WO2017057265A1 - 強皮症予防および／または治療剤 - Google Patents

強皮症予防および／または治療剤 Download PDF

Info

Publication number
WO2017057265A1
WO2017057265A1 PCT/JP2016/078250 JP2016078250W WO2017057265A1 WO 2017057265 A1 WO2017057265 A1 WO 2017057265A1 JP 2016078250 W JP2016078250 W JP 2016078250W WO 2017057265 A1 WO2017057265 A1 WO 2017057265A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
scleroderma
glycyrrhizic acid
blm
administration
skin
Prior art date
Application number
PCT/JP2016/078250
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
佐藤　伸一
善英 浅野
尚志 山下
Original Assignee
国立大学法人 東京大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 国立大学法人 東京大学 filed Critical 国立大学法人 東京大学
Priority to US15/763,527 priority Critical patent/US20180303859A1/en
Publication of WO2017057265A1 publication Critical patent/WO2017057265A1/ja

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators

Definitions

  • the present invention relates to a preventive and / or therapeutic agent for scleroderma containing glycyrrhetinic acids and / or salts thereof.
  • the present invention also relates to a Th2 enhancement inhibitor or vascular stabilizer containing glycyrrhetinic acids and / or salts thereof.
  • Scleroderma is an autoimmune disease involving multiple organs characterized by vascular lesions, fibrosis of the skin and various internal organs. The cause of scleroderma is still unknown, and no cure has yet been established to lead to remission.
  • corticosteroids are commonly used for early-stage patients, and pulmonary symptoms In contrast, immunosuppressive drugs are commonly used.
  • suppression of the accumulation of extracellular matrix such as collagen due to activation of fibroblasts such as skin, which is a pathological condition, is also considered, but no drug showing such an effect has been found.
  • glycyrrhetinic acids such as glycyrrhizic acid are the main medicinal ingredients of licorice that have been used in Chinese medicine since ancient times, and developed in Japan as anti-allergic agents, therapeutic agents for liver fibrosis (Non-patent Document 1), Its effectiveness and safety are widely recognized.
  • An object of the present invention is to provide a preventive and / or therapeutic agent for scleroderma whose cause is still unknown.
  • a further object of the present invention is to provide a Th2 enhancement inhibitor and a vascular stabilizer.
  • glycyrrhetinic acids such as glycyrrhizic acid and / or salts thereof are effective for the treatment of scleroderma, have a Th2 enhancement inhibitory action and a vascular stabilizing action, and have completed the present invention.
  • a scleroderma preventive and / or therapeutic agent comprising glycyrrhetinic acids and / or salts thereof.
  • scleroderma preventive and / or therapeutic agent according to any one of [1] to [3], wherein the scleroderma is systemic scleroderma.
  • a Th2 enhancement inhibitor comprising glycyrrhetinic acids and / or salts thereof.
  • a method for preventing and / or treating scleroderma comprising administering glycyrrhetinic acids and / or salts thereof to a subject.
  • a method for inhibiting Th2 enhancement comprising administering glycyrrhetinic acids and / or salts thereof to a subject.
  • a method for stabilizing blood vessels comprising administering glycyrrhetinic acids and / or salts thereof to a subject.
  • Glycyrrhetinic acids and / or salts thereof inhibit Th2 hyperactivity, improve inflammatory response and fibrosis, stabilize blood vessels, and prevent or treat scleroderma.
  • A A photograph showing the results of measuring changes in dermis thickness caused by administration of glycyrrhizic acid in a bleomycin (BLM) -induced scleroderma model mouse.
  • B The graph which shows the measurement result of the dermis thickness measured in A.
  • C A graph showing changes in the amount of collagen by administration of glycyrrhizic acid in BLM-induced scleroderma model mice. The amount of each collagen is shown as a relative value where the amount of collagen in the group in which a solvent was administered instead of glycyrrhizic acid to control mice that had not been induced with BLM.
  • A A photograph showing the result of immunostaining the skin of a BLM-induced scleroderma model mouse with ⁇ -smooth muscle actin ( ⁇ -SMA).
  • B A graph showing the number of fibroblasts that were positive for ⁇ -SMA staining in a field of ⁇ 400 magnification in A.
  • A shows the results of evaluating the expression of IFN- ⁇ , IL-4 and IL17A in CD4 positive cells collected from lymph nodes of BLM-induced scleroderma model mice by flow cytometry.
  • B A graph of the results of A.
  • FIG. 1 shows the results of evaluating the expression of IFN- ⁇ , IL-4 and IL17A in CD4 positive cells collected from the spleen of a BLM-induced scleroderma model mouse by flow cytometry.
  • FIG. 1 shows the results of evaluating the expression of IFN- ⁇ , IL-4 and IL17A in CD4 positive cells collected from the spleen of a BLM-induced scleroderma model mouse by flow cytometry.
  • FIG. 1 shows the results of evaluating the expression of IFN- ⁇ , IL-4 and IL17A in CD4 positive cells collected from the spleen of a BLM-induced scleroderma model mouse by flow cytometry.
  • FIG. 1 shows the results of evaluating the expression of IFN- ⁇ , IL-4 and IL17A in CD4 positive cells collected from the spleen of a BLM-induced scleroderma model mouse by flow cytometry.
  • FIG. 1 shows the results of evaluating the expression of IFN
  • the left vertical column is a control group without BLM induction
  • the middle vertical column is a group in which solvent was administered to BLM-induced scleroderma model mice
  • the right vertical column is glycyrrhizic acid to BLM-induced scleroderma model mice. Shows the group.
  • the arrow at the bottom indicates a cell in which VE-cadherin and FSP1 are stained simultaneously.
  • (A) A photograph showing the results of observing cutaneous blood vessels from the dermis side of a mouse dissected after administering a solvent or glycyrrhizic acid to a vascular endothelial cell-specific Fli1-deficient mouse and then administering Evans blue dye.
  • (B) A graph showing the result of measuring the amount of extravasation of Evansvanblue dye. Each amount of leakage is shown as a relative value with the amount of leakage taken as 1 in a group in which a solvent was administered instead of glycyrrhizic acid to control mice that had not been induced with BLM.
  • the present invention relates to a preventive and / or therapeutic agent for scleroderma containing glycyrrhetinic acids and / or salts thereof.
  • the present invention also relates to a Th2 enhancement inhibitor or vascular stabilizer containing glycyrrhetinic acids and / or salts thereof.
  • Scleroderma is a disease whose main symptom is a skin disorder that hardens the skin.
  • Systemic scleroderma which is chronically characterized by changes (hardening) of the skin and internal organs, and hardening only in the skin. It is roughly divided into localized scleroderma that occurs.
  • Systemic scleroderma is considered to be a disease in which three abnormalities of autoimmunity, fibrosis, and vascular disorder occur.
  • autoantibodies such as anti-centromere antibody, anti-topoisomerase I (Scl-70) antibody, anti-U1RNP antibody, and anti-RNA polymerase antibody are positive. Since these autoantibodies are thought to appear in the blood before symptoms occur, patients who have become positive for these autoantibodies can prevent the present invention in the sense of prevention even if no symptoms appear. Agents may be applied.
  • Fibrosis is caused by accumulation of excessive collagen fibers in the skin as fibroblasts actively produce collagen fibers. This excessive collagen fiber production is thought to occur when lymphocytes produce various substances called cell growth factors and cytokines in the skin that act in complex ways to stimulate fibroblasts. .
