WO2017013732A1 - 精製ウイルス液の製造方法およびウイルス検出方法 - Google Patents
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- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
Definitions
- the present invention relates to a method for producing a purified virus solution and a method for detecting a virus.
- the amount of virus contained in a sample such as environmental water is very small, and since the sample contains a large number of contaminants, the virus is detected from a sample obtained from environmental water or the like. It is not easy.
- NAT nucleic acid amplification test
- Patent Document 1 describes a method for purifying a sample by adsorbing impurities. More specifically, Patent Document 1 discloses a method for detecting norovirus including silica gel having a pore volume of 0.2 to 2.5 ml / g, a specific surface area of 20 to 900 m 2 / g, and an average pore diameter of 1 to 1000 nm. An invention relating to the material is described. According to Patent Document 1, by purifying a sample using a specific silica gel suitable for adsorption of contaminants in the sample, the detection rate of Norovirus can be increased. It is described that it can be increased by 5 times or more.
- environmental water or the like generally contains humic substances, which are a kind of humic substances, as impurities.
- the humic substance is a mixture of high molecular organic acids that are chemically and biologically synthesized from the degradation products of plant residues, microorganisms, and plankton bodies that have been decomposed by microorganisms.
- humic substances are derived from animals and plants, they exist in every place in the environment such as soil, seawater, river lake water, drainage, and waste.
- the humic substances are generally soluble in alkaline solutions but form precipitates in acidic solutions; fulvic acids that are soluble at any pH; and humic substances (or humic substances) that are insoluble in alkali. being classified.
- humic acid which is one of humic substances among the contaminants
- Patent Literature Even when the norovirus detection material described in 1 was applied, it was found that separation from the virus was difficult. As a result, virus amplification cannot be suitably performed due to inhibition of the PCR reaction by the remaining humic acid, and virus detection becomes difficult.
- an object of the present invention is to provide means capable of selectively separating humic acid from a sample (sample solution) containing virus and humic acid.
- the present inventor has conducted intensive research to solve the above problems. As a result, it has been found that the above problem can be solved by bringing a sample liquid containing virus and humic acid into contact with predetermined particles having a cationic group, and the present invention has been completed.
- the present invention relates to a method for producing a purified virus solution, which comprises bringing a sample solution containing virus and humic acid into contact with particles (A) having a cationic group and an average particle diameter of 1 to 3000 ⁇ m.
- humic acid can be selectively separated from a sample solution containing humic acid and a virus. Thereby, detection of a virus etc. can be performed suitably.
- the method for producing a purified virus solution according to the present invention includes contacting a sample solution containing a virus and humic acid with particles (A) having a cationic group and an average particle diameter of 1 to 3000 ⁇ m.
- Adsorption of impurities using conventional silica gel as described in Patent Document 1 is non-specific adsorption depending on the size of the pores, and therefore does not selectively remove impurities. . For this reason, it is difficult to separate humic acid having a property similar to that of a virus from among impurities.
- the present invention focuses on the difference in surface charge between virus and humic acid, and can selectively separate humic acid by using predetermined particles (A) having a cationic group. I found it.
- the humic acid in the selective separation of humic acid using the particles (A), the humic acid can be effectively separated when the amount of humic acid is a predetermined value.
- a method for producing a purified virus solution comprising contacting a sample solution containing virus and humic acid with particles (A) having a cationic group and having an average particle size of 1 to 3000 ⁇ m. Provided. At this time, when the amount of humic acid relative to the total surface area of the particles (A) is 0.5 to 100 ⁇ g / cm 2 , humic acid can be suitably separated.
- sample solution contains virus, humic acid, and solvent.
- a salt, impurities, and the like may be included as necessary.
- Sample liquid is usually environmental water such as river water, lake water, sea water, rain water, etc .; drinking water such as well water, tap water, bottled water, etc .; sewage, drainage, pool water, agricultural water, industrial water, refrigerant water, etc. Industrial water; food; collected from nature such as blood and other animal and plant components.
- a natural sample may be used as it is as a sample solution, but if necessary, a sample obtained by appropriately purifying a sample collected by a known method may be used as a sample solution.
- collected sample as a sample liquid from a viewpoint of isolate
- the pH of the sample solution is preferably 3 to 10, and more preferably 4 to 9. It is preferable for the pH of the sample solution to be within the above range since adverse effects on the virus can be prevented.
- the virus is not particularly limited, and a known virus can be applied.
- viruses include double-stranded DNA viruses, single-stranded DNA viruses, double-stranded RNA viruses, single-stranded RNA viruses, single-stranded RNA reverse transcription viruses, and double-stranded DNA reverse transcription viruses.
- Examples of the double-stranded DNA virus include adenovirus and podovirus.
- Examples of the single-stranded DNA virus include parvovirus.
- RNA virus examples include rotavirus and reovirus.
- RNA virus examples include single-stranded RNA viruses acting as mRNA of enterovirus, hepatitis A virus (HAV), hepatitis C virus (HCV) norovirus, feline calicivirus, etc .; measles virus, rabies virus, Marburg Examples thereof include single-stranded RNA viruses that act as complementary strands of mRNA such as viruses, Ebola viruses, and influenza viruses.
- HAV hepatitis A virus
- HCV hepatitis C virus
- feline calicivirus etc .
- measles virus rabies virus
- Marburg examples thereof include single-stranded RNA viruses that act as complementary strands of mRNA such as viruses, Ebola viruses, and influenza viruses.
- RNA reverse transcription virus examples include human immunodeficiency virus and foamy virus.
- Examples of the double-stranded DNA reverse transcription virus include hepatitis B virus.
- viruses that can be applied to the present form are adenoviruses, polyomaviruses, hepatitis A viruses (HAV), noroviruses, enteroviruses, polioviruses, hepatitis E viruses that exist in water and can infect humans ( HEV), rotavirus, Aichi virus, parecovirus and reovirus, preferably norovirus, HAV, HEV, enterovirus and rotavirus.
- the above viruses may be applied alone or in combination of two or more.
- the virus concentration in the sample solution is preferably 2 ⁇ 10 2 PFU / mL or more, and more preferably 1 ⁇ 10 3 to 1 ⁇ 10 14 PFU / mL. It is preferable that the virus concentration in the sample solution is 2 ⁇ 10 2 PFU / mL or more because PCR can be easily measured without concentration.
- humic acid As described above, humic acid is soluble in an alkaline solution among humic substances, but forms a precipitate in an acidic solution.
- Humic acid generally has many aromatic rings and many of them form a three-dimensional network structure.
- humic acid is often a polyphenol type carboxylic acid having at least one acidic group such as a hydroxyl group or a carboxy group.
- the humic acid according to the present embodiment is not limited to those existing in nature, but may be a humic acid derivative in which at least a part of the chemical structure is different from humic acid in nature.
- humic acid may be contained alone or in combination of two or more.
- humic acid can be detected and evaluated by measuring absorbance.
- humic acid can be detected and evaluated by the ratio (E4 / E6) of the absorbance (E4) at a wavelength of 465 nm and the absorbance (E6) at a wavelength of 665 nm.
- E4 / E6 the ratio of the absorbance (E4) at a wavelength of 465 nm
- E6 the absorbance
- Detection and evaluation of humic acid can also be performed.
- the humic acid concentration (humic acid concentration / total surface area of the particles (A)) relative to the total surface area of the particles (A) described later is 0.5 to 100 ⁇ g / cm 2 , preferably 1 to 50 ⁇ g / cm 2. cm 2 , more preferably 2.5 to 30 ⁇ g / cm 2 .
- humic acid concentration with respect to the total surface area of the particles (A) is in the above range, humic acid can be preferentially bound to the cationic groups of the particles (A) as compared to viruses. It is preferable because it can be separated.
- the humic acid concentration in the sample solution in the present embodiment is preferably 3 ⁇ g / mL or more, and more preferably 10 to 10,000 ⁇ g / mL. It is preferable that the concentration of humic acid in the sample solution is 3 ⁇ g / mL or more because the virus recovery rate is increased.
- the humic acid concentration in the sample solution can be obtained by measuring the absorbance when irradiated with light having a wavelength suitable for the humic acid to be measured.
- the total surface area of the particles (A) in the present invention is the sum of the surface areas of the particles (A) when it is assumed that the following three conditions are satisfied.
- Particle (A) is a perfect sphere without pores. 2. The particle diameters of the particles (A) are all average particle diameters. Particle (A) has a close-packed structure after spin down
- total surface area of the particles (A) can be calculated from the following equation (1).
- Total surface area 4 ⁇ ⁇ ⁇ r 2 ⁇ (v / ((4/3 ⁇ ⁇ ⁇ r 3 ) /0.74)) (1)
- r average particle diameter (cm) of the particles (A)
- v Volume after spin down of particle (A) (cm 3 )
- solvent examples include water and organic solvents, although they vary depending on the sample liquid to be collected or the solvent used in the step of obtaining the sample liquid by purifying the collected sample.
- organic solvent examples include alcohols such as methanol, ethanol, propanol, isopropyl alcohol and 1-butanol; esters such as ethyl acetate and butyl acetate; ethers such as diethyl ether and ethylene glycol monoethyl ether; dimethyl Examples include amides such as formamide and N-methylpyrrolidone; ketones such as acetone and methyl ethyl ketone. These solvents may be used alone or in combination of two or more.
- the solvent component used is preferably water from the viewpoints of environment, simplicity of operation, and the like.
- the salt that can be contained in the sample solution is not particularly limited, and examples thereof include known inorganic salts and organic salts.
- the inorganic salt is not particularly limited, and examples thereof include alkali metal salts, alkaline earth metal salts, aluminum salts, zinc salts and ammonium salts of inorganic acids such as hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, carbonic acid and phosphoric acid.
- chlorides such as sodium chloride, potassium chloride, magnesium chloride, calcium chloride, aluminum chloride, zinc chloride, and ammonium chloride
- sulfides such as sodium sulfate, potassium sulfate, magnesium sulfate, aluminum sulfate, zinc sulfate, and ammonium sulfate
- carbonates such as sodium carbonate, potassium carbonate, magnesium carbonate and calcium carbonate
- phosphorus such as sodium phosphate and potassium phosphate An oxide is mentioned.
- organic salt examples include alkali metal salts of organic acids. More specifically, examples include sodium phosphate, sodium citrate, sodium alginate, sodium aspartate, sodium lactate, sodium malate, sodium succinate, sodium tartrate, sodium ascorbate, and sodium glutamate.
- the salt is preferably sodium acetate, sodium citrate, or sodium phosphate, more preferably sodium citrate or sodium phosphate, and even more preferably sodium phosphate.
- the above-mentioned salts may be contained alone or in combination of two or more.
- the salt concentration of the sample solution is preferably 500 mM or less, more preferably 100 mM or less, further preferably 50 mM or less, particularly preferably 1 to 30 mM, and preferably 1 to 10 mM. Most preferred.
- a salt concentration of the sample solution of 500 mM or less is preferable because aggregation due to the hydrophobic interaction between the virus and humic acid can be easily prevented and humic acid can be more selectively separated.
- Impurities are usually contained in collected samples.
- Specific examples of the impurities include metal components such as V, Sr, Cd, Ce, Cr, Co, Ge, Cd, and Pb; bacteria such as Escherichia coli and staphylococci; protozoa such as Cryptosporidium and Giardia; Examples include fungi such as yeast. These impurities may be contained alone, or two or more kinds may be mixed and contained.
- the content of impurities in the sample liquid is preferably 1000 ppm or less, more preferably 1 to 100 ppm, and most preferably not contained. It is preferable that the impurity content is 1000 ppm or less because inhibition of the PCR reaction is unlikely to occur.
- the particles (A) have a cationic group.
- humic acid can be mainly adsorbed and humic acid can be separated from the sample solution.
- the “cationic group” means a group that is at least partially cationic in a solution having a pH of 1 to 7.
- the average particle diameter of the particles (A) is 1 to 3000 ⁇ m, preferably 30 to 1000 ⁇ m, more preferably 30 to 200 ⁇ m.
- the average particle diameter of the particles (A) is less than 1 ⁇ m, it cannot be separated from the sample liquid.
- the average particle size of the particles (A) is more than 3000 ⁇ m, the amount of particles for obtaining a desired surface area increases, so that the virus cannot be recovered in a high yield.
- the value of “average particle size” is a volume average particle size calculated by microscopy.
- Particle (A) usually has a configuration including a first particulate material having a cationic group.
- the first particulate material is not particularly limited, and examples thereof include agarose gel, cellulose gel, dextran gel, polyacrylamide gel, polyvinyl gel, glucomannan gel, and derivatives thereof. Among these, it is preferable to use agarose gel, cellulose gel, or dextran gel as the first particulate material. That is, in one embodiment, the particles (A) include at least one selected from the group consisting of an agarose gel having a cationic group, a cellulose gel having a cationic group, and a dextran gel having a cationic group. Is preferred.
- the above first particulate material may be used alone or in combination of two or more.
- the average particle diameter of the first particulate material is usually the same as that of the particles (A), preferably 1 to 3000 ⁇ m, more preferably 30 to 1000 ⁇ m, and further preferably 30 to 200 ⁇ m.
- the cationic group is not particularly limited, and examples thereof include an amino group, an ammonium group, a sulfonium group, and a phosphonium group.
- each R 1 is independently a hydrogen atom; a halogen atom such as a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, or an iodine atom; a methyl group, an ethyl group, a propyl group, an isopropyl group, a butyl group, or iso-butyl.
- substituents include: halogen atom; hydroxy group; thiol group; nitro group; sulfo group; alkoxy group such as methoxy group, ethoxy group, propyl group, isopropyloxy group, butoxy group; methylcarbonyl group, ethylcarbonyl group, propyl Examples thereof include alkylcarbonyl groups such as carbonyl group and butylcarbonyl group; ester groups such as methyloxycarbonyl group, ethyloxycarbonyl group, propyloxycarbonyl group and butyloxycarbonyl group.
- amino groups include amino group (—NH 2 ), methylamino group, ethylamino group, propylamino group, butylamino group, vinylamino group, cyclohexylamino group, dimethylamino group, ethylmethylamino group, diethylamino group.
- an amino group can be cationic in a solution having a pH of 1 to 9 by protonating a nitrogen atom at least partially.
- the ammonium group is usually represented by “—N (R 2 ) 3 + ”. At this time, each R 2 is independently the same as R 1 . Specific examples of the ammonium group include a trimethylammonium group, an ethyldimethylammonium group, and a triethylammonium group.
- the sulfonium group is usually represented by “—S (R 4 ) 2 + ”.
- R 4 is the same as R 1 independently.
- Specific examples of the sulfonium group include a dimethylsulfonium group and a diethylsulfonium group.
- the phosphonium group is usually represented by “—P (R 5 ) 4 + ”.
- R 5 is the same as R 1 independently.
- Specific examples of the phosphonium group include a triphenylphosphonium group.
- an amino group is preferable, and an “—N (R 1 ′ ) 2 ” group (wherein R 1 ′ is independently a hydrogen atom or a C1-C12 alkyl group). It is more preferably an amino group, a methylamino group, an ethylamino group, a dimethylamino group, an ethylmethylamino group, a diethylamino group or a hydroxyamino group, and an amino group or a diethylamino group. Particularly preferred.
- the above-mentioned cationic groups may be present alone in the particles (A) or two or more of them may be present.
- the pKa of the cationic group contained in the particles (A) is preferably 7 to 14, and more preferably 9 to 14. It is preferable that the pKa of the cationic group contained in the particles (A) is 7 or more because the pH of the sample solution can be easily adjusted because the particles (A) are anionic under neutral conditions. On the other hand, when the pKa of the cationic group contained in the particles (A) is 14 or less, it is preferable because the preparation of the cationic group is easy.
- the value of “pKa of the cationic group possessed by the particle (A)” is a calculated value calculated from the titration value when the particle (A) is titrated with an acid by the Henderson Hasselbalch equation. Shall be adopted.
- the amount of the functional group of the cationic group is not particularly limited, but is preferably 1 to 3000 ⁇ mol / mL, more preferably 5 to 1500 ⁇ mol / mL, and further preferably 50 to 300 ⁇ mol / mL. It is preferable that the functional group amount of the cationic group is 1 ⁇ mol / mL or more because the collection efficiency of humic acid is increased. On the other hand, it is preferable that the functional group amount of the cationic group is 3000 ⁇ mol / mL or less because the virus recovery rate is increased. In addition, in this specification, the value measured by the titration method shall be adopted as the value of the functional group amount.
- the cationic group may be bonded to the first particulate material through an intervening group.
- a cationic group can be suitably introduced into the first particulate material through the intervening group.
- the intervening group is not particularly limited, but is C1-C12 alkylene such as methylene (—CH 2 —), ethylene (—CH 2 CH 2 —); —CH 2 —O—CH 2 —, —O—CH 2 —CH 2 —, —O—CH 2 —CH 2 —CH 2 —, —O—CH 2 —CH 2 —CH 2 —CH 2 —, —O—C (CH 3 ) (CH 3 ) —CH 2 — CH 2 - C1 ⁇ C4 alkyleneoxy ;-( such CH 2 -O) 2 -, - (CH 2 -CH 2 -O) 2 -, - (CH 2 -CH 2 -CH 2 -O) 2 -, — (CH 2 —O) 4 —, — (CH 2 —CH 2 —O) 4 —, — (CH 2 —CH 2 —O) 4 —, — (CH 2 —CH 2 —O)
- Alkylene dithio such as —O—CH 2 —NH—, —O—CH 2 —CH 2 —NH—, etc. N'amino; -O-CH 2 -S -, - O-CH 2 -CH 2 -S- , etc.
- At this time, at least one of hydrogen atoms constituting alkylene, alkyleneoxy, polyalkyleneoxy, alkylenethio, alkylenedioxy, alkylenedithio, oxyalkyleneamino, oxyalkylenethio, alkyleneamino, alkylenediamino, thioalkyleneamino, alkenylene May be substituted with the above-described substituents.
- the intervening group is preferably alkylene such as methylene, ethylene, —CH (OH) CH 2 —, —CH 2 CH (OH) —, etc., and is —CH (OH) CH 2 —. Is more preferable.
- the above-mentioned intervening groups may be contained alone or in combination of two or more in the particles (A).
- the particles (A) can be used as they are when the first particulate material has a cationic group.
- the particles (A) can be produced by introducing a cationic group into the first particulate material.
- the functional group when the first particulate material has a functional group such as a hydroxy group such as an agarose gel, the functional group is activated by an activator and then the cationic group precursor compound is reacted.
- grains (A) can be manufactured.
- the first particulate material having a cationic group (a) is reacted with an activator and a cationic group precursor compound to further form a cationic group (b) different from the cationic group (a). It may be introduced. Thereby, the particle
- the activator is not particularly limited, but is preferably a compound that induces the above-described intervening group.
- the compound include halohydrins such as epichlorohydrin; bis such as ethylene glycol diglycidyl ether, diethylene glycol diglycidyl ether, polyethylene glycol diglycidyl ether, polypropylene glycol diglycidyl ether, and neopentyl glycol diglycidyl ether.
- epoxides include polyepoxides such as glycerol polyglycidyl ether, diglycerol polyglycidyl ether, sorbitol polyglycidyl ether, and trimethylolpropane polyglycidyl ether. These activators may be used alone or in combination of two or more.
- the cationic group precursor compound is preferably a compound that induces the above-mentioned cationic group.
- Specific examples of the compound include ammonia, methylamine, ethylamine, dimethylamine, diethylamine, hydroxylamine and the like. These cationic group precursor compounds may be used alone or in combination of two or more.
- the reaction at the time of introducing a cationic group into the first particulate material is not particularly limited and can be appropriately performed by a known technique.
- the sample solution is brought into contact with the particles (A).
