JPH04507340A - 除草剤抵抗性トウモロコシ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 除草剤抵抗性トウモロコシ　。

本発明は除草剤抵抗性（ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ　ｒｅｓｉｓｔａｎｔ）　トウモロ コシ植物及びその種子及び後代（ｐｒｏｇｅｎｙ）に関する。　除草剤の作用に 抵抗性の作物植物を提供する目的は、通常の状態、即ち、除草剤感受性の（ｈｅ ｒｂｔｃｉｄｅｓｅｎｓｉｔｉｖｅ）状態の作物植物を破壊する、除草剤として 有効な濃度の除草剤の全体的な施用によって、植物の間で生長している種子の破 壊（ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）を促進することにある。かかる抵抗性植物は既往 の植物からの除草剤の短期間の移行（ｃａｒｒｙ−ｏｖｅｒ）の生じる場所にお いても有用である。　多数の無作為突然変異（ｒａｎｄ。

ｍ　ｍｕｔａｔｉｏｎ）を含有する植物の集団（ｐｏｐｕｌａｔｔｏｎ）を得る ことのできる方法は知られている。かかる方法としては自生的ツマクローナル（ 変異（５ｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ　５ｏＩｌｌａｃｌｏｎａｌ　ｖａｒｌａｔｆｏ ｎ）を突然変異誘発物質（＠ｕｔａｇｅｎ）の存在下または不存在下で生起させ る組織培養技術が挙げられる。培地（Ｃυ１ｔｕｒｅ）にある形の淘汰圧（ｓｏ ｌ　ｅＣｔ　ｉ□ｎ　ｐｒｅｓｓｕｒｅ）を加えることによって、この淘汰圧に 抵抗する細胞を回収することができる。植物種に応じて、抵抗性細胞から全植物 （ｗｈｏｌｅ　ｐｌａｎｔ）を再生させることがしばしば可能である。

Ｎｅｕｒｒｅｒ及びＣｏｅ　［Ｍａｙｄｌｃａ　ＸＸＴＩＩ（１９７８）　２１ −２８；２１頁］は軽質パラフィン油中に分散させた突然変異誘発物質を使用す るトウモロコシ（ｃｏｒｎ、ｍａｉｚｅ）花粉（ｐｏｌｌｅｎ）の突然変異誘発 （ｍｕｔａｇｅｎｅｓｌｓ）及びその後に行われる、突然変異誘発（ｌｉｕｔａ ｇｅｎｌｚｅｄ＞花粉を使用する受体植物の受粉について記載している。報告さ れているごとく、商業的に重要な突然変異体（ｍｕｔａｎｔ）を探索しかつ単離 するための試みがこれまでに行われたいうことは何ら示されておらずそして得ら れた植物を突然変異体について検討したと述べているが、恐らくは肉眼による観 察によって見出だされ得た突然変異体の性質についての詳細は与えられていない 。

Ｐｌａｎｔ　Ｂｒｅｅｄｔｎｇ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　５．３９〜１８０頁において Ｂｊ「ｄ及びＮｅｕｒｆｅｒはトウモロコシに変異（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を生 ぜしめるための突然変異誘発法（Ｍｕｔａｇｅｎｔｃ　ｐｒｏｃｅｓｓ）の使用 について考察している。花粉突然変異誘発（Ｐｏ１１ｅｎ　ｇｕｔａｇｅｎｅｓ ｌｓ）は１５０〜１５１頁で検討されている。

花粉突然変異誘発により他の利用可能な方法と比較して、Ｍ　世代（Ｍ　１ｇｅ ｎｅｒａｔｉｏｎ）において比較的高い頻度で変異が生ずる。しかしながら、除 草剤の作用に対して抵抗性を示す突然変異体を発生させるための花粉突然変異誘 発の使用については何ら示唆されていない。第■章（１４９頁）には遺伝的変異 （ｇｅｎｅｔｉｃ　ｖａｒｌａｔｌｏｎ）の供給源としての突然変異誘発の使用 の困難性の幾つについて記載されている。重要な観点の一つは推定上の突然変異 体（ｐｕｔａｔｉｖｅ　５ｕｔａｎｔ）の集団を有用な表現型（＋）ｈｅｎｏｔ ｙｐｅ）についてスクリーンする方法である。

本発明の目的は除草剤抵抗性トウモロコシ（ｈｅｒｂｌｃｉｄｅ　ｒｅｓｉｓｔ ａｎｔ　ｇ＋ａｉｚｅ）を提供することである。

ｇｅｎ）を作用させ、突然変異誘発された（＠ｕｔａｇｅｎ　＋５ｅｄ）花粉を 回収し、この花粉を雌親（ｆｅｍａｌｅ　ｐａｒｅｎｔ）に授粉し、成熟した植 物から種子を収穫し、この種子を選択された除草剤又は選択された除草斉工と同 様な作用形式を有する第、２除草剤の淘汰圧Ｃ５ｅｌｅｃｔＩｏｎ　ｐｒｅｓｓ ｕｒｅ＞下で生長させついで適用された淘汰圧に対して抵抗性の後代（ｐｒｏｇ ｅｎｙ）を回収することからなる、通常の致死濃度の、選択された除草剤に対す る抵抗性を有する突然変異体トウモロコシ（ｌｕｔａｎｔ　Ｚｅａ　５ｌａｙｓ ）の製造方法が提供される。化学的突然変異誘発物質はメタンスルホン酸エチル であることが好ましい。

淘汰圧を適用するのに使用し得る除草剤はアセト乳酸塩合成酵素（ａｃｅｔｏｌ ａｃｔａ、ｔｅ　５ｙｎｔｈａｓｅ）の抑制剤であることが好ましく、より好ま しくはイマゼタビル（ＩＩＩ＋ａｚｅｔｈａｐｙｒ）である。