  • Vascular disorders include Raynaud's symptoms, which are seen in more than 80% of patients with systemic scleroderma. Raynaud's symptoms are vasospasms that occur in various parts of the hand in response to cold and emotional stress, causing reversible discomfort and color changes (palm white, cyanosis, erythema, or combinations thereof) on the fingers. In addition, when the fibrosis occurs in blood vessels, the blood vessels become hard and blood flow is reduced, which contributes to the formation of ulcers. Such vascular hardening and blood flow reduction occur not only in the skin but also in the internal organs.
  • pulmonary hypertension occurs in the blood vessels of the lungs, and a symptom called scleroderma kidney crisis occurs in the blood vessels of the kidneys.
  • scleroderma kidney crisis occurs in the blood vessels of the kidneys.
  • nail epithelial bleeding points may be seen, which is also considered a symptom reflecting vascular disorders.
  • systemic scleroderma is a major criterion, 1) skin sclerosis confined to the fingers or toes 2) concave scars at the fingertips Or abdominal atrophy, 3) bilateral basal fibrosis, 4) anti-topoisomerase I (Scl-70) antibody or anti-centromere antibody or anti-RNA ⁇ polymerase III antibody Alternatively, systemic scleroderma is diagnosed if one or more of the small criteria 1) and 2) to 4) is satisfied.
  • Localized scleroderma is a disease that causes fibrous sclerosis in the skin and the underlying fat pad, muscles and bones, and this fibrous sclerosis is recognized as a skin eruption in the skin. This eruption is very diverse from patient to patient, and while skin sclerosis may be clearly recognized, it may be recognized as a depressed aspect.
  • the skin tone is often accompanied by erythema, brown or white. Based on the shape of the eruption, it is classified into mottled scleroderma (morphia) and linear scleroderma.
  • morphia mottled scleroderma
  • linear scleroderma As a special type of linear scleroderma, what occurred on the face and head and neck is called sword wound scleroderma, and it affects the scalp and causes hair loss.
  • Plaque scleroderma is classified into a localized type, a drop type, and a multiple type based on the size and number of eruptions.
  • prevention of scleroderma means that scleroderma does not develop.
  • prevention of scleroderma includes preventing or suppressing further deterioration of scleroderma symptoms at various stages such as the onset of onset.
  • Treatment of scleroderma means amelioration, alleviation, prevention or suppression of scleroderma symptoms.
  • Th2 enhancement inhibitor A subset of helper T cells includes Th1 cells and Th2 cells.
  • Th1 activates cellular immunity
  • Th2 activates humoral immunity, and the immune response is controlled by the mutual balance. If this Th1 / Th2 balance is not properly controlled, it may cause various diseases such as autoimmune diseases.
  • autoimmune diseases are roughly classified into organ-specific ones such as Graves' disease and systemic ones (non-organ specific) such as scleroderma. When increased, organ-specific autoimmune disease is induced, and when Th2 is increased, systemic autoimmune disease is induced.
  • the Th2 enhancement inhibitor in the present invention suppresses such an enhanced state of Th2.
  • the Th2 enhancement inhibitor in the present invention is scleroderma, systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, polymyositis, dermatomyositis, Sjogren's syndrome, mixed connective tissue disease, antiphospholipid syndrome, microscopic polyangiitis, Applicable to systemic autoimmune diseases such as multiple vasculitic granulomatosis.
  • the vascular stabilization in the present invention refers to improving the state of increased vascular vulnerability and / or vascular permeability and improving extravasation. Therefore, the vascular stabilizer in the present invention is a disease that exhibits vascular vulnerability, increased vascular permeability and / or extravasation symptoms, such as vascular leakage syndrome, Eras Dunlos syndrome, Schönlein-Hennoch purpura or simplicity Applicable to various purpura such as purpura, hereditary hemorrhagic telangiectasia (Randu-Osler-Weber disease) and the like.
  • it may be applied as a preventive measure to patients before administration of the anticancer drug.
  • Glycyrrhetinic acids in the present invention mean those containing a pentacyclic triterpene structure, such as glycyrrhizic acid, glycyrrhetinic acid, 18 ⁇ -glycyrrhetinic acid 3-O-glucuronide, methyl glycyrrhetinate, stearyl glycyrrhetinate, pyridoxine glycyrrhetinate, Examples include, but are not limited to, glyceryl glycyrrhetinate, glycyrrhetinyl stearate, and carbenoxolone.
  • glycyrrhetinic acids glycyrrhizic acid is preferred.
  • glycyrrhetic acid in this invention as long as glycyrrhetic acid is included, the crude extract of the licorice which is a leguminous plant may be sufficient.
  • the glycyrrhetinic acid salts of the present invention may be any pharmaceutically acceptable salt, such as alkali metal (potassium, sodium, etc.) salts, alkaline earth metal (calcium, magnesium etc.) salts, ammonium salts, Pharmaceutically acceptable organic amines (tetramethylammonium, triethylammonium, methylamine, dimethylamine, cyclopentylamine, benzylamine, phenethylamine, piperidine, monoethanolamine, diethanolamine, tris (hydroxymethyl) aminomethane, lysine, arginine, N-methyl-D-glucamine and the like).
  • alkali metal potassium, sodium, etc.
  • alkaline earth metal calcium, magnesium etc.
  • ammonium salts Pharmaceutically acceptable organic amines (tetramethylammonium, triethylammonium, methylamine, dimethylamine, cyclopentylamine, benzylamine, phenethyl
  • an ammonium salt or an alkali metal salt is preferable, and glycyrrhizic acid ⁇ disodium salt, glycyrrhizic acid ⁇ 2 potassium salt, or glycyrrhizic acid ⁇ monoammonium salt is more preferable.
  • these salts can be used alone or in combination of two or more.
  • the definition of these salts is applicable also to the said fatty acid ester of glycyrrhizic acid (for example, stearyl glycyrrhizinate, glyceryl glycyrrhizinate, etc.).
  • the agent in the present invention may be used alone, but can also be used in combination with a known scleroderma preventive / therapeutic agent, a Th2 hyperinhibitory agent or a vascular stabilizer. Combined use is expected to enhance the preventive and therapeutic effects.
  • the prophylactic / therapeutic agent used in combination may be contained as a component of the agent in the present invention as long as the effect of the agent in the present invention is not diminished or eliminated, or formulated separately from the agent of the present invention. It is good also as a kit of the type arrange
  • auxiliary component other than the above active ingredients excipients, lubricants, disintegrants, binders, stabilizers, surfactants, dilutions as necessary Agents, additives, lubricants, preservatives, coating agents and the like may be contained to form a pharmaceutical composition.
  • a high-concentration solution of glycyrrhetinic acids and / or salts thereof may be gelled under a low pH such as the stomach.
  • phosphates such as disodium monohydrogen phosphate and potassium dihydrogen phosphate
  • the formulation form of the agent in this invention is not specifically limited, According to usage, it can select suitably. Specific examples include tablets, pills, powders, liquids, granules, capsules, syrups, gels, and decoction.
  • the dosage of glycyrrhetinic acid and / or a salt thereof in the present invention is not particularly limited as long as the drug effect can be exhibited, and varies depending on symptoms, age, etc., but preferably a single dose is 50 to 150 mg, more preferably 70. It can be administered 1 to several times a day at ⁇ 100 mg, even more preferably 80 mg.
  • a single dose is 50 to 150 mg, more preferably 70. It can be administered 1 to several times a day at ⁇ 100 mg, even more preferably 80 mg.
  • limiting in an administration method For example, oral administration, sublingual administration, intravenous administration, subcutaneous administration, transdermal administration, intraperitoneal administration, etc. are mentioned.
  • the administration target may be any animal, but humans, mice, rats, monkeys, rabbits, guinea pigs and the like are exemplified, and humans are particularly preferable.