- the contact method is not particularly limited, and for example, the contact can be performed by introducing the particles (A) into the sample liquid.
- the contact can be performed by passing the sample solution through the column filled with the particles (A).
- the contact time between the sample liquid and the particles (A) is preferably 30 minutes or less, more preferably 1 to 10 minutes. A contact time of 30 minutes or less is preferable because rapid inspection of environmental water and the like is possible.
- the temperature at the time of contact is preferably 4 to 40 ° C., more preferably 10 to 30 ° C. It is preferable that the temperature at the time of contact is in the above-mentioned range because virus death can be prevented or suppressed.
- the salt concentration in the solvent at the time of contact is preferably 500 mM or less, more preferably 100 mM or less, further preferably 50 mM or less, particularly preferably 1 to 30 mM, and preferably 1 to 30 mM. Most preferably, it is 10 mM. It is preferable that the salt concentration in the solvent is 500 mM or less because aggregation of virus and humic acid can be prevented or suppressed.
- the pH in the solvent at the time of contact is preferably 3 to 10, and more preferably 4 to 9.
- the pH of the solvent is in the above range, it is preferable because virus death can be prevented or suppressed.
- the method for producing a purified virus liquid includes a step of separating particles (A) and humic acid from a mixed liquid obtained by bringing a sample liquid and particles (A) into contact with each other.
- a humic acid can be isolate
- the separation since the adsorption state of the virus and humic acid on the particles (A) differs depending on the contact conditions and the like, at least a part of the virus is separated from the mixed solution together with the humic acid. Sometimes.
- the separation method is not particularly limited and can be performed by a known method. Specific examples of the separation method include filtration, decantation, centrifugation, and recovery of the supernatant.
- the equipment used for separation, the separated solution, and the like may be washed with a solvent, and the resulting washing solution may be mixed with the purified virus solution.
- the above contact and separation may be repeated twice or more. By further repeating contact and separation twice or more, a further purified virus solution can be obtained.
- the contact and separation may be performed under different conditions and methods. Efficient purification may be possible by performing contact and separation suitable for the situation such as the type and content of contaminants in the sample solution or the solution obtained by contact and separation.
- a sample liquid containing virus and humic acid is prepared from particles (A) having a cationic group and having an average particle diameter of 1 to 3000 ⁇ m and negative surface charges having an average particle diameter of 10 to There is provided a method for producing a purified virus solution comprising contacting the particles (B) that are 100 nm. By using the particles (B) in combination, humic acid can be suitably separated.
- FIG. 1 is a schematic view of a sample liquid, particles (A), and particles (B) according to the second embodiment.
- the sample liquid 1 according to this embodiment includes a virus 2 and a humic acid 3.
- the virus 2 has a positive charge and a negative charge as surface charges.
- the humic acid 3 has a negative charge as a surface charge.
- the particle (A) 4 according to this embodiment has a cationic group, it has a positive charge as a surface charge.
- the average particle diameter of the particles (A) 4 is 1 to 3000 ⁇ m.
- the particle (B) 5 according to this embodiment has a negative surface charge. At this time, the average particle diameter of the particles (B) 5 is 10 to 100 nm.
- FIG. 2 is a schematic diagram when the sample liquid according to the second embodiment is brought into contact with particles (A) and particles (B).
- the particle (A) 4 has a positive charge as the surface charge
- the virus 2, the humic acid 3 and the particle (B) 5 having a negative charge as the surface charge are adsorbed on the particle (A) 4. Yes.
- the virus 2 can have a positive charge as a surface charge, it tends to be relatively less adsorbed than the humic acid 3 and the particles (B) 5.
- a situation can be formed in which the virus 2 is not adsorbed on the particles (A) 4 and the humic acid 3 is adsorbed on the particles (A) 4.
- the particles (A) 4 having a large particle size that can be easily separated are separated from the sample liquid, whereby the humic acid 3 (and the particles (and particles) adsorbed on the particles (A) 4 are separated.
- B) 5) can also be separated from the sample solution. As a result, a purified virus solution from which humic acid has been removed can be obtained.
- the particle (B) 5 competes with the adsorption of the virus 2 to the particle (A) 4 and inhibits the adsorption of the virus 2 to the particle (A) 4, whereby the virus 2 is removed from the sample solution. This contributes to improving the recovery rate of virus 2.
- the particle (B) 5 has an average particle size comparable to that of the virus, and even if it remains in the purified virus solution, it is removed by the RNA extraction step, so that inhibition of the PCR reaction or the like hardly occurs. Since it does not occur, it does not adversely affect virus detection.
- the humic acid 4 can be selectively removed from the sample liquid by the particles (A) 4 and the particles (B) 5.
- virus purification mechanism is just an estimation, and even when the effect of the present invention is obtained by a mechanism other than the above mechanism, it is included in the technical scope of the present invention.
- sample solution Since the sample liquid is the same as in the first embodiment, the description thereof is omitted here.
- the second embodiment can exhibit a particularly high effect when the humic acid concentration is low.
- the humic acid concentration in the sample solution is preferably 10,000 ppm or less, and more preferably 1 to 5000 ppm.
- the humic acid concentration in the sample solution is 10000 ppm or less, the competitive inhibition action of the particles (B) against the adsorption of the virus particles (A) can be effectively exhibited.
- the humic acid is selectively selected. It is preferable because it can be removed.
- the particles (B) have a negative surface charge.
- adsorption of a virus having a relatively negative surface charge to the particle (A) can be prevented or suppressed, and the virus recovery rate can be improved.
- “having a negative surface charge” means having a negative zeta potential.
- the zeta potential can be measured by using the Smoluchowski equation by the electrophoretic light scattering measurement method.
- the zeta potential of the particles (B) is preferably ⁇ 5 to ⁇ 100 mV, more preferably ⁇ 10 to ⁇ 50 mV. It is preferable that the zeta potential of the particles (B) is ⁇ 5 mV or more because it is easy to prevent the adsorption of the virus particles (A). It is preferable that the zeta potential of the particles (B) is ⁇ 100 mV or less because the preparation of the particles (B) is easy.
- the average particle diameter of the particles (B) is preferably 10 to 100 nm, more preferably 20 to 80 nm, and further preferably 40 to 70 nm.
- the average particle diameter of the particles (B) is 10 nm or more, it is preferable because aggregation in the solution can be prevented and the function as the particles (B) can be suitably exhibited.
- the average particle size of the particles (B) is 100 nm or less, an effect of inhibiting the adsorption of the virus to the particles (A) can be obtained, and the function as the particles (B) can be preferably exhibited.
- the average particle diameter of the particles (B) can be measured by a dynamic light scattering method.
- Particle (B) usually has a configuration including a second particulate material having an anionic group.
- the “anionic group” means a group having at least a part of an anionic property in a solution having a pH of 8 to 14.
- the surface charge of the particles (B) can be controlled by appropriately adjusting the type of the anionic group and the amount of the functional group.
- the second particulate material is not particularly limited, but polyethylene, polypropylene, polyvinyl chloride, polystyrene, polyamide polyester, polyethylene terephthalate (PET), polycarbonate (PC), polyurethane, polyacryl, polyepoxy, polysulfone, poly Examples thereof include tetrafluoroethylene, silica, and alumina. Of these, polystyrene, polyurethane, polyacryl, polyepoxy, silica, and alumina are preferably used as the second particulate material.
- the particles (B) are polystyrene having an anionic group, polyurethane having an anionic group, polyacryl having an anionic group, polyepoxy having an anionic group, silica having an anionic group, And at least one selected from the group consisting of alumina having an anionic group.
- the above-mentioned second particulate matter may be used alone or in combination of two or more.
- the average particle diameter of the second particulate material is usually the same as that of the particles (B), preferably 10 to 100 nm, more preferably 20 to 80 nm, and further preferably 40 to 70 nm.
- Anionic group Although it does not restrict
- the carboxy group is represented by “—COOH”.
- the sulfone group is represented by “—SO 3 H”.
- the sulfonamide group is usually represented by “—SO 2 NR 6 2 ”.
- R 6 is the same as R 1 independently.
- Specific examples of the sulfonamide group include an aminosulfonyl group and a methylaminosulfonyl group.
- at least one of R 6 is preferably a hydrogen atom or a halogen atom, and more preferably a hydrogen atom.
- at least a part of the R 6 is eliminated (eg, deprotonated) in a solution having a pH of 8 to 14, whereby the nitrogen atom can be anionic.
- the phosphoric acid group is represented by “—OP (O) (OH) 2 ”.
- the silanol group is represented by “—SiOH”.
- the anionic group preferably includes at least one selected from the group consisting of a carboxy group, a sulfone group, a phosphate group, and a silanol group, and is a carboxy group or a sulfone group. Is more preferable.
- the pKa of the anionic group contained in the particle (B) is preferably 1 to 7, and more preferably 1 to 5. It is preferable that the pKa of the anionic group contained in the particles (B) is 1 or more because the preparation of the anionic group is easy. On the other hand, when the pKa of the anionic group contained in the particle (B) is 7 or less, the particle (B) is anionic under neutral conditions, and therefore it is preferable because pH adjustment of the sample is easy.
- the value of “pKa of the anionic group possessed by the particle (B)” is a calculated value calculated from the titration value when the particle (B) is titrated with a base by the Henderson Hasselbalch equation. Shall be adopted.
- the amount of the functional group of the anionic group is not particularly limited, but is preferably 10 to 5000 ⁇ mol / mL, and more preferably 100 to 3000 ⁇ mol / mL. It is preferable that the functional group amount of the anionic group is 10 ⁇ mol / mL or more because the stability of the particles (B) is increased. On the other hand, it is preferable that the functional group amount of the anionic group is 5000 ⁇ mol / mL or less because the particle diameter control of the particles (B) is easy.
- the anionic group may be bonded to the second particulate material through an intervening group.
- An anionic group can be suitably introduced into the second particulate material through the intervening group.
- the intervening group is not particularly limited, and examples thereof include those described above.
- the above-described intervening groups may be contained alone in the particles (B) or may be two or more kinds.
- the particles (B) can be used as they are when the second particulate material has an anionic group.
- Examples of the method for producing the second particulate material having an anionic group include various radical polymerization methods in an aqueous system such as an emulsion polymerization method, a miniemulsion polymerization method, a microemulsion polymerization method and a suspension polymerization method, and an anionic property in a solvent.
- an acrylic resin having a group, a urethane resin, an epoxy resin, or the like is synthesized, followed by phase inversion emulsification in an aqueous solvent.
- the particles (B) can be produced by introducing an anionic group into the second particulate material.
- the second particulate material when the second particulate material has a reactive group such as polystyrene, for example, an appropriate amount of paraformaldehyde is added in a sulfuric acid solution and heated to form a sulfonic acid group that is an anionic group. Can be introduced directly. In another embodiment, when the second particulate material does not have a reactive group such as polyethylene, a desired anionic group is introduced by introducing a reactive monomer or the like. Can do.
- a reactive group such as polystyrene
- an appropriate amount of paraformaldehyde is added in a sulfuric acid solution and heated to form a sulfonic acid group that is an anionic group. Can be introduced directly.
- a desired anionic group is introduced by introducing a reactive monomer or the like. Can do.
- the reactive monomer is not particularly limited, and examples thereof include styrene, glycidyl methacrylate, styrene, chloromethylstyrene, acrolein, vinyl pyridine, acrylonitrile and the like. These reactive monomers may be used alone or in combination of two or more.
- anionic group by physical adsorption of a surfactant having an anionic group on the surface of the second particulate material by hydrophobic interaction.
- surfactant having such an anionic group include sodium dodecylbenzenesulfonate.
- the sample solution is brought into contact with the particles (A) and the particles (B).
- the contact method is not particularly limited, and (1) the sample (A) and the particle (B) may be put into the sample liquid for contact, or (2) the solution and particles containing the particles (A) ( Each of the solutions containing B) may be prepared and mixed with the sample solution for contact, or (3) a mixed solution containing particles (A) and particles (B) is prepared, and this is used as the sample solution. It may be mixed and contacted.
- the order of contacting the sample liquid with the particles (A) and the particles (B) is not particularly limited, and the particles (A) may be contacted with the sample liquid first, or the particles (B) may be contacted with the sample liquid first.
- the particles (A) and the particles (B) may be contacted alternately, or the particles (A) and the particles (B) may be contacted simultaneously.
- a method of contacting the particles (B) first a method of contacting the particles (A) and the particles (B) simultaneously. Is preferably applied, and it is more preferable to apply a method in which the particles (A) and the particles (B) are contacted simultaneously.
- the method for producing a purified virus liquid comprises a step of separating at least particles (A) and humic acid from a mixed liquid obtained by bringing a sample liquid, particles (A), and particles (B) into contact with each other.
- a humic acid can be isolate
- the separation since the adsorption state of the virus, humic acid, and particles (B) to the particles (A) varies depending on the contact conditions and the like, at least the virus, particles (B) together with the humic acids. Some of them may be separated from the mixed solution.
- a virus detection method comprising the step (1) of producing a purified virus solution and the step (2) of detecting a virus in the purified virus solution.
- Step (1) is a step of producing a purified virus solution.
- either the first embodiment or the second embodiment may be applied, or both may be applied. Thereby, a purified virus solution can be produced from the sample solution.
- Step (2) is a step of detecting the virus in the purified virus solution obtained in step (1).
- the purified virus solution is obtained by purifying the purified virus solution obtained in step (1) using a sample collected from environmental water or the like as the sample solution.
- the amount of virus in the purified virus solution is very small. Therefore, in a preferred embodiment, it is preferable that the virus is detected in the step (2) by applying the NAT method.
- the step (2) is preferably a concentration step for concentrating the purified virus solution, an extraction step for extracting nucleic acid from the purified virus solution, a purification step for purifying the extracted nucleic acid, and a virus using the purified nucleic acid.
- a virus detection step of detecting If necessary, at least one of the above steps may be omitted or a known technique may be combined.
- the concentration step is a step of concentrating the purified virus solution obtained in step (1) to increase the virus concentration.
- the concentration method is not particularly limited, and a known technique can be applied. Examples thereof include a positive charge membrane method, a negative charge membrane method, a polyethylene glycol precipitation method, and an ultrafiltration method. These techniques may be applied alone or in combination of two or more.
- extraction process There is no restriction
- Specific examples of the nucleic acid extraction method include a phenol / chloroform extraction method and an extraction method using a surfactant or a protease in combination. These techniques may be applied alone or in combination of two or more.
- purification process There is no restriction
- the nucleic acid extracted by the liquid phase extraction method, the ethanol precipitation method, the spin column method etc. can be purified. These techniques may be applied alone or in combination of two or more.
- Virus detection process In the NAT method, detection using a primer specific to a virus, detection using hybridization after amplification of a viral nucleic acid, and the like are usually performed.
- nucleic acid amplification is performed using a virus-specific primer, and if amplification is observed, the virus is found to be present.
- nucleic acid amplification is performed, and enzyme immunization (EIA), fluorescent antibody method (FA), Southern blot hybridization, etc. are applied to the amplified nucleic acid.
- EIA enzyme immunization
- FA fluorescent antibody method
- Southern blot hybridization etc.
- the above-described virus detection step includes amplification of nucleic acid.
- the nucleic acid amplification method is not particularly limited, but in addition to the method using the polymerase chain reaction (PCR) or ligase chain reaction (LCR) described above, a transcription-mediated amplification (TMA) method, a strand displacement reaction (LAMP) method, Examples include isothermal gene amplification (ICAN) method and nucleic acid sequence amplification (NASBA) method.
- the purified virus solution obtained in step (1) does not contain or hardly contains humic acid, nucleic acid amplification in the virus detection step is not inhibited or hardly inhibited. As a result, virus detection can be suitably performed.
- test sample solution was prepared.
- humic acid solution was prepared by adding humic acid (Nacalai Tesque Co., Ltd.) to purified water to 10000 ⁇ g / mL and adjusting the pH to 7.3 using a sodium hydroxide solution.
- a phage solution was prepared by adjusting Q ⁇ phage (NBRC20012) in purified water to a final concentration of 10 12 PFU / mL.
- the humic acid solution, the phage solution, and the citrate buffer prepared above were adjusted so that the humic acid concentration, the phage concentration, and the pH were 100 ⁇ g / mL, 10 10 PFU / mL, and pH 5.0, respectively.
- a sample solution was prepared by mixing. At this time, the salt concentration of the citrate buffer was appropriately adjusted.
- Preparation Example 1-2 A humic acid solution and a phage solution were prepared in the same manner as in Preparation Example 1-1.
- humic acid solution Mix the humic acid solution, phage solution, and citrate buffer so that the humic acid concentration, phage concentration, and pH are 100 ⁇ g / mL, 10 10 PFU / mL, and pH 4.0, respectively. Prepared. At this time, the salt concentration of the citrate buffer was appropriately adjusted.
- Preparation Example 1-3 A humic acid solution and a phage solution were prepared in the same manner as in Preparation Example 1-1.
- Preparation Example 1-4 A humic acid solution and a phage solution were prepared in the same manner as in Preparation Example 1-1.
- Preparation Example 1-5 A humic acid solution and a phage solution were prepared in the same manner as in Preparation Example 1-1.
- a sample solution was prepared by mixing the humic acid solution, the phage solution, and ion-exchanged water so that the humic acid concentration and the phage concentration were 100 ⁇ g / mL and 10 10 PFU / mL, respectively.
- the prepared sample solution has a pH of 7.3.
- Preparation Example 1-6 A humic acid solution and a phage solution were prepared in the same manner as in Preparation Example 1-1.
- humic acid solution Mix the humic acid solution, phage solution, and citrate buffer so that the humic acid concentration, phage concentration, and pH are 1000 ⁇ g / mL, 10 10 PFU / mL, and pH 5.0, respectively. Prepared. At this time, the salt concentration of the citrate buffer was appropriately adjusted.
- Preparation Example 1-7 A humic acid solution and a phage solution were prepared in the same manner as in Preparation Example 1-1.
- humic acid solution Mix the humic acid solution, phage solution, and citrate buffer so that the humic acid concentration, phage concentration, and pH are 10 ⁇ g / mL, 10 10 PFU / mL, and pH 5.0, respectively. Prepared. At this time, the salt concentration of the citrate buffer was appropriately adjusted.
- DEAE Sepharose 6B FF DEAE (hereinafter sometimes simply referred to as “DEAE”) (manufactured by GE helthcare) was prepared as particles (A).
- the material of DEAE is an agarose gel and has a cationic group —NH (C 2 H 5 ) 2 .
- DEAE has an average particle size of 90 ⁇ m, an amino group amount of 135 ⁇ mol / mL, an exclusion limit molecular weight of 1000 kDa, and a total surface area of 246.7 cm 2 / mL.
- celfine-Amino celfine-Amino (manufactured by JNC Corporation) was prepared as particles (A).
- the material of celfine-Amino is a cellulose gel, and the cellulose gel has an amino group (—NH 2 ) which is a cationic group via a —OCH 2 CH (OH) CH 2 group.
- celfine-Amino has an average particle size of 165 ⁇ m, an amino group content of 17.5 ⁇ mol / mL, and a surface area of 133 cm 2 / mL.
- SA-10A SA-10A (Mitsubishi Chemical Corporation) was prepared as particles (A).
- the material of SA-10A is a styrene-based anion exchange resin, and a trimethylammonium group (—N + (CH 3 ) 3 ) group that is a cationic group is bonded to an aromatic group of styrene via a —CH 2 group. It has a structure.
- SA-10A has an average particle size of 700 ⁇ m, an amino group content of 1300 ⁇ mol / mL, and a surface area of 31.7 cm 2 / mL.
- Silica gel Silica gel 60N (63-210 ⁇ m) (manufactured by Kanto Chemical Co., Inc.), which is silica gel beads, was prepared.
