WO2016193514A1 - Péptidos derivados del peptidoglicano de 5. aureus y su uso como haptenos en un método de detección. - Google Patents

Péptidos derivados del peptidoglicano de 5. aureus y su uso como haptenos en un método de detección. Download PDF

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WO2016193514A1
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aureus
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compound
hapten
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PCT/ES2016/070390
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M. Pilar MARCO COLÁS
Nuria Pascual Duran
Carme PASTELLS DÍEZ
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Consejo Superior De Investigaciones Cientificas (Csic)
Centro De Investigación Biomédica En Red (Ciber)
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    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Definitions

  • the present invention relates to compounds derived from the bacterial wall of Staphylococcus aureus for use as haptens. Furthermore, the invention relates to haptens and their conjugates useful for obtaining antibodies and / or for detecting said bacteria. Therefore, the present invention can be encompassed in the field of developing new technologies for clinical medicine.
  • Staphylococcus aureus is a pathogen of great virulence and one of the main microorganisms responsible for infectious diseases in developed countries.
  • S. aureus causes nosocomial diseases, respiratory tract infections, endocarditis and soft tissue infections.
  • the pathogen identification time is a key factor in acting and ensuring patient survival.
  • the eradication of the diseases caused by this pathogen is hindered by the multi-resistance to antibiotics that it presents and at the same time by the lack of fast and specific techniques to identify the cause of the disease.
  • S. aureus also poses a problem in food safety since said pathogen can be present in the flora of a healthy individual and when the necessary hygiene measures are not taken it can be a food contaminant and a direct source of infection for the being. human.
  • cell culture is the reference technique for the identification of pathogenic microorganisms but this technique has the disadvantage that the waiting time ranges between 24-72 hours (J Clin Microbiol 2012, 50, 195), which is too high when the patient's life is at stake.
  • methods of detection of S. aureus walls by immunochemical assays using antibodies developed from the immunization of semisynthetic forms of S. aureus peptidoglycan have also been described.
  • Peptidoglycan is a non-crystalline macromolecule, which makes it difficult to determine the three-dimensional structure at high resolution, however, various experiments of nuclear magnetic resonance (NMR), high performance liquid chromatography and mass spectrometry (HPLC-MS ) and microscopy have elucidated much of that structure.
  • PG consists of repeated units of disaccharide units, / V-acetylglucosamine (GIcNAc) and acid / V-acetyl-muramic (MurNAc) entwined by peptide chains that alternate amino acids D- and L-. The S.
  • aureus PG has a stem peptide ([Ala-DGIu (& 1) -NH 2 ] [(& 1) -Lys-DAIa-DAIa)) entwined with a pentaglycyl (Gly) 5 bridge that joins on one side to through the ⁇ - ⁇ 2 group of the Lys located in the third position of a stem peptide and on the other through the carbonyl group of the DAla group located in the fourth position of another stem peptide (J. Amer. Chem. Soc2009, 131 , 7023-7030; J. Bacteriol. 2004, 186, 5978).
  • stem peptide [Ala-DGIu (& 1) -NH 2 ] [(& 1) -Lys-DAIa-DAIa)
  • haptens derived from the bacterial wall peptidoglycan of S. aureus useful for the generation of antibodies against said bacterium and useful for the detection thereof are described.
  • a method of detecting S. aureus by antibodies generated by inoculation of the immunogens obtained from the bioconjugation of the haptens of the present invention to a protein is also described; This method significantly reduces the analysis time and is easy to implement.
  • the present invention relates to a compound of general formula (I):
  • R ' is selected from H or alkyl n is an integer selected from 0 to 1;
  • n is an integer selected from 0 to 7;
  • X ! and X 2 are each independently selected from D-Glu, D-GIn, D- ⁇ -Glu and Dy-GIn;
  • Z and Z ' are each independently selected from an amino acid, which may be L or D, selected from the list consisting of Gly (glycine), Ala (alanine), Leu (leucine), lie (isoleucine) or Val (valine); p and q are each independently an integer selected from 0 to 1;
  • Y ' are each independently selected from R 4 , COR 4 and Cys (cysteine), optionally the cysteine may contain a thiol protecting group;
  • R 2 and R 3 are independently selected from H, alkyl (CC 4 ) and CO-alkyl (CC 2 );
  • r, s, t or v are, independently, an integer selected from 0 to 1;
  • R 4 is an alkyl (CC 5 ), substituted with a group -SH, -halogen, -CECH, -N 3 or -COR 5 ;
  • R 5 is selected from H or OR ", where R" is selected from H or alkyl with the proviso that:
  • n is from 3 to 6 and more preferably m is 5.
  • n is 0 and / or is NHR 'and R' is selected from H or methyl. In another preferred embodiment of the compound of the invention, n is 1 and / or is OH.
  • X ! and / or X 2 are D-GIn or D-Gln.
  • X ! and X 2 are the same.
  • D-Glu or D-glutamic acid is the group:
  • D-GIn or D-glutamine is the group:
  • D-y-Glu or D-y-glutamic acid or D-iGlu is the group:
  • Dy-GIn or Dy-glutamine or D-YGIU-N H 2 O D-iGIn is the group:
  • Y or Y ' is Cys, optionally substituted by a thiol protecting group.
  • this amino acid may be free or protected by a thiol protecting group, such as and not limited to -alkyl (CrC 6 ), -COalkyl (Ci-C 3 ), -CH 2 Oalkyl ( Ci-C 3 ), -COC 6 H 5 , -CONHalkyl (CC 3 ),
  • thiol protecting group is -COCH 3 .
  • ty / ov are 1, more preferably R 2 and / or R 3 are COalkyl (CrC 2 ), and more preferably COCH 3 . More preferably R 2 and R 3 are COalkyl (CrC 2 ), and more preferably COCH 3 .
  • the compound of the invention is selected from:
  • alkyl (CrC 4 ) refers, in the present invention, to saturated, linear or branched hydrocarbon chains having 1 to 4 carbon atoms, for example, methyl, ethyl, n-propyl, / ' -propyl , n-butyl, tere-butyl or sec-butyl.
  • the alkyl group has between 1 and 2 carbon atoms or alkyl (CrC 2 ), more preferably it is a methyl.
  • substituted (CrC 5 ) alkyl refers, in the present invention, to saturated, linear or branched hydrocarbon chains having 1 to 5 carbon atoms, for example, methyl, ethyl, n-propyl, / ' - propyl, n-butyl, tere-butyl, sec-butyl, pentyl, etc., which is substituted by at least one substituent selected from the list consisting of-SH, -halogen, -CECH, -N 3 , -CHO , -COOH, -COOalkyl (CC 4 ).
  • a second aspect of the invention relates to the use of the compound of formula (I) of the first aspect of the invention as hapten (hereinafter "hapten of the invention").
  • hapten refers to a molecule that alone is not capable of generating an immune response in an animal and needs to be attached to a macromolecule to generate an immune response.
  • the hapten is selected from a compound of formula (I) of the first aspect of the present invention.
  • the hapten can be selected from the list consisting of PSau3, PSau4, PSau6 and PSau8.