  • Example 1 Examination on fibrosis of scleroderma Bleomycin prepared at 1 mg / ml with phosphate buffered saline (PBS) on the back skin of 8-week-old C57BL / 6 mice (wild type) (BLM) solution was intradermally injected every day for 300 ⁇ g for 4 weeks to prepare BLM-induced scleroderma model mice.
  • the control group was injected subcutaneously with the same amount of PBS.
  • monoammonium glycyrrhizinate dissolved in PBS was administered intraperitoneally for 4 weeks every day at a dose of 30 mg / kg.
  • the control group received the same amount of PBS intraperitoneally.
  • the skin tissue at the injection site was collected using a skin biopsy punch with a diameter of 6 mm, and the dermis thickness was measured by staining with Hematoxylin & Eosin.
  • collagen content was quantified in a skin sample collected by the same method using a QuickZyme Total Collagen Assay kit (QuickZyme BioSciences B.V, Netherlands).
  • Paraffin sections were prepared using the dorsal skin, which is the injection site of the BLM-induced scleroderma model mouse, and anti- ⁇ -smooth muscle muscle according to the product manual of VEVTOR MOM Immunodetection Kit (Vector laboratories, Burlingame, CA, USA). After reacting with an actin ( ⁇ -SMA) antibody (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), color was developed with DAB (0.2 mg / ml, DOJINDO LABORATORIES, kumamoto, JAPAN). For each mouse skin sample, three photographs of the superficial dermis were randomly taken with a field of view of 400 times, and the number of ⁇ -SMA positive spindle-shaped cells was counted. The average value was defined as the number of ⁇ -SMA positive fibroblasts of the mouse, and the glycyrrhizic acid group and the control group were compared.
  • Col1a1 F GCCAAGAAGACATCCCTGAAG (SEQ ID NO: 1)
  • R TGTGGCAGATACAGATCAAGC
  • Col1a2 F GGAGGGAACGGTCCACGAT (SEQ ID NO: 3)
  • Col3a1 F TTTGTGCAAGTGGAACCTG (SEQ ID NO: 5)
  • R: TGGACTGCTGTGCCAAAATA SEQ ID NO: 6)
  • Mmp13 F TGATGGCACTGCTGACATCAT (SEQ ID NO: 7)
  • Thbs1 F TGGTAGCTGGAAATGTGGTG (SEQ ID NO: 9)
  • R: CAGGCACTTCTTTGCACTCA Gapdh F: CGTGTTCCTACCCCCAATGT (SEQ ID NO: 11)
  • glycyrrhizic acid did not affect normal dermis in control mice without BLM induction, so glycyrrhizic acid did not act on normal dermis, but only thickened dermis in scleroderma model mice. It was shown to be effective.
  • Mmp13 mRNA a gene encoding collagenase, was significantly increased by administration of glycyrrhizic acid.
  • thrombospondin (Thbs1) mRNA which converts latent TGF- ⁇ into active TGF- ⁇ , was also decreased by administration of glycyrrhizic acid to scleroderma model mice. Active TGF- ⁇ is known to promote collagen fiber production.
  • Example 2 Examination on inflammation and immune abnormality of scleroderma BLM-induced scleroderma model mice were prepared by the same treatment as in Example 1 except that bleomycin administration treatment was carried out for only one week, and the final administration On the next day, the bilateral inguinal lymph nodes and spleen of the mice were removed. Lymph nodes were ground to separate lymphocytes. Blood cells taken out from the spleen were separated by adding RBC lysis buffer (0.0017M Trizma, Sigma-Aldrich, 0.1M NH 4 Cl 2.675g, Sigma-Aldrich). Lymphocytes were stained for surface antigen using anti-CD3 antibody (17A2), anti-CD4 antibody (RM4-5), anti-CD8a antibody 53-6.7).
  • Il4 F ACGGAGATGGATGTGCCAAACGTC (SEQ ID NO: 13)
  • R CGAGTAATCCATTTGCATGATGC (SEQ ID NO: 14)
  • Il1b F TTGACGGACCCCAAAAGAT (SEQ ID NO: 15)
  • R GAAGCTGGATGCTCTCATCTG (SEQ ID NO: 16)
  • Arg1 F CAGAAGAATGGAAGAGTCAG (SEQ ID NO: 17)
  • glycyrrhizic acid administration was examined in the skin tissue of BLM-induced scleroderma model mice.
  • mRNA of interleukin 4 and interleukin 1b was decreased by administration of glycyrrhizic acid.
  • arginase mRNA which is a marker for M2 macrophages, was also decreased by administration of glycyrrhizic acid.
  • IL4-positive CD4-positive T cells which are Th2 cells
  • IFN- ⁇ positive CD4 positive T cells which are Th1 cells
  • IL17A positive CD4 positive T cells which are Th17 cells
  • IL4 that induces differentiation into Th2 cells and IL1b which is a pro-inflammatory cytokine
  • IL4 that induces differentiation into Th2 cells
  • IL1b which is a pro-inflammatory cytokine
  • arginase a marker of M2 macrophages induced by IL4
  • glycyrrhizic acid may suppress inflammation and improve the Th2 dominant environment in scleroderma model mice.
  • Scleroderma is one of the autoimmune diseases and its patients are known to be predominantly Th2 cells that activate humoral immunity, but glycyrrhizic acid suppresses such Th2 dominance It was suggested to do.
  • vascular endothelial disorder of scleroderma In patients with scleroderma, vascular endothelial disorder is seen in addition to fibrosis. This is because vascular endothelium is transferred to mesenchymal cells such as fibroblasts. It has been suggested that the cause may be caused by (endothelial-mesenchymal transition (Endo-MT)). Therefore, we examined how glycyrrhizic acid affects Endo-MT using scleroderma model mice.
  • Endo-MT endothelial-mesenchymal transition
  • Paraffin sections were prepared using skin specimens of injection sites of BLM-induced scleroderma model mice prepared under the same conditions as in Example 1, and rabbit anti-VE-cadherin antibody (Santa Cruz Biotechnolog) and goat anti-fibroblast as primary antibodies.
  • FSP1 -specific protein 1 (FSP1) antibody (abcam, Cambridge, UK) as a secondary antibody, FITC-conjugated donkey anti-rabbit IgG antibody (Santa Cruz Biotechnolog) and Alexa Fluor donkey 555 anti-goat IgG antibody (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), stained with nuclei with Vectashield with DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) and 495 nm (green), 565 nm with Bio Zero BZ-8000 (Keyence, Osaka, Japan) Observation was performed at wavelengths of (red) and 400 nm (blue).
  • FSP1 -specific protein 1
  • Snail1 F CAACTATAGCGAGCTGCAGGA (SEQ ID NO: 19)
  • R ACTTGGGGTACCAGGAGAGAGT (SEQ ID NO: 20)
  • vascular endothelial cell-specific Fli1-deficient mouse (Fli1flox / flox; Tie2-Cre: American Journal of Pathology, April 2010 Volume 176, Issue 4, p1983, a model mouse for vascular injury in scleroderma -1998) or control mice (Fli1flox / flox) were administered intraperitoneally with monoammonium glycyrrhizinate or PBS under the same conditions as in Example 1.
  • FIG. 5 The results of immunostaining using anti-VE-cadherin antibody and anti-FSP1 antibody are shown in FIG.
  • the superimposed image in the lower part of FIG. 5 is marked with an arrow, which is a cell stained with both anti-VE-cadherin antibody and anti-FSP1 antibody at the same time, that is, a cell that caused Endo-MT.
  • Show. Endo-MT-induced cells are increased by bleomycin administration (FIG. 5, BLM + solvent, lower panel), and the increasing action is suppressed by glycyrrhizic acid administration (FIG. 5, BLM + glycyrrhizic acid, lower panel).
  • Snail1 mRNA that induces Endo-MT was measured in BLM-induced scleroderma model mice. As a result, the amount of Snail1 mRNA was significantly reduced by administration of glycyrrhizic acid.
  • vascular endothelial cell-specific Fli1 knockout mouse which is a model mouse for vascular injury in scleroderma, was prepared, and leakage of Evans Blue out of the blood vessel was examined.
  • the amount of extravasation to Evans Blue increased by Fli1 knockout was significantly reduced by administration of glycyrrhizic acid (FIGS. 6A and B).
  • glycyrrhizic acid improves the stability of blood vessels. It was suggested that the improvement in stability may be due to suppression of endothelial mesenchymal transition.
  • glycyrrhetinic acids and / or salts thereof contained in the agent of the present invention are main medicinal ingredients of licorice that have been used in Chinese medicine since ancient times, and their safety has been widely recognized, so it is safe to use scleroderma. Can be prevented and / or treated.
  • glycyrrhetinic acids and / or salts thereof can be used as Th2 enhancement inhibitors or vascular stabilizers.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Abstract

