WO2017041152A1

WO2017041152A1 - Gel de plaquetas enriquecido com sulfadiazina de prata e sulfato de zinco

Info

Publication number: WO2017041152A1
Application number: PCT/BR2016/050208
Authority: WO
Inventors: Rosana Rossi FERREIRA; Elenice DEFFUNE; Ari Tiago Faustino De SOUSA; Helga Caputo NUNES; Henrique De Souza VIEIRA; Ana Carolina Picolo PASIAN
Original assignee: Universidade Estadual Paulista Julio De Mesquita Filho
Priority date: 2015-09-11
Filing date: 2016-08-19
Publication date: 2017-03-16
Also published as: BR102015022689A2

Abstract

A presente invenção se refere a um gel de plaquetas enriquecido com sulfadiazina de prata e sulfato de zinco para uso externo.

Description

GEL DE PLAQUE TAS ENRIQUECIDO COM SULFADIAZ INA DE PRATA E

SULFATO DE Z INCO CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção se insere no campo da

Medicina, mais especificamente nas áreas da Dermatologia, Angiologia e Medicina Vascular, e da Farmacologia, e descreve um gel de plaquetas enriquecido com sulfadiazina de prata e sulfato de zinco para uso externo.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[002] A pele é formada por três camadas bem unidas, a epiderme, a derme e a hipoderme. Todas são importantes para o corpo, e cada uma tem características e funções diferentes. A epiderme é composta por um epitélio estratificado, enquanto que a derme é um tecido conjuntivo responsável pela sustentação da epiderme, além de promover a união da pele à hipoderme ao tecido celular subcutâneo. Já a hipoderme é formada basicamente por tecido adiposo.

[003] Um acidente causando uma lesão de pele de menor ou maior intensidade pode ocasionar um dano grave para o paciente. Existem algumas complicações que podem ocorrer no reparo da pele, em situações nas quais a cicatrização de feridas localizadas nos membros é inviabilizada pela pouca elasticidade da pele, escassez de tecidos locais ou a associação frequente de lesões ortopédicas com perda cutânea.

[004] O processo de cicatrização de lesões na pele compreende fases interdependentes e simultâneas, que são descritas em fase dinâmicas e sobrepostas entre si. Essas fases são chamadas de inflamatória, proliferativa e de remodelação. Esse processo tem início no momento da lesão, onde ocorrem estímulos para deposição, ativação e recrutamento de plaquetas, responsáveis pela formação do trombo, impedindo a perda de sangue. Quando essas plaquetas são ativadas pela trombina contida no plasma, liberam através de seus grânulos vários mediadores inflamatórios como ADP (Adenosina difosfato) , fibronectina e fibrinogênio, cu a função é de agregação celular. Liberam também fatores de crescimento (TGF β - Fator de Crescimento Transformador e PDGF - Fator de Crescimento Derivado de Plaquetas), orientando a chegada de células vindas da circulação e regiões adjacentes que vão promover a resposta inflamatória (primeira fase do processo de cicatrização) . Conclui-se então que o conteúdo das plaquetas (ADP, fibronectina, fibrinogênio, vários fatores de crescimento) consiste no gatilho para iniciar o processo de cicatrização .

[005] No Brasil, as feridas decorrentes das doenças crônico-degenerativas constituem um sério problema de saúde pública devido ao grande número de doentes com alterações na integridade da pele. O elevado número de pessoas com úlceras contribui para onerar o gasto público, além de interferir na qualidade de vida da população. Elas são impactantes do ponto de vista de saúde pública sendo consideradas como doenças negligenciáveis atingindo preferencialmente mulheres de faixa etária entre 55-90 anos. Os fatores determinantes das feridas crónicas são multicausais , no entanto, o aumento da longevidade acarreta o maior número de comorbidades como a hipertensão arterial, diabetes mellitus, insuficiência venosa, diminuição da mobilidade física. Em resumo, seja qual for a causa, toda a dinâmica de reparação tecidual fica comprometida no caso das feridas crónicas. A tentativa de reparo é lenta, insuficiente, com produtos celulares desvitalizados, o que gera uma ausência de reepitelização .

Sulfadiazina de prata

[006] A sulfadiazina de prata é um pó branco, inodoro que se torna amarelo em exposição à luz, tem ampla atividade antimicrobiana contra as bactérias Gram-positivas e Gram-negativas , incluindo Pseudomonas aeruginosa, e algumas leveduras e fungos. Também inibe o crescimento in vitro de quase todas as bactérias e fungos patogênicos, incluindo algumas espécies resistentes às sulfonamidas . Os cátions de Prata (Ag⁺) apresentam potente efeito antimicrobiano por meio do bloqueio imediato da cadeia respiratória e destruição da membrana celular e parede bacteriana. O creme com sulfadiazina de prata (1%) é eficaz para a prevenção de infecções em pessoas com queimaduras graves e no final do século 20, o nitrato de prata 1% foi introduzido como colírio nos recém-nascidos para diminuição de infecção pós-parto.