  • the term "antigen" refers to a molecule, such as a peptide, a carbohydrate, a glycolipid, a glycoprotein or a molecule that is recognized and binds to an antibody.
  • the part of the antigen that is the target of the antibody binding corresponds to the antigenic determinant.
  • the antigen refers to S. aureus, or an analyte derived from S. aureus, that is, to a peptide part of the chemical structure of the peptidoglycan of the bacterial wall of S. aureus or to a hapten of the invention conjugated with a macromolecule.
  • a third aspect of the invention relates to a conjugate (hereafter conjugate of the invention) comprising at least one hapten selected from a compound of formula (I) of the first aspect of the invention (the hapten of the invention) together with at least one component selected from the list consisting of: a macromolecule, such as a protein or a fragment thereof, an oligonucleotide or a polysaccharide; a detectable label or a support, in particular the support can be a polymer or an inorganic material.
  • a macromolecule such as a protein or a fragment thereof, an oligonucleotide or a polysaccharide
  • a detectable label or a support in particular the support can be a polymer or an inorganic material.
  • conjugate refers in the present invention to the complex formed by the covalent attachment of a hapten selected from a compound of formula (I) and a second component selected from the group consisting of a macromolecule, such as a protein or a fragment of the same, an oligonucleotide or a polysaccharide; a detectable label or a support, such as a polymer or an inorganic material.
  • a macromolecule such as a protein or a fragment of the same, an oligonucleotide or a polysaccharide
  • a detectable label or a support such as a polymer or an inorganic material.
  • Methods for obtaining hapten-macromolecule conjugates are known to those skilled in the art.
  • immunogen refers to a conjugate according to the invention capable of generating an immune response generating antibodies, that is, a conjugate formed by a hapten of the invention, selected from a compound of formula (I), and a second component comprising a macromolecule that confers antigenicity, said macromolecule being responsible for the immunogenic nature of the conjugate.
  • the macromolecules in the present invention can be proteins or fragments thereof, oligonucleotides or polysaccharides.
  • Useful proteins have a mass greater than 10 kDA, preferably greater than 15 kDa. When the conjugates of the invention are used to immunize an animal, said proteins must come from an animal species other than the species to be immunized.
  • Useful proteins include, without limitation, serum albumin of various species, for example bovine (BSA), rabbit (RSA); mollusk hemocyanins, for example crab hemocyanin (HCH) or barnacle hemocyanin (KLH); horseradish peroxidase (HRP), ovalbumin (OVA), conalbumin (CONA), thyroglobulin and fibrinogen, as well as fragments of these proteins that confer antigenicity, etc.
  • the protein is selected from the list consisting of horseshoe crab hemocyanin (HCH), bovine serum albumin (BSA), ovalbumin (OVA) and, with albumin (CONA). More preferably BSA and HCH.
  • the proteins are covalently bound to the hapten by means of the amino acids accessible on their surface, preferably those amino acids with nucleophilic side chains.
  • the reactive amino acid of the proteins is selected from the list consisting of, but not limited to, cysteine, serine, tyrosine and lysine; preferably it is lysine.
  • the procedures for achieving conjugation of haptens to other carrier molecules depend on the functional group present in the hapten molecule in question. The stability and solubility of hapten must also be taken into account.
  • oligonucleotide refers to a nucleic acid of at least 4, preferably at least 10, preferably at least 15, preferably not more than 100 nucleotides. Both oligonucleotides formed by conventional nucleotides linked by conventional phosphodiester bonds and variants thereof including modifications to the purine or pyrimidine moieties and modifications to the ribose or deoxyribose moieties are contemplated.
  • the hapten and the macromolecule are linked by a crosslinking agent.
  • the hapten of the invention selected from a compound of formula (I), is conjugated to the macromolecule through the group Y or Y '.
  • the conjugate of the invention is formed by the hapten and a protein.
  • the -SH group is conjugated to proteins with maleimides, or by activation of the proteins with haloacetyls (such as iodoacetyl).
  • the Y or Y 'group of the hapten contains carboxylic acid (-COOH), the mixed anhydride method, the carbodiimide (CDI) method or the ester- / V-hydroxysuccinimide method can be used for conjugation, among others. (NHS) (the latter also known as the active ester method).
  • the Y or Y 'group of the hapten contains an aldehyde (-CHO), it can be transformed into a carboxyl group by forming 0- (carboxymethyl) oximes. The reaction is carried out by treating the hapten with 0- (carboxymethyl) hydroxylamine. The reaction of the carboxylic acid formed with the protein is continued by one of the aforementioned methods.
  • Haptens that have formyl groups can also be directly coupled through the formation of Schiff bases, which are transformed to amines by reduction with sodium borohydride.
  • Schiff bases which are transformed to amines by reduction with sodium borohydride.
  • the conjugation is performed on a previously modified protein or peptide so that it has reactive thiol groups.
  • the hapten of the invention selected from a compound of formula (I), may be attached to a marking agent, as a marker for detection.
  • the hapten may be attached to a support, such as a polymer or an inorganic material.
  • support refers to any solid material to which the components of the invention, in particular the antibodies, haptens or conjugates of the invention, are physically bound, thus being immobilized.
  • Any of a wide variety of solid supports can be employed in the immunoassays of the present invention. Suitable materials for the solid support are synthetic such as polystyrene, polyvinyl chloride, polyamide or other synthetic polymers, natural polymers such as cellulose, as well as derived natural polymers such as cellulose acetate or nitrocellulose, and glass, especially glass fibers.
  • the support can take the form of spheres, rods, tubes, and microassay or microtiter plates. Sheet-like structures such as paper strips, small plates and membranes are also suitable.
  • the surface of the supports can be permeable and impermeable for aqueous solutions.
  • Additional inorganic solid materials suitable for use in the present invention include, without limitation, silicone, crystal, quartz, ceramics, metals and their oxides, silicon, silicates, silicides, nitrides, amorphous silicon carbide as well as any other material suitable for microfabrication. or microlithography
  • Additional organic solid supports suitable for use in the present invention include, without limitation polymers such as polyimide, acrylate, polymethylmethacrylate, polystyrene or nitrocellulose.
  • detectable label refers to a molecular label that allows the detection, location and / or identification of the molecule to which it is attached, by procedures and equipment suitable for detection, either by means of spectroscopic, photochemical means , biochemical, immunochemical or chemical.
  • detectable labels for compound compounding include, but are not limited to radioactive isootopes, enzyme substrates, co-factors, ligands, chemiluminescent agents, fluorophores, enzymes and combinations thereof. Methods for marking and guidance for the selection of suitable markings for different purposes are known to the person skilled in the art.
  • the conjugate of the invention has an immunogenic character, that is, it induces the formation of antibodies.
  • a fourth aspect of the invention relates to the use of a conjugate of the third aspect of the invention comprising a hapten of the invention, selected from a compound of general formula (I), and a macromolecule, which confers antigenicity for obtaining of antibodies.
  • antibody refers to immunoglobulin molecules and immunologically active portions of immunoglobulin molecules, that is, molecules containing an antigen binding site that specifically binds (immunoreacts) with an antigen, such as, for example, a protein.
  • an antigen such as, for example, a protein.