また、淘汰圧は発芽前の種子に除草剤を適用することによって適用することが好 ましい。

淘汰圧を適用するために使用される除草剤の濃度は、発芽を抑制するのには不十 分であるが、感受性植物の生長を抑制するのには十分であることが好ましい。

本発明によれば、更に、除草剤抵抗性のトウモロコ特表平４−５０７３４０　（ ３） シ植物が提供される。この植物の種子は英国、アバーディーン（Ａｂｅｒｄｅｅ ｎ）所在の、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｒＩｎｄｕｓｔｒｉ ａｌ　＆　Ｍａｒｉｎｅ　Ｂａｃｔｅｒｉａに寄託されている１寄託についての 公式な細目（ｏｆ’ｒｉｃｉａｌ　ｄｅｔａｆｌ）は表１に示す通りである。

★突然変異体　Ｎα４は更に行った試験からこの突然変異体は有用な抵抗性を有 していないことが示されたので取下げた。この番号は以下の説明において番号の 順序を保持するために残留させた。

これらの寄託物（ｄｅｐｏｓｌｔ）の各々は遺伝子混合物、分離する（ｓｅｇｒ ｅｇａｔｉｎｇ）突然変異体及び非突然変異体種子である。突然変異体は除草剤 抵抗性を付与する遺伝子についてはへテロ接合体的（ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ ）である。

突然変異体植物はこれらの種子から、除草剤イマゼタビルの存在下で、“スクリ ーニング”　’（’ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　”）という表題で後記する条件下で生 長させることにより誘導し得る。

本発明によれば、更に、上記植物の種子及び本発明の植物と他のトウモロコシ植 物系統との交配によって産生された上記植物の後代（ｐｒｏｇｅｎｙ）が提供さ れる。

本発明の植物はある種のイミダゾリノン系列の除草剤例えばイマゼタピル［５− エチル−２−（５−イソ−プロピル−５−メチル−４−オキソ−２−イミダシリ ン−２−イル）ニコチン酸　（商標ＰＵＲ３ＵＩＴ、　Ａａ＋ｅｒｊｃａｎ　Ｃ ｙａｎａＩＩｔｄ）］に対して抵抗性であることが認められた。フェノキシピリ ミジン及びトリアゾロピリミジンに対する抵抗性を有することから明らかなごと く、スルホニル尿素系列の除草剤、例えばクロルスルフロン（ｃｈｌｏｒｓｕｌ 　！’ｕｒｏｎ）に対する交叉抵抗性（ｃｒｏｓｓ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）を 有することも認められた。試験は行っていないが、他の除草剤に対する抵抗性も 存在し得る。

これまで本発明の植物を試験した除草剤は、その作用の形式としてアセト乳酸塩 合成酵素（ＡＬＳ）−アセトヒドロキシ酸合成酵素（Ａ）ＩＡＳ）としても知ら れている−の抑制作用を有する除草剤である。除草剤はその名称で市販されてい る商標で表すことが好都合である。図２には活性成分の化学的構造が示されてい る。

スルホニル尿素除草剤に対する抵抗性の分子ベースの詳細な説明は欧州特許出願 ２５７，９９３号明細書（Ｅ、Ｉ。

Ｄｕｐｏｎｔ　ｄｅ　Ｎｅ＋１ｏｕｒｓ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ）に記載され ティる。

組織培養からのイミダゾリノン−抵抗性トウモロコシの単離は米国特許第４，７ ８１，３７３号明細書（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｌｃｓ　Ｉｎｃ、）に 報告されている。抵抗性突然変異体（ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｃｕｔａｎｔ）を単 離するための組織培養法において種々の植物種及び種々の除草剤が使用されたこ とが文献に記載されている。

これと比較して、本発明においては組織培養はを利用されない。抵抗性は化学的 突然変異誘発物質による花粉の突然変異誘発により導入される。突然変異誘発花 粉を使用して行われそして発芽前の種子の処理又は発芽（ｓｅｅｄ　Ｉ　Ｉ　ｎ ｇ）工程での処理又はこの両者により行われる受精の後に形成される種子につい て、直接、選択（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）が行われる。

変異を生ぜしるめためにツマクローナル（ｓｏｓａｃｌｏｎａｌ）変異に依存す る、より一般的な方法の代わりに、突熱度異体を創生するための方法として花粉 突然変異誘発を使用することによりある種の利点が得られる。ツマクロナール変 異を生ぜしめるためには植物組織の培地（ｃｕ　ｌ　ｔｕｒｅを）を確立するこ とが必要である。培養された組織から全植物（ｗｈｏｌｅ　ｐｌａｎｔ）を再生 することは必ずしも可能ではないので、上記の要件によって、使用し得る遺伝子 型の選択が制限される。一方、突然変異誘発花粉は、商業的に重要なかつ十分に 確立された、優れた（ｅｌ　１ｔｅ）育種系統（ｂｒｅｅｄｉｎｇ　１ｉｎｅ） を含めて、任意の受容体（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）　トウモロコシ遺伝子型に適用 し得る。また、ツマクローナル変異により生ずることが知られている望ましくな い突然変異の割合も減少する。

本発明においては、選択はＭ１世代において行われ、その結果、優生突然変異（ ｄｏｌ！ｔｎａｎｔ　１ｕｔａｔｆｏｎ）だけが選択される。また、全植物につ いて行うか又は発芽前の種子について行うか又はこの両者について行うことによ り、除草剤濃度を、組織培養に除草剤の淘汰圧を適用することによって可能な濃 度より、屋外条件により近似させることが可能である。組織培養選択法において は、屋外での除草剤の適用割合のもとて後代の性能（ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ） が示される前に、全植物（ｗｈｏｌｅ　ｐｌａｎｔ）を組織から再生させかつ成 熟するまで生長させなければならない。本発明の方法においては、屋外で通常の 雑草枯死活性を得るのに推奨されているものと同１）表子４−５０７３４０　（ ４） 等の除草剤濃度の下で植物に、直接、選択を行いうる。