[007] Nas duas últimas décadas, com advento e desenvolvimento da nanotecnologia, novas formulações de prata surgem como opção terapêutica e vem sendo muito utilizada em queimaduras e cirurgia vascular no Brasil. Análises de resultados morfológicos permite inferir que o grupo da Sulfadiazina de Prata, barbatimão e ipê-roxo favoreceram o processo de cicatrização das feridas cutâneas sob hipertensão venosa, quando comparados com o controle (COELHO, et al . 2010) .

Sulfato de zinco [008] As propriedades medicinais do zinco na forma de calamina foram documentadas há cerca de 300 anos atrás nos antigos manuscritos Ayurvedicos. O zinco, como sulfato ou óxido, também é usado como antisséptico tópico. Seu efeito é fraco e se relaciona principalmente com a sua propriedade adstringente, isto é, sua capacidade de precipitar proteínas. O zinco é um micronutriente essencial à homeostase humana e atua como cofator na atividade funcional de 300 enzimas diferentes, inclusive algumas envolvidas na síntese de RNA e DNA. É uma ortomolécula constituinte de diversas enzimas e parte inerente da insulina, atua no metabolismo e na cicatrização. Na sua deficiência a reparação tecidual encontra-se prejudicada, com diminuição da formação de tecido conjuntivo.

Gel de plaquetas

[009] O termo gel de plaquetas é aplicado a um produto cuja forma farmacêutica é um emulgel. O constituinte-chave é o concentrado de plaquetas (CP) colhido e validado como hemocomponente de uso intravenoso, respeitando desta forma, todos os quesitos legais explicitados na RDC 34 de 11 de junho de 2014. Por questões de segurança biológica, são otimizados para o protocolo de produção de gel de plaquetas, os produtos oriundos de doadores fidelizados no serviço. A matriz do gel é capaz de reter as substâncias bioativas produzidas a partir do aglomerado plaquetário, e essas substâncias são liberadas em contato com a lesão.

[010] Assim, desde que o gel de Plaquetas home made foi desenvolvido, suas propriedades químicas, organolépticas , farmacológicas, vida de prateleira e análise do potencial imunogênico vem sendo estudadas.

ESTADO DA TÉCNICA

[011] O documento CN1814280 (A) revela um gel de plaquetas sanguíneas humanas recombinantes derivadas do fator de crescimento. Ao adaptar o método de dispensação de gel de filtragem, faz com que o fator de crescimento de plaquetas sanguíneas derivadas do fator de crescimento se torne em gel, podendo ser diretamente revestido sobre a seção da ferida de úlcera neuropática diabética dos membros inferiores .

[012] O documento JPH11246420 (A) proporciona um acelerador de cura de feridas utilizando plaquetas de sangue dentro de uma matriz (por exemplo, gel de colágeno) . Tal acelerador contém citocina, fator de crescimento celular (por exemplo, fato de crescimento de fibroblasto básico) ou um agente aglutinante.

[013] O documento JPH0597706 propõe tratar uma úlcera aftosa dermatose ou mucosa, fazendo com que sítio afetado entre em contato com um agente de tratamento que contém uma quantidade eficaz de um composto que possui propriedades bioquímicas/biológicas selecionadas a partir do grupo que consiste de (A) um agente de liberação/mediação, (B) um inibidor da 5-lipoxigenase, (C) um antagonista do leucotrieno, e (D) um antagonista do fator de ativação de plaquetas. O referido composto é aplicado sob a forma de, por exemplo, colar, solução, gel, comprimido de desintegração rápida, antisséptico bucal, pomada, creme, pó, remendo adesivo, spray aerossol, pastilha, troche, dentifrício, lenço dental.

[014] O documento CN101264130 (A) descreve um agente de revestimento para tratar úlcera na pele com o intuito de resolver os problemas de baixo efeito antálgico e permeabilidade a ar do estado da técnica. Tal agente tem a vantagem de inibir agregação plaquetária, dilatando microvasos de úlcera parcial, prevenindo micro trombos de serem formados e de antagonizar a formação de mediadores inflamatórios, melhorando consideravelmente o fornecimento de sangue parcial da úlcera, reduzindo o valor de pH da superfície da úlcera, promovendo ambiente ácido e facilitando a reparação da úlcera e, obviamente, encurtando o tempo de cura da mesma.

[015] O documento US2011086008 (Al) refere-se a um novo método para a reparação de tecidos humanos ou animais, tais como a cartilagem, meniscos, ligamento, tendão, osso, pele, córnea, tecidos periodontais , abcessos, tumores ressecados, e úlceras. O método compreende a etapa de introduzir no tecido uma composição de polímero gel dependente da temperatura, de tal modo que a composição adere ao tecido e promove a proliferação das células de apoio para a reparação dos tecidos.

[016] O artigo intitulado "Sangue bom" diz respeito ao desenvolvimento de nova linha de biocurativos à base de plasma e plaquetas que são capazes de tratar em meses feridas que incomodavam pacientes há anos. Uma das diferenças entre os produtos tradicionais e os biocurativos é a cicatriz, que no primeiro caso tem coloração diferente e é mais rígida, podendo romper, enquanto que a gerada pelos biocurativos é flexível e sem diferença de cor.

[017] O documento intitulado "Terapia tópica de úlceras crónicas de perna com plasma rico em plaquetas - PRP" faz um estudo sobre a utilização do plasma rico em plaquetas (PRP) no tratamento tópico de feridas, visando favorecer um processo de cicatrização eficaz, rápido e seguro .

[018] Diante dos documentos mostrados acima, percebe-se que nenhum deles descreve uma composição ou processo semelhante à presente invenção, nem tampouco mencionam a utilização de sulfato de zinco e sulfadiazina de prata em suas formulações.

BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[019] O objetivo da presente invenção é estudar a incorporação dos ativos sulfadiazina de Prata Micronizada e Sulfato de Zinco Heptahidratado em gel de plaquetas para uso externo e, desta forma propõe um gel de plaquetas enriquecido com sulfadiazina de prata e sulfato de zinco para uso externo.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[020] A FIG. 1 mostra os Halos de inibição do gel de plaquetas com diferentes concentrações de sulfadiazina de prata e Staphylococcus aureus, sendo A para a amostra 1, B para a amostra 2 e C para a amostra 3;

[021] A FIG. 2 mostra os halos de inibição do gel de plaquetas com diferentes concentrações de sulfadiazina de prata e Escherichia coli _r sendo A para a amostra 1, B para a amostra 2 e C para a amostra 3;

[022] A FIG. 3 mostra os halos de inibição do gel de plaquetas com diferentes concentrações de sulfadiazina de prata e Pseudomonas aerogionosa , sendo A para a amostra 1, B para a amostra 2 e C para a amostra 3;

[023] A FIG. 4 mostra o gráfico gel de plaquetas 30 dias com sulfato de zinco heptahidratado X densidade;

[024] A FIG. 5 mostra o gráfico gel de plaquetas

30 dias com sulfato de zinco heptahidratado X pH;

[025] A FIG. 6 mostra o gráfico gel de plaquetas

30 dias com sulfato de zinco heptahidratado X comportamento reológico ;

[026] A FIG. 7 mostra o gráfico gel de Plaquetas

30 dias com sulfadiazina de prata X densidade;

[027] A FIG. 8 mostra o gráfico gel de plaquetas

30 dias com sulfadiazina de prata X pH;

[028] A FIG. 9 mostra o gráfico gel de plaquetas

30 dias com sulfadiazina de prata X comportamento reológico ;

[029] A FIG. 10 mostra o gráfico gel de plaquetas

60 dias com sulfadiazina de prata X densidade;

[030] A FIG. 11 mostra o gráfico gel de plaquetas

60 dias com sulfadiazina de prata X pH;

[031] A FIG. 12 mostra o gráfico gel de plaquetas

60 dias com sulfadiazina de prata X comportamento reológico .

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[032] A presente invenção refere-se a um gel de plaquetas enriquecido com sulfadiazina de prata e sulfato de zinco para uso externo.

[033] Para a preparação do gel de plaquetas são necessárias as etapas prévias:

Qualificação do Concentrado de Plaquetas (CP)

Após o 5^o dia de vida de prateleira, as unidades (bolsas) de concentrado de plaquetas, que podem ser coletadas tanto por coleta standard ou por coleta de aféresis, são colocadas sob agitação em agitador apropriado, onde uma a uma das unidades é verificado a presença de swirling, que consiste em elevar a bolsa de CP ao alto e contra luz e fazer movimentos delicados de vaivém, até que uma onda {swirling) possa ser vista se deslocando de um lado para outro. Caso esta onda não seja evidenciada, deve-se injetar lmL de vitamina C com uma seringa dentro da bolsa, sem abrir o sistema fechado da mesma. Se após a nova verificação o swirling continuar negativo, o hemocomponente de ser descartado. A presença do swirling evidencia a integridade e a atividade das plaquetas ;

Verificar o pH do CP com fita apropriada, devendo o mesmo ficar entre 6,4 e 7,4;

Identificar 12 unidades de CP standard ou 02 aféresis do mesmo grupo ABO;

Confeccionar um pool de CPs . As unidades de CP devem ser colocadas dentro da capela de fluxo laminar, e o opérculo de todas as bolsas higienizado. Após cortar as bolsas com tesoura estéril, os CPs, um a um são transferidos para um frasco estéril. O manuseio das unidades de CP dentro da capela de fluxo laminar impede a contaminação do hemocomponente que estava armazenado em sistema fechado;

Coletar uma aliquota de 1 mL do pool com seringa e agulha estéril e injetar no frasco de hemocultura para realização de testes microbiológicos para verificar a presença de microrganismos aeróbios, anaeróbios e fungos;

Coletar 1 mL do pool para dosagem de PDGF e VEGF e contagem de plaquetas (plaquetometria) ; Armazenar o frasco (pool) em freezer a -80 °C.

[034] A matéria-prima só será considerada qualificada quando os resultados das hemoculturas forem negativos .

Preparação do Gel Base

[035] Foram utilizados 82 mL de água para injeção,

0,8 g de Carbopol 940, 5 mL óleo de amêndoas, 5 mL de propilenoglicol , 1 mL de NaOH 50%, 0,15 g de Nipagin, quantidades estas necessárias para preparar 100 g da composição de Gel Base.

[036] Primeiramente deve-se bater em uma batedeira a água com o Carbopol, pulverizando até sumir os grumos;

[037] À parte, misturar propilenoglicol 5% com

Nipagin 0,15% e aquecer em banho-maria a 50 °C para a completa dissolução do Nipagin no propilenoglicol;

[038] Incorporar essa mistura na batedeira e colocar o óleo de amêndoas. Nesta fase o pH deverá estar em torno de 3,0 - 4,0;

[039] Adicionar 1 mL de solução de NaOH a 50%.

Isso fará o pH ficar entre 5,5 a 6,0;

[040] O resultado desta mistura é um creme uniforme, de coloração branca (emulgel), de fácil espalhamento e absorção pela pele.

Produção de Trombina Humana

Utilizar Plasma Frasco Congelado (PFC) , também considerado um hemocomponente, recém-produzido (últimos 90 dias) a partir da doação de sangue e armazenado em freezer a -80 °C;

Diluir 100 mL de plasma em 900 mL de água deionizada purificada em sistema Milli-Q (Millipore®) , ajustando o pH da solução para 5,3, com ácido acético (2%), e deixando em repouso em recipiente com gelo por 15 minutos ;

Centrifugar por 15 minutos a 2000 rpm; desprezar o sobrenadante, e dissolver o precipitado com 25 mL de solução salina (0,9%), ajustando o pH para 7,0 com solução de carbonato de sódio (NaC0₃ a 2%);

Adicionar 3 mL de cloreto de cálcio (CaCl₂) a 0,25 mM e deixar à temperatura ambiente por 2 horas para estabilizar a trombina;

Adicionar 25 mL de acetona PA na mesma proporção de solução salina (25 mL) agitando cuidadosamente;

Centrifugar a 2000 rpm por 10 minutos e desprezar o sobrenadante;

Adicionar 25 mL de solução salina para extrair a trombina, centrifugar a 2.000 rpm por 10 minutos e desprezar o precipitado.

Fazer o teste tempo de trombina (Valor de Referência: Normal até 14 segundos) para controlar a qualidade da Trombina extraída de Plasma Fresco Humano;

Para o correto armazenamento sem desnaturá-la, fazer alíquotas de 10 mL em frascos tipo penicilina e congelar em freezer a -80 °C. Descongelar no momento do uso .

[041] O rendimento desta extração é variável, podendo ser estimado entre 50 a 100 mL de trombina humana.

Preparação do Gel de Plaquetas com sulfadiazina de prata e sulfato de zinco

Descongelar um frasco do pool de CP qualificado; Centrifugar a 2000 rpm por 5 minutos para retirar os debris formados pelo rompimento da membrana das plaquetas em virtude do congelamento e posterior descongelamento, mesmo que tal processo de congelamento/descongelamento seja necessário para que as plaquetas se rompam e liberem todo seu conteúdo (princípios ativos) . Os sobrenadantes desta centrifugação serão utilizados ;

Incorporar em 100 g de gel base previamente preparado: 38 mL de CP; 1 mL de trombina humana; 1 mL de gluconato de cálcio; 1 g de sulfato de zinco heptahidratado (1%); 1 g de sulfadiazina de prata micronizada (1%); e 3 g de polímero composto de poliacrilamida, isoparafina C13-14 e lauril-7 como espessante.

[042] A adição do espessante foi necessária para restabelecer a viscosidade do gel, visto que ao se adicionar o ativo sulfato de zinco, observou-se uma perda da viscosidade do gel. Assim, o sulfato de zinco foi adicionado com uma parte do creme base utilizando gral e pistilo para fazer essa mistura.

Acertar o pH do produto final para 6,0 a 6,5 com NaOH 0,1 M.

Parametrização do Gel de Plaquetas

[043] O produto denominado "Gel de Plaquetas" foi avaliado inicialmente, antes da implementação com os ativos. A Tabela 1 abaixo mostra os parâmetros de referência do gel de plaquetas antes da adição dos ativos e que servirão como referência após adição dos ativos.

Tabela 1: Parametrização de Gel de Plaquetas

Gel de Plaquetas

Produto Puro (parametrização) Caracteres Densidade pH Comportamento Teste de Teste de

Identificação

Organolépticos (g/ml) (25°C) Reológico (cPS) Espatulação Centrifugação

Gel,

opalescente,

amarelo

Gel de Sem

levemente 1, 0137 6,18 600.000 De acordo Plaquetas grânulos

avermelhado ,

odor

característico

Adição do ativo Sulf adiazina de Prata

[044] Adição de Sulfadiazina de Prata Micronizada,

Formula Molecular: Ci₀H₉AgN₄O S, Peso molecular: 357,14, CAS n° 68-35-9. Foram preparadas 5 amostras de 60 gramas cada com concentração de Prata crescente seguindo o esquema: 0,1%, 0,25%, 0,5%, 0,75% e 1,0%, conforme observado na Tabela 2 abaixo.

Tabela 2: Concentração de Sulfadiazina de Prata em Gel Plaquetas

[045] 0 produto Gel de Plaquetas foi acrescido com o insumo Sulfadiazina de Prata Micronizada através de adição na proporção de diluição geométrica, com o emprego de Gral de porcelana e Pistilo. 0 processo de homogeneização ocorreu de forma normal, com movimentos circulares e auxilio de espátula para auxiliar o processo de incorporação do ativo na base.

Adição do ativo Sulfato de Zinco

[046] 0 Sulfato de Zinco Heptahidratado, Fórmula

Molecular: ZnS0₄.7H₂0, Peso Molecular: 287,54, CAS n° 7446- 20-0, foi definido como fonte de zinco estável e mais viável e foi acrescentado na proporção citada abaixo. Foram preparadas 5 amostras de 60 gramas cada com concentração de Zinco crescente seguindo o esquema: 1%, 2,5%, 5%, 7,5% e 15%, conforme observado na Tabela 3 abaixo.

Tabela 3: Concentração de Sulfato de Zinco em Gel de Plaquetas

[047] O produto Gel de Plaquetas foi acrescido com o insumo Sulfato de Zinco Heptahidratado através de adição na proporção de diluição geométrica, com o emprego de Gral de porcelana e Pistilo.

[048] Todas as incorporações com Sulfato de Zinco

Heptahidratado sofreram intervenções farmacotécnicas a fim de manter as características iniciais dos produtos. O processo de homogeneização ocorreu em gral de porcelana com pistilo auxiliado com movimento circulares e emprego de espátula para auxiliar o processo.

[049] Em 2.B.1, com a adição de 0,6 g do insumo, o pH do produto ficou 5, 14/25 °C e notou-se perda da característica de gel do produto. Adicionou-se 2,5 ml de NaOH 0,1 M para correção de pH e estabilização em pH 6,5/25 °C. Foi necessária a adição de 3% sobre a massa do produto (equivalente a 1,8 g) de espessante para restabelecimento da viscosidade e característica iniciais.

[050] Em 2.B.2, após adição de 1,5 g do insumo, o pH identificado foi de 4,52/25 °C e o produto tornou-se líquido. Adicionou-se, no total, 22,5 ml de NaOH 0, 1 M para correção de pH até 6, 34/25 °C. No entanto, o produto não recuperou a viscosidade inicial. Foi necessária adição de 20% de Polímero composto de poliacrilamida, isoparafina C13-14 e lauril-7 como espessante sobre a massa do produto, ou seja, 12 g. Após adição e homogeneização constante, o produto recuperou a viscosidade inicial.

[051] Em 2.B.3, após adição de 3 g do insumo, houve quebra da viscosidade e homogeneização do produto. O pH apurado foi de 3,98/25 °C. Utilizaram-se 7 ml (total) de NaOH 1 M par ajuste do pH em 6,3/25 °C. Não houve recuperação da viscosidade. Adição de 6 g de espessante, equivalente a 10% da massa do produto. Após, recuperou-se a viscosidade inicial.

[052] As concentrações de 7,5% (2.B.4) e 15%

(2.B.5) não foram executadas pela impossibilidade de estabilização do produto final. Não foi possível estabelecer um produto com as características iniciais e definidas como padrão.

[053] Após a implementação com os ativos propostos anteriormente, os produtos ficaram 30 dias + 30 dias armazenados sob refrigeração, de 4,0 a 8,0 °C. Após a decorrência do primeiro prazo de 30 dias, os produtos foram avaliados e comparados aos parâmetros iniciais. Após a decorrência do segundo prazo de 30 dias, novamente foram levantados os valores referentes aos parâmetros especificados .

Resultados do Primeiro Prazo (30 dias)

[054] A Tabela 4 abaixo mostra as características apresentadas pelo Gel de Plaquetas após 30 dias de incorporação com o ativo Sulfadiazina de Prata Micronizada.