- the average particle diameter of the silica gel 60N is 120 ⁇ m.
- the used particles (A) and the like are shown in Table 2 below.
- Step (1) Contact between sample liquid and particles (A)
- DEAE washed as particles (A) was added to 1 mL of the sample solution prepared in Preparation Example 1-1 (pH 5 citrate buffer, salt concentration: 500 mM) so that the volume after spin-down was 30 ⁇ L.
- the mixture was mixed by inverting for 10 minutes and then allowed to stand.
- the amount of humic acid relative to the particles (A) is 13.5 ⁇ g / cm 2 .
- Step (2) The amount of humic acid and the amount of phage in the purified virus solution were quantified, and the humic acid removal rate and virus removal rate were calculated by the following formulas (2) and (3).
- the humic acid recovery rate was 27% (that is, the humic acid removal rate was 73%).
- the amount of phage was quantified as follows.
- phage RNA was extracted using QIAGEN MinElute Virus Spin kit (manufactured by Qiagen). Next, according to Journal Virological Methods 149 (2008), p123-128, primers and probes were prepared, and purified RNA solution was measured by measuring the extracted RNA using StepOnePlus real-time PCR system (Life Technologies Japan Co., Ltd.). The amount of phage in it was determined.
- the amount of phage quantified was 5.7 ⁇ 10 10 PFU / mL.
- the virus recovery rate was 57% (that is, the virus removal rate was 43%).
- the humic acid removal rate / virus removal rate was calculated to be 1.7.
- Example 1-2 The same as Example 1-1 except that 1 mL of sample solution (pH 5 citrate buffer, salt concentration: 100 mM) was used instead of 1 mL of sample solution (pH 5 citrate buffer, salt concentration: 500 mM).
- a purified virus solution was prepared by the method described above.
- the humic acid recovery rate was measured in the same manner as in Example 1-1, and it was 16.8% (that is, the humic acid removal rate was 83.2%). Further, when the virus recovery rate was measured in the same manner as in Example 1-1, it was 67.8% (that is, the virus removal rate was 32.2%).
- the humic acid removal rate / virus removal rate is 2.6.
- Example 1-3 The same as Example 1-1 except that 1 mL of sample solution (pH 5 citrate buffer, salt concentration: 50 mM) was used instead of 1 mL of sample solution (pH 5 citrate buffer, salt concentration: 500 mM).
- a purified virus solution was prepared by the method described above.
- the humic acid recovery rate as measured in the same manner as in Example 1-1 was 24.7% (that is, the humic acid removal rate was 75.3%). Further, when the virus recovery rate was measured by the same method as in Example 1-1, it was 99.0% (that is, the virus removal rate was 1.0%).
- the humic acid removal rate / virus removal rate is 75.3.
- Example 1-4 Similar to Example 1-1, except that 1 mL of sample solution (pH 5 citrate buffer, salt concentration: 10 mM) was used instead of 1 mL of sample solution (pH 5 citrate buffer, salt concentration: 500 mM).
- a purified virus solution was prepared by the method described above.
- the humic acid recovery rate was measured by the same method as in Example 1-1, and it was 17.8% (that is, the humic acid removal rate was 82.2%). Further, when the virus recovery rate was measured by the same method as in Example 1-1, it was 99.0% (that is, the virus removal rate was 1.0%).
- the humic acid removal rate / virus removal rate is 82.2.
- step 1 the volume of DEAE spin-down after 30 ⁇ L was changed to 150 ⁇ L, and instead of 1 mL of sample solution (pH 5 citrate buffer, salt concentration: 500 mM), 1 mL of sample solution (pH 5 citrate buffer)
- the purified virus solution was prepared in the same manner as in Example 1-1 except that the salt concentration was 1 mM.
- the amount of humic acid relative to the particles (A) is 2.7 ⁇ g / cm 2 .
- the humic acid recovery rate as measured in the same manner as in Example 1-1 was 7.3% (that is, the humic acid removal rate was 92.7%). Further, when the virus recovery rate was measured in the same manner as in Example 1-1, it was 86.3% (that is, the virus removal rate was 13.7%).
- the humic acid removal rate / virus removal rate is 6.7.
- Example 1 except that 1 mL of sample solution (pH 5 citrate buffer, salt concentration: 1 mM) was changed to 1 mL of sample solution (pH 4 citrate buffer, salt concentration: 1 mM) prepared in Preparation Example 1-2.
- a purified virus solution was prepared in the same manner as in 1-5.
- the humic acid recovery rate was measured by the same method as in Example 1-1, and it was 10.6% (that is, the humic acid removal rate was 89.4%). Further, when the virus recovery rate was measured by the same method as in Example 1-1, it was 78.4% (that is, the virus removal rate was 21.6%).
- the humic acid removal rate / virus removal rate is 4.1.
- Step 1 instead of the sample solution prepared in Preparation Example 1-1 (pH 5 citrate buffer solution, salt concentration: 1 mM), the sample solution prepared in Preparation Example 1-3 (phosphate buffer solution, salt concentration: 1 mM) ) was used in the same manner as in Example 1-5, except that a purified virus solution was prepared.
- the humic acid recovery rate was measured by the same method as in Example 1-1, and it was 7.5% (that is, the humic acid removal rate was 92.5%). Further, when the virus recovery rate was measured by the same method as in Example 1-1, it was 99.0% (that is, the virus removal rate was 1.0%).
- the humic acid removal rate / virus removal rate is 94.6.
- Step 1 the volume of DEAE spin-down after 30 ⁇ L was changed to 300 ⁇ L, and instead of 1 mL of sample solution (pH 5 citrate buffer, salt concentration: 500 mM), 1 mL of sample solution (pH 5 citrate buffer)
- the purified virus solution was prepared in the same manner as in Example 1-1 except that the salt concentration was 1 mM.
- the amount of humic acid relative to the particles (A) is 1.4 ⁇ g / cm 2 .
- the humic acid recovery rate measured by the same method as in Example 1-1 was 2.8% (that is, the humic acid removal rate was 97.2%). Further, when the virus recovery rate was measured by the same method as in Example 1-1, it was 65.7% (that is, the virus removal rate was 34.3%).
- the humic acid removal rate / virus removal rate is 2.8.
- step 1 instead of the sample solution prepared in Preparation Example 1-1 (pH 5 citrate buffer, salt concentration: 500 mM), the sample solution prepared in Preparation Example 1-4 (acetate buffer, salt concentration: 1 mM) A purified virus solution was prepared in the same manner as in Example 1-8 except that was used.
- the humic acid recovery rate as measured in the same manner as in Example 1-1 was 3.5% (that is, the humic acid removal rate was 96.5%). Further, when the virus recovery rate was measured by the same method as in Example 1-1, it was 64.1% (that is, the virus removal rate was 35.9%).
- the humic acid removal rate / virus removal rate is 2.7.
- step 1 a purified virus solution was prepared in the same manner as in Example 1-3, except that celfine-Amino was used instead of DEAE.
- the amount of humic acid relative to the particles (A) is 25.0 ⁇ g / cm 2 .
- the humic acid recovery rate measured by the same method as in Example 1-1 was 24.9% (that is, the humic acid removal rate was 75.1%). Further, when the virus recovery rate was measured by the same method as in Example 1-1, it was 93.5% (that is, the virus removal rate was 6.5%).
- the humic acid removal rate / virus removal rate is 11.5.
- step 1 a purified virus solution was prepared in the same manner as in Example 1-4, except that 300 ⁇ L of SA-10A was added instead of 30 ⁇ L of DEAE.
- the amount of humic acid relative to the particles (A) is 10.5 ⁇ g / cm 2 .
- the humic acid recovery rate measured by the same method as in Example 1-1 was 28.3 (that is, the humic acid removal rate was 71.7%). Further, when the virus recovery rate was measured by the same method as in Example 1-1, it was 55.5% (that is, the virus removal rate was 44.5%).
- the humic acid removal rate / virus removal rate is 1.6.
- Example 1 except that the sample solution prepared in Preparation Example 1-6 (citrate buffer solution concentration: 10 mM) was used in Step 1 instead of the sample solution prepared in Preparation Example 1-1.
- a purified sample solution was prepared in the same manner as in No. 8.
- the total surface area of the particles (A) is 74 cm 2 and the amount of humic acid is 1000 ⁇ g. Therefore, the amount of humic acid relative to the particles (A) is 13.5 ⁇ g / cm 2 .
- the humic acid recovery rate was measured by the same method as in Example 1-1, and it was 11.0% (that is, the humic acid removal rate was 89.0%). Further, when the virus recovery rate was measured by the same method as in Example 1-1, it was 77.4% (that is, the virus removal rate was 22.6%).
- the humic acid removal rate / virus removal rate is 3.9.
- ⁇ Comparative Example 1-1> In the same manner as in Example 1-1 except that 1000 ⁇ L of silica gel beads was added to 1 mL of the sample solution prepared in Preparation Example 1-2 (phosphate buffer, salt concentration: 1 mM) in Step 1. A purified virus solution was prepared.
- the humic acid recovery rate measured by the same method as in Example 1-1 was 99.0% (that is, the humic acid removal rate was 1.0%). Further, when the virus recovery rate was measured by the same method as in Example 1-1, it was 99.0% (that is, the virus removal rate was 1.0%).
- the humic acid removal rate / virus removal rate is 1.0.
- a purified virus solution was prepared in the same manner as in 1.
- the total surface area of the particles (A) is 37 cm 2 and the amount of humic acid is 10 ⁇ g. Therefore, the amount of humic acid relative to the particles (A) is 0.27 ⁇ g / cm 2 .
- the humic acid recovery rate was measured by the same method as in Example 1-1, and it was 3.0% (that is, the humic acid removal rate was 97.0%). Further, when the virus recovery rate was measured in the same manner as in Example 1-1, it was 1.0% (that is, the virus removal rate was 99.0%).
- the humic acid removal rate / virus removal rate is 0.98.
- sample solution Humic acid (NBRC20012) and Q ⁇ phage (Nacalai Tesque, Inc.) were added to purified water so that the final concentrations were 5 ⁇ 10 10 PFU / mL and 500 ppm, respectively, to prepare a sample solution (pH 7).
- particles (A) Sepharose 6B FF DEAE (DEAE) (manufactured by GE healthcare) was prepared as particles (A).
- the particles (A) were used after being immersed in a 0.1 M aqueous hydrochloric acid solution to neutralize amino groups and then washed with a sufficient amount of purified water until the pH of the washing water became neutral.
- SC-0050-D SIZE STANDARD PARTICLES
- SC-0050-D (manufactured by JSR Corporation) was prepared as particles (B).
- the material of SC-0050-D is polystyrene. Note that SC-0050-D has a zeta potential of ⁇ 43.1 mV and an average particle size of 48 nm.
- a sample solution (virus concentration: 5 ⁇ 10 10 PFU / mL, humic acid concentration: 500 ppm) was added, and contact was performed by inversion mixing for 10 minutes.
- the virus concentration at the time of contact is 1 ⁇ 10 10 PFU / mL, and the humic acid concentration is 100 ppm.
- a purified virus solution was prepared by separating particles (A) and particles (B) from the solution contacted above.
- 0.8 mL of a purified virus solution was prepared by spinning down the particles (A) and particles (B) of the solution obtained by mixing by inversion and collecting the supernatant.
- Step (2) Virus was detected in the purified virus solution obtained.
- the amount of phage was determined by the same method as in Example 1-1.
- the phage residual ratio (%) in the purified virus solution was calculated from the obtained phage amount by the following formula.
- the phage residual rate was 92%.
- the purified virus solution was diluted 100 times with purified water to prepare a diluted purified virus solution.
- the phage residual ratio (dilution) was determined in the same manner as the purified virus solution. As a result, the phage residual ratio (dilution) was 87%.
- the absorbance at 400 nm of the sample solution (Abs sample ) and the absorbance at 400 nm of the purified virus solution (Abs purified virus ) were measured, and the humic acid removal rate (%) was calculated by the following formula.
- the humic acid removal rate was 93%.
- Example 2-2 A purified virus solution was prepared in the same manner as in Example 2-1, except that the particles (A) were changed to celfine-Amino (manufactured by JNC Corporation).
- the particles (A) were used after being immersed in a 0.1 M aqueous hydrochloric acid solution to neutralize amino groups and then washed with a sufficient amount of purified water until the pH of the washing water became neutral.
- Phage remaining rate (%) in the obtained purified virus solution was 80%. Further, the phage residual rate (dilution) was 83%, and the humic acid removal rate was 88%.
- Example 2-3 A purified virus solution was prepared in the same manner as in Example 2-1, except that the particle (A) was changed to EA.
- EA is prepared by immersing Epoxy-activated Sepharose 6B (manufactured by GE healthcare) in 28% aqueous ammonia solution, shaking overnight at room temperature, and then washing with purified water until the pH of the washing water becomes neutral. This is an agarose gel having an amino group (—NH 2 ) prepared therein. At this time, the average particle diameter of EA is 105 ⁇ m, and the amount of amino groups is 18 ⁇ mol / mL.
- the particles (A) were used after being immersed in a 0.1 M aqueous hydrochloric acid solution to neutralize amino groups and then washed with a sufficient amount of purified water until the pH of the washing water became neutral.
- Phage remaining rate (%) in the obtained purified virus solution was 42%. Moreover, the phage residual rate (dilution) was 90%, and the humic acid removal rate was 70%.
- Example 2-4 A purified virus solution was prepared in the same manner as in Example 2-1, except that the particles (A) were changed to DEA.
- DEA is immersed in Epoxy-activated Sepharose 6B (manufactured by GE healthcare) in a 20% ethanolamine aqueous solution, shaken overnight at 40 ° C., and then the pH of the washing water becomes neutral with purified water. It is an agarose gel into which a hydroxyethylamino group (—NHC 2 H 4 OH) prepared by washing until is introduced. At this time, the average particle diameter of DEA is 105 ⁇ m, and the amount of amino groups is 19 ⁇ mol / mL.
- the particles (A) were used after being immersed in a 0.1 M aqueous hydrochloric acid solution to neutralize amino groups and then washed with a sufficient amount of purified water until the pH of the washing water became neutral.
- Phage remaining rate (%) in the obtained purified virus solution was 50%. Moreover, the phage residual rate (dilution) was 93% and the humic acid removal rate was 82%.
- Example 2-5 A purified virus solution was prepared in the same manner as in Example 2-1, except that the dose of particles (A) was changed to 30 ⁇ L.
- Phage remaining rate (%) in the obtained purified virus solution was 30%. Moreover, the phage residual rate (dilution) was 90%, and the humic acid removal rate was 60%.
- Example 2-6 Example 2-5, except that the phosphate buffer used in preparing the mixture of particles (A) and particles (B) was changed to a phosphate buffer (pH 7.0, 10 mM). A purified virus solution was prepared in the same manner as described above.
- Phage remaining rate (%) in the obtained purified virus solution was 39%. Moreover, the phage residual rate (dilution) was 83%, and the humic acid removal rate was 71%.
- Example 2-7 Example 2-5, except that the phosphate buffer used in preparing the mixture of particles (A) and particles (B) was changed to a citrate buffer (pH 5.0, 10 mM). A purified virus solution was prepared in the same manner as described above.
- Phage remaining rate (%) in the obtained purified virus solution was 35%. Moreover, the phage residual rate (dilution) was 70%, and the humic acid removal rate was 80%.
- Example 2-8> A purified virus solution was prepared in the same manner as in Example 2-5, except that the time of inversion mixing of the mixed solution and the sample solution was changed to 15 hours.
- Phage remaining rate (%) in the obtained purified virus solution was 56%. Moreover, the phage residual rate (dilution) was 76%, and the humic acid removal rate was 86%.
- Example 2-9 A purified virus solution was prepared in the same manner as in Example 2-1, except that the final concentration of humic acid in the sample solution was changed to 5 ppm so that the humic acid concentration at the time of contact was 1 ppm. .
- Phage remaining rate (%) in the obtained purified virus solution was 100%. Moreover, the phage residual rate (dilution) was 100%, and the humic acid removal rate was 100%.
- Example 2-10> A purified virus solution was prepared in the same manner as in Example 2-8, except that the final concentration of humic acid in the sample solution was changed to 5 ppm so that the humic acid concentration at the time of contact was 1 ppm. .
- Phage remaining rate (%) in the obtained purified virus solution was 100%. Moreover, the phage residual rate (dilution) was 100%, and the humic acid removal rate was 100%.
- Step (1) A purified virus solution was prepared by the following method.
- sample solution In phosphate buffer (pH 7.0, 1 mM), 1% of humic acid (NBRC20012), Q ⁇ phage (Nacalai Tesque Co., Ltd.) and particles (B) SC-0050-D were added at a final concentration of 1 ⁇ , respectively.
- a sample solution (pH 7) was prepared by adding 10 10 PFU / mL and 200 ppm.
- Particle (A) DEAE was prepared as particles (A).
- Step (2) In the same manner as in Example 2-1, the phage residual rate (%), phage residual rate (dilution), and humic acid removal rate in the purified virus solution were measured.
- the phage survival rate (%) was 50%.
- the phage residual rate (dilution) was 69%, and the humic acid removal rate was 84%.
- Example 2-12 A purified virus solution was prepared in the same manner as in Example 2-11 except that the solvent of the sample solution was changed to purified water.
- Phage remaining rate (%) in the obtained purified virus solution was 50%. Moreover, the phage residual rate (dilution) was 70%, and the humic acid removal rate was 82%.
- Example 2-13> A purified virus solution was prepared in the same manner as in Example 2-12, except that the final concentration of humic acid in the sample solution was changed to 1 ppm.
- Phage remaining rate (%) in the obtained purified virus solution was 90%. Moreover, the phage residual rate (dilution) was 90%, and the humic acid removal rate was 100%.
- Example 2-14> A purified virus solution was prepared in the same manner as in Example 2-11, except that the solvent of the sample solution was changed to phosphate buffer (pH 7.0, 10 mM) and the DAEA dose was changed to 50 ⁇ L. Was prepared.
- Phage remaining rate (%) in the obtained purified virus solution was 69%. Moreover, the phage residual rate (dilution) was 71%, and the humic acid removal rate was 72%.
- Example 2-15 A purified virus solution was prepared in the same manner as in Example 2-11 except that the particles (B) were changed to STADEX SC-0030-A (manufactured by JSR Corporation).
- SC-0030-A The material of SC-0030-A is polystyrene.
- SC-0030-A has a zeta potential of ⁇ 45 mV and an average particle size of 29 nm.
- Phage remaining rate (%) in the obtained purified virus solution was 47%. Moreover, the phage residual rate (dilution) was 80%, and the humic acid removal rate was 72%.
- Example 2-16 A purified virus solution was prepared in the same manner as in Example 2-11 except that the particles (B) were changed to STADEX SC-0100-D (manufactured by JSR Corporation).
- SC-0100-D The material of SC-0100-D is polystyrene. SC-0100-D has a zeta potential of ⁇ 38 mV and an average particle size of 100 nm.
- Phage remaining rate (%) in the obtained purified virus solution was 38%. Moreover, the phage residual rate (dilution) was 50%, and the humic acid removal rate was 85%.
- Example 2-17> A purified virus solution was prepared in the same manner as in Example 2-11 except that the dose of SC-0050-D was changed so that the addition amount was 1000 ppm.
- Phage remaining rate (%) in the obtained purified virus solution was 48%. Moreover, the phage residual rate (dilution) was 78%, and the humic acid removal rate was 77%.
- Example 2-1 Purified virus was prepared in the same manner as in Example 2-1, except that 1000 ⁇ L of silica gel (average particle size: 90 ⁇ m) was used in place of the particles (A), and the particles (B) were not mixed. A liquid was prepared.
- Phage remaining rate (%) in the obtained purified virus solution was 14%. Moreover, the phage residual rate (dilution) was 99%, and the humic acid removal rate was 1%.
- Example 2-1 except that the particles (B) were not added, and the final concentration of humic acid in the sample solution was changed to 5 ppm so that the humic acid concentration at the time of contact was 1 ppm.
- a purified virus solution was prepared in the same manner as above.
- Phage remaining rate (%) in the obtained purified virus solution was 1%. Moreover, the phage residual rate (dilution) was 1%, and the humic acid removal rate was 100%.
- ⁇ Comparative Example 2-3> A purified virus solution was prepared in the same manner as in Comparative Example 2-2, except that the time of inversion mixing of the mixed solution and the sample solution was changed to 15 hours.
- Phage remaining rate (%) in the obtained purified virus solution was 0%. Moreover, the phage residual rate (dilution) was 0%, and the humic acid removal rate was 100%.
- Phage remaining rate (%) in the obtained purified virus solution was 7%. Moreover, the phage residual rate (dilution) was 28%, and the humic acid removal rate was 96%.
- Example 2-5 A purified virus solution was prepared in the same manner as in Example 2-11 except that the particles (B) were changed to STADEX SC-034-S (manufactured by JSR Corporation).
- SC-034-S The material of SC-034-S is polystyrene.
- SC-034-S has a zeta potential of ⁇ 35 mV and an average particle size of 352 nm.
- Phage remaining rate (%) in the obtained purified virus solution was 14%. Moreover, the phage residual rate (dilution) was 23%, and the humic acid removal rate was 83%.
- the purified virus solution prepared in Examples 2-1 to 2-17 was compared with the purified virus solution prepared in Comparative Examples 2-1 to 2-5. It can be seen that the amplification can be suitably performed.
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Abstract
環境水等の試料(サンプル液)中に含まれるウイルスを検出する場合において、サンプル液中に含まれるにフミン酸等の夾雑物はPCR反応を阻害することから、サンプル液中のウイルスの検出等が困難となる。そこで、ウイルスおよびフミン酸を含むサンプル液から、フミン酸を選択的に分離することができる手段を提供する。 当該手段は、ウイルスおよびフミン酸を含むサンプル液を、カチオン性基を有し平均粒径が1~3000μmである粒子(A)を含み、前記粒子(A)の総表面積に対するフミン酸量が、0.5~100μg/cm2である、精製ウイルス液の製造方法に関する。
Description
本発明は、精製ウイルス液の製造方法およびウイルス検出方法に関する。
近年、安全志向の高まりから、我々を取り巻く環境に対する安全性を担保することが重要視されている。特に、河川水や海水といった環境水、水道水等が各種ウイルスによって汚染されると、近隣住民への感染が爆発的に拡大し、甚大な健康被害を生じる虞がある。このため、環境水等のウイルス汚染を恒常的に監視することは、人々の安全安心を維持していく上で非常に重要である。このようなウイルス汚染の恒常的な監視を実現するためには、簡便で正確にウイルスを検出、定量等できる方法を確立することが必要となる。
しかしながら、環境水等の試料中に含有されるウイルス量は微量であり、また、当該試料中には数多くの夾雑物が含まれていることから、環境水等から入手した試料からウイルスを検出することは容易ではない。
これに対し、ウイルス量が微量である点に対しては、従来、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)やリガーゼ連鎖反応(LCR)等によりウイルスの核酸を増幅することで、試料中のウイルスの検出等を行うことが可能となることが知られている。例えば、核酸増幅検査(NAT)法は、ウイルスに含まれる核酸を人工的に増幅して高感度に検出する方法である。NAT法においては、ウイルスに特異なプライマーを利用した検出、ウイルス核酸を増幅させた後にハイブリダイゼーションを利用する検出等が行われる。
一方、試料中に含有される夾雑物に対しては、当該夾雑物がPCR反応を阻害しうることから、一般に、試料から夾雑物を分離して精製することが行われる。例えば、特許文献1には、夾雑物を吸着させて試料を精製する方法が記載されている。より詳細には、特許文献1には、細孔容積が0.2~2.5ml/g、比表面積が20~900m2/g、平均細孔径が1~1000nmであるシリカゲルを含むノロウイルス検出用材料に係る発明が記載されている。特許文献1によれば、ノロウイルスおよびPCR反応を阻害する夾雑物を含む試料に対し、試料中の夾雑物の吸着に適した特定のシリカゲルを用いて試料を精製することにより、ノロウイルスの検出率を5倍以上に高めることができることが記載されている。
ところで、環境水等の中には、一般に、夾雑物として腐植物質の一種であるフミン質が含有される。フミン質とは、植物残渣や微生物、プランクトンの遺骸が微生物による分解を受け、その分解生成物から化学的、生物的に合成された高分子有機酸の混合物である。この際、フミン質は、動植物由来物質であることから、土壌・海水・河川湖沼水や排水・廃棄物等の環境中のあらゆる場所に存在する。当該フミン質は、一般に、アルカリ溶液に可溶であるが、酸性溶液では沈殿を形成するフミン酸;どのpHでも可溶な性質を有するフルボ酸;およびアルカリに不溶なヒューミン(またはフムス質)に分類される。
環境水等から入手した試料中のウイルスを検出するに際し、試料に含有される夾雑物を分離する場合において、夾雑物のうち、特にフミン質の1種であるフミン酸については、例えば、特許文献1に記載のノロウイルス検出用材料を適用したとしても、ウイルスとの分離が困難であることが判明した。その結果、残存するフミン酸によるPCR反応の阻害等によりウイルスの増幅を好適に行うことができず、ウイルスの検出等が困難となる。
そこで、本発明は、ウイルスおよびフミン酸を含む試料(サンプル液)から、フミン酸を選択的に分離することができる手段を提供することを目的とする。
本発明者は、上記課題を解決すべく、鋭意研究を行った。その結果、ウイルスおよびフミン酸を含むサンプル液を、カチオン性基を有する所定の粒子に接触させることで、上記課題が解決されうることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、ウイルスおよびフミン酸を含むサンプル液を、カチオン性基を有し平均粒径が1~3000μmである粒子(A)に接触させることを含む、精製ウイルス液の製造方法に関する。
本発明によれば、フミン酸およびウイルスを含むサンプル液からフミン酸を選択的に分離することができる。これにより、ウイルスの検出等を好適に行うことができる。
<精製ウイルス液の製造方法>
本発明に係る精製ウイルス液の製造方法は、ウイルスおよびフミン酸を含むサンプル液を、カチオン性基を有し平均粒径が1~3000μmである粒子(A)に接触させることを含む。
本発明に係る精製ウイルス液の製造方法は、ウイルスおよびフミン酸を含むサンプル液を、カチオン性基を有し平均粒径が1~3000μmである粒子(A)に接触させることを含む。
特許文献1に記載されるような従来のシリカゲルを用いた夾雑物の吸着は、細孔の大きさに依存した非特異的な吸着であることから、選択的に夾雑物を除去するものではない。そのため、夾雑物のうちウイルスと類似する性質を有するフミン酸については、ウイルスとの分離が困難となる。
これに対し、本発明は、ウイルスとフミン酸との表面電荷の違いに着目し、カチオン性基を有する所定の粒子(A)を用いることにより、フミン酸を選択的に分離することができることを見出した。
このうち、第1の実施形態によれば、前記粒子(A)を用いたフミン酸の選択的分離において、フミン酸量が所定値であると効果的にフミン酸を分離できることを見出した。
また、第2の実施形態によれば、前記粒子(A)を用いたフミン酸の選択的分離において、アニオン性基を有する所定の粒子(B)を併用すると効果的にフミン酸を分離できることを見出した。
以下、各実施形態について、詳細に説明する。
<第1の実施形態>
本実施形態によれば、ウイルスおよびフミン酸を含むサンプル液を、カチオン性基を有し平均粒径が1~3000μmである粒子(A)に接触させることを含む、精製ウイルス液の製造方法が提供される。この際、前記粒子(A)の総表面積に対するフミン酸量が、0.5~100μg/cm2であることにより、フミン酸を好適に分離することができる。
本実施形態によれば、ウイルスおよびフミン酸を含むサンプル液を、カチオン性基を有し平均粒径が1~3000μmである粒子(A)に接触させることを含む、精製ウイルス液の製造方法が提供される。この際、前記粒子(A)の総表面積に対するフミン酸量が、0.5~100μg/cm2であることにより、フミン酸を好適に分離することができる。
[サンプル液]
サンプル液は、ウイルス、フミン酸、および溶媒を含む。その他、必要に応じて、塩、不純物等を含んでいてもよい。
サンプル液は、ウイルス、フミン酸、および溶媒を含む。その他、必要に応じて、塩、不純物等を含んでいてもよい。
サンプル液は、通常、河川水、湖沼水、海水、雨水等の環境水;井戸水、水道水、ボトルドウォーター等の飲料水;下水、排水、プール水、農業用水、工業用水、冷媒水等の産業用水;食品;血液等の動植物成分等の自然界から採取したものを用いる。この際、自然界のサンプルをそのままサンプル液として使用してもよいが、必要に応じて、公知の手法により採取したサンプルを適宜精製したものをサンプル液として使用してもよい。このうち、フミン酸を好適に分離する観点から、採取したサンプルを精製したものをサンプル液として使用することが好ましい。
サンプル液のpHは、3~10であることが好ましく、4~9であることがより好ましい。サンプル液のpHが上記範囲内であると、ウイルスへの悪影響を防止できることから好ましい。
(ウイルス)
ウイルスとしては、特に制限されず、公知のウイルスが適用されうる。
ウイルスとしては、特に制限されず、公知のウイルスが適用されうる。
ウイルスの具体例としては、2本鎖DNAウイルス、1本鎖DNAウイルス、2本鎖RNAウイルス、1本鎖RNAウイルス、1本鎖RNA逆転写ウイルス、2本鎖DNA逆転写ウイルス等が挙げられる。
前記2本鎖DNAウイルスとしては、アデノウイルス、ポドウイルス等が挙げられる。
前記1本鎖DNAウイルスとしては、パルボウイルス等が挙げられる。
前記2本鎖RNAウイルスとしては、ロタウイルス、レオウイルス等が挙げられる。
前記1本鎖RNAウイルスとしては、エンテロウイルス、A型肝炎ウイルス(HAV)、C型肝炎ウイルス(HCV)ノロウイルス、ネコカリシウイルス等のmRNAとして作用する1本鎖RNAウイルス;麻疹ウイルス、狂犬病ウイルス、マールブルグウイルス、エボラウイルス、インフルエンザウイルス等のmRNAの相補鎖として作用する1本鎖RNAウイルスが挙げられる。
前記1本鎖RNA逆転写ウイルスとしては、ヒト免疫不全ウイルス、泡沫状ウイルス等が挙げられる。
前記2本鎖DNA逆転写ウイルスとしては、B型肝炎ウイルス等が挙げられる。
これらのうち、本形態に適用されうるウイルスは、水中に存在し、ヒトに感染しうるアデノウイルス、ポリオーマウイルス、A型肝炎ウイルス(HAV)、ノロウイルス、エンテロウイルス、ポリオウイルス、E型肝炎ウイルス(HEV)、ロタウイルス、アイチウイルス、パレコウイルス、レオウイルスであることが好ましく、ノロウイルス、HAV、HEV、エンテロウイルス、ロタウイルスであることがより好ましい。
上述のウイルスは単独で適用しても、2種以上が混合されて適用されてもよい。
サンプル液中のウイルス濃度は、2×102PFU/mL以上であることが好ましく、1×103~1×1014PFU/mLであることがより好ましい。サンプル液中のウイルス濃度が2×102PFU/mL以上であると、濃縮なしで容易にPCRを測定できることから好ましい。
(フミン酸)
フミン酸は、上述のようにフミン質のうち、アルカリ溶液に可溶であるが、酸性溶液では沈殿を形成するものである。
フミン酸は、上述のようにフミン質のうち、アルカリ溶液に可溶であるが、酸性溶液では沈殿を形成するものである。
フミン酸は、一般に芳香族環を多数有し、三次元網目状構造を形成するものが多い。なかでもフミン酸は、水酸基、カルボキシ基等の酸性基をそれぞれ1以上有するポリフェノール型カルボン酸であるものが多い。
本形態に係るフミン酸は、自然界に存在するものだけでなく、化学構造の少なくとも一部が自然界のフミン酸と異なるフミン酸誘導体であってもよい。
なお、サンプル液において、フミン酸は単独で含まれていても、2種以上が混合して含まれていてもよい。
フミン酸の構造は非常に複雑であるが、吸光度の測定により検出、評価を行うことができる。一般には、波長465nmの吸光度(E4)と、波長665nmの吸光度(E6)との比(E4/E6)によりフミン酸の検出、評価を行うことができる。なお、サンプル液に含有されたフミン酸が既知である場合、または事前に構造決定をする場合等には、そのフミン酸を検出、評価をするのに適当な波長の吸光度を測定することにより、フミン酸の検出、評価を行うこともできる。
本実施形態において、後述する粒子(A)の総表面積に対するフミン酸濃度(フミン酸濃度/粒子(A)の総表面積)は、0.5~100μg/cm2であり、好ましくは1~50μg/cm2であり、より好ましくは2.5~30μg/cm2である。粒子(A)の総表面積に対するフミン酸濃度が上記範囲にあると、粒子(A)のカチオン性基に対し、ウイルスと比べて、フミン酸が優先的に結合しうるため、好適にフミン酸を分離できることから好ましい。
また、本実施形態におけるサンプル液中のフミン酸濃度は、3μg/mL以上であることが好ましく、10~10000μg/mLであることがより好ましい。サンプル液中のフミン酸濃度が3μg/mL以上であると、ウイルスの回収率が高まることから好ましい。
なお、サンプル液中のフミン酸濃度は、測定対象となるフミン酸に適した波長の光を照射した場合の吸光度を測定することにより求めることができる。
また、本発明における粒子(A)の総表面積とは、以下3点の条件を満たしたと仮定した場合の粒子(A)の表面積の和のことである。
1.粒子(A)が孔のない完全な球形である
2.粒子(A)の粒子径が全て平均粒子径である
3.粒子(A)がスピンダウン後に最密充填構造となっている
2.粒子(A)の粒子径が全て平均粒子径である
3.粒子(A)がスピンダウン後に最密充填構造となっている
この条件から、粒子(A)の総表面積は以下の式(1)から計算できる。
(総表面積)=4×π×r2×(v/((4/3×π×r3)/0.74)) (1)
r:粒子(A)の平均粒子径(cm)
v:粒子(A)のスピンダウン後の体積(cm3)
(総表面積)=4×π×r2×(v/((4/3×π×r3)/0.74)) (1)
r:粒子(A)の平均粒子径(cm)
v:粒子(A)のスピンダウン後の体積(cm3)
(溶媒)
溶媒としては、採取するサンプル液または採取したサンプルを精製してサンプル液を得る工程で使用する溶媒等によっても異なるが、水および有機溶媒が挙げられる。
溶媒としては、採取するサンプル液または採取したサンプルを精製してサンプル液を得る工程で使用する溶媒等によっても異なるが、水および有機溶媒が挙げられる。
前記有機溶媒の具体例としては、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロピルアルコール、1-ブタノール等のアルコール類;酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル類;ジエチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル等のエーテル類;ジメチルホルムアミド、N-メチルピロリドン等のアミド類;アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類などが挙げられる。これらの溶媒は、単独で用いても、2種以上を混合して用いてもよい。
これらのうち、環境面、操作の簡便性等の観点から、用いられる溶媒成分は水であることが好ましい。
(塩)
サンプル液に含有されうる塩としては、特に制限されず、公知の無機塩および有機塩が挙げられる。
サンプル液に含有されうる塩としては、特に制限されず、公知の無機塩および有機塩が挙げられる。
前記無機塩としては、特に制限されないが、塩酸、硫酸、硝酸、炭酸、リン酸等の無機酸のアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、亜鉛塩、アンモニウム塩等が挙げられる。より詳細には、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、塩化アルミニウム、塩化亜鉛、塩化アンモニウム等の塩化物;硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸アルミニウム、硫酸亜鉛、硫酸アンモニウム等の硫化物;硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、硝酸マグネシウム、硝酸カルシウム、硝酸アルミニウム、硝酸亜鉛、硝酸アンモニウム等の硝酸化物;炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸マグネシウム、炭酸カルシウム等の炭酸化物;リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等のリン酸化物が挙げられる。
前記有機塩としては、有機酸のアルカリ金属塩等が挙げられる。より詳細には、リン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、アスパラギン酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、リンゴ酸ナトリウム、コハク酸ナトリウム、酒石酸ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウム、グルタミン酸ナトリウム等が挙げられる。
これらのうち、塩としては、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウムであることが好ましく、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウムであることがより好ましく、リン酸ナトリウムであることがさらに好ましい。