組織培養法におけるごとく、Ｍ２世代に−〕いての選択により劣性突然変異およ び優生素質（ｄｏＩｌｉｎａｎｔ　ｔｒａｉｔ）が選択される。所望の素質（ｔ ｒａｉｔ）の優生性は一般的により有用であると考えられておりかつ特にハイブ リッド作物（ｈｙｂｒｔｄ　ｃｒｏｐ）の育成プログラム（ｂｒｅｅｄｉｎｇｐ ｒｏｇｒａｍｍｅ）において取扱うことを容易にする。

除草剤の淘汰圧力（ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ　ｐｒｅｓｓｕｒ（Ｎ）の下で選択され る突然変異体は、使用された除草剤系列の特定の種類によって変動すると考えら れる。本発明の突然変異体は全てイマゼタビルの圧力下で選択された。異なるイ ミダゾリノン除草剤を使用した場合には、異なった種類の突然変異体が選択され るであろう。

本発明者は、全く驚くべきことに、本発明の方法によって単離された突然変異体 は有害な（ｄｅｌｅｔｅｒｉｏｕｓ）突然変異を示さないことを認めた。このこ とは全く予期しなかったことでありかつその理由は完全には明らかででない。除 草剤を注意深く制御した割合で使用することにより、例えば、除草剤に全体的に かつ均一に暴露することにより、選択工程全体に亘って行い得る制御の程度によ るものと考えられ得る。

以下においては、以下で述べるごとき本発明の除草剤抵抗性植物を誘導する方法 の要約によって本発明を説明する。

本明細書に添付される図面は以下の通りである；図１は本発明によって産生きれ た植物からの、種々の世代の後代の誘導を示すフローチャートである。

図２は本発明で使用される除草剤の化学的構造を示す； 図３はイマゼタビルの存在下での＾ＬＳ酵素活性のグラフである。この酵素は抵 抗性遺伝子についてヘテロ接合体型（ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ）である植物か ら抽出される。

図４はイマザピル（ｉＩｌａｚａｐｙｒ）の存在下でのＡＬＳ酵素活性のグラフ である。この酵素は抵抗性遺伝子についてヘテロ接合体型である植物から抽出さ れる；図５はイマザキン（ｉｉａｚａｑｕｉｎ）の存在下でのＡＬＳ酵素活性の グラフである。この酵素は抵抗性遺伝子についてヘテロ接合体型である植物から 抽出される；図６はクロルスルフロンの存在下でのＡＬＳ酵素活性のグラフであ る。この酵素は抵抗性遺伝子についてヘテロ接合体型である植物から抽出される ；図７はクロルイムロン（ｃｈｌｏｒｉｍｕｒｏｎ）の存在下でのＡＬＳ酵素活 性のグラフである。この酵素は抵抗性遺伝子についてヘテロ接合体型である植物 から抽出される；図８はチアカルブロン（ｔｈｌａｅａｒｂｕｒｏｎ）の存在下 での子についてヘテロ接合体型である植物から抽出される：図９は抵抗性対立遺 伝子（ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ａｌｌｅｌｅ）についてホモ接合体型（ｈｏｉｏｚ ｙｇｏｕｓ）である突然変異体１および２の後代の葉から抽出されたかつイマゼ タビル（ＰＵＲＳＵＩＴ）の存在下でのＡＬＳの活性についての酵素活性のグラ フである； 図１０は低抗性対立遺伝子についてホモ接合体型である突然変異体１および２の 後代の葉から抽出されたかつイマザキン（ＳＣＥＰＴＥＲ）の存在下でのＡＬＳ の活性についての酵素活性のグラフである： 図１１は抵抗性対立遺伝子についてホモ接合体型である突然変異体ｌおよび２の 後代の葉から抽出されたかつイマザピル（ＡＲ３ＥＮＡＬ）の存在下でのＡＬＳ の活性についての酵素活性のグラフである： 図１２は抵抗性対立遺伝子についてホモ接合体型である突然変異体１および２の 後代の葉から抽出されたかつクロルスルフロン（ＧＬＥＡＮ）の存在下でのＡＬ Ｓの活性についての酵素活性のグラフである；図１３は抵抗性対立遺伝子につい てホモ接合体型である突然変異体１および２の後代の葉から抽出されたかつクロ ルイムロン（ＣＬＡＳＳＩＣ）の存在下でのＡＬＳの活性についての酵素活性の グラフである；図１４は抵抗性対立遺伝子についてホモ接合体型である突然変異 体ｌおよび２の後代の葉から抽出されたかつチアカルブロン（ＨＡＲＭＯＮＹ） の存在下でのＡＬＳの活性についての酵素活性のグラフである；図１５は抵抗性 対立遺伝子についてホモ接合体型である突然変異体ｌおよび２の後代の葉から抽 出されたかつトリアゾロピリミジンの存在下でのＡＬＳの活性についての酵素活 性のグラフである； 図１６は抵抗性対立遺伝子についてホモ接合体型である突然変異体１および２の 後代の葉から抽出されたかつフェノキンピリミジンの存在下でのＡＬＳの活性に ついての酵素活性のグラフである； 図１７は除草剤イマザビル（ＰＵＲ９ＵＩＴ）についての施用量応答曲線（ｄｏ ｓｅ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｃｕｒｖｅ）である；図１８は除草剤イマザキン（Ｓ ＣＥＰＴＥＲ）についての施用量応答曲線である； 図１９は除草剤クロルイムロン（ＣＬＡＳＳＩＣ）についての施用量応答曲線で ある； 図２０は除草剤クロルスルフロン（ＯＬＥＡＮ）についての施用量応答曲線であ る； 図２１はトリアゾロピリミジン除草剤についての施用量応答曲線である； 図２２はフェノキンピリミジン除草剤についての施用量応答曲線である； 図２３はへテロ接合体型及びホモ接合体型の両者の形の突然変異体１及び２に対 する、除草剤イマザビル（ＰＵＲ３ＩＪ　ＩＴ）についての施用量応答曲線であ る。

１１Ｍ１種子（Ｍｌ　５ｅｅｄ）の製造１００１の軽質パラフィン曲中に１１の メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）を含有するＥＭＳの原液を調製した。

この原液を冷却して貯蔵した。

ｎ　（ａｎｔｈｅｒ）を有する新しい花粉粒子を屋外で生長さ特表平４−５０７ ３４０　（５） せたトウモロコシの遅発系統（ｉｎｂｒｅｄ　１ｉｎｅ）ＵＥ９５の１２個の房 の全部から採取した。花粉粒子をグラフシン（Ｇｌａｓｓｉｎｅ）（商標）バッ グを使用して薊から分離した。

約３ｍｇの花粉を容量Ｂｏｉｌの瓶内の４５１のＥＭＳ原液に添加した。花粉／ ＥＭＳ溶液混合物を３０秒間激しく振とうしついで各々３分間ずつ、４又は５回 、４０分間に亘って振とうして花粉粒子の沈殿を防止した。処理された花粉粒子 を、房を除去した遅発雌親（ｉｎｂｒｅｄ　ｒｅｍａｌｅ　ｐａｒｅｎｔ）　（ コードＵＥ９５）の毛（ｓｉｌｋ）に刷毛で付着させた。

植物を成熟するまで生長させ、Ｍ１種子を収穫した。

２、スクリーニング 別種子、トレー１個当り、種子１００個、をＷＣＢ生長培地（低有機物、４５％ ローム、５５％グリッド）に播種しついでトラックスプレイヤーを使用してイマ ザビル（ＰＵＲ３ＵＩＴ）の溶液を活性成分の当量が２５０ｇ／ｈａと算定され た濃度で“流れ出る”（“ｒｕｎ　ｏｆｒ”）まで散布した。種子を０５インチ のＶＣＢで覆い、２５℃の温室内で生長させた。

選択された施用割合は、発芽は１００％に近いものになるが後に、実質的に全て の感受性植物が著しく影響を受けるようなものであった。しかしながら、約２週 間後、除草剤の当初の影響は明瞭になった；薄い、すじのある（ｓｔｒｉｐｅｄ ）葉及び対照植物の高さの約２０％に過ぎない短縮された高さ。３〜４週間後に は、感受性植物の殆ど全てが枯死した。ＵＥ９５の通常の苗木（ｓｅｅｄｌｌｎ ｇ）およびＭ１苗木（Ｍｌｓｅｅｄｌｌｎｇ）は散布することなしに発芽させか つ成熟するまで生長させた場合には殆ど区別し得ないことが既に知られているの で、非散布ＵＩＥ９５植物は、対照としての各スクリーンと平行的に、つねに生 長させた。

３、選択（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）及び生長１０本の植物（全体の０．旧％に相当 ）の全てを、通常の致死施用量の除草剤についての耐性（ｔｏｌｅｒａｎｃｅ） を示すものとしてスクリーンから当初に選択した。その後に、突然変異体　Ｎα ４は感受性表現型であることが認められたので、プログラムから除外した。残り の９本の中、大部分は選択後の非処理対照に形態学的に類似していたが、４本は 影響を受け、より短くかつ他の除草剤的影響（ｈｅｒｂｌｃｉｄａｌ　ｅｆ’ｆ ｅｃｔ）を示した。親［ＪＥ９５（突然変異体１〜１０．　Ｎａ、　４を除く） と戻し交配した（ｂａｃｋ−ｃｒｏｓｓｅｄ）、これらの９本の植物の種子の試 料は、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ 　＆　Ｍａｒｉｎｅ　Ｂａｃｔｅｒｉａに淘汰圧されているものである（表１参 照）。

４、ＨＥＬＰの検討 同胞植物（ｓｌｂｌｉｎｇ　ｐｌａｎｔ）は実際に、起源的にＵＥ９５遺伝子型 のものであり、本来的により耐性の、混入（Ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｎｇ）遅発 系（ｉｎｂｒｅｄ）又はハイブリッドではないことを確認するために、ＲＦＬＰ 　［制限酵素に対する半型性（ｒｅｓｔｒｉｃｔｔｏｎ　ｆｒａＨｅｎｔ　ｌｅ ｎｇｔｈ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）植物の全てからの葉組織から抽…したＤ ＮＡについて行った。

約１〜５ｇの葉組織を各植物（４週間〜“成熟”までの樹令）から取出し、ＤＮ Ａを抽出しそして臨床用単一コピープローブ（ｄｌａｇｏｎｏｓｔｉｃ　ｓｉｎ ｇｌｅ　ｃｏｐｙ　ｐｒｏｂｅ）を使用してＲＦＬＰ分析を行った。

ＲＦＬＰ分析により選択された植物はＵＰ９５遺伝子型のものであることが確認 された。

５、分離（ｓｅｇｒｅｇａｔ　ｔｏｎ）の検討ホモ接合体型、除草剤感受性ＵＥ ９５との相互戻し交配（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ　ｂａｃｋ−ｃｒｏｓｓ）に抵抗 性植物を使用した。

Ｍ　ＢＣ及びＭＩＢＣ２世代における抵抗性後代の頻度はイマゼタビルを使用す る処理を行いかつ残存植物（ｓｕｒｖｔｖｏｒ）を数えることにより測定された 。結果をＸ２（１：ｌの比について）の計算値と共に表２に示した。