Tabela 4 : Primeiro Prazo de Gel de Plaquetas Incorporado com Sulfadiazina

30 dias de incorporação

Caracteres Densidade pH Comportamento Teste de Teste de

Identificação

Organolé ticos (g/ml) (25°C) Reológico (cPS) Espatulação Centrifugação

Gel,

opalescente,

am relo

Sem

2.A.1 levemente 1, 0148 6,18 600.000 De acordo grânulos

avermelhado,

odor

característico

Gel,

opalescente,

amarelo

Sem

2.A.2 levemente 1, 0153 6,19 600.123 De acordo grânulos

avermelhado,

odor

característico Gel,

opalescente,

am relo

Sem

2.A.3 levemente 1, 0169 6,19 600.012 De acordo grânulos

avermelhado,

odor

Gel,

opalescente,

amarelo

Sem

2.A.4 levemente 1, 0205 6,21 600.980 De acordo grânulos

avermelhado,

odor

Gel,

opalescente,

amarelo

Sem

2.A.5 levemente 1, 0240 6,29 599.340 De acordo grânulos

avermelhado,

odor

[055] A Tabela 5 mostra as características apresentadas pelo Gel de Plaquetas após 30 dias de incorporação com o ativo Sulfato de Zinco Heptahidratado.

Tabela 5: Primeiro Prazo de Gel de Plaquetas Incorporado com Zinco

30 dias de incorporação

Comportamento

Caracteres Densidade pH Teste de Teste de

Identificação Reológico

Organolépticos (g/ml) (25°C) Espatulação Centrifugação

(cPS) Gel,

opalescente,

amarelo

Sem

2.B.1 levemente 1, 0248 5,80 598.021 De acordo grânulos

avermelhado,

odor

característico

Gel,

opalescente,

amarelo Sem

2.B.2 1, 0288 5, 99 655.000 De acordo esbranquiçado, grânulos odor

característico

Gel,

opalescente,

amarelo Sem

2.B.3 1, 0399 6, 70 701.000 De acordo esbranquiçado, grânulos odor

característico

Resultados do Segundo Prazo (+ 30 dias - Total 60 dias)

[056] A Tabela 6 abaixo mostra as características apresentadas pelo Gel de Plaquetas após 60 dias de incorporação com o ativo Sulfadiazina de Prata Micronizada.

Tabela 6: Segundo Prazo de Gel de Plaquetas Incorporado com Sulfadiazina

60 dias de incorporação

Carac eres Densidade pH Comportamento Teste de Teste de

Identificação

Organolé ticos (g/ml) (25°C) Reológico (cPS) Espatulação Centrifugação Gel,

opalescente,

am relo

Sem

levemente 1, 0113 6,21 599.021 De acordo grânulos

avermelhado,

odor

Gel,

opalescente,

amarelo

Sem

levemente 1, 0158 6,30 600.021 De acordo grânulos

avermelhado,

odor

Gel,

opalescente,

amarelo

Sem

levemente 1, 0171 6,20 600.015 De acordo grânulos

avermelhado,

odor

Gel,

opalescente,

amarelo

Sem

levemente 1, 0290 6,15 600.589 De acordo grânulos

avermelhado,

odor Gel,

opalescente,

am relo

Sem

2.A.5 levemente 1, 0235 6,31 599.789 De acordo grânulos

avermelhado,

odor

[057] A Tabela 7 abaixo mostra as características apresentadas pelo Gel de Plaquetas após 60 dias de incorporação com o ativo Sulfato de Zinco Heptahidratado.

Tabela 7 : Segundo Prazo de Gel de Plaquetas Incorporado com Zinco

30 dias de incorporação

Caracteres Densidade pH Comportamento Teste de Teste de

Identificação

Organolé ticos (g/ml) (25°C) Reológico (cPS) Espatulação Centrifugação

Gel,

opalescente,

amarelo

Sem

2.B.1 levemente 1, 0248 5,80 598.021 De acordo grânulos

avermelhado,

odor

característico

Gel,

opalescente,

amarelo Sem

2.B.2 1, 0288 5, 99 655.000 De acordo esbranquiçado, grânulos odor

característico Gel,

opalescente,

am relo Sem

2.B.3 1, 0399 6,70 701.000 De acordo esbranquiçado, grânulos odor

Avaliação de Parâmetro Físico-Químicos

[058] Os biocurativos foram avaliados nos seguintes parâmetros fisico-quimicos :

Características Organolépticas;

Determinação da Densidade de Massa;

Determinação do Potencial Hidrogeniônico ;

Comportamento reológico;

Teste de Espatulação ;

Teste de Centrifugação.

[059] O produto Gel de Plaquetas, obtido a partir do hemocomponente Concentrado de plaquetas, foi avaliado inicialmente neste estudo de modo que sejam obtidos parâmetros iniciais para os referidos testes. Estes foram definidos como padrão de normatização.

Características Organolépticas

[060] Esta avaliação compreende uma análise sensorial utilizando a capacidade visual, olfato e tato. Esta avaliação descreve requisitos fundamentais para a caracterização dos produtos avaliados, de modo que alterações nas especificações de normatização possam ser indicativas de alterações.

Determinação da Densidade de Massa

[061] A densidade da massa de uma substância é a razão da sua massa por seu volume a 20 °C. Foi utilizado o método do densímetro onde se identificou a massa dos produtos Gel de Plaquetas e Biofibrin.

Determinação do Potencial Hidrogenionico

[062] Trata-se da determinação potenciométrica do pH dos produtos biocurativos . O valor do pH é definido como a medida da atividade do íon hidrogénio de uma determinada amostra. Para essa determinação utilizou-se um potenciômetro, equipado com eletrodo misto, com compensação automática de temperatura para 25 °C. O equipamento foi calibrado anteriormente com soluções tampão pH 4,0 e 7,0.

Comportamento Reológico

[063] A viscosidade é a expressão da resistência dos líquidos ao deslocamento de parte de suas moléculas sobre moléculas vizinhas. A medição será realizada quanto à resistência ao movimento de rotação de eixos metálicos imersos nos produtos biocurativos. O aparelho é um Viscosímetro equipado com dispositivo Helipath.

Teste de Espatulação

[064] Uma placa molde de acrílico de 40 cm X 20 cm sobre uma superfície plana. Com o auxílio de uma espátula, espalha-se o produto sobre a placa de acrílico, deixando uma fina camada (aproximadamente 0,2 cm), para observação de material granulado ou não emulsifiçado nos produtos.

Teste de Centrifugação

[065] Avaliação da estabilidade do processo de emulsificação em função de aplicação de força rotacional gerada por um aparelho de centrifugação a 3.500 rpm por 30 minutos .

Avaliação Antimicrobiana

Obtenção da Solução Amostra [066] O Gel de Plaquetas implementado com

Sulfadiazina de Prata nas seguintes concentrações: 0,1%, 0,25%, 0,5%, 0,75% e 1% foi avaliado quanto a potencial ação antibacteriano . Para a preparação das soluções amostra foi utilizado 1 grama de cada concentração do produto, sendo uma solução de 1:10 de salina 0,85%. Amostras foram preparadas contendo 10 ml para cada concentração do Gel de Plaquetas.

Preparação dos Discos de Teste

[067] A partir da solução - amostra obtida de cada concentração, foram preparados discos de teste antimicrobiano, utilizando papel de filtro Whatman 6 mm. Foram preparados discos com as cinco diluições obtidas e sobre eles foi adicionado 16μ1 de cada diluição (solução - amostra) . Como controle negativo, foi confeccionado discos com 16μ1 do solvente utilizado, salina 0,85%. Como controle positivo, foi utilizado disco com Norfloxacina lOmg, definido como padrão positivo.

Microrganismos Testados

[068] Foram escolhidas cepas de bactérias Gram (+) e Gram (-), com importância clinica, para o desenvolvimento dos testes. Para o grupo de bactérias Gram (+) foram selecionados Staphylococcus aureus (ATCC 25.923) . Para o grupo de bactérias Gram (-), foram selecionados Escherichia coli (ATCC 25.922) e Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27.853) .

[069] As bactérias foram ativadas em Caldo BHI

(Brain Heart Infusion broth) a 37 °C, durante um período de 24 a 48 horas, dependendo do género bacteriano.

[070] Foram preparados inóculos do microrganismo a testar tomando-se colónias da cepa isolada e diluindo em solução salina a 0,85% até atingir a turbidez correspondente ao tubo 0,5 da escala de Mac-Farland correspondendo aproximadamente 1,5 x IO⁸ UFC/ml . Cada suspensão de microrganismo foi semeada, em triplicata, com auxilio de um swab descartável, em toda a superfície de meio ágar Muller-Hinton . Em seguida foram adicionados os discos previamente preparados com as diluições da solução amostra, controle positivo e controle negativo, e as placas foram incubadas em estufa de cultura a temperatura entre 35 °C a 37 °C por 24 horas.

[071] As Tabelas 8, 9 e 10 abaixo mostram a medida dos halos inibitórios (em mm) para 03 amostras de Gel de Plaquetas incorporados com diferentes concentrações de sulfadiazina de prata na presença de Staphylococcus aureus (Tabela 8), Escherichia coli (Tabela 9) e Pseudomonas aerogionosa (Tabela 10) .

Tabela 8 : Staphylococcus aureus e Gel de Plaquetas Incorporado com Sulfadizina

[072] Os halos de inibição do Gel de plaquetas com diferentes concentrações de sulfadiazina de prata e Staphylococcus aureus são mostrados na FIG. 1, sendo A para a amostra 1, B para a amostra 2 e C para a amostra 3;

Tabela 9. Escherichia coli e Gel de Plaquetas Incorporado com Sulfadiazina.

[073] Os halos de inibição do Gel de plaquetas com diferentes concentrações de sulfadiazina de prata e Escherichia coli são mostrados na FIG. 2_r sendo A para a amostra 1, B para a amostra 2 e C para a amostra 3;

Tabela 10. Pseudomonas aerogionosa e Gel de Plaquetas Incorporado com Sulfadizina.

Pseudomonas aerog-iziosa (ATCC 27.853)

Concentração Concentração

Amostra 1 Amostra 2 Amostra 3

Identificação Ativo Série Ativo Série

(mm) (mm) (mm) (%) (mg)

N 0, 0 0, 0 0, 0 0, 0 0, 0

P 10, 0 25, 5 25, 1 27, 0

2.A.1 0, 10 0, 0016 9, 1 9, 7 9, 5 2.A.2 0,25 0, 0027 10, 8 12, 4 14, 1

2.A.3 0, 50 0, 0080 12, 7 14, 7 15, 5

2.A.4 0, 75 0, 0120 14, 1 14,2 15, 4

2.A.5 1, 00 0, 0160 14, 4 14,2 14, 4

[074] Os halos de inibição do Gel de plaquetas com diferentes concentrações de sulfadiazina de prata e Pseudomonas aerogionosa são mostrados na FIG. 3, sendo A para a amostra 1, B para a amostra 2 e C para a amostra 3.

[075] Como citado anteriormente, os cátions de

Prata causam o bloqueio imediato da cadeia respiratória e destruição da membrana celular e parede bacteriana. Desse modo, os resultados encontrados para a avaliação antimicrobiana foram relevantes. Os organismos testados foram para o grupo de bactérias Gram ( + ), Staphylococcus aureus (ATCC 25.923) e para o grupo de bactérias Gram (-), onde foram selecionados Escherichia coli (ATCC 25.922) e Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27.853) . Nas Tabelas 8, 9 e 10 é possível identificar o diâmetro de formação do halo de inibição. A inibição mais significativa foi para o Pseudomonas aeruginosa _r onde nota-se uma média de halo de inibição maior quando comparados aos outros micro^¬ organismos. A Escherichia coli foi o microorganismo que apresentou menor halo de inibição quando comparados entre si e o Staphylococcus aureus ficou entre os outros, como a formação de um halo inibitório intermediário. Um dado importante é o fato que uma quantidade equivalente a 0,016 mg de Sulfadiazina de Prata (série 1.A.5), apresenta a formação de um halo inibitório médio de 15, 87 mm quando comparado ao halo formado pelo padrão positivo (norfloxacino - 10 mg) foi de 27, 60 mm. Desse modo é possível estabelecer uma informação positiva e relevante para a ação antimicrobiana agregada ao Gel de Plaquetas.

[076] Embora a invenção tenha sido amplamente descrita, é óbvio para aqueles versados na técnica que várias alterações e modificações podem ser feitas visando aprimoramento do projeto sem que as referidas alterações não estejam cobertas pelo escopo da invenção.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Gel de plaquetas caracterizado pelo fato de compreender :

100 g de gel base previamente preparado: 38 mL de concentrado de plaquetas previamente qualificado;

1 mL de trombina humana previamente produzida; 1 mL de gluconato de cálcio;

1 g de sulfato de zinco heptahidratado (1%);

1 g de sulfadiazina de prata micronizada (1%); e 3 g de espessante à base de poliacrilamida, isoparafina C13-14 e lauril-7.

2. Gel de plaquetas, de acordo com a reivindicação

1, caracterizado pelo fato do concentrado de plaquetas ser previamente qualificado verificando-se a presença de swirling nas unidades.

3. Gel de plaquetas, de acordo com a reivindicação

2, caracterizado pelo fato de injetar 1 mL de vitamina C caso o swirling não seja observado.

4. Gel de plaquetas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato do pH do concentrado de plaquetas estar entre 6,4 e 7,4.

5. Gel de plaquetas, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de 100 g de gel base compreender 82 mL de água para injeção, 0,8 g de carbopol 940, 5 mL óleo de amêndoas, 5 mL de propilenoglicol , 1 mL de NaOH 50% e 0,15 g de Nipagin.

6. Gel de plaquetas, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato do gel base ser um creme uniforme de coloração branca, fácil espalhamento e absorção pela pele.

7. Gel de plaquetas, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de antes da incorporação dos constituintes no gel base, o pool do concentrado de plaquetas foi descongelado e centrifugado a 2000 rpm por 5 minutos .

8. Gel de plaquetas, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do espessante ser adicionado para reestabelecer a viscosidade do gel após a adição do sulfato de zinco.

9. Gel de plaquetas, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do pH ser ajustado entre 6,0 e 6, 5 com NaOH 0,1 M.

10. Uso do gel de plaquetas conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de ser para uso externo.