上述の塩は単独で含まれていても、2種以上が混合して含まれていてもよい。
サンプル液の塩濃度は、500mM以下であることが好ましく、100mM以下であることがより好ましく、50mM以下であることがさらに好ましく、1~30mMであることが特に好ましく、1~10mMであることが最も好ましい。サンプル液の塩濃度が500mM以下であると、ウイルスとフミン酸との疎水性相互作用による凝集を防止しやすくなり、フミン酸をより選択的に分離できることから好ましい。
(不純物)
不純物は、通常、採取したサンプルに含まれているものである。当該不純物の具体例としては、V、Sr、Cd、Ce、Cr、Co、Ge、Cd、Pb等の金属成分;大腸菌、ブドウ球菌等の細菌類;クリプトスポリジウム、ジアルジア等の原虫類;カビ、酵母等の真菌類が挙げられる。これらの不純物は単独で含まれていても、2種以上が混合されて含まれていてもよい。
不純物は、通常、採取したサンプルに含まれているものである。当該不純物の具体例としては、V、Sr、Cd、Ce、Cr、Co、Ge、Cd、Pb等の金属成分;大腸菌、ブドウ球菌等の細菌類;クリプトスポリジウム、ジアルジア等の原虫類;カビ、酵母等の真菌類が挙げられる。これらの不純物は単独で含まれていても、2種以上が混合されて含まれていてもよい。
サンプル液中の不純物の含有量は、1000ppm以下であることが好ましく、1~100ppmであることがより好ましく、含まれないことが最も好ましい。不純物の含有量が1000ppm以下であると、PCR反応への阻害がかかりにくいことから好ましい。
[粒子(A)]
粒子(A)は、カチオン性基を有する。粒子(A)が、カチオン性基を有することにより、主としてフミン酸を吸着し、サンプル液からフミン酸を分離することができる。なお、本明細書において、「カチオン性基」とは、pH1~7の溶液中において、少なくとも一部がカチオン性を有する基を意味する。
粒子(A)は、カチオン性基を有する。粒子(A)が、カチオン性基を有することにより、主としてフミン酸を吸着し、サンプル液からフミン酸を分離することができる。なお、本明細書において、「カチオン性基」とは、pH1~7の溶液中において、少なくとも一部がカチオン性を有する基を意味する。
また、粒子(A)の平均粒径は、1~3000μm、好ましくは30~1000μm、より好ましくは30~200μmである。粒子(A)の平均粒径が1μm未満であると、サンプル液から分離することができない。一方、粒子(A)の平均粒径が3000μm超であると、所望の表面積を得るための粒子量が多くなるため、ウイルスを高収率で回収することができない。なお、本明細書において、「平均粒径」の値は、顕微鏡法によって算出された体積平均粒径の値を採用するものとする。
粒子(A)は、通常、カチオン性基を有する第1の粒子状材料を含む構成を有する。
(第1の粒子状材料)
前記第1の粒子状材料としては、特に制限されないが、アガロースゲル、セルロースゲル、デキストランゲル、ポリアクリルアミドゲル、ポリビニルゲル、グルコマンナンゲル、およびこれらの誘導体等が挙げられる。これらのうち、第1の粒子状材料としては、アガロースゲル、セルロースゲル、デキストランゲルを用いることが好ましい。すなわち、一実施形態において、粒子(A)が、カチオン性基を有するアガロースゲル、カチオン性基を有するセルロースゲル、およびカチオン性基を有するデキストランゲルからなる群から選択される少なくとも1つを含むことが好ましい。
前記第1の粒子状材料としては、特に制限されないが、アガロースゲル、セルロースゲル、デキストランゲル、ポリアクリルアミドゲル、ポリビニルゲル、グルコマンナンゲル、およびこれらの誘導体等が挙げられる。これらのうち、第1の粒子状材料としては、アガロースゲル、セルロースゲル、デキストランゲルを用いることが好ましい。すなわち、一実施形態において、粒子(A)が、カチオン性基を有するアガロースゲル、カチオン性基を有するセルロースゲル、およびカチオン性基を有するデキストランゲルからなる群から選択される少なくとも1つを含むことが好ましい。
上述の第1の粒子状物質は、単独で用いても、2種以上を組み合わせて用いてもよい。
第1の粒子状材料の平均粒径は、通常、粒子(A)と同様であり、好ましくは1~3000μm、より好ましくは30~1000μm、さらに好ましくは30~200μmである。
(カチオン性基)
カチオン性基としては、特に制限されないが、アミノ基、アンモニウム基、スルホニウム基、ホスホニウム基等が挙げられる。
カチオン性基としては、特に制限されないが、アミノ基、アンモニウム基、スルホニウム基、ホスホニウム基等が挙げられる。
前記アミノ基は、通常、「-N(R1)2」で表される。この際、前記R1は、それぞれ独立して、水素原子;フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等のハロゲン原子;メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、iso-ブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、ペンチル基等のC1-C12アルキル基;ビニル基、1-プロピレニル基、2-プロピレニル基、1-ブテニル基、1,3-ブタジエニル基等のC2-C12アルケニル基;エチニル基、プロパルギル基等のC2-C12アルキニル基;シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等のC3-C8シクロアルキル基;シクロブテニル基、シクロへキセニル基等のC3-C8シクロアルケニル基;フェニル基、ベンジル基、トシル基、ナフチル基、アントラセニル基等のC6-C20アリール基等である。この際、前記アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、アリール基を構成する水素原子の少なくとも1つは、置換基で置換されていていてもよい。当該置換基としては、ハロゲン原子;ヒドロキシ基;チオール基;ニトロ基;スルホ基;メトキシ基、エトキシ基、プロピル基、イソプロピルオキシ基、ブトキシ基等のアルコキシ基;メチルカルボニル基、エチルカルボニル基、プロピルカルボニル基、ブチルカルボニル基等のアルキルカルボニル基;メチルオキシカルボニル基、エチルオキシカルボニル基、プロピルオキシカルボニル基、ブチルオキシカルボニル基等のエステル基が挙げられる。具体的なアミノ基としては、アミノ基(-NH2)、メチルアミノ基、エチルアミノ基、プロピルアミノ基、ブチルアミノ基、ビニルアミノ基、シクロヘキシルアミノ基、ジメチルアミノ基、エチルメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、メチルプロピルアミノ基、エチルプロピルアミノ基、ジプロピルアミノ基、ジブチルアミノ基、クロロメチルアミノ基、ブロモエチルアミノ基、クロロプロピルアミノ基、ヒドロキシアミノ基等が挙げられる。なお、アミノ基は、通常、pH1~9の溶液中において、少なくとも一部は窒素原子がプロトン化されてカチオン性を示しうる。
前記アンモニウム基は、通常、「-N(R2)3
+」で表される。この際、前記R2は、それぞれ独立して、R1と同様である。アンモニウム基の具体例としては、トリメチルアンモニウム基、エチルジメチルアンモニウム基、トリエチルアンモニウム基等が挙げられる。
前記スルホニウム基は、通常、「-S(R4)2
+」で示される。この際、前記R4は、それぞれ独立して、R1と同様である。スルホニウム基の具体例としては、ジメチルスルホニウム基、ジエチルスルホニウム基等が挙げられる。
前記ホスホニウム基は、通常、「-P(R5)4
+」で示される。この際、前記R5は、それぞれ独立して、R1と同様である。ホスホニウム基の具体例としては、トリフェニルホスホニウム基等が挙げられる。
上述のカチオン性基のうち、アミノ基であることが好ましく、「-N(R1’)2」基(この際、R1’はそれぞれ独立して、水素原子、C1-C12アルキル基である)であることがより好ましく、アミノ基、メチルアミノ基、エチルアミノ基、ジメチルアミノ基、エチルメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、ヒドロキシアミノ基であることがさらに好ましく、アミノ基、ジエチルアミノ基であることが特に好ましい。
上述のカチオン性基は、粒子(A)において単独で存在していても、2種以上が存在していていもよい。
粒子(A)が有するカチオン性基のpKaとしては、7~14であることが好ましく、9~14であることがより好ましい。粒子(A)が有するカチオン性基のpKaが7以上であると、中性条件で粒子(A)がアニオン性を有することからサンプル溶液のpH調整が容易であるため好ましい。一方、粒子(A)が有するカチオン性基のpKaが14以下であると、カチオン性基の調製が容易であることから好ましい。なお、本明細書において、「粒子(A)が有するカチオン性基のpKa」の値は、粒子(A)を酸で滴定した際の滴定値から、ヘンダーソン・ハッセルバルヒの式により算出された計算値を採用するものとする。
カチオン性基の官能基量としては、特に制限されないが、1~3000μmol/mLであることが好ましく、5~1500μmol/mLであることがより好ましく、50~300μmol/mLであることがさらに好ましい。カチオン性基の官能基量が1μmol/mL以上であると、フミン酸の捕集効率が高まることから好ましい。一方、カチオン性基の官能基量が3000μmol/mL以下であると、ウイルスの回収率が高まることから好ましい。なお、本明細書において、官能基量の値は、滴定法により測定された値を採用するものとする。
(介在基)
粒子(A)において、カチオン性基は、介在基を介して第1の粒子状材料に結合していてもよい。
粒子(A)において、カチオン性基は、介在基を介して第1の粒子状材料に結合していてもよい。
介在基を介することにより、第1の粒子状材料に好適にカチオン性基を導入することができる。
当該介在基としては、特に制限されないが、メチレン(-CH2-)、エチレン(-CH2CH2-)等のC1-C12アルキレン;-CH2-O-CH2-、-O-CH2-CH2-、-O-CH2-CH2-CH2-、-O-CH2-CH2-CH2-CH2-、-O-C(CH3)(CH3)-CH2-CH2-等のC1~C4アルキレンオキシ;-(CH2-O)2-、-(CH2-CH2-O)2-、-(CH2-CH2-CH2-O)2-、-(CH2-O)4-、-(CH2-CH2-O)4-、-(CH2-CH2-CH2-O)4-、-(CH2-O)10-、-(CH2-CH2-O)10-、-(CH2-CH2-CH2-O)10-、-(CH2-O)30-、-(CH2-CH2-O)30-、-(CH2-CH2-CH2-O)30-等のC1-C100ポリアルキレンオキシ;-CH2-S-CH2-、-S-CH2-CH2-、-S-CH2-CH2-CH2-、-S-CH2-CH2-CH2-CH2-、-S-C(CH3)(CH3)-CH2-CH2-等のC1-C4アルキレンチオ;-O-CH2-O-、-O-CH2-CH2-O-、-O-CH2-CH2-CH2-O-等のC1-C3アルキレンジオキシ;-S-CH2-S-、-S-CH2-CH2-S-、-S-CH2-CH2-CH2-S-等のC1-C3アルキレンジチオ;-O-CH2-NH-、-O-CH2-CH2-NH-等のC1-C2オキシアルキレンアミノ;-O-CH2-S-、-O-CH2-CH2-S-等のC1-C2オキシアルキレンチオ;-NH-CH2-CH2-、-NH-CH2-CH2-CH2-等のC2-C3アルキレンアミノ;-NH-CH2-NH-、-NH-CH2-CH2-NH-等のC1-C2アルキレンジアミノ;-S-CH2-NH-、-S-CH2-CH2-NH-等のC1-C2チオアルキレンアミノ;-CH2-CH=CH-、-CH2-CH2-CH=CH-、-CH2-CH=CH-CH2-等のC3-C6アルケニレン等が挙げられる。この際、アルキレン、アルキレンオキシ、ポリアルキレンオキシ、アルキレンチオ、アルキレンジオキシ、アルキレンジチオ、オキシアルキレンアミノ、オキシアルキレンチオ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノ、チオアルキレンアミノ、アルケニレンを構成する水素原子の少なくとも1つは、上述の置換基で置換されていていてもよい。これらのうち、介在基としては、メチレン、エチレン、-CH(OH)CH2-、-CH2CH(OH)-等のアルキレンであることが好ましく、-CH(OH)CH2-であることがより好ましい。
上述の介在基は、粒子(A)中に単独で有していても、2種以上を有していてもよい。
(粒子(A)の製造方法)
粒子(A)は、第1の粒子状材料がカチオン性基を有する場合には、そのまま使用することができる。
粒子(A)は、第1の粒子状材料がカチオン性基を有する場合には、そのまま使用することができる。
第1の粒子状材料がカチオン性基を有さない場合には、第1の粒子状材料にカチオン性基を導入することで、粒子(A)を製造することができる。
一実施形態において、第1の粒子状材料がアガロースゲルのようなヒドロキシ基等の官能基を有する場合には、活性化剤により当該官能基を活性化し、次いでカチオン性基前駆体化合物を反応させることで、粒子(A)を製造することができる。なお、カチオン性基(a)を有する第1の粒子状材料に活性化剤、カチオン性基前駆体化合物を反応させて、前記カチオン性基(a)とは異なるカチオン性基(b)をさらに導入してもよい。これにより、2種以上のカチオン性基を有する粒子(A)を製造することができる。
前記活性化剤としては、特に制限されないが、上述の介在基を誘導する化合物であることが好ましい。当該化合物の具体例としては、例えば、エピクロロヒドリン等のハロヒドリン;エチレングリコールジグリシジルエーテル、ジエチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリプロピレングリコールジグリシジルエーテル、ネオペンチルグリコールジグリシジルエーテル等のビスエポキシド;グリセロールポリグリシジルエーテル、ジグリセロールポリグリシジルエーテル、ソルビトールポリグリシジルエーテル、トリメチロールプロパンポリグリシジルエーテル等のポリエポキシド等が挙げられる。これらの活性化剤は、単独で用いても、2種以上を組み合わせて用いてもよい。
また、カチオン性基前駆体化合物としては、上述のカチオン性基を誘導する化合物であることが好ましい。当該化合物の具体例としては、例えば、アンモニア、メチルアミン、エチルアミン、ジメチルアミン、ジエチルアミン、ヒドロキシルアミン等が挙げられる。これらのカチオン性基前駆体化合物は単独で用いても、2種以上を組み合わせて用いてもよい。
第1の粒子状材料にカチオン性基を導入する際の反応については、特に制限はなく、適宜公知の技術により行うことができる。
[接触]
第1の実施形態に係る精製ウイルス液の製造方法によれば、サンプル液を、粒子(A)に接触させることを含む。
第1の実施形態に係る精製ウイルス液の製造方法によれば、サンプル液を、粒子(A)に接触させることを含む。
接触方法は、特に制限されず、例えば、サンプル液に、粒子(A)を投入して接触を行うことができる。
サンプル液を粒子(A)と好適に接触させる観点から、転倒混和、撹拌、超音波処理等により、接触機会を増加させることが好ましい。
また、より簡便にサンプル液を粒子(A)に接触させる観点から、粒子(A)を充填したカラムに、サンプル液を通液することにより接触を行うこともできる。
サンプル液および粒子(A)の接触時間は、30分以下であることが好ましく、1~10分であることがより好ましい。接触時間が30分以下であると、環境水等の迅速な検査が可能となることから好ましい。
また、接触時の温度は、4~40℃であることが好ましく、10~30℃であることがより好ましい。接触時の温度が上記範囲にあると、ウイルスの死滅等を防止または抑制できることから好ましい。
さらに、接触時における溶媒中の塩濃度は、500mM以下であることが好ましく、100mM以下であることがより好ましく、50mM以下であることがさらに好ましく、1~30mMであることが特に好ましく、1~10mMであることが最も好ましい。溶媒における塩濃度が500mM以下であると、ウイルスとフミン酸の凝集を防止または抑制できることから好ましい。
また、接触時における溶媒中のpHは、3~10であることが好ましく、4~9であることがより好ましい。溶媒のpHが上記範囲にあると、ウイルスの死滅等を防止または抑制できることから好ましい。
[分離]
一実施形態において、精製ウイルス液の製造方法は、サンプル液と、粒子(A)と、を接触させて得られる混合液から、粒子(A)およびフミン酸を分離する工程を有する。これにより、混合液中からフミン酸を分離することができ、精製ウイルス液を製造することができる。
一実施形態において、精製ウイルス液の製造方法は、サンプル液と、粒子(A)と、を接触させて得られる混合液から、粒子(A)およびフミン酸を分離する工程を有する。これにより、混合液中からフミン酸を分離することができ、精製ウイルス液を製造することができる。
なお、前記分離においては、接触条件等に応じて、ウイルスおよびフミン酸の粒子(A)への吸着状態が異なることから、フミン酸とともに、ウイルスの少なくとも一部が併せて混合液から分離されることがある。
分離方法としては、特に制限されず、公知の方法によって行うことができる。具体的な分離方法としては、例えば、ろ過、デカンテーション、遠心分離、上澄み液の回収等が挙げられる。
なお、必要に応じて、分離に使用した器具、分離した溶液等は、溶媒で洗浄し、得られた洗浄液を精製ウイルス液に混合してもよい。
上述の接触および分離は、2度以上繰り返してもよい。接触および分離を2度以上繰り返すことにより、さらに精製された精製ウイルス液を得ることができる。
接触および分離を2度以上行う場合には、それぞれ異なる条件、方法で接触および分離を行ってもよい。サンプル液または接触および分離によって得られた溶液中の夾雑物の種類、含有量等の状況に応じて適した接触および分離を行うことで、効率的な精製が可能となりうる。
<第2の実施形態>
本実施形態によれば、ウイルスおよびフミン酸を含むサンプル液を、カチオン性基を有し平均粒径が1~3000μmである粒子(A)および負の表面電荷を有し平均粒径が10~100nmである粒子(B)に接触させることを含む、精製ウイルス液の製造方法が提供される。前記粒子(B)を併用することにより、フミン酸を好適に分離することができる。
本実施形態によれば、ウイルスおよびフミン酸を含むサンプル液を、カチオン性基を有し平均粒径が1~3000μmである粒子(A)および負の表面電荷を有し平均粒径が10~100nmである粒子(B)に接触させることを含む、精製ウイルス液の製造方法が提供される。前記粒子(B)を併用することにより、フミン酸を好適に分離することができる。
以下、図面を参照しながら、第2の実施形態を説明するが、以下の形態のみに制限されない。なお、図面の寸法比率は、説明の都合上誇張されており、実際の比率とは異なる場合がある。
図1は、第2の実施形態に係るサンプル液、粒子(A)、および粒子(B)の模式図である。図1によると、本形態に係るサンプル液1は、ウイルス2およびフミン酸3を含む。この際、ウイルス2は、表面電荷として正電荷および負電荷を有する。一方、フミン酸3は、表面電荷として負電荷を有する。また、本形態に係る粒子(A)4はカチオン性基を有することから、表面電荷として正電荷を有する。この際、粒子(A)4の平均粒径は1~3000μmである。さらに、本形態に係る粒子(B)5は負の表面電荷を有する。この際、粒子(B)5の平均粒径は10~100nmである。
図2は、第2の実施形態に係るサンプル液を、粒子(A)および粒子(B)に接触させた場合の模式図である。図2によると、粒子(A)4は表面電荷として正電荷を有することから、表面電荷として負電荷を有するウイルス2、フミン酸3、および粒子(B)5は、粒子(A)4に吸着しうる。この際、ウイルス2は、表面電荷として正電荷をも有しうることから、フミン酸3および粒子(B)5よりも相対的に吸着しにくい傾向がある。その結果、ウイルス2は粒子(A)4に吸着されず、フミン酸3は粒子(A)4に吸着されるという状況を形成することができる。そうすると、フミン酸3の吸着後、粒径が大きく容易に分離することができる粒子(A)4をサンプル液から分離することにより、粒子(A)4に吸着されたフミン酸3(および粒子(B)5)も併せてサンプル液から分離することができる。その結果、フミン酸が除去された精製ウイルス液を得ることができる。
なお、粒子(B)5は、ウイルス2の粒子(A)4への吸着と競合し、ウイルス2の粒子(A)4への吸着を阻害することで、ウイルス2がサンプル液から除去されることを防止しており、ウイルス2の回収率の向上に寄与している。この際、粒子(B)5は、ウイルスと同程度の平均粒径を有し、仮に精製ウイルス液に残存してもRNA抽出工程で除去されるためPCR反応の阻害等を起こさない、またはほとんど起こさないことから、ウイルスの検出等に悪影響を及ぼさない。
したがって、粒子(A)4および粒子(B)5により、サンプル液からフミン酸4を選択的に除去することができる。
なお、上記ウイルス精製のメカニズムは、あくまで推定のものであり、上記メカニズム以外のメカニズムによって本発明の効果が得られる場合であっても、本発明の技術的範囲に含まれる。
[サンプル液]
サンプル液は、第1の実施形態と同様であることから、ここでは説明を省略する。
サンプル液は、第1の実施形態と同様であることから、ここでは説明を省略する。
ただし、第2の実施形態は、その推定メカニズムからも明らかなように、フミン酸濃度が低い場合に、特に高い効果を発揮しうる。具体的には、サンプル液中のフミン酸濃度は、10000ppm以下であることが好ましく、1~5000ppmであることがより好ましい。サンプル液中のフミン酸濃度が10000ppm以下であると、ウイルスの粒子(A)への吸着に対する粒子(B)の競合阻害作用を効果的に発揮することができ、結果としてフミン酸を選択的に除去できることから好ましい。
[粒子(A)]
粒子(A)は、第1の実施形態と同様のものが用いられうることから、ここでは説明を省略する。
粒子(A)は、第1の実施形態と同様のものが用いられうることから、ここでは説明を省略する。
[粒子(B)]
粒子(B)は、負の表面電荷を有する。粒子(B)が、負の表面電荷を有することにより、相対的に負の表面電荷を有するウイルスの粒子(A)への吸着を防止または抑制し、ウイルスの回収率を向上させることができる。なお、本明細書において、「負の表面電荷を有する」とは、負のゼータ電位を有することを意味する。なお、ゼータ電位は、電気泳動光散乱測定法によって、Smoluchowskiの式を用いることで測定することができる。
粒子(B)は、負の表面電荷を有する。粒子(B)が、負の表面電荷を有することにより、相対的に負の表面電荷を有するウイルスの粒子(A)への吸着を防止または抑制し、ウイルスの回収率を向上させることができる。なお、本明細書において、「負の表面電荷を有する」とは、負のゼータ電位を有することを意味する。なお、ゼータ電位は、電気泳動光散乱測定法によって、Smoluchowskiの式を用いることで測定することができる。
粒子(B)のゼータ電位は、好ましくは-5~-100mV、より好ましくは-10~-50mVである。粒子(B)のゼータ電位が-5mV以上であると、ウイルスの粒子(A)の吸着を防止しやすいため好ましい。粒子(B)のゼータ電位が-100mV以下であると、粒子(B)の調製が容易であるため好ましい。
また、粒子(B)の平均粒径は、好ましくは10~100nm、より好ましくは20~80nm、さらに好ましくは40~70nmである。粒子(B)の平均粒径が10nm以上であると、溶液中での凝集を防止し、粒子(B)としての機能を好適に発揮できることから好ましい。一方、粒子(B)の平均粒径が100nm以下であると、ウイルスの粒子(A)への吸着を阻害する効果を得ることができ、粒子(B)としての機能を好適に発揮できることから好ましい。
粒子(B)の平均粒径は、動的光散乱法によって測定することができる。
粒子(B)は、通常、アニオン性基を有する第2の粒子状材料を含む構成を有する。なお、本明細書において、「アニオン性基」とは、pH8~14の溶液中において、少なくとも一部がアニオン性を有する基を意味する。アニオン性基の種類、官能基量を適宜調整することにより、粒子(B)の表面電荷を制御することができる。
(第2の粒子状材料)
第2の粒子状材料としては、特に制限されないが、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリアミドポリエステル、ポリエチレンテレフタート(PET)、ポリカーボネート(PC)、ポリウレタン、ポリアクリル、ポリエポキシ、ポリスルホン、ポリテトラフルオロエチレン、シリカ、アルミナが挙げられる。これらのうち、第2の粒子状材料としては、ポリスチレン、ポリウレタン、ポリアクリル、ポリエポキシ、シリカ、アルミナを用いることが好ましい。すなわち、一実施形態において、粒子(B)が、アニオン性基を有するポリスチレン、アニオン性基を有するポリウレタン、アニオン性基を有するポリアクリル、アニオン性基を有するポリエポキシ、アニオン性基を有するシリカ、およびアニオン性基を有するアルミナからなる群から選択される少なくとも1つを含むことが好ましい。
第2の粒子状材料としては、特に制限されないが、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリアミドポリエステル、ポリエチレンテレフタート(PET)、ポリカーボネート(PC)、ポリウレタン、ポリアクリル、ポリエポキシ、ポリスルホン、ポリテトラフルオロエチレン、シリカ、アルミナが挙げられる。これらのうち、第2の粒子状材料としては、ポリスチレン、ポリウレタン、ポリアクリル、ポリエポキシ、シリカ、アルミナを用いることが好ましい。すなわち、一実施形態において、粒子(B)が、アニオン性基を有するポリスチレン、アニオン性基を有するポリウレタン、アニオン性基を有するポリアクリル、アニオン性基を有するポリエポキシ、アニオン性基を有するシリカ、およびアニオン性基を有するアルミナからなる群から選択される少なくとも1つを含むことが好ましい。
上述の第2の粒子状物質は、単独で用いても、2種以上を組み合わせて用いてもよい。
第2の粒子状材料の平均粒径は、通常、粒子(B)と同様であり、好ましくは10~100nm、より好ましくは20~80nm、さらに好ましくは40~70nmである。
(アニオン性基)
アニオン性基としては、特に制限されないが、カルボキシ基、スルホン基、スルホンアミド基、リン酸基、シラノール基等が挙げられる。
アニオン性基としては、特に制限されないが、カルボキシ基、スルホン基、スルホンアミド基、リン酸基、シラノール基等が挙げられる。
前記カルボキシ基は、「-COOH」で表される。
前記スルホン基は、「-SO3H」で表される。
前記スルホンアミド基は、通常、「-SO2NR6
2」で表される。この際、前記R6は、それぞれ独立して、R1と同様である。スルホンアミド基の具体例としては、アミノスルホニル基、メチルアミノスルホニル基等が挙げられる。ただし、スルホンアミド基を好適にアニオン化させる観点から、R6の少なくとも1つは水素原子またはハロゲン原子であることが好ましく、水素原子であることがより好ましい。なお、スルホンアミド基は、通常、pH8~14の溶液中において、少なくとも一部は前記R6が脱離(例えば、脱プロトン化)されることにより、窒素原子がアニオン性を示しうる。
前記リン酸基は、「-OP(O)(OH)2」で表される。
前記シラノール基は、「-SiOH」で表される。
上述のアニオン性基のうち、アニオン性基は、カルボキシ基、スルホン基、リン酸基、およびシラノール基からなる群から選択される少なくとも1つを含むことが好ましく、カルボキシ基、スルホン基であることがより好ましい。
粒子(B)が有するアニオン性基のpKaとしては、1~7であることが好ましく、1~5であることがより好ましい。粒子(B)が有するアニオン性基のpKaが1以上であると、アニオン性基の調製が容易であることから好ましい。一方、粒子(B)が有するアニオン性基のpKaが7以下であると、中性条件で粒子(B)がアニオン性を有することから、サンプルのpH調整が容易であるため好ましい。なお、本明細書において、「粒子(B)が有するアニオン性基のpKa」の値は、粒子(B)を塩基で滴定した際の滴定値から、ヘンダーソン・ハッセルバルヒの式により算出された計算値を採用するものとする。
アニオン性基の官能基量としては、特に制限されないが、10~5000μmol/mLであることが好ましく、100~3000μmol/mLであることがより好ましい。アニオン性基の官能基量が10μmol/mL以上であると、粒子(B)の安定性が高まることから好ましい。一方、アニオン性基の官能基量が5000μmol/mL以下であると、粒子(B)の粒子径制御が容易であることから好ましい。
(介在基)
粒子(B)においても、アニオン性基は、介在基を介して第2の粒子状材料に結合していてもよい。
粒子(B)においても、アニオン性基は、介在基を介して第2の粒子状材料に結合していてもよい。
介在基を介することにより、第2の粒子状材料に好適にアニオン性基を導入することができる。
当該介在基としては、特に制限されないが、上述のものが挙げられる。
上述の介在基は、粒子(B)中に単独で有していても、2種以上を有していてもよい。
(粒子(B)の製造方法)
粒子(B)は、第2の粒子状材料がアニオン性基を有する場合には、そのまま使用することができる。
粒子(B)は、第2の粒子状材料がアニオン性基を有する場合には、そのまま使用することができる。
アニオン性基を有する第2の粒子状材料の製造法としては、乳化重合法やミニエマルション重合法、マイクロエマルション重合法、懸濁重合法といった水系での各種ラジカル重合法や、溶剤中でアニオン性基を有するアクリル樹脂、ウレタン樹脂、エポキシ樹脂等を合成した後、水系溶媒に転相乳化させることによって製造する方法などがある。
第2の粒子状材料がアニオン性基を有さない場合には、第2の粒子状材料にアニオン性基を導入することで、粒子(B)を製造することができる。
一実施形態において、第2の粒子状材料がポリスチレンのような反応性基を有する場合には、例えば、硫酸溶液中でパラホルムアルデヒドを適量添加し、加熱することでアニオン性基であるスルホン酸基を直接導入することができる。また、別の一実施形態において、第2の粒子状材料がポリエチレンのような反応性基を有しない場合には、反応性モノマーの導入等をすることで、所望のアニオン性基を導入することができる。
前記反応性モノマーとしては、特に制限されないが、スチレン、グリシジルメタクリレート、スチレン、クロロメチルスチレン、アクロレイン、ビニルピリジン、アクリロニトリル等が挙げられる。これらの反応性モノマーは、単独で用いても、2種以上を組み合わせて用いてもよい。
また、第2の粒子状材料の表面にアニオン性基を有する界面活性剤を疎水性相互作用によって物理吸着させることによっても、前期アニオン性基を導入することが可能である。このようなアニオン性基を有する界面活性剤としては、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムなどがある。
[接触]
第2の実施形態に係る精製ウイルス液の製造方法によれば、サンプル液を、粒子(A)および粒子(B)に接触させることを含む。
第2の実施形態に係る精製ウイルス液の製造方法によれば、サンプル液を、粒子(A)および粒子(B)に接触させることを含む。
接触方法は、特に制限されず、(1)サンプル液に、粒子(A)および粒子(B)を投入して接触を行ってもよいし、(2)粒子(A)を含む溶液および粒子(B)を含む溶液をそれぞれ調製し、これらをサンプル液と混合して接触を行ってもよいし、(3)粒子(A)および粒子(B)を含む混合液を調製し、これをサンプル液と混合して接触を行ってもよい。
サンプル液と、粒子(A)および粒子(B)との接触順序も特に制限されず、粒子(A)を先にサンプル液と接触させてもよいし、粒子(B)を先にサンプル液と接触させてもよいし、粒子(A)および粒子(B)を交互に接触させてもよいし、粒子(A)および粒子(B)を同時に接触させてもよい。これらのうち、サンプル液中におけるウイルスの粒子(A)への過度な吸着を防止する観点から、粒子(B)を先に接触させる方法、粒子(A)および粒子(B)を同時に接触させる方法を適用することが好ましく、粒子(A)および粒子(B)を同時に接触させる方法を適用することがより好ましい。
サンプル液並びに粒子(A)および粒子(B)の接触方法、接触時間、接触時の温度、塩濃度、接触時における溶媒のpHについては、第1の実施形態と同様であるため、ここでは説明を省略する。
[分離]
一実施形態において、精製ウイルス液の製造方法は、サンプル液と、粒子(A)と、粒子(B)とを接触させて得られる混合液から、少なくとも粒子(A)およびフミン酸を分離する工程を有する。これにより、混合液中からフミン酸を分離することができ、精製ウイルス液を製造することができる。
一実施形態において、精製ウイルス液の製造方法は、サンプル液と、粒子(A)と、粒子(B)とを接触させて得られる混合液から、少なくとも粒子(A)およびフミン酸を分離する工程を有する。これにより、混合液中からフミン酸を分離することができ、精製ウイルス液を製造することができる。
なお、前記分離においては、接触条件等に応じて、ウイルス、フミン酸、および粒子(B)の粒子(A)への吸着状態が異なることから、フミン酸とともに、ウイルス、粒子(B)の少なくとも一部が併せて混合液から分離されることがある。
具体的な分離方法については、第1の実施形態と同様であることから、ここでは説明を省略する。
<ウイルス検出方法>
本発明の一形態によれば、精製ウイルス液を製造する工程(1)と、前記精製ウイルス液中のウイルスを検出する工程(2)と、を含むウイルス検出方法が提供される。
本発明の一形態によれば、精製ウイルス液を製造する工程(1)と、前記精製ウイルス液中のウイルスを検出する工程(2)と、を含むウイルス検出方法が提供される。
[工程(1)]
工程(1)は、精製ウイルス液を製造する工程である。当該工程においては、第1の実施形態、第2の実施形態のいずれのものを適用してもよいし、両者をともに適用してもよい。これにより、サンプル液から精製ウイルス液を製造することができる。
工程(1)は、精製ウイルス液を製造する工程である。当該工程においては、第1の実施形態、第2の実施形態のいずれのものを適用してもよいし、両者をともに適用してもよい。これにより、サンプル液から精製ウイルス液を製造することができる。
なお、その他、必要に応じて、公知の精製方法をさらに組み合わせてもよい。
[工程(2)]
工程(2)は、工程(1)で得られた精製ウイルス液中のウイルスを検出する工程である。
工程(2)は、工程(1)で得られた精製ウイルス液中のウイルスを検出する工程である。
一実施形態において、精製ウイルス液は、工程(1)で得られた精製ウイルス液は環境水等により採取されたサンプルをサンプル液として使用し、これを精製して得られたものであることから、精製ウイルス液中のウイルス量は微量である。よって、好ましい一実施形態において、工程(2)は、NAT法を適用することによりウイルスを検出することが好ましい。より詳細には、工程(2)は、好ましくは、精製ウイルス液を濃縮する濃縮工程、精製ウイルス液から核酸を抽出する抽出工程、抽出した核酸を精製する精製工程、精製した核酸を用いてウイルスを検出するウイルス検出工程を含む。なお、必要に応じて、上記工程の少なくとも1つを省略しても、公知の技術を組み合わせてもよい。
(濃縮工程)
濃縮工程は、工程(1)で得られた精製ウイルス液を濃縮し、ウイルス濃度を増加させる工程である。
濃縮工程は、工程(1)で得られた精製ウイルス液を濃縮し、ウイルス濃度を増加させる工程である。
濃縮方法としては、特に制限されず、公知の技術を適用することができる。例えば、陽電荷膜法、陰電荷膜法、ポリエチレングリコール沈殿法、限外ろ過法等が挙げられる。これらの技術は、単独で適用しても、2種以上を組み合わせて適用してもよい。
(抽出工程)
抽出工程としては、特に制限はなく、公知の技術が適用されうる。核酸の抽出方法の具体例としては、フェノール・クロロホルム抽出法、界面活性剤やプロテアーゼを併用した抽出法等が挙げられる。これらの技術は、単独で適用しても、2種以上を組み合わせて適用してもよい。
抽出工程としては、特に制限はなく、公知の技術が適用されうる。核酸の抽出方法の具体例としては、フェノール・クロロホルム抽出法、界面活性剤やプロテアーゼを併用した抽出法等が挙げられる。これらの技術は、単独で適用しても、2種以上を組み合わせて適用してもよい。
(精製工程)
精製工程についても特に制限はなく、例えば、液相抽出法、エタノール沈殿法、スピンカラム法等により抽出した核酸を精製することができる。これらの技術は、単独で適用しても、2種以上を組み合わせて適用してもよい。
精製工程についても特に制限はなく、例えば、液相抽出法、エタノール沈殿法、スピンカラム法等により抽出した核酸を精製することができる。これらの技術は、単独で適用しても、2種以上を組み合わせて適用してもよい。
(ウイルス検出工程)
NAT法では、通常、ウイルスに特異なプライマーを利用した検出、ウイルス核酸を増幅させた後にハイブリダイゼーションを利用する検出等が行われる。
NAT法では、通常、ウイルスに特異なプライマーを利用した検出、ウイルス核酸を増幅させた後にハイブリダイゼーションを利用する検出等が行われる。
ウイルスに特異的なプライマーを利用した検出の場合、ウイルスに特異的なプライマーを用いて核酸増幅を行い、増幅が認められればウイルスが存在することが判明する。
また、ウイルス核酸を増幅させた後にハイブリダイゼーションを利用する検出の場合、核酸増幅を行い、増幅した核酸について、酵素免疫法(EIA)、蛍光抗体法(FA)、サザンブロットハイブリダイゼーション等を適用することにより、ウイルスの存在を判断することができる。
この際、上述のウイルス検出工程においては、核酸の増幅を含む。当該核酸増幅法としては、特に制限されないが、上述のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)やリガーゼ連鎖反応(LCR)を用いた方法の他、転写媒介増幅(TMA)法、鎖置換反応(LAMP)法、等温遺伝子増幅(ICAN)法、核酸配列増幅(NASBA)法等が挙げられる。
一実施形態において、工程(1)で得られた精製ウイルス液にはフミン酸が含まれていない、またはほとんど含まれていないため、ウイルス検出工程における核酸増幅が阻害されず、またはほとんど阻害されないため、結果として、好適にウイルス検出を行うことができる。
以下、実施例を用いて本発明を説明するが、本発明は実施例の記載に制限されるものではない。また、実施例において特段の記載がない場合、部及び%は質量基準である。
まず、第1の実施形態について説明する。
[試験用のサンプル液]
試験用のサンプル液を調製した。
試験用のサンプル液を調製した。
<調製例1-1>
精製水にフミン酸(ナカライテスク株式会社)を10000μg/mLとなるように添加し、水酸化ナトリウム溶液を用いてpHを7.3に調整することで、フミン酸溶液を調製した。
精製水にフミン酸(ナカライテスク株式会社)を10000μg/mLとなるように添加し、水酸化ナトリウム溶液を用いてpHを7.3に調整することで、フミン酸溶液を調製した。
また、精製水にQβファージ(NBRC20012)を終濃度1012PFU/mLとなるように調整してファージ溶液を調製した。
そして、フミン酸濃度、ファージ濃度、およびpHが、それぞれ100μg/mL、1010PFU/mL、およびpH5.0となるように、上記で調製したフミン酸溶液およびファージ溶液、並びにクエン酸緩衝液を混合してサンプル液を調製した。この際、クエン酸緩衝液の塩濃度は適宜調整した。
<調製例1-2>
調製例1-1と同様の方法で、フミン酸溶液およびファージ溶液を調製した。
調製例1-1と同様の方法で、フミン酸溶液およびファージ溶液を調製した。
フミン酸濃度、ファージ濃度、およびpHが、それぞれ100μg/mL、1010PFU/mL、およびpH4.0となるように、フミン酸溶液、ファージ溶液、およびクエン酸緩衝液を混合してサンプル液を調製した。この際、クエン酸緩衝液の塩濃度は適宜調整した。
<調製例1-3>
調製例1-1と同様の方法で、フミン酸溶液およびファージ溶液を調製した。
調製例1-1と同様の方法で、フミン酸溶液およびファージ溶液を調製した。
フミン酸濃度、ファージ濃度、およびpHが、それぞれ100μg/mL、1010PFU/mL、およびpH7.0となるように、フミン酸溶液、ファージ溶液、およびリン酸緩衝液を混合してサンプル液を調製した。この際、リン酸緩衝液の塩濃度は適宜調整した。
<調製例1-4>
調製例1-1と同様の方法で、フミン酸溶液およびファージ溶液を調製した。
調製例1-1と同様の方法で、フミン酸溶液およびファージ溶液を調製した。
フミン酸濃度、ファージ濃度、およびpHが、それぞれ100μg/mL、1010PFU/mL、およびpH4.0となるように、フミン酸溶液、ファージ溶液、および酢酸緩衝液を混合してサンプル液を調製した。この際、酢酸緩衝液の塩濃度は適宜調整した。
<調製例1-5>
調製例1-1と同様の方法で、フミン酸溶液およびファージ溶液を調製した。
調製例1-1と同様の方法で、フミン酸溶液およびファージ溶液を調製した。