表２に示された数字から明らかなごとく、戻し交配の後代における抵抗性植物と 感受性植物の比率は、階。

３及び７を除く突然変異体の全てについて１：１から著しく異なっておらず、抵 抗性は単一の優性遺伝子によって制御されることを示している。

表２ ★これらの突然変異体のイマゼタビルに対する抵抗性は低く従ってこの試験にお いて有意義な評価をすることは困難であるが、他の試験においては、分離は１： １の範囲であることを示している。

６、抵抗性植物からのＦ１種子の生成 スクリーンにおいて同定された（ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ）１０本の植物の全てを ＵＥ９５植物との相互同胞交配（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌｓｉｂ−ｃｒｏｓｓｉｎ ｇ）に使用して、種子（ＭＩＢＣｌと称する）を得た、即ち、抵抗性植物を雄性 及び雌性ドナー特表平４−５０７３４Ｃ）　（６） として使用した。

７、後代種子（ｐｒｏｇｅｎｙ　５ｅｅｄ）の再スクリーニング得られた穂軸（ ｃａｂ）　、小さい種子の試料、の各々を最初のスクリーンと同一の条件を使用 してイマゼタビル（ＰＵＲ３ＵＩＴ）抵抗性について選択した。

抵抗性表現型及び感受性表現型が各抵抗性植物の後代において分離（ｓｅｇｒｅ ｇａｔｅ）　した。

８、更なる後代の産生 図１を参照して、ＭＩＢＣ１植物を自己受粉させて世代Ｍ　Ｉ　Ｂ　ＣＩ　Ｓ　 ｉを取得しついでこれを再び自己受粉させて世代Ｍ　ＩＢ　Ｃｔ　Ｓ　２を取得 した。その世代から、抵抗性素質（ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｔｒａｉｔ）は非分離 性（ｎｏｎ−ｓｅｇｒｅｇａｔ　ｉｎｇ）であるという事実により、この素質に ついてホモ接合型である系列（ｌｆｎｅ）を同定することができる。突然変異体 Ｎα１から誘導されるホモ接合型系列はイミダゾリノン除草剤に対する抵抗性を 有するＦ１ハイブリッドの産生又は更なる育種操作（ｂｒｅｅｄｉｎｇ　ｖ。

ｒｋ）に利用し得る。

９、酵素定ｊｉ　（ｅｎｚｙｌｌｅ　ａｓｓａｙ）９１Ｗの突然変異体の世代Ｍ ＩＢＣ，、Ｍより　Ｃ２の種子に、発芽前、除草剤イマゼタビル（ＰＩＪｌ？５ ＵＩＴ）　（商標）を２５０ｇ／ｈａの割合で散布しそして生長室で生長させた （１８時間、日中、２７℃；８時間、夜間、１７℃）。

植物は１１日後に収穫した。

４ｇの葉材料（ｌｅａｆａ＋ａｔｅｒ＋ａｌ＞を第−葉軸（ｆｉｒｓｔ　１ｅａ ｒ　ａｘｌｓ）の直ぐ上から採取し、乳鉢と乳棒を使用して、４０μＭのトリシ ン（Ｔｒｉｃｌｎｅ）　（商標）　、ＬＯｍＭのＥＤＴＡ、５ｄのピルビン酸、 ８０μＭのフラビン　アデニン　ジヌクレオチド（ＰＡＤ）　、１ｍＭのジチオ トレイトール（ＤＴＴ）を含有する溶液、ｐｌ（８，２０１及び０，８ｇのポリ カール（Ｐａ　１ｙｅａｒ）　ＡＴ中で磨砕した。均質化物（ｈｏｍｏｇｅｎａ ｔａ）を加圧して４枚のモスリン層を通過させ、３０　、０００ｇで２０分間遠 心分離した。　上澄液を硫酸アンモニウムで６５％飽和状態とし、３０分間沈殿 させついで３０．０００ｇで２０分間遠心分離した。ペレットを２．５ｇｌの４ ｈＭ　トリシン、１０１のＥＤＴＡ、　５ｍＭのピルビン酸、８０４ｃＭのＦＡ Ｄ　、　２５％（■／Ｖ）のグリセリン、１ａ＋ＭのＤＴＴ　、　ｐｉ（８中に 再懸濁させついで３．５ｍｌの４０μＭ　）リシン、ＬＯＩＩＭ　ＥＤＴＡ　、 　２５％（Ｖ／Ｖ）グリセリン、ｌａＭ　ＤＴＴ　、　ｐＨ８に脱塩した（ｄｅ ｓａｌｔ）。

１００μｌの酵素抽出物（ｅｎｚｙＩＩｅ　ｅｘｔｒａｃｔ）を各々の定量に使 用した。最終薬剤濃度は下記の通りであった：容Ｉｋ７５０μｍ中に、トリシン １２０５Ｍ、ピルビン酸５０１１Ｍ　、　ＭＭｇＣｌ２ＬＯＩｌ１　、ＦＡＤ　 ６ＢｇＭ、チアミンピロホスフェート（ＴＰＰ）　９３μＭ　、　ｐｌ　８、除 草剤は存在又は不存在。

インキュベーションは３７℃で３０分間行った。２５０μｍの１８４Ｍの硫酸を 使用して反応を中止しついでアセト乳酸塩の脱炭酸を３７℃で７５分間又は６０ ℃で３０分間行った。定量用ブランクについては酵素抽出を行う前に硫酸を添加 した。試料及びブランクに２．７３ＭＮａＯＨ１０，１８％（Ｖ／Ｖ）クレアチ ン中の６５０μＩのα−ナフトールを添加しついでインキュベーションを３７℃ で３０分間行った。

３０．０００ｇで遠心分離した後、上澄液の光学濃度を５４０ｎＩで測定した。

上記で述べた定量法は下記の除草剤について、９個の突然変異体から抽…した＾ ＬＳ酵素について行った・イマゼタピル（Ｐｔｌｌ？５ＬｌｌＴ）イマザピル（ ＾ＬＳＥＮＡＬ） イマザキン（ＳＣＥＰＴＥＲ） クロルスルフロン（ＧＬＥＡＮ） クロルイムロン（ＣＬＡＳＳＩＣ） チアカルブロン（ＨＡＲＭＯＮＹ） 酵素活性グラフは図３〜８に示す通りである。尚、世代ＭＩＢＣＩＳ２から選択 された突然変異体１及び２を、上記と同一のグループの除草剤及びトリアゾロピ リミジン及びフェノキシピリミジンの代表的なものに対して試験した。結果は図 ９〜１６に示されている。

これらの除草剤の化学的構造は添付図面の図２に示さ酵素定量データーから、各 突然変異体及び各除草剤について、抑制（ｉｎｈｉｂｌｔｌｏｎ）の程度の尺度 として、係数ＩＤ５０％を誘導し得る。この係数は野生型対照と比較した、ＡＬ Ｓ活性を５０％抑制する除草剤濃度を指示するものである。抵抗性のフォルト増 加（ｆｏｌｄ　１ｎｃｒｅａｓｅ）も誘導し得る。これらの計算値を以下の表３ に示す。

表３ イマゼタビル（ヘテロ接合体型突然変異体）イマザビル（ヘテロ接合体型突然変 異体）特表平４−５０７３４０　（７） クロルイムロン（ヘテロ接合体型突然度異−１．；クロルスルフロノ（ヘテロ接 合体型突然変異体）チアカルブロン（ヘテロ接合体型突然変異体）同様の計算を ホモ接合体型突然変異体１および２についてだけ行った。その結果を表４に示す 。

表　４ このスクリーンで使用した種子はホモ接合体型感受性ＵＥ９５と交配させたベテ ロ接合体型耐性突然変異体の各々から誘導された、１・ｌで分離する、混合耐性 及び感受性種子の集団である。耐性後代の全ては耐性についてヘテロ接合体型で ある。突然変異体４を除いて上記で同定した全ての突然変異体の各々を使用した 。対照は耐性系統と同じ年に受粉させた自己受粉ＵＥ９５の種子である。

１１の堆肥を１．９ｃｍ　ｘｌ、１ｃＩＡ、深さ５ｃ１１１の寸法の種子用トレ イの各々に装入し、平らに固めた。各トレイの堆肥の表面に深さ］、ｃｍの溝　 を２個形成させ、各々の溝に６個の種子を播種したくトレイ１個について全部で 種子１２個）。幾つかのトレイには２４個の種子を播種し、この場合には、３個 の溝を形成させ、溝１個当り　８個の種子を播種した。

各試験において、各除草剤の施用割合について及び非処理対照について、各々の トレイに１種の突然変異体の種子又はＵＥ９５対照の種子を含有させた。

５種の異なるタイプの＾ＬＳ−抑制剤除草剤を、突然変異体及び比較用としての イマゼタビル（ＰＵＲ３ＵＩＴ）について試験した。各々について４種の施用割 合を適用した；各除草剤についての推定屋外施用割合（ｅｓｔｉｍａｔｅｄｒｌ ｅｌｄ　ｒａｔｅ）の０．１！、　０．５Ｘ、　ＬＸ及び４Ｘ、施用割合は突然 変異体３〜１０については同一であるが、突然変異体１及び２については、クロ ルイムロン（ＣＬＡＳＳＩＣ）につい゛てはより高い割合を、クロルスルフロン （ＧＬＥＡＮ）についてはより低い割合を適用した。

下記の推定屋外施用割合を有する下記の除草剤を使用した： クロルイムロン（ＣＬＡＳＳＩＣ）　８−１３　ｇ／ＩＩＡクロルスルフロン（ ＧＬＥＡＮ）　４−２６　ｇ／Ｈａイマザキン（ＳＣＥＰＴＥＲ）　１００−２ ６　ｇ／ｌ（ａトリアゾロピリミジン　ｔｏ−３０ｇ／Ｈａフェノキンピリミジ ン　１００−２００　ｇ／ｌ（ａイマゼタビル（ＰＩＪＲ３ＵＩＴ）　７０−１ ４０　ｇ／Ｈａスクリーニング試験において使用した施用割合は下記の通りであ る： クロルイムｏ　ン（ＣＬＡＳＳＩＣ）　４．２０，４０，１６０　ｇ／Ｈａ　（ 突然変異体１及び２）；及び８．４０．８０，３２０　ｇ／Ｈａ　（突然変異体 ３及び１０）； クロルスルフロン（ＧＬＥＡＮ）　５．２５．５０，２００　ｇ／Ｈａ（突然変 異体１及び２）：及び１，５，１．０．４０　ｇ／Ｈａ（突然変異体３及びｌＯ ）ニ トリアゾロピリミジンとフェノキシピリミジンはＪＦ５９６９として知られる補 助薬湿潤剤中で製剤し、水で稀釈してＪＰ５９８９の最終濃度を１０％とした。

残りの化合物は水だけで稀釈した。

スプレージェット及びパラメーターは“スクリーニング千４−５０７３４０　（ ８） ングの項で述べたものと同一である。散布後、種子を０．５１の堆肥で覆い、平 らに固め（覆い２．５ｃｍ）ついで“スクリーニングの項で述べたものと同一の 条件下で生長させた。

４週間生長させた後、植物を肉眼で評価した。各植物を０〜５の等級と土壌表面 から最高の葉の頂部までの高さて評価した。評価等級は下記の通りである。

ロー損傷率０〜１０％（除草剤の影響が少ないか又は影響無し） １−損傷率　１１〜２５％ ２−損傷率　２６〜５０％ ３−損傷率　５１〜８５％ ４−損傷率　８６〜９５％ ５−損傷率　９６〜１００％（植物が完全に枯死）これらの評価を行うにあった では、明らかに感受性の表現型である植物は無視した（植物の約５０％）。

等級０．１又は２の植物を記録し、大きな鉢に植え、成熟するまで生長させた。

結果を図１７〜２２に示す。図２３はへテロ接合体型植物とホモ接合体型植物と で得られる結果の比較を示す。

１２、結果の解釈 酵素定量によってヘテロ接合体について得られたデーターと生長植物についての 施用量応答曲線とは正確には相互的に関連か無い。このことは当業者には特に予 期し得なかったことであろう。しかしながら、酵素定量において示される抵抗性 の一般的な水準は温室内での研究に反映される傾向にあると言う点においては一 般的な相互関係が存在する。勿論、有用な突然変異体を構成するものは何である かを決定する基準は除草剤又は除草剤の範囲及び取扱う除草剤の施用割合によっ て変動しそして本発明の突然変異体によって示される交差耐性の範囲における比 較的豊富な多様性は、望ましくない変動ではなく、むしろ利点と考えられるもの であり、意図する用途の環境についての突然変異体の選択を可能にする。例えば 、特定の突然変異体は特定の除草剤に対して他の除草剤と比較して比較的低い抵 抗性を示すことがあり得るが、このことは、非常に少量の除草剤に対して耐性を 示すことを意図している植物、例えば、“キャリーオーバー°　（“ｃａｒｒｙ −ｏｖｅｒ”）効果に対して抵抗性であることを意図している植物を提供するこ とについて、除草剤を極めて有用なものにせしめる。

従って、このことを考慮に入れた場合には、突然変異体を酵素定量及び温室試験 に基づいて、各除草剤について、“強”、“中間“、“弱”及び“零”抵抗性の 群に分類することができる。この分類は表５に要約され一〇いる。

！Ｌ＋　５ 特表平４−５０７３４０　（９） １３、植物の育生（ｐｌａｎｔ　ｂｒｅｅｄｌｎｇ）本発明の突然変異系統（ｉ ｕｔａｎｔｅｄ　１ｉｎｅ）を種々の第２親系統（ｓｅｃｏｎｄ　ｐａｒｅｎｔ 　１ｉｎｅ）と共通に使用して除草剤抵抗性ハイブリッドを産生じ得る。

ホモ接合体系統からの材料（ｍａｔｅｒ　ｉａ　Ｉ　）を、追加の遠縁交配（ｏ ｕｔｃｒｏｓｓｉｎｇ）、自家生殖、肉眼選択（ｖｉｓｕａｌｓｅｌｅｃｔｉｏ ｎ）及び除草剤スクリーニングをこの順序で行う育生プログラムに導入して、あ る範囲の新規な除草剤耐性ハイブリッド種子を製造し得る。

前記したごとき除草剤抵抗性についての選択を使用して、前記した突然変異育生 （ＩＩｕｔａｔｉｏｎ　ｂｒｅｅｄｉｎｇ）法又は慣用の育生法によって、除草 剤抵抗性素質を新規な系統に移行させ得る。この方法を促進するのに当業者は生 化学的又は分子スクリーニング（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｓａｒｅｅｎｉｎｇ）技 術も利用し得る。抵抗性遺伝子を単嶋しかつ転移（ｔ　ｒａｎｓ　ｆｅｒ）させ るのに遺伝子工学技術を使用することは容易に考えられる。

育生プログラムの目的は、単に、除草剤抵抗性の有用な移行であるか又は農業的 性能（ａｇｒｏｎｏｒｌｃ　ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ）の同時的改善を含む、よ り複雑なものであり得る。

ＡＬＳ　ＡＣＴｒＶＩＴＹ　Ｘ　ＯＦ　Ｃ０ＮＴＲ０ＬＡＬＳ　ＡσｎＶＩＴＹ 　Ｘ　ＯＦ　Ｃ０ＮＴＦｔＯＬＡＬＳ　ＡＣＴＴＶＩＴＹ　にＯＦＣＯＮＴＲＯ ＬＡＬＳ　ＡＣＴＴＶＩＴＹ　％　ＯＦ　Ｃ０ＮＴＲ０ＬＡＬＳ　ＡＣＴＩＶＩ ＴＹ　％　ＯＦ　Ｃ０ＮＴＲ０ＬＡＬ５ＡＣＴＩＶＩＴＹＸＯＦＣＯＮＴＲＯＬ ＡＬＳ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ　％ｏｆ　ＣｏｎｔｒｏｌＡＬＳＡｃｔＭｔＹ％ｏｆ ＣｏｎｔｒｏｌＡＬＳ　ＡｃＨｖ＋ｔｙ　％ｏｆ　ＣｏｎｔｒｏｌＲＥＳＰＯＮ ＳＥ　ＯＦ　ＬＥＡＦ　ＡＬＳ　Ｔｏ　’ＨＡＲＭＯＮＹ’ＲＥＳＰＯＮＳＥ　 ＯＦ　ＡＬＳ　Ｔｏ　Ａ　ＰＨＥＮＯＸＹＰＹＲＩＦＪＩＤＩＮＥＦＩＧ　１５ ．。ｍｕｒ　、、、　ＰＨＥＮＯＸＷＹｌｔｌｌＪｌ：・・・；。〜。。５゜＋ ＥＩＧｌ−ＩＴ　（ＣＭ）　％　ＯＦ　ＬＪＮＴＲＥＡＴＥＤｌ−ＩＥＩＧＨＴ 　（ＣＭ）Ｘ　ＯＦ　ＵＮＴＲＥＡＴＥＤ１−ＩＥＩｃＩ−ＩＴ　（ＣＭ）にＯ Ｆ　ＵＮＴＲＥＡＴＥＤＨＥＩＣＩ−ＩＴ　（ＣＭ）Ｘ　ＯＦ　ＵＮＴＲＥＡＴ ＥＤｆｆｆｆｔｔｆｆｔり 、、、１．Ｈ−ｉ ＨＥＩＧＨＴ　（ＣＭ）　Ｚ　ＯＦ　ＬＩＮＴＲＥＡ丁ＥＤＨεＩｃＩ−ＩＴ　 ％　ＯＦ　ＬＪＮ丁ＲＥＡ丁εＤ国際調査報告 艶詩雪ｈＩ＋＋１＾６０１（ｊＩＩＩ＋Ｈロ　ＰＣＴ／ＧＢ　９０１００７５３ 国際調査報告 ＱＢ　９０００７５３ ＳＡ　３６Ｂ４４

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．単離されたトウモロコシの花粉に化学的突然変異誘発物質を作用させ、突然 変異誘発された花粉を回収し、この花粉を雌親に授粉し、成熟した植物から種子 を収穫し、この種子を選択された除草剤又は選択された除草剤と同様な作用形式 を有する第２除草剤の淘汰圧下で生長させついで適用された淘汰圧に対して抵抗 性の植物及びその後代を回収することからなる、通常の致死濃度の、選択された 除草剤に対する抵抗性を有する突然変異体トウモロコシの製造方法。 ２．化学的突然変異誘発物質はメタンスルホン酸メチルである請求の範囲第１項 に記載の方法。 ３．淘汰圧を加えるために利用される除草剤はアセト乳酸塩合成酵素の抑制剤で ある請求の範囲第１項に記載の方法。 ４．除草剤はイマゼタビルである請求の範囲第３項に記載の方法。 ５．淘汰圧を適用するために使用される除草剤の濃度は、発芽を抑制するのには 不十分であるが、感受性植物の生長を抑制するのには十分である請求の範囲第１ 項〜第４項のいずれかに記載の方法。 ６．淘汰圧は発芽前の種子に除草剤を施用することによって適用する請求の範囲 第１項〜第４項のいずれかに記載の方法。 ７．ブダペスト条約の規定により英国、アバーデイーン所在の、Ｎａｔｉｏｎａ ｌ　Ｃｏｌｌｅｃｔｌｏｎ　Ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　＆Ｍａｒｉｎｅ　Ｂ ａｃｔｅｒｉａ　Ｌｔｄに下記の寄託番号でかつ下記の日付でその試料が寄託さ れている、除草剤抵抗性トウモロコシの種子。 寄託番号寄託日 ＮＣＩＭ　４０１３７１９８９．５．８ＮＣＩＭＢ　４０１３６１９８９．５． ８ＮＣＩＭＢ　４０１３８１９８９．５．８ＮＣＩＭＢ　４０１６７１９８９． ７．１８ＮＣＩＭＢ　４０１６８１９８９．７．１８ＮＣＩＭＢ　４０１６９１ ９８９．７．１８ＮＣＩＭＢ　４０１７０１９８９．７．１８ＮＣＩＭＢ　４０ １７１１９８９．７．１８ＮＣＩＭＢ　４０１７２１９８９．７．１８８．ブタ ペスト条約の規定により英国、アバーデイーン所在の、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏ ｌｌｅｃｔｉｏｎ　Ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ＆Ｍａｒｉｎｅ　Ｂａｃｔｅｒ ｉａ　Ｌｔｄに下記の寄託番号でかつ下記の日付でその試料が寄託されている、 イマゼタピル抵抗性トウモロコシの種子。 寄託番号寄託日 ＮＣＩＭＢ　４０１３７１９８９．５．８ＮＣＩＭＢ　４０１６７１９８９．７ ．１８ＮＣＩＭＢ　４０１７０１９８９．７．１８ＮＣＩＭＢ　４０１７１１９ ８９．７．１８９．ブダペスト条約の規定により英国、アバーデイーン所在の、 Ｎａｔｌｏｎａｌ　Ｃｏｅｌｌｅｃｔｌｏｎ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ＆Ｍ ａｒｉｎｅ　Ｂａｃｔｅｒｉａ　Ｌｔｄに下記の寄託番号でかつ下記の日付でそ の試料が寄託されている、イマザキン抵抗性トウモロコシの種子。 寄託番号寄託日 ＮＣＩＭＢ　４０１３７１９８９．５．８ＮＣＩＭＢ　４０１６７１９８９．５ ．８ＮＣＩＭＢ　４０１７０１９８９．７．１８ＮＣＩＭＢ　４０１７１１９８ ９．７．１８１０．ブタペスト条約の規定により英国、アバーデイーン所在の、 Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　Ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ＆Ｍａ ｒｉｎｅ　Ｂａｃｔｅｒｉａ　Ｌｔｄに下記の寄託番号でかつ下記の日付でその 試料が寄託されている、イマザキン抵抗性トウモロコシの種子。 寄託番号寄託日 ＮＣＩＭＢ　４０１３７１９８９．５．８ＮＣＩＭＢ　４０１３６１９８９．５ ．８ＮＣＩＭＢ　４０１６７１９８９．７．１８ＮＣＩＭＢ　４０１７０１９８ ９．７．１８ＮＣＩＭＢ　４０１７１１９８９．７．１８１１．請求の範囲第７ 項〜第１０項のいずれかに記載の除草剤抵抗性種子から誘導された除草剤抵抗性 トウモロコシ植物。 １２．請求の範囲第１１項に記載の植物から創生された除草剤抵抗性トウモロコ シのハイブリッド。 １３．請求の範囲第７項に記載の種子のいずれか一つから単離された、除草剤抵 抗性を与えるアセト乳酸塩合成酵素の対立遺伝子。 １４．請求の範囲第７項に記載の種子のいずれか一つ中に存在する対立遺伝子と 同一である、除草剤抵抗性を与えるアセト乳酸塩合成酵素の対立遺伝子。