強皮症予防および／または治療剤を提供することを課題とする。また、Ｔｈ２亢進抑制剤または血管安定化剤を提供することを課題とする。強皮症予防、強皮症治療、Ｔｈ２亢進抑制または血管安定化にグリチルレチン酸類および／またはその塩を適用する。

Description

強皮症予防および／または治療剤
　本発明は、グリチルレチン酸類および／またはその塩を含有する、強皮症予防および／または治療剤に関する。また、本発明は、グリチルレチン酸類および／またはその塩を含有する、Ｔｈ２亢進抑制剤または血管安定化剤に関する。
　強皮症は、血管の病変、皮膚や様々な内臓の線維化を特徴とする多臓器に亘る自己免疫疾患である。強皮症の原因は未だ不明であり、寛解に導く治療法も確立していないが、現状においては、早期の患者に対しては副腎皮質ステロイド薬が一般的に使用され、また肺の症状に対しては免疫抑制薬が一般的に使用される。一方、病態である皮膚等の線維芽細胞の活性化によるコラーゲンなど、細胞外基質の蓄積の抑制も考慮の対象であるが、このような効果を示す薬剤は見出されていない。
　一方、グリチルリチン酸等のグリチルレチン酸類は、漢方において古来より用いられている甘草の主薬効成分であり、日本において、抗アレルギー剤、肝線維症（非特許文献１）などの治療剤として開発され、その有効性と安全性は広く認められている。
Life Sciences, Volume 83, Issues 15-16, 2008, Pages 531-539
　本発明の目的は、未だ原因不明である強皮症の予防および／または治療剤を提供することである。本発明のさらなる目的は、Ｔｈ２亢進抑制剤および血管安定化剤を提供することである。
　本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討を行った。その結果、グリチルリチン酸等のグリチルレチン酸類および／またはその塩が、強皮症の治療に有効であること、Ｔｈ２亢進抑制作用および血管安定化作用を有することを知見し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は以下を提供する。
［１］グリチルレチン酸類および／またはその塩を含有する、強皮症予防および／または治療剤。
［２］前記グリチルレチン酸類が、グリチルリチン酸である、［１］に記載の強皮症予防および／または治療剤。
［３］前記グリチルレチン酸類の塩が、アンモニウム塩またはアルカリ金属塩である、［１］または［２］に記載の強皮症予防および／または治療剤。
［４］前記強皮症が、全身性強皮症である、［１］～［３］のいずれか一に記載の強皮症予防および／または治療剤。
［５］グリチルレチン酸類および／またはその塩を含有する、Ｔｈ２亢進抑制剤。
［６］グリチルレチン酸類および／またはその塩を含有する、血管安定化剤。
［７］強皮症の予防および／または治療方法であって、グリチルレチン酸類および／またはその塩を対象に投与することを含む、方法。
［８］Ｔｈ２亢進抑制方法であって、グリチルレチン酸類および／またはその塩を対象に投与することを含む、方法。
［９］血管安定化方法であって、グリチルレチン酸類および／またはその塩を対象に投与することを含む、方法。
　グリチルレチン酸類および／またはその塩は、Ｔｈ２亢進状態を抑制し、炎症反応および線維化を改善し、血管を安定化させて、強皮症を予防または治療する。
（A）ブレオマイシン（BLM）誘発強皮症モデルマウスにおいて、グリチルリチン酸投与による真皮厚の変化を測定した結果を示す写真。（B）Aにおいて測定した真皮厚の測定結果を示すグラフ。（C）BLM誘発強皮症モデルマウスにおいて、グリチルリチン酸投与によるコラーゲン量の変化を示すグラフ。各々のコラーゲン量は、BLM誘発を行っていない対照マウスに、グリチルリチン酸の代わりに溶媒を投与した群におけるコラーゲン量を１とした相対値にて示す。 （A）BLM誘発強皮症モデルマウスの皮膚をα-平滑筋アクチン（α-SMA）で免疫染色した結果を示す写真。（B）Aにおいて、×４００倍視野内においてα-SMA染色陽性となった線維芽細胞数を示すグラフ。 （A）BLM誘発強皮症モデルマウスのリンパ節から採取されたCD4陽性細胞におけるIFN-γ、IL-4およびIL17Aの発現を、フローサイトメトリーにより評価した結果を示す。（B）Aの結果をグラフ化したもの。 （A）BLM誘発強皮症モデルマウスの脾臓から採取されたCD4陽性細胞におけるIFN-γ、IL-4およびIL17Aの発現を、フローサイトメトリーにより評価した結果を示す。（B）Aの結果をグラフ化したもの。 BLM誘発強皮症モデルマウスの皮膚検体を抗VE-cadherin抗体および抗fibroblast-specific protein 1（FSP1）抗体を用いて免疫染色を行った結果を示す写真。上段は抗FSP1抗体で染色した結果、中段は抗VE-cadherin抗体で染色した結果、下段は上段と中段の結果を重ね合わせた結果を示す。左の縦一列はBLM誘発を行っていない対照群、中央の縦一列はBLM誘発強皮症モデルマウスに溶媒を投与した群、右の縦一列はBLM誘発強皮症モデルマウスにグリチルリチン酸を投与した群を示す。下段の矢印は、VE-cadherinとFSP1が同時に染色されている細胞を示す。 （A）血管内皮細胞特異的Fli1欠失マウスに、溶媒またはグリチルリチン酸を投与した後、Evans blue dyeを投与し、その後解剖したマウスの真皮側から皮膚血管を観察した結果を示す写真。（B）Evans blue dyeの血管外漏出量を測定した結果を示すグラフ。各々の漏出量は、BLM誘発を行っていない対照マウスに、グリチルリチン酸の代わりに溶媒を投与した群における漏出量を１とした相対値にて示す。
　以下、本発明の実施の形態について、説明する。
　本発明は、グリチルレチン酸類および／またはその塩を含有する、強皮症予防および／または治療剤に関する。また、本発明は、グリチルレチン酸類および／またはその塩を含有する、Ｔｈ２亢進抑制剤または血管安定化剤に関する。
（強皮症予防および／または治療剤）
　強皮症は、皮膚が硬くなる皮膚障害を主な症状とする病気であり、皮膚や内臓が硬くなる変化（硬化）を特徴として慢性に経過する全身性強皮症と、皮膚のみに硬化が起こる限局性強皮症に大別される。
　全身性強皮症は、主に、自己免疫、線維化および血管障害という３つの異常が起こる疾患であると考えられている。自己免疫の結果、抗セントロメア抗体、抗トポイソメラーゼＩ（Scl-70）抗体、抗U1RNP 抗体、抗RNA ポリメラーゼ抗体等の自己抗体が陽性となる。これらの自己抗体は、症状が起こる前に血液中に現れてくると考えられているため、これら自己抗体が陽性となった患者には、症状が現れていなくとも、予防の意味で本発明の剤を適用してもよい。
　線維化は、線維芽細胞が活発に膠原線維を産生することにより、皮膚に過剰な膠原線維が蓄積して起こる。この過剰な膠原線維の産生は、リンパ球が皮膚において様々な細胞成長因子やサイトカインと呼ばれる物質を産生し、それらが複雑に作用しあって線維芽細胞を刺激することにより起こると考えられている。
　血管障害としては、レイノー症状が挙げられ、これは全身性強皮症患者のうち80％以上でみられる障害である。レイノー症状とは、寒冷や情動的ストレスに反応して手の各部に起こる血管攣縮であり、手指に可逆的な不快感および色の変化（蒼白、チアノーゼ、紅斑またはその組み合わせ）を引き起こす。また、上記線維化が血管にも起こると、血管が硬くなって血流低下を来たし、潰瘍を形成する一因となる。このような血管の硬化と血流低下は、皮膚だけではなく、内臓にも起こる。例えば、肺の血管に起こると肺高血圧症となり、腎臓の血管に起こると強皮症腎クリーゼと呼ばれる症状となる。また、強皮症の患者では、爪上皮出血点がみられることがあり、これも血管障害を反映する症状と考えられている。