  • immunoglobulin M immunoglobulin M
  • IgD immunoglobulin D
  • IgG immunoglobulin G
  • IgA immunoglobulin A
  • IgE immunoglobulin E
  • the term “antibody” comprises monoclonal antibodies, or intact polyclonal antibodies, or fragments thereof; and includes human, humanized and non-human origin antibodies.
  • the term “antibody” refers to the immunoglobulin that the animal or a hybrid cell has specifically synthesized against the immunogen of the invention.
  • a fifth aspect of the invention relates to an antibody (hereinafter "antibody of the invention") obtained by immunization with the conjugate of the invention, this antibody specifically recognizes the hapten of the conjugate of the third aspect of the present invention, to S. aureus and / or an analyte derived from S. aureus.
  • the antibody is monoclonal or polyclonal.
  • the antibody of the invention is linked to a marking agent that allows its location and / or identification, by spectroscopic, photochemical, biochemical, immunochemical or chemical means.
  • Monoclonal antibodies are homogeneous populations of identical antibodies, produced by a hybrid cell resulting from the fusion of a clone of B lymphocytes descending from a single and single stem cell and a tumor plasma cell, which are directed against a single site or determinant antigenic
  • the process for obtaining the monoclonal antibodies of the invention can be carried out according to conventional methods, known in the state of the art.
  • the method consists in immunizing an animal with a conjugate according to the invention comprising a hapten, selected from a compound of formula (I), and a macromolecule that confers immunogenicity, and subsequently extracting cells from the spleen of the immunized animal, which are fused with myeloma cells in the presence of a fusion inducer, such as PEG-1500 by standard procedures (Harlow D and La ⁇ e D. Antibodies: a laboratory manual. 1988. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor New York).
  • the hybridomas are selected and subcloned by dilution. Clones suitable for expansion constitute a hybridoma cell line.
  • said hybridoma cell line is cultured in a culture medium suitable for hybridoma cells to produce antibodies and secrete them into the medium, and the culture medium supernatant containing the produced monoclonal antibodies is subsequently collected.
  • said antibodies can be purified by conventional means, such as affinity chromatography, A-Sepharose protein, hydroxyapatite chromatography, gel electrophoresis or dialysis. Therefore, in one embodiment of the invention the obtaining of antibodies comprises the administration of a conjugate of the invention and the collection of tissue cells of said animal capable of producing said antibodies.
  • Polyclonal antibodies are heterogeneous populations of antibodies that recognize several epitopes of the same antigen, that is, against different antigenic determinants.
  • a non-human animal is immunized with a conjugate of the invention according to methods known to those skilled in the art. Once an acceptable antibody titer is obtained, the animal it is exanguinated and the antiserum containing the serum antibodies formed by said animal is collected.
  • the conjugate of the invention used for the production of antibodies is a hapten of the invention, preferably PSau3, PSau4, PSau6 or PSau8, conjugated to HCH.
  • a sixth aspect of the invention relates to an antiserum comprising the antibody of the fifth aspect of the present invention.
  • antiserum refers to a serum obtained after immunization of an animal with an immunogen.
  • the antiserum comprises antibodies specific to said immunogen generated after the immune response produced in the animal.
  • the immunogen is the conjugate of the invention and the antiserum comprises specific antibodies generated against the conjugate of the invention, the antibodies of the invention.
  • a seventh aspect of the invention relates to the use of the hapten of the second aspect of the invention, selected from a compound of formula (I), or of the conjugate of the third aspect of the invention, or of the antibody of the fifth aspect of the invention or of the antiserum of the sixth aspect of the invention for the detection of S. aureus in a biological sample isolated from a subject.
  • An eighth aspect of the invention relates to the use of the hapten of the second aspect of the invention, selected from a compound of formula (I), or of the conjugate of the third aspect of the invention, or of the antibody of the fifth aspect of the invention or of the antiserum of the sixth aspect of the invention for the detection of S. aureus in a food sample.
  • a ninth aspect of the present invention relates to a method for detecting S. aureus or an analyte derived from S.
  • method of the invention comprising the use of an antibody of the fifth aspect of the invention or of a fragment thereof capable of binding to the antigen or of an antiserum of the sixth aspect of the invention comprising the above antibody and the detection of the binding of said antibody to S. aureus. It preferably further comprises the use of the conjugate of the invention.
  • sample refers to the sample to be analyzed by the method of the invention, capable of containing the analyte to be detected, in this invention an analyte is understood as S. aureus or a analyte derived from this bacterium. Any type of sample can be analyzed according to the method of the invention.
  • analyte is understood as S. aureus or a analyte derived from this bacterium. Any type of sample can be analyzed according to the method of the invention.
  • the analysis of isolated biological samples of both animal and human origin is contemplated, either for clinical purposes (for example, to detect infections caused by the presence of S. aureus and establish a therapeutic method to combat it) or within the scope of food safety for the analysis of contaminants in food samples or environmental security such as water, soil or surface, or samples from cell cultures.
  • aureus is meant in this invention a chemical compound that maintains a peptide part of the chemical structure of the bacterial wall peptidoglycan of S. aureus, which can be specifically recognized by the antibodies of the invention .
  • the analyte derived from S. aureus peptidoglycan is a compound of formula (I), and in a more preferred embodiment is a compound of formula (I) selected from PSau5 and PSau7. These analytes are used as a standard sample to make the calibration line in the ELISA test.
  • the biological sample can be, for example, without limitation, blood, serum, plasma, saliva, urine, sputum, bronchoalveolar lavages (BAL) and bronchoaspirates (BAS).
  • BAL bronchoalveolar lavages
  • BAS bronchoaspirates
  • the sample in which infections caused by S. aureus is detected is a BAL or BAS sample.
  • the method of the invention comprises at least the following steps: (a) contacting the sample to be analyzed with the antibody of the invention or a fragment thereof for the time necessary for its binding (or incubation),
  • step (b) identify the formation of the immunocomplexes formed with said antibody and / or measure the amount of said immunocomplexes. Additionally, said method may also require a conjugate according to the invention. Therefore, in a particular embodiment, in addition to the antibody of the invention in step (a) a conjugate is used; wherein said conjugate comprises a hapten of the invention, selected from a compound of formula (I), and a second component that can be a macromolecule, a detectable tidal agent or a support, such as a polymer or an inorganic material.
  • a conjugate comprises a hapten of the invention, selected from a compound of formula (I), and a second component that can be a macromolecule, a detectable tidal agent or a support, such as a polymer or an inorganic material.
  • the term "detection method” refers to a method that allows to establish whether a given sample comprises or does not comprise S. aureus or an analyte derived from S. aureus with adequate sensitivity and specificity. Typical detection desensibility intervals may be between about 20% and about 90% of the maximum signal.
  • the sensitivity of a detection method is given by the probability that the detection is positive in a sample containing the compound to be detected.
  • the sensitivity expressed as a percentage, represents the percentage of cases of positive detection with respect to the total cases in which the compound to be detected is present. A greater sensitivity, greater number of positive cases and fewer false negatives
  • the specificity of a diagnostic method is given by the probability that the detection is negative in a sample that does not contain the compound to be detected.