フミン酸濃度およびファージ濃度が、それぞれ100μg/mLおよび1010PFU/mLとなるように、フミン酸溶液、ファージ溶液、およびイオン交換水を混合してサンプル液を調製した。なお、調製したサンプル液のpHは7.3である。
<調製例1-6>
調製例1-1と同様の方法で、フミン酸溶液およびファージ溶液を調製した。
調製例1-1と同様の方法で、フミン酸溶液およびファージ溶液を調製した。
フミン酸濃度、ファージ濃度、およびpHが、それぞれ1000μg/mL、1010PFU/mL、およびpH5.0となるように、フミン酸溶液、ファージ溶液、およびクエン酸緩衝液を混合してサンプル液を調製した。この際、クエン酸緩衝液の塩濃度は適宜調整した。
<調製例1-7>
調製例1-1と同様の方法で、フミン酸溶液およびファージ溶液を調製した。
調製例1-1と同様の方法で、フミン酸溶液およびファージ溶液を調製した。
フミン酸濃度、ファージ濃度、およびpHが、それぞれ10μg/mL、1010PFU/mL、およびpH5.0となるように、フミン酸溶液、ファージ溶液、およびクエン酸緩衝液を混合してサンプル液を調製した。この際、クエン酸緩衝液の塩濃度は適宜調整した。
調製例1-1~1-7で調製したサンプル液を下記表1に示す。
[粒子(A)等]
・DEAE
Sepharose 6B FF DEAE(以下、単に「DEAE」と称することがある)(GE helthcare社製)を粒子(A)として準備した。DEAEの材料は、アガロースゲルであり、カチオン性基である-NH(C2H5)2を有する。なお、DEAEは、平均粒径が90μmであり、アミノ基量が135μmol/mLであり、排除限界分子量が1000kDaであり、総表面積が246.7cm2/mLである。
・DEAE
Sepharose 6B FF DEAE(以下、単に「DEAE」と称することがある)(GE helthcare社製)を粒子(A)として準備した。DEAEの材料は、アガロースゲルであり、カチオン性基である-NH(C2H5)2を有する。なお、DEAEは、平均粒径が90μmであり、アミノ基量が135μmol/mLであり、排除限界分子量が1000kDaであり、総表面積が246.7cm2/mLである。
・celfine-Amino
celfine-Amino(JNC株式会社製)を粒子(A)として準備した。celfine-Aminoの材料はセルロースゲルであり、当該セルロースゲルは-OCH2CH(OH)CH2基を介してカチオン性基であるアミノ基(-NH2)を有している。なお、celfine-Aminoは、平均粒径が165μmであり、アミノ基量が17.5μmol/mLであり、表面積が133cm2/mLである。
celfine-Amino(JNC株式会社製)を粒子(A)として準備した。celfine-Aminoの材料はセルロースゲルであり、当該セルロースゲルは-OCH2CH(OH)CH2基を介してカチオン性基であるアミノ基(-NH2)を有している。なお、celfine-Aminoは、平均粒径が165μmであり、アミノ基量が17.5μmol/mLであり、表面積が133cm2/mLである。
・SA-10A
SA-10A(三菱化学株式会社製)を粒子(A)として準備した。SA-10Aの材料はスチレン系陰イオン交換樹脂であり、スチレンの芳香族基に-CH2基を介してカチオン性基であるトリメチルアンモニウム基(-N+(CH3)3)基が結合した構造を有する。なお、SA-10Aは、平均粒径が700μmであり、アミノ基量が1300μmol/mLであり、表面積が31.7cm2/mLである。
SA-10A(三菱化学株式会社製)を粒子(A)として準備した。SA-10Aの材料はスチレン系陰イオン交換樹脂であり、スチレンの芳香族基に-CH2基を介してカチオン性基であるトリメチルアンモニウム基(-N+(CH3)3)基が結合した構造を有する。なお、SA-10Aは、平均粒径が700μmであり、アミノ基量が1300μmol/mLであり、表面積が31.7cm2/mLである。
・シリカゲル
シリカゲルビーズであるシリカゲル60N(63-210μm)(関東化学株式会社製)を準備した。なお、シリカゲル60Nの平均粒径は、120μmである。
シリカゲルビーズであるシリカゲル60N(63-210μm)(関東化学株式会社製)を準備した。なお、シリカゲル60Nの平均粒径は、120μmである。
使用した粒子(A)等を下記表2に示す。
<実施例1-1>
[工程(1)]
(サンプル液と、粒子(A)との接触)
調製例1-1で調製したサンプル液1mL(pH5クエン酸緩衝液、塩濃度:500mM)に、粒子(A)として洗浄処理を行ったDEAEをスピンダウン後の容積として30μLになるように投入し、10分間転倒混和した後、静置した。
[工程(1)]
(サンプル液と、粒子(A)との接触)
調製例1-1で調製したサンプル液1mL(pH5クエン酸緩衝液、塩濃度:500mM)に、粒子(A)として洗浄処理を行ったDEAEをスピンダウン後の容積として30μLになるように投入し、10分間転倒混和した後、静置した。
なお、この場合において、粒子(A)の総表面積を上記式(1)で計算したところ、7.4cm2となり、フミン酸量は100μgである。よって、粒子(A)に対するフミン酸量は、13.5μg/cm2である。
(精製)
粒子(A)をスピンダウンして上澄み、すなわち精製ウイルス液を回収した。
粒子(A)をスピンダウンして上澄み、すなわち精製ウイルス液を回収した。
[工程(2)]
精製ウイルス液中のフミン酸量およびファージ量を定量し、下記式(2)および(3)により、フミン酸除去率およびウイルス除去率を算出した。
精製ウイルス液中のフミン酸量およびファージ量を定量し、下記式(2)および(3)により、フミン酸除去率およびウイルス除去率を算出した。
精製ウイルス液中のフミン酸量を、260nmの吸光度測定にて定量したところ、27μg/cm2であった。
よって、フミン酸回収率は27%(すなわち、フミン酸除去率は73%)であった。
また、ファージ量については以下のように定量した。
すなわち、QIAGEN MinElute Virus Spinキット(株式会社キアゲン製)を用いてファージRNAを抽出した。次いで、Journal of Virological Methods 149 (2008), p123-128に従って、プライマーおよびプローブを作製し、StepOnePlusリアルタイムPCRシステム(ライフテクノロジーズジャパン株式会社製)を用いて、抽出したRNAを測定することで精製ウイルス液中のファージ量を求めた。
定量されたファージ量は、5.7×1010PFU/mLであった。
よって、ウイルス回収率は57%(すなわち、ウイルス除去率は43%)であった。
また、フミン酸除去率/ウイルス除去率を算出したところ、1.7であった。
<実施例1-2>
サンプル液1mL(pH5クエン酸緩衝液、塩濃度:500mM)に代えて、サンプル液1mL(pH5クエン酸緩衝液、塩濃度:100mM)を使用したことを除いては、実施例1-1と同様の方法で精製ウイルス液を調製した。
サンプル液1mL(pH5クエン酸緩衝液、塩濃度:500mM)に代えて、サンプル液1mL(pH5クエン酸緩衝液、塩濃度:100mM)を使用したことを除いては、実施例1-1と同様の方法で精製ウイルス液を調製した。
実施例1-1と同様の方法でフミン酸回収率を測定したところ16.8%(すなわち、フミン酸除去率は83.2%)であった。また、実施例1-1と同様の方法でウイルス回収率を測定したところ67.8%(すなわち、ウイルス除去率は32.2%)であった。
よって、フミン酸除去率/ウイルス除去率は、2.6である。
<実施例1-3>
サンプル液1mL(pH5クエン酸緩衝液、塩濃度:500mM)に代えて、サンプル液1mL(pH5クエン酸緩衝液、塩濃度:50mM)を使用したことを除いては、実施例1-1と同様の方法で精製ウイルス液を調製した。
サンプル液1mL(pH5クエン酸緩衝液、塩濃度:500mM)に代えて、サンプル液1mL(pH5クエン酸緩衝液、塩濃度:50mM)を使用したことを除いては、実施例1-1と同様の方法で精製ウイルス液を調製した。
実施例1-1と同様の方法でフミン酸回収率を測定したところ24.7%(すなわち、フミン酸除去率は75.3%)であった。また、実施例1-1と同様の方法でウイルス回収率を測定したところ99.0%(すなわち、ウイルス除去率は1.0%)であった。
よって、フミン酸除去率/ウイルス除去率は、75.3である。
<実施例1-4>
サンプル液1mL(pH5クエン酸緩衝液、塩濃度:500mM)に代えて、サンプル液1mL(pH5クエン酸緩衝液、塩濃度:10mM)を使用したことを除いては、実施例1-1と同様の方法で精製ウイルス液を調製した。
サンプル液1mL(pH5クエン酸緩衝液、塩濃度:500mM)に代えて、サンプル液1mL(pH5クエン酸緩衝液、塩濃度:10mM)を使用したことを除いては、実施例1-1と同様の方法で精製ウイルス液を調製した。
実施例1-1と同様の方法でフミン酸回収率を測定したところ17.8%(すなわち、フミン酸除去率は82.2%)であった。また、実施例1-1と同様の方法でウイルス回収率を測定したところ99.0%(すなわち、ウイルス除去率は1.0%)であった。
よって、フミン酸除去率/ウイルス除去率は、82.2である。
<実施例1-5>
工程1において、DEAEのスピンダウン後の容積としての投入量30μLを150μLに変更し、サンプル液1mL(pH5クエン酸緩衝液、塩濃度:500mM)に代えて、サンプル液1mL(pH5クエン酸緩衝液、塩濃度:1mM)を使用したことを除いては、実施例1-1と同様の方法で精製ウイルス液を調製した。
工程1において、DEAEのスピンダウン後の容積としての投入量30μLを150μLに変更し、サンプル液1mL(pH5クエン酸緩衝液、塩濃度:500mM)に代えて、サンプル液1mL(pH5クエン酸緩衝液、塩濃度:1mM)を使用したことを除いては、実施例1-1と同様の方法で精製ウイルス液を調製した。
なお、この場合において、粒子(A)の総表面積を上記式(1)で計算したところ、37cm2であり、フミン酸量は100μgである。よって、粒子(A)に対するフミン酸量は、2.7μg/cm2である。
実施例1-1と同様の方法でフミン酸回収率を測定したところ7.3%(すなわち、フミン酸除去率は92.7%)であった。また、実施例1-1と同様の方法でウイルス回収率を測定したところ86.3%(すなわち、ウイルス除去率は13.7%)であった。
よって、フミン酸除去率/ウイルス除去率は、6.7である。
<実施例1-6>
サンプル液1mL(pH5クエン酸緩衝液、塩濃度:1mM)を調製例1-2で調製したサンプル液1mL(pH4クエン酸緩衝液、塩濃度:1mM)に変更したことを除いては、実施例1-5と同様の方法で精製ウイルス液を調製した。
サンプル液1mL(pH5クエン酸緩衝液、塩濃度:1mM)を調製例1-2で調製したサンプル液1mL(pH4クエン酸緩衝液、塩濃度:1mM)に変更したことを除いては、実施例1-5と同様の方法で精製ウイルス液を調製した。
実施例1-1と同様の方法でフミン酸回収率を測定したところ10.6%(すなわち、フミン酸除去率は89.4%)であった。また、実施例1-1と同様の方法でウイルス回収率を測定したところ78.4%(すなわち、ウイルス除去率は21.6%)であった。
よって、フミン酸除去率/ウイルス除去率は、4.1である。
<実施例1-7>
工程1において、調製例1-1で調製したサンプル液(pH5クエン酸緩衝液、塩濃度:1mM)に代えて、調製例1-3で調製したサンプル液(リン酸緩衝液、塩濃度:1mM)を用いたことを除いては、実施例1-5と同様の方法で精製ウイルス液を調製した。
工程1において、調製例1-1で調製したサンプル液(pH5クエン酸緩衝液、塩濃度:1mM)に代えて、調製例1-3で調製したサンプル液(リン酸緩衝液、塩濃度:1mM)を用いたことを除いては、実施例1-5と同様の方法で精製ウイルス液を調製した。
実施例1-1と同様の方法でフミン酸回収率を測定したところ7.5%(すなわち、フミン酸除去率は92.5%)であった。また、実施例1-1と同様の方法でウイルス回収率を測定したところ99.0%(すなわち、ウイルス除去率は1.0%)であった。
よって、フミン酸除去率/ウイルス除去率は、94.6である。
<実施例1-8>
工程1において、DEAEのスピンダウン後の容積としての投入量30μLを300μLに変更し、サンプル液1mL(pH5クエン酸緩衝液、塩濃度:500mM)に代えて、サンプル液1mL(pH5クエン酸緩衝液、塩濃度:1mM)を使用したことを除いては、実施例1-1と同様の方法で精製ウイルス液を調製した。
工程1において、DEAEのスピンダウン後の容積としての投入量30μLを300μLに変更し、サンプル液1mL(pH5クエン酸緩衝液、塩濃度:500mM)に代えて、サンプル液1mL(pH5クエン酸緩衝液、塩濃度:1mM)を使用したことを除いては、実施例1-1と同様の方法で精製ウイルス液を調製した。
なお、この場合において、粒子(A)の総表面積を上記式(1)で計算したところ、74cm2であり、フミン酸量は100μgである。よって、粒子(A)に対するフミン酸量は、1.4μg/cm2である。
実施例1-1と同様の方法でフミン酸回収率を測定したところ2.8%(すなわち、フミン酸除去率は97.2%)であった。また、実施例1-1と同様の方法でウイルス回収率を測定したところ65.7%(すなわち、ウイルス除去率は34.3%)であった。
よって、フミン酸除去率/ウイルス除去率は、2.8である。
<実施例1-9>
工程1において、調製例1-1で調製したサンプル液(pH5クエン酸緩衝液、塩濃度:500mM)に代えて、調製例1-4で調製したサンプル液(酢酸緩衝液、塩濃度:1mM)を用いたことを除いては、実施例1-8と同様の方法で精製ウイルス液を調製した。
工程1において、調製例1-1で調製したサンプル液(pH5クエン酸緩衝液、塩濃度:500mM)に代えて、調製例1-4で調製したサンプル液(酢酸緩衝液、塩濃度:1mM)を用いたことを除いては、実施例1-8と同様の方法で精製ウイルス液を調製した。
実施例1-1と同様の方法でフミン酸回収率を測定したところ3.5%(すなわち、フミン酸除去率は96.5%)であった。また、実施例1-1と同様の方法でウイルス回収率を測定したところ64.1%(すなわち、ウイルス除去率は35.9%)であった。
よって、フミン酸除去率/ウイルス除去率は、2.7である。
<実施例1-10>
工程1において、DEAEに代えて、celfine-Aminoを用いたことを除いては、実施例1-3と同様の方法で精製ウイルス液を調製した。
工程1において、DEAEに代えて、celfine-Aminoを用いたことを除いては、実施例1-3と同様の方法で精製ウイルス液を調製した。
なお、この場合において、粒子(A)の総表面積を上記式(1)で計算したところ、4.0cm2であり、フミン酸量は100μgである。よって、粒子(A)に対するフミン酸量は、25.0μg/cm2である。
実施例1-1と同様の方法でフミン酸回収率を測定したところ24.9%(すなわち、フミン酸除去率は75.1%)であった。また、実施例1-1と同様の方法でウイルス回収率を測定したところ93.5%(すなわち、ウイルス除去率は6.5%)であった。
よって、フミン酸除去率/ウイルス除去率は、11.5である。
<実施例1-11>
工程1において、DEAE30μLに代えて、SA-10Aを300μL投入したことを除いては、実施例1-4と同様の方法で精製ウイルス液を調製した。
工程1において、DEAE30μLに代えて、SA-10Aを300μL投入したことを除いては、実施例1-4と同様の方法で精製ウイルス液を調製した。
なお、この場合において、粒子(A)の総表面積を上記式(1)で計算したところ、9.5cm2であり、フミン酸量は100μgである。よって、粒子(A)に対するフミン酸量は、10.5μg/cm2である。
実施例1-1と同様の方法でフミン酸回収率を測定したところ28.3(すなわち、フミン酸除去率は71.7%)であった。また、実施例1-1と同様の方法でウイルス回収率を測定したところ55.5%(すなわち、ウイルス除去率は44.5%)であった。
よって、フミン酸除去率/ウイルス除去率は、1.6である。
<実施例1-12>
工程1において、調製例1-1で調製したサンプル液に代えて、調製例1-6で調製したサンプル液(クエン酸緩衝液濃度:10mM)を用いたことを除いては、実施例1-8と同様の方法で精製サンプル液を調製した。
工程1において、調製例1-1で調製したサンプル液に代えて、調製例1-6で調製したサンプル液(クエン酸緩衝液濃度:10mM)を用いたことを除いては、実施例1-8と同様の方法で精製サンプル液を調製した。
なお、この場合において、粒子(A)の総表面積は74cm2であり、フミン酸量は1000μgである。よって、粒子(A)に対するフミン酸量は、13.5μg/cm2である。
実施例1-1と同様の方法でフミン酸回収率を測定したところ11.0%(すなわち、フミン酸除去率は89.0%)であった。また、実施例1-1と同様の方法でウイルス回収率を測定したところ77.4%(すなわち、ウイルス除去率は22.6%)であった。
よって、フミン酸除去率/ウイルス除去率は、3.9である。
<比較例1-1>
工程1において、調製例1-2で調製したサンプル液1mL(リン酸緩衝液、塩濃度:1mM)に、シリカゲルビーズ1000μLを投入したことを除いては、実施例1-1と同様の方法で精製ウイルス液を調製した。
工程1において、調製例1-2で調製したサンプル液1mL(リン酸緩衝液、塩濃度:1mM)に、シリカゲルビーズ1000μLを投入したことを除いては、実施例1-1と同様の方法で精製ウイルス液を調製した。
実施例1-1と同様の方法でフミン酸回収率を測定したところ99.0%(すなわち、フミン酸除去率は1.0%)であった。また、実施例1-1と同様の方法でウイルス回収率を測定したところ99.0%(すなわち、ウイルス除去率は1.0%)であった。
よって、フミン酸除去率/ウイルス除去率は、1.0である。
<比較例1-2>
工程1において、調製例1-1で調製したサンプル液に代えて、調製例1-7で調製したサンプル液(クエン酸緩衝液濃度:1mM)を用いたことを除いては、実施例1-1と同様の方法で精製ウイルス液を調製した。
工程1において、調製例1-1で調製したサンプル液に代えて、調製例1-7で調製したサンプル液(クエン酸緩衝液濃度:1mM)を用いたことを除いては、実施例1-1と同様の方法で精製ウイルス液を調製した。
なお、この場合において、粒子(A)の総表面積は37cm2であり、フミン酸量は10μgである。よって、粒子(A)に対するフミン酸量は、0.27μg/cm2である。
実施例1-1と同様の方法でフミン酸回収率を測定したところ3.0%(すなわち、フミン酸除去率は97.0%)であった。また、実施例1-1と同様の方法でウイルス回収率を測定したところ1.0%(すなわち、ウイルス除去率は99.0%)であった。
よって、フミン酸除去率/ウイルス除去率は、0.98である。
実施例1-1~1-12および比較例1-1~1-2をまとめた結果を下記表3~5に示す。
フミン酸除去率/ウイルス除去率の値が大きいほど、フミン酸を選択的に除去することができたといえる。
ここで、表5の結果を見ると、実施例1-1~1-12では、比較例1-1および1-2に対して優位に高い値となっており、特異的にフミン酸を除去できたことが分かる。
次いで、第2の実施形態について説明する。
<実施例2-1>
[工程(1)]
以下の方法により精製ウイルス液を調製した。
次いで、第2の実施形態について説明する。
<実施例2-1>
[工程(1)]
以下の方法により精製ウイルス液を調製した。
(サンプル液)
精製水に、フミン酸(NBRC20012)およびQβファージ(ナカライテスク株式会社)を、終濃度がそれぞれ5×1010PFU/mLおよび500ppmとなるように添加し、サンプル液(pH7)を調製した。
精製水に、フミン酸(NBRC20012)およびQβファージ(ナカライテスク株式会社)を、終濃度がそれぞれ5×1010PFU/mLおよび500ppmとなるように添加し、サンプル液(pH7)を調製した。
(粒子(A))
Sepharose 6B FF DEAE(DEAE)(GE healthcare社製)を粒子(A)として準備した。
Sepharose 6B FF DEAE(DEAE)(GE healthcare社製)を粒子(A)として準備した。
なお、粒子(A)は、0.1M塩酸水溶液に浸漬させてアミノ基を中和させた後、十分な量の精製水で洗浄水のpHが中性になるまで洗浄した後に使用した。
(粒子(B))
SIZE STANDARD PARTICLES SC-0050-D(以下、単に「SC-0050-D」と称する)(JSR株式会社製)を粒子(B)として準備した。SC-0050-Dの材料はポリスチレンである。なお、SC-0050-Dのゼータ電位は-43.1mVであり、平均粒径は48nmである。
