WO2017009515A1 - Método de genotipado simultáneo de polimorfismos y/o mutaciones - Google Patents

Método de genotipado simultáneo de polimorfismos y/o mutaciones Download PDF

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WO2017009515A1
WO2017009515A1 PCT/ES2016/070537 ES2016070537W WO2017009515A1 WO 2017009515 A1 WO2017009515 A1 WO 2017009515A1 ES 2016070537 W ES2016070537 W ES 2016070537W WO 2017009515 A1 WO2017009515 A1 WO 2017009515A1
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amplification
ligation
oligonucleotides
probes
anchored
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PCT/ES2016/070537
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Ángel MAQUIEIRA CATALA
Regina NIÑOLES RODENES
Luis Antonio Tortajada Genaro
Salvador MENA MOLLÁ
Elizabeth Mildred HEVIA MARÍN
Sergi Beñat MORAIS EZQUERRO
Rosa Puchades Pla
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Universitat Politècnica De València
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    • C12Q2565/50—Detection characterised by immobilisation to a surface
    • C12Q2565/501—Detection characterised by immobilisation to a surface being an array of oligonucleotides

Definitions

  • the present invention relates to a method of genotyping polymorphisms, preferably single nucleotide polymorphisms, or other type of mutations comprising an allele-specific ligation stage, an amplification with universal primers, a hybridization with probes anchored to a support. and the detection of the specific formed products of said polymorphisms and / or mutations.
  • the present invention can be framed in the field of biomedicine and the agri-food industry.
  • SNPs Single nucleotide polymorphisms
  • alleles in the same position of the genomic DNA there are different variants called alleles and the less frequent allele abundance is equal to or greater than 1% .
  • SNPs located in genome coding regions can alter the structure and function of proteins, which can translate into changes at the phenotypic level. Numerous studies have established associations between the presence of a certain allele and the observed phenotype. Therefore, SNPs have important applications as markers, among which biomedical ones stand out: employment for diagnostic purposes, to establish the risk of an individual suffering from a disease, or in pharmacogenetics.
  • US2012252700 includes an amplification and subsequent allele-specific ligation, the multiplexing capacity of the technique being approximately between 3 and 20 SNPs.
  • US20120270272 describes the methodology of discrimination based on allele-specific ligation and subsequent amplification by universal PCR using specific oligonucleotides modified with a thiophosphate or sugar group and preferably thermostable ligases.
  • thermostable ligases that cannot be inactivated by a subsequent heat treatment (Taq or Pyrococcus ligases), so that during the amplification the ligation events continue and, consequently, altering the formation of products of the different SNPs.
  • a method of allelic discrimination, based on allele-specific ligation, and subsequent amplification with universal primers has been combined with hybridization detection with probes anchored on a surface, preferably of an optical disk either CD, DVD, Blu-ray, etc. and using an optical disc reader / writer.
  • This preferred approach means that the methodology presented combines the high fidelity and multiplexing capacity of ligation discrimination and amplification-hybridization with primers and universal probes, with the characteristics of detection based on optical disc technology, such as portability, ease of handling and low cost.
  • this invention provides a robust, analytically powerful, reliable and economically competitive genotyping system, which can be applied on a large scale in health centers, industries, laboratories or in emergency or critical situations.
  • the method of the present invention is framed within the genotyping methodologies of polymorphisms or other mutations, allowing sufficient multiplexing to effectively apply to the clinical setting (for example in personalized medicine) and agri-food (for example for food authentication, both animals such as vegetables), especially, and it is easy to locate in places of interest (POC, "Point of care").
  • POC "Point of care"
  • amplification is a key stage and is subsequent (unlike most ligation-based techniques) to the step of ligation, which discriminates the different genetic variants of the polymorphisms studied. That is, only allele-specific products are amplified. This results in better selectivity and less analysis time.
  • the method of the present invention can also be useful in the environmental field (for example for the identification of animal or plant species) and in the coroner (for identification of individuals), among others.
  • the present invention describes a method for simultaneous genotyping of mutations, preferably genetic polymorphisms, especially single nucleotide polymorphisms (or SNPs, Single Nucleotide Polymorphism), also called single nucleotide polymorphisms.
  • genetic polymorphism refers to a variation in the nucleotide sequence of the deoxyribonucleic acid (DNA) chain that has at least a frequency of 1% in individuals in a population. Genetic polymorphisms can be variations of one or more nucleotides. Particularly, single nucleotide polymorphisms generally give rise to two alleles. The genotyping of SNPs provides information on the variation of a single polymorphism or the information of a haplotype (SNP tags or "tagSNP"). "Haplotype” is a combination of alleles of different loci of a chromosome that are transmitted together.
  • a haplotype can be a locus, several loci, or an entire chromosome depending on the number of recombination events that have occurred between a given set of loci.
  • haplotype a set of polymorphisms (SNPs) that are inherited in block with measures of linkage imbalance r2 ⁇ 0.8 and that are identified by genotyping one of the polymorphisms included in said haplotype Therefore, the method of the present invention allows the detection of a certain polymorphism and / or haplotype in an individual.
  • the present invention employs an allelic discrimination technique comprising an allele-specific ligation (through the action of a ligase enzyme capable of binding oligonucleotides specifically designed for the discrimination of each SNP to be detected) followed by an amplification with universal primers, hybridization. with probes anchored on a surface and detection.
  • the analytical support is an optical disk (either in CD, DVD, Blu-Ray, thermochromic engraving discs, etc.) and the detector is an optical disc reader / writer. It allows to formalize a development that reduces the time of analysis, lowers and simplifies the test, at the same time that makes it an easily applicable methodology in situ.
  • the present invention relates to a method of detecting at least one polymorphism or other mutation, preferably single nucleotide polymorphism (SNP), in an isolated sample of a subject comprising (hereafter " method of the invention ”) the following steps:
  • step (a) amplification of the ligation products obtained in step (a), wherein the amplification is performed using at least one universal primer in solution or in solid phase, preferably with a single pair of universal primers;
  • step (c) polymorphism detection or mutation of the product obtained in step (c).
  • the method of the invention allows several polymorphisms or other mutations to be detected simultaneously, preferably single nucleotide polymorphisms (SNPs).
  • SNPs single nucleotide polymorphisms
  • the polymorphisms or other mutations detected simultaneously are between 5 and 200. In a more particular embodiment there are more than 15 and less than 100, the SNPs and / or mutations detected. In a more particular embodiment there are more than 20 SNPs and / or mutations detected, more preferably between 30 and 100, that is: 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96,
  • ligation (allelic discrimination) of step (a) is effected through a ligase enzyme, preferably thermostable, that binds oligonucleotides designed ad hoc for each gene and polymorphism.
  • a ligase enzyme preferably thermostable
  • thermostable ligase refers to the enzyme maintaining its activity (ligation) even subject to an elevated temperature, for example, typically, a temperature greater than 45 ° C, and more preferably, at least 60 ° C.
  • examples of thermostable ligases can be (but not limited to): Thermus aquaticus, Thermus themophilus or Pyrococcus spp.
  • Non-thermostable enzymes such as T4 ligase or E. coli ligases could be used, but the error rate would increase. Therefore, thermostable ligases are the preferred option because when acting at elevated temperatures (for example between 60 and 65 ° C), the high reliability of the assay is maintained, reducing non-specific hybridization with the template DNA and, therefore, the unwanted ligation.
  • the ligation is performed at a temperature between 60 to 65 ° C (60, 61, 62, 63, 64 or 65 ° C).
  • thermostable ligase enzymes with short reaction times (5-15 minutes) and which can be inactivated prior to amplification will be used, for example, by heat treatment or the addition of a blocker, so as to prevent the continuation of ligation events during this stage.
  • An example would be "Ligase 65" (Holland HRC), which is thermostable and can be inactivated by a treatment (for example 5 minutes at 98 ° C).
  • step (b) the ligase of step (a) is inactivated for 3-10 minutes (3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 minutes ), preferably 5 minutes at 95-99 ° C (95, 96, 97, 98 or 99 ° C), preferably at 98 ° C.
  • the ligation is performed in a time between 5 to 15 minutes at a temperature between 60 to 65 ° C and subsequently inactivated for 3-10 minutes, preferably for 5 minutes at 95-99 ° C, preferably 98 ° C.
  • discriminating oligonucleotides For each gene or polymorphism, discriminating oligonucleotides (OD), one for each allelic variant, and a common oligonucleotide (OC) are used in the ligation stage For all variants.
  • each ligation of step (a) is performed by means of two discriminating oligonucleotides (for example, referred to as OD-A and OD-B) and a common oligonucleotide.
  • the oligonucleotides used in step (a) have the following characteristics.
  • OD oligonucleotides are complementary to genomic DNA and differ from each other in the nucleotide of one of its ends, which is specific for each allele.
  • the oligonucleotides ODs may have mismatches with the target region of the subject's DNA to favor correct discrimination.
  • the OD oligonucleotides for a given polymorphism may be the same or different in size.
  • the common oligonucleotide (OC) is complementary to the genomic DNA located immediately after the SNP and in the same strand as the ODs.
  • ODs oligonucleotides or OC oligonucleotide are phosphorylated at one end to allow ligation.
  • the OD oligonucleotides are complementary to the genomic DNA prior to the polymorphism and have the specific nucleotide for each allele at the 3 'end and the OC oligonucleotide is phosphorylated at the 5' end.
  • oligonucleotides may have modifications that improve process selectivity and / or anchoring, such as blocked nucleic acids (LNA), or be modified (in 5 'position, 3' position and / or internal nucleotides) with structures such as biotin, digoxigenin, sugars, particles and / or nanotubes.
  • LNA blocked nucleic acids
  • the oligonucleotides used in addition to the region complementary to the genomic DNA under study, have tails, generic sequences not present in the target genome, which allow amplification-hybridization in universal format.
  • the queues included in the OD (for example, OD-A, OD-B) and OC for universal amplification can all be the same, only two the same or all different from each other, but they are the same for all polymorphisms and / or analyzed alleles.
  • the sequences of the queues used can be, but not limited to, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3.
  • the oligonucleotide OD, OC, or both also have a generic but different tail for each polymorphism and / or allele.
  • the size of the oligonucleotides can be any, preferably between 16 to 100 nucleotides, more preferably between 40 and 70 nucleotides (ie, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 or 70).
  • the allelic discrimination reaction begins with the hybridization of specific oligonucleotides (ODs and OCs) with the template DNA ( Figure 1), and then the ligase enzyme binds adjacent fragments. Ligation will take place only, or as a priority, when the complementarity of the OD, with respect to the nucleotide corresponding to the allele under study, is perfect; so that only the products corresponding to the allele / s own / s of the genome of each subject will be obtained.