  • the specificity, expressed as a percentage represents the percentage of cases of negative detection with respect to the total cases in which the compound to be detected is absent. The greater the specificity, the lower the probability of obtaining a false positive.
  • immunoassay or "immunochemical analysis technique” is an immunochemical method of analysis in which an antibody that specifically binds to an antigen is used.
  • the immunoassay is characterized by the use of specific binding properties of a particular antibody to isolate, direct and / or quantify the antigen.
  • Immunoassays include, but are not limited to, immunological techniques such as ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), Western blot, RIA (radioimmunoassay), competitive EIA (competitive enzyme immunoassay), DAS-ELISA (Double Antibody Sandwich-ELISA), immunoaffinity chromatography, strip or lateral flow tests (lateral-flow immunoassay), immunoprecipitation, dot-blot, radio immunoassay, flow cytometry, immunocytochemical and immunohistochemical techniques, techniques based on the use of biomarker biochips, biosensors or microarrays that include specific antibodies or tests based on colloidal precipitation in formats such as dipsticks.
  • immunological techniques such as ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), Western blot, RIA (radioimmunoassay), competitive EIA (competitive enzyme immunoassay), DAS-ELISA (Double Antibody Sandwich-ELISA), immunoaffin
  • immunoassays also include immunosensors whose transduction principle can be optical, electrochemical, mass or thermometric.
  • immunosorbents or immunoaffinity extraction systems are also included, which allow the selective extraction of the analyte within a complex mixture. These systems are usually biohybrid materials, the result of stable binding of the antibody to a solid support (polymer, inorganic material, metal particles, etc.), and which are used for the separation or extraction of the analyte from the rest of the matrix components. .
  • Such formats may be heterogeneous or homogeneous, sequential or simultaneous, competitive or non-competitive.
  • the detection is performed by an immunochemical technique.
  • the immunochemical technique is an ELISA type assay.
  • Different types of ELISA are known, such as direct ELISA, indirect ELISA or sandwich ELISA, of a competitive or non-competitive nature.
  • Methods included in the present invention are those ELISA assays in which the conjugate of the invention is anchored to the support, as well as those ELISA assays in which it is anchored to the support is the antibody of the invention. More preferably, the detection method is an indirect competitive ELISA.
  • directly competitive ELISA refers to an assay in which the sample to be analyzed is added together, capable of containing a certain concentration of S. aureus or a derived analyte, and a specific antibody according to the invention that recognizes S. aureus , where the analyte present in the sample will compete for its binding to the antibody with a conjugate immobilized on a solid support.
  • the sample contains the analyte there are no antibodies available to react with the immobilized conjugates and therefore the reaction produced by the marking agent is not very intense. Whereas when no analyte is present in the sample, a large amount of antibodies bind to the immobilized conjugate in the solid phase.
  • direct competitive ELISA is similar and characterizes the assay in which the specific antibody or antiserum is immobilized to the ELISA plate and the sample to be analyzed is mixed with a hapten conjugate with a detectable marking agent. As in the case of the indirect test both compounds compete for the antibodies and the signal resulting from the test is inversely proportional to the amount of analyte present in the sample.
  • the indirect competitive ELISA assay comprises the following steps:
  • a hapten or the conjugate of the invention preferably a conjugate comprising a hapten of the invention and a macromolecule or a conjugate comprising the hapten of the invention and a polymer;
  • step (c) adding a second antibody conjugated with a detectable marking agent, said second antibody recognizing the first antibody that is bound in step (c), and incubating,
  • a hapten or a conjugate comprising a hapten of the invention and a macromolecule, preferably a protein, or a conjugate comprising a hapten of the invention and a polymer In the first stage of the method of the invention [step (a)] a hapten or a conjugate comprising a hapten of the invention and a macromolecule, preferably a protein, or a conjugate comprising a hapten of the invention and a polymer.
  • the solid support are plates for the analysis of ELISA type immunoassays.
  • the immobilization of the conjugate on the surface of a support such as polystyrene plastic is directed by surface chemistry.
  • the immobilization capacity of the conjugates that in this case act as competing antigens depends on many factors, such as time and temperature.
  • the immobilization step of the hapten or conjugate may include blocking support spaces that have not been occupied by said conjugates.
  • the blocking is carried out by proteins or detergents, preferably non-ionic detergents.
  • the conjugate that Immobilizes must comprise a macromolecule different from that used in the conjugate used as immunogen.
  • the conjugate immobilized at this stage comprises a hapten of the invention and a macromolecule, preferably BSA.
  • the components may be immobilized to the support by covalent bonds or non-covalent bonds such as hydrogen bonds, hydrophobic interactions or ionic bonds.
  • covalent bonds such as hydrogen bonds, hydrophobic interactions or ionic bonds.
  • suitable microarrays and supports has been described in Shalon et al. (Genome Res 1996, 6, 639).
  • these groups include 3-glisidoxypropyltrimethoxysilane (GTMS), 2- (3,4 epoxycyclohexyl) ethyltrimethoxysilane, 3-glisidoxypropylmethyldiethoxysilane, 3- glisidoxypropyl triethoxysilane and the like.
  • Step (b) of the method consists in removing the hapten or non-immobilized conjugate. Typically, this is accomplished by washing, usually between 1 and 10 washes, preferably 2 to 5 washes. The washes are intended to eliminate conjugates that have not been immobilized, so that everything that is detected is specific and desired.
  • the third stage of the method of the invention [step (c)] consists in adding the analytical sample capable of containing the analyte to be detected and / or quantified, that is, S. aureus or a derived analyte, and a first anti-antibody.
  • -PSau according to the invention in the solid support of section (a) and incubate. This stage is the competitive stage of the essay.
  • first anti-PSau antibody an antibody according to the invention, generated against a conjugate comprising a hapten of the invention and a macromolecule that confers antigenicity, preferably against a conjugate comprising the hapten of the invention and the HCH protein .
  • the S. aureus or the derived analyte present in the sample to be analyzed and the hapten or conjugate immobilized on the solid support of step (a) compete for the binding of the first anti-PSau antibody.
  • the hapten of the immobilized conjugate of step (a) and the hapten of the conjugate used to obtain the antibodies of step (c) may or may not be the same.
  • Stage (c) is the crucial stage of the trial.
  • step (c) has a duration between 10 minutes and 1 hour, preferably 30 minutes. This test has been shown to tolerate a wide range of ionic forces and pH values. The inventors have optimized the buffer used in the competitive stage of the test [step (c)].
  • step (c) is performed in the presence of a buffer having the following characteristics: i. a concentration of non-ionic detergent between 0% and 0.1% preferably 0.05%;
  • I a pH between 5.5 and 9.5, preferably 7.5;
  • step (d) consists in removing the first antibody not bound to the hapten or immobilized conjugate. This unbound antibody will have bound to the analyte. Typically, this is done by washing under the same conditions as step (b).
  • step (e) is to add a second antibody conjugated with a detectable dyeing agent, said second antibody recognizing the first antibody and incubating.
  • Said second antibody is conjugated with a compound capable of reacting with some substrate, so that a chromogenic, fluorogenic and / or chemiluminescent detection is derived therefrom.