SIZE STANDARD PARTICLES SC-0050-D(以下、単に「SC-0050-D」と称する)(JSR株式会社製)を粒子(B)として準備した。SC-0050-Dの材料はポリスチレンである。なお、SC-0050-Dのゼータ電位は-43.1mVであり、平均粒径は48nmである。
(サンプル液と、粒子(A)および粒子(B)との接触)
洗浄処理を行った粒子(A)であるDAEA 200μLと、粒子(B)であるSC-0050-Dの1%水溶液0.02mL(粒子(B)の添加量:200ppm)と、リン酸緩衝液(pH7.0、1mM)0.78mLと、を混合し、ボルデックスにて30秒間混合することで、混合液(pH7.0)を調製した。
洗浄処理を行った粒子(A)であるDAEA 200μLと、粒子(B)であるSC-0050-Dの1%水溶液0.02mL(粒子(B)の添加量:200ppm)と、リン酸緩衝液(pH7.0、1mM)0.78mLと、を混合し、ボルデックスにて30秒間混合することで、混合液(pH7.0)を調製した。
得られた混合液に、サンプル液(ウイルス濃度:5×1010PFU/mL、フミン酸濃度:500ppm)0.2mLを添加し、10分間転倒混和することで接触を行った。なお、接触時のウイルス濃度は1×1010PFU/mLであり、フミン酸濃度は100ppmである。
(精製)
上記で接触させた溶液から、粒子(A)および粒子(B)を分離することで、精製ウイルス液を調製した。
上記で接触させた溶液から、粒子(A)および粒子(B)を分離することで、精製ウイルス液を調製した。
より詳細には、転倒混和して得られた溶液について、粒子(A)および粒子(B)をスピンダウンし、上澄み液を回収することにより、0.8mLの精製ウイルス液を調製した。
[工程(2)]
得られた精製ウイルス液中のウイルスを検出した。
得られた精製ウイルス液中のウイルスを検出した。
(ファージ残存率)
PCR法を用いて精製前後におけるファージ残存率を求めた。
PCR法を用いて精製前後におけるファージ残存率を求めた。
より詳細には、まず、上記実施例1-1と同様の方法でファージ量を求めた。
次いで、得られたファージ量から、下記式により精製ウイルス液中のファージ残存率(%)を算出した。
その結果、ファージ残存率は92%であった。
[他の評価]
(ファージ残存率(希釈))
精製ウイルス液中に残存しうるフミン酸のPCR阻害を防止する観点から、精製水を用いて精製ウイルス液を100倍に希釈して、希釈精製ウイルス液を調製した。当該希釈精製ウイルス液を用いて、上記精製ウイルス液と同様の方法で、ファージ残存率(希釈)を求めた。その結果、ファージ残存率(希釈)は87%であった。
(ファージ残存率(希釈))
精製ウイルス液中に残存しうるフミン酸のPCR阻害を防止する観点から、精製水を用いて精製ウイルス液を100倍に希釈して、希釈精製ウイルス液を調製した。当該希釈精製ウイルス液を用いて、上記精製ウイルス液と同様の方法で、ファージ残存率(希釈)を求めた。その結果、ファージ残存率(希釈)は87%であった。
(フミン酸除去率)
吸光度法を用いて精製前後におけるフミン酸除去率を求めた。
吸光度法を用いて精製前後におけるフミン酸除去率を求めた。
より詳細には、サンプル液の400nmにおける吸光度(Absサンプル)と、精製ウイルス液の400nmにおける吸光度(Abs精製ウイルス)と、を測定し、下記式により、フミン酸除去率(%)を算出した。
その結果、フミン酸除去率は93%であった。
<実施例2-2>
粒子(A)をcelfine-Amino(JNC株式会社製)に変更したことを除いては、実施例2-1と同様の方法で精製ウイルス液を調製した。
粒子(A)をcelfine-Amino(JNC株式会社製)に変更したことを除いては、実施例2-1と同様の方法で精製ウイルス液を調製した。
なお、粒子(A)は、0.1M塩酸水溶液に浸漬させてアミノ基を中和させた後、十分な量の精製水で洗浄水のpHが中性になるまで洗浄した後に使用した。
得られた精製ウイルス液中のファージ残存率(%)は80%であった。また、ファージ残存率(希釈)は83%であり、フミン酸除去率は88%であった。
<実施例2-3>
粒子(A)をEAに変更したことを除いては、実施例2-1と同様の方法で精製ウイルス液を調製した。
粒子(A)をEAに変更したことを除いては、実施例2-1と同様の方法で精製ウイルス液を調製した。
なお、EAは、Epoxy-activated Sepharose 6B (GE healthcare社製)を28%アンモニア水溶液に浸漬し、室温にて一晩振とうし、次いで、精製水で洗浄水のpHが中性になるまで洗浄することで調製したアミノ基(-NH2)が導入されたアガロースゲルである。この際、EAの平均粒径は105μmであり、アミノ基量は18μmol/mLである。
なお、粒子(A)は、0.1M塩酸水溶液に浸漬させてアミノ基を中和させた後、十分な量の精製水で洗浄水のpHが中性になるまで洗浄した後に使用した。
得られた精製ウイルス液中のファージ残存率(%)は42%であった。また、ファージ残存率(希釈)は90%であり、フミン酸除去率は70%であった。
<実施例2-4>
粒子(A)をDEAに変更したことを除いては、実施例2-1と同様の方法で精製ウイルス液を調製した。
粒子(A)をDEAに変更したことを除いては、実施例2-1と同様の方法で精製ウイルス液を調製した。
なお、DEAは、Epoxy-activated Sepharose 6B (GE healthcare社製)を20%エタノールアミン水溶液に浸漬し、40℃にて一晩振とうし、次いで、精製水で洗浄水のpHが中性になるまで洗浄することで調製したヒドロキシエチルアミノ基(-NHC2H4OH)が導入されたアガロースゲルである。この際、DEAの平均粒径は105μmであり、アミノ基量は19μmol/mLである。
なお、粒子(A)は、0.1M塩酸水溶液に浸漬させてアミノ基を中和させた後、十分な量の精製水で洗浄水のpHが中性になるまで洗浄した後に使用した。
得られた精製ウイルス液中のファージ残存率(%)は50%であった。また、ファージ残存率(希釈)は93%であり、フミン酸除去率は82%であった。
<実施例2-5>
粒子(A)の投与量を30μLに変更したことを除いては、実施例2-1と同様の方法で精製ウイルス液を調製した。
粒子(A)の投与量を30μLに変更したことを除いては、実施例2-1と同様の方法で精製ウイルス液を調製した。
得られた精製ウイルス液中のファージ残存率(%)は30%であった。また、ファージ残存率(希釈)は90%であり、フミン酸除去率は60%であった。
<実施例2-6>
粒子(A)および粒子(B)の混合液を調製する際に使用するリン酸緩衝液として、リン酸緩衝液(pH7.0、10mM)に変更したことを除いては、実施例2-5と同様の方法で精製ウイルス液を調製した。
粒子(A)および粒子(B)の混合液を調製する際に使用するリン酸緩衝液として、リン酸緩衝液(pH7.0、10mM)に変更したことを除いては、実施例2-5と同様の方法で精製ウイルス液を調製した。
得られた精製ウイルス液中のファージ残存率(%)は39%であった。また、ファージ残存率(希釈)は83%であり、フミン酸除去率は71%であった。
<実施例2-7>
粒子(A)および粒子(B)の混合液を調製する際に使用するリン酸緩衝液として、クエン酸緩衝液(pH5.0、10mM)に変更したことを除いては、実施例2-5と同様の方法で精製ウイルス液を調製した。
粒子(A)および粒子(B)の混合液を調製する際に使用するリン酸緩衝液として、クエン酸緩衝液(pH5.0、10mM)に変更したことを除いては、実施例2-5と同様の方法で精製ウイルス液を調製した。
得られた精製ウイルス液中のファージ残存率(%)は35%であった。また、ファージ残存率(希釈)は70%であり、フミン酸除去率は80%であった。
<実施例2-8>
混合液およびサンプル液の転倒混和の時間を15時間に変更したことを除いては、実施例2-5と同様の方法で精製ウイルス液を調製した。
混合液およびサンプル液の転倒混和の時間を15時間に変更したことを除いては、実施例2-5と同様の方法で精製ウイルス液を調製した。
得られた精製ウイルス液中のファージ残存率(%)は56%であった。また、ファージ残存率(希釈)は76%であり、フミン酸除去率は86%であった。
<実施例2-9>
サンプル液中のフミン酸の終濃度を5ppmに変更して接触時のフミン酸濃度は1ppmとなるようにしたことを除いては、実施例2-1と同様の方法で精製ウイルス液を調製した。
サンプル液中のフミン酸の終濃度を5ppmに変更して接触時のフミン酸濃度は1ppmとなるようにしたことを除いては、実施例2-1と同様の方法で精製ウイルス液を調製した。
得られた精製ウイルス液中のファージ残存率(%)は100%であった。また、ファージ残存率(希釈)は100%であり、フミン酸除去率は100%であった。
<実施例2-10>
サンプル液中のフミン酸の終濃度を5ppmに変更して接触時のフミン酸濃度は1ppmとなるようにしたことを除いては、実施例2-8と同様の方法で精製ウイルス液を調製した。
サンプル液中のフミン酸の終濃度を5ppmに変更して接触時のフミン酸濃度は1ppmとなるようにしたことを除いては、実施例2-8と同様の方法で精製ウイルス液を調製した。
得られた精製ウイルス液中のファージ残存率(%)は100%であった。また、ファージ残存率(希釈)は100%であり、フミン酸除去率は100%であった。
<実施例2-11>
[工程(1)]
以下の方法により精製ウイルス液を調製した。
[工程(1)]
以下の方法により精製ウイルス液を調製した。
(サンプル液)
リン酸緩衝液(pH7.0、1mM)に、フミン酸(NBRC20012)およびQβファージ(ナカライテスク株式会社)および粒子(B)であるSC-0050-Dの1%を、終濃度がそれぞれ1×1010PFU/mLおよび200ppmとなるように添加し、サンプル液(pH7)を調製した。
リン酸緩衝液(pH7.0、1mM)に、フミン酸(NBRC20012)およびQβファージ(ナカライテスク株式会社)および粒子(B)であるSC-0050-Dの1%を、終濃度がそれぞれ1×1010PFU/mLおよび200ppmとなるように添加し、サンプル液(pH7)を調製した。
(粒子(A))
DEAEを粒子(A)として準備した。
DEAEを粒子(A)として準備した。
(粒子(B))
SC-0050-Dを粒子(B)として準備した。
SC-0050-Dを粒子(B)として準備した。
(サンプル液と、粒子(A)および粒子(B)との接触)
洗浄処理を行った粒子(A)であるDAEA 200μLを直径2mmのカラムに充填した後、粒子(B)であるSC-0050-Dの200ppm水分散液を1mL流した。次いで、DAEA充填したカラムに、調製したサンプル液1mlを通し、その後精製水1mLでカラムを洗浄して、精製ウイルス液を調製した。
洗浄処理を行った粒子(A)であるDAEA 200μLを直径2mmのカラムに充填した後、粒子(B)であるSC-0050-Dの200ppm水分散液を1mL流した。次いで、DAEA充填したカラムに、調製したサンプル液1mlを通し、その後精製水1mLでカラムを洗浄して、精製ウイルス液を調製した。
[工程(2)]
実施例2-1と同様の方法で、精製ウイルス液中のファージ残存率(%)、ファージ残存率(希釈)、およびフミン酸除去率を測定した。
実施例2-1と同様の方法で、精製ウイルス液中のファージ残存率(%)、ファージ残存率(希釈)、およびフミン酸除去率を測定した。
その結果、ファージ残存率(%)は50%であった。また、ファージ残存率(希釈)は69%であり、フミン酸除去率は84%であった。
<実施例2-12>
サンプル液の溶媒を精製水に変更したことを除いては、実施例2-11と同様の方法で精製ウイルス液を調製した。
サンプル液の溶媒を精製水に変更したことを除いては、実施例2-11と同様の方法で精製ウイルス液を調製した。
得られた精製ウイルス液中のファージ残存率(%)は50%であった。また、ファージ残存率(希釈)は70%であり、フミン酸除去率は82%であった。
<実施例2-13>
サンプル液中のフミン酸の終濃度を1ppmとなるように変更したことを除いては、実施例2-12と同様の方法で精製ウイルス液を調製した。
サンプル液中のフミン酸の終濃度を1ppmとなるように変更したことを除いては、実施例2-12と同様の方法で精製ウイルス液を調製した。
得られた精製ウイルス液中のファージ残存率(%)は90%であった。また、ファージ残存率(希釈)は90%であり、フミン酸除去率は100%であった。
<実施例2-14>
サンプル液の溶媒をリン酸緩衝液(pH7.0、10mM)に変更し、かつ、DAEAの投与量を50μLに変更したことを除いては、実施例2-11と同様の方法で精製ウイルス液を調製した。
サンプル液の溶媒をリン酸緩衝液(pH7.0、10mM)に変更し、かつ、DAEAの投与量を50μLに変更したことを除いては、実施例2-11と同様の方法で精製ウイルス液を調製した。
得られた精製ウイルス液中のファージ残存率(%)は69%であった。また、ファージ残存率(希釈)は71%であり、フミン酸除去率は72%であった。
<実施例2-15>
粒子(B)を、STADEX SC-0030-A(JSR株式会社製)に変更したことを除いては、実施例2-11と同様の方法で精製ウイルス液を調製した。
粒子(B)を、STADEX SC-0030-A(JSR株式会社製)に変更したことを除いては、実施例2-11と同様の方法で精製ウイルス液を調製した。
なお、SC-0030-Aの材料はポリスチレンである。また、SC-0030-Aのゼータ電位は-45mVであり、平均粒径は29nmである。
得られた精製ウイルス液中のファージ残存率(%)は47%であった。また、ファージ残存率(希釈)は80%であり、フミン酸除去率は72%であった。
<実施例2-16>
粒子(B)を、STADEX SC-0100-D(JSR株式会社製)に変更したことを除いては、実施例2-11と同様の方法で精製ウイルス液を調製した。
粒子(B)を、STADEX SC-0100-D(JSR株式会社製)に変更したことを除いては、実施例2-11と同様の方法で精製ウイルス液を調製した。
なお、SC-0100-Dの材料はポリスチレンである。また、SC-0100-Dのゼータ電位は-38mVであり、平均粒径は100nmである。
得られた精製ウイルス液中のファージ残存率(%)は38%であった。また、ファージ残存率(希釈)は50%であり、フミン酸除去率は85%であった。
<実施例2-17>
SC-0050-Dの投与量を、添加量が1000ppmとなるように変更したことを除いては、実施例2-11と同様の方法で精製ウイルス液を調製した。
SC-0050-Dの投与量を、添加量が1000ppmとなるように変更したことを除いては、実施例2-11と同様の方法で精製ウイルス液を調製した。
得られた精製ウイルス液中のファージ残存率(%)は48%であった。また、ファージ残存率(希釈)は78%であり、フミン酸除去率は77%であった。
<比較例2-1>
粒子(A)の代わりに、シリカゲル(平均粒径:90μm)1000μLを使用し、かつ、粒子(B)を混合しなかったことを除いては、実施例2-1と同様の方法で精製ウイルス液を調製した。
粒子(A)の代わりに、シリカゲル(平均粒径:90μm)1000μLを使用し、かつ、粒子(B)を混合しなかったことを除いては、実施例2-1と同様の方法で精製ウイルス液を調製した。
得られた精製ウイルス液中のファージ残存率(%)は14%であった。また、ファージ残存率(希釈)は99%であり、フミン酸除去率は1%であった。
<比較例2-2>
粒子(B)を添加せず、かつ、サンプル液中のフミン酸の終濃度を5ppmに変更して接触時のフミン酸濃度は1ppmとなるようにしたことを除いては、実施例2-1と同様の方法で精製ウイルス液を調製した。
粒子(B)を添加せず、かつ、サンプル液中のフミン酸の終濃度を5ppmに変更して接触時のフミン酸濃度は1ppmとなるようにしたことを除いては、実施例2-1と同様の方法で精製ウイルス液を調製した。
得られた精製ウイルス液中のファージ残存率(%)は1%であった。また、ファージ残存率(希釈)は1%であり、フミン酸除去率は100%であった。
<比較例2-3>
混合液およびサンプル液の転倒混和の時間を15時間に変更したことを除いては、比較例2-2と同様の方法で精製ウイルス液を調製した。
混合液およびサンプル液の転倒混和の時間を15時間に変更したことを除いては、比較例2-2と同様の方法で精製ウイルス液を調製した。
得られた精製ウイルス液中のファージ残存率(%)は0%であった。また、ファージ残存率(希釈)は0%であり、フミン酸除去率は100%であった。
<比較例2-4>
粒子(B)の代わりに、ポリアクリル酸(ゼータ電位:測定不可、平均粒径:測定条件において溶解、重量平均分子量(Mw):5000)を、添加量が500ppmとなる量で使用したことを除いては、実施例2-11と同様の方法で精製ウイルス液を調製した。
粒子(B)の代わりに、ポリアクリル酸(ゼータ電位:測定不可、平均粒径:測定条件において溶解、重量平均分子量(Mw):5000)を、添加量が500ppmとなる量で使用したことを除いては、実施例2-11と同様の方法で精製ウイルス液を調製した。
得られた精製ウイルス液中のファージ残存率(%)は7%であった。また、ファージ残存率(希釈)は28%であり、フミン酸除去率は96%であった。
<比較例2-5>
粒子(B)を、STADEX SC-034-S(JSR株式会社製)に変更したことを除いては、実施例2-11と同様の方法で精製ウイルス液を調製した。
粒子(B)を、STADEX SC-034-S(JSR株式会社製)に変更したことを除いては、実施例2-11と同様の方法で精製ウイルス液を調製した。
なお、SC-034-Sの材料はポリスチレンである。また、SC-034-Sのゼータ電位は-35mVであり、平均粒径は352nmである。
得られた精製ウイルス液中のファージ残存率(%)は14%であった。また、ファージ残存率(希釈)は23%であり、フミン酸除去率は83%であった。
実施例2-1~2-17および比較例2-1~2-5で得られた結果を下記表6および表7に示す。
表7のファージ残存率の結果から、実施例2-1~2-17で調製された精製ウイルス液は、比較例2-1~2-5で調製された精製ウイルス液と対比して、ウイルスの増幅を好適に行うことができることがわかる。
そして、表7のファージ残存率(希釈)およびフミン酸除去率の結果から、実施例2-1~2-17では、フミン酸およびウイルスを含むサンプル液から、フミン酸を選択的に分離することができていることが分かる。
Claims (9)
- ウイルスおよびフミン酸を含むサンプル液を、カチオン性基を有し平均粒径が1~3000μmである粒子(A)を含み、
前記粒子(A)の総表面積に対するフミン酸量が、0.5~100μg/cm2である、精製ウイルス液の製造方法。 - 前記サンプル液中のフミン酸濃度が、3μg/mL以上である、請求項1に記載の製造方法。
- ウイルスおよびフミン酸を含むサンプル液を、カチオン性基を有し平均粒径が1~3000μmである粒子(A)および負の表面電荷を有し平均粒径が10~100nmである粒子(B)に接触させることを含む、精製ウイルス液の製造方法。
- 前記粒子(B)が、負の表面電荷を有するポリスチレン、負の表面電荷を有するポリウレタン、負の表面電荷を有するポリアクリル、負の表面電荷を有するポリエポキシ、負の表面電荷を有するシリカ、および負の表面電荷を有するアルミナからなる群から選択される少なくとも1つを含む、請求項3のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記粒子(B)が、カルボキシ基、スルホン基、リン酸基、およびシラノール基からなる群から選択される少なくとも1つのアニオン性基を含む、請求項3または4に記載の製造方法。
- 前記粒子(A)が、カチオン性基を有するアガロースゲル、カチオン性基を有するセルロースゲル、およびカチオン性基を有するデキストランゲルからなる群から選択される少なくとも1種である、請求項1~5のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記カチオン性基が、アミノ基である、請求項1~6のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記接触が、塩を含む溶液中で行われ、
前記溶液の塩濃度が、50mM以下である、請求項1~7のいずれか1項に記載の製造方法。 - 請求項1~8のいずれか1項の方法により精製ウイルス液を製造する工程(1)と、
前記精製ウイルス液中のウイルスを検出する工程(2)と、
を含む、ウイルス検出方法。
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