  • the ligation step can be carried out by a single reaction or by two independent allelic discrimination reactions, which differ in the OD oligonucleotides used for each SNP (Table 1).
  • the reaction mixture contains the oligonucleotides OD (exemplified as OD-A, OD-B) and OC which allows to simultaneously form the ligation products corresponding to both alleles.
  • the reaction mixture A contains the OD-A and OC oligonucleotides
  • the reaction mixture B the OD-B and OC oligonucleotides.
  • Table 1 Ligation products formed based on the oligonucleotides added to the reaction mixture and the genotype of the subject for the analyzed polymorphism.
  • the A allele is the native one and the B allele is the mutant.
  • the ligation of step (a) can be carried out in solution or in solid phase, that is, on the surface of a support in contact with the solution ( Figure 2).
  • at least one of the oligonucleotides involved in the ligation is anchored on the analytical surface and the OD-OC ligation results in the ligation production anchored to said surface.
  • the oligonucleoid to be anchored can be modified to allow or favor immobilization. In a particular embodiment, the modifications include the inclusion of ileum, amino, bioin, digoxigenin, particles or sugar groups.
  • the anchoring of the oligonucleóides is carried out on the surface or in specific regions, preferably, but not limited to, in a microarray format.
  • the anchoring methods include direct adsorption, indirect adsorption, affinity (eg, esirepiavidin / bioinine pair, neuiravidin / bioinin, anidigoxyigenin / digoxigenin, lecidin / sugar, etc.), or covalency, enter other modes ( Figure 3).
  • Ipova covalenie immobilization reactions that may be comparable include reactions via ileum, amino, and other groups, and may include surface-probe spacer groups, such as a tail of several imine or adenine nucleoids.
  • step (b) refers to the increase in the number of copies of a region of the template nucleic acid ( Figure 4).
  • the amplification is carried out with the methods known to the expert in the field.
  • the step (b) of amplification of the period of the invention can be carried out by means of polymerase chain reaction [PCR (polymerase chain reaction)] or isoerymal amplification reactions, such as RPA amplification (recombinant polymerase amplification, recombined polymerase amplification) or SDA (strand displacement amplification), you will hear. In any case, amplification is carried out using universal primers.
  • primer refers to an oligonucleotide capable of acting as a starting point for DNA synthesis when hybridized with the template nucleic acid, that is, with the ligation product obtained in step ( a) of the method of the present invention.
  • universal primer refers to those oligonucleotides that do not recognize any part of the target genome and are used to amplify all ligation products at the same time, thanks to the prior incorporation of the relevant tails. .
  • Amplification occurs for all genes, polymorphisms or other mutations simultaneously, using universal primers that recognize the tails present in the OD and OC.
  • the number of primers used is between 1 and 3, depending on the type of amplification and the sequences of the tails present in the linked oligonucleotides.
  • the size of the primers can be any, preferably between 15 to 30 nucleotides, more preferably between 18 and 24 (18, 19, 20, 21, 22, 23 or 24).
  • the sequences of the universal primers are the same or complementary (totally or partially) to the sequences of the tails present in the OD and / or OC oligonucleotides.
  • the primers used in the present invention but not limited to, have the following sequences: SEQ ID NO: 1, 2 and 4.
  • step (a) when the ligation, step (a), takes place by means of two independent allelic discrimination reactions (A and B), a single pair of universal primers (front and rear) is used for each reaction.
  • the primer pairs used in the present invention may have, but are not limited to, the following sequences: the SEQ ID NO: 1 and 4 pair or the SEQ ID NO: 2 and 4 pair.
  • this step (b) Preference is given to the labeling of the bound products using labeled primers and / or functionalized nucleotides, known to any person skilled in the art.
  • nucleotide includes deoxyribonucleoside triphosphates such as, but not limited to, dATP, dCTP, dITP, dUTP, dGTP, dTTP, or derivatives thereof, such as LNA.
  • An alternative of marking is to make the post-amplification and / or post-modification hybridization of the products formed, using functionalized oligonucleotides and / or nucleotides.
  • Detectable markers or labels include, for example, radioactive isotopes, fluorescent labels, chemiluminescent labels, bioluminescent labels or enzymatic labels.
  • the markers comprise antigens, particles, fluorophores or the like, bound to the primers or as nucleotide functional groups.
  • the amplification is preferably performed in solution ( Figure 5).
  • the products obtained after amplification subsequently interact with the probes immobilized on the surface, step (c). Specifically, hybridization recognition of the amplified product with the anchored probe occurs.
  • the amplification is carried out in solid phase ( Figure 5).
  • solid phase amplification implies the immobilization of at least one of the primers on the solid surface, the amplification reaction occurring at the solution-solid interface and causing a product anchored to said surface.
  • steps (b) and (c) are integrated.
  • the oligonucleotides OD, OC, both, or regions specific to each gene and polymorphism are immobilized on a surface to act as primers.
  • at least one universal primer can be added to the solution, in contact with the surface to allow amplification or increase its yield or specificity.
  • the sequences of the universal primers used could be, but not limited to, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4.
  • At least one of the universal primers is anchored or added to the solution, in contact with the surface, and the ligation product (anchored on the surface ) acts as a template for amplification ( Figure 5).
  • the ligation product anchored on the surface
  • Figure 5 acts as a template for amplification
  • hybridization refers to the pairing of two complementary single-stranded nucleic acid (DNA and / or RNA) molecules to give rise to a molecule of double chain ( Figure 6).
  • Hybridization occurs under controlled conditions of pH, saline content, astringency, temperature and time.
  • the components of the hybridization mixture comprise, for example, saline sodium citrate (SSC) at pH 7, formamide, Denhardt's, etc. Variations in the concentrations of these components influence the specificity and selectivity of hybridization, as is known to the person skilled in the art.
  • the hybridization temperature may be, for example, between 35 and 45 ° C (35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 or 45 ° C) and the hybridization time is preferably , between 30 minutes and 2 hours (for example, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 1 10, 1 15 or 120 minutes ).
  • One of the participating molecules is the ligation or amplification product and is in solution.
  • the other molecules that participate in hybridization called "probes" are anchored on a surface (or support, or solid support or solid surface).
  • the probes in the hybridization step (c) are nucleic acids and are between 20 and 30 nucleotides in size.
  • the probes may be aptamers or modified nucleic acids, such as LNAs.
  • the anchoring of the probes is performed over the entire surface or in specific regions, preferably, but not limited to, in a microarray format.
  • the oligonucleotide to be anchored may be modified to allow immobilization.
  • the modifications comprise the inclusion of thiol, amino, biotin, digoxigenin, particles or sugar groups. They may also include modifications that improve process selectivity, such as blocked nucleic acids (LNA).
  • the probes are immobilized on the surface by direct adsorption, indirect adsorption, affinity (eg streptavidin / biotin pair, neutravidin / biotin, antidigoxigenin / digoxigenin, lectins / sugar, etc.), or by covalent anchoring, among other modes of fixation of probes (Figure 3).
  • Covalent-type immobilization reactions that may be compatible include reactions via thiol, amino groups, among others, and may include surface-probe spacer groups, such as a tail of several thymine or adenine nucleotides.
  • the probes may have a specific sequence of the gene in question, or be generic probes.
  • Generic probes are those that do not hybridize with the target genome, but recognize the tails present in the oligonucleotides used, preferably those used in ligation (OD, OC or both). With this option, the probes are designed to hybridize with the target oligonucleotides under substantially similar hybridization conditions. Therefore, this approach brings versatility to the genotyping platform, since it allows maintaining the same probes and hybridization conditions for any set of polymorphisms or mutations under study.
  • the probes in the hybridization step (c) are between 20 and 30 nucleotides in size, preferably 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 or 30 nucleotides.
  • step (c) of the proposed genotyping method when the amplification takes place in solution, the products generated in the amplification, step (b), are specifically recognized by a set of probes anchored on the surface. In particular embodiments based on solid phase ligation and solid phase amplification, this step (c) occurs in an integrated manner to step (b) of the method, reducing the test times and handling required.
  • the marking of the hybridized or amplified products on the surface can also be carried out, including a previous, simultaneous or subsequent stage of hybridization, ligation or extension, among others.
  • an additional hybridization step is incorporated for the marking of the products formed, using an oligonucleotide complementary to the product and containing a marker such as biotin or digoxigenin, among others.
  • the oligonucleotides, probes or primers, anchored on the surface may be specific or generic or comprise a specific region and a generic one.
  • the terms “surface”, “support”, “solid support” or “solid surface” are used interchangeably.
  • the terms “anchored”, “fixed assets” and “fixed” are used interchangeably.
  • the support for performing the genotyping of polymorphisms and / or mutations (in steps (a), (b) and / or (c)) can be any surface (sheets, chips or particles) of a polymeric material, derived from silicon, etc. provided that it allows the immobilization of the probes and the detection of the product formed (step (d)).
  • the number of microarrays, replicas and their spatial configuration in the assay can be varied.
  • the dimensions of the interaction regions may be of the order of nanometers or greater.
  • the support is the surface of an optical disk or compact disk and in step (d) the detection is performed using optical disk or compact disk readers.
  • optical disk or “compact disk” is meant an optical data storage medium, consisting essentially of a disk in which the information is encoded, stored and stored in the microscopic grooves generated in one of the flat layers That composes. Any type or morphology of the information (text, image, audio, video, etc.) can be encoded in digital format and stored in this type of media. They can be selected, without limitation, to CD (Compact Disc or Compact Disc), DVD (Digital Versatile Disc or Digital Video Disc), Blu-ray, among others.
  • the disc used can be any disc of a commercial standard or not, which can be read with a reader / writer that preferably uses a laser head to read / write.
  • the disc to be used may be unmodified or include some pretreatment stage, such as washing, activation, coating, etc. They also include discs that incorporate additional layers, for example microfluidics.
  • the use of this type of surfaces provides the present invention with a high-performance work surface (robust, versatile, economical, etc.) and a simple and fast method, as well as cheap and easy to implement in the required place.
  • the support is unmodified discs or their modified variants that preferably comprise treated surfaces or discs with a greater number of layers (multilayer optical discs).
  • the anchoring of the oligonucleotides can be performed directly on the surface of the disk or on a polymeric layer added to the disk ( Figure 3).
  • the optical disk can be pretreated with treatments that do not damage its optical properties, such as washing solutions, addition of polymer layers, structured or microstructured, irradiated or subjected to plasma attack, among others known to a person skilled in the art.
  • the oligonucleotides may be arranged on the disk in a microarray format, and may include positive and negative controls (Figure 7).
  • step (d) of the method of the invention the detection of the SNP or mutation is produced by the marking done, by observation or with a detector.
  • This process can be direct if the previous stages of the method have originated a detectable product, or include several stages of development or amplification to generate the detectable product and / or increase the amount of detectable product.
  • the "detectable product”, as understood in the present description, is a species that produces an observable signal or a response in the detector. These products comprise compounds with redox groups, fluorescent or luminescent, solids, precipitates, particles, metallographic, enzymatic deposits or colored compounds, among others. Examples of detection processes include the measurement of emission, absorption, transmission, conductivity or voltage variations, among others, using equipment such as spectrophotometers, fluorimeters, conductometers or voltamperimeters, among others.
  • the detection is preferably performed by measuring the interaction with a laser beam emitted by an optical disc reader (CD, DVD, Blu-Ray reader, for example).
  • optical disk reader means the device capable of obtaining the information stored on said disk using a laser that allows it to read said information. This category includes readers / writers of CDs, DVDs, Blu-Rays and any device capable of scanning the surface of the disc with a laser beam.
  • a product or reservoir capable of interacting with light (absorbing, dispersing, etc.) by modifying the intensity of the laser beam is needed (Figure 8).
  • These products comprise solids, precipitates, metallographic deposits, enzymatic or colored compounds, among others.
  • a preferred embodiment is the marking of the product with an antigen and subsequent incubation with antibodies that recognize said antigen and that are conjugated to markers such as enzymes, particles, etc., resulting in the modification of the intensity of the laser beam of the optical disc reader.
  • the method allows genotyping in an isolated sample of a subject under study that comprises DNA.
  • isolated sample is meant a representative part or portion extracted from the subject.
  • subject is meant any organism (animal, plant, bacterial, etc.) or mixture of organisms or their derivatives, for example food (in this case the food comprises a portion of the animal or plant from which it derives, for example tissues, muscle, fat, tendons in animals or parts of the plant, for example, roots, leaves, inflorescences or stems).
  • the subject is preferably a human, male or female of any age, born or unborn (since the method of the invention is also useful in prenatal diagnosis).
  • the term "human", “patient” and “individual” are used interchangeably.
  • the sample can be selected from the list consisting of: blood, serum, plasma, lymph, urine, saliva, bronchoalveolar lavage, sputum, pleural fluid, cerebrospinal fluid, synovial fluid, tissue, oral smear, tear secretion or other tissues or fluids.
  • the sample is fresh, frozen, fixed or fixed and embedded in paraffin.
  • the extraction of genomic DNA from the samples is carried out by conventional methods or using commercial kits.
  • the DNA can be from an embryo or fetus and the sample can be a maternal sample, for example blood, that comprises the DNA of the embryo or fetus.
  • the method of the present invention can also comprise the detection of an internal (or standard) control, said control can be added to the sample to be analyzed and / or be a region, polymorphism or mutation of the genome of the subject.
  • the method of the present invention is useful for detecting genetic diseases or cancer, as a tool in pharmacogenetics / pharmacogenomics (to establish the dose of the drug or the type of treatment specific to a patient) and in other clinical applications. It is also useful in agrifood areas (eg food authentication), environmental-biological (eg identification of animal or plant species) and forensic (eg identification of human remains), among others.
  • the present invention also relates to a kit (it can also be a device) comprising the elements necessary to carry out the method of the present invention.
  • the present invention comprises a ligase, at least one universal primer, at least one probe and a support surface, preferably an optical disk or compact disk, such as CD, DVD, Blu-Ray and the like, and a detector, preferably, a reader optical disc or compact disc.
  • a ligase preferably an optical disk or compact disk, such as CD, DVD, Blu-Ray and the like
  • a detector preferably, a reader optical disc or compact disc.
  • the present invention also relates to the use of the kit (or device) for carrying out the method of the present invention.
  • FIG. 1 Scheme of polymorphism discrimination by the use of discriminant oligonucleotide (OD) and common oligonucleotide (OC).
  • OD discriminant oligonucleotide
  • OC common oligonucleotide
  • I Total complementarity
  • II Partial complementarity
  • FIG. 2 Ligation reaction in solution (I) and in solid phase or on the surface of the disc (II).
  • FIG. 3 Scheme of oligonucleotide immobilization modes on the analytical surface: (I) direct covalent, (II) indirect adsorption or affinity, (III) indirect covalent or on additional layer, (a) oligonucleotide with specific or generic sequence, (b ) tail or spacer, (c) anchor molecule, (d) polymeric layer, (e) surface.
  • FIG. 4 Amplification-tidal reaction of ligation products. Discriminant oligonucleotide (OD) and common oligonucleotide (OC).
  • FIG. 5 Solution amplification (I), solid phase amplification (II) and amplification of the anchored ligation product (III): (a) Ligation product, (b) Primer, (c) Marked amplification product, (d) Surface , (e) Anchored primer, (f) Marked and immobilized amplification product, (g) Anchored ligation product.
  • FIG. 6 Hybridization scheme of the amplification products with the probes immobilized on the surface.
  • Positive recognition and II lack of recognition,
  • FIG. 7 Diagram of arrangement of the probes in microarray format on an optical disk.
  • FIG. 8 (I) Principle of reflection reading of products formed on the surface of the disc using compact disc readers / recorders. (II) Registers of variation of the intensity of the beam depending on the position on the disk, (a) Optical disk, (b) reader, (c) beam of emitted light, (d) beam of reflected light, (e) product formed.
  • FIG. 9 Scheme of the procedure Example I for genotyping SNPs.
  • FIG. 10 Images of test results. Left: Matrix of probes anchored on the DVD. Center: Image resulting from example I for probes of allele 1 (4 points / gene). Right: Image resulting from test 1 for probes of allele 2 (4 points / gene).
  • Negative control Probe that is not recognized by any of the amplification products.
  • FIG. 11 Scheme of the procedure of Example II for the genotyping of SNPs.
  • FIG. 12 Results images of example II. Left: Matrix of probes anchored on the DVD. Center: Image resulting from test 2 for probes of allele 1 (4 points / gene). Right: Image resulting from test 2 for probes of allele 2 (4 points / gene).
  • gen1 AG
  • gen2 TT
  • gen3 AG
  • gen4 GG
  • gen5 AA
  • gen6 GG
  • gen7 GG
  • gen8 CA
  • gen9 GG
  • gen10 GG
  • gen11 AA
  • gen12 CC
  • gen13 CG
  • gen14 AG
  • gen15 AA
  • gen16 CT
  • gen17 GG
  • gen18 CT.
  • Example 1 Genotyping of SNPs by ligation, PCR amplification and hybridization with universal probes anchored on optical disc
  • the DNA sample is obtained from oral smears.
  • two allelic discrimination reactions (A and B) are carried out that differ in the discriminating oligonucleotides used for each SNP.
  • DVD-R discs of 12 cm in diameter are used as a test stand and a DVD reader / writer as a detector.
  • the test protocol comprises several stages ( Figure 9).
  • allelic discrimination the following steps are distinguished:
  • DNA denaturation 10-100 ng of genomic DNA is added to the reaction buffer and incubated at 95 ° C for 5 min.
  • oligonucleotide OD is added, with an allele-specific sequence and a tail for universal amplification, SEQ ID NO: 6, 7, 10, 1 1, 14, 15, 18, 19, 22, 23, 26, 27, 30, 31, 34, 35, 38, 39, 42, 43, 46, 47, 50, 51, 54, 55, 58, 59, 62, 63, 66, 67, 70, 71, 74, 75, 78, 79, 82, 83, 86, 87, 90, 91, 94, 95, 98 and 99 (Table 2).
  • an OC oligonucleotide is added whose sequence has a region at the 3 'specific end of the gene, a central region for hybridization with universal probes and a region at the 5' end for universal amplification, SEQ ID NO: 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96 and 100 (Table 2 ).
  • Hybridization takes place at 60 ° C for 7 minutes.
  • Ligation of oligonucleotides A solution containing the enzyme Ligase 65 (MRC-Holland) is added.
  • amplification reaction takes place by PCR with a pair of universal primers that hybridize with the tails incorporated in the linked oligonucleotides.
  • primers SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 4 are used, and in reaction B, primers SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 4.
  • the reagent mixture used contains buffer amplification, enzyme polymerase, nucleotides and universal primers, with primers SEQ ID NO: 1 and 2 labeled with digoxigenin at the 5 'end.
  • the solution containing the ligation products is added to the reagent mixture and the temperature program is applied.
  • the anchoring of the probes, functionalized with biotin, is carried out via indirect adsorption (streptavidin / biotin) on the polycarbonate face of the DVD-R in which the laser of the DVD reader / writer will affect.
  • the probes are generic, that is, not present in the target genome, but complementary to the tail present in the OC oligo of each gene and polymorphism SEQ ID NO: 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 49, 53, 57, 61, 65, 69, 73, 77, 81, 85, 89, 93 and 97 (Table 2).
  • Hybridization of the amplified products with the probes is performed by diluting 1/10 the products in hybridization buffer (65 mM saline citrate sodium buffer, pH 7 and 25% formamide).
  • hybridization buffer 65 mM saline citrate sodium buffer, pH 7 and 25% formamide.
  • the solutions of each discrimination reaction (A and B) hybridize in their corresponding probe microarray. The process is carried out in an oven at 37 ° C for one hour.
  • FIG. 10 shows the image resulting from the simultaneous genotyping of 24 SNPs of an individual.
  • the format of the probe array has a design with 26 probes (24 genes and 2 controls) with 4 replicas of each.
  • Table 2 List of oligonucleotides used for genotyping by ligation, PCR amplification and hybridization with universal probes anchored on DVD disc
  • Example 2 Genotyping of SNPs by solid phase ligation on optical disc
  • the DNA sample is obtained from blood serum.
  • two allelic discrimination reactions (A and B) are carried out in two different areas of the disc.
  • Optical discs such as 12 cm diameter digital versatile discs (DVD-R) are used as a test stand and a DVD reader / writer as a detector.
  • the protocol has different steps ( Figure 1 1). It begins with a solid phase ligation reaction in the area of the disc that contains each of the discriminating oligonucleotides. Subsequently, an amplification is performed by dispensing on the disc one or two of the universal primers that have the same or complementary reverse sequences to the OD and OC tails, respectively.
  • DNA denaturation is performed, mixing the genomic DNA extract with the reaction buffer and incubating at 95 ° C for 5 min and subsequently dispensing on the microarray of a DVD disc with the OD oligonucleotides (Table 3 ). These have the 5 'phosphorylated end and are anchored covalently on the surface of the disk through its 3' end and an amino group, following a microarray format. Common oligonucleotides (OCs), listed in Table 3, and the enzyme Ligase 65 are also added, incubating at 60 ° C for at least 30 min under stirring. The subsequent wash cycle with 100 mM saline phosphate buffer, pH 7.5 and water, removes excess OC and template DNA. The result of the reaction is the formation of the ligation products in those cases where the corresponding allele is found.
  • OCs Common oligonucleotides
  • Ligase 65 are also added, incubating at 60 ° C for at least 30 min under stirring.
  • the subsequent wash cycle with 100
  • Isothermal RPA type amplification is achieved by dispensing the mixture containing the amplification buffer, universal primers and biotin functionalized deoxynucleotides.
  • A the primers SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 4, and in reaction B primers SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 4.
  • a metallographic development is performed based on the gold-catalyzed silver ion reduction reaction and the consequent formation of metallic silver deposits on the surface of the optical disk.
  • the intensity variation of the reflected beam is recorded with a DVD reader / writer.
  • Figure 12 shows the image resulting from the simultaneous genotyping of 18 SNPs in a sample of the same individual.
  • the matrix format has a design with 20 probes (18 genes and 2 controls) and 4 replicas of each.
  • Table 3 List of oligonucleotides used for genotyping by ligation and amplification-hybridization in solid phase on DVD
  • the method of the present invention advantageously solves the problem of genotyping of polymorphism and / or mutations that the previous approximations known by the person skilled in the art, based on allele-specific hybridization combined with compact disc technology (or not) or that the approximations based on ligation combined with capillary electrophoresis, optical microscopy techniques, fluorescence scanners or other instruments.
  • the former the number of genotyped polymorphisms, working conditions, flexibility of the system, etc., is improved, and in comparison with the latter, it is a simple, cheap, portable and large-capacity measuring system.

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Abstract

La presente invención se refiere a un método de discriminación alélica para la detección de polimorfismos genéticos y/o mutaciones,especialmente polimorfismo de un único nucleótido, que comprende una ligación alelo-específica,posterior amplificación con cebadores universales, hibridación con sondas ancladas sobre una superficie, preferiblemente la superficie de un disco óptico, y la detección de los polimorfismos y/o mutaciones, preferiblemente mediante un lector de disco óptico.

Description

Método de genotipado simultáneo de polimorfismos y/o mutaciones
DESCRIPCIÓN La presente invención se refiere a un método de genotipado de polimorfismos, preferiblemente polimorfismos de un único nucleótido, u otro tipo de mutaciones que comprende una etapa de ligación alelo-específica, una amplificación con cebadores universales, una hibridación con sondas ancladas a un soporte y la detección de los productos formados específicos de dichos polimorfismos y/o mutaciones. La presente invención se puede encuadrar en el ámbito de la biomedicina y de la industria agroalimentaria.
ESTADO DE LA TÉCNICA Los polimorfismos de un único nucleótido (SNPs) son mutaciones puntuales en el genoma, de modo que en una misma posición del ADN genómico existen diferentes variantes denominadas alelos y la abundancia del alelo menos frecuente es igual o mayor que el 1 %. Los SNPs situados en regiones codificantes del genoma pueden alterar la estructura y función de las proteínas, lo que puede traducirse en cambios a nivel fenotípico. Numerosos estudios han establecido asociaciones entre la presencia de un determinado alelo y el fenotipo observado. Por tanto, los SNPs tienen importantes aplicaciones como marcadores, entre las que destacan las biomédicas: empleo con fines diagnósticos, para establecer el riesgo de un individuo a padecer una enfermedad, o en farmacogenética.
En la actualidad hay disponibles diversas metodologías de genotipado de polimorfismos y otras mutaciones que se basan en diferentes reacciones de discriminación alélicas tales como la hibridación alelo-específica (ej. Genechips® de Affymetrix) o la extensión de cebadores y posterior ligación (ej. Goldengate® de lllumina®). No obstante, existe una demanda de nuevas tecnologías que superen a las ya desarrolladas en:
-Escalabilidad, es decir, el número de polimorfismos interrogados debe de adaptarse a las necesidades de cada problema genético concreto.
-Capacidad de multiplexado, suficiente (10-100 SNPs) para que se puedan sacar conclusiones clínicas a partir de los resultados obtenidos. -Método versátil, que pueda ser empleada con diferentes fines sin necesidad cambios importantes.
-Plataforma de detección portátil, de fácil manejo y más simple, que permita hacer uso de la tecnología en el lugar de interés ("Point of Care") y no únicamente en laboratorios bien dotados.
-Protocolo de trabajo corto, que pueda llevarse a cabo en una jornada laboral o menos.
En la actualidad no se dispone de una herramienta que comprenda todas las características anteriormente señaladas.
Entre los métodos que permiten la detección de SNPs, serían por ejemplo los descritos en US20030215825. Esta aproximación requiere el empleo de sondas específicas lo que presenta desventajas como la posible reactividad cruzada o el multiplexado limitado, por tener que emplear condiciones de hibridación comunes entre ellas. Además, se limita exclusivamente al empleo de partículas como marcadores para la detección. US2012252700 incluye una amplificación y posterior ligación alelo-específica, siendo la capacidad de multiplexado de la técnica de aproximadamente entre 3 y 20 SNPs. US20120270272 describe la metodología de discriminación basada en ligación alelo-específica y posterior amplificación por PCR universal utilizando oligonucleótidos específicos modificados con un grupo tiofosfato o azúcares y preferentemente ligasas termoestables. Esta metodología utiliza ligasas termoestables que no pueden ser inactivadas por un tratamiento térmico posterior (ligasas Taq o de Pyrococcus), por lo que durante la amplificación continúan los eventos de ligación y, en consecuencia, alterando la formación de productos de los diferentes SNPs.
Entre las técnicas versátiles y portables por ahora conocidas para el análisis de ácidos nucleicos se encuentra, por ejemplo, el empleo de discos ópticos como soporte para anclar biomoléculas y de lectores/grabadores de discos como detectores para estudiar diferentes biointeracciones (por ejemplo EP1324042, ES2304093A1 , Santiago et al. (2014), Sensors and Actuators B: Chemical, 204, p. 273-281). Se han descrito técnicas de discriminación de SNPs mediante hibridación alelo-específica sobre discos ópticos, donde la hibridación se realiza generalmente con oligonucleótidos sintéticos, por ejemplo, Moráis et al. (2006) Chemical Communications, 22, p. 2368-2370 (sólo un SNP), Bañuls et al. (2008) Bioconjugate Chemistry, 19, (3), p. 665-672 y Yu et al. (2013) Acc. Chem. Res., 46 (2), p. 258-268. Sin embargo, hasta ahora no se ha demostrado que esta técnica permita el genotipado masivo de SNPs. La principal causa es que cada polimorfismo, debido a su propia naturaleza y a los nucleótidos de su entorno, requiere unas condiciones específicas para su correcta discriminación. Por ello, establecer unas condiciones que permitan diferenciar simultáneamente un gran número de SNPs mediante este método resulta muy complejo.
Por lo tanto, se hace necesario un método robusto para la detección simultánea de SNPs u otras mutaciones, con capacidad de multiplexado suficientemente elevada, escalable, más simple y con un protocolo de trabajo corto.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En la presente invención se ha combinado un método de discriminación alélica, basado en ligación alelo-específica, y posterior amplificación con cebadores universales, con una detección por hibridación con sondas ancladas sobre una superficie, preferiblemente de un disco óptico bien sea CD, DVD, Blu-ray, etc. y utilizando un lector/grabador de discos ópticos. Esta aproximación preferente hace que la metodología presentada aúne la alta fidelidad y la capacidad de multiplexado de la discriminación por ligación y la amplificación-hibridación con cebadores y sondas universales, con las características propias de la detección basada en la tecnología de discos ópticos, tales como portabilidad, facilidad de manejo y bajo coste. Así, esta invención aporta un sistema robusto, analíticamente poderoso, fiable y económicamente competitivo de genotipado, que puede ser aplicado a gran escala en centros de salud, industrias, laboratorios o en situaciones de emergencia o críticas. El método de la presente invención se enmarca dentro de las metodologías de genotipado de polimorfismos u otras mutaciones, permitiendo un multiplexado suficiente para aplicarse efectivamente al ámbito clínico (por ejemplo en medicina personalizada) y el agroalimentario (por ejemplo para la autenticación de alimentos, tanto animales como vegetales), especialmente, y es fácil de ubicar en los lugares de interés (POC, "Point of care"). El método descrito es, por tanto, una clara alternativa a los métodos más largos y excesivamente caros, disponibles actualmente a nivel comercial para el genotipado de un número medio de mutaciones. En la presente invención el orden y el modo en que se realizan cada uno de los pasos del método tienen efecto sinérgico. En la presente invención la amplificación es una etapa clave y es posterior (a diferencia de la mayoría de técnicas basadas en la ligación) al paso de la ligación, que discrimina las diferentes variantes genéticas de los polimorfismos estudiados. Es decir, sólo se amplifican los productos alelo-específicos. Esto redunda en una mejor selectividad y un menor tiempo de análisis
El método de la presente invención también puede ser útil en el ámbito medioambiental (por ejemplo para la identificación de especies animales o vegetales) y en el forense (para identificación de individuos), entre otros.
La presente invención describe un método para el genotipado simultáneo de mutaciones, preferiblemente polimorfismos genéticos, especialmente polimorfismos de un único nucleótido (o SNPs, Single Nucleotide Polymorphism), también llamados polimorfismos de nucleótido simple.
El término "polimorfismo genético" se refiere a una variación en la secuencia de nucleótidos de la cadena de ácido desoxirribonucleico (ADN) que tiene al menos una frecuencia del 1 % en los individuos de una población. Los polimorfismos genéticos pueden ser variaciones de uno o varios nucleótidos. Particularmente, los polimorfismos de un solo nucleótido generalmente dan lugar a dos alelos. El genotipado de SNPs proporciona información sobre la variación de un solo polimorfismo o la información de un haplotipo (SNP etiquetas o "tagSNP"). "Haplotipo" es una combinación de alelos de diferentes loci de un cromosoma que son trasmitidos juntos. Un haplotipo puede ser un locus, varios loci, o un cromosoma entero dependiendo del número de eventos de recombinación que han ocurrido entre un conjunto dado de loci. En la presente invención nos referimos a "haplotipo" como un conjunto de polimorfismos (SNPs) que se heredan en bloque con unas medidas de desequilibrio de ligamiento r2≥0,8 y que se identifican mediante el genotipado de uno de los polimorfismos incluidos en dicho haplotipo. Por lo tanto, el método de la presente invención permite la detección de un determinado polimorfismo y/o haplotipo en un individuo. La presente invención emplea una técnica de discriminación alélica que comprende una ligación alelo-específica (mediante la acción de una enzima ligasa con capacidad para unir los oligonucleótidos específicamente diseñados para la discriminación de cada SNP a detectar) seguida de una amplificación con cebadores universales, hibridación con sondas ancladas en una superficie y la detección. En una realización particular, el soporte analítico es un disco óptico (ya sea en formato CD, DVD, Blu- Ray, discos de grabado termocrómico, etc.) y el detector es un lector/grabador de discos ópticos. Permite formalizar un desarrollo que reduce los tiempos de análisis, abarata y simplifica el ensayo, al mismo tiempo que lo convierte en una metodología fácilmente aplicable in situ.
En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un método de detección de al menos un polimorfismo u otra mutación, preferiblemente polimorfismo de un único nucleótido (SNP), en una muestra aislada de un sujeto que comprende (a partir de ahora el "método de la invención") los siguientes pasos:
a. ligación alelo-específica entre oligonucleótidos en disolución o en fase sólida;
b. amplificación de los productos de ligación obtenido en el paso (a), donde la amplificación se realiza utilizando al menos un cebador universal en disolución o en fase sólida, preferiblemente con una única pareja de cebadores universales;
c. hibridación del producto amplificado obtenido en el paso (b) con sondas, donde las sondas están fijadas en una superficie; y
d. detección del polimorfismo o mutación del producto obtenido en el paso (c).
El método de la invención permite detectar simultáneamente varios polimorfismos u otras mutaciones, preferiblemente polimorfismos de un único nucleótido (SNP).
En una realización preferida del método de la presente invención, los polimorfismos u otras mutaciones detectados simultáneamente son entre 5 y 200. En una realización más particular son más de 15 y menos de 100, los SNPs y/o mutaciones detectados. En una realización más particular son más de 20 los SNPs y/o mutaciones detectados, más preferiblemente de entre 30 y 100, es decir: 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100.
En el método de la presente invención, la ligación (discriminación alélica) del paso (a) se efectúa a través de una enzima ligasa, preferentemente termoestable, que enlaza oligonucleótidos diseñados ad hoc para cada gen y polimorfismo.
El término "ligasa termoestable" se refiere a que la enzima mantiene su actividad (ligación) incluso sometida a una temperatura elevada, por ejemplo, típicamente, una temperatura superior a 45 °C, y más preferiblemente de, al menos 60 °C. Ejemplos de ligasas termoestables pueden ser (pero sin limitarse): ligasas de Thermus aquaticus, Thermus themophilus o de Pyrococcus spp. Enzimas no termoestables como la T4 ligasa o ligasas de E. coli, podrían utilizarse, pero la tasa de error cometido aumentaría. Por lo tanto, las ligasas termoestables son la opción preferente porque al actuar a temperaturas elevadas (por ejemplo entre 60 y 65°C), se mantiene la alta fiabilidad del ensayo, reduciéndose la hibridación inespecífica con el ADN molde y, por tanto, la ligación no deseada. En una realización particular, la ligación se realiza a una temperatura de entre 60 a 65 °C (60, 61 , 62, 63, 64 o 65 °C). Preferiblemente, se utilizarán enzimas ligasas termoestables con tiempos de reacción cortos (5-15 minutos) y que puedan ser inactivadas previamente a la amplificación, por ejemplo, mediante un tratamiento térmico o la adición de un bloqueante, de modo que se evite que continúen los eventos de ligación durante esta etapa. Un ejemplo sería la "Ligasa 65" (Holland HRC), que es termoestable y puede ser inactivada mediante un tratamiento (por ejemplo de 5 minutos a 98 °C). Por este motivo, en una realización particular, previo a la amplificación, paso (b), se inactiva la ligasa del paso (a) durante 3-10 minutos (3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 minutos), preferiblemente de 5 minutos a 95-99 °C (95, 96, 97, 98 o 99 °C), preferiblemente a 98 °C. En una realización particular, la ligación se realiza en un tiempo entre 5 a 15 minutos a una temperatura de entre 60 a 65 °C y posteriormente se inactiva durante 3-10 minutos, preferiblemente durante 5 minutos a 95-99 °C, preferiblemente 98°C.
Para cada gen o polimorfismo, en la etapa de ligación se utilizan oligonucleótidos discriminantes (OD), uno para cada variante alélica, y un oligonucleótido común (OC) para todas las variantes. En una realización preferida, en caso de dos variantes alélicas, cada ligación del paso (a) se realiza mediante con dos oligonucleótidos discriminantes (por ejemplo, denominados como OD-A y OD-B) y un oligonucleótido común.
En el caso de SNPs, los oligonucleótidos utilizados el paso (a) poseen las siguientes características. Los oligonucleótidos ODs son complementarios al ADN genómico y se diferencian entre sí en el nucleótido de uno de sus extremos, que es específico para cada alelo. Los oligonucleótidos ODs pueden poseer desapareamientos con la región diana del ADN del sujeto para favorecer la correcta discriminación. Además, los oligonucleótidos ODs para un determinado polimorfismo pueden ser iguales o diferentes en tamaño. El oligonucleótido común (OC) es complementario al ADN genómico situado inmediatamente a continuación del SNP y en la misma hebra que los ODs. Los oligonucleótidos ODs o el oligonucleótido OC están fosforilados en un extremo para permitir la ligación. En una realización particular, los oligonucleótidos OD son complementarios al ADN genómico anterior al polimorfismo y tienen el nucleótido específico para cada alelo en el extremo 3' y el oligonucleótido OC está fosforilado en el extremo 5'. Además, los oligonucleótidos pueden poseer modificaciones que mejoren la selectividad del proceso y/o anclaje, tales como ácidos nucleicos bloqueados (LNA, locked nucleic acids), o estar modificados (en posición 5', posición 3' y/o nucleótidos internos) con estructuras como biotina, digoxigenina, azúcares, partículas y/o nanotubos.
Los oligonucleótidos empleados (OD y/o OC), además de la región complementaria al ADN genómico en estudio, poseen colas, secuencias genéricas no presentes en el genoma diana, que permiten la amplificación-hibridación en formato universal. Las colas incluidas en los OD (por ejemplo, OD-A, OD-B) y OC para la amplificación universal, pueden ser todas iguales, únicamente dos iguales o todas diferentes entre sí, pero son las mismas para todos los polimorfismos y/o alelos analizados. Particularmente, para lograr la amplificación universal, las secuencias de las colas utilizadas pueden ser, pero sin limitarse, SEQ ID NO: 1 , SEQ I D NO: 2 y SEQ ID NO: 3. En el caso de hibridación con sondas universales ancladas sobre el soporte, paso (c), el oligonucleotido OD, OC, o ambos además poseen una cola genérica pero diferente para cada polimorfismo y/o alelo.
El tamaño de los oligonucleótidos puede ser cualquiera, preferiblemente entre 16 a 100 nucleótidos, más preferiblemente entre 40 y 70 nucleótidos (es decir, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 o 70).
La reacción de discriminación alélica se inicia con la hibridación de los oligonucleótidos específicos (ODs y OC) con el ADN molde (Figura 1), y a continuación la enzima ligasa une los fragmentos adyacentes. La ligación tendrá lugar únicamente, o prioritariamente, cuando la complementariedad del OD, respecto al nucleótido correspondiente al alelo en estudio, sea perfecta; de modo que se obtendrán únicamente, o prioritariamente, los productos correspondientes al alelo/s propio/s del genoma de cada sujeto.
La etapa de ligación se puede llevar a cabo mediante una única reacción o mediante dos reacciones independientes de discriminación alélica, que difieren en los oligonucleótidos ODs empleados para cada SNP (Tabla 1). En el primer caso la mezcla de reacción contiene los oligonucleótidos OD (ejemplificados como OD-A, OD- B) y OC lo que permite formar simultáneamente los productos de ligación correspondientes a ambos alelos. En el segundo caso, la mezcla de reacción A contiene los oligonucleótidos OD-A y OC, y la mezcla de reacción B, los oligonucleótidos OD-B y OC. De este modo, cada reacción genera únicamente el producto de ligación específico para el alelo correspondiente a cada OD, si el ADN molde presenta dicha variante alélica.
Tabla 1 : Productos de ligación formados en función de los oligonucleótidos añadidos a la mezcla de reacción y del genotipo del sujeto para el polimorfismo analizado. En este caso, el alelo A es el nativo y el alelo B es el muíante.
Oligonucleótidos Homocigoto Homocigoto Heíerocigoío nativo muíante
Mezcla OD-A Producto Producto Ambos
OD-B nativo muíaníe producios
OC Reacción OD-A Producto No producto Producto
A OC nativo nativo
Reacción OD-B No producto Producto Producto
B OC muíante muíante
En el méíodo de la invención, la ligación del paso (a) puede ser realizada en disolución o en fase sólida, es decir, en la superficie de un soporte en coníacío con la disolución (Figura 2). En esíe segundo caso, al menos uno de los oligonucleóíidos implicados en la ligación esíá anclado en la superficie analííica y la ligación OD-OC da lugar al producío de ligación anclado a dicha superficie. El oligonucleóíido a anclar puede esíar modificado para permiíir o favorecer la inmovilización. En una realización particular, las modificaciones comprenden la inclusión de grupos íiol, amino, bioíina, digoxigenina, partículas o azúcares.
El anclaje de los oligonucleóíidos se realiza sobre íoda la superficie o en regiones específicas, prefereníemeníe, pero sin limiíarse, en formato de micromaíriz. Los métodos de anclaje comprenden adsorción direcía, adsorción indirecía, afinidad (ej. par esírepíavidina/bioíina, neuíravidina/bioíina, aníidigoxigenina/digoxigenina, lecíinas/azúcar, etc.), o covaleníe, eníre oíros modos (Figura 3). Las reacciones de inmovilización íipo covaleníe que pueden ser compaíibles incluyen reacciones vía grupos íiol, amino, eníre oíros, pudiendo incluir grupos espaciadores superficie-sonda, como por ejemplo, una cola de varios nucleóíidos de íimina o adenina. El íérmino "amplificación", íal y como se uíiliza en la presento descripción, paso (b), se refiere al aumento del número de copias de una región del ácido nucleico molde (Figura 4). La amplificación se realiza con los métodos conocidos por el experto en la maíeria. El paso (b) de amplificación del méíodo de la invención se puede realizar medianíe reacción en cadena de la polimerasa [PCR (polymerase chain reaction)] o reacciones de amplificación isoíerma, íales como amplificación RPA (amplificación recombinasa polimerasa, recombinase polymerase amplification) o SDA (amplificación por desplazamiento de hebra, strand displacement amplification), eníre oirás. En cualquier caso, la amplificación se lleva a cabo empleando cebadores universales. El término "cebador", como se utiliza aquí, se refiere a un oligonucleótido capaz de actuar como punto de inicio de la síntesis de ADN cuando híbrida con el ácido nucleico molde, es decir, con el producto de la ligación obtenido en el paso (a) del método de la presente invención.
El término "cebador universal", tal y como aquí se utiliza, se refiere a aquellos oligonucleótidos que no reconocen ninguna parte del genoma diana y son empleados para amplificar todos los productos de ligación al mismo tiempo, gracias a la incorporación previa de las colas pertinentes.
La amplificación ocurre para todos los genes, polimorfismos u otras mutaciones de forma simultánea, empleando cebadores universales que reconocen las colas presentes en los OD y OC. Preferiblemente, el número de cebadores empleados es entre 1 y 3, dependiendo del tipo de amplificación y de las secuencias de las colas presentes en los oligonucleótidos ligados. El tamaño de los cebadores puede ser cualquiera, preferiblemente entre 15 a 30 nucleótidos, más preferiblemente entre 18 y 24 (18, 19, 20, 21 , 22, 23 o 24). Las secuencias de los cebadores universales son las mismas o complementarias (total o parcialmente) a las secuencias de las colas presentes en los oligonucleótidos OD y/o OC. Particularmente, los cebadores empleados en la presente invención, pero sin limitarse, presentan las siguientes secuencias: SEQ ID NO: 1 , 2 y 4.
En una realización particular de la invención, cuando la ligación, paso (a), tiene lugar mediante dos reacciones independientes de discriminación alélica (A y B), se emplea una única pareja de cebadores universales (delantero y trasero) para cada reacción. Particularmente, las parejas de cebadores empleadas en la presente invención pueden tener, pero sin limitarse, las siguientes secuencias: la pareja SEQ ID NO: 1 y 4 o la pareja SEQ ID NO: 2 y 4. Asimismo, durante este paso (b) tiene preferiblemente lugar el mareaje de los productos ligados empleando cebadores marcados y/o nucleótidos funcionalizados, conocidos por cualquier experto en la materia. El término "nucleótido" incluye desoxirribonucleósidos trifosfato como, por ejemplo, pero sin limitarse, dATP, dCTP, dITP, dUTP, dGTP, dTTP, o derivados de los mismos, tales como LNA. Una alternativa de mareaje es realizar la modificación post-amplificación y/o post- hibridación de los productos formados, utilizando oligonucleotidos y/o nucleótidos funcionalizados. Marcadores o etiquetas detectables incluyen, por ejemplo, isótopos radiactivos, etiquetas fluorescentes, etiquetas quimioluminiscentes, etiquetas bioluminiscentes o etiquetas enzimáticas. En una realización preferente, los marcadores comprenden antígenos, partículas, fluoróforos o similares, unidos a los cebadores o como grupos funcionales de los nucleótidos.
La amplificación se realiza preferentemente en disolución (Figura 5). En este caso, los productos obtenidos tras la amplificación interaccionan posteriormente con las sondas inmovilizadas en la superficie, paso (c). Concretamente, se produce un reconocimiento de hibridación del producto amplificado con la sonda anclada.
En una realización particular de la presente invención, la amplificación se lleva a cabo en fase sólida (Figura 5). El término "amplificación en fase sólida" implica la inmovilización de al menos uno de los cebadores sobre la superficie sólida, ocurriendo la reacción de amplificación en la interfaz disolución-sólido y originando un producto anclado a dicha superficie. De este modo, los pasos (b) y (c) quedan integrados. En esta realización, los oligonucleotidos OD, OC, ambos, o regiones específicas para cada gen y polimorfismo se inmovilizan en una superficie para actuar como cebadores. Además, se puede añadir al menos un cebador universal a la disolución, en contacto con la superficie para permitir la amplificación o aumentar su rendimiento o especificidad. Particularmente, las secuencias de los cebadores universales empleados podría ser, pero sin limitarse, SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4.
Para llevar a cabo la amplificación en la realización preferida basada en la ligación en fase sólida, al menos uno de los cebadores universales está anclado o se añade a la disolución, en contacto con la superficie, y el producto de ligación (anclado en la superficie) actúa como molde de la amplificación (Figura 5). En este caso, al integrarse las etapas de amplificación e hibridación, se genera un producto final anclado a la superficie, y si se utilizan cebadores o nucleótidos marcados, el producto resultante también está marcado. Ejemplos de superficies incluirían derivados del silicio, polímeros naturales o sintéticos, entre otros. El término "hibridación", tal y como se utiliza en la presente descripción del paso (c), se refiere al apareamiento de dos moléculas complementarias de ácido nucleico (de ADN y/o ARN) de cadena simple para dar lugar a una molécula de doble cadena (Figura 6). La hibridación se produce en condiciones controladas de pH, contenido salino, astringencia, temperatura y tiempo. Los componentes de la mezcla de hibridación comprenden, por ejemplo, citrato sódico salino (SSC) a pH 7, formamida, Denhardt's, etc. Variaciones en las concentraciones de estos componentes influyen en la especificidad y selectividad de la hibridación, tal y como es conocido por el experto en la materia. La temperatura de hibridación puede ser, por ejemplo, de entre 35 y 45°C (35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44 o 45°C) y el tiempo de hibridación es, preferiblemente, entre 30 minutos y 2 horas (por ejemplo, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 1 10, 1 15 o120 minutos). Una de las moléculas participantes es el producto de ligación o de amplificación y se encuentra en disolución. Las otras moléculas que participan en la hibridación, denominadas "sondas", se encuentran ancladas sobre una superficie (o soporte, o soporte sólido o superficie sólida). En una realización preferida, las sondas en el paso (c) de hibridación son ácidos nucleicos y tienen un tamaño de entre 20 y 30 nucleótidos. En otra realización particular las sondas pueden ser aptámeros o ácidos nucleicos modificados, tales como LNAs. El anclaje de las sondas se realiza sobre toda la superficie o en regiones específicas, preferentemente, pero sin limitarse, en formato de micromatriz. El oligonucleótido a anclar puede estar modificado para permitir la inmovilización. En una realización particular, las modificaciones comprenden la inclusión de grupos tiol, amino, biotina, digoxigenina, partículas o azúcares. También pueden incluir modificaciones que mejoren la selectividad del proceso, tales como ácidos nucleicos bloqueados (LNA, locked nucleic acids). Las sondas son inmovilizadas sobre la superficie mediante adsorción directa, adsorción indirecta, afinidad (ej. par estreptavidina/biotina, neutravidina/biotina, antidigoxigenina/ digoxigenina, lectinas/azúcar, etc.), o por anclaje covalente, entre otros modos de fijación de sondas (Figura 3). Las reacciones de inmovilización tipo covalente que pueden ser compatibles incluyen reacciones vía grupos tiol, amino, entre otros, pudiendo incluir grupos espaciadores superficie-sonda, como por ejemplo, una cola de varios nucleótidos de timina o adenina. Las sondas pueden tener una secuencia específica del gen en cuestión, o ser sondas genéricas. Las sondas genéricas son aquellas que no hibridan con el genoma diana, pero reconocen a las colas presentes en los oligonucleótidos empleados, preferentemente en aquellos empleados en la ligación (OD, OC o ambos). Con esta opción, las sondas son diseñadas para que hibriden con los oligonucleótidos diana en condiciones de hibridación sustancialmente similares. Por lo tanto, esta aproximación aporta versatilidad a la plataforma de genotipado, ya que permite mantener las mismas sondas y condiciones de hibridación para cualquier conjunto de polimorfismos o mutaciones en estudio.
En una realización preferida, las sondas en el paso (c) de hibridación tienen un tamaño de entre 20 y 30 nucleótidos, preferiblemente de 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleótidos. En el paso (c) del método de genotipado propuesto, cuando la amplificación tiene lugar en disolución, los productos generados en la amplificación, paso (b), son reconocidos específicamente por un conjunto de sondas ancladas sobre la superficie. En las realizaciones particulares basadas en la ligación en fase sólida y la amplificación en fase sólida, este paso (c) ocurre de forma integrada al paso (b) del método, reduciendo los tiempos de ensayo y la manipulación requerida.
El mareaje de los productos hibridados o amplificados en la superficie también puede realizarse, incluyendo una etapa previa, simultánea o posterior de hibridación, ligación o extensión, entre otras. En una opción preferida, se incorpora un paso de hibridación adicional para el mareaje de los productos formados, utilizando un oligonucleótido complementario al producto y que contiene un marcador como biotina o digoxigenina, entre otros.
En otra realización preferida del método de la invención, los oligonucleótidos, sondas o cebadores, anclados sobre la superficie pueden ser específicos o genéricos o comprender una región específica y una genérica.
En la presente invención los términos "superficie", "soporte", "soporte sólido" o "superficie sólida" se utilizan indistintamente. En la presente invención los términos "anclado", "inmovilizado" y "fijado" se utilizan indistintamente. El soporte para realizar el genotipado de polimorfismos y/o mutaciones (en los pasos (a), (b) y/o (c)) puede ser cualquier superficie (láminas, chips o partículas) de un material polimérico, derivado del silicio, etc. siempre que permita la inmovilización de las sondas y la detección del producto formado (paso (d)). El número de micromatrices, réplicas y su configuración espacial en el ensayo puede ser variado. Las dimensiones de las regiones de interacción pueden ser del orden de nanómetros o superiores. En una realización preferida, el soporte es la superficie de un disco óptico o disco compacto y en el paso (d) la detección se realiza utilizando lectores de disco óptico o disco compacto.
Por "disco óptico" o "disco compacto" se entiende un medio de almacenamiento de datos de tipo óptico, que consiste esencialmente en un disco en el cual la información se codifica, guarda y almacena en los surcos microscópicos generados en una de las capas planas que lo componen. Cualquier tipo o morfología de la información (texto, imagen, audio, vídeo, etc.) puede ser codificada en formato digital y almacenada en este tipo de soportes. Se pueden seleccionar, sin limitarse, a CD (Compact Disc o disco compacto), DVD (Digital Versatile Disc o Digital Video Disc), Blu-ray, entre otros. El disco utilizado puede ser cualquier disco de un estándar comercial o no, que se pueda leer con un lector/grabador que preferiblemente utilice un cabezal láser para leer/grabar. El disco a utilizar puede estar sin modificar o incluir alguna etapa de pretratamiento, tales como lavado, activación, recubrimiento, etc. También incluyen discos que incorporen capas adicionales, por ejemplo microfluídicas. El uso de este tipo de superficies proporciona a la presente invención una superficie de trabajo de altas prestaciones (robusta, versátil, económica, etc.) y un método sencillo y rápido, además de barato y fácil de implementar en el lugar requerido. En una realización particular, el soporte son discos sin modificar o sus variantes modificadas que preferiblemente comprenden superficies tratadas o discos con un mayor número de capas (discos ópticos multicapa).
El anclaje de los oligonucleótidos puede realizarse directamente sobre la superficie del disco o sobre una capa polimérica añadida al disco (Figura 3). Para lograr un buen rendimiento de inmovilización de oligonucleótidos, el disco óptico puede ser pretratado con tratamientos que no dañen sus propiedades ópticas, como por ejemplo disoluciones de lavado, adición de capas poliméricas, estructurado o microestructurado, irradiado o sometido a ataque con plasma, entre otros conocidos por un experto en la materia. Los oligonucleótidos pueden estar dispuestos en el disco en formato de micromatriz, pudiendo incluir controles positivos y negativos (Figura 7).
En el paso (d) del método de la invención, se produce la detección del SNP o mutación gracias al mareaje realizado, mediante observación o con un detector. Este proceso puede ser directo si las etapas anteriores del método han originado un producto detectable, o incluir varias etapas de revelado o amplificación para generar el producto detectable y/o aumentar la cantidad de producto detectable. El "producto detectable", tal como se entiende en la presente descripción, es una especie que origina una señal observable o una respuesta en el detector. Estos productos comprenden compuestos con grupos redox, fluorescentes o luminiscentes, sólidos, precipitados, partículas, depósitos metalográficos, enzimáticos o compuestos coloreados, entre otros. Ejemplos de procesos de detección comprenden la medida de la emisión, absorción, transmisión, conductividad o variaciones de voltaje, entre otros, utilizando equipos como espectrofotómetros, fluorímetros, conductímetros o voltamperímetros, entre otros.
En la presente invención, la detección se realiza preferiblemente mediante la medida de la interacción con un haz láser emitido por un lector de discos ópticos (lector de CD, DVD, Blu-Ray, por ejemplo). Se entiende por "lector de disco óptico", el dispositivo capaz de obtener la información almacenada en dicho disco utilizando un láser que le permite leer dicha información. En esta categoría, se incluyen los lectores/grabadores de CDs, DVDs, Blu-Rays y cualquier dispositivo capaz de escanear la superficie del disco con un haz láser.
Para la detección mediante un lector de discos ópticos, se necesita la formación de un producto o depósito capaz de interaccionar con la luz (absorber, dispersar, etc.) modificando la intensidad del haz láser (Figura 8). Estos productos comprenden sólidos, precipitados, depósitos metalográficos, enzimáticos o compuestos coloreados, entre otros. Una realización preferida es el mareaje del producto con un antígeno y posterior incubación con anticuerpos que reconocen dicho antígeno y que están conjugados a marcadores como enzimas, partículas, etc., dando lugar a la modificación de la intensidad del haz láser del lector de disco óptico.
El método permite el genotipado en una muestra aislada de un sujeto en estudio que comprende ADN. Por "muestra aislada" se entiende una parte o porción representativa extraída del sujeto. Por "sujeto" se entiende cualquier organismo (animal, vegetal, bacteriano, etc.) o mezcla de organismos o sus derivados, por ejemplo alimentos (en este caso el alimento comprende una porción del animal o vegetal del que deriva, por ejemplo tejidos, músculo, grasa, tendones en animales o partes del vegetal por ejemplo, raíces, hojas, inflorescencias o tallos). En la presente invención, el sujeto es, preferiblemente, un humano, hombre o mujer de cualquier edad, nacido o no nacido (ya que el método de la invención es de utilidad también en diagnóstico prenatal). En la presente invención el término "humano", "paciente" e "individuo" se utilizan indistintamente. En el caso de humanos o pacientes, la muestra (muestra biológica) se puede seleccionar de la lista que consiste en: sangre, suero, plasma, linfa, orina, saliva, lavado broncoalveolar, esputo, líquido pleural, líquido cefalorraquídeo, líquido sinovial, tejido, frotis bucal, secreción lacrimal u otros tejidos o fluidos. Preferiblemente, la muestra es fresca, congelada, fijada o fijada y embebida en parafina. La extracción del ADN genómico de las muestras, se lleva a cabo por métodos convencionales o empleando kits comerciales. El ADN puede ser de un embrión o feto y la muestra puede ser una muestra materna, por ejemplo sangre, que comprenda el ADN del embrión o feto.
Por tanto, en la presente invención se ha desarrollado un método de genotipado simultáneo, económico, sensible y específico de polimorfismos y/o mutaciones, siendo especialmente adecuado para el genotipado de SNPs.
El método de la presente invención puede también comprender la detección de un control interno (o estándar), dicho control se puede añadir a la muestra a analizar y/o ser una región, polimorfismo o mutación del genoma del sujeto.
El método de la presente invención es útil para detectar enfermedades genéticas o cáncer, como herramienta en farmacogenética/farmacogenómica (para establecer la dosis del fármaco o el tipo de tratamiento específico para un paciente) y en otras aplicaciones clínicas. También es útil en los ámbitos agroalimentario (p. e. autentificación de alimentos), medioambiental-biológico (p. e. identificación de especies animales o vegetales) y forense (p. e. identificación de restos humanos), entre otros. La presente invención también se refiere a un kit (también puede ser un dispositivo) que comprende los elementos necesarios para llevar a cabo el método de la presente invención. Preferiblemente, comprende una ligasa, al menos un cebador universal, al menos una sonda y una superficie de soporte, preferiblemente un disco óptico o disco compacto, como CD, DVD, Blu-Ray y similares, y un detector, preferiblemente, un lector de disco óptico o disco compacto. La presente invención también se refiere al uso del kit (o del dispositivo) para la realización del método de la presente invención.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones, la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
FIG. 1 Esquema de la discriminación del polimorfismo mediante el uso de oligonucleotido discriminante (OD) y oligonucleotido común (OC). (I) Complementariedad total e (II) Complementariedad parcial.
FIG. 2 Reacción de ligación en disolución (I) y en fase sólida o en la superficie del disco (II). Oligonucleotido discriminante para la variante alélica A (OD-A) o B (OD-B) y oligonucleotido común (OC). FIG. 3 Esquema de los modos de inmovilización de oligonucleótidos sobre la superficie analítica: (I) covalente directo, (II) adsorción indirecta o afinidad, (III) covalente indirecto o sobre capa adicional, (a) oligonucleotido con secuencia específica o genérica, (b) cola o espaciador, (c) molécula de anclaje, (d) capa polimérica, (e) superficie. FIG. 4 Reacción de amplificación-mareaje de los productos de ligación. Oligonucleótido discriminante (OD) y oligonucleótido común (OC).
FIG. 5 Amplificación en disolución (I), amplificación en fase sólida (II) y amplificación del producto de ligación anclado (III): (a) Producto de ligación, (b) Cebador, (c) Producto de amplificación marcado, (d) Superficie, (e) Cebador anclado, (f) Producto de amplificación marcado e inmovilizado, (g) Producto de ligación anclado.
FIG. 6 Esquema de la hibridación de los productos de amplificación con las sondas inmovilizadas en la superficie. (I) Reconocimiento positivo y (II) ausencia de reconocimiento, (a) Superficie, (b) sondas ancladas en la superficie, (c) producto de amplificación marcado.
FIG. 7 Esquema de disposición de las sondas en formato de micromatriz sobre un disco óptico.
FIG. 8 (I) Principio de lectura por reflexión de los productos formados en la superficie del disco utilizando lectores/grabadores de discos compactos. (II) Registros de variación de la intensidad del haz en función de la posición en el disco, (a) Disco óptico, (b) lector, (c) haz de luz emitido, (d) haz de luz reflejado, (e) producto formado. FIG. 9 Esquema del procedimiento ejemplo I para el genotipado de SNPs.
FIG. 10 Imágenes de resultados de los ensayos. Izquierda: Matriz de sondas ancladas sobre el DVD. Centro: Imagen resultante del ejemplo I para sondas del alelo 1 (4 puntos/gen). Derecha: Imagen resultante del ensayo 1 para sondas del alelo 2 (4 puntos/gen). Los resultados de este ejemplo son: gen1 :GG, gen2:CT, gen3:AG, gen4:CC, gen5:GG, gen6:CC, gen7:AA, gen8:TT, gen9:GG, gen10:AG, gen11 :AA, gen12:CC, gen13:CT, gen14:CG, gen15:AG, gen16:CT, gen17:GG, gen18:AG, gen19:CG, gen20:CC, gen21 :GG, gen22:CC, gen23:CC, gen24:TT. Control positivo: Sonda marcada con digoxigenina. Control negativo: Sonda que no es reconocida por ninguno de los productos de amplificación.
FIG. 11 Esquema del procedimiento del ejemplo II para el genotipado de SNPs. FIG. 12 Imágenes de resultados del ejemplo II. Izquierda: Matriz de sondas ancladas sobre el DVD. Centro: Imagen resultante del ensayo 2 para sondas del alelo 1 (4 puntos/gen). Derecha: Imagen resultante del ensayo 2 para sondas del alelo 2 (4 puntos/gen). Los resultados de este ejemplo son: gen1 :AG, gen2:TT, gen3:AG, gen4:GG, gen5:AA, gen6:GG, gen7:GG, gen8:CA, gen9:GG, gen10:GG, gen11 :AA, gen12:CC, gen13:CG, gen14:AG, gen15:AA, gen16:CT, gen17:GG, gen18:CT. Control positivo: Sonda marcada con digoxigenina. Control negativo: Sonda que no es reconocida EJEMPLOS
A continuación se ilustrará la invención mediante ensayos realizados por los inventores, demostrando la viabilidad y la efectividad del producto de la invención. Ejemplo 1 : Genotipado de SNPs mediante ligación, amplificación por PCR e hibridación con sondas universales ancladas sobre disco óptico
La muestra de ADN se obtiene a partir de frotis bucal. Para cada muestra se llevan a cabo dos reacciones de discriminación alélica (A y B) que difieren en los oligonucleotidos discriminantes empleados para cada SNP. Se emplean discos DVD-R de 12 cm de diámetro como soporte de ensayo y un lector/grabador de DVDs como detector. El protocolo de ensayo comprende varias etapas (Figura 9).
En la discriminación alélica, se distinguen los siguientes pasos:
Desnaturalización del ADN. Se añaden 10-100 ng de ADN genómico al tampón de reacción y se incuba a 95 °C durante 5 min.
Hibridación de los oligonucleotidos con el ADN molde. Para cada polimorfismo se añade un oligonucleótido OD, con una secuencia alelo-específica y una cola para la amplificación universal, SEQ ID NO: 6, 7, 10, 1 1 , 14, 15, 18, 19, 22, 23, 26, 27, 30, 31 , 34, 35, 38, 39, 42, 43, 46, 47, 50, 51 , 54, 55, 58, 59, 62, 63, 66, 67, 70, 71 , 74, 75, 78, 79, 82, 83, 86, 87, 90, 91 , 94, 95, 98 y 99 (Tabla 2). Además se añade para cada polimorfismo, un oligonucleótido OC cuya secuencia posee una región en el extremo 3' específica del gen, una región central para la hibridación con sondas universales y una región en el extremo 5' para la amplificación universal, SEQ ID NO: 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96 y 100 (Tabla 2). La hibridación tiene lugar a 60°C durante 7 minutos. Ligación de los oligonucleótidos. Se añade una disolución que contiene la enzima Ligasa 65 (MRC-Holland). Se mantiene a 60°C durante 7 minutos y se inactiva mediante tratamiento térmico (5 minutos a 98°C). La reacción de amplificación tiene lugar mediante PCR con una pareja de cebadores universales que hibridan con las colas incorporadas en los oligonucleótidos ligados. En la reacción de amplificación A, se emplean los cebadores SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 4, y en la reacción B, los cebadores SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 4. La mezcla de reactivos empleada contiene tampón de amplificación, enzima polimerasa, nucleótidos y cebadores universales, estando los cebadores SEQ ID NO: 1 y 2 marcados con digoxigenina en el extremo 5'. La disolución que contiene los productos de ligación se añade a la mezcla de reactivos y se aplica el programa de temperaturas. No se requiere ningún paso de purificación o mareaje posterior. El anclaje de las sondas, funcionalizadas con biotina, se realiza vía adsorción indirecta (estreptavidina/biotina) sobre la cara de policarbonato del DVD-R en la que incidirá el láser del lector/grabador de DVDs. Las sondas son genéricas, es decir, no presentes en el genoma diana, pero complementarias a la cola presente en el oligo OC de cada gen y polimorfismo SEQ ID NO: 5, 9, 13, 17, 21 , 25, 29, 33, 37, 41 , 45, 49, 53, 57, 61 , 65, 69, 73, 77, 81 , 85, 89, 93 y 97 (Tabla 2).
La hibridación de los productos amplificados con las sondas se realiza diluyendo 1/10 los productos en tampón de hibridación (tampón citrato sódico salino 65 mM, pH 7 y 25% de formamida). Las disoluciones de cada reacción de discriminación (A y B) se hibridan en su correspondiente micromatriz de sondas. El proceso se lleva a cabo en estufa a 37°C durante una hora.
El revelado se realiza por incubación del disco con un anticuerpo de oveja anti- digoxigenina (abcam, ab64509) y un anticuerpo anti-oveja marcado con la enzima peroxidasa (HRP) (abcam, ab6747) en tampón fosfato salino 100 mM, pH 7,5, durante 30 minutos a temperatura ambiente. Tras añadir disolución de 3, 3', 5,5'- tetrametilbencidina se forma un precipitado que será detectado al leer el disco con un lector/grabador de DVDs, registrando la variación de intensidad del haz reflejado. La figura 10 muestra la imagen resultante del genotipado simultáneo de 24 SNPs de un individuo. El formato de la matriz de sondas presenta un diseño con 26 sondas (24 genes y 2 controles) con 4 réplicas de cada una. Tabla 2: Listado de oligonucleótidos utilizados para el genotipado mediante ligación, amplificación por PCR e hibridación con sondas universales ancladas sobre disco DVD
(Ejemplo 1 : 24 genes)
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Ejemplo 2: Genotipado de SNPs mediante ligación en fase sólida sobre disco óptico La muestra de ADN se obtiene a partir de suero sanguíneo. Para cada muestra se llevan a cabo dos reacciones de discriminación alélica (A y B), en dos zonas diferentes del disco. Se emplean discos ópticos tipo discos versátiles digitales de 12 cm de diámetro (DVD-R) como soporte de ensayo y un lector/grabador de DVDs como detector. El protocolo posee diferentes pasos (Figura 1 1). Comienza con una reacción de ligación en fase sólida en la zona del disco que contiene inmovilizados cada uno de los oligonucleótidos discriminantes. Posteriormente, se realiza una amplificación dispensando sobre el disco uno o dos de los cebadores universales que poseen las mismas secuencias o complementarias reversas a las colas de los OD y OC, respectivamente.
Para ello, se realiza la desnaturalización del ADN, mezclando el extracto de ADN genómico con el tampón de reacción e incubando a 95 °C durante 5 min y, posteriormente, se dispensa sobre la micromatriz de un disco DVD con los oligonucleótidos OD (Tabla 3). Éstos poseen el extremo 5' fosforilado y están anclados vía covalente en la superficie del disco a través de su extremo 3' y un grupo amino, siguiendo un formato de micromatriz. También se añaden los oligonucleótidos comunes (OC), listados en tabla 3, y la enzima Ligasa 65, incubándose a 60°C durante al menos 30 min en agitación. El posterior ciclo de lavado con tampón fosfato salino 100 mM, pH 7,5 y agua, elimina el exceso de OC y ADN molde. El resultado de la reacción es la formación de los productos de ligación en aquellos casos en que se encuentre el correspondiente alelo.
La amplificación isoterma tipo RPA se logra dispensando la mezcla que contiene el tampón de amplificación, los cebadores universales y los deoxinucleótidos funcionalizados con biotina. En la reacción de amplificación A se emplean los cebadores SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 4, y en la reacción B los cebadores SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 4. Se incuba durante 60 min a 40°C y se lava con disolución de lavado. El posterior revelado se lleva a cabo con anticuerpo anti-biotina conjugado a nanopartículas de oro de 10 nm de diámetro. Se realiza un revelado metalográfico basado en la reacción de reducción de iones plata catalizada por oro y la consecuente formación de depósitos de plata metálica sobre la superficie del disco óptico. La variación de intensidad del haz reflejado es registrada con un lector/grabador de DVDs. La figura 12 muestra la imagen resultante del genotipado simultáneo de 18 SNPs en una muestra de un mismo individuo. El formato de la matriz presenta un diseño con 20 sondas (18 genes y 2 controles) y 4 réplicas de cada una.
Tabla 3: Listado de oligonucleótidos utilizados para el genotipado mediante ligación y amplificación-hibridación en fase sólida sobre DVD
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RESULTADOS:
El método de la presente invención resuelve ventajosamente el problema del genotipado de polimorfismo y/o mutaciones que las aproximaciones previas conocidas por el experto en la materia, basadas en hibridación alelo-específica combinada con tecnología de disco compacto (o no) o que las aproximaciones basadas en ligación combinadas con electroforesis capilar, técnicas de microscopía óptica, escáneres de fluorescencia u otros instrumentos. Respecto a las primeras se mejora el número de polimorfismos genotipados, condiciones de trabajo, flexibilidad del sistema, etc., y en comparación con las segundas, se trata de un sistema de medida sencillo, barato, portátil y, con gran capacidad de trabajo.

Claims

REIVINDICACIONES
Método de detección de al menos un polimorfismo genético u otra mutación, preferiblemente de polimorfismo de un único nucleótido (SNP), en una muestra aislada de un sujeto que comprende los siguientes pasos:
a. ligación alelo-específica entre oligonucleótidos en disolución o en fase sólida, donde la ligación se realiza mediante una ligasa termoestable durante un tiempo de entre 5 a 15 minutos y posteriormente se inactiva la ligasa;
b. amplificación de al menos un producto de ligación obtenido en el paso (a), donde la amplificación se realiza utilizando al menos un cebador universal en disolución o en fase sólida;
c. hibridación de al menos un producto amplificado obtenido en el paso (b) con al menos una sonda, donde la sonda está fijada en una superficie; y d. detección del polimorfismo y/o mutación del producto obtenido en el paso (c);
donde la etapa (b) de amplificación se realiza posteriormente a la etapa (a) de ligación.
Método según la reivindicación 1 donde los polimorfismos y/o mutaciones detectados simultáneamente son entre 5 y 200; preferiblemente son entre 15 y 100.
Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 donde cada ligación del paso (a) se realiza mediante al menos un oligonucleótido discriminante y un oligonucleótido común.
Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 donde la ligación tiene lugar en fase sólida, y al menos uno de los oligonucleótidos está anclado en la superficie.
Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 donde en el paso (a) de la ligación la inactivación se lleva a cabo a 95-99 °C, preferiblemente a 98°C, durante entre 3-10 minutos, preferiblemente 5 minutos.
6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 donde la amplificación del paso (b) se realiza mediante reacción en cadena de la polimerasa y/o reacción de amplificación isoterma, preferiblemente amplificación recombinasa polimerasa o amplificación por desplazamiento de hebra, en fase sólida.
7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 donde la amplificación del paso (b) se realiza utilizando nucleótidos marcados y/o cebadores marcados; preferiblemente los marcadores son antígenos, partículas o fluoróforos. 8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 donde los oligonucleótidos, sondas y/o cebadores anclados sobre la superficie son específicos, genéricos o comprenden una región específica y una genérica.
9. Método según la reivindicación 8 donde el anclaje sobre la superficie se realiza, en formato de micromatriz, preferiblemente además incluye controles.
10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 donde la superficie en la que se anclan los oligonucleótidos, sondas, y/o cebadores, es un disco óptico o disco compacto, y la detección (paso (d)) se realiza utilizando lectores de disco óptico o disco compacto.
1 1. Método según la reivindicación 10 donde los discos se seleccionan de la lista que consiste en: CD, DVD, Blu-ray, sin modificar o modificada, que preferiblemente comprenden superficies tratadas o discos ópticos multicapa.
12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 11 donde la detección se realiza de una partícula, un depósito metalográfico, un depósito enzimático o un compuesto coloreado. 13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 donde el sujeto es un organismo, mezcla de organismos o sus derivados, preferiblemente es un humano.
14. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 donde la muestra aislada se selecciona de la lista que consiste en: sangre, suero, plasma, linfa, orina, saliva, lavado broncoalveolar, esputo, líquido pleural, líquido cefalorraquídeo, líquido sinovial, tejido y secreción lacrimal.
15. Método según la reivindicación 14 donde la muestra es fresca, congelada, fijada o fijada y embebida en parafina.
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