  • This compound can bind to the antibody directly or through another component.
  • the second antibody may be a natural immunoglobulin isolated from a non-human species and different from the species used to produce the first antibody (eg, murine anti-lgG antibody, goat anti-lgG antibody, goat anti-lgM antibody) or It can be produced recombinantly or synthetically.
  • step (f) takes place, which consists in eliminating the second antibody nounido to the first antibody. Typically, this is done by washing under the same conditions as in steps (b) and (d).
  • the last step (g) consists in the identification and / or measuring the amount of the complex obtained according to section (e) with a composition containing a chromogenic, fluorogenic and / or chemiluminescent indicator substrate.
  • An indicator substrate is a substance capable of reacting with the second antibody dyeing agent resulting in a chromophore, fluorescent or chemiluminescent compound that can be detected by methods known in the state of the art. Indicating substrates suitable for carrying out the present invention are known to those skilled in the art and accessible from various commercial sources.
  • the indicator substrate is chromogenic, such as for example 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine (TMB), azino-bis (3-ethylbenzothiazoline 6- sulfonic acid) or phenylenediamine, without limitation of using other substrates such as chemical markers (for example, colloidal gold markers, latex balls).
  • TMB 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine
  • azino-bis 3-ethylbenzothiazoline 6- sulfonic acid
  • phenylenediamine without limitation of using other substrates such as chemical markers (for example, colloidal gold markers, latex balls).
  • chemical markers for example, colloidal gold markers, latex balls
  • the detection and quantification is carried out by means of fluorimetry, and if the substrate is chemiluminescent, the signal can be quantified by means of a luminometer.
  • the enzyme marker is horseradish peroxidase (HRP)
  • the substrate is chromogenic and the reaction is enzymatic. In this case, the reaction is inhibited after a while since the substrate is added and for this the optimal operating conditions of the enzyme being used are changed.
  • the method may further comprise a calibration line prepared with known concentrations of analytes derived from S. aureus (among them PSau5 and / or PSau7 can be used) which allows quantifying the concentration of S. aureus detected in a sample.
  • a tenth aspect of the present invention relates to a kit or device for the detection of S. aureus or an analyte derived in a sample comprising at least one hapten of the invention, a conjugate of the third aspect of the invention, an antibody of the fifth aspect of the invention or an antiserum of the sixth aspect of the invention, or combinations thereof.
  • the hapten, conjugate or antibody is immobilized on a solid support.
  • the kit further comprises an antibody against the anti-PSau antibodies according to the invention.
  • a tenth aspect of the present invention relates to the use of the kit or device of the tenth aspect of the invention for the detection of S. aureus or an analyte derived in a biological sample or in a food sample.
  • FIG. 1 Standard calibration curves for the PSa ⁇ v3-MP-BSA / As291 ELISA.
  • 1A Calibration curve obtained with the commercial S. aureus PG in PBT.
  • FIG. 2 Effects of the different physicochemical parameters of the PSau3-MP-BSA / As291 immunoassay. Experiments were performed using PG standards in PBST.
  • 2A pH effect of the assay buffer
  • 2B Effect of the ionic strength of the assay buffer
  • 3C Percentage effect of Tween 20 in the assay buffer
  • 2D Effect of preincubation time between antibody and analyte
  • 2E Time effect of the competition stage.
  • the results were obtained from the calibration of the curves of Calibration performed under the different conditions shown. The calibration curves were performed in triplicate in the wells of the plate for each of the concentrations. IC 50 values are expressed in ⁇ g mL "1. Legend: ⁇ A max ;
  • FIG. 3 Evaluation of the matrix effect of the deglycosylation extract in the PSat / 3-MP-BSA / As291 ELISA.
  • FIG. 4 Immunoequivalents of PSau7 measured before and after the deglycosylation treatment of commercial PG prepared at different concentrations.
  • FIG. 5 Immunochemical response of S. aureus CECT 5190 with respect to P. aeruginosa CECT 1 10 and E. coli K12 CECT 433 before and after the deglycosylation treatment. All suspensions were prepared at a concentration of 10 7 CFU mL "1 .
  • FIG 6 S. ai / rei / sCECT5190 samples doped at different densities in PBS, BAL and BAS. * Indicates the limit of detection of deglycosylated samples in PBS.
  • the invention will now be illustrated by tests carried out by the inventors, which demonstrates the effectiveness of the product of the invention.
  • the compounds of formula (I) can be prepared following different methods known to any person skilled in the field of organic synthesis, in particular by the general procedures presented in the following schemes.
  • the starting materials for the preparative methods are commercially available or can be prepared by methods described in the literature.
  • PSau3, PSau4, PSau5, PSauQ, PSau7 and PSau8 peptides were synthesized manually in polypropylene syringes equipped with porous polyethylene discs using the appropriate polymeric support in each case.
  • PSau3, PSau4, PSau5 and PSau6 were synthesized in 2-chloro trityl resin (2-CTC, 600 mg; 1 mmol g "1 ) and H-Rink Amide ChemMatrix® resin (600 mg, 0.53 mmol g " 1 ) It was used for the synthesis of PSau7 and PSau8. Solvents and soluble reagents were removed by suction.
  • PSau peptides were synthesized using an Fmoc / tBu / Alloc strategy, using in all cases Fmoc-L-Lys (Alloc) -OH for L-Lys in the third position of the first stem peptide and Fmoc-L-Lys (Boc ) for another L-Lyslocalized in the second stem peptide.
  • Fmoc- DGIu-NH2 was used for PSau5, PSau6, PSau7 and PSau8 and Fmoc-DGIn (Trt) -OH for PSai / 3, PSai / 4.Fmoc-LCys (Trt) was used to incorporate the LCys into these four peptides.
  • the Kaiser colorimetric assay was used for the detection of amino acid incorporation. When necessary the re-coupling was performed with HBTU (3 equiv), HOAT (3 equiv) and DIEA (4 equiv) in DMF for 40 min.
  • the acetylations were carried out with acetic anhydride (10 equiv), DIEA (10 equiv) in DCM for 15 min.
  • the Alloc group was removed with phenylsilane (10 equiv), tetrakistriphenylphosphine Pd zero (0.1 equiv) in DCM (3 x 15 min).
  • the cleavage of the resin peptides was carried out with a mixture of TFA-H 2 0-TIS (95: 2.5: 2.5) for 1 hour. After this time the TFA was removed by evaporation and the peptides were precipitated by the addition of cold anhydrous diethyl ether, centrifuged and the supernatant discarded. The solid was dissolved in H 2 0-MeCN (1: 1) and lyophilized. Peptides were characterized by HPLC and HPLC-MS.
  • the crude PSau peptides were purified by reverse phase HPLC semi-preparative chromatography using a linear gradient from 0% B to 50% B in 10 min, at a flow of 16 mL min "1 and UV detection at 220 nm.
  • the system Elution was A: H 2 0: TFA (99: 1, v / v) and B: CH3CN (99: 1), v / v).
  • the MALDI-TOF / TOF-MS ionization matrix assisted laser desorption flight time mass spectrometer
  • AUTOFLEX Bruker-Daltonics, Bremen, Germany
  • SmartBeam laser that operates at 200 Hz.
