WO2017043418A1 - 脂質の製造方法 - Google Patents

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acid sequence
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    • C12Y301/02—Thioester hydrolases (3.1.2)
    • C12Y301/02014—Oleoyl-[acyl-carrier-protein] hydrolase (3.1.2.14), i.e. ACP-thioesterase

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing lipids.
  • the present invention also relates to a glycerol-3-phosphate dehydrogenase used in the method, a gene encoding the same, and a transformant that promotes the expression of the gene.
  • Fatty acids are one of the main components of lipids, and constitute lipids (oils and fats) such as triacylglycerol produced by ester bonds with glycerin in vivo. In many animals and plants, fatty acids are also stored and used as energy sources. Fatty acids and lipids stored in animals and plants are widely used for food or industry. For example, derivatives of higher alcohols obtained by reducing higher fatty acids having about 12 to 18 carbon atoms are used as surfactants. Alkyl sulfate esters and alkylbenzene sulfonates are used as anionic surfactants. Polyoxyalkylene alkyl ethers, alkyl polyglycosides, and the like are used as nonionic surfactants.
  • surfactants are used as cleaning agents, disinfectants, and the like.
  • Cationic surfactants such as alkylamine salts and mono- or dialkyl quaternary amine salts, which are derivatives of the same higher alcohol, are routinely used for fiber treatment agents, hair rinse agents, disinfectants, and the like.
  • Benzalkonium-type quaternary ammonium salts are routinely used for bactericides and preservatives.
  • plant-derived lipids are also used as raw materials for biodiesel fuel.
  • fatty acids and lipids are widely used, and therefore, attempts have been made to improve the productivity of fatty acids and lipids in vivo in plants and the like.
  • attempts have been made to control the number of carbon atoms of fatty acids, that is, the chain length.
  • Plant fatty acid synthesis pathway is localized in chloroplasts.
  • acetyl-ACP acyl carrier protein
  • acyl-ACP acyl which is a fatty acid residue
  • a complex comprising a group and an ACP).
  • the synthesized acyl-ACP becomes a free fatty acid by acyl-ACP thioesterase (hereinafter also simply referred to as “TE”). Free fatty acids are bound to CoA by acyl-CoA synthetase.
  • Glycerol-3-phosphate dehydrogenase (hereinafter also referred to simply as “G3PDH”) reduces dihydroxyacetone phosphate (DHAP) and converts it to glycerol-3-phosphate in lipid synthesis It is known to act to catalyze the reaction to supply the glycerol skeleton. Therefore, in order to accumulate glycerolipids in plants and yeasts, enhancement of expression of G3PDH and modification of G3PDH itself have been proposed (see Patent Documents 1 to 3 and Non-Patent Document 1). Also in algae, it has been reported that the amount of lipid increases by enhancing the expression of G3PDH (see Non-Patent Document 2).
  • algae has attracted attention as being useful for biofuel production.
  • Algae are attracting attention as next-generation biomass resources because they can produce lipids that can be used as biodiesel fuel by photosynthesis and do not compete with food.
  • the present invention relates to a method for producing a lipid, in which a transformant in which expression of a gene encoding the following protein (A) or (B) is promoted is cultured to produce a fatty acid or a lipid comprising the same.
  • a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • B A protein comprising an amino acid sequence having an identity of 64% or more with the amino acid sequence of the protein (A) and having glycerol 3-phosphate dehydrogenase activity.
  • the present invention also promotes the expression of the gene encoding the protein (A) or (B), and improves the productivity of medium-chain fatty acids produced in the cells of the transformant or lipids comprising this. To improve lipid productivity.
  • the present invention also relates to a method for improving lipid productivity, which promotes the expression of a gene encoding the protein (A) or (B) and improves the total amount of fatty acids produced in the cells of the transformant. Further, the present invention promotes the expression of the gene encoding the protein (A) or (B), and increases the productivity of medium chain fatty acids produced in the cells of the transformant or lipids comprising this as a constituent.
  • a method for modifying the composition of lipids which improves and modifies the composition of fatty acids or lipids in the total fatty acids or total lipids produced.
  • the present invention also relates to the protein (A) or (B).
  • the present invention also relates to a gene encoding the protein (A) or (B). Furthermore, this invention relates to the transformant which promoted the expression of the gene which codes the said protein (A) or (B).
  • the present invention relates to a method for producing a lipid, which improves the productivity of a medium chain fatty acid or a lipid comprising the same and the total amount of the fatty acid produced. Moreover, this invention relates to the transformant which improved the productivity of the lipid which uses a medium chain fatty acid or this as a structural component, and the total amount of the fatty acid produced.
  • the present inventors have newly identified G3PDH of algae belonging to the genus Nannochloropsis, which is a kind of algae, as an enzyme involved in lipid synthesis. As a result of promoting the expression of G3PDH in microorganisms, the present inventors have found that the productivity of the medium chain fatty acid produced or the lipid containing it as a constituent and the total amount of fatty acid produced are significantly improved. The present invention has been completed based on these findings.
  • the method for producing lipids of the present invention it is possible to improve the productivity of the medium chain fatty acids or lipids comprising the same and the total amount of fatty acids produced.
  • the transformant of the present invention is excellent in productivity of medium-chain fatty acids or lipids containing this as a constituent and productivity of all fatty acids produced.
  • lipid refers to simple lipids such as neutral fats (such as triacylglycerol), waxes, and ceramides; complex lipids such as phospholipids, glycolipids, and sulfolipids; and fatty acids derived from these lipids And derived lipids such as alcohols and hydrocarbons.
  • Cx: y in the notation of fatty acids and acyl groups constituting fatty acids means that the number of carbon atoms is x and the number of double bonds is y.
  • “Cx” represents a fatty acid or acyl group having x carbon atoms.
  • the identity of a base sequence and an amino acid sequence is calculated by the Lipman-Pearson method (Science, 1985, vol. 227, p. 1435-1441). Specifically, it is calculated by performing an analysis assuming that Unit size to compare (ktup) is 2 using the homology analysis (Search homology) program of genetic information processing software Genetyx-Win.
  • “stringent conditions” include, for example, Molecular Cloning-A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION [Joseph Sambrook, David W., et al. Russell., Cold Spring Harbor Laboratory Press].
  • upstream of a gene indicates not a position from the translation start point but a region continuing on the 5 ′ side of the gene or region regarded as a target.
  • downstream of a gene indicates a region continuing 3 ′ side of the gene or region captured as a target.
  • the proteins (A) and (B) are one type of oxidoreductase, and are proteins that catalyze a reduction reaction from dihydroxyacetone phosphate to glycerol 3-phosphate.
  • the protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is G3PDH derived from Nannochloropsis oculata NIES2145 strain, which is an algae belonging to the genus Nannochloropsis.
  • G3PDH activity means an activity of catalyzing a reduction reaction from dihydroxyacetone phosphate to glycerol 3-phosphate.
  • the fact that a protein has G3PDH activity means that, for example, a DNA in which a gene encoding the protein is linked downstream of a promoter that functions in the host cell is introduced into the host cell, and the cell is subjected to conditions under which the introduced gene is expressed.
  • G3P glycerol-3-phosphate
  • the proteins (A) and (B) were determined to be G3PDH.
  • the amount of G3P in the Nannochloropsis oculata strain NIES-2145 introduced with the genes encoding the proteins (A) and (B) is significantly improved as compared with the wild strain.
  • the productivity of medium chain fatty acids such as 12 or 14 carbon atoms and the total amount of fatty acids produced Will improve.
  • the “medium chain” means that the acyl group has 6 to 14 carbon atoms, preferably 8 to 14 carbon atoms, more preferably 10 to 14 carbon atoms, and more preferably It means that the number of carbon atoms is 12 or more and 14 or less, more preferably 12 or 14.
  • the identity with the amino acid sequence of the protein (A) is preferably 65% or more, preferably 70% or more, more preferably 75% or more, and more preferably 80% or more.
  • 83% or more is more preferable, 85% or more is more preferable, 87% or more is more preferable, 90% or more is more preferable, 93% or more is more preferable, 95% or more is more preferable, 97% or more is more preferable 98% or more is more preferable, and 99% or more is more preferable.
  • the amino acid sequence of the protein (A) is one or more, for example, 1 to 167, preferably 1 to 162, more preferably 1 to 139.
  • proteins in which the amino acids are deleted, substituted, inserted or added are proteins in which the amino acids are deleted, substituted, inserted or added.
  • Examples of the method for introducing a mutation into an amino acid sequence include a method for introducing a mutation into a base sequence encoding an amino acid sequence.
  • Examples of the method for introducing mutation include site-specific mutagenesis.
  • Specific methods for introducing site-specific mutations include a method using SOE-PCR, an ODA method, a Kunkel method, and the like. Also, commercially available kits such as Site-Directed Mutagenesis System Mutan-SuperExpress Km Kit (Takara Bio), Transformer TM Site-Directed Mutagenesis Kit (Clonetech), KOD-Plus-Mutagenesis Kit (Toyobo) may be used. it can. Moreover, after giving a random gene mutation, the target gene can also be obtained by performing enzyme activity evaluation and gene analysis by an appropriate method.
  • the proteins (A) and (B) can be obtained by ordinary chemical techniques, genetic engineering techniques, and the like.
  • a protein derived from a natural product can be obtained by isolation, purification or the like from Nannochloropsis oculata.
  • the proteins (A) and (B) can be obtained by artificial chemical synthesis based on the amino acid sequence information shown in SEQ ID NO: 1.
  • the proteins (A) and (B) may be prepared as recombinant proteins by genetic recombination techniques.
  • the G3PDH gene described later can be used.
  • algae such as Nannochloropsis oculata can be obtained from a preservation organization such as a private or public laboratory.
  • Nannochloropsis oculata strain NIES-2145 can be obtained from the National Institute for Environmental Studies (NIES).
  • G3PDH gene a gene comprising the following DNA (a) or (b) (hereinafter also referred to as “NoG3PDH gene”)
  • A DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • B A DNA encoding a protein having a base sequence having 59% or more identity with the base sequence of the DNA (a) and having G3PDH activity.
  • the base sequence of SEQ ID NO: 2 is the base sequence of a gene encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (G3PDH derived from Nannochloropsis oculata NIES2145 strain).
  • the identity with the base sequence of the DNA (a) is preferably 60% or more, preferably 65% or more, preferably 70% or more, more preferably 75% or more. 80% or more, more preferably 83% or more, more preferably 85% or more, more preferably 87% or more, more preferably 90% or more, more preferably 93% or more, and more preferably 95% or more, 97% or more is more preferable, 98% or more is more preferable, and 99% or more is more preferable.
  • the DNA (b) one or more, for example, 1 to 573, preferably 1 to 559, more preferably 1 to 489 in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, More preferably 1 to 419, more preferably 1 to 349, more preferably 1 to 279, preferably 1 to 209, more preferably 1 to 181, more Preferably 1 to 139, more preferably 1 to 97, more preferably 1 to 69, more preferably 1 to 41, more preferably 1 to 27, Also preferred is a DNA encoding a protein having 1 to 13 bases deleted, substituted, inserted or added and having G3PDH activity. Further, the DNA (b) is also preferably a DNA that hybridizes with a DNA comprising a base sequence complementary to the DNA (a) under stringent conditions and encodes a protein having G3PDH activity.
  • the method for promoting the expression of the G3PDH gene can be appropriately selected from conventional methods. Examples thereof include a method of introducing the G3PDH gene into a host, and a method of modifying an expression regulatory region (promoter, terminator, etc.) of the gene in a host having the G3PDH gene on the genome.
  • a substance that promotes the expression of a gene encoding a target protein is also referred to as a “transformant”, and a substance that does not promote the expression of a gene encoding a target protein is referred to as a “host” or “ Also referred to as “wild strain”.
  • the transformant used in the present invention is produced as compared to the host itself or the wild strain, and the productivity of medium-chain fatty acids and lipids comprising them (production amount of medium-chain fatty acids or lipids comprising them).
  • the ratio of medium-chain fatty acids in all fatty acids or in all lipids or lipids comprising this as a constituent component) is significantly improved.
  • the fatty acid composition in the lipid is modified. Therefore, the present invention using the transformant is a lipid having a specific number of carbon atoms, particularly a medium chain fatty acid or a lipid comprising this, preferably a fatty acid having 6 to 14 carbon atoms or a constituent thereof.
  • a fatty acid having 8 to 14 carbon atoms or a lipid comprising this as a constituent more preferably a fatty acid having 10 to 14 carbon atoms or a lipid comprising this, more preferably Fatty acids having 12 or more and 14 or less carbon atoms or lipids comprising the same, more preferably fatty acids having 12 or 14 carbon atoms or lipids comprising the same, more preferably 12 or 14 carbon atoms
  • saturated fatty acids lauric acid, myristic acid
  • the transformant of the present invention significantly improves the productivity of medium-chain fatty acids and lipids comprising them as components, as well as the total amount of fatty acids produced, as compared to the host itself. Therefore, the present invention using the transformant can be suitably used for lipid production.
  • the productivity of fatty acids and lipids in the host and transformant can be measured by the method used in the examples.
  • the G3PDH gene can be obtained by ordinary genetic engineering techniques.
  • the G3PDH gene can be artificially synthesized based on the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or the base sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • services such as Invitrogen can be used.
  • It can also be obtained by cloning from Nannochloropsis oculata.
  • Nannochloropsis oculata NIES-2145 used in the examples can be obtained from the National Institute for Environmental Studies (NIES).
  • a transformant that can be preferably used in the present invention can be obtained by introducing the G3PDH gene into the host by a conventional method. Specifically, it can be prepared by preparing a recombinant vector or gene expression cassette capable of expressing the G3PDH gene in a host cell, introducing the gene into a host cell, and transforming the host cell.
  • the host for the transformant can be appropriately selected from those usually used.
  • hosts that can be used in the present invention include microorganisms (including algae and microalgae), plants, and animals. From the viewpoint of production efficiency and availability of the obtained lipid, the host is preferably a microorganism or a plant, more preferably a microorganism, and even more preferably a microalgae.
  • the microorganism may be either prokaryotic, eukaryotic, Escherichia (Escherichia) genus microorganisms or Bacillus (Bacillus) genus microorganisms, Synechocystis (Synechocystis) microorganism of the genus, Synechococcus (Synechococcus) genus microorganism of Prokaryotes or eukaryotic microorganisms such as yeast and filamentous fungi can be used.
  • Escherichia coli Escherichia coli
  • Bacillus subtilis Bacillus subtilis
  • red yeast Rhodosporidium toruloides
  • Mortierella sp Mortierella sp.
  • Chlamydomonas Chlamydomonas
  • Chlorella Chlorella
  • Faye Oda Kuti ram Phaeodactylum
  • Nan'nokuroro Algae of the genus Psis are preferred, and algae of the genus Nannochloropsis are more preferred.
  • Nannochloropsis gaditana examples include Nannochloropsis gaditana , Nannochloropsis salina , Nannochloropsis oceanica , Nannochloropsis oceanica , Nannochloropsis oceanica Examples thereof include Nannochloropsis atomus , Nannochloropsis maculata , Nannochloropsis granulata , Nannochloropsis sp.
  • Nannochloropsis oculata or Nannochloropsis gaditana is preferable, and Nannochloropsis oculata is more preferable.
  • Arabidopsis thaliana As the plant body, Arabidopsis thaliana , Brassica napus , Brassica rapa , Cocos nucifera , Palm ( Elaeis guineensis ), caffe, soybean, from the viewpoint of high lipid content in seeds ( Glycine max ), corn ( Zea mays ), rice ( Oryza sativa ), sunflower ( Helianthus annuus ), camphor ( Cinnamomum camphora ), or jatropha ( Jatropha curcas ) are preferable, and Arabidopsis is more preferable.
  • a gene capable of introducing a gene encoding a target protein into a host and expressing the gene in a host cell I just need it.
  • a vector having an expression regulatory region such as a promoter or terminator according to the type of host to be introduced, and a vector having a replication origin or a selection marker can be used.
  • it may be a vector that autonomously grows and replicates outside the chromosome, such as a plasmid, or a vector that is integrated into the chromosome.
  • an expression vector that can be preferably used in the present invention, when a microorganism is used as a host, for example, pBluescript (pBS) II SK (-) (Stratagene), pSTV vector (Takara Bio), pUC vector (Takara Shuzo), pET vector (Takara Bio), pGEX vector (GE Healthcare), pCold vector (Takara Bio), pHY300PLK (Takara Bio), pUB110 ( Mckenzie, T. et al., 1986, Plasmid 15 (2), p.
  • pBR322 (Takara Bio), pRS403 (Stratagene), and pMW218 / 219 (Nippon Gene) It is done.
  • pBluescript II SK ( ⁇ ) or pMW218 / 219 is preferably used.
  • pUC19 manufactured by Takara Bio Inc.
  • P66 Cholamydomonas Center
  • P-322 Cholamydomonas Center
  • pPha-T1 Yangmin Gong, et al., Journal of Basic Microbiology, 2011, vol.
  • pJET1 manufactured by Cosmo Bio
  • the host is an algae belonging to the genus Nannochloropsis
  • pUC19, pPha-T1, or pJET1 is preferably used.
  • pJET1 is an algae belonging to the genus Nannochloropsis, Oliver Kilian, et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2011, vol.
  • a host can also be transformed with a DNA fragment (gene expression cassette) comprising a target gene, a promoter and a terminator.
  • Examples of the DNA fragment include a DNA fragment amplified by PCR and a DNA fragment cleaved with a restriction enzyme.
  • pRI vectors manufactured by Takara Bio Inc.
  • pBI vectors manufactured by Clontech
  • IN3 vectors manufactured by Implanta Innovations
  • the host is Arabidopsis thaliana
  • pRI vectors or pBI vectors are preferably used.
  • promoter that regulates the expression of the gene encoding the target protein incorporated in the expression vector
  • Promoters that can be preferably used in the present invention can be induced by the addition of lac promoter, trp promoter, tac promoter, trc promoter, T7 promoter, SpoVG promoter, isopropyl ⁇ -D-1-thiogalactopyranoside (IPTG).
  • Promoters related to various derivatives Rubisco operon (rbc), PSI reaction center protein (psaAB), PSII D1 protein (psbA), cauliflower mosil virus 35SRNA promoter, housekeeping gene promoter (eg, tubulin promoter, actin promoter, ubiquitin promoter) etc.), rape or oilseed rape derived Napin gene promoter, a plant-derived Rubisco promoters, Nannochloropsis from the genus violaxanthin / chlorophyll a binding protein gene promoter VCP1 promoter, VCP2 promoter) (Oliver Kilian, et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2011, vol.
  • Nannochloropsis lipid droplet surface protein gene promoter
  • the promoter of a violaxanthin / chlorophyll a binding protein gene or the promoter of an oleosin-like protein LDSP gene derived from the genus Nannochloropsis can be preferably used.
  • the type of selectable marker for confirming that the gene encoding the target protein has been incorporated can be appropriately selected according to the type of host used.
  • Selectable markers that can be preferably used in the present invention include ampicillin resistance gene, chloramphenicol resistance gene, erythromycin resistance gene, neomycin resistance gene, kanamycin resistance gene, spectinomycin resistance gene, tetracycline resistance gene, blasticidin S Drug resistance genes such as resistance genes, bialaphos resistance genes, zeocin resistance genes, paromomycin resistance genes, and hygromycin resistance genes. Furthermore, a gene deficiency associated with auxotrophy can be used as a selectable marker gene.
  • transformation method can be appropriately selected from conventional methods according to the type of host used. For example, transformation methods using calcium ions, general competent cell transformation methods, protoplast transformation methods, electroporation methods, LP transformation methods, methods using Agrobacterium, particle gun methods, etc. .
  • transformation methods using calcium ions For example, transformation methods using calcium ions, general competent cell transformation methods, protoplast transformation methods, electroporation methods, LP transformation methods, methods using Agrobacterium, particle gun methods, etc.
  • transformation can also be performed using the electroporation method described in Randor Radakovits, et al., Nature Communications, DOI: 10.1038 / ncomms1688, 2012, or the like.
  • ⁇ Selection of transformant introduced with target gene fragment> can be performed by using a selection marker or the like.
  • a drug resistance gene acquired by a transformant as a result of introduction of a drug resistance gene into a host cell together with a target DNA fragment at the time of transformation can be used as an indicator.
  • the introduction of the target DNA fragment can be confirmed by a PCR method using a genome as a template.
  • “Expression regulatory region” refers to a promoter or terminator, and these sequences are generally involved in regulating the expression level (transcription level, translation level) of adjacent genes.
  • the expression regulatory region of the gene is modified to promote the expression of the G3PDH gene, thereby improving the productivity of medium-chain fatty acids or lipids composed thereof. be able to.
  • Examples of the method for modifying the expression regulatory region include promoter replacement.
  • the expression of the G3PDH gene can be promoted by replacing the promoter of the gene (hereinafter also referred to as “G3PDH promoter”) with a promoter having higher transcriptional activity.
  • G3PDH promoter the promoter of the gene
  • Nannochloropsis oculata strain NIES-2145 which is one of the hosts having the G3PDH gene on the genome, has a NoG3PDH gene immediately below the DNA sequence consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 58, A promoter region is present in the DNA sequence consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 58.
  • the promoter used for replacement of the G3PDH promoter is not particularly limited, and can be appropriately selected from those having higher transcriptional activity than the G3PDH promoter and suitable for the production of medium chain fatty acids or lipids comprising them.
  • a tubulin promoter a heat shock protein promoter, a promoter of the above-mentioned violaxanthin / chlorophyll a binding protein gene (VCP1 promoter (SEQ ID NO: 30), VCP2 promoter), or Nannochloropsis genus
  • the promoter (SEQ ID NO: 18) of the derived oleosin-like protein LDSP gene can be preferably used. From the viewpoint of improving the productivity of medium-chain fatty acids or lipids containing these as constituents, the promoter of violaxanthin / chlorophyll a-binding protein gene and the promoter of LDSP gene are more preferable.
  • the above-described promoter modification can be performed according to a conventional method such as homologous recombination. Specifically, a linear DNA fragment containing upstream and downstream regions of the target promoter and containing another promoter instead of the target promoter is constructed and incorporated into the host cell, and the target promoter of the host genome Two homologous recombination occurs at the upstream and downstream side of. As a result, the target promoter on the genome is replaced with another promoter fragment, and the promoter can be modified.
  • a method for modifying a target promoter by homologous recombination is described in, for example, Besher et al., Methods in molecular biology, 1995, vol. 47, p. Reference can be made to documents such as 291-302.
  • the transformant of the present invention preferably promotes expression of a gene encoding TE (hereinafter also referred to as “TE gene”) in addition to the gene encoding the protein (A) or (B). .
  • TE hydrolyzes the thioester bond of acyl-ACP synthesized by fatty acid synthase such as ⁇ -ketoacyl-acyl-carrier-protein synthase (hereinafter also referred to as “KAS”).
  • KAS ⁇ -ketoacyl-acyl-carrier-protein synthase
  • the fatty acid synthesis on the ACP is completed by the action of TE, and the extracted fatty acid is used for synthesis of polyunsaturated fatty acid, triacylglycerol (hereinafter also referred to as “TAG”) and the like.
  • TAG triacylglycerol
  • the aforementioned G3PDH is involved in TAG synthesis and the like. Therefore, by promoting the expression of the TE gene in addition to the G3PDH gene, the amount of TAG substrate synthesized by G3PDH is increased, and the lipid productivity of the transformant used for lipid production, particularly the production of fatty acids Property can be further improved.
  • the TE that can be used in the present invention may be a protein having acyl-ACP thioesterase activity (hereinafter also referred to as “TE activity”).
  • TE activity refers to an activity of hydrolyzing the thioester bond of acyl-ACP.
  • TE is known to have a plurality of TEs having different reaction specificities depending on the number of carbon atoms and the number of unsaturated bonds in the acyl group (fatty acid residue) constituting the substrate acyl-ACP.
  • TE is considered to be an important factor that determines the fatty acid composition in vivo.
  • it is preferable to promote the expression of the gene encoding TE.
  • the productivity of medium chain fatty acids is improved. By introducing such a gene, the productivity of medium chain fatty acids can be further improved.
  • TE that can be used in the present invention can be appropriately selected from normal TE and functionally equivalent proteins according to the type of host.
  • TE (GenBank ABB71581) from Cuphea calophylla subsp. Mesostemon; TE from Cinnamomum camphora (GenBank AAC49151.1); TE from Myristica fragrans (GenBank AAB71729); TE from Myristica fragrans (GenBank AAB71730); Cuphea lanceolata TE (GenBank CAA54060); TE from Cuphea hookeriana (GenBank Q39513); TE from Ulumus americana (GenBank AAB71731); TE from Sorghum bicolor (GenBank EER87824); TE from Sorghum bicolor (GenBank EER88593); Cocos nucifera TE from CnFatB1 (see Jing et al.
  • the identity with any one of the above-mentioned TE amino acid sequences is 50% or more, preferably 60% or more, more preferably 65% or more, more preferably 70% or more. More preferably 75% or more, more preferably 80% or more, more preferably 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and a protein having TE activity is also used. be able to.
  • a protein having TE activity and having 15 to 15 amino acids deleted, substituted, inserted or added can also be used.
  • BTE (SEQ ID NO: 29, nucleotide sequence of the gene encoding the same: SEQ ID NO: 26), NoTE (SEQ ID NO: 38, gene encoding the same) Nucleotide sequence of SEQ ID NO: 39), TE derived from coconut (SEQ ID NO: 59, nucleotide sequence of the gene encoding the same: SEQ ID NO: 60), TE derived from Nannochloropsis gaditana (SEQ ID NO: 61, the gene encoding the same) Nucleotide sequence: SEQ ID NO: 62), TE derived from Nannochloropsis granulata (SEQ ID NO: 63, nucleotide sequence of the gene encoding this: SEQ ID NO: 64), TE derived from symbiodinium microadria thycam (sequence) No.
  • TE amino acid sequences are 50% or more, Preferably 60% or more, more preferably 65% or more, more preferably 70% or more, more preferably 75% or more, more preferably 80% or more, more preferably 85% or more, more preferably 90% or more, more Preferably, a protein consisting of 95% or more amino acid sequence and having TE activity against medium chain acyl-ACP (for example, a protein encoded by a DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 44), or any one of these TEs
  • One or several amino acid sequences for example, 1 or more and 149 or less, preferably 1 or more and 119 or less, more preferably 1 or more and 104 or less, more preferably 1 or more and 90 or less, more preferably 1 75 or more, more preferably 1 or more and 60 or less, more preferably 1 or more and 45 or less, more preferably 1 or more and 30 or less
  • More amino acids are deleted of preferably 15 or less one or more), substituted, inserted or added, and the protein preferably has a TE activity against medium-chain acyl-ACP.
  • the sequence information of these TEs and the genes encoding them can be obtained from, for example, the National Center for Biotechnology Information (NCBI).
  • a protein has TE activity is, for example, that a DNA in which an acyl-ACP thioesterase gene is linked downstream of a promoter that functions in a host cell such as Escherichia coli is introduced into a host cell lacking the fatty acid degradation system, and the introduced TE It can be confirmed by culturing under conditions where the gene is expressed, and analyzing changes in the fatty acid composition in the host cell or culture solution using a method such as gas chromatography analysis. In addition, after introducing the DNA linked to the TE gene downstream of a promoter that functions in a host cell such as E.
  • a transformant that promotes the expression of the TE gene can be prepared by a conventional method. For example, similar to the method for promoting the expression of the G3PDH gene described above, a method for introducing a TE gene into a host, a method for modifying the expression regulatory region of the gene in a host having the TE gene on the genome, etc. Can be produced.
  • the transformant of the present invention preferably promotes the expression of the KAS gene in addition to the gene encoding the protein (A) or (B).
  • KAS one of the enzymes involved in the fatty acid synthesis pathway, is an enzyme involved in the control of the acyl group chain length.
  • KAS III works at the initiation stage of the chain length extension reaction and extends acetyl-ACP having 2 carbon atoms (or acetyl-CoA) to ⁇ -ketoacyl-ACP having 4 carbon atoms.
  • Subsequent elongation reactions involve KAS I, KAS II, and KAS IV.
  • KAS I is mainly involved in the elongation reaction up to 16 carbon atoms palmitoyl-ACP
  • KAS II is mainly involved in the elongation reaction up to 18 carbon atoms stearoyl-ACP.
  • KAS IV is said to be involved in the elongation reaction up to medium chain acyl-ACP having 6 to 14 carbon atoms.
  • KAS is involved in the synthesis of a free fatty acid precursor (acyl-ACP) that is used as a substrate in the synthesis of TAG. Therefore, by promoting the expression of the KAS gene, the amount of acyl-ACP is increased, and the amount of free fatty acid that is a substrate for TAG synthesis is increased.
  • the KAS that can be used in the present invention may be a protein having ⁇ -ketoacyl-ACP synthase activity (hereinafter also referred to as “KAS activity”).
  • KAS activity means an activity of catalyzing the condensation reaction of acetyl-ACP (or acetyl-CoA) or acyl-ACP with malonyl ACP.
  • KAS is classified as KAS I, KAS II, KAS III, or KAS IV depending on the substrate specificity. Therefore, KAS is considered to be an important factor that determines the fatty acid composition in vivo. Thus, fatty acid productivity can be further improved by promoting the expression of the KAS gene.
  • the KAS that can be used in the present invention can be appropriately selected from normal KAS and functionally equivalent proteins according to the type of host.
  • KAS derived from Nannochloropsis oculata SEQ ID NO: 48, nucleotide sequence of gene encoding the same: SEQ ID NO: 49; SEQ ID NO: 75, nucleotide sequence of the gene encoding the same: SEQ ID NO: 76
  • Nannochloropsis KAS derived from Gaditana SEQ ID NO: 67, nucleotide sequence of the gene encoding the same: SEQ ID NO: 68
  • KAS derived from bay SEQ ID NO: 69, the nucleotide sequence of the gene encoding the same: SEQ ID NO: 70; SEQ ID NO: 71, this Nucleotide sequence of the gene that encodes: KAS derived from camphor (SEQ ID NO: 73, the nucleotide sequence of the gene encoding this: SEQ ID NO: 74), K
  • the identity with any one of the above-mentioned KAS amino acid sequences is 50% or more, preferably 60% or more, more preferably 65% or more, more preferably 70% or more. More preferably 75% or more, more preferably 80% or more, more preferably 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and a protein having KAS activity is also used. be able to.
  • one or several (for example, 1 to 255, more preferably 1 to 204, more preferably 1 to 179, more preferably 1 to any one of the above-described KAS amino acid sequences) 1 to 153, more preferably 1 to 128, more preferably 1 to 102, more preferably 1 to 77, more preferably 1 to 51, more preferably A protein having 1 to 26 amino acids) deleted, substituted, inserted or added and having KAS activity can also be used.
  • KAS derived from Nannochloropsis oculata (SEQ ID NO: 48, nucleotide sequence of the gene encoding it: SEQ ID NO: 49; SEQ ID NO: 75, this (SEQ ID NO: 76), KAS derived from Nannochloropsis gaditana (SEQ ID NO: 67, nucleotide sequence encoding the gene: SEQ ID NO: 68), KAS derived from bay (SEQ ID NO: 69, this) SEQ ID NO: 70; SEQ ID NO: 71, base sequence of gene encoding this: SEQ ID NO: 72), KAS derived from camphor (SEQ ID NO: 73, base sequence of gene encoding this: SEQ ID NO: 74), KAS derived from coconut (SEQ ID NO: 77, nucleotide sequence of the gene encoding this: SEQ ID NO: SEQ ID NO: 48, nucleotide sequence of the gene encoding it: SEQ ID NO: 49; SEQ ID NO: 75
  • DNA in which a gene encoding a protein is linked downstream of a promoter that functions in the host cell is introduced into a host cell lacking the fatty acid degradation system, and the introduced gene is expressed.
  • the change in the fatty acid composition in the host cells or culture medium can be confirmed by a conventional method.
  • it can confirm by co-expressing TE in said system
  • a transformant that promotes the expression of the KAS gene can be prepared by a conventional method. For example, similar to the method for promoting the expression of the G3PDH gene described above, the transformant can be obtained by introducing the KAS gene into the host, modifying the expression regulatory region of the gene in a host having the KAS gene on the genome, or the like. Can be produced.
  • the transformant of the present invention preferably promotes expression of a gene encoding an acyltransferase in addition to the gene encoding the protein (A) or (B).
  • acyltransferase is an enzyme that performs acylation necessary for the biosynthesis of TAG. Therefore, in addition to the G3PDH gene, by promoting the expression of genes encoding medium-chain fatty acid-specific acyltransferases such as diacylglycerol acyltransferase specific for medium-chain fatty acids, the productivity of medium-chain fatty acids is further improved. be able to.
  • the acyltransferase that can be used in the present invention can be appropriately selected from ordinary acyltransferases and proteins functionally equivalent to them according to the type of the host.
  • the transformant which promoted the expression of these genes can be produced by a conventional method.
  • a method for introducing a gene encoding an acyltransferase into a host, a regulation of the expression of the gene in a host having a gene encoding an acyltransferase on the genome A transformant can be produced by a method of modifying the region.
  • productivity of medium-chain fatty acids or lipids comprising the same is improved as compared to a host in which expression of the gene encoding the protein (A) or (B) is not promoted. is doing. Therefore, if the transformant of the present invention is cultured under appropriate conditions, and then the medium chain fatty acid or the lipid containing it as a constituent component is recovered from the obtained culture or growth product, the medium chain fatty acid or the constituent component thereof is recovered. Can be produced efficiently. Further, the transformant significantly improves the total amount of fatty acids produced compared to the host itself.
  • the transformant of the present invention is cultured under appropriate conditions and then the fatty acid or the lipid comprising this as a constituent component is recovered from the obtained culture or growth product, the fatty acid or the lipid comprising this component is obtained. It can be manufactured efficiently.
  • culture refers to the culture solution and transformant after culturing
  • growth refers to the transformant after growth.
  • the culture conditions of the transformant of the present invention can be appropriately selected depending on the host, and culture conditions usually used for the host can be used. From the viewpoint of fatty acid production efficiency, for example, glycerol, acetic acid, glucose or the like may be added to the medium as a precursor involved in the fatty acid biosynthesis system.
  • the Escherichia coli When Escherichia coli is used as a host, the Escherichia coli can be cultured, for example, in LB medium or Overnight Express Instant TB Medium (Novagen) at 30 to 37 ° C. for 0.5 to 1 day.
  • the culture of Arabidopsis thaliana can be performed, for example, at a temperature of 20 to 25 ° C. in soil, continuously irradiated with white light, or under light conditions such as 16 hours of light and 8 hours of dark. Can be cultivated monthly.
  • the culture medium may be based on natural seawater or artificial seawater, or a commercially available culture medium may be used.
  • the medium include f / 2 medium, ESM medium, Daigo IMK medium, L1 medium, and MNK medium.
  • f / 2 medium, ESM medium, or Daigo IMK medium is preferable, f / 2 medium or Daigo IMK medium is more preferable, and f / 2 medium is further included. preferable.
  • nitrogen sources, phosphorus sources, metal salts, vitamins, trace metals, and the like can be appropriately added to the medium.
  • the amount of transformant to be inoculated into the medium can be appropriately selected, and is preferably 1 to 50% (vol / vol), more preferably 1 to 10% (vol / vol) per medium from the viewpoint of growth.
  • the culture temperature is not particularly limited as long as it does not adversely affect the growth of algae, but it is usually in the range of 5 to 40 ° C. From the viewpoint of promoting the growth of algae, improving the productivity of fatty acids, and reducing the production cost, the temperature is preferably 10 to 35 ° C, more preferably 15 to 30 ° C.
  • the algae is preferably cultured under light irradiation so that photosynthesis is possible. The light irradiation may be performed under conditions that allow photosynthesis, and may be artificial light or sunlight.
  • the illuminance during light irradiation is preferably in the range of 100 to 50000 lux, more preferably in the range of 300 to 10000 lux, and still more preferably in the range of 1000 to 6000 lux, from the viewpoint of promoting the growth of algae and improving the productivity of fatty acids. It is. Further, the light irradiation interval is not particularly limited, but from the same viewpoint as described above, it is preferably performed in a light / dark cycle, and the light period in 24 hours is preferably 8 to 24 hours, more preferably 10 to 18 hours, More preferably, it is 12 hours.
  • the culture of algae is preferably performed in the presence of a gas containing carbon dioxide or a medium containing a carbonate such as sodium bicarbonate so that photosynthesis is possible.
  • concentration of carbon dioxide in the gas is not particularly limited, but is preferably 0.03 (similar to atmospheric conditions) to 10%, more preferably 0.05 to 5%, from the viewpoint of promoting growth and improving the productivity of fatty acids. More preferably, it is 0.1 to 3%, and still more preferably 0.3 to 1%.
  • the concentration of the carbonate is not particularly limited.
  • sodium bicarbonate it is preferably 0.01 to 5% by mass, more preferably 0.05 to 2% by mass, from the viewpoint of promoting growth and improving the productivity of fatty acids.
  • the content is 0.1 to 1% by mass.
  • the culture time is not particularly limited, and may be performed for a long period of time (for example, about 150 days) so that algal bodies that accumulate lipids at a high concentration can grow at a high concentration. From the viewpoint of promoting the growth of algae, improving the productivity of fatty acids, and reducing the production cost, the culture period is preferably 3 to 90 days, more preferably 3 to 30 days, and even more preferably 7 to 30 days.
  • the culture may be any of aeration and agitation culture, shaking culture or stationary culture. From the viewpoint of improving aeration, aeration and agitation culture or shaking culture is preferable, and aeration and agitation culture is more preferable.
  • the method for collecting lipid from the culture or growth can be appropriately selected from conventional methods.
  • lipid components can be isolated from the aforementioned culture or growth by filtration, centrifugation, cell disruption, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, chloroform / methanol extraction method, hexane extraction method, ethanol extraction method, or the like. Can be separated and recovered.
  • oil is recovered from the culture or growth by pressing or extraction, and then general purification such as degumming, deoxidation, decolorization, dewaxing, deodorization, etc. is performed to obtain lipids. be able to.
  • a fatty acid can be obtained by hydrolyzing the isolated lipid.
  • Examples of the method for isolating the fatty acid from the lipid component include a method of treating at a high temperature of about 70 ° C. in an alkaline solution, a method of treating with lipase, a method of decomposing using high-pressure hot water, and the like.
  • the lipid produced in the production method of the present invention preferably contains a fatty acid or a fatty acid compound, and more preferably contains a fatty acid or a fatty acid ester compound, from the viewpoint of its availability.
  • the fatty acid or fatty acid ester compound contained in the lipid is preferably a medium chain fatty acid or an ester compound thereof, more preferably a fatty acid having 6 to 14 carbon atoms or an ester compound thereof, from the viewpoint of availability to a surfactant or the like.
  • a fatty acid having 8 to 14 carbon atoms or an ester compound thereof is more preferable, a fatty acid having 10 to 14 carbon atoms or an ester compound thereof is more preferable, and a fatty acid having 12 to 14 carbon atoms or a fatty acid thereof.
  • Ester compounds are more preferred, fatty acids having 12 or 14 carbon atoms or ester compounds thereof are more preferred, saturated fatty acids having 12 or 14 carbon atoms (lauric acid, myristic acid) or fatty acid ester compounds thereof are more preferred.
  • the fatty acid ester compound is preferably a simple lipid or a complex lipid, more preferably a simple lipid, and even more preferably triacylglycerol.
  • Lipids obtained by the production method of the present invention are used as edible, plasticizers, emulsifiers such as cosmetics, detergents such as soaps and detergents, fiber treatment agents, hair rinse agents, or bactericides and preservatives. Can do.
  • the present invention further relates to the embodiments described above, and the following methods for producing lipids, methods for improving lipid productivity, methods for modifying the composition of fatty acids produced, proteins, genes, recombinant vectors, organisms, transformants, and A method for producing a transformant is disclosed.
  • a method for producing a lipid comprising culturing a transformant in which expression of a gene encoding the following protein (A) or (B) is promoted to produce a fatty acid or a lipid comprising the same.
  • a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the identity with the amino acid sequence of the protein (A) is 64% or more, preferably 65% or more, more preferably 70% or more, more preferably 75% or more, more preferably 80% or more, more preferably 83 % Or more, more preferably 85% or more, more preferably 87% or more, more preferably 90% or more, more preferably 93% or more, more preferably 95% or more, more preferably 97% or more, more preferably 98%.
  • ⁇ 2> Promote the expression of the gene encoding the protein (A) or (B), and improve the productivity of medium-chain fatty acids produced in the cells of the transformant or lipids comprising this as a constituent component, Method for improving lipid productivity.
  • Method for improving lipid productivity A method for improving lipid productivity, which promotes the expression of a gene encoding the protein (A) or (B) and improves the total amount of fatty acids produced in the cells of the transformant.
  • ⁇ 4> Promoting the expression of the gene encoding the protein (A) or (B) to improve the productivity of medium-chain fatty acids produced in the cells of the transformant or lipids comprising this as a constituent component
  • a method for modifying the composition of lipids which modifies the composition of fatty acids or lipids in total fatty acids or total lipids produced.
  • ⁇ 5> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 4>, wherein the gene encoding the protein (A) or (B) is introduced into a host to promote expression of the gene.
  • ⁇ 6> A method for producing a lipid, comprising culturing a transformant introduced with a gene encoding the protein (A) or (B) to produce a fatty acid or a lipid comprising this as a constituent.
  • ⁇ 7> A medium-chain fatty acid produced in a transformant by introducing a gene encoding the protein (A) or (B) into a host, and a lipid comprising this as a constituent To improve the productivity of lipids.
  • ⁇ 8> Transforming a gene by introducing a gene encoding the protein (A) or (B) into a host, and improving the total amount of fatty acids produced in the cells of the transformant. How to improve.
  • Transformants are produced by introducing a gene encoding the protein (A) or (B), and medium-chain fatty acids produced in the cells of the transformants or lipid production comprising them A method for modifying the composition of lipids, which improves the properties and modifies the composition of fatty acids or lipids in total fatty acids or total lipids produced.
  • the protein (B) has one or more, preferably 1 or more and 167 or less, more preferably 1 or more and 162 or less, more preferably 1 or more amino acid sequences in the protein (A). 139 or less, more preferably 1 or more and 116 or less, more preferably 1 or more and 93 or less, more preferably 1 or more and 69 or less, more preferably 1 or more and 60 or less, more preferably 1 or more 46 or less, more preferably 1 or more and 32 or less, more preferably 1 or more and 23 or less, more preferably 1 or more and 13 or less, more preferably 1 or more and 9 or less, and even more preferably 1 or more 10.
  • the protein is a protein in which 4 or less amino acids are deleted, substituted, inserted or added.
  • the gene encoding the protein (A) or (B) is a gene comprising the following DNA (a) or (b).
  • (B) The identity with the base sequence of the DNA (a) is 59% or more, preferably 60% or more, more preferably 65% or more, more preferably 70% or more, more preferably 75% or more, more preferably 80%.
  • the DNA (b) has one or more, preferably 1 to 573, more preferably 1 to 559, more preferably 1 or more nucleotide sequences in the DNA (a).
  • the DNA is a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA having a nucleotide sequence complementary to the DNA (a) and that encodes a protein having G3PDH activity.
  • ⁇ 13> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 12>, wherein expression of a gene encoding TE is promoted in the transformant.
  • ⁇ 14> The method according to ⁇ 13>, wherein the TE is TE having substrate specificity for medium-chain acyl-ACP.
  • a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63 or SEQ ID NO: 65, and 50% identity with the amino acid sequence of the protein Or more, preferably 60% or more, more preferably 65% or more, more preferably 70% or more, more preferably 75% or more, more preferably 80% or more, more preferably 85% or more, more preferably 90% or more, More preferably 95% or more of the amino acid sequence and a protein having TE activity against medium chain acyl-ACP, or one or several, preferably 1 to 149, more preferably amino acid sequence of the protein 1 to 119, more preferably 1 to 104, more preferably 1 to 90 Preferably 1 or more and 75 or less, more preferably 1 or more and 60 or less, more preferably 1 or more and 45 or less, more preferably 1 or more and 30 or less, more preferably 1 or more and 15 or less.
  • ⁇ 13> or ⁇ 14> The method according to ⁇ 13> or ⁇ 14> above, wherein the amino acid is a protein having a deletion, substitution, insertion or addition, and TE activity against medium chain acyl-ACP.
  • ⁇ 16> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 15>, wherein expression of a gene encoding KAS is promoted in the transformant.
  • ⁇ 17> The method according to ⁇ 16>, wherein the KAS is KAS having a medium-chain ⁇ -ketoacyl-ACP synthesis activity.
  • a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, or SEQ ID NO: 81, Identity with the amino acid sequence of the protein is 50% or more, preferably 60% or more, more preferably 65% or more, more preferably 70% or more, more preferably 75% or more, more preferably 80% or more, more preferably Is a protein having an amino acid sequence of 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and having a medium-chain ⁇ -ketoacyl-ACP synthesis activity, or one or a number in the amino acid sequence of the protein , Preferably 1 to 255, more preferably 1 to 204, more preferably 1 to 179 Or less, more preferably 1 to 153, more preferably 1 to 128, more preferably 1 to
  • ⁇ 19> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 18>, wherein the transformant is a microorganism or a plant.
  • the microorganism is a microalgae.
  • the microalga is an algae belonging to the genus Nannochloropsis, preferably Nannochloropsis oculata.
  • the microorganism is Escherichia coli.
  • the plant is Arabidopsis thaliana.
  • the lipid is a medium chain fatty acid or an ester compound thereof, preferably a fatty acid having 6 to 14 carbon atoms or an ester compound thereof, more preferably a fatty acid having 8 to 14 carbon atoms or an ester compound thereof, More preferably a fatty acid having 10 to 14 carbon atoms or an ester compound thereof, more preferably a fatty acid having 12 to 14 carbon atoms or an ester compound thereof, more preferably a fatty acid having 12 or 14 carbon atoms or a fatty acid thereof.
  • the method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 23> above, comprising an ester compound, more preferably a saturated fatty acid having 12 or 14 carbon atoms (lauric acid, myristic acid) or a fatty acid ester compound thereof.
  • ⁇ 25> The protein (A) or (B) defined in any one of ⁇ 1> to ⁇ 24>.
  • ⁇ 26> A gene encoding the protein according to ⁇ 25>.
  • ⁇ 27> A gene comprising the DNA (a) or (b) defined in any one of ⁇ 1> to ⁇ 24>.
  • ⁇ 28> A recombinant vector containing the gene according to ⁇ 26> or ⁇ 27>.
  • ⁇ 29> Promoting the expression of the gene according to ⁇ 26> or ⁇ 27>, and producing a medium-chain fatty acid or a lipid containing the same as a constituent, which is produced in a transformant cell; A transformant in which at least one of the total amount is improved.
  • ⁇ 31> A method for producing a transformant, wherein the gene according to ⁇ 26> or ⁇ 27> or the recombinant vector according to ⁇ 28> is introduced into a host.
  • ⁇ 32> The transformant according to any one of ⁇ 29> to ⁇ 31> or a method for producing the same, wherein expression of a gene encoding TE is promoted.
  • ⁇ 33> The transformant according to ⁇ 32> or a method for producing the same, wherein the TE is TE having substrate specificity for medium-chain acyl-ACP.
  • a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63 or SEQ ID NO: 65, and the identity of the TE with the amino acid sequence of the protein is 50% Or more, preferably 60% or more, more preferably 65% or more, more preferably 70% or more, more preferably 75% or more, more preferably 80% or more, more preferably 85% or more, more preferably 90% or more, More preferably 95% or more of the amino acid sequence and a protein having TE activity against medium chain acyl-ACP, or one or several, preferably 1 to 149, more preferably amino acid sequence of the protein 1 to 119, more preferably 1 to 104, more preferably 1 to 90 Preferably 1 or more and 75 or less, more preferably 1 or more and 60 or less, more preferably 1 or more and 45 or less, more preferably 1 or more and 30 or less, more preferably 1 or more and 15 or less
  • the transformant according to the above ⁇ 32> or ⁇ 33> or a method for producing the same which is a protein having an amino acid deleted, substituted, inserted or added and having TE activity against medium chain acyl-ACP.
  • ⁇ 35> The transformant according to any one of ⁇ 29> to ⁇ 34> or a method for producing the same, wherein expression of a gene encoding KAS is promoted.
  • ⁇ 36> The transformant according to ⁇ 35> or the method for producing the same, wherein the KAS is KAS having a medium-chain ⁇ -ketoacyl-ACP synthesis activity.
  • a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79 or SEQ ID NO: 81, Identity with the amino acid sequence of the protein is 50% or more, preferably 60% or more, more preferably 65% or more, more preferably 70% or more, more preferably 75% or more, more preferably 80% or more, more preferably Is a protein having an amino acid sequence of 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and having a medium-chain ⁇ -ketoacyl-ACP synthesis activity, or one or a number in the amino acid sequence of the protein , Preferably 1 to 255, more preferably 1 to 204, more preferably 1 to 179 Or less, more preferably 1 to 153, more preferably 1 to 128, more preferably 1 to 102
  • the transformant of claim item or its manufacturing method.
  • ⁇ 38> The transformant according to any one of ⁇ 29> to ⁇ 37> or the method for producing the transformant, wherein the transformant or host is a microorganism or a plant.
  • ⁇ 40> The transformant according to ⁇ 39> or the method for producing the same, wherein the microalgae are algae belonging to the genus Nannochloropsis, preferably Nannochloropsis oculata.
  • ⁇ 41> The transformant according to ⁇ 38> or the production method thereof, wherein the microorganism is Escherichia coli.
  • ⁇ 42> The transformant according to ⁇ 38> or a method for producing the same, wherein the plant is Arabidopsis thaliana.
  • the lipid is a medium chain fatty acid or an ester compound thereof, preferably a fatty acid having 6 to 14 carbon atoms or an ester compound thereof, more preferably a fatty acid having 8 to 14 carbon atoms or an ester compound thereof, More preferably a fatty acid having 10 to 14 carbon atoms or an ester compound thereof, more preferably a fatty acid having 12 to 14 carbon atoms or an ester compound thereof, more preferably a fatty acid having 12 or 14 carbon atoms or a fatty acid thereof.
  • Example 1 Production of transformant in which NoG3PDH gene was introduced into Nannochloropsis oculata, and production of fatty acid by transformant
  • PCR was performed using the primer pair of primer number 5 and primer number 6 and the primer pair of primer number 7 and primer number 8 shown in Table 1, and the neomycin resistance gene and the tubulin promoter sequence were determined. Each was amplified. Further, PCR was performed using the genome of Nannochloropsis oculata NIES2145 strain as a template and the primer pair of primer number 9 and primer number 10 shown in Table 1 to amplify the heat shock protein terminator sequence (SEQ ID NO: 11).
  • PCR was performed using the primer pair of primer number 12 and primer number 13 shown in Table 1, to amplify plasmid vector pUC19.
  • neomycin resistant gene expression plasmid consists of an insert sequence linked in the order of a tubulin promoter sequence, a neomycin resistance gene, a heat shock protein terminator sequence, and a pUC19 vector sequence.
  • Nannochloropsis oculata strain NIES-2145 is f / 2 liquid medium (NaNO 3 75 mg, NaH 2 PO 4 ⁇ 2H 2 O 6 mg, vitamin B12 0.5 ⁇ g, biotin 0.5 ⁇ g, thiamine 100 ⁇ g, Na 2 SiO 3 ⁇ 9H 2 O 10mg, Na 2 EDTA ⁇ 2H 2 O 4.4mg, FeCl 3 ⁇ 6H 2 O 3.16mg, FeCl 3 ⁇ 6H 2 O 12 ⁇ g, ZnSO 4 ⁇ 7H 2 O 21 ⁇ g, MnCl 2 ⁇ 4H 2 O 180 ⁇ g, CuSO 4 ⁇ 5H 2 O 7 ⁇ g, Na 2 MoO 4 ⁇ 2H 2 O 7 ⁇ g / artificial seawater 1L), inoculate 10% in 50mL f / 2 medium
  • RNA was purified using RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen). From the obtained total RNA, a cDNA library was prepared using SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR (manufactured by Invitrogen). Using this cDNA as a template, a NoG3PDH gene fragment was obtained by PCR using the primer pair of primer number 14 and primer number 15 shown in Table 1. Moreover, PCR was performed using the genome of Nannochloropsis oculata NIES2145 strain as a template and the primer pair of primer number 16 and primer number 17 shown in Table 1 to amplify the LDSP promoter sequence (SEQ ID NO: 18).
  • VCP1 violaxanthin / chlorophyll a binding protein gene of Nannochloropsis sp. W2J3B strain registered in GenBank
  • VCP1 terminator sequence SEQ ID NO: 19
  • PCR was performed using the synthesized DNA fragment as a template and the primer pair of primer number 20 and primer number 21 shown in Table 1 to obtain a VCP1 terminator sequence.
  • PCR was performed using the above-described neomycin resistance gene expression plasmid as a template and the primer pair of primer number 22 and primer number 13 shown in Table 1, and a neomycin resistance gene expression cassette (tubulin promoter sequence, neomycin resistance gene, heat The fragment consisting of the shock protein terminator sequence) and the pUC19 sequence was amplified.
  • NoG3PDH gene expression plasmid consists of an LDSP promoter sequence, NoG3PDH gene, VCP1 terminator sequence, tubulin promoter sequence, neomycin resistance gene, heat shock protein terminator sequence ligated insert sequence in this order, and pUC19 vector sequence.
  • NoG3PDH gene expression fragment into Nannochloropsis oculata
  • PCR was performed using the primer pair of primer number 16 and primer number 10 shown in Table 1, and the NoG3PDH gene A fragment for expression (DNA fragment consisting of LDSP promoter sequence, NoG3PDH gene, VCP1 terminator sequence, tubulin promoter sequence, neomycin resistance gene, heat shock protein terminator sequence) was amplified.
  • the amplified gene fragment was purified using High Pure PCR Product Purification Kit (Roche Applied Science). Note that sterilized water was used for elution during purification, not the elution buffer included in the kit.
  • Nannochloropsis oculata strain NIES-2145 obtained from the National Institute for Environmental Studies (NIES)
  • NIES-2145 obtained from the National Institute for Environmental Studies (NIES)
  • 384 mM sorbitol solution used as host cell for transformation.
  • About 500 ng of the NoG3PDH gene expression fragment amplified above was mixed with a host cell and electroporated under the conditions of 50 ⁇ F, 500 ⁇ , and 2,200 v / 2 mm.
  • N15P5 medium a medium in which the nitrogen concentration of f / 2 medium is increased 15-fold and the phosphorus concentration is increased 5-fold. ° C., under 0.3% CO 2 atmosphere, for 4 weeks shaking culture at 12h / 12h light-dark conditions to the preculture. 10 mL of the preculture was transferred to 40 mL of N15P5 medium, and cultured under shaking in a 12 h / 12 h light / dark condition at 25 ° C. in a 0.3% CO 2 atmosphere. After 3 weeks of culture, the lipid components contained in the culture solution were analyzed by the following method. As a negative control, an experiment was similarly performed on a transformant (WT) in which only the neomycin resistance gene was introduced into the host cell.
  • WT transformant
  • Nitrogen gas was blown onto the resulting chloroform layer to dry it, 0.7 mL of 0.5N potassium hydroxide / methanol solution was added, and the temperature was kept constant at 80 ° C. for 30 minutes. Subsequently, 1 mL of 14% boron trifluoride-methanol solution (manufactured by SIGMA) was added, and the temperature was kept constant at 80 ° C. for 10 minutes. Thereafter, 1 mL each of hexane and saturated saline was added and stirred vigorously, and allowed to stand at room temperature for 30 minutes. The upper hexane layer was recovered to obtain a fatty acid methyl ester.
  • the fatty acid methyl ester was identified by subjecting the sample to gas chromatograph mass spectrometry analysis under the same conditions.
  • the amount of methyl ester of each fatty acid was quantified from the peak area of the waveform data obtained by gas chromatography analysis. Each peak area was compared with the peak area of 7-pentadecanone, which is an internal standard, to correct between samples, and the amount of each fatty acid per liter of culture solution was calculated. Furthermore, the sum total of each fatty acid amount was made into the total fatty acid amount (FA), and the ratio of each fatty acid amount which occupies for the total fatty acid amount was computed. The results are shown in Table 2.
  • “Fatty acid composition (% TFA)” indicates the ratio (weight percent) of each fatty acid to the total fatty acid.
  • “N” represents an integer of 0 to 5, for example, when “C18: n” is described, C18: 0, C18: 1, C18: 2, C18: 3, C18: 4, and C18: 5 Represents the sum of fatty acids.
  • Example 2 Production of Transformant Introducing BTE Gene and NoG3PDH Gene into Nannochloropsis Oculata, and Production of Fatty Acids by Transformant
  • PCR was performed using the neomycin resistance gene expression plasmid constructed in Example 1 as a template and using the primer pair of primer number 9 and primer 8 shown in Table 1, heat shock protein terminator sequence, pUC19 vector sequence, tubulin A gene fragment consisting of a promoter sequence was amplified.
  • the obtained gene fragment was fused in the same manner as in Example 1 to construct a zeocin resistant gene expression plasmid.
  • This plasmid consists of an insert sequence linked in the order of a tubulin promoter sequence, a zeocin resistance gene, and a heat shock protein terminator sequence, and a pUC19 vector sequence.
  • BTE gene expression plasmid A gene sequence (SEQ ID NO: 26) encoding BTE described in WO 92/20236 was artificially synthesized. Using the synthesized DNA fragment as a template, PCR was performed using the primer pair of primer number 27 and primer number 28 shown in Table 1 to obtain a BTE gene fragment. In this DNA fragment, the portion corresponding to the chloroplast translocation signal (N-terminal amino acid 85 residues) of BTE (SEQ ID NO: 29) was deleted. In addition, from the complete cds sequence (Accession number: JF957601.1) of the VCP1 gene of Nannochloropsis sp. No.
  • VCP1 terminator sequence SEQ ID NO: 19
  • PCR was performed using the primer pair of primer number 32 and primer 33 shown in Table 1, the primer pair of primer number 34 and primer 35, and the primer pair of primer number 20 and primer 21, respectively.
  • a VCP1 promoter sequence, a VCP1 chloroplast transition signal sequence, and a VCP1 terminator sequence were obtained.
  • PCR was performed using the above-mentioned zeocin resistance gene expression plasmid as a template and the primer pair of primer number 22 and primer 13 shown in Table 1, and a tubulin promoter sequence, zeocin resistance gene, heat shock protein terminator sequence and pUC19 A gene fragment consisting of a vector sequence was amplified.
  • the gene fragment obtained by the above method was fused in the same manner as in Example 1 to construct a BTE gene expression plasmid.
  • This plasmid consists of a VCP1 promoter sequence, a VCP1 chloroplast translocation signal sequence, a BTE gene fragment, a VCP1 terminator sequence, a tubulin promoter sequence, a zeocin resistance gene, a heat shock protein terminator sequence, and a pUC19 vector. Consists of an array.
  • BTE BTE gene-introduced strain
  • NoG3PDH gene was introduced by the same method as in Example 1 using the BTE gene-introduced strain as a host. The obtained colonies were selected as a BTE gene and NoG3PDH gene-introduced strain (BTE + NoG3PDH).
  • Example 3 Production of transformants in which NoTE modified gene and NoG3PDH gene were introduced into Nannochloropsis oculata, and production of fatty acids by transformants (1) Acquisition of NoTE gene and construction of NoTE gene expression plasmid The nucleotide sequence from position 262 to position 864 of SEQ ID NO: 39 was obtained by PCR using the primer pair of primer number 36 and primer number 37 shown in Table 1 using the cDNA of Nannochloropsis oculata strain NIES2145 prepared in Example 1 as a template.
  • pBluescriptII SK (-) was amplified by PCR using the plasmid vector pBluescriptII SK (-) (manufactured by Stratagene) as a template and the primer pair of primer number 40 and primer number 41 shown in Table 1, and the restriction enzyme Dpn I
  • the mold was digested by treatment (manufactured by Toyobo Co., Ltd.). These two fragments were purified using High Pure PCR Product Purification Kit (Roche Applied Science) and then fused using In-Fusion HD Cloning Kit (Clontech) to construct NoTE gene expression plasmid NoTE_262. did.
  • NoTE_262 removes amino acid residues from the 1st to 87th positions on the N-terminal side of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 38, and upstream from the 1st position of the N-terminal side of the LacZ protein derived from the plasmid vector pBluescriptII SK (-) It was constructed to express a protein in which the amino acid residue at position 29 was fused.
  • “NoTE_262” is the nucleotide sequence encoding the polypeptide consisting of the amino acid sequence of positions 88 to 287 of SEQ ID NO: 38, and the nucleotide sequence of positions 262 to 864 of SEQ ID NO: 39 is the plasmid.
  • a gene obtained by mutating a part of bases from positions 262 to 864 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 39 by PCR using the primer pair of primer No. 42 and primer No. 43 shown in Table 1 A fragment (SEQ ID NO: 44) was obtained.
  • a NoTE variant expression plasmid NoTE_262 (V204W) was constructed in the same manner as described above.
  • the codon encoding valine at position 204 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 38 is replaced with a codon (TGG) encoding tryptophan.
  • PCR was performed using the plasmid NoTE_262 (V204W) as a template and the primer pair of primer number 41 and primer number 42 shown in Table 1, and a NoTE variant gene fragment consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 44 was obtained.
  • Example 2 In the same manner as in Example 2, a VCP1 promoter sequence, a VCP1 chloroplast transition signal sequence, and a VCP1 terminator sequence were obtained. Furthermore, plasmid vector pUC19 was amplified by the same method as in Example 1. The NoTE variant gene fragment, VCP1 promoter sequence, VCP1 chloroplast translocation signal sequence, and VCP1 terminator sequence obtained by the above method were fused to the plasmid vector pUC19 in the same manner as in Example 1, and the NoTE variant gene An expression plasmid NoTE_262 (V204W) _Nanno was constructed.
  • This plasmid consists of a NoTE gene expression sequence linked in the order of a VCP1 promoter sequence, a VCP1 chloroplast transfer signal sequence, a NoTE variant gene fragment, and a VCP1 terminator sequence, and a pUC19 vector sequence.
  • PCR was performed using the plasmid NoTE_262 (V204W) _Nanno as a template and the primer pair of primer number 32 and primer number 21 shown in Table 1, VCP1 promoter sequence, VCP1 chloroplast transition signal, NoTE variant gene, VCP1 terminator A gene fragment consisting of the sequence was obtained. Further, PCR was performed using the zeocin resistance gene expression plasmid constructed in Example 2 as a template and the primer pair of primer number 22 and primer number 13 shown in Table 1, and the tubulin promoter sequence, zeocin resistance gene, heat shock A gene fragment consisting of a protein terminator sequence and a pUC19 vector sequence was amplified.
  • the obtained gene fragment was fused in the same manner as in Example 1 to construct a NoTE variant gene expression plasmid.
  • this plasmid VCP1 promoter sequence, VCP1 chloroplast translocation signal sequence, NoTE variant gene fragment, VCP1 terminator sequence, tubulin promoter sequence, zeocin resistance gene, heat shock protein terminator sequence connected in order, It consists of the pUC19 vector sequence.
  • NoTE variant gene and NoG3PDH gene were introduced using the NoTE variant gene expression plasmid as a template and the primer pairs of primer numbers 32 and 10 shown in Table 1.
  • NoTE variant gene expression fragment DNA fragment consisting of VCP1 promoter sequence, VCP1 chloroplast transfer signal sequence, NoTE variant gene, VCP1 terminator sequence, tubulin promoter sequence, zeocin resistance gene, heat shock protein terminator sequence
  • the amplified gene fragment was purified using High Pure PCR Product Purification Kit (Roche Applied Science). Note that sterilized water was used for elution during purification, not the elution buffer included in the kit.
  • NoTE variant gene was introduced into the Nannochloropsis oculata strain NIES2145, cultured in zeocin-containing f / 2 medium, and the resulting colony was NoTE variant gene-introduced strain (NoTE). As selected.
  • NoG3PDH gene was introduced by the same method as in Example 1 using the NoTE variant gene-introduced strain as a host.
  • the obtained colonies were selected as a NoTE modified pair gene and a NoG3PDH gene-introduced strain (NoTE + NoG3PDH).
  • Example 4 Production of transformants in which BTE gene, NoKASIV gene and NoG3PDH gene were introduced into Nannochloropsis oculata, and production of fatty acids by transformants
  • Construction of paromomycin-resistant gene expression plasmid Artificially synthesized paromomycin resistance PCR was performed using the DNA fragment of the gene (SEQ ID NO: 45) as a template and the primer pair of primer number 46 and primer number 47 shown in Table 1 to amplify the paromomycin resistance gene.
  • PCR was performed using the neomycin resistance gene plasmid constructed in Example 1 as a template and the primer pair of primer number 9 and primer 8 shown in Table 1, heat shock protein terminator sequence, pUC19 vector sequence, tubulin promoter A gene fragment consisting of the sequence was amplified.
  • the obtained gene fragment was fused in the same manner as in Example 1 to construct a paromomycin resistance gene expression plasmid.
  • This plasmid consists of an insert sequence linked in the order of a tubulin promoter sequence, a paromomycin resistance gene, and a heat shock protein terminator sequence, and a pUC19 vector sequence.
  • PCR was performed using the synthesized DNA fragment as a template and the primer pair of primer number 53 and primer number 54 shown in Table 1 to obtain a DNA fragment of the ubiquitin promoter. Further, PCR was performed using the primer pair of primer number 20 and primer number 21 shown in Table 1 using the DNA fragment of the VCP1 terminator sequence artificially synthesized by the above-described method as a template to obtain a VCP1 terminator sequence. Further, PCR was performed using the paromomycin resistance gene expression plasmid as a template and the primer pair of primer number 22 and primer number 13 shown in Table 1, and the tubulin promoter sequence, paromomycin resistance gene, heat shock protein terminator sequence and pUC19 A gene fragment consisting of a vector sequence was amplified.
  • NoKASIV gene expression plasmid consists of an ubiquitin promoter sequence, a NoKASIV gene fragment, a VCP1 terminator sequence, a tubulin promoter sequence, a paromomycin resistance gene, a heat shock protein terminator sequence and an pUC19 vector sequence.
  • NoKASIV gene expression plasmid was performed using the primer pair of primer number 53 and primer number 10 shown in Table 1.
  • NoKASIV gene expression fragment DNA fragment consisting of ubiquitin promoter sequence, NoKASIV gene, VCP1 terminator sequence, tubulin promoter sequence, paromomycin resistance gene, heat shock protein terminator sequence
  • the amplified gene fragment was purified using High Pure PCR Product Purification Kit (Roche Applied Science). Note that sterilized water was used for elution during purification, not the elution buffer included in the kit.
  • BTE gene-introduced strain BTE
  • BTE + NoKASIV BTE gene-introduced strain
  • BTE + NoKASIV BTE gene-introduced strain
  • NoG3PDH BTE gene, NoKASIV gene and NoG3PDH gene-introduced strain
  • the content of lauric acid (C12: 0) and myristic acid (C14: 0) and the total amount of fatty acids are obtained by further introducing the NoG3PDH gene into the strain into which the BTE gene and the NoKASIV gene have been introduced. Significantly increased.
  • the resulting chloroform layer was dried by blowing nitrogen gas and dissolved in 20 ⁇ L of chloroform.
  • the plate After development, the plate is dried, sprayed with 0.1% primulin (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) dissolved in methanol, and then dried with a handy UV lamp UVL-21 (manufactured by Mutual Rikagaku Glass Co., Ltd.). Minute detected.
  • a handy UV lamp UVL-21 manufactured by Mutual Rikagaku Glass Co., Ltd.
  • the TAG fraction was scraped off using a toothpick, 1 mL of 14% boron trifluoride-methanol solution (manufactured by SIGMA) was added, and the temperature was kept constant at 80 ° C. for 10 minutes. Thereafter, 0.5 mL of hexane and 1 mL of saturated brine were added and stirred vigorously. After standing at room temperature for 10 minutes, the upper hexane layer was recovered to obtain a fatty acid methyl ester. The obtained fatty acid methyl ester was subjected to gas chromatography analysis in the same manner as described above. The results are shown in Table 6.
  • medium chain fatty acids (lauric acid (C12: 0) and myristic acid (C14: 0) in TAG were obtained by further introducing NoG3PDH gene into the strain into which BTE gene and NoKASIV gene were introduced. Content and total amount of TAG increased significantly.
  • a transformant with improved productivity of medium chain fatty acids and productivity of all fatty acids produced can be produced.
  • the productivity of medium chain fatty acids and the total amount of fatty acids produced can be improved.
  • PCR was performed using the NoG3PDH gene expression plasmid constructed in Example 1 as a template and the primer pair of primer number 20 and primer number 17 shown in Table 1, and LDSP promoter, VCP1 terminator, tubulin promoter sequence, neomycin A gene fragment consisting of a resistance gene, a heat shock protein terminator sequence and a pUC19 vector sequence was amplified.
  • the gene fragment obtained by the above-mentioned method was fused in the same manner as in Example 1 to construct a YG3PDH expression plasmid.
  • the plasmid consists of an LDSP promoter sequence, a YG3PDH gene, a VCP1 terminator sequence, a tubulin promoter sequence, a neomycin resistance gene, and a heat shock protein terminator sequence in that order, and a pUC19 vector sequence.
  • BTE BTE gene-introduced strain
  • BTE + YG3PDH yeast G3PDH gene-introduced strain

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Abstract

下記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子の発現を促進させ、形質転換体の細胞内で生産される中鎖脂肪酸若しくはこれを構成成分とする脂質の生産性、又は形質転換体の細胞内で生産される脂肪酸の総量を向上させる、脂質生産性の向上方法。 （Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。 （Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が６４％以上のアミノ酸配列からなり、かつグリセロール3-リン酸脱水素酵素活性を有するタンパク質。

Description

脂質の製造方法
　本発明は、脂質の製造方法に関する。また、本発明は当該方法に用いるグリセロール-3-リン酸脱水素酵素、これをコードする遺伝子、及び当該遺伝子の発現を促進させた形質転換体に関する。
　脂肪酸は脂質の主要構成成分の１つであり、生体内においてグリセリンとのエステル結合により生成するトリアシルグリセロール等の脂質（油脂）を構成する。また、多くの動植物において脂肪酸はエネルギー源として貯蔵され利用される物質でもある。動植物内に蓄えられた脂肪酸や脂質は、食用又は工業用として広く利用されている。
　例えば、炭素原子数１２～１８前後の高級脂肪酸を還元して得られる高級アルコールの誘導体は、界面活性剤として用いられている。アルキル硫酸エステル塩やアルキルベンゼンスルホン酸塩等は陰イオン性界面活性剤として利用されている。また、ポリオキシアルキレンアルキルエーテルやアルキルポリグリコシド等は非イオン性界面活性剤として利用されている。そしてこれらの界面活性剤は、いずれも洗浄剤や殺菌剤等に利用されている。同じ高級アルコールの誘導体であるアルキルアミン塩やモノ又はジアルキル４級アミン塩等のカチオン性界面活性剤は、繊維処理剤、毛髪リンス剤、殺菌剤等に日常的に利用されている。また、ベンザルコニウム型４級アンモニウム塩は殺菌剤や防腐剤等に日常的に利用されている。さらに、植物由来の脂質はバイオディーゼル燃料の原料としても利用されている。
　このように脂肪酸や脂質の利用は多岐にわたり、そのため植物等において生体内での脂肪酸や脂質の生産性を向上させる試みが行われている。さらに、脂肪酸の用途や有用性はその炭素原子数に依存するため、脂肪酸の炭素原子数、即ち鎖長を制御する試みも行われている。
　植物の脂肪酸合成経路は葉緑体に局在する。葉緑体ではアセチル-ACP（アシルキャリアプロテイン、acyl carrier protein）を出発物質とし、炭素鎖の伸長反応が繰り返され、最終的に炭素原子数１６又は１８のアシル-ACP（脂肪酸残基であるアシル基とACPとからなる複合体）が合成される。合成されたアシル-ACPは、アシル-ACPチオエステラーゼ（以下、単に「TE」ともいう）によって遊離脂肪酸となる。遊離脂肪酸は、アシル-CoAシンテターゼによりCoAが結合する。そして、脂肪酸アシルCoAは、各種アシル基転移酵素によってグリセロール骨格へと組み込まれ、トリアシルグリセロールとして蓄積される。
　グリセロール-3-リン酸脱水素酵素（Glycerol-3-phosphate　dehydrogenase、以下単に、「G3PDH」ともいう）は脂質合成において、ジヒドロキシアセトンリン酸（DHAP）を還元してグリセロール-3-リン酸に変換する反応を触媒し、グリセロール骨格を供給する働きをすることが知られている。そこで、植物や酵母においてグリセロ脂質を蓄積させるために、G3PDHの発現の強化やG3PDH自体の改変が提案されている（特許文献１～３、非特許文献１参照）。また藻類においても、G3PDHの発現を強化することで脂質量が増加することが報告されている（非特許文献２参照）。
　近年、バイオ燃料生産に有用であるとして、藻類が注目を集めている。藻類は、バイオディーゼル燃料として利用可能な脂質を光合成によって生産でき、しかも食料と競合しないことから、次世代のバイオマス資源として注目されている。また、藻類は、植物に比べ、高い脂質生産・蓄積能力を有するとの報告もある。藻類の脂質合成・蓄積のメカニズムやそれを応用した生産技術について研究が始まってはいるが、未解明な部分も多い。
米国特許出願公開第２００６／０１６８６８４号明細書 国際公開第０１／２１８２０号 米国特許出願公開第２０１３／０１４９７５４号明細書
Vigeolas　H．et　al.，Plant　Biotechnology　Journal，2007，vol．5，p．431-441 Yao　Y，et　al.，Biotechnology　for　Biofuels，2014，vol．7(110)
　本発明は、下記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子の発現を促進させた形質転換体を培養し、脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を生産させる、脂質の製造方法に関する。
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が６４％以上のアミノ酸配列からなり、かつグリセロール3-リン酸脱水素酵素活性を有するタンパク質。
　また本発明は、前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子の発現を促進させ、形質転換体の細胞内で生産される中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させる、脂質生産性の向上方法。
　また本発明は、前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子の発現を促進させ、形質転換体の細胞内で生産される脂肪酸の総量を向上させる、脂質生産性の向上方法。
　また本発明は、前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子の発現を促進させて、形質転換体の細胞内で生産される中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させ、生産される全脂肪酸又は全脂質中の脂肪酸又は脂質の組成を改変する、脂質の組成の改変方法。
　また本発明は、前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）に関する。
　また本発明は、前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子に関する。
　さらに本発明は、前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子の発現を促進させた形質転換体に関する。
　本発明は、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性及び生産される脂肪酸の総量を向上させる、脂質の製造方法に関する。
　また本発明は、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性及び生産される脂肪酸の総量を向上させた形質転換体に関する。
　本発明者らは、脂質の合成に関与する酵素として、藻類の１種であるナンノクロロプシス属の藻類のG3PDHを新たに同定した。そして、このG3PDHの微生物内での発現を促進させた結果、生産される中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性及び生産される脂肪酸の総量が有意に向上することを見出した。
　本発明はこれらの知見に基づいて完成するに至ったものである。
　本発明の脂質の製造方法によれば、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性及び生産される脂肪酸の総量を向上させることができる。
　また本発明の形質転換体は、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性及び生産される全脂肪酸の生産性に優れる。
　本発明の上記及び他の特徴及び利点は、下記の記載からより明らかになるであろう。
　本明細書における「脂質」は、中性脂肪（トリアシルグリセロール等）、ろう、セラミド等の単純脂質；リン脂質、糖脂質、スルホ脂質等の複合脂質；及びこれらの脂質から誘導される、脂肪酸、アルコール類、炭化水素類等の誘導脂質を包含するものである。
　また本明細書において、脂肪酸や、脂肪酸を構成するアシル基の表記において「Ｃｘ：ｙ」とあるのは、炭素原子数ｘで二重結合の数がｙであることを表す。「Ｃｘ」は炭素原子数ｘの脂肪酸やアシル基を表す。
　さらに本明細書において、塩基配列及びアミノ酸配列の同一性は、Lipman-Pearson法（Science，1985，vol．227，p．1435-1441）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Winのホモロジー解析（Search　homology）プログラムを用いて、Unit　size　to　compare（ktup）を2として解析を行うことにより算出される。
　また本明細書において「ストリンジェントな条件」としては、例えばMolecular　Cloning－A　LABORATORY　MANUAL　THIRD　EDITION［Joseph　Sambrook，David　W．Russell.，Cold　Spring　Harbor　Laboratory　Press］記載の方法が挙げられる。例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、pH７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８～１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
　さらに明細書において、遺伝子の「上流」とは、翻訳開始点からの位置ではなく、対象として捉えている遺伝子又は領域の5'側に続く領域を示す。一方、遺伝子の「下流」とは、対象として捉えている遺伝子又は領域の3'側に続く領域を示す。
　前記タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）（以下、「NoG3PDH」ともいう）は酸化還元酵素の１種であり、ジヒドロキシアセトンリン酸からグリセロール3-リン酸への還元反応を触媒するタンパク質である。配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質は、ナンノクロロプシス属に属する藻類であるナンノクロロプシス・オキュラータ（Nannochloropsis　oculata）NIES2145株由来のG3PDHである。
　前記タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）はいずれも、グリセロール3-リン酸脱水素酵素活性（以下、「G3PDH活性」ともいう）を有する。本明細書において「G3PDH活性」とは、ジヒドロキシアセトンリン酸からグリセロール3-リン酸への還元反応を触媒する活性を意味する。
　タンパク質がG3PDH活性を有することは、例えば、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流に前記タンパク質をコードする遺伝子を連結したDNAを宿主細胞内へ導入し、導入した遺伝子が発現する条件下で細胞を培養し、宿主細胞内のグリセロール-3-リン酸（以下、「G3P」ともいう）量の変化を定法により分析することで確認できる。あるいは、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流に前記タンパク質をコードする遺伝子を連結したDNAを宿主細胞内へ導入し、導入した遺伝子が発現する条件下で細胞を培養した後、細胞の破砕液に対し、ジヒドロキシアセトンリン酸とNADHを用いてG3Pの生成反応をを行うことにより確認できる。
　アミノ酸配列及び塩基配列のBlastの結果から、前記タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）はG3PDHであると判断した。また、前記タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）をコードする遺伝子を導入したナンノクロロプシス・オキュラータNIES-2145株では野生株と比較してG3P量が有意に向上することも確認している。
　後述の実施例で示すように、前記タンパク質（Ａ）をコードする遺伝子の発現を促進した形質転換体では、炭素原子数１２や１４等の中鎖脂肪酸の生産性と、生産される脂肪酸の総量が向上する。
　なお本明細書において「中鎖」とは、アシル基の炭素原子数が６以上１４以下、好ましくは炭素原子数が８以上１４以下、より好ましくは炭素原子数が１０以上１４以下、より好ましくは炭素原子数が１２以上１４以下、よりさらに好ましくは炭素原子数が１２又は１４、であることをいう。
　前記タンパク質（Ｂ）において、G3PDH活性の点から、前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列との同一性は６５％以上が好ましく、７０％以上が好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８３％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、８７％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９３％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９７％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。また、前記タンパク質（Ｂ）として、前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列に、１又は複数個、例えば１個以上１６７個以下、好ましくは１個以上１６２個以下、より好ましくは１個以上１３９個以下、より好ましくは１個以上１１６個以下、より好ましくは１個以上９３個以下、より好ましくは１個以上６９個以下、より好ましくは１個以上６０個以下、より好ましくは１個以上４６個以下、より好ましくは１個以上３２個以下、より好ましくは１個以上２３個以下、より好ましくは１個以上１３個以下、より好ましくは１個以上９個以下、さらに好ましくは１個以上４個以下、のアミノ酸を欠失、置換、挿入又は付加したタンパク質が挙げられる。
　アミノ酸配列に変異を導入する方法としては、例えば、アミノ酸配列をコードする塩基配列に変異を導入する方法が挙げられる。変異を導入する方法としては、部位特異的な変異導入法が挙げられる。具体的な部位特異的変異の導入方法としては、SOE-PCRを利用した方法、ＯＤＡ法、Kunkel法等が挙げられる。また、Site-Directed　Mutagenesis　System　Mutan-SuperExpress　Kmキット（タカラバイオ社）、Transformer　TM　Site-Directed　Mutagenesisキット（Clonetech社）、KOD-Plus-Mutagenesis　Kit（東洋紡社）等の市販のキットを利用することもできる。また、ランダムな遺伝子変異を与えた後、適当な方法により酵素活性の評価及び遺伝子解析を行うことにより目的遺伝子を取得することもできる。
　前記タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）は、通常の化学的手法、遺伝子工学的手法等により得ることができる。例えば、ナンノクロロプシス・オキュラータから単離、精製等することで天然物由来のタンパク質を取得することができる。また、配列番号１に示すアミノ酸配列情報をもとに人工的に化学合成することで、前記タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）を得ることができる。あるいは、遺伝子組み換え技術により、組換えタンパク質として前記タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）を作製してもよい。組換えタンパク質を作製する場合には、後述するG3PDH遺伝子を用いることができる。
　なお、ナンノクロロプシス・オキュラータ等の藻類は、私的又は公的な研究所等の保存機関より入手することができる。例えば、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES-2145株は、国立環境研究所（NIES）から入手することができる。
　前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子（以下、「G3PDH遺伝子」ともいう）の一例として、下記ＤＮＡ（ａ）又は（ｂ）からなる遺伝子（以下、「NoG3PDH遺伝子」ともいう）が挙げられる。
 
（ａ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）前記ＤＮＡ（ａ）の塩基配列と同一性が５９％以上の塩基配列からなり、かつG3PDH活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
 
　配列番号２の塩基配列は、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質（ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株由来のG3PDH）をコードする遺伝子の塩基配列である。
　前記ＤＮＡ（ｂ）において、G3PDH活性の点から、前記ＤＮＡ（ａ）の塩基配列との同一性は６０％以上が好ましく、６５％以上が好ましく、７０％以上が好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８３％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、８７％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９３％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９７％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。また前記ＤＮＡ（ｂ）として、配列番号２で表される塩基配列において１又は複数個、例えば１個以上５７３個以下、好ましくは１個以上５５９個以下、より好ましくは１個以上４８９個以下、より好ましくは１個以上４１９個以下、より好ましくは１個以上３４９個以下、より好ましくは１個以上２７９個以下、好ましくは１個以上２０９個以下、より好ましくは１個以上１８１個以下、より好ましくは１個以上１３９個以下、より好ましくは１個以上９７個以下、より好ましくは１個以上６９個以下、より好ましくは１個以上４１個以下、より好ましくは１個以上２７個以下、さらに好ましくは１個以上１３個以下、の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつG3PDH活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも好ましい。
　さらに前記ＤＮＡ（ｂ）として、前記ＤＮＡ（ａ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつG3PDH活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも好ましい。
　前記G3PDH遺伝子の発現を促進させる方法としては、常法より適宜選択することができる。例えば、前記G3PDH遺伝子を宿主に導入する方法、前記G3PDH遺伝子をゲノム上に有する宿主において、当該遺伝子の発現調節領域（プロモーター、ターミネーター等）を改変する方法、などが挙げられる。
　なお本明細書において、目的のタンパク質をコードする遺伝子の発現を促進させたものを「形質転換体」ともいい、目的のタンパク質をコードする遺伝子の発現を促進させていないものを「宿主」又は「野生株」ともいう。
　本発明で用いる形質転換体は、宿主自体又は野生株に比べ、中鎖脂肪酸及びこれを構成成分とする脂質の生産性（中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産量、生産される全脂肪酸中又は全脂質中に占める中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の割合）が有意に向上する。またその結果、当該形質転換体では、脂質中の脂肪酸組成が改変される。そのため、当該形質転換体を用いた本発明は、特定の炭素原子数の脂質、特に中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質、好ましくは炭素原子数６以上１４以下の脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質、より好ましくは炭素原子数８以上１４以下の脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質、より好ましくは炭素原子数が１０以上１４以下の脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質、より好ましくは炭素原子数が１２以上１４以下の脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質、より好ましくは炭素原子数が１２若しくは１４の脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質、より好ましくは炭素原子数が１２若しくは１４の飽和脂肪酸（ラウリン酸、ミリスチン酸）又はこれを構成成分とする脂質、の生産に好適に用いることができる。
　さらに、本発明の形質転換体は、宿主自体に比べ、中鎖脂肪酸及びこれを構成成分とする脂質の生産性が有意に向上するとともに、生産される脂肪酸の総量も有意に向上する。そのため、当該形質転換体を用いた本発明は、脂質の生産に好適に用いることができる。
　なお、宿主や形質転換体の脂肪酸及び脂質の生産性については、実施例で用いた方法により測定することができる。
　前記G3PDH遺伝子を宿主に導入して前記遺伝子の発現を促進させる方法について説明する。
　前記G3PDH遺伝子は、通常の遺伝子工学的手法により得ることができる。例えば、配列番号１に示すアミノ酸配列又は配列番号２に示す塩基配列に基づいて、G3PDH遺伝子を人工的に合成できる。G3PDH遺伝子の合成は、例えば、インビトロジェン社等のサービスを利用することができる。また、ナンノクロロプシス・オキュラータからクローニングによって取得することもできる。例えば、Molecular　Cloning－A　LABORATORY　MANUAL　THIRD　EDITION［Joseph　Sambrook，David　W．Russell，Cold　Spring　Harbor　Laboratory　Press（2001）］記載の方法等により行うことができる。また、実施例で用いたナンノクロロプシス・オキュラータNIES-2145は、国立環境研究所(NIES)より入手することができる。
　本発明で好ましく用いることができる形質転換体は、前記G3PDH遺伝子を常法により前記宿主に導入することで得られる。具体的には、前記G3PDH遺伝子を宿主細胞中で発現させることのできる組換えベクターや遺伝子発現カセットを調製し、これを宿主細胞に導入して宿主細胞を形質転換させることにより作製できる。
　形質転換体の宿主としては通常用いられるものより適宜選択することができる。本発明で用いることができる宿主としては、微生物（藻類や微細藻類を含む）、植物体、及び動物体が挙げられる。製造効率及び得られた脂質の利用性の点から、宿主は微生物又は植物体であることが好ましく、微生物であることがより好ましく、微細藻類であることがさらに好ましい。
　前記微生物は原核生物、真核生物のいずれであってもよく、エシェリキア（Escherichia）属の微生物やバシラス（Bacillus）属の微生物、シネコシスティス（Synechocystis）属の微生物、シネココッカス（Synechococcus）属の微生物等の原核生物、又は酵母や糸状菌等の真核微生物を用いることができる。なかでも、脂質生産性の観点から、大腸菌（Escherichia　coli）、枯草菌（Bacillus　subtilis）、赤色酵母（Rhodosporidium　toruloides）、又はモルチエレラ・エスピー（Mortierella　sp．）が好ましく、大腸菌がより好ましい。
　前記藻類や微細藻類としては、遺伝子組換え手法が確立している観点から、クラミドモナス（Chlamydomonas）属の藻類、クロレラ（Chlorella）属の藻類、ファエオダクティラム（Phaeodactylum）属の藻類、又はナンノクロロプシス属の藻類が好ましく、ナンノクロロプシス属の藻類がより好ましい。ナンノクロロプシス属の藻類の具体例としては、ナンノクロロプシス・オキュラータ、ナンノクロロプシス・ガディタナ（Nannochloropsis　gaditana）、ナンノクロロプシス・サリナ（Nannochloropsis　salina）、ナンノクロロプシス・オセアニカ（Nannochloropsis　oceanica）、ナンノクロロプシス・アトムス（Nannochloropsis　atomus）、ナンノクロロプシス・マキュラタ（Nannochloropsis　maculata）、ナンノクロロプシス・グラニュラータ（Nannochloropsis　granulata）、ナンノクロロプシス・エスピー（Nannochloropsis　sp．）等が挙げられる。なかでも、脂質生産性の観点から、ナンノクロロプシス・オキュラータ、又はナンノクロロプシス・ガディタナが好ましく、ナンノクロロプシス・オキュラータがより好ましい。
　前記植物体としては、種子に脂質を高含有する観点から、シロイヌナズナ（Arabidopsis　thaliana）、西洋アブラナ（Brassica　napus）、アブラナ（Brassica　rapa）、ココヤシ（Cocos　nucifera）、パーム（Elaeis　guineensis）、クフェア、ダイズ（Glycine　max）、トウモロコシ（Zea　mays）、イネ（Oryza　sativa）、ヒマワリ（Helianthus　annuus）、クスノキ（Cinnamomum　camphora）、又はヤトロファ（Jatropha　curcas）が好ましく、シロイヌナズナがより好ましい。
　遺伝子発現用プラスミドベクター又は遺伝子発現カセットの母体となるベクター（プラスミド）としては、目的のタンパク質をコードする遺伝子を宿主に導入することができ、宿主細胞内で当該遺伝子を発現させることができるベクターであればよい。例えば、導入する宿主の種類に応じたプロモーターやターミネーター等の発現調節領域を有するベクターであって、複製開始点や選択マーカー等を有するベクターを用いることができる。また、プラスミド等の染色体外で自立増殖・複製するベクターであってもよいし、染色体内に組み込まれるベクターであってもよい。
　本発明で好ましく用いることができる発現用ベクターとしては、微生物を宿主とする場合には、例えば、pBluescript（pBS）　II　SK(-)（Stratagene社製）、pSTV系ベクター（タカラバイオ社製）、pUC系ベクター（宝酒造社製）、pET系ベクター（タカラバイオ社製）、pGEX系ベクター（GEヘルスケア社製）、pCold系ベクター（タカラバイオ社製）、pHY300PLK（タカラバイオ社製）、pUB110（Mckenzie，T．et　al.，1986，Plasmid　15（2），p．93-103）、pBR322（タカラバイオ社製）、pRS403（ストラタジーン社製）、及びpMW218/219（ニッポンジーン社製）が挙げられる。特に、宿主が大腸菌の場合は、pBluescript　II　SK(-)、又はpMW218/219が好ましく用いられる。
　藻類又は微細藻類を宿主とする場合には、例えば、pUC19（タカラバイオ社製）、P66（Chlamydomonas　Center）、P-322（Chlamydomonas　Center）、pPha-T1（Yangmin　Gong，et　al.，Journal　of　Basic　Microbiology，2011，vol．51，p．666-672参照）、及びpJET1（コスモ・バイオ社製）が挙げられる。特に、宿主がナンノクロロプシス属に属する藻類の場合は、pUC19、pPha-T1、又はpJET1が好ましく用いられる。また、宿主がナンノクロロプシス属に属する藻類の場合には、Oliver　Kilian，et　al.，Proceedings　of　the　National　Academy　of　Sciences　of　the　United　States　of　America，2011，vol．108(52)の記載の方法を参考にして、目的の遺伝子、プロモーター及びターミネーターからなるＤＮＡ断片（遺伝子発現カセット）を用いて宿主を形質転換することもできる。このＤＮＡ断片としては、例えば、PCRにより増幅したDNA断片や制限酵素で切断したDNA断片が挙げられる。
　植物細胞を宿主とする場合には、例えば、pRI系ベクター（タカラバイオ社製）、pBI系ベクター（クロンテック社製）、及びIN3系ベクター（インプランタイノベーションズ社製）が挙げられる。特に、宿主がシロイヌナズナの場合は、pRI系ベクター又はpBI系ベクターが好ましく用いられる。
　また、前記発現ベクターに組み込んだ目的のタンパク質をコードする遺伝子の発現を調整するプロモーターの種類も、使用する宿主の種類に応じて適宜選択することができる。本発明で好ましく用いることができるプロモーターとしては、lacプロモーター、trpプロモーター、tacプロモーター、trcプロモーター、T7プロモーター、SpoVGプロモーター、イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加によって誘導可能な誘導体に関するプロモーター、Rubiscoオペロン（rbc）、PSI反応中心タンパク質（psaAB）、PSIIのD1タンパク質（psbA）、カリフラワーモザイルウイルス35SRNAプロモーター、ハウスキーピング遺伝子プロモーター（例えば、チューブリンプロモーター、アクチンプロモーター、ユビキチンプロモーター等）、西洋アブラナ又はアブラナ由来Napin遺伝子プロモーター、植物由来Rubiscoプロモーター、ナンノクロロプシス属由来のビオラキサンチン／クロロフィルａ結合タンパク質遺伝子のプロモーター（VCP1プロモーター、VCP2プロモーター）（Oliver　Kilian，et　al.，Proceedings　of　the　National　Academy　of　Sciences　of　the　United　States　of　America，2011，vol．108(52)）、及びナンノクロロプシス属由来のオレオシン様タンパクＬＤＳＰ(lipid　droplet　surface　protein)遺伝子のプロモーター（Astrid　Vieler,　et　al.,　PLOS　Genetics,　2012;8(11):e1003064.　doi:　10.1371）が挙げられる。本発明で宿主としてナンノクロロプシスを用いる場合、ビオラキサンチン／クロロフィルａ結合タンパク質遺伝子のプロモーターや、ナンノクロロプシス属由来のオレオシン様タンパクＬＤＳＰ遺伝子のプロモーターを好ましく用いることができる。
　また、目的のタンパク質をコードする遺伝子が組み込まれたことを確認するための選択マーカーの種類も、使用する宿主の種類に応じて適宜選択することができる。本発明で好ましく用いることができる選択マーカーとしては、アンピシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ブラストサイジンＳ耐性遺伝子、ビアラフォス耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、パロモマイシン耐性遺伝子、及びハイグロマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。さらに、栄養要求性に関連する遺伝子の欠損等を選択マーカー遺伝子として使用することもできる。
　目的のタンパク質をコードする遺伝子の前記ベクターへの導入は、制限酵素処理やライゲーション等の常法により行うことができる。
　また、形質転換方法は、使用する宿主の種類に応じて常法より適宜選択することができる。例えば、カルシウムイオンを用いる形質転換方法、一般的なコンピテントセル形質転換方法、プロトプラスト形質転換法、エレクトロポレーション法、LP形質転換方法、アグロバクテリウムを用いた方法、パーティクルガン法等が挙げられる。宿主としてナンノクロロプシス属の藻類を用いる場合、Randor　Radakovits,　et　al.，Nature　Communications，DOI:10.1038/ncomms1688，2012等に記載のエレクトロポレーション法を用いて形質転換を行うこともできる。
　目的遺伝子断片が導入された形質転換体の選択は、選択マーカー等を利用することで行うことができる。例えば、薬剤耐性遺伝子が、形質転換時に目的DNA断片とともに宿主細胞中に導入された結果、形質転換体が獲得する薬剤耐性を指標に行うことができる。また、ゲノムを鋳型としたPCR法等によって、目的DNA断片の導入を確認することもできる。
　前記G3PDH遺伝子をゲノム上に有する宿主において、当該遺伝子の発現調節領域を改変して、前記遺伝子の発現を促進させる方法について説明する。
　「発現調節領域」とは、プロモーターやターミネーターを示し、これらの配列は一般に隣接する遺伝子の発現量（転写量、翻訳量）の調節に関与している。ゲノム上に前記G3PDH遺伝子を有する宿主においては、当該遺伝子の発現調節領域を改変して前記G3PDH遺伝子の発現を促進させることで、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させることができる。
　発現調節領域の改変方法としては、例えばプロモーターの入れ替えが挙げられる。ゲノム上に前記G3PDH遺伝子を有する宿主において、当該遺伝子のプロモーター（以下、「G3PDHプロモーター」ともいう）を、より転写活性の高いプロモーターに入れ替えることで、前記G3PDH遺伝子の発現を促進させることができる。例えば、ゲノム上に前記G3PDH遺伝子を有する宿主の１つであるナンノクロロプシス・オキュラータNIES-2145株においては、配列番号５８に示す塩基配列からなるＤＮＡ配列の直下にNoG3PDH遺伝子が存在しており、配列番号５８に示す塩基配列からなるＤＮＡ配列中にプロモーター領域が存在している。この配列番号５８に示す塩基配列からなるＤＮＡ配列の一部又は全部をより転写活性の高いプロモーターに入れ替えることで、前記G3PDH遺伝子の発現を促進させることができる。
　G3PDHプロモーターの入れ替えに用いるプロモーターとしては特に限定されず、G3PDHプロモーターよりも転写活性が高く、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産に適したものから適宜選択することができる。
　宿主としてナンノクロロプシスを用いる場合には、チューブリンプロモーター、ヒートショックプロテインプロモーター、上述のビオラキサンチン／クロロフィルａ結合タンパク質遺伝子のプロモーター（VCP1プロモーター（配列番号３０）、VCP2プロモーター）、又はナンノクロロプシス属由来のオレオシン様タンパクＬＤＳＰ遺伝子のプロモーター（配列番号１８）を好ましく用いることができる。中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性向上の観点から、ビオラキサンチン／クロロフィルａ結合タンパク質遺伝子のプロモーター及びＬＤＳＰ遺伝子のプロモーターがより好ましい。
　前述のプロモーターの改変は、相同組換えなどの常法に従い行うことができる。具体的には、標的とするプロモーターの上流、下流領域を含み、標的プロモーターに代えて別のプロモーターを含む直鎖状のDNA断片を構築し、これを宿主細胞に取り込ませ、宿主ゲノムの標的プロモーターの上流側と下流側とで２回交差の相同組換えを起こす。その結果、ゲノム上の標的プロモーターが別のプロモーター断片と置換され、プロモーターを改変することができる。
　このような相同組換えによる標的プロモーターの改変方法は、例えば、Besher　et　al.，Methods　in　molecular　biology，1995，vol．47，p．291-302等の文献を参考に行うことができる。特に、宿主がナンノクロロプシス属に属する藻類の場合、Oliver　Kilian，et　al.，Proceedings　of　the　National　Academy　of　Sciences　of　the　United　States　of　America，2011，vol．108(52)等の文献を参考にして、相同組換え法によりゲノム中の特定の領域を改変することができる。
　本発明の形質転換体は、前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子に加えて、TEをコードする遺伝子（以下、「TE遺伝子」ともいう）の発現も促進されていることが好ましい。
　前述したように、TEは、β-ケトアシル-ACPシンターゼ（β-Ketoacyl-acyl-carrier-protein　synthase、以下「KAS」ともいう）等の脂肪酸合成酵素によって合成されたアシル-ACPのチオエステル結合を加水分解し、遊離の脂肪酸を生成する酵素である。TEの作用によってACP上での脂肪酸合成が終了し、切り出された脂肪酸は多価不飽和脂肪酸の合成やトリアシルグリセロール（以下、「TAG」ともいう）等の合成に供される。そして、TAGの合成などに、前述のG3PDHが関与する。
　そのため、G3PDH遺伝子に加えてTE遺伝子の発現を促進することで、G3PDHにより合成されるTAGの基質の生成量が増加し、脂質の製造に用いる形質転換体の脂質の生産性、特に脂肪酸の生産性を一層向上させることができる。さらに、後述の実施例でも示すように、G3PDH遺伝子に加えてTE遺伝子の発現を促進することで、各脂肪酸量の総和（総脂肪酸量）も向上させることができる。
　本発明で用いることができるTEは、アシル-ACPチオエステラーゼ活性（以下、「TE活性」ともいう）を有するタンパク質であればよい。ここで「TE活性」とは、アシル-ACPのチオエステル結合を加水分解する活性をいう。
　TEは、基質であるアシル-ACPを構成するアシル基（脂肪酸残基）の炭素原子数や不飽和結合数によって異なる反応特異性を示す複数のTEが存在していることが知られている。よってTEは、生体内での脂肪酸組成を決定する重要なファクターであると考えられている。また、TEをコードする遺伝子を元来有していない宿主を用いる場合、TEをコードする遺伝子の発現を促進させることが好ましい。また、中鎖アシル-ACPに対する基質特異性を有するTE遺伝子の発現を促進させることにより、中鎖脂肪酸の生産性が向上する。このような遺伝子を導入することで、中鎖脂肪酸の生産性を一層向上させることができる。
　本発明で用いることができるTEは、通常のTEや、それらと機能的に均等なタンパク質から、宿主の種類等に応じて適宜選択することができる。
　例えば、Cuphea　calophylla　subsp.　mesostemon由来のTE（GenBank　ABB71581）；Cinnamomum　camphora由来のTE（GenBank　AAC49151.1）；Myristica　fragrans由来のTE（GenBank　AAB71729）；Myristica　fragrans由来のTE（GenBank　AAB71730）；Cuphea　lanceolata由来のTE（GenBank　CAA54060）；Cuphea　hookeriana由来のTE（GenBank　Q39513）；Ulumus　americana由来のTE(GenBank　AAB71731）；Sorghum　bicolor由来のTE(GenBank　EER87824）；Sorghum　bicolor由来のTE(GenBank　EER88593）；Cocos　nucifera由来のTE（CnFatB1：Jing　et　al.　BMC　Biochemistry　2011,　12:44参照）；Cocos　nucifera由来のTE（CnFatB2：Jing　et　al.，BMC　Biochemistry，2011，12:44参照）；Cuphea　viscosissima由来のTE（CvFatB1：Jing　et　al.，BMC　Biochemistry，2011，12:44参照）；Cuphea　viscosissima由来のTE（CvFatB2：Jing　et　al.，BMC　Biochemistry　2011，12:44参照）；Cuphea　viscosissima由来のTE（CvFatB3：Jing　et　al.，BMC　Biochemistry，2011，12:44参照）；Elaeis　guineensis由来のTE（GenBank　AAD42220）；Desulfovibrio　vulgaris由来のTE（GenBank　ACL08376）；Bacteriodes　fragilis由来のTE（GenBank　CAH09236）；Parabacteriodes　distasonis由来のTE（GenBank　ABR43801）；Bacteroides　thetaiotaomicron由来のTE（GenBank　AAO77182）；Clostridium　asparagiforme由来のTE（GenBank　EEG55387）；Bryanthella　formatexigens由来のTE（GenBank　EET61113）；Geobacillus　sp．由来のTE（GenBank　EDV77528）；Streptococcus　dysgalactiae由来のTE（GenBank　BAH81730）；Lactobacillus　brevis由来のTE（GenBank　ABJ63754）；Lactobacillus　plantarum由来のTE（GenBank　CAD63310）；Anaerococcus　tetradius由来のTE（GenBank　EEI82564）；Bdellovibrio　bacteriovorus由来のTE（GenBank　CAE80300）；Clostridium　thermocellum由来のTE（GenBank　ABN54268）；ゲッケイジュ（Umbellularia　californica（California　bay））由来のTE（以下、「BTE」ともいう）（GenBank　AAA34215.1、配列番号２９、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号２６）；ナンノクロロプシス・オキュラータ由来のTE（以下、「NoTE」ともいう）（配列番号３８、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号３９）；ココヤシ由来のTE（配列番号５９、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号６０）；ナンノクロロプシス・ガディタナ由来のTE（配列番号６１、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号６２）；ナンノクロロプシス・グラニュラータ由来のTE（配列番号６３、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号６４）；シンビオディニウム・ミクロアドリアチカム（Symbiodinium　microadriaticum）由来のTE（配列番号６５、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号６６）、等が挙げられる。
　また、これらと機能的に均等なタンパク質として、上述したいずれか１つのTEのアミノ酸配列との同一性が５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、のアミノ酸配列からなり、かつTE活性を有するタンパク質も用いることができる。あるいは、上述したいずれかの１つのTEのアミノ酸配列に１又は数個（例えば１個以上１４９個以下、好ましくは１個以上１１９個以下、より好ましくは１個以上１０４個以下、より好ましくは１個以上９０個以下、より好ましくは１個以上７５個以下、より好ましくは１個以上６０個以下、より好ましくは１個以上４５個以下、より好ましくは１個以上３０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下）のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加され、かつTE活性を有するタンパク質も用いることができる。
　上述したTEの中でも、中鎖アシル-ACPに対する基質特異性の観点から、BTE（配列番号２９、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号２６）、NoTE（配列番号３８、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号３９）、ココヤシ由来のTE（配列番号５９、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号６０）、ナンノクロロプシス・ガディタナ由来のTE（配列番号６１、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号６２）、ナンノクロロプシス・グラニュラータ由来のTE（配列番号６３、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号６４）、シンビオディニウム・ミクロアドリアチカム由来のTE（配列番号６５、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号６６）、これらのTEのいずれか１つのアミノ酸配列との同一性が５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、のアミノ酸配列からなり、かつ中鎖アシル-ACPに対するTE活性を有するタンパク質（例えば、配列番号４４に示す塩基配列からなるDNAがコードするタンパク質）、又はこれらTEのいずれか１つのアミノ酸配列に１若しくは数個（例えば１個以上１４９個以下、好ましくは１個以上１１９個以下、より好ましくは１個以上１０４個以下、より好ましくは１個以上９０個以下、より好ましくは１個以上７５個以下、より好ましくは１個以上６０個以下、より好ましくは１個以上４５個以下、より好ましくは１個以上３０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下）のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加され、かつ中鎖アシル-ACPに対するTE活性を有するタンパク質が好ましい。
　これらのTE及びそれらをコードする遺伝子の配列情報等は、例えば、国立生物工学情報センター（National　Center　for　Biotechnology　Information,　NCBI）などから入手することができる。
　タンパク質がTE活性を有することは、例えば、大腸菌等の宿主細胞内で機能するプロモーターの下流にアシル-ACPチオエステラーゼ遺伝子を連結したDNAを脂肪酸分解系が欠損した宿主細胞へ導入し、導入したTE遺伝子が発現する条件で培養して、宿主細胞又は培養液中の脂肪酸組成の変化をガスクロマトグラフィー解析等の方法を用いて分析することにより、確認することができる。
　また、大腸菌等の宿主細胞内で機能するプロモーターの下流にTE遺伝子を連結したDNAを宿主細胞へ導入し、導入したTE遺伝子が発現する条件で細胞を培養した後、細胞の破砕液に対し、Yuanらの方法（Yuan　L．et　al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，1995，vol．92(23)，p．10639-10643）によって調製した各種アシル-ACPを基質とした反応を行うことにより、TE活性を測定することができる。
　TE遺伝子の発現を促進させた形質転換体は、常法により作製できる。例えば、前述のG3PDH遺伝子の発現を促進させる方法と同様、TE遺伝子を宿主に導入する方法、TE遺伝子をゲノム上に有する宿主において当該遺伝子の発現調節領域を改変する方法、などにより形質転換体を作製することができる。
　本発明の形質転換体は、前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子に加えて、KAS遺伝子の発現も促進されていることが好ましい。
　脂肪酸合成経路に関与する酵素の１種であるKASは、アシル基の鎖長制御に関与する酵素である。植物では、KAS　I、KAS　II、KAS　III、KAS　IV、のそれぞれ機能が異なる４種のKASが存在することが知られている。このうち、KAS　IIIは鎖長伸長反応の開始段階で働き、炭素原子数２のアセチル-ACP（又はアセチル-CoA）を炭素原子数４のβ-ケトアシル-ACPに伸長する。それ以降の伸長反応には、KAS　I、KAS　II、及びKAS　IVが関与する。KAS　Iは主に炭素原子数１６のパルミトイル-ACPまでの伸長反応に関与し、KAS　IIは主に炭素原子数１８のステアロイル-ACPまでの伸長反応に関与する。一方、KAS　IVは炭素原子数６～１４の中鎖アシル-ACPまでの伸長反応に関与するといわれている。
　KASは、TAGの合成に際して基質として使用する、遊離脂肪酸の前駆体（アシル-ACP）の合成に関与する。そのためKAS遺伝子の発現を促進することでアシル-ACP量が増加し、TAG合成の基質となる遊離脂肪酸の生成量が増加する。そしてさらにG3PDH遺伝子の発現を促進することでTAGの骨格であるG3P量が増えるため、全体としてTAG合成量が増加し、脂質の製造に用いる形質転換体の脂質の生産性、特に脂肪酸の生産性を一層向上させることができる。さらに、後述の実施例でも示すように、G3PDH遺伝子に加えてKAS遺伝子の発現を促進することで、各脂肪酸量の総和（総脂肪酸量）も向上させることができる。
　本発明で用いることができるKASは、β-ケトアシル-ACPシンターゼ活性（以下、「KAS活性」ともいう）を有するタンパク質であればよい。ここで「KAS活性」とは、アセチル-ACP（又はアセチル-CoA）やアシル-ACPと、マロニルACPとの縮合反応を触媒する活性を意味する。
　前述のように、KASはその基質特異性によってKAS　I、KAS　II、KAS　III、又はKAS　IVに分類される。よってKASは、生体内での脂肪酸組成を決定する重要なファクターであると考えられている。よって、KAS遺伝子の発現を促進させることにより、脂肪酸の生産性を一層向上させることができる。
　本発明で用いることができるKASは、通常のKASや、それらと機能的に均等なタンパク質から、宿主の種類等に応じて適宜選択することができる。
　例えば、ナンノクロロプシス・オキュラータ由来のKAS（配列番号４８、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号４９；配列番号７５、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号７６）、ナンノクロロプシス・ガディタナ由来のKAS（配列番号６７、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号６８）、ゲッケイジュ由来のKAS（配列番号６９、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号７０；配列番号７１、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号７２）、クスノキ由来のKAS（配列番号７３、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号７４）、ココヤシ由来のKAS（配列番号７７、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号７８）、クフェア・フッケリアナ（Cuphea　hookeriana）由来のKAS（配列番号７９、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号８０）、クフェア・ランケオラータ（Cuphea　lanceolata）由来のKAS（配列番号８１、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号８２）、等が挙げられる。
　また、これらと機能的に均等なタンパク質として、上述したいずれか１つのKASのアミノ酸配列との同一性が５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、のアミノ酸配列からなり、かつKAS活性を有するタンパク質も用いることができる。あるいは、上述したいずれかの１つのKASのアミノ酸配列に１又は数個（例えば１個以上２５５個以下、より好ましくは１個以上２０４個以下、より好ましくは１個以上１７９個以下、より好ましくは１個以上１５３個以下、より好ましくは１個以上１２８個以下、より好ましくは１個以上１０２個以下、より好ましくは１個以上７７個以下、より好ましくは１個以上５１個以下、より好ましくは１個以上２６個以下）のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加され、かつKAS活性を有するタンパク質も用いることができる。
　上述したKASの中でも、中鎖β-ケトアシル-ACP合成活性の観点から、ナンノクロロプシス・オキュラータ由来のKAS（配列番号４８、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号４９；配列番号７５、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号７６）、ナンノクロロプシス・ガディタナ由来のKAS（配列番号６７、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号６８）、ゲッケイジュ由来のKAS（配列番号６９、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号７０；配列番号７１、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号７２）、クスノキ由来のKAS（配列番号７３、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号７４）、ココヤシ由来のKAS（配列番号７７、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号７８）、クフェア・フッケリアナ由来のKAS（配列番号７９、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号８０）、クフェア・ランケオラータ（配列番号８１、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号８２）、これらのKASのいずれか１つのアミノ酸配列との同一性が５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、、のアミノ酸配列からなり、かつ中鎖β-ケトアシル-ACP合成活性を有するタンパク質、又はこれらKASのいずれか１つのアミノ酸配列に１若しくは数個（例えば１個以上２５５個以下、より好ましくは１個以上２０４個以下、より好ましくは１個以上１７９個以下、より好ましくは１個以上１５３個以下、より好ましくは１個以上１２８個以下、より好ましくは１個以上１０２個以下、より好ましくは１個以上７７個以下、より好ましくは１個以上５１個以下、より好ましくは１個以上２６個以下）のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加され、かつ中鎖β-ケトアシル-ACP合成活性を有するタンパク質が好ましい。
　これらのKAS及びそれらをコードする遺伝子の配列情報等は、例えば、国立生物工学情報センター（National　Center　for　Biotechnology　Information,　NCBI）などから入手することができる。
　タンパク質のKAS活性については、例えば、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流にタンパク質をコードする遺伝子を連結したＤＮＡを、脂肪酸分解系が欠損した宿主細胞へ導入し、導入した遺伝子が発現する条件下で細胞を培養して、宿主細胞又は培養液中の脂肪酸組成の変化を常法により分析することで確認できる。また、上記の系にTEを共発現させ、TEのみを発現させた場合の脂肪酸組成と比較することにより確認できる。また、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流にタンパク質をコードする遺伝子を連結したＤＮＡを、宿主細胞へ導入し、導入した遺伝子が発現する条件下で細胞を培養した後、細胞の破砕液に対し鎖長伸長反応を行うことにより確認できる。
　KAS遺伝子の発現を促進させた形質転換体は、常法により作製できる。例えば、前述のG3PDH遺伝子の発現を促進させる方法と同様、KAS遺伝子を宿主に導入する方法、KAS遺伝子をゲノム上に有する宿主において当該遺伝子の発現調節領域を改変する方法、などにより形質転換体を作製することができる。
　さらに本発明の形質転換体は、前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子に加えて、アシル基転移酵素をコードする遺伝子などの発現も促進されていることが好ましい。
　前述したように、アシル基転移酵素は、TAGの生合成に必要なアシル化を行う酵素である。そのため、G3PDH遺伝子に加え中鎖脂肪酸特異的なジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼなどの中鎖脂肪酸特異的なアシル基転移酵素をコードする遺伝子の発現を促進することで、中鎖脂肪酸の生産性を一層向上させることができる。
　本発明で用いることができるアシル基転移酵素は、通常のアシル基転移酵素や、それらと機能的に均等なタンパク質から、宿主の種類等に応じて適宜選択することができる。
　また、これら遺伝子の発現を促進させた形質転換体は、常法により作製できる。例えば、前述のG3PDH遺伝子の発現を促進させる方法と同様、アシル基転移酵素をコードする遺伝子を宿主に導入する方法、アシル基転移酵素をコードする遺伝子をゲノム上に有する宿主において当該遺伝子の発現調節領域を改変する方法、などにより形質転換体を作製することができる。
　本発明の形質転換体は、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性が、前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子の発現が促進されていない宿主と比較して向上している。したがって、本発明の形質転換体を適切な条件で培養し、次いで得られた培養物又は生育物から中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を回収すれば、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を効率のよく製造することができる。
　さらに当該形質転換体は、宿主自体に比べ、生産される脂肪酸の総量も有意に向上する。よって、本発明の形質転換体を適切な条件で培養し、次いで得られた培養物又は生育物から脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を回収すれば、脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を効率よく製造することができる。
　ここで「培養物」とは培養した後の培養液及び形質転換体をいい、「生育物」とは生育した後の形質転換体をいう。
　本発明の形質転換体の培養条件は、宿主に応じて適宜選択することができ、その宿主に対して通常用いられる培養条件を使用できる。また脂肪酸の生産効率の点から、培地中に、例えば脂肪酸生合成系に関与する前駆物質としてグリセロール、酢酸、又はグルコース等を添加してもよい。
　宿主として大腸菌を用いる場合、大腸菌の培養は、例えば、ＬＢ培地又はOvernight　Express　Instant　TB　Medium（Novagen社）で、３０～３７℃、０．５～１日間培養することができる。
　また、宿主としてシロイヌナズナを用いる場合、シロイヌナズナの培養は、例えば、土壌で温度条件２０～２５℃、白色光を連続照射又は明期１６時間・暗期８時間等の光条件下で１～２か月間栽培することができる。
　宿主として藻類を用いる場合、培地は天然海水又は人工海水をベースにしたものを使用してもよいし、市販の培養培地を使用してもよい。具体的な培地としては、ｆ／２培地、ＥＳＭ培地、ダイゴＩＭＫ培地、Ｌ１培地、ＭＮＫ培地、等を挙げることができる。なかでも、脂質の生産性向上及び栄養成分濃度の観点から、ｆ／２培地、ＥＳＭ培地、又はダイゴＩＭＫ培地が好ましく、ｆ／２培地、又はダイゴＩＭＫ培地がより好ましく、ｆ／２培地がさらに好ましい。藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上のため、培地に、窒素源、リン源、金属塩、ビタミン類、微量金属等を適宜添加することができる。
　培地に接種する形質転換体の量は適宜選択することができ、生育性の点から培地当り１～５０％（vol/vol）が好ましく、１～１０％（vol/vol）がより好ましい。培養温度は、藻類の増殖に悪影響を与えない範囲であれば特に制限されないが、通常、５～４０℃の範囲である。藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上、及び生産コストの低減の観点から、好ましくは１０～３５℃であり、より好ましくは１５～３０℃である。
　また藻類の培養は、光合成ができるよう光照射下で行うことが好ましい。光照射は、光合成が可能な条件であればよく、人工光でも太陽光でもよい。光照射時の照度としては、藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上の観点から、好ましくは１００～５００００ルクスの範囲、より好ましくは３００～１００００ルクスの範囲、さらに好ましくは１０００～６０００ルクスの範囲である。また、光照射の間隔は、特に制限されないが、前記と同様の観点から、明暗周期で行うことが好ましく、２４時間のうち明期が好ましくは８～２４時間、より好ましくは１０～１８時間、さらに好ましくは１２時間である。
　また藻類の培養は、光合成ができるように二酸化炭素を含む気体の存在下、又は炭酸水素ナトリウムなどの炭酸塩を含む培地で行うことが好ましい。気体中の二酸化炭素の濃度は特に限定されないが、生育促進、脂肪酸の生産性向上の観点から０．０３（大気条件と同程度）～１０％が好ましく、より好ましくは０．０５～５％、さらに好ましくは０．１～３％、よりさらに好ましくは０．３～１％である。炭酸塩の濃度は特に限定されないが、例えば炭酸水素ナトリウムを用いる場合、生育促進、脂肪酸の生産性向上の観点から０．０１～５質量％が好ましく、より好ましくは０．０５～２質量％、さらに好ましくは０．１～１質量％である。
　培養時間は特に限定されず、脂質を高濃度に蓄積する藻体が高い濃度で増殖できるように、長期間（例えば１５０日程度）行なってもよい。藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上、及び生産コストの低減の観点から、培養期間は、好ましくは３～９０日間、より好ましくは３～３０日間、さらに好ましくは７～３０日間である。なお、培養は、通気攪拌培養、振とう培養又は静置培養のいずれでもよく、通気性の向上の観点から、通気撹拌培養又は振とう培養が好ましく、通気撹拌培養がより好ましい。
　培養物又は生育物から脂質を採取する方法としては、常法から適宜選択することができる。例えば、前述の培養物又は生育物から、ろ過、遠心分離、細胞の破砕、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、クロロホルム／メタノール抽出法、ヘキサン抽出法、又はエタノール抽出法等により脂質成分を単離、回収することができる。より大規模な培養を行った場合は、培養物又は生育物より油分を圧搾又は抽出により回収後、脱ガム、脱酸、脱色、脱蝋、脱臭等の一般的な精製を行い、脂質を得ることができる。このように脂質成分を単離した後、単離した脂質を加水分解することで脂肪酸を得ることができる。脂質成分から脂肪酸を単離する方法としては、例えば、アルカリ溶液中で７０℃程度の高温で処理をする方法、リパーゼ処理をする方法、又は高圧熱水を用いて分解する方法等が挙げられる。
　本発明の製造方法において製造される脂質は、その利用性の点から、脂肪酸又は脂肪酸化合物を含んでいることが好ましく、脂肪酸又は脂肪酸エステル化合物を含んでいることがさらに好ましい。
　脂質中に含まれる脂肪酸又は脂肪酸エステル化合物は、界面活性剤等への利用性の観点から、中鎖脂肪酸又はそのエステル化合物が好ましく、炭素原子数が６以上１４以下の脂肪酸又はそのエステル化合物がより好ましく、炭素原子数が８以上１４以下の脂肪酸又はそのエステル化合物がより好ましく、炭素原子数が１０以上１４以下の脂肪酸又はそのエステル化合物がより好ましく、炭素原子数が１２以上１４以下の脂肪酸又はそのエステル化合物がより好ましく、炭素原子数が１２若しくは１４の脂肪酸又はそのエステル化合物がより好ましく、炭素原子数が１２若しくは１４の飽和脂肪酸（ラウリン酸、ミリスチン酸）又はその脂肪酸エステル化合物がより好ましい。
　脂肪酸エステル化合物は、生産性の点から、単純脂質又は複合脂質が好ましく、単純脂質がさらに好ましく、トリアシルグリセロールがさらにより好ましい。
　本発明の製造方法により得られる脂質は、食用として用いる他、可塑剤、化粧品等の乳化剤、石鹸や洗剤等の洗浄剤、繊維処理剤、毛髪リンス剤、又は殺菌剤や防腐剤として利用することができる。
　上述した実施形態に関し、本発明はさらに以下の脂質の製造方法、脂質生産性の向上方法、生産される脂肪酸の組成を改変する方法、タンパク質、遺伝子、組換えベクター、生物、形質転換体、及び形質転換体の作製方法を開示する。
＜１＞下記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子の発現を促進させた形質転換体を培養し、脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を生産させる、脂質の製造方法。
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が６４％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８３％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは８７％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９３％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、のアミノ酸配列からなり、かつG3PDH活性を有するタンパク質。
＜２＞前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子の発現を促進させ、形質転換体の細胞内で生産される中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させる、脂質生産性の向上方法。
＜３＞前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子の発現を促進させ、形質転換体の細胞内で生産される脂肪酸の総量を向上させる、脂質生産性の向上方法。
＜４＞前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子の発現を促進させて、形質転換体の細胞内で生産される中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させ、生産される全脂肪酸又は全脂質中の脂肪酸又は脂質の組成を改変する、脂質の組成の改変方法。
＜５＞前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子を宿主に導入して前記遺伝子の発現を促進させる、前記＜１＞～＜４＞のいずれか１項記載の方法。
＜６＞前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子を導入した形質転換体を培養して脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を生産させる、脂質の製造方法。
＜７＞前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子を宿主に導入して形質転換体を作製し、形質転換体の細胞内で生産される中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させる、脂質生産性の向上方法。
＜８＞前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子を宿主に導入して形質転換体を作製し、形質転換体の細胞内で生産される脂肪酸の総量を向上させる、脂質生産性の向上方法。
＜９＞前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子を導入して形質転換体を作製し、形質転換体の細胞内で生産される中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させ、生産される全脂肪酸中又は全脂質中の脂肪酸又は脂質の組成を改変する、脂質の組成の改変方法。
＜１０＞前記タンパク質（Ｂ）が、前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列に、１又は複数個、好ましくは１個以上１６７個以下、より好ましくは１個以上１６２個以下、より好ましくは１個以上１３９個以下、より好ましくは１個以上１１６個以下、より好ましくは１個以上９３個以下、より好ましくは１個以上６９個以下、より好ましくは１個以上６０個以下、より好ましくは１個以上４６個以下、より好ましくは１個以上３２個以下、より好ましくは１個以上２３個以下、より好ましくは１個以上１３個以下、より好ましくは１個以上９個以下、さらに好ましくは１個以上４個以下、のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたタンパク質である、前記＜１＞～＜９＞のいずれか１項記載の方法。
＜１１＞前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子が、下記ＤＮＡ（ａ）又は（ｂ）からなる遺伝子である、前記＜１＞～＜１０＞のいずれか１項記載の方法。
（ａ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）前記ＤＮＡ（ａ）の塩基配列と同一性が５９％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、好ましくは８３％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは８７％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９３％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、の塩基配列からなり、かつG3PDH活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
＜１２＞前記ＤＮＡ（ｂ）が、前記ＤＮＡ（ａ）の塩基配列に、１若しくは複数個、好ましくは１個以上５７３個以下、より好ましくは１個以上５５９個以下、より好ましくは１個以上４８９個以下、より好ましくは１個以上４１９個以下、より好ましくは１個以上３４９個以下、より好ましくは１個以上２７９個以下、より好ましくは１個以上２０９個以下、より好ましくは１個以上１８１個以下、より好ましくは１個以上１３９個以下、より好ましくは１個以上９７個以下、より好ましくは１個以上６９個以下、より好ましくは１個以上４１個以下、より好ましくは１個以上２７個以下、さらに好ましくは１個以上１３個以下、の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加された塩基配列からなり、かつG3PDH活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は前記ＤＮＡ（ａ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつG3PDH活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである、前記＜１１＞項記載の方法。
＜１３＞前記形質転換体において、TEをコードする遺伝子の発現を促進させた、前記＜１＞～＜１２＞のいずれか１項記載の方法。
＜１４＞前記TEが、中鎖アシル-ACPに対する基質特異性を有するTEである、前記＜１３＞項記載の方法。
＜１５＞前記TEが、配列番号２９、配列番号３８、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３若しくは配列番号６５に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、当該タンパク質のアミノ酸配列との同一性が５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、のアミノ酸配列からなり、かつ中鎖アシル-ACPに対するTE活性を有するタンパク質、又は、当該タンパク質のアミノ酸配列に１若しくは数個、好ましくは１個以上１４９個以下、より好ましくは１個以上１１９個以下、より好ましくは１個以上１０４個以下、より好ましくは１個以上９０個以下、より好ましくは１個以上７５個以下、より好ましくは１個以上６０個以下、より好ましくは１個以上４５個以下、より好ましくは１個以上３０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加され、かつ中鎖アシル-ACPに対するTE活性を有するタンパク質、である、前記＜１３＞又は＜１４＞項記載の方法。
＜１６＞前記形質転換体において、KASをコードする遺伝子の発現を促進させた、前記＜１＞～＜１５＞のいずれか１項記載の方法。
＜１７＞前記KASが、中鎖β-ケトアシル-ACP合成活性を有するKASである、前記＜１６＞項記載の方法。
＜１８＞前記KASが、配列番号４８、配列番号７５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７７、配列番号７９若しくは配列番号８１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、当該タンパク質のアミノ酸配列との同一性が５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、のアミノ酸配列からなり、かつ中鎖β-ケトアシル-ACP合成活性を有するタンパク質、又は、当該タンパク質のアミノ酸配列に１若しくは数個、好ましくは１個以上２５５個以下、より好ましくは１個以上２０４個以下、より好ましくは１個以上１７９個以下、より好ましくは１個以上１５３個以下、より好ましくは１個以上１２８個以下、より好ましくは１個以上１０２個以下、より好ましくは１個以上７７個以下、より好ましくは１個以上５１個以下、より好ましくは１個以上２６個以下）のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加され、かつ中鎖β-ケトアシル-ACP合成活性を有するタンパク質、である、前記＜１６＞又は＜１７＞項記載の方法。
＜１９＞前記形質転換体が微生物又は植物である、前記＜１＞～＜１８＞のいずれか１項記載の方法。
＜２０＞前記微生物が微細藻類である、前記＜１９＞項記載の方法。
＜２１＞前記微細藻類がナンノクロロプシス属に属する藻類、好ましくはナンノクロロプシス・オキュラータ、である、前記＜２０＞項記載の方法。
＜２２＞前記微生物が大腸菌である、前記＜１９＞項記載の方法。
＜２３＞前記植物がシロイヌナズナである、前記＜１９＞項記載の方法。
＜２４＞前記脂質が、中鎖脂肪酸又はそのエステル化合物、好ましくは炭素原子数が６以上１４以下の脂肪酸又はそのエステル化合物、より好ましくは炭素原子数が８以上１４以下の脂肪酸又はそのエステル化合物、より好ましくは炭素原子数が１０以上１４以下の脂肪酸又はそのエステル化合物、より好ましくは炭素原子数が１２以上１４以下の脂肪酸又はそのエステル化合物、より好ましくは炭素原子数が１２若しくは１４の脂肪酸又はそのエステル化合物、より好ましくは炭素原子数が１２若しくは１４の飽和脂肪酸（ラウリン酸、ミリスチン酸）又はその脂肪酸エステル化合物、を含む、前記＜１＞～＜２３＞のいずれか１項記載の方法。
＜２５＞前記＜１＞～＜２４＞のいずれか１項で規定した、前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）。
＜２６＞前記＜２５＞項記載のタンパク質をコードする遺伝子。
＜２７＞前記＜１＞～＜２４＞のいずれか１項で規定した、前記ＤＮＡ（ａ）又は（ｂ）からなる遺伝子。
＜２８＞前記＜２６＞又は＜２７＞項記載の遺伝子を含有する、組換えベクター。
＜２９＞前記＜２６＞又は＜２７＞項記載の遺伝子の発現を促進させ、形質転換体の細胞内で生産される、中鎖脂肪酸若しくはこれを構成成分とする脂質の生産性、並びに脂肪酸の総量の少なくともいずれか一方を向上させた形質転換体。
＜３０＞前記＜２６＞若しくは＜２７＞項記載の遺伝子、又は前記＜２８＞項記載の組換えベクターを宿主に導入してなる、形質転換体。
＜３１＞前記＜２６＞若しくは＜２７＞項記載の遺伝子、又は前記＜２８＞項記載の組換えベクターを宿主に導入する、形質転換体の作製方法。
＜３２＞TEをコードする遺伝子の発現を促進させた、前記＜２９＞～＜３１＞のいずれか１項記載の形質転換体又はその作製方法。
＜３３＞前記TEが、中鎖アシル-ACPに対する基質特異性を有するTEである、前記＜３２＞項記載の形質転換体又はその作製方法。
＜３４＞前記TEが、配列番号２９、配列番号３８、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３若しくは配列番号６５に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、当該タンパク質のアミノ酸配列との同一性が５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、のアミノ酸配列からなり、かつ中鎖アシル-ACPに対するTE活性を有するタンパク質、又は、当該タンパク質のアミノ酸配列に１若しくは数個、好ましくは１個以上１４９個以下、より好ましくは１個以上１１９個以下、より好ましくは１個以上１０４個以下、より好ましくは１個以上９０個以下、より好ましくは１個以上７５個以下、より好ましくは１個以上６０個以下、より好ましくは１個以上４５個以下、より好ましくは１個以上３０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加され、かつ中鎖アシル-ACPに対するTE活性を有するタンパク質、である、前記＜３２＞又は＜３３＞項記載の形質転換体又はその作製方法。
＜３５＞KASをコードする遺伝子の発現を促進させた、前記＜２９＞～＜３４＞のいずれか１項記載の形質転換体又はその作製方法。
＜３６＞前記KASが、中鎖β-ケトアシル-ACP合成活性を有するKASである、前記＜３５＞項記載の形質転換体又はその作製方法。
＜３７＞前記KASが、配列番号４８、配列番号７５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７７、配列番号７９若しくは配列番号８１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、当該タンパク質のアミノ酸配列との同一性が５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、のアミノ酸配列からなり、かつ中鎖β-ケトアシル-ACP合成活性を有するタンパク質、又は、当該タンパク質のアミノ酸配列に１若しくは数個、好ましくは１個以上２５５個以下、より好ましくは１個以上２０４個以下、より好ましくは１個以上１７９個以下、より好ましくは１個以上１５３個以下、より好ましくは１個以上１２８個以下、より好ましくは１個以上１０２個以下、より好ましくは１個以上７７個以下、より好ましくは１個以上５１個以下、より好ましくは１個以上２６個以下）のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加され、かつ中鎖β-ケトアシル-ACP合成活性を有するタンパク質、である、前記＜３５＞又は＜３６＞項記載の形質転換体又はその作製方法。
＜３８＞前記形質転換体又は宿主が微生物又は植物である、前記＜２９＞～＜３７＞のいずれか１項記載の形質転換体又はその作製方法。
＜３９＞前記微生物が微細藻類である、前記＜３８＞項記載の形質転換体又はその作製方法。
＜４０＞前記微細藻類がナンノクロロプシス属に属する藻類、好ましくはナンノクロロプシス・オキュラータ、である、前記＜３９＞項記載の形質転換体又はその作製方法。
＜４１＞前記微生物が大腸菌である、前記＜３８＞項記載の形質転換体又はその作製方法。
＜４２＞前記植物がシロイヌナズナである、前記＜３８＞項記載の形質転換体又はその作製方法。
＜４３＞脂質を製造するための、前記＜２５＞～＜４２＞のいずれか１項記載のタンパク質、遺伝子、組換えベクター、形質転換体、又は形質転換体の作製方法により得られた形質転換体の使用。
＜４４＞前記脂質が、中鎖脂肪酸又はそのエステル化合物、好ましくは炭素原子数が６以上１４以下の脂肪酸又はそのエステル化合物、より好ましくは炭素原子数が８以上１４以下の脂肪酸又はそのエステル化合物、より好ましくは炭素原子数が１０以上１４以下の脂肪酸又はそのエステル化合物、より好ましくは炭素原子数が１２以上１４以下の脂肪酸又はそのエステル化合物、より好ましくは炭素原子数が１２若しくは１４の脂肪酸又はそのエステル化合物、より好ましくは炭素原子数が１２若しくは１４の飽和脂肪酸（ラウリン酸、ミリスチン酸）又はその脂肪酸エステル化合物、を含む、前記＜４３＞項記載の使用。
　以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。ここで、本実施例で用いるプライマーの塩基配列を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
実施例１　NoG3PDH遺伝子をナンノクロロプシス・オキュラータに導入した形質転換体の作製、及び形質転換体による脂肪酸の生産
（１）ネオマイシン耐性遺伝子発現用プラスミドの構築
　ネオマイシン耐性遺伝子（配列番号３）、及び文献（Randor　Radakovits,　et　al.，Nature　Communications，DOI:10.1038/ncomms1688，2012）記載のナンノクロロプシス・ガディタナCCMP526株由来チューブリンプロモーター配列（配列番号４）を人工合成した。
　合成したＤＮＡ断片を鋳型として、表１に示すプライマー番号５及びプライマー番号６のプライマー対、並びにプライマー番号７及びプライマー番号８のプライマー対を用いてPCRを行い、ネオマイシン耐性遺伝子及びチューブリンプロモーター配列をそれぞれ増幅した。
　また、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株のゲノムを鋳型として、表１に示すプライマー番号９及びプライマー番号１０のプライマー対を用いてPCRを行い、ヒートショックプロテインターミネーター配列（配列番号１１）を増幅した。
　さらに、プラスミドベクターpUC19（タカラバイオ社製）を鋳型として、表１に示すプライマー番号１２及びプライマー番号１３のプライマー対を用いてPCRを行い、プラスミドベクターpUC19を増幅した。
　これら４つの増幅断片をそれぞれ制限酵素DpnI（東洋紡社製）にて処理し、High　Pure　PCR　Product　Purification　Kit（Roche　Applied　Science社製）を用いて精製した。その後、得られた４つの断片をIn-Fusion　HD　Cloning　Kit（Clontech社製）を用いて融合し、ネオマイシン耐性遺伝子発現用プラスミドを構築した。
　なお、本プラスミドは、チューブリンプロモーター配列、ネオマイシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列の順に連結したインサート配列と、pUC19ベクター配列からなる。
（２）NoG3PDH遺伝子発現用プラスミドの構築
　国立環境研究所(NIES)からナンノクロロプシス・オキュラータNIES-2145株を購入し、使用した。ナンノクロロプシス・オキュラータNIES-2145株をｆ／２液体培地（NaNO3　75mg、NaH2PO4・2H2O　6mg、ビタミンB12　0.5μg、ビオチン　0.5μg、チアミン　100μg、Na2SiO3・9H2O　10mg、Na2EDTA・2H2O　4.4mg、FeCl3・6H2O　3.16mg、FeCl3・6H2O　12μg、ZnSO4・7H2O　21μg、MnCl2・4H2O　180μg、CuSO4・5H2O　7μg、Na2MoO4・2H2O　7μg／人工海水1L）で十分培養し、50mLのｆ／２培地に10％植菌し、25℃、二酸化炭素０．３％で人工気象機にて６日間培養した。培養後に回収したサンプルをマルチビーズショッカーにて破砕し、RNeasy　Plant　Mini　Kit（Qiagen社製）を用いてRNAの精製を行った。得られたtotal　RNAから、SuperScript　III　First-Strand　Synthesis　System　for　RT-PCR（invitrogen社製）を用いてcDNAライブラリーを作製した。このcDNAを鋳型として、表１に示すプライマー番号１４及びプライマー番号１５のプライマー対を用いたPCRにより、NoG3PDH遺伝子断片を取得した。
　また、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株のゲノムを鋳型として、表１に示すプライマー番号１６及びプライマー番号１７のプライマー対を用いてPCRを行い、LDSPプロモーター配列（配列番号１８）を増幅した。
　また、GenBankに登録されているナンノクロロプシス・エスピー（Nannochloropsis　sp.）W2J3B株のVCP1（ビオラキサンチン／クロロフィルａ結合タンパク質）遺伝子のcomplete　cds　配列（Accession　number：JF957601.1）より、VCP1ターミネーター配列（配列番号１９）を人工合成した。合成したＤＮＡ断片を鋳型として、表１に示すプライマー番号２０及びプライマー番号２１のプライマー対を用いたPCRを行い、VCP1ターミネーター配列を取得した。
　さらに、前述のネオマイシン耐性遺伝子発現プラスミドを鋳型として、表１に示すプライマー番号２２及びプライマー番号１３のプライマー対を用いたPCRを行い、ネオマイシン耐性遺伝子発現カセット（チューブリンプロモーター配列、ネオマイシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列）及びpUC19配列からなる断片を増幅した。
　これら４つの増幅断片を、前述の方法と同様の方法にて融合し、NoG3PDH遺伝子発現用プラスミドを構築した。
　なお、本プラスミドはLDSPプロモーター配列、NoG3PDH遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ネオマイシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列の順で連結したインサート配列と、pUC19ベクター配列からなる。
（３）NoG3PDH遺伝子発現用断片のナンノクロロプシス・オキュラータへの導入
　前記NoG3PDH遺伝子発現用プラスミドを鋳型として、表１に示すプライマー番号１６及びプライマー番号１０のプライマー対を用いてPCRを行い、NoG3PDH遺伝子発現用断片（LDSPプロモーター配列、NoG3PDH遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ネオマイシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列からなるDNA断片）を増幅した。
　増幅した遺伝子断片を、High　Pure　PCR　Product　Purification　Kit（Roche　Applied　Science社製）を用いて精製した。なお、精製の際の溶出には、キットに含まれる溶出バッファーではなく、滅菌水を用いた。
　約1×109個の細胞のナンノクロロプシス・オキュラータNIES-2145株（独立行政法人国立環境研究所(NIES)より入手）を、384mMのソルビトール溶液で洗浄して塩を完全に除去し、形質転換の宿主細胞として用いた。上記で増幅したNoG3PDH遺伝子発現用断片約500ngを宿主細胞に混和し、50μF、500Ω、2,200v/2mmの条件でエレクトロポレーションを行った。
　ｆ／２液体培地（NaNO3　75mg、NaH2PO4・2H2O　6mg、ビタミンB12　0.5μg、ビオチン　0.5μg、チアミン　100μg、Na2SiO3・9H2O　10mg、Na2EDTA・2H2O　4.4mg、FeCl3・6H2O　3.16mg、FeCl3・6H2O　12μg、ZnSO4・7H2O　21μg、MnCl2・4H2O　180μg、CuSO4・5H2O　7μg、Na2MoO4・2H2O　7μg／人工海水1L）にて１日間回復培養を行った。その後に、500μg/mLのネオマイシン含有ｆ／２寒天培地に塗布し、25℃、0.3%CO2雰囲気下、12h/12h明暗条件にて２～３週間培養した。得られたコロニーを遺伝子導入株（G3PDH）として選抜した。
（４）形質転換体による脂肪酸の生産
　選抜した株を、ｆ／２培地の窒素濃度を15倍、リン濃度を5倍に増強した培地（以下、「Ｎ１５Ｐ５培地」という）50mLに播種し、25℃、0.3%CO2雰囲気下、12h/12h明暗条件にて４週間振盪培養し、前培養液とした。前培養液10mLを、Ｎ１５Ｐ５培地40mLに植継ぎ、25℃、0.3%CO2雰囲気下、12h/12h明暗条件にて振盪培養した。培養３週間後、培養液に含まれる脂質成分を、以下の方法にて解析した。
　なお、陰性対照として、ネオマイシン耐性遺伝子のみを前記宿主細胞に導入した形質転換体（WT）についても同様に実験を行った。
（５）脂質の抽出及び構成脂肪酸の分析
　培養液1mLに、内部標準として1mg/mLの7-ペンタデカノン50μLを添加後、クロロホルム0.5mL、メタノール1mL、及び２Ｎ塩酸10μLを培養液に添加して激しく攪拌し、30分間放置した。その後さらに、クロロホルム0.5mL及び1.5%KCl　0.5mLを添加して攪拌し、3,000rpmにて15分間遠心分離を行い、パスツールピペットにてクロロホルム層（下層）を回収した。
　得られたクロロホルム層に窒素ガスを吹き付けて乾固し、0.5N水酸化カリウム／メタノール溶液0.7mLを添加し、80℃で30分間恒温した。続いて14%三フッ化ホウ素－メタノール溶液（SIGMA社製）1mLを添加し、80℃にて10分間恒温した。その後、ヘキサン及び飽和食塩水を各1mL添加して激しく撹拌し、室温にて30分放置し、上層であるヘキサン層を回収して脂肪酸メチルエステルを得た。
　下記に示す測定条件下で、得られた脂肪酸メチルエステルをガスクロマトグラフィー解析に供した。
＜ガスクロマトグラフィー条件＞
キャピラリーカラム：DB-1　MS（30m×200μm×0.25μm、J＆W　Scientific社製）
移動層：高純度ヘリウム
カラム内流量：1.0mL/min
昇温プログラム：100℃（1分間）→10℃/min→300℃（5分間）
平衡化時間：1分間
注入口：スプリット注入（スプリット比：100：1），圧力14.49psi，104mL/min
注入量：1μL
洗浄バイアル：メタノール・クロロホルム
検出器温度：300℃
　脂肪酸メチルエステルの同定は、同サンプルを同条件でガスクロマトグラフ質量分析解析に供することにより行った。
　ガスクロマトグラフィー解析により得られた波形データのピーク面積より、各脂肪酸のメチルエステル量を定量した。各ピーク面積を、内部標準である7-ペンタデカノンのピーク面積と比較することで試料間の補正を行い、培養液1Lあたりの各脂肪酸量を算出した。さらに、各脂肪酸量の総和を総脂肪酸量（FA）とし、総脂肪酸量に占める各脂肪酸量の割合を算出した。
　その結果を表２に示す。なお、以下の表において、以下の表において、「脂肪酸組成（％ＴＦＡ）」は総脂肪酸の重量に対する各脂肪酸量の割合（重量パーセント）を示す。また「ｎ」は０～５の整数を表し、例えば「Ｃ１８：ｎ」と記載した場合には、Ｃ１８：０、Ｃ１８：１、Ｃ１８：２、Ｃ１８：３、Ｃ１８：４及びＣ１８：５の脂肪酸の総和を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
　表２に示すように、NoG3PDH遺伝子を導入することで、ラウリン酸（Ｃ１２：０）及びミリスチン酸（Ｃ１４：０）の含有率が有意に増加し、総脂肪酸量が増加傾向にあることが確認された。
実施例２　BTE遺伝子及びNoG3PDH遺伝子をナンノクロロプシス・オキュラータに導入した形質転換体の作製、及び形質転換体による脂肪酸の生産
（１）ゼオシン耐性遺伝子発現用プラスミドの構築
　人工合成したゼオシン耐性遺伝子（配列番号２３）のＤＮＡ断片を鋳型として、表１に示すプライマー番号２４及びプライマー番号２５のプライマー対を用いてPCRを行い、ゼオシン耐性遺伝子配列を増幅した。
　また、実施例１で構築したネオマイシン耐性遺伝子発現用プラスミドを鋳型として、表１に示すプライマー番号９及びプライマー８のプライマー対を用いてPCRを行い、ヒートショックプロテインターミネーター配列、pUC19ベクター配列、チューブリンプロモーター配列からなる遺伝子断片を増幅した。
　得られた遺伝子断片を、実施例１と同様の方法で融合し、ゼオシン耐性遺伝子発現用プラスミドを構築した。
　なお、本プラスミドは、チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列の順に連結したインサート配列と、pUC19ベクター配列からなる。
（２）BTE遺伝子発現用プラスミドの構築
　国際公開第９２／２０２３６号公報に記載のBTEをコードする遺伝子配列（配列番号２６）を人工合成した。合成したＤＮＡ断片を鋳型として、表１に示すプライマー番号２７及びプライマー番号２８のプライマー対を用いてPCRを行い、BTE遺伝子断片を取得した。なお、このＤＮＡ断片では、BTE（配列番号２９）の葉緑体移行シグナル（Ｎ末端のアミノ酸８５残基）に相当する部分を欠損させた。
　また、GenBankに登録されているナンノクロロプシス・エスピーW2J3B株のVCP1遺伝子のcomplete　cds　配列（Accession　number:　JF957601.1）より、VCP1プロモーター配列（配列番号３０）、VCP1葉緑体移行シグナル配列（配列番号３１）、及びVCP1ターミネーター配列（配列番号１９）を人工合成した。合成したＤＮＡ断片を鋳型として、表１に示すプライマー番号３２及びプライマー３３のプライマー対、プライマー番号３４及びプライマー３５のプライマー対、並びにプライマー番号２０及びプライマー２１のプライマー対をそれぞれ用いたPCRを行い、VCP1プロモーター配列、VCP1葉緑体移行シグナル配列及びVCP1ターミネーター配列をそれぞれ取得した。
　また、前述のゼオシン耐性遺伝子発現用プラスミドを鋳型として、表１に示すプライマー番号２２及びプライマー１３のプライマー対を用いたPCRを行い、チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列及びpUC19ベクター配列からなる遺伝子断片を増幅した。
　上述の方法により得られた遺伝子断片を、実施例１と同様の方法で融合し、BTE遺伝子発現用プラスミドを構築した。
　なお、本プラスミドは、VCP1プロモーター配列、VCP1葉緑体移行シグナル配列、BTE遺伝子断片、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列の順に連結したインサート配列と、pUC19ベクター配列からなる。
（３）BTE遺伝子及びNoG3PDH遺伝子のナンノクロロプシス・オキュラータへの導入
　前記BTE遺伝子発現用プラスミドを鋳型として、表１に示すプライマー番号３２及びプライマー番号１０のプライマー対を用いてPCRを行い、BTE遺伝子発現用断片（VCP1プロモーター配列、VCP1葉緑体移行シグナル配列、BTE遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列からなるDNA断片）を増幅した。
　増幅した遺伝子断片を、High　Pure　PCR　Product　Purification　Kit（Roche　Applied　Science社製）を用いて精製した。なお、精製の際の溶出には、キットに含まれる溶出バッファーではなく、滅菌水を用いた。
　実施例１と同様の方法にてBTE遺伝子をナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株に導入し、ゼオシン含有f/2培地にて培養し、得られたコロニーをBTE遺伝子導入株（BTE）として選抜した。
　さらに、前記BTE遺伝子導入株を宿主として、実施例１と同様の方法にて、前記NoG3PDH遺伝子を導入した。得られたコロニーを、BTE遺伝子及びNoG3PDH遺伝子導入株（BTE+NoG3PDH）として選抜した。
（４）形質転換体による脂肪酸の生産
　選抜した株を、Ｎ１５Ｐ５培地50mLに播種し、25℃、0.3%CO2雰囲気下、12h/12h明暗条件にて4週間振盪培養し、前培養液とした。前培養液10mLを、Ｎ１５Ｐ５培地40mLに植継ぎ、25℃、0.3%CO2雰囲気下、12h/12h明暗条件にて振盪培養した。
　培養３週間後、培養液に含まれる脂質成分を、実施例１に記載の方法にて解析した。その結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
　表３に示すように、BTE遺伝子を導入した株にNoG3PDH遺伝子をさらに導入することで、ラウリン酸（Ｃ１２：０）及びミリスチン酸（Ｃ１４：０）の含有率が有意に増加し、総脂肪酸量が増加傾向にあることが確認された。
実施例３　NoTE改変体遺伝子及びNoG3PDH遺伝子をナンノクロロプシス・オキュラータに導入した形質転換体の作製、及び形質転換体による脂肪酸の生産
（１）NoTE遺伝子の取得、及びNoTE遺伝子発現用プラスミドの構築
　実施例１で作製したナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株のcDNAを鋳型として、表１に示すプライマー番号３６及びプライマー番号３７のプライマー対を用いたPCRにより、配列番号３９の２６２位～８６４位の塩基配列からなる遺伝子断片を取得した。
　また、プラスミドベクターpBluescriptII　SK(-)（Stratagene社製）を鋳型として、表１に示すプライマー番号４０及びプライマー番号４１のプライマー対を用いたPCRによりpBluescriptII　SK(-)を増幅し、制限酵素DpnI（東洋紡社製）処理により鋳型の消化を行った。
　これら２つの断片を、High　Pure　PCR　Product　Purification　Kit（Roche　Applied　Science社製）を用いて精製した後に、In-Fusion　HD　Cloning　Kit（Clontech社製）を用いて融合し、NoTE遺伝子発現プラスミドNoTE_262を構築した。このプラスミドNoTE_262は、配列番号３８に示すアミノ酸配列のＮ末端側１位～８７位のアミノ酸残基を除去し、その上流にプラスミドベクターpBluescriptII　SK(-)由来のLacZタンパク質のＮ末端側１位～２９位のアミノ酸残基が融合したタンパク質を発現させるように構築した。
　なお、以下のプラスミド表記において、「NoTE_262」は、配列番号３８の８８位～２８７位のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列として、配列番号３９の２６２位～８６４位の塩基配列をプラスミドが有することを意味する。
　前記プラスミドNoTE_262を鋳型として、表１に示すプライマー番号４２及びプライマー番号４３のプライマー対を用いたPCRにより、配列番号３９に示す塩基配列の２６２位～８６４位の塩基の一部を変異させた遺伝子断片（配列番号４４）を取得した。この遺伝子断片を用いて、前記手法と同様の手法により、NoTE改変体発現プラスミドNoTE_262(V204W)を構築した。ここで、配列番号４４に示す塩基配列は、配列番号３８に示すアミノ酸配列の２０４位のバリンをコードするコドンがトリプトファンをコードするコドン（TGG）に置換されている。
　前記プラスミドNoTE_262(V204W)を鋳型として、表１に示すプライマー番号４１及びプライマー番号４２のプライマー対を用いてPCRを行い、配列番号４４に示す塩基配列からなる、NoTE改変体遺伝子断片を取得した。
　実施例２と同様の方法により、VCP1プロモーター配列、VCP1葉緑体移行シグナル配列、及びVCP1ターミネーター配列をそれぞれ取得した。
　さらに、実施例１と同様の方法により、プラスミドベクターpUC19を増幅した。
　上述の方法により得られたNoTE改変体遺伝子断片、VCP1プロモーター配列、VCP1葉緑体移行シグナル配列、及びVCP1ターミネーター配列を、実施例１と同様の方法でプラスミドベクターpUC19に融合し、NoTE改変体遺伝子発現用プラスミドNoTE_262(V204W)_Nannoを構築した。なおこのプラスミドは、VCP1プロモーター配列、VCP1葉緑体移行シグナル配列、NoTE改変体遺伝子断片、及びVCP1ターミネーター配列の順に連結したNoTE遺伝子発現用配列と、pUC19ベクター配列からなる。
　前記プラスミドNoTE_262(V204W)_Nannoを鋳型に、表１に示すプライマー番号３２及びプライマー番号２１のプライマー対を用いてPCRを行い、VCP1プロモーター配列、VCP1葉緑体移行シグナル、NoTE改変体遺伝子、VCP1ターミネーター配列からなる遺伝子断片を取得した。
　また、実施例２で構築したゼオシン耐性遺伝子発現用プラスミドを鋳型に、表１に示すプライマー番号２２及びプライマー番号１３のプライマー対を用いてPCRを行い、チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列及びpUC19ベクター配列からなる遺伝子断片を増幅した。
　得られた遺伝子断片を、実施例１と同様の方法で融合し、NoTE改変体遺伝子発現用プラスミドを構築した。
　なお、本プラスミドは、VCP1プロモーター配列、VCP1葉緑体移行シグナル配列、NoTE改変体遺伝子断片、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列の順に連結したインサート配列と、pUC19ベクター配列からなる。
（３）NoTE改変体遺伝子及びNoG3PDH遺伝子のナンノクロロプシス・オキュラータへの導入
　前記NoTE改変体遺伝子発現用プラスミドを鋳型として、表１に示すプライマー番号３２及びプライマー番号１０のプライマー対を用いてPCRを行い、NoTE改変体遺伝子発現用断片（VCP1プロモーター配列、VCP1葉緑体移行シグナル配列、NoTE改変体遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列からなるDNA断片）を増幅した。
　増幅した遺伝子断片を、High　Pure　PCR　Product　Purification　Kit（Roche　Applied　Science社製）を用いて精製した。なお、精製の際の溶出には、キットに含まれる溶出バッファーではなく、滅菌水を用いた。
　実施例１と同様の方法にてNoTE改変体遺伝子をナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株に導入し、ゼオシン含有f/2培地にて培養し、得られたコロニーをNoTE改変体遺伝子導入株（NoTE）として選抜した。
　さらに、前記NoTE改変体遺伝子導入株を宿主として、実施例１と同様の方法にて、前記NoG3PDH遺伝子を導入した。得られたコロニーを、NoTE改変対遺伝子及びNoG3PDH遺伝子導入株（NoTE+NoG3PDH）として選抜した。
（４）形質転換体による脂肪酸の生産
　選抜した株を、Ｎ１５Ｐ５培地50mLに播種し、25℃、0.3%CO2雰囲気下、12h/12h明暗条件にて4週間振盪培養し、前培養液とした。前培養液10mLを、Ｎ１５Ｐ５培地40mLに植継ぎ、25℃、0.3%CO2雰囲気下、12h/12h明暗条件にて振盪培養した。
　培養３週間後、培養液に含まれる脂質成分を、実施例１に記載の方法にて解析した。その結果を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
　表４に示すように、NoTE改変体遺伝子を導入した株にNoG3PDH遺伝子をさらに導入することで、ラウリン酸（Ｃ１２：０）及びミリスチン酸（Ｃ１４：０）の含有率が有意に増加し、総脂肪酸量が増加傾向にあることが確認された。
実施例４　BTE遺伝子、NoKASIV遺伝子及びNoG3PDH遺伝子をナンノクロロプシス・オキュラータに導入した形質転換体の作製、及び形質転換体による脂肪酸の生産
（１）パロモマイシン耐性遺伝子発現用プラスミドの構築
　人工合成したパロモマイシン耐性遺伝子（配列番号４５）のＤＮＡ断片を鋳型として、表１に示すプライマー番号４６及びプライマー番号４７のプライマー対を用いてPCRを行い、パロモマイシン耐性遺伝子を増幅した。
　また、実施例１にて構築したネオマイシン耐性遺伝子プラスミドを鋳型として、表１に示すプライマー番号９及びプライマー８のプライマー対を用いてPCRを行い、ヒートショックプロテインターミネーター配列、pUC19ベクター配列、チューブリンプロモーター配列からなる遺伝子断片を増幅した。
　得られた遺伝子断片を、実施例１と同様の方法で融合し、パロモマイシン耐性遺伝子発現用プラスミドを構築した。
　なお、本プラスミドは、チューブリンプロモーター配列、パロモマイシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列の順に連結したインサート配列と、pUC19ベクター配列からなる。
（２）NoKASIV遺伝子の取得、及びNoKASIV遺伝子発現用プラスミドの構築
　実施例１で作製したナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株のcDNAを鋳型として、表１に示すプライマー番号５０及びプライマー番号５１のプライマー対を用いたPCRを行い、配列番号４９に示すNoKASIV遺伝子断片を取得した。
　次に、Randor　Radakovits，et　al.，Nature　Communications，DOI:10.1038/　ncomms1688，2012、に記載のナンノクロロプシス・ガディタナCCMP526株由来ユビキチンプロモーター配列（配列番号５２）を人工合成した。合成したＤＮＡ断片を鋳型として、表１に示すプライマー番号５３及びプライマー番号５４のプライマー対を用いたPCRを行い、ユビキチンプロモーターのＤＮＡ断片を取得した。
　さらに、前述の方法により人工合成したVCP1ターミネーター配列のＤＮＡ断片を鋳型として、表１に示すプライマー番号２０及びプライマー番号２１のプライマー対を用いたPCRを行い、VCP1ターミネーター配列を取得した。
　また、前記パロモマイシン耐性遺伝子発現用プラスミドを鋳型として、表１に示すプライマー番号２２及びプライマー番号１３のプライマー対を用いてPCRを行い、チューブリンプロモーター配列、パロモマイシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列及びpUC19ベクター配列からなる遺伝子断片を増幅した。
　得られた４つの遺伝子断片を、実施例１と同様の方法で融合し、NoKASIV遺伝子発現用プラスミドを構築した。
　なお、本プラスミドは、ユビキチンプロモーター配列、NoKASIV遺伝子断片、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、パロモマイシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列の順に連結したインサート配列と、pUC19ベクター配列からなる。
（３）BTE遺伝子、NoKASIV遺伝子及びNoG3PDH遺伝子のナンノクロロプシス・オキュラータへの導入
　前記NoKASIV遺伝子発現用プラスミドを鋳型として、表１に示すプライマー番号５３及びプライマー番号１０のプライマー対を用いてPCRを行い、NoKASIV遺伝子発現用断片（ユビキチンプロモーター配列、NoKASIV遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、パロモマイシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列からなるDNA断片）を増幅した。
　増幅した遺伝子断片を、High　Pure　PCR　Product　Purification　Kit（Roche　Applied　Science社製）を用いて精製した。なお、精製の際の溶出には、キットに含まれる溶出バッファーではなく、滅菌水を用いた。
　実施例２で作製したBTE遺伝子導入株（BTE）を宿主として、実施例１と同様の方法にて、前記NoKASIV遺伝子を導入し、パロモマイシン含有f/2培地にて培養し、得られたコロニーをBTE遺伝子及びNoKASIV遺伝子導入株（BTE+NoKASIV）として選抜した。
　さらに、前記BTE遺伝子及びNoKASIV遺伝子導入株（BTE+NoKASIV）を宿主として、実施例１と同様の方法にてNoG3PDH遺伝子を導入し、ネオマイシン含有f/2培地にて培養し、得られたコロニーを、BTE遺伝子、NoKASIV遺伝子及びNoG3PDH遺伝子導入株（BTE+NoKASIV+NoG3PDH）として選抜した。
（４）形質転換体による脂肪酸の生産
　選抜した株を、Ｎ１５Ｐ５培地50mLに播種し、25℃、0.3%CO2雰囲気下、12h/12h明暗条件にて4週間振盪培養し、前培養液とした。前培養液10mLを、Ｎ１５Ｐ５培地40mLに植継ぎ、25℃、0.3%CO2雰囲気下、12h/12h明暗条件にて振盪培養した。
　培養３週間後、培養液に含まれる脂質成分を、実施例１に記載の方法にて解析した。その結果を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000005
　表５に示すように、BTE遺伝子及びNoKASIV遺伝子を導入した株にNoG3PDH遺伝子をさらに導入することで、ラウリン酸（Ｃ１２：０）及びミリスチン酸（Ｃ１４：０）の含有率と、総脂肪酸量が有意に増加した。
（５）TAGの分画、及びTAG中の構成脂肪酸の分析
　前述の培養液1mLに内部標準として1mg/mLのトリヘプタデカン（シグマアルドリッチ社製）５０μLを添加後、クロロホルム0.5mL、及びメタノール1mLを添加して激しく攪拌し、10分間放置した。その後さらに、クロロホルム0.5mL及び1.5%KCl　0.5mLを添加して攪拌し、3,000rpmにて5分間間遠心分離を行い、パスツールピペットにてクロロホルム層（下層）を回収した。得られたクロロホルム層に窒素ガスを吹き付けて乾固し、クロロホルム20μLに溶解した。
　このようにして得られた脂質抽出液全量、及び３種類の標準溶液｛トリミリスチン（和光純薬工業社製）、ジオレイン酸グリセロール（和光純薬工業社製）、オレイン酸（和光純薬工業社製）、10mg/mLクロロホルム溶液｝3μLをそれぞれTLCプレートシリカゲル60F254（メルク社製）上にスポットし、TLC展開槽DT-150（三菱化学メディエンス社製）を用い、展開溶媒（ヘキサン:ジエチルエーテル:ギ酸＝42：28：0.3（体積比））で約15分展開した。展開後プレートを乾燥させ、メタノールに溶解させた0.1%プリムリン（和光純薬工業社製）を噴霧して乾燥させた後、ハンデイ型UVランプUVL-21（相互理化学硝子製作所社製）でTAG画分を検出した。
　爪楊枝を用いてTAG画分を掻き取り、14%三フッ化ホウ素－メタノール溶液（SIGMA社製）1mLを添加し、80℃にて10分間恒温した。その後、ヘキサン0.5mL、飽和食塩水1mLを添加し激しく撹拌し、室温にて10分間放置後、上層であるヘキサン層を回収して脂肪酸メチルエステルを得た。
　前述の方法と同様の方法にて、得られた脂肪酸メチルエステルをガスクロマトグラフィー解析に供した。その結果を表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000006
　表６から明らかなように、BTE遺伝子及びNoKASIV遺伝子を導入した株にNoG3PDH遺伝子をさらに導入することで、TAG中の中鎖脂肪酸（ラウリン酸（Ｃ１２：０）及びミリスチン酸（Ｃ１４：０））の含有率と、TAGの総量が有意に増加した。
　以上のように、本発明で規定するG3PDH遺伝子の発現を促進させることで、中鎖脂肪酸の生産性及び生産される全脂肪酸の生産性を向上させた形質転換体を作製することができる。そしてこの形質転換体を培養することで、中鎖脂肪酸の生産性及び生産される脂肪酸の総量を向上させることができる。
比較例　酵母由来G3PDH遺伝子をナンノクロロプシス・オキュラータに導入した形質転換体の作製、及び形質転換体による脂肪酸の生産
（１）酵母由来G3PDH遺伝子発現用プラスミドの構築
　米国特許出願公開第２００６／０１６８６８４号明細書記載の酵母（Saccharomyces　cerevisiae）由来G3PDH遺伝子（以下、「YG3PDH遺伝子」ともいう）（配列番号５５）を人工合成した。合成したDNA断片を鋳型として、表１に示すプライマー番号５６及びプライマー番号５７のプライマー対を用いてPCRを行い、酵母G3PDH遺伝子断片を増幅した。
　また、実施例１で構築したNoG3PDH遺伝子発現用プラスミドを鋳型として、表１に示すプライマー番号２０及びプライマー番号１７のプライマー対を用いてPCRを行い、LDSPプロモーター、VCP1ターミネーター、チューブリンプロモーター配列、ネオマイシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列及びpUC19ベクター配列からなる遺伝子断片を増幅した。
　上述の方法により得られた遺伝子断片を、実施例１と同様の方法で融合し、YG3PDH発現用プラスミドを構築した。
　なお、本プラスミドは、LDSPプロモーター配列、YG3PDH遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ネオマイシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列の順に連結したインサート配列と、pUC19ベクター配列からなる。
（２）BTE遺伝子及び酵母G3PDH遺伝子のナンノクロロプシス・オキュラータへの導入
　前記YG3PDH遺伝子発現用プラスミドを鋳型として、表１に示すプライマー番号１６及びプライマー番号１０のプライマー対を用いてPCRを行い、YG3PDH遺伝子発現用断片（LDSPプロモーター配列、YG3PDH遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ネオマイシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列からなるDNA断片）を増幅した。
　増幅した遺伝子断片を、High　Pure　PCR　Product　Purification　Kit（Roche　Applied　Science社製）を用いて精製した。なお、精製の際の溶出には、キットに含まれる溶出バッファーではなく、滅菌水を用いた。
　実施例２で作製したBTE遺伝子導入株（BTE）を宿主として、実施例１と同様の方法にて、前記YG3PDH遺伝子を導入し、ネオマイシン含有f/2培地にて培養し、得られたコロニーをBTE遺伝子及び酵母G3PDH遺伝子導入株（BTE+YG3PDH）として選抜した。
（３）形質転換体による脂肪酸の生産
　選抜した株を、Ｎ１５Ｐ５培地50mLに播種し、25℃、0.3%CO2雰囲気下、12h/12h明暗条件にて4週間振盪培養し、前培養液とした。前培養液10mLを、Ｎ１５Ｐ５培地40mLに植継ぎ、25℃、0.3%CO2雰囲気下、12h/12h明暗条件にて振盪培養した。
　培養３週間後、培養液に含まれる脂質成分を、実施例１に記載の方法にて解析した。その結果を表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000007
　表７から明らかなように、本発明とは異なり、YG3PDH遺伝子を導入した場合、中鎖脂肪酸含有量は低下し、油脂量の増加も確認されなかった。
　なお、NoG3PDHのアミノ酸配列に対する、YG3PDHのアミノ酸配列の同一性を遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Winのホモロジー解析（Search　homology）プログラムにより計算した。その結果、相同性は２７％であった。
　本発明をその実施態様とともに説明したが、我々は特に指定しない限り我々の発明を説明のどの細部においても限定しようとするものではなく、添付の請求の範囲に示した発明の精神と範囲に反することなく幅広く解釈されるべきであると考える。
　本願は、2015年9月11日に日本国で特許出願された特願2015-179166に基づく優先権を主張するものであり、これはここに参照してその内容を本明細書の記載の一部として取り込む。

Claims (34)

  1. 　下記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子の発現を促進させ、形質転換体の細胞内で生産される中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させる、脂質生産性の向上方法。
    （Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が６４％以上のアミノ酸配列からなり、かつグリセロール3-リン酸脱水素酵素活性を有するタンパク質。
  2. 　下記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子の発現を促進させ、形質転換体の細胞内で生産される脂肪酸の総量を向上させる、脂質生産性の向上方法。
    （Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が６４％以上のアミノ酸配列からなり、かつグリセロール3-リン酸脱水素酵素活性を有するタンパク質。
  3. 　下記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子の発現を促進させて、形質転換体の細胞内で生産される中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させ、生産される全脂肪酸又は全脂質中の脂肪酸又は脂質の組成を改変する、脂質の組成の改変方法。
    （Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が６４％以上のアミノ酸配列からなり、かつグリセロール3-リン酸脱水素酵素活性を有するタンパク質。
  4. 　前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子を宿主に導入して前記遺伝子の発現を促進させる、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　下記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子を宿主に導入して形質転換体を作製し、形質転換体の細胞内で生産される中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させる、脂質生産性の向上方法。
    （Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が６４％以上のアミノ酸配列からなり、かつグリセロール3-リン酸脱水素酵素活性を有するタンパク質。
  6. 　下記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子を宿主に導入して形質転換体を作製し、形質転換体の細胞内で生産される脂肪酸の総量を向上させる、脂質生産性の向上方法。
    （Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が６４％以上のアミノ酸配列からなり、かつグリセロール3-リン酸脱水素酵素活性を有するタンパク質。
  7. 　下記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子を導入して形質転換体を作製し、形質転換体の細胞内で生産される中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させ、生産される全脂肪酸中又は全脂質中の脂肪酸又は脂質の組成を改変する、脂質の組成の改変方法。
    （Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が６４％以上のアミノ酸配列からなり、かつグリセロール3-リン酸脱水素酵素活性を有するタンパク質。
  8. 　前記タンパク質（Ｂ）が、前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列に１個以上１６７個以下のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたタンパク質である、請求項１～７のいずれか１項記載の方法。
  9. 　前記タンパク質（Ｂ）が、前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなり、かつグリセロール3-リン酸脱水素酵素活性を有する、請求項１～８のいずれか１項記載の方法
  10. 　前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子が、下記ＤＮＡ（ａ）又は（ｂ）からなる遺伝子である、請求項１～９のいずれか１項記載の方法。
    （ａ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
    （ｂ）前記ＤＮＡ（ａ）の塩基配列と同一性が５９％以上の塩基配列からなり、かつグリセロール3-リン酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
  11. 　前記ＤＮＡ（ｂ）が、前記ＤＮＡ（ａ）の塩基配列に１個以上５７３個以下の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加された塩基配列からなり、かつグリセロール3-リン酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は前記ＤＮＡ（ａ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグリセロール3-リン酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである、請求項１０記載の方法。
  12. 　前記形質転換体において、アシル-ACPチオエステラーゼをコードする遺伝子の発現を促進させた、請求項１～１１のいずれか１項記載の方法。
  13. 　前記アシル-ACPチオエステラーゼが、中鎖アシル-ACPに対する基質特異性を有するアシル-ACPチオエステラーゼである、請求項１２記載の方法。
  14. 　前記アシル-ACPチオエステラーゼが、配列番号２９、配列番号３８、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３若しくは配列番号６５に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、当該タンパク質のアミノ酸配列との同一性が５０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ中鎖アシル-ACPに対するアシル-ACPチオエステラーゼ活性を有するタンパク質、又は、当該タンパク質のアミノ酸配列に１個以上１４９個以下のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加され、かつ中鎖アシル-ACPに対するアシル-ACPチオエステラーゼ活性を有するタンパク質である、請求項１２又は１３記載の方法。
  15. 　前記形質転換体において、β-ケトアシル-ACPシンターゼをコードする遺伝子の発現を促進させた、請求項１～１４のいずれか１項記載の方法。
  16. 　前記β-ケトアシル-ACPシンターゼが、中鎖β-ケトアシル-ACP合成活性を有するβ-ケトアシル-ACPシンターゼである、請求項１５記載の方法。
  17. 　前記β-ケトアシル-ACPシンターゼが、配列番号４８、配列番号７５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７７、配列番号７９若しくは配列番号８１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、当該タンパク質のアミノ酸配列との同一性が５０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ中鎖β-ケトアシル-ACP合成活性を有するタンパク質、又は、当該タンパク質のアミノ酸配列に１個以上２５５個以下のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加され、かつ中鎖β-ケトアシル-ACP合成活性を有するタンパク質、である、請求項１５又は１６記載の方法。
  18. 　前記形質転換体が微生物である、請求項１～１７のいずれか１項記載の方法。
  19. 　前記微生物が微細藻類である、請求項１８記載の方法。
  20. 　前記微細藻類がナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属に属する藻類である、請求項１９記載の方法。
  21. 　前記脂質が中鎖脂肪酸又はそのエステル化合物、好ましくは炭素原子数が６以上１４以下の脂肪酸又はそのエステル化合物、を含む、請求項１～２０のいずれか１項記載の方法。
  22. 　下記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子の発現を促進させ、形質転換体の細胞内で生産される、中鎖脂肪酸若しくはこれを構成成分とする脂質の生産性、並びに脂肪酸の総量の少なくともいずれか一方を向上させた形質転換体。
    （Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなり、かつグリセロール3-リン酸脱水素酵素活性を有するタンパク質。
  23. 　下記ＤＮＡ（ａ）又は（ｂ）からなる遺伝子の発現を促進させ、形質転換体の細胞内で生産される、中鎖脂肪酸若しくはこれを構成成分とする脂質の生産性、並びに脂肪酸の総量の少なくともいずれか一方を向上させた形質転換体。
    （ａ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
    （ｂ）前記ＤＮＡ（ａ）の塩基配列と同一性が８０％以上の塩基配列からなり、かつグリセロール3-リン酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
  24. 　アシル-ACPチオエステラーゼをコードする遺伝子の発現を促進させた、請求項２２又は２３記載の形質転換体。
  25. 　前記アシル-ACPチオエステラーゼが、中鎖アシル-ACPに対する基質特異性を有するアシル-ACPチオエステラーゼである、請求項２４記載の形質転換体。
  26. 　前記アシル-ACPチオエステラーゼが、配列番号２９、配列番号３８、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３若しくは配列番号６５に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、当該タンパク質のアミノ酸配列との同一性が５０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ中鎖アシル-ACPに対するアシル-ACPチオエステラーゼ活性を有するタンパク質、又は、当該タンパク質のアミノ酸配列に１個以上１４９個以下のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加され、かつ中鎖アシル-ACPに対するアシル-ACPチオエステラーゼ活性を有するタンパク質である、請求項２４又は２５項記載の形質転換体。
  27. 　β-ケトアシル-ACPシンターゼをコードする遺伝子の発現を促進させた、請求項２２～２６のいずれか１項記載の形質転換体。
  28. 　前記β-ケトアシル-ACPシンターゼが、中鎖β-ケトアシル-ACP合成活性を有するβ-ケトアシル-ACPシンターゼである、請求項２７記載の形質転換体。
  29. 　前記β-ケトアシル-ACPシンターゼが、配列番号４８、配列番号７５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７７、配列番号７９若しくは配列番号８１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、当該タンパク質のアミノ酸配列との同一性が５０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ中鎖β-ケトアシル-ACP合成活性を有するタンパク質、又は、当該タンパク質のアミノ酸配列に１個以上２５５個以下のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加され、かつ中鎖β-ケトアシル-ACP合成活性を有するタンパク質、である、請求項２７又は２８記載の形質転換体。
  30. 　前記形質転換体が微生物である、請求項２２～２９のいずれか１項記載の形質転換体。
  31. 　前記微生物が微細藻類である、請求項３０記載の形質転換体。
  32. 　前記微細藻類がナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属に属する藻類である、請求項３１記載の形質転換体。
  33. 　脂質を製造するための、請求項２２～３２のいずれか１項記載の形質転換体の使用。
  34. 　前記脂質が、中鎖脂肪酸又はそのエステル化合物、好ましくは炭素原子数が６以上１４以下の脂肪酸又はそのエステル化合物、を含む、請求項３３記載の使用。
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