WO2017008134A1 - Desenvolvimento de linhagens de arroz (oryza sativa l.) com resistência a herbicidas inibidores da enzima acetyl coenzima a carboxilase (accase) obtidas por mutação induzida com raios gama - Google Patents

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Moacir Antônio SCHIOCCHET
Fernando Adami TCACENCO
Adriana PEREIRA
Rubens MARSCHALEK
Domingos Savio EBERHARDT
Augusto TULMANN NETO
José Alberto NOLDIN
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Definitions

  • the invention is the development of rice (Oryza sativa L.) strains with resistance to acetyl coenzyme A carboxylase enzyme (ACCase) herbicide inhibitor herbicides obtained by mutation induced by gamma rays.
  • rice Oryza sativa L.
  • ACCase acetyl coenzyme A carboxylase enzyme
  • US2013 / 0023416A1 and US 2014/0045686 disclose rice plants with ACCase inhibitor herbicide resistance. The difference between patents is in the position of the altered nucleotide of the gene responsible for encoding the ACCase enzyme.
  • US20150106970 describes the application of gamma rays for the mutation of the japonica rice subspecies at a radius dosage of 280 Gy.
  • strains in the process described in this report, have a G> T substitution mutation at the position corresponding to the codon that gives rise to amino acid 2027 (referring to the Alopecurus myosuroides standard, accession number AJ632096, GenBank CAC84161 .1) at the carboxyl site. - ACase transferase.
  • the invention includes plants that present a nucleic acid mutation of the gene responsible for coding the enzyme. ACCase. Mutated plants show a differential response to herbicides when compared to rice plants without the mutation.
  • the plants have the G2027T mutation (Alopecurus myosuroides, accession number AJ632096, Gen Bank CAC84161 .1) nomenclature at the carboxyl transferase site of the enzyme acetyl coenzyme A carboxylase, which confers resistance to the action of ACCase inhibiting herbicides.
  • the present invention also includes seeds produced by these plants and the weed control methods in rice fields.
  • the present invention describes rice plants, which show a variation in the gene coding for the enzyme Acetyl Coenzyme A carboxylase, promoting resistance to ACCase inhibitor herbicides compared to a wild variety of the plant.
  • Figure 1 represents the sequence SEQ ID NO: 1 of the genetically modified rice line.
  • Figure 2 shows the effect of ACCase enzyme inhibitor herbicide (haloxyfop-p-methyl (Verdict R, 2 L / ha) 30 days after application on SCM 268 (A) strain SC plants 155 (B) and the SCM 269 (C) strain.
  • ACCase enzyme inhibitor herbicide haloxyfop-p-methyl (Verdict R, 2 L / ha) 30 days after application on SCM 268 (A) strain SC plants 155 (B) and the SCM 269 (C) strain.
  • Figure 3 shows the effect of the ACCase inhibitor herbicide (quizalofop-p-ethyl-Targa 50 CE, 2 L / ha) at 30 days after application on SCM 268 (A), SC 155 (B) and SCM 269 (C) plants.
  • ACCase inhibitor herbicide quizalofop-p-ethyl-Targa 50 CE, 2 L / ha
  • Figure 4 shows the effect of ACCase inhibitor herbicide (haloxyfop-p-methyl-Verdict, 2 L / ha), 15 days after application, on SCM 268 (A) strain SC 155 (B) and SCM 269 (C).
  • the process for generating mutants by inducing gamma ray mutation to develop rice strains with ACCase inhibitor herbicide resistance comprises the steps of a) Formation of mutant strains. b) Selection of herbicide resistant plants, c) Alteration of the amino acid sequence of the strains promoted resistance to ACCase inhibiting herbicides. d) Selection of resistant plants.
  • the seeds (300 g) of the SC 155 rice line were irradiated with 25 krad gamma rays at Cena / USP, Piracicaba, S ⁇ o Paulo. After irradiation, the seeds were sown in boxes with sandy soil at Epagri / Experimental Station of Itaja ⁇ . In the two to three leaf stage, the seedlings were transplanted individually to the field, forming the population (Mi) with approximately 25,000 plants. At maturation, three panicles were harvested from each plant, forming the seeds of generation M2.
  • the M2 generation seeds of the mutation-derived populations were sown in the field, totaling an estimated population of 5 million plants. When the plants reached the stage of three to four leaves, they were sprayed with 1.5 L / ha of haloxyfop-p-methyl herbicide. The evaluations and Survival plants were selected 15 days after herbicide treatment. During the evaluations and selection, two plants that presented resistance to the herbicide were found.
  • progenies were selected and conducted as strains, and the evaluation of the productive and agronomic potential was carried out under cultivation conditions. Either of the rice strains could give rise to a cultivar with high yield potential and appropriate agronomic characteristics, representing an alternative technology for the control of weed rice and other weedy rice crop weeds.
  • ACCase inhibitory herbicide resistant cultivars may be screened by herbicide application or by molecular techniques. Molecular markers may be used to select plants that have resistance to ACCase inhibitor herbicides. Molecular techniques and herbicide bioassays can facilitate the development of new rice varieties that are resistant to ACCase inhibitors.
  • Figure 1 shows the sequence listings of genetically modified rice strains (Oryza sativa L) with acetyl coenzyme A carboxylase (ACCase) inhibiting herbicides obtained by gamma-induced mutation, called SEQ ID NO: 1.

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Abstract

A presente invenção revela o desenvolvimento de linhagens de arroz (Oryza sativa L.) com resistência a herbicidas inibidores da enzima acetyl coenzima A carboxilase (ACCase) através da aplicação de raios gama para a produção da espécie Oryza sativa L. modificada com a sequência descrita em SEQ ID NO: 1 e as linhagens do arroz compreendem a mutação de substituição da base nitrogenada Guanina por Timina na posição correspondente ao códon que dá origem ao aminoácido 2027 no sítio carboxil-transferase da enzima da ACCase e as plantas de arroz apresentam uma variação no gene que codifica para a enzima Acetil-coenzima A carboxilase, promovendo resistência a herbicidas inibidores da ACCase, em comparação com variedade selvagem da planta.

Description

Desenvolvimento de linhagens de arroz {Oryza sativa L.) com resistência a herbicidas inibidores da enzima acetyl coenzima A carboxilase (ACCase) obtidas por mutação induzida com raios gama.
[001 ] A invenção, descrita neste relatório, consiste no desenvolvimento de linhagens de arroz (Oryza sativa L.) com resistência a herbicidas inibidores da enzima acetyl coenzima A carboxilase (ACCase) obtido por mutação induzida com raios gama.
[002] Os documentos US2013/0023416A1 e US 2014/0045686 revelam plantas de arroz com resistência a herbicidas inibidores da ACCase. A diferença entre as patentes está na posição do nucleotídeo alterado do gene responsável por codificar a enzima da ACCase. O documento US20150106970 descreve a aplicação de raios gama para a mutação da subespécie de arroz, japonica , numa dosagem de raios de 280 Gy.
[003] O processo de obtenção da linhagem com tolerância a inibidores da ACCase, descrito neste relatório, é distinto das referidas patentes. Nas patentes citadas, a obtenção das linhagens é por mutação química enquanto que no processo descrito neste relatório é por mutação física através de raios gama.
[004] As linhagens, no processo descrito neste relatório, apresentam uma mutação de substituição G>T na posição correspondente ao códon que dá origem ao aminoácido 2027 (referente ao padrão Alopecurus myosuroides, accession number AJ632096, GenBank CAC84161 .1 ) no sítio carboxil- transferase da enzima da ACCase.
[005] O invento, revelado neste relatório, inclui plantas que apresentam uma mutação no ácido núcleico do gene responsável pela codificação da enzima ACCase. As plantas com mutação apresentam uma resposta diferencial a herbicidas quando comparadas a plantas de arroz sem a mutação. As plantas apresentam a mutação G2027T (nomenclatura referente à gramínea Alopecurus myosuroides, accession number AJ632096, Gen Bank CAC84161 .1 ) no sitio carboxil-transferase da enzima acetyl coenzima A carboxilase, que confere resistência a ação de herbicidas inibidores da ACCase. A presente invenção também inclui sementes produzidas por estas plantas e os métodos de controle de plantas daninhas nas lavouras de arroz.
[006] A presente invenção descreve plantas de arroz, que apresentam uma variação no gene que codifica para a enzima Acetil-coenzima A carboxilase, promovendo resistência a herbicidas inibidores da ACCase, em comparação com uma variedade selvagem da planta.
[007] O desenvolvimento de cultivares de arroz resistentes aos herbicidas inibidores da ACCase pode ser uma opção estratégica para o manejo de plantas daninhas beneficiando toda a cadeia produtiva (produtor, indústria e consumidor) com o aumento da qualidade e da produtividade deste cereal.
[008] A Figura 1 representa a sequência SEQ ID NO: 1 da linhagem de arroz modificada geneticamente.
[009] A Figura 2 mostra o efeito do herbicida inibidor da enzima ACCase (haloxyfop-p-methyl (Verdict R, 2 L/ha), 30 dias após a aplicação, em plantas da linhagem SCM 268 (A), da linhagem SC 155 (B) e da linhagem SCM 269 (C).
[0010] A Figura 3 mostra o efeito do herbicida inibidor da ACCase (quizalofop-p-ethyl -Targa 50 CE, 2 L/ha), aos 30 dias após a aplicação, em plantas da linhagem SCM 268 (A), da linhagem SC 155 (B) e da linhagem SCM 269 (C).
[001 1 ] A Figura 4 mostra o efeito do herbicida inibidor da ACCase (haloxyfop-p-methyl -Verdict, 2 L/ha), 15 dias após a aplicação, em plantas da linhagem SCM 268 (A), da linhagem SC 155 (B) e da linhagem SCM 269 (C).
[0012] O processo para a geração de mutantes através de indução de mutação com raios gama para desenvolver linhagens de arroz com resistência a herbicidas inibidores da ACCase, compreende as etapas de a) Formação de linhagens mutantes. b) Seleção de plantas resistentes a herbicidas, c) Alteração da sequência de aminoácidos das linhagens promoveu resistência a herbicidas inibidores da ACCase. d) Seleção das plantas resistentes.
[0013] Formação de linhagens mutantes
[0014] As sementes (300 g) da linhagem de arroz SC 155 foram irradiadas com 25 krad de raios gama no Cena/USP, Piracicaba, São Paulo. Após a irradiação, as sementes foram semeadas em caixas com solo arenoso na Epagri/Estação Experimental de Itajaí. No estádio de duas a três folhas, as mudas foram transplantadas individualmente a campo, formando a população (Mi) com aproximadamente 25.000 plantas. Na maturação, foram colhidas três panículas de cada planta, formando as sementes da geração M2.
[0015] Seleção de plantas resistentes a herbicidas
[0016] As sementes da geração M2 das populações oriundas da mutação foram semeadas a campo, totalizando uma população estimada de 5 milhões de plantas. As plantas, ao atingirem o estádio de três a quatro folhas, foram aspergidas com 1 ,5 L/ha do herbicida haloxyfop-p-methyl. As avaliações e seleção das plantas sobreviventes foram realizadas 15 dias após o tratamento com o herbicida. Durante as avaliações e seleção, foram encontradas duas plantas que apresentaram resistência ao herbicida.
[0017] A alteração da sequência de aminoácidos das linhagens promoveu resistência a herbicidas inibidores da ACCase.
[0018] Nas plantas que apresentaram resistência ao herbicida haloxyfop- p-methyl, foi realizado o sequenciamento da região carboxil-transferase do gene que codifica para a proteína ACCase plastidial. As plantas da linhagem SCM 268 e SCM 269 apresentaram uma mutação de substituição no gene responsável por codificar a enzima ACCase. A mutação encontrada nas linhagens de arroz com resistência a aplicação de haloxyfop-p-methyl apresentou uma alteração na posição 2027 (referente ao padrão Alopecurus myosuroides, accession number AJ632096, Gen Bank CAC84161 .1 . Essa alteração está caracterizada pela substituição do nucleotídeo "G" pelo nucleotídeo "T" na sequência de DNA, resultando na substituição do aminoácido triptofano (W) pelo aminoácido cisteina (C) na proteína ACCase, substituição essa doravante referida como W20207C. A resistência foi confirmada através de bioensaio onde foi aplicado o herbicida haloxyfop-p-methyl em progénies das linhagens SCM 268 e SCM 269.
[0019] Plantas resistentes
[0020] a. Após o tratamento com o herbicida, apenas duas plantas de arroz (SCM 268 e SCM 269) sobreviveram à ação do produto, permanecendo verdes e saudáveis, enquanto todas as outras apresentaram sintomas de fitoxicidade e alteração do desenvolvimento, com posterior morte. As plantas sobreviventes foram transplantadas e suas sementes colhidas. As avaliações das progénies SCM 268 e SCM 269 demonstraram que a característica de resistência a herbicidas inibidores da ACCase é transferida, não ocorrendo alteração no desenvolvimento e na reprodução das plantas. A aplicação dos herbicidas haloxyfop-p-methyl e quizalofop-p-ethyl em progénies das linhagens SCM 268 e SCM 269 confirmaram a característica de resistência aos herbicidas inibidores da ACCase. A avaliação de plantas heterozigotas com a resistência demonstrou que o gene é dominante para a característica resistência, tornando as plantas ideais para serem retrocruzadas com cultivares comerciais. As fotos das figuras 2, 3 e 4 mostram essa evolução.
[0021 ] b. As progénies foram selecionadas e conduzidas como linhagens, e a avaliação do potencial produtivo e agronómico foi realizado sob condições de cultivo. Qualquer uma das linhagens de arroz poderá dar origem a uma cultivar com alto potencial produtivo e características agronómicas adequadas, representando uma tecnologia alternativa para o controle do arroz-daninho e outras plantas daninhas poáceas infestantes de lavouras de arroz.
[0022] As cultivares resistentes aos herbicidas inibidores da ACCase poderão ser rastreadas através da aplicação de herbicidas ou por meio de técnicas moleculares. Marcadores moleculares poderão ser utilizados na seleção de plantas que apresentam resistência aos herbicidas inibidores da ACCase. As técnicas moleculares e os bioensaios com herbicidas podem facilitar o desenvolvimento de novas variedades de arroz que apresentam resistência aos inibidores da ACCase. A figura 1 mostra a listagens de sequência de linhagens de arroz (Oryza sativa L), modificada geneticamente com resistência a herbicidas inibidores da enzima acetyl coenzima A carboxilase (ACCase) obtidas por mutação induzida com raios gama, nominada SEQ ID NO: 1 .
[0023] Em um programa de melhoramento genético de arroz, a seleção de linhagens com resistência a herbicida é realizada através de um ensaio biológico com a aplicação do produto nas linhagens de interesse. As plantas que apresentarem a característica de resistência podem ser selecionadas e avaliadas agronomicamente. Alternativamente, as linhagens SCM 268 e SCM 269 podem ser selecionadas através da detecção com um marcador polimórfico ou por sequenciamento da região do gene que apresenta a mutação. Arquivo em anexo mostra listagens de sequencias de linhagens de arroz (Oryza sativa
L.)

Claims

REIVINDICAÇÕES
1 - Desenvolvimento de linhagens de arroz (Oryza sativa L.) com resistência a herbicidas inibidores da enzima acetyl coenzima A carboxiiase (ACCase) caracterizado por compreender a aplicação de raios gama para a produção da espécie Oryza sativa L. modificada com a sequência descrita em SEQ ID NO: 1
2- Linhagens de arroz (Oryza sativa L.) com resistência a herbicidas inibidores da enzima acetyl coenzima A carboxiiase (ACCase) obtidas por processo descrito na reivindicação 1 , caracterizado pelas linhagens do arroz compreender mutação de substituição da base nitrogenada Guanina por Timina na posição correspondente ao códon que dá origem ao aminoácido 2027 no sítio carboxil-transferase da enzima da ACCase.
3- Linhagens de arroz (Oryza sativa L.) com resistência a herbicidas inibidores da enzima acetyl coenzima A carboxiiase (ACCase) obtidas por processo descrito na reivindicação 1 , caracterizada por compreender uma enzima codificada por uma molécula de ácido nucleico com a sequência de nucleotídeos descrita em SEQ ID NO: 1 .
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