  • the pH and conductivity of all buffers and solutions were measured with a pH meter pH 540 GLP and an LF 340 conductimeter, respectively (WTW, Weilheim, Germany).
  • Protein purification was performed by dialysis using regenerated cellulose tubular membrane with a cut line of a molecular weight of 12,000-14,000 (Cellu Sep of the T series membranes; Membrane filtration productes Inc., Seguin, USA) or by molecular exclusion chromatography (HiTrap® Sephadex® G-25 superfine column; Amersham Biosciences). Polystyrene microtiter plates were purchased from Nunc (Maxisorp, Roskilde, Denmark). The washing steps were carried out using an ELx405 HT microplate washer (BioTek, Vinooski, Vermont, USA).
  • the PBS is 10 mM phosphate buffer in a solution of 140 mM NaCl, and the pH is 7.5.
  • PBST is PBS with 0.05% Tween 20.
  • PBT is PBST without NaCI.
  • PBST-D is a blank aqueous phase extraction solution resulting from chemical deglycosylation treatment, performed as described below, diluted 1 / 3.5 with PBT.
  • the upholstery buffer is 50 mM carbonate-bicarbonate buffer pH 9.6.
  • Citrate buffer is a 40 mM solution of sodium citrate pH 5.5.
  • the solution of substrate contains 0.01% TMB (3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine) and 0.004% of H 2 0 2 in citrate buffer.
  • the borate buffer is 0.2 M boric acid / sodium borate pH 8.7.
  • Peptides PSau3, PSau4, PSau5, PSau6, PSau7 and PSau8 were synthesized as described in the chemical section.
  • Staphylococcus aureus peptidoglycan (77140) and rabbit anti-lgG peroxidase (A8275) were purchased from Sigma-Aldrich.
  • Staphylococcus aureus CECT 5190, Escherichia coli K12 CECT 433 and Pseudomonas aeruginosa CECT 1 10 were supplied by the Protein Production Platform (PPP, Applied Microbiology Group, Autonomous University of Barcelona) previously heat inactivated at 100 ° C. The samples were suspended in PBS and stored at -40 ° C.
  • the hapten protein-peptide bioconjugates with an LCys residue were synthesized using N-succinimidyl-3- maleimidyl propanoate (N-SMP) or N-succinimidyl iodoacetate (N-SIA) as heterobifunctional spacer arms, using the general procedure described then, to obtain the corresponding malimidopropyl peptide (peptide-MP) or peptide-iodoacetyl (peptide-IA-protein conjugates).
  • PSau6 and PSau8 were coupled to HCH (horseshoe crab hemocyanin) and BSA (bovine serum albumin), while PSau3 and PSau4 only coupled to BSA.
  • HCH human hemocyanin
  • BSA bovine serum albumin
  • Step 1 Activation of proteins.
  • a solution of N-SMP (1.6 mol, 0.43 mg) or N-SIA (9.22 mol, 2.61 mg) in dry DMF (200 ⁇ ) was added dropwise to a solution of the protein (HCH or BSA, 10 mg each) in borate buffer (1.8 mL). The mixture was stirred 4 h at room temperature, and then purified by molecular size exclusion using borate buffer as eluent. The eluted fractions (0.5 mL) of the corresponding MP-protein or IA-protein conjugates were collected in Eppendorf tubes, and those that tested positive in the Bradford protein test were combined (3 mL). A part of this solution was reserved for MALDI-TOF-MS analysis, and the rest was used for conjugation as described in step 2.
  • Step 2 Bioconjugation. Haptens PSau3 (2.17 mg, 1.6 mmol), PSau4 (2.17 mg, 1.6 mmol), PSauQ (6.26 mg, 4.6 mmol) and PSau8 (5.93 mg, 4, 6 mmol) dissolved in 1: 1 ACN: H 2 0 MilliQ (200 ⁇ _) and each solution was added dropwise to the corresponding purified activated protein solutions (10 mg; see step 1). PSau3 and PSau4 were conjugated to MP-protein and PSau6 and PSau8 were conjugated to IA-protein through the SH group.
  • the mixture was kept under slight stirring for 4 h at room temperature to obtain the corresponding PSai / 3-MP-protein and PSai / 4-MP-protein or PSai / 6-CH 2 CO-protein and PSai 8-CH 2 CO conjugate - protein
  • the blocking of unreacted iodine atoms was performed by adding a cysteine solution (80 mM, 200 ⁇ ) and stir the mixture for 2 h more at room temperature.
  • the conjugates were purified by dialysis against 0.5 mM PBS (4 ⁇ 5 L) and MilliQ water (1 x 5 L), lyophilized and stored at -80 ° C.
  • BSA conjugate densities were calculated using MALDI-TOF / TOF-MS by comparing molecular weight of the native protein with the corresponding MP-or IA-protein and with the conjugate peptide-MP-protein or peptide-CH 2 CO-protein.
  • MALDI spectra were obtained by mixing the matrix-trans-3,5- hydroxycinnamic dimethoxy-4 (2 ⁇ , 10 mg mL "1 in CH 3 CN / H 2 0 70:30, 0.1% formic acid, freshly prepared) and the conjugate or protein solution (2 ⁇ _, 10 mg mL "1 in CH 3 CN / H 2 0 70:30, 0.1% TFA) (table 1).
  • the analyzes were performed using MALDI-TOF / TOF-MS.
  • the evolution of antibody titers was evaluated by measuring the binding of serial dilutions of the antisera to microtiter plates coated with the homologous conjugate (PSai6-CH 2 CO-BSA and PSai 8-CH 2 CO-BSA). After obtaining an acceptable antibody titer, the rabbits were bled and the blood was collected in vacutainer tubes provided with a serum separation gel. The antiserum was obtained by centrifugation for 15 min at 4000 rpm and stored at -80 ° C in the presence of 0.02% NaN 3 . Work rates were stored at 4 ° C.
  • PG peptidoglycan
  • TFMSA trifluoromethanesulfonic acid
  • aeruginosa 1 mL of 10 9 UFCmL "1 of lyophilized bacteria
  • TFMSA anisole
  • diethyl ether 1.5 mL was added dropwise to the suspension and then the mixture was added to a 1: 1 solution of pyridine: Milli-Q water (2.5 mL)
  • the aqueous phase was washed with diethyl ether (2.5 mL x 3) and dried using a nitrogen flow for 10 min.
  • BAL or BAS of 10 patients diagnosed as having no S. aureus infection were treated with dithiothreitol (DTT) to hydrolyse their mucolytic structure.
  • DTT dithiothreitol
  • the BAL or BAS samples were weighed (50 mg) and a 0.1% w / v DTT solution (200 ⁇ ) was added and stirred for 30 min. Then, 200 ⁇ ⁇ - of PBS was added and the mixture was filtered with a 48 ⁇ nylon filter and centrifuged (10 min, 4000 G). The supernatant was divided into aliquots and stored at -40 ° C.
  • a representative white sample of BAL or BAS was prepared by mixing equal volumes of BAL or BAS with samples from 10 individuals diagnosed as having no S. aureus, respectively. Matrix effect studies Deglycosylation treatment. Non-specific interferences produced by the type of sample analyzed were determined.