　「全身性強皮症・診断基準 2010 年」によれば、手指あるいは足趾を越える皮膚硬化を大基準とし、１）手指あるいは足趾に限局する皮膚硬化、２）手指尖端の陥凹性瘢痕、あるいは指腹の萎縮、３）両側性肺基底部の線維症、４）抗トポイソメラーゼＩ(Scl-70) 抗体または抗セントロメア抗体または抗RNA ポリメラーゼIII 抗体陽性を小基準とした場合、大基準、あるいは小基準１）かつ２）～４）の１項目以上を満たせば、全身性強皮症と診断される。
　限局性強皮症は、皮膚ならびにその下床である皮下脂肪織、筋および骨に線維性の硬化をきたす疾患であり、この線維性硬化が皮膚における皮疹として認識される。この皮疹は患者により非常に多種多様であり、皮膚硬化が明らかに認識される場合もある一方、陥凹局面として認識される場合もある。皮疹の色調は、紅斑を伴うものや、褐色、白色を呈することが多い。皮疹の形状から、斑状強皮症（モルフィア）と線状強皮症に分類される。線状強皮症の特殊型として、顔面・頭頸部に生じたものは剣創状強皮症と呼ばれ、頭皮に及んで脱毛を生じさせる。斑状強皮症は、皮疹の大きさや数に基づいて、限局型、滴状型、多発型に分類される。
　本発明において、強皮症の予防とは、強皮症を発症させないことを意味する。また、強皮症予防には、発症初期等の様々な段階における強皮症症状のそれ以上の悪化を阻止または抑制することを含む。強皮症の治療とは、強皮症症状の改善、緩和、悪化の阻止または抑制することを意味する。
　（Ｔｈ２亢進抑制剤）
　ヘルパーＴ細胞のサブセットには、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２細胞がある。Ｔｈ１は細胞性免疫を活性化し、Ｔｈ２は体液性免疫を活性化するものであり、相互のバランスにより免疫応答が制御されている。このＴｈ１／Ｔｈ２バランスが適切に制御されないと、自己免疫疾患等の様々な疾病を起こす原因となり得る。たとえば、自己免疫疾患は、大別すると、バセドウ病等の臓器特異性のものと、強皮症等の全身性（臓器非特異性）のものとに分類されるが、一般的に、Ｔｈ１が亢進すると臓器特異性自己免疫疾患が誘発され、Ｔｈ２が亢進すると、全身性自己免疫疾患が誘発される。本発明におけるＴｈ２亢進抑制剤は、そのようなＴｈ２の亢進状態を抑制するものである。したがって、本発明におけるＴｈ２亢進抑制剤は、強皮症、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、多発性筋炎、皮膚筋炎、シェーグレン症候群、混合性結合組織病、抗リン脂質抗体症候群、顕微鏡的多発血管炎、多発血管炎性肉芽腫症等の全身性自己免疫疾患に適用可能である。
　（血管安定化剤）
　本発明における血管安定化とは、血管脆弱性および／または血管透過性が亢進した状態を改善すること、血管外漏出を改善することを指す。そのため、本発明における血管安定化剤は、血管脆弱性、血管透過性亢進および／または血管外漏出症状を示す疾患、たとえば、血管漏出症候群、エーラスダンロス症候群、シェーンライン・ヘノッホ紫斑病または単純性紫斑病等の各種紫斑病、遺伝性出血性毛細血管拡張症（ランデュ・オスラー・ウェーバー病）等に適用可能である。他に、抗がん剤血管外漏出を予防するために、抗がん剤投与前の患者に予防措置として適用してもよい。
（グリチルレチン酸類および／またはその塩）
　本発明におけるグリチルレチン酸類としては、５環性トリテルペン構造を含むものを意味し、例えば、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸、１８α－グリチルレチン酸３－O-グルクロニド、グリチルレチン酸メチル、グリチルレチン酸ステアリル、グリチルレチン酸ピリドキシン、グリチルレチン酸グリセリル、ステアリン酸グリチルレチニル、およびカルベノキソロン等が挙げられるが、それらに限定されない。これらは単独で、または２種類以上を併用して用いることができる。それらのグリチルレチン酸類の中で、グリチルリチン酸が好ましい。また、本発明におけるグリチルレチン酸類としては、グリチルレチン酸類を含む限り、マメ科植物である甘草の粗抽出物であってもよい。
　本発明のグリチルレチン酸類の塩としては、薬学的に許容されるものであればよく、例えばアルカリ金属（カリウム、ナトリウム等）の塩、アルカリ土類金属（カルシウム、マグネシウム等）の塩、アンモニウム塩、薬学的に許容される有機アミン（テトラメチルアンモニウム、トリエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、シクロペンチルアミン、ベンジルアミン、フェネチルアミン、ピペリジン、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、リジン、アルギニン、N-メチル-D-グルカミン等）の塩があげられる。特に、アンモニウム塩またはアルカリ金属塩
が好ましく、グリチルリチン酸・２ナトリウム塩、グリチルリチン酸・２カリウム塩またはグリチルリチン酸・モノアンモニウム塩がより好ましい。これらは単独で、または２種類以上を併用して用いることができる。また、これら塩の定義は、上記グリチルリチン酸の脂肪酸エステル類（例えばグリチルリチン酸ステアリル、グリチルリチン酸グリセリルなど）にも適用できる。
　本発明における剤は、単独で使用しても良いが、公知の強皮症予防・治療剤、Ｔｈ２亢進抑制剤または血管安定剤と併用して使用することも可能である。併用することによって、予防・治療効果を高めることが期待される。併用する予防・治療剤は、本発明における剤の効果を減弱または消失させない限りにおいて、本発明における剤の成分として含有させても良いし、本発明の剤とは別に製剤化して、本発明の剤と組み合わせて配置し、使用時に併用するタイプのキットとしてもよい。
　製剤化に関しては、本発明の効果を損なわない限り、上記の有効成分以外の副成分として、必要に応じて賦形剤、滑沢剤、崩壊剤、結合剤、安定剤、界面活性剤、希釈剤、添加物、潤滑剤、防腐剤、コーティング剤等を含有させて、医薬組成物としてもよい。グリチルレチン酸類および／またはその塩の高濃度溶液は、胃などの低pH下においては、ゲル化のおそれがある。それを防止するには、高pH化を可能とするリン酸塩（リン酸一水素二ナトリウムやリン酸二水素カリウムなど）およびゲル化を防止する作用を有するL-アルギニンを添加することが効果的である。また、本発明における剤の製剤形態は特に限定されず、用法に応じて適宜選択できる。具体的には、錠剤、丸剤、散剤、液剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、ゲル剤、煎じ薬等を例示できる。
　本発明におけるグリチルレチン酸類および／またはその塩の投与量は、薬効が発現できる量であれば特に制限はなく、症状、年齢等によって異なるが、好ましくは１回量が５０～１５０ｍｇ、より好ましくは７０～１００ｍｇ、さらにより好ましくは８０ｍｇで、１日１～数回投与することができる。投与方法に制限はなく、たとえば、経口投与、舌下投与、静脈内投与、皮下投与、経皮投与および腹腔内投与等が挙げられる。投与対象は、いかなる動物であってもよいが、ヒト、マウス、ラット、サル、ウサギ、モルモット等が例示され、特にヒトが好ましい。
　以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り、これらの実施例に限定されるものではない。
＜実施例１＞強皮症の線維化に関する検討
　8週齢のC57BL/6マウス（野生型）の背部皮膚に、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で1mg/mlとなるように調製したブレオマイシン(BLM)溶液を、300μgずつ4週間連日皮内注射し、BLM誘発強皮症モデルマウスを作製した。対照群は、同量のPBSを皮下注射した。また、同時に、PBSで溶解したグリチルリチン酸モノアンモニウム（宏輝株式会社）を、30mg/kgの用量で腹腔内に4週間連日投与した。対照群は、同量のPBSを腹空内投与した。直径 6 mm の皮膚生検パンチを用いて注射部位の皮膚組織を採取し、Hematoxylin & Eosin染色を行って真皮厚を測定した。また、同様の方法で採取した皮膚検体において、QuickZyme Total Collagen Assay kit (QuickZyme BioSciencesB.V, Netherlands)を用いてコラーゲン含量を定量した。
　上記BLM誘発強皮症モデルマウスの注射部位である背部皮膚を用いて、パラフィン切片を作製し、VEVTOR M.O.M Immunodetection Kit (Vector laboratories, Burlingame, CA, USA)の製品マニュアルにしたがって、抗α-smooth muscle actin (α-SMA)抗体(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)と反応させた後、DAB(0.2mg/ml ,DOJINDO LABORATORIES, kumamoto, JAPAN)で発色させた。マウスの皮膚検体ごとに、真皮浅層を400倍の視野でランダムに3枚写真撮影し、α-SMA陽性の紡錘形細胞の数をカウントした。平均値をそのマウスのα-SMA陽性線維芽細胞数とし、グリチルリチン酸群と対照群で比較を行った。
　さらに、上記BLM誘発強皮症モデルマウスの注射部位である背部皮膚から、RNeasy min kit（Qiagen Valencia, CA, USA）によりＲＮＡを抽出し、iScript cDNA Synthesis Kits（Bio-Rad, Hercules, CA, USA）を用いてcDNAに逆転写した。定量的リアルタイムPCRはSYBR Green PCR Master Mix （Life technologies）を用いてABI prism 7000 （Life technologies）で施行、測定した。いずれの検体もtriplicatesで測定し、その平均を値として用いた。リファレンス遺伝子としてはGapdhを用いて、対象遺伝子のmRNAの相対発現量をΔΔCt methodにて算出した。プライマーは以下の配列のものを用いた。
Col1a1
　F:GCCAAGAAGACATCCCTGAAG（配列番号１）
　R:TGTGGCAGATACAGATCAAGC（配列番号２）
Col1a2
　F:GGAGGGAACGGTCCACGAT（配列番号３）
　R:GAGTCCGCGTATCCACAA（配列番号４）
Col3a1
　F:TTTGTGCAAGTGGAACCTG（配列番号５）
　R:TGGACTGCTGTGCCAAAATA（配列番号６）
Mmp13
　F:TGATGGCACTGCTGACATCAT（配列番号７）
　R:TGTAGCCTTTGGAACTGCTT（配列番号８）
Thbs1
　F:TGGTAGCTGGAAATGTGGTG（配列番号９）
　R:CAGGCACTTCTTTGCACTCA（配列番号１０）
Gapdh
　F:CGTGTTCCTACCCCCAATGT（配列番号１１）
　R:TGTCATCATACTTGGCAGGTTTCT（配列番号１２）
＜結果＞
　まず、BLM誘発強皮症モデルマウスにおける線維化について検討するために、当該マウスの真皮厚を測定したところ、BLMの代わりにPBSを投与した対照マウスよりも、モデルマウスの真皮厚は肥厚した（図１AおよびB）。すなわち、BLMで強皮症を誘発することにより、真皮厚は肥厚した。そして、それらモデルマウスおよび対照マウスに、グリチルリチン酸を投与すると、BLM誘発強皮症モデルマウスにおける真皮の肥厚が減少したことが示された（図１AおよびB）。一方、BLM誘発を行っていない対照マウスでは、グリチルリチン酸投与により真皮厚は変化しなかったため、グリチルリチン酸は、正常な真皮には働きかけず、強皮症モデルマウスにおける肥厚した真皮にのみ、肥厚抑制効果を発揮することが示された。
　BLM誘発強皮症モデルマウスにおいて、膠原線維（コラーゲン）の定量を行ったところ、BLM誘発強皮症モデルマウスにおいて増加した膠原線維の量は、グリチルリチン酸の投与により減少した（図１C）。BLM誘発を行っていない対照マウスにおいては、グリチルリチン酸投与により膠原線維の量は変化しなかったため、グリチルリチン酸は、正常なマウスの膠原線維には働きかけず、強皮症モデルマウスにおける膠原線維にのみ効果を発揮することが示された。
　また、BLM誘発強皮症モデルマウスにグリチルリチン酸を投与すると、皮膚の筋線維芽細胞数が有意に減少した（図２AおよびB）。筋線維芽細胞は膠原線維を産生することが知られているため、上記強皮症モデルマウスにおけるグリチルリチン酸投与による膠原線維の減少の一因は、筋線維芽細胞を減少することによるものであると考えられる。
　さらに、強皮症モデルマウスにおいて、膠原線維産生に関係する遺伝子のmRNA量を測定したところ、膠原線維をコードするコラーゲン遺伝子であるCol1a1、Col1a2およびCol3a1のmRNAはグリチルリチン酸の投与により有意に減少し、コラゲナーゼをコードする遺伝子であるMmp13のmRNAはグリチルリチン酸の投与により有意に増加した。また、潜在型TGF-βを活性型TGF-βに変換するトロンボスポンジン（Thbs1）のmRNAも、強皮症モデルマウスへのグリチルリチン酸の投与により減少した。活性型TGF-βは膠原線維の産生を促進することが知られている。
　以上より、BLM誘発強皮症モデルマウスにおいて、線維化に対する検討を行ったところ、グリチルリチン酸の投与により、真皮の肥厚および膠原線維量が減少する効果が示された。当該効果は、膠原線維を産生する筋線維芽細胞数の減少、コラーゲン遺伝子のmRNA発現量の減少、コラゲナーゼ遺伝子のmRNA発現量の増加、トロンボスポンジンmRNA発現量の減少によるものであることが示唆された。
＜実施例２＞強皮症の炎症及び免疫異常に関する検討
　BLM誘発強皮症モデルマウスを、ブレオマイシン投与処理を1週間だけ行うこと以外は実施例１と同様の処理をして作製し、最終投与翌日にマウスの両側鼠径リンパ節と脾臓を摘出した。リンパ節はすり潰してリンパ球を分離した。脾臓から取り出した血球は、RBC lysis buffer (0.0017M Trizma, Sigma-Aldrich, 0.1M NH4Cl 2.675g, Sigma-Aldrich) を添加してリンパ球を分離した。リンパ球は抗CD3抗体(17A2),抗CD4抗体(RM4-5),抗CD8a抗体53-6.7)を用いて表面抗原の染色を行った。また10 ng/ml phorbol myristate acetate (Sigma-Aldrich), 1μg/ml ionomycin(Sigma-Aldrich), 1μg/ml brefeldin A (GolgiStop; BD PharMingen)で4時間刺激を行い、抗インターロイキン（IL）-4抗体(11B11)、抗IL17A抗体(TC11-18HC0.1)、抗インターフェロン（ＩＦＮ）-γ抗体(XMG1.2)(抗体は全てBioLegend, San Diego, CA, USA)を用いて、細胞内抗原の染色を行った。染色されたリンパ球をFACS　Verseflow cytometer (BD Biosciences)を用いて解析した。
　さらに、上記BLM誘発強皮症モデルマウスの注射部位である背部皮膚から、実施例１と同様の方法でＲＮＡを抽出し、ＩＬ４、ＩＬ１ｂ、およびアルギナーゼのｍＲＮＡ量を測定した。プライマーは以下の配列のものを用いた。
Il4
　F:ACGGAGATGGATGTGCCAAACGTC（配列番号１３）
　R:CGAGTAATCCATTTGCATGATGC（配列番号１４）
Il1b
　F:TTGACGGACCCCAAAAGAT（配列番号１５）
　R:GAAGCTGGATGCTCTCATCTG（配列番号１６）
Arg1
　F:CAGAAGAATGGAAGAGTCAG（配列番号１７）
　R:CAGATATGCAGGGAGTCACC（配列番号１８）
＜結果＞
　BLM誘発強皮症モデルマウスにおいて、リンパ節または脾臓におけるＣＤ４陽性T細胞に占めるＩＬ４陽性細胞の割合を、ＦＡＣＳにて測定したところ、リンパ節および脾臓のどちらにおいても、グリチルリチン酸の投与により、ＩＬ４陽性細胞は有意に減少していた（図３および４）。一方、ＣＤ４陽性細胞に占めるＩＦＮ－γまたはＩＬ１７Ａ陽性細胞の割合は、グリチルリチン酸の投与により変化しなかった。
　また、BLM誘発強皮症モデルマウスの皮膚組織中において、グリチルリチン酸投与がサイトカイン産生に及ぼす影響を検討した。その結果、インターロイキン４およびインターロイキン１ｂのmRNAが、グリチルリチン酸の投与により減少した。また、M2マクロファージのマーカーであるアルギナーゼのｍＲＮＡも、グリチルリチン酸の投与により減少した。
　以上より、BLM誘発強皮症モデルマウスにおいて、グリチルリチン酸が炎症および免疫異常に及ぼす影響を検討したところ、Ｔｈ２細胞であるＩＬ４陽性ＣＤ４陽性T細胞は、グリチルリチン酸の投与により有意に減少した。一方、Ｔｈ１細胞であるＩＦＮ－γ陽性ＣＤ４陽性Ｔ細胞と、Ｔｈ１７細胞であるＩＬ１７Ａ陽性ＣＤ４陽性Ｔ細胞は、グリチルリチン酸の投与による顕著な変化は観察されなかった。また、Ｔｈ２細胞への分化を誘導するＩＬ４および炎症促進性サイトカインであるＩＬ１ｂもグリチルリチン酸の投与により有意に減少し、さらに、ＩＬ４により誘導されるM2マクロファージのマーカーであるアルギナーゼも減少した。これらの結果から、グリチルリチン酸は、強皮症モデルマウスにおいて、炎症を抑制し、Ｔｈ２優位の環境を改善させる可能性が示唆された。強皮症は自己免疫疾患の１つであり、その患者は体液性免疫を活性化するＴｈ２細胞が優位となっていることが知られているが、グリチルリチン酸は、そのようなＴｈ２優位を抑制することが示唆された。
＜実施例３＞強皮症の血管障害に関する検討
　強皮症患者においては、線維化の他に血管内皮障害が見られるが、これは、血管内皮が線維芽細胞等の間葉系細胞に移行する（内皮間葉移行（Endo-MT））ことが原因である可能性が示唆されている。そこで、強皮症モデルマウスを用いて、グリチルリチン酸がEndo-MTにどのような影響を及ぼすかを検討した。
　実施例１と同じ条件で作製したＢＬＭ誘発強皮症モデルマウスの注射部位の皮膚検体を用いて、パラフィン切片を作製し、一次抗体としてrabbit抗VE-cadherin抗体(Santa Cruz Biotechnolog) とgoat抗fibroblast-specific protein 1 (FSP1)抗体(abcam, Cambridge, UK)を、二次抗体としてFITC-conjugated donkey 抗rabbit IgG抗体 (Santa Cruz Biotechnolog)とAlexa Fluor donkey 555 抗goat IgG抗体 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)を用いて反応させ、Vectashield with DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)で核の染色を行い、Bio Zero BZ-8000 (Keyence, Osaka, Japan) を用いて495nm (緑), 565 nm (赤), 400 nm (青)の波長で観察を行った。緑色に観察されるFSP1と赤色に観察されるVE-Cadherin が同時に染まる細胞(Endo-MTを起こした細胞)の数の比較を行った。また、上記皮膚検体から実施例１と同様の方法でＲＮＡを抽出し、Ｓｎａｉｌ１のｍＲＮＡ量を測定した。プライマーは以下の配列のものを用いた。
Snail1
　F:CAACTATAGCGAGCTGCAGGA（配列番号１９）
　R:ACTTGGGGTACCAGGAGAGAGT（配列番号２０）
　次に、強皮症における血管障害のモデルマウスである10週齢の血管内皮細胞特異的Fli1欠失マウス(Fli1flox/flox;Tie2-Cre：American Journal of Pathology, April 2010 Volume 176, Issue 4,p1983-1998参照)あるいは対照マウス(Fli1flox/flox)に、実施例１と同様の条件でグリチルリチン酸モノアンモニウムあるいはPBSの腹腔内投与を行った。2週間後、マウスの尾静脈に200μlのEvans blue dye (0.5% in PBS)を投与し、30分後にマウスを安楽死させた後、腹部正中より皮膚を切開し、真皮側から皮膚血管を肉眼的に観察し、色素の漏出の程度を評価した。また、エバンスブルーの血管外漏出量を測定するために、直径 4 mm の皮膚生検パンチを用いて3箇所皮膚を採取し、37℃で24時間formamide に溶解したのち、Microplate Reader を用いて620nmの波長の吸光度を測定した。
＜結果＞
　抗VE-cadherin抗体および抗FSP1抗体を用いて免疫染色を行った結果を、図５に示す。図５における下段の重ね合わせ写真には、矢印が付されており、これは、抗VE-cadherin抗体と抗FSP1抗体の両方で同時に染まった細胞であり、すなわち、Endo-MTを起こした細胞を示している。Endo-MTを起こした細胞は、ブレオマイシン投与により増加しており（図５のBLM+溶媒、下段）、当該増加作用はグリチルリチン酸の投与により抑制されている（図５のBLM+グリチルリチン酸、下段）。
　また、BLM誘発強皮症モデルマウスにおいて、Endo-MTを誘導するSnail1のmRNAを測定した。その結果、グリチルリチン酸の投与により、Snail１のmRNA量が有意に減少した。
　さらに、強皮症における血管障害のモデルマウスである血管内皮細胞特異的Fli1ノックアウトマウスを作製し、エバンスブルーの血管外への漏出を検討した。その結果、Fli1ノックアウトにより増加したエバンスブルーへの血管外への漏出量が、グリチルリチン酸の投与により有意に減少した（図６AおよびB）。
　以上から、グリチルリチン酸は、血管の安定性を改善することが示唆された。当該安定性の改善は、内皮間葉移行の抑制によるものである可能性が示唆された。
　本発明による強皮症予防および／または治療剤の投与により、強皮症を予防および／または治療することが可能となる。また、本発明の剤に含まれるグリチルレチン酸類および／またはその塩は、漢方において古来より用いられている甘草の主薬効成分であり、その安全性は広く認められていることから、安全に強皮症を予防および／または治療することが可能となる。また、グリチルレチン酸類および／またはその塩は、Ｔｈ２亢進抑制剤または血管安定化剤としても使用可能である。

Claims (6)

  1. 　グリチルレチン酸類および／またはその塩を含有する、強皮症予防および／または治療剤。
  2. 　前記グリチルレチン酸類が、グリチルリチン酸である、請求項１に記載の強皮症予防および／または治療剤。
  3. 　前記グリチルレチン酸類の塩が、アンモニウム塩またはアルカリ金属塩である、請求項１または２に記載の強皮症予防および／または治療剤。
  4. 　前記強皮症が、全身性強皮症である、請求項１～３のいずれか一項に記載の強皮症予防および／または治療剤。
  5. 　グリチルレチン酸類および／またはその塩を含有する、Ｔｈ２亢進抑制剤。
  6. 　グリチルレチン酸類および／またはその塩を含有する、血管安定化剤。
PCT/JP2016/078250 2015-09-30 2016-09-26 強皮症予防および／または治療剤 WO2017057265A1 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US15/763,527 US20180303859A1 (en) 2015-09-30 2016-09-26 Agent For Preventing And/Or Treating Scleroderma

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2015-192743 2015-09-30
JP2015192743A JP6741194B2 (ja) 2015-09-30 2015-09-30 強皮症予防および／または治療剤

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2017057265A1 true WO2017057265A1 (ja) 2017-04-06

Family

ID=58427482

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2016/078250 WO2017057265A1 (ja) 2015-09-30 2016-09-26 強皮症予防および／または治療剤

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20180303859A1 (ja)
JP (1) JP6741194B2 (ja)
WO (1) WO2017057265A1 (ja)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH10236967A (ja) * 1997-02-25 1998-09-08 Nippon High Potsukusu:Kk 甘草発酵物からなる薬剤
JPH10330256A (ja) * 1997-05-30 1998-12-15 Kureha Chem Ind Co Ltd グリチルレチン酸化合物含有ｈｓｐ４７合成抑制剤
JP2003119145A (ja) * 2001-10-09 2003-04-23 Minofuaagen Seiyaku:Kk 整形外科用薬剤

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1748767A (zh) * 2005-10-20 2006-03-22 北京阜康仁生物制药科技有限公司 狼疮制剂及新的制备方法
US9416151B2 (en) * 2010-08-25 2016-08-16 Lurong ZHANG Use of glycyrrhetinic acid, glycyrrhizic acid and related compounds for prevention and/or treatment of pulmonary fibrosis
US10214590B2 (en) * 2013-09-20 2019-02-26 Tufts Medical Center, Inc. Inhibitors of endoglin activity for the treatment of fibrosis

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH10236967A (ja) * 1997-02-25 1998-09-08 Nippon High Potsukusu:Kk 甘草発酵物からなる薬剤
JPH10330256A (ja) * 1997-05-30 1998-12-15 Kureha Chem Ind Co Ltd グリチルレチン酸化合物含有ｈｓｐ４７合成抑制剤
JP2003119145A (ja) * 2001-10-09 2003-04-23 Minofuaagen Seiyaku:Kk 整形外科用薬剤

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MASAHITO JINNIN: "Mechanism of fibrosis in the skin of systemic sclerosis", JOURNAL OF CLINICAL AND EXPERIMENTAL MEDICINE, vol. 251, no. 8, 2014, pages 609 - 613 *
WANG B. ET AL.: "Effect of compound glycyrrhizin on airway inflammation in asthmatic rats", ZHONGGUO YISHI ZAZHI, vol. 11, no. 4, 2009, pages 491 - 493 *
YAMASHITA T. ET AL.: "Glycyrrhizin Ameliorates Fibrosis, Vasculopathy, and Immune Abnormalities in Animal Models of Systemic Sclerosis", 2015 ACR/ARHP ANNUAL MEETING ABSTRACTS, 29 September 2015 (2015-09-29) *
YANG C. ET AL.: "High mobility group box protein1 as a novel vascular permeability factor derived from endothelial inflammasome activation during obesity", THE FASEB JOURNAL, vol. 28, no. 1, 2014 *

Also Published As

Publication number Publication date
JP2017066079A (ja) 2017-04-06
US20180303859A1 (en) 2018-10-25
JP6741194B2 (ja) 2020-08-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Gordon et al. Resveratrol decreases inflammation and increases utrophin gene expression in the mdx mouse model of Duchenne muscular dystrophy
Grenda et al. A randomized trial to assess the impact of early steroid withdrawal on growth in pediatric renal transplantation: the TWIST study
Geraghty et al. Neuroimmune interactions and osteoarthritis pain: focus on macrophages
Zou et al. Baicalin attenuates TNBS-induced colitis in rats by modulating the Th17/Treg paradigm
JP6638092B2 (ja) ピロロキノリンキノン、その誘導体及び／又は塩の乾燥症候群における使用ならびに医薬組成物
TW201615187A (zh) 用於舒緩及減輕近視之醫藥組合物及其製備方法與用途
Kim et al. Mechanism underlying the effect of combined therapy using glucosamine and low-dose cyclosporine A on the development of atopic dermatitis-like skin lesions in NC/Nga mice
Wang et al. The effects of anti-IL-23p19 therapy on atherosclerosis development in ApoE−/− mice
Wang et al. Electrophilic nitro-fatty acids suppress psoriasiform dermatitis: STAT3 inhibition as a contributory mechanism
Li et al. Sodium houttuyfonate plays a protective role in the asthmatic airway by alleviating the NLRP3-related pyroptosis and Th1/Th2 immune imbalance
Espinosa et al. Efficacy of cyclophosphamide in the treatment of interstitial lung disease associated with systemic sclerosis
WO2014180269A2 (zh) 间充质干细胞在预防或治疗应激反应导致的免疫力下降中的应用
WO2017057265A1 (ja) 強皮症予防および／または治療剤
Guo et al. Amygdalin and exercise training exert a synergistic effect in improving cardiac performance and ameliorating cardiac inflammation and fibrosis in a rat model of myocardial infarction
JP2024529764A (ja) カルシニューリン抑制剤と幹細胞を用いて免疫疾患を治療する方法
CN117597131A (zh) 包含牛磺脱氧胆酸或其药学上可接受的盐作为有效成分的新型冠状病毒肺炎治疗用组合物
CN112546056A (zh) 一种用于治疗化疗诱发的外周神经病变的组合物及其应用
AU2019276779A1 (en) Treatment of skin diseases or disorders by delivery of anti-osmrbeta antibody
JP7233087B2 (ja) 抗動脈硬化剤
Zha et al. Highly active antiretroviral therapy (HAART) and metabolic complications
WO2018213766A1 (en) Compositions and methods for improving cognition
Hassan et al. Potential Effect of Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells on Zymogen Granules and Rab3D in Parotid Salivary Glands of Senile Albino Rats
CN109939117B (zh) 环黄芪醇在制备治疗银屑病药物中的应用
Wang et al. Hydroxychloroquine ameliorates DSS-induced colitis by inhibiting M1 macrophage polarization through NF-κB/NLRP3 signaling pathway
JP2018513862A (ja) シェーグレン症候群の治療にける使用のための特定のトリフルオロエチルキノリン類似体

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 16851436

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 15763527

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 16851436

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1