, los valores del IS están comprendidos entre 6,0 y > 32,9, presentando una vez más el compuesto 22 el máximo valor, por lo que resulta prometedor como una alternativa al fármaco de referencia.

Claims

RE I V I NDIC ACION £S
! , Compuestos derivados de S-nitroindazol de fórmulas enerales 1 II
Figure imgf000042_0001
donde R puede ser:
-■ un grupo alquenifo o aiquinilo de 2-6 átomos de carbono y con el enlace máltípíe en cualquiera de las posiciones posibles. Se excluye específicamente la l-alil-2- bencíl~5~nitroindazolmona [compuesto tipo (i)] .
- un grupo polimetüéiiíco de longitud variable [(C¾)n, n :::: 1 -6] con sustituyentes terminales de tipo Br, OH, COOR (R :::: H o alquilo de 1 -5 átomos de carbono), CONR'R (RJ y/o R2 ~ H o alquilo de 1 -5 átomos de carbono), CN, OR (R™ grupos alquilo o acilo de 1 -5 átomos de carbono).
- un grupo etoxicarbonilo o benciloxicarbonilo.
- un grupo acilo alifitico (de 1 a 5 átomos de carbono tales como tomillo, acetiio o propionilo) u aromático {benzoilo o benzoiios diferentemente sustituidos en jas posiciones 2, 3 o 4 con grupos tales como F, Cl, Br, OH, OR, N¾, Ní¾ o CN).
- un grupo sulfonilo alifitico o aromático [metanosulfonilo o -toluenosulfonilo
(íosilo)]. y donde X puede ser cualquier sustituyente en las posiciones 2, 3 o 4 de un grupo bencilo, seleccionado entre un grupo alquilo sencillo o ramificado de 1 -5 átomos de carbono, trifluorometilo (CFj), F, Cl, Br, grupos hidroxílo (OH), alcoxüo (OR; R = alquilo), grupos amino (N¾ NR;>). nitro (NO2) o ciano (CN). En compuestos de tipo (I), cuando R ::: CH2COOH, se excluyen específicamente derivados con dos átomos de halógeno en el sustituyeme bencílico. o sus solvatos o oroflrmacos.
2. ün compuesto de fórmula genera! (I) según la reivindicación 1 , seleccionado de la lisia siguiente:
2-Bencil-5-nítro- l -propargiI- l ,2-dihidro-3/ -irsdazol-3-ona
2-Bencii-l -(2-bromoetíl)-5-n!tra-l,2-dihidro-3 -indazol-3-ona
2~Bencil~ l~(3-broniopropi3)-5~nitro-] ,2-d5hidro-3H-indazoi-3-ona
2~Bencil~ l ~(meíüxicarbani!)metií~5^^
2-BenciI" ] "CÍanornetil~5-nitro~ L2~dih¾dro-3i1 -irid82ol~3~ona
2-Bencií- 1 -[2-(metoxkarboml)etil]-5~niíro- 1 ,2-dihidro-3H-indazol-3-ona
2-Bencü- 1 -[3-(etoxicarbonil)propi]]-5-njtro- 1 ,2-díhidro~3//-indazoi-3-ona
2-Bencií- l -(2-hidroxietil)-5-nitro-l ,2-dihidro-3.//-mdazo]-3-oi a
2-Bencü- 1 -(3~hidroxipropil)~5-nítro- 1 ,2-dihidro-3i¥-inda2:ol-3-ona
2-Bencil- í -(2-metoxieü])-5-nitro- ! ,2-dihidro-3H-indazol-3-ona
2-Benci{- ! -etoxicarbQnil-S-n¡tro-l ,2-dihidi -3H-mdazol-3-ona
2-Bencil~l -benciloxicarbonil-5-n ro-l ,2-dihidro-3H-inda7X)!-3-ona
1 ~Aceíil-2-ber5Cíl-5-nitro-l ,2-dihidro-3H-indazo!-3-ona
2-Bencil- ! -benzoil-5-nttro-l ,2-dihidro-3//-indazol-3-ona
2-BeriC3Í-5-nitro- l -tosi]- l 52-dihtdrO"3//-indazoi-3-ona
2-Bencil-5-nitro-l -viníl- l ,2-dihidro-3H~indazo]-3-ona
2-Bencil- 1 -(2-carboxieti I )-5-ni tro- 1 ,2-dihidro-3H-5ndazo!-3-ona
2-Bencü- 1 -(3-carboxipropii)-5-nitro- 1 ,2-dihídro-3//~indazol-3-oiia
2-Bencil- 1 -(3-carbamoilpropil)-5- tro- 1 ,2-dihidro-3H-indazoi-3-ona
2-Bencil- í -[3-(meíilcarbamoil)propil]--5~nitro~ 'í ,2~dihidro~3H-indazoi-3-or)a
Figure imgf000043_0001
2-Bencil- 1 -{3-etoxipropi3)~5-n3tro- 1 ,2-díhidro-3H-indazol-3-ona
1 -{2-Acetoxieíi{)-2-bencil-5-n ro- ! ,2-dihidro-3 H-indazol-3-ona o sus solvatos o profármacos.
3, Un compuesto de fórmula general (II) segán la reivindicación 1 $ seleccionado de ia lista siguiente:
2-Bencil-3-(2-bromoetoxi)-5-niíro~2H-indazol
2-Bencil-3-(3-bromopropoxi)-5-nitro-2//-indazol 2-Benci]-3-(meíoxicarboni!)metoxi-5-nhro-2//-sndazoÍ
2-Bencil-3-[2~(meíoxicarboni¡)etoxi -5~nitro-2//-sndazol
2-Bencil-3-(2-hidrox}etoxi)-5-nitro-2//-mdazol
2-Bencil-3-{3-hidroxipropoxi)-5-nitro-2H-indazoI
2-Bencil-3-(2-metoxietoxi)-5-nitro-2/f-indazol o sus sotvatos o profármaeos
4. Procedimiento para k preparación de ios compuestos de fórmula general (I) y (II ) por tratamiento de la 5-nitroÍndazolinona con agentes alquilantes, aleoxicarboni lantes, acilantes y suífonilantes, según se recoge en el Esquema 1 .
Figure imgf000044_0001
Esq uema 1
5. Procedimiento para ]a preparación de compuestos de férmula general (I) modificación química de la cadena lateral de los compuestos de formula general incluidos en la reivindicación 1 , segán se recoge en el Esquema 2,
Figure imgf000044_0002
6. Uso de ios compuestos de las reivindicaciones 1 -3 para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de enfermedades causadas por protozoos patógenos de las familias Trypanoa matidae { Trypanosoma, Leishmania) Trickom nadidae { Trich monas).
7, Una composición farmacéutica que incluya cualquiera de los compuestos definidos en las reivindicaciones 1 -3 y, al menos, un excipiente farmacéuticamente aceptable.
8. Una composición farmacéutica, según reivindicación 7, que, opcionalmente, puede contener también otros principios activos.
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