  • BAL or BAS the calibration curves in BAL or BAS were prepared and evaluated by ELISA to compare the parallelism with the standard curve prepared in PBST-D. (See Figure 1 B and Table 3)
  • Non-deglycosylated doped samples a. Samples prepared in buffer. PBS was doped at various concentrations of PSau7, PG and S. aureus and the immunoreactive equivalents of PSau7 were measured in the PSau7 PBT reference curve by ELISA ( Figures 4 and 6 and Table 4).
  • Deglycosylated doped samples a. Samples prepared in buffer: PBS was doped at various concentrations of PSau7, PG, S. aureus, P. aeruginosa or E. coli. They were deglycosylated as described above and the immunoreactive equivalents of PSau7 were measured in the PSau7 PBST-D reference curve by ELISA using the procedure described for deglycosylated samples (Table 4 and Figure 4 for PG; Figure 5 P. aeruginosa and E. coli) b. BAL or BAS doped samples. BAL or BAS was doped at various concentrations of S. aureus and measured in the PSau7 PBST-D ELISA. ( Figure 6 for S.
  • Indirect competitive ELISA The appropriate concentrations of the antisera (As288-As291) and bioconjugates (PSai / 3-MP-BSA, PSai / 4- ⁇ - BSA, PSai6-CH 2 CO-BSA or PSai / 8- were selected CH 2 CO-BSA) to establish the ELISA tests after a 2D titration plate test that was performed as described (Anal. Chim Acta 1997, 347 (1-2), 139) (table 2). The following quantitative procedure was established with the best As / bioconjugate combination:
  • microtiter plates were upholstered with PSai / 3-MP-BSA (0.125 mg mL "1 in upholstery buffer, 100 ⁇ " 1 ) 4 hours at 25 ° C. Then, the plates were washed with PBST (4 x 300 L well “1 ) and the standard solutions of the peptide ⁇ PSau5 or PSau7, from 1,500 nM to 0 nM in PBT) or PG (200 ⁇ g mL " 1 were added at 0 ⁇ g mL "1 in PBST) or samples (bacterial suspensions), previously pre-incubated with the antiserum (As291, 1/6000 diluted in PBT) for 30 min at room temperature, (100 ⁇ well "1 ).
  • the plates were washed as before and the anti-lgG-HRP solution was added (1/6000 in PBST, 100 ⁇ _ well "1 ) and incubated for an additional 30 min.
  • the substrate solution 0.01% TMB (3.3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine) and 0.004% H 2 0 2 in citrate buffer
  • the enzymatic reaction was stopped after 30 min at room temperature with H 2 S0 4 4N (50 ⁇ _ well "1 ). Absorbances were measured at 450 nm.
  • the microplate upholstery was performed with PSai / 3-MP-BSA (1.5 mg mL "1 in upholstery buffer, 100 ⁇ -well " 1 ) and the samples or standard solutions PSau7 (from 3350 nM to 0 nM in PBST-D, 90 well "1 ) previously pre-incubated with As291 (1/500 diluted in PBT, 10 well " 1 ).
  • Table 3 ELISA parameters developed based on microplate, using different analytes ⁇ PSau5, PSau7 and PG) and different conditions (PBT and PBST-D).
  • aEI PG molecular weight is not known.
  • the tests were performed using three replication wells under the conditions shown in the table.
  • PBT indicates that the immunoassay protocol was used for non-deglycosylated samples
  • PBST-D indicates that the assay be performed under the conditions of deglycosylated samples.
  • the values shown are the average and standard deviation of the calibration curve parameters obtained on two different days.
  • c The values shown are the average and standard deviation of the calibration curve parameters obtained on three different days.
  • a multiplication factor of 2.5 has been applied to the IC 50 and LOD values corresponding to the deglycosylation treatment.
  • e The values are expressed in nM.
  • f The values are expressed in nmoles of PSau7Kg "1 BAL. 9
  • the values are expressed in nmoles of PSau7Kg " 1 BAS.
  • PSau5 contains the DAIa-DAla sequence of the bacterial wall peptidoglycan of S. aureus
  • PSau7 contains a single residue DAIa.
  • carboxy and amino terminal residues were amidated (-CONH 2 and CH 3 CONH-, respectively). Only in the case of the second DAIa residue of PSau5 the carboxy terminal group was released.
  • the immunization haptens PSauQ and PSau8 were designed to mimic and maximize recognition of these epitopes by placing an LCys residue at the amino terminus, next to one of the LAIa residues that are linked to PG MurNAc residues.
  • Two other peptide haptens (PSau3 and PSau4), different from immunization haptens, were designed and synthesized by introducing slight modifications with respect to the PSaub peptide epitope, to be used as competitors and to improve the detection capacity of the assay.
  • PSau2> is very similar to the immunization hapten PSau6 except for the DGIn residue that replaces D-YGIU-N H 2 , which is present in the PG structure and in PSau6.
  • DGIn forms a normal amide bond with the neighboring amino acid through the ⁇ -COOH group, unlike D-YGIU-N H 2 of PSau6, which is linked through of the ⁇ -COOH group, as in the actual structure of the S. aureus PG.
  • PSauA also has this modification, but in addition, the Cys residue is located on the opposite side leaving the DAIa-DAla terminal more accessible for antibody recognition.
  • parameters such as pH (5.5 to 9.5), ionic strength (1 , 5 to 52.2 mS cm “1 ), the percent Tween 20 (0-0.1%) of the assay buffer as other parameters such as the length of the competitive stage (10-60 min) or the introduction of a preincubation phase (0-60 min) of the analyte with the antiserum
  • the test is stable between pH values of 5.5 and 8.5, low ionic strength values improve
  • the detectability of the assay and the effect of Tween20 does not significantly affect the assay ( Figure 2A, 2B and 2C).
  • the epitopes of the selected peptide were recognized to a degree comparable with similar IC 50 values of about 0.7 nM (0.8 ng ml_ " 1 ) PSau7 was chosen to calibrate the assay, expressing the results as equivalent immunoreactivity of PSau7 (equiv IR PSau7)
  • the assay could be used to characterize the different batches of PG as a function of its immunochemical response in the test, expressed as IR equivs of PSau7.
  • the objective was to develop a diagnostic immunochemical tool capable of detecting infections caused by S. aureus without the need for pre-enrichment of the sample.
  • the bacterial cell wall cleavage methods have been extensively studied to elucidate the PG structure or even to develop new antimicrobial agents but have not described to increase assay detectability.
  • the method of deglycosylation used was based on chemical hydrolysis with TFMSA, although other methods described in the literature could have been used. TFMSA is not dependent on mutations, the amide bond of the peptides is unaffected and only breaks the bonds of the glycan fractions.
  • the potential for non-specific interference caused by this treatment in the PSai / 3- ELISA was evaluated.
  • the deglycosylation treatment was performed as described in the experimental section but in the absence of matrix, and the final solution was used to prepare the calibration curves.
  • the signal was completely inhibited in this medium.
  • the extract had to be diluted at least 80 times in order to have a usable assay, substantially decreasing the detectability.
  • the samples of E. coli and P. aeruginosa show no response, either before or after TFMSA treatment, in c oncentrations of up to 10 8 and 10 7 CFU mL "1 ( Figure 5) which demonstrates the specificity of the immunochemical protocol presented here.
  • BAL and BAS samples doped with S. aureus were prepared at different concentrations. Samples were treated as before and after they were titrated with the ELISA PSau7 PBST-D reference curve. As can be seen in Figure 6, the immunochemical response of the BAL and BAS samples was very similar to that obtained from the S. aureus samples doped in PBST, except for the fact that the detectability achieved was lower ( 10 5 BAS and 10 6 for BAL), but it is still useful for diagnosis, taking into account that the ELISA described does not require cell pre-enrichment culture steps to achieve this detectability.
  • cystic fibrosis CF
  • bronchitis and pneumonia of patients have often reported bacterial loads around 10 6 CFU mL. ”1
  • Corne et al. J Clin Microbiol 2005, 43, 3491
  • S. aureus is one of the first pathogenic agents that colonize the airways and bacterial loads reach up to 10 8 CFU mL "1 in the sputum (J Clin Microbiol 2002, 40, 2300).
  • a detection method based on a competitive ELISA is presented for the first time, using antibodies specific for the S. aureus PG, capable of detecting this microorganism at levels of 10 4 CFU mL "1 , without pre-enrichment in culture Cellular State-of-the-art documents that addressed the development of antibodies against S. aureus PG do not show sufficient results to demonstrate the possibility of detecting bacteria in clinical samples, and often only show data related to the detectability of preparations of PG or cell wall.
  • the strategy used in this document to generate antibodies against specific synthetic epitopes of the PG has allowed the creation of an immunochemical assay with better detectability and higher sampling performance capabilities, significantly reducing the test time and the volume of Sample needed.
  • the ELISA described here detects S. aureus directly (without cell culture or pre-enrichment) in clinical samples at cell densities, which can be useful for diagnosis in almost 2.5 hours (1 h of sample treatment and 1.5 h for the test).
  • the test is easy to perform, it has capacity for high sample analysis and needs very small sample volumes.

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Abstract

La presente invención se refiere a compuestos derivados de la pared bacteriana de Staphylococcus aureus para su uso como haptenos,a sus aplicacionesy métodos para la detección de S. aureus, así como a losanticuerpos y antisueros generados parasu utilización.

Description

Péptidos derivados del peptidoglicano de 5. aureus y su uso como haptenos en un método de
detección.
DESCRIPCIÓN
La presente invención se refiere a compuestos derivados de la pared bacteriana de Staphylococcus aureus para su uso como haptenos. Además la invención se refiere a los haptenos y sus conjugados útiles para la obtención de anticuerpos y/o para detectar dicha bacteria. Por lo tanto, la presente invención puede englobarse en el campo del desarrollo de nuevas tecnologías para la medicina clínica.
ESTADO DE LA TÉCNICA
Staphylococcus aureus es un patógeno de gran virulencia y uno de los principales microorganismos responsables de las enfermedades infecciosas en los países desarrollados. S. aureus provoca enfermedades nosocomiales, infecciones del tracto respiratorio, endocarditis e infecciones de los tejidos blandos. Cuando la infección pasa al torrente sanguíneo el tiempo de identificación del patógeno es un factor clave para actuar y garantizar la supervivencia del paciente. La erradicación de las enfermedades provocadas por este patógeno se ve dificultada por la multirresistencia a antibióticos que presenta y al mismo tiempo por la falta de técnicas rápidas y específicas para identificar el causante de la enfermedad.
Además, S. aureus también supone un problema en seguridad alimentaria ya que dicho patógeno puede estar presente en la flora de un individuo sano y cuando no se toman las medidas de higiene necesarias puede ser un contaminante alimenticio y una fuente directa de infección para el ser humano.
En la actualidad el cultivo celular es la técnica de referencia para la identificación del microorganismos patógenos pero dicha técnica presenta la desventaja de que el tiempo de espera oscila entre 24-72 horas (J Clin Microbiol 2012, 50, 195), que es demasiado elevado cuando la vida del paciente está en juego. Por otra parte, también se han descrito métodos de detección de paredes de S. aureus mediante ensayos inmunoquímicos utilizando anticuerpos desarrollados a partir de la inmunización de formas semisintéticas del peptidoglicano de S. aureus. El peptidoglicano (PG) es una macromolécula no cristalina, lo cual dificulta la determinación de la estructura tridimensional a alta resolución, aun así, diversos experimentos de resonancia magnética nuclear (RMN), cromatografía líquida de alta resolución y espectrometría de masas(HPLC-MS) y de microscopía han elucidado gran parte de dicha estructura. En general, el PG consiste en unidades repetidas de unidades de disacárido, /V-acetilglucosamina (GIcNAc) y ácido /V-acetil-murámico (MurNAc) entrelazadas por cadenas peptídicas que alternan aminoácidos D- y L-. El PG de S. aureus presenta un péptido tallo ([Ala-DGIu(&1)-NH2][(&1)-Lys-DAIa-DAIa]) entrelazado con un puente pentaglicil (Gly)5 que se une por un lado a través del grupo ε-ΝΗ2 de la Lys situada en la tercera posición de un péptido tallo y por el otro a través del grupo carbonilo del grupo DAla situado en la cuarta posición de otro péptido tallo (J. Amer. Chem. Soc2009, 131, 7023-7030; J.Bacteriol.2004, 186, 5978).
Algunos autores en el pasado se han ocupado de la producción de anticuerpos frente a secuencias peptídicas particulares del PG de S. aureus. En 1977, SeidI y Schieifer (European J fí/oc 7em1977, 74 (2), 353) desarrollaron un test de aglutinación de látex con anticuerpos producidos contra un péptido sintético de cinco glicinas conjugado a seroalbúmina humana y Wergel et al. (JlmmunolMeth 287 , 104, 57) desarrollaron un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) en formato sandwich con anticuerpos monoclonales de tipo IgM producidos a partir de la inmunización del oligopéptido (Gly)5 en su forma libre. Más recientemente, Sandhu et al. (Analyst20^2, 137 (5), 1130) reportaron la preparación de anticuerpos contra un precursor semisintético del peptidoglicano usado como inmunógeno, el cual contiene una parte peptídica que contiene la cadena de pentaglicinas más el ácido N-acetilmurámico unido a seroalbúmina bovina (BSA). Todos estos trabajos citados han demostrado la posibilidad de generar anticuerpos contra el PG de S. aureus pero ninguno proporciona datos respecto a la detectabilidad de la bacteria en términos de unidades formadoras de colonias (UFC) y tampoco muestra el rendimiento en muestras clínicas. Por lo tanto, se hace necesario un método donde se demuestre la capacidad de dicha detección en infecciones producidas por S. aureus con tiempos de análisis bajos y con buena sensibilidad.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En la presente invención se describen haptenos derivados del peptidoglicano de la pared bacteriana de S. aureus útiles para la generación de anticuerpos frente a dicha bacteria y útiles para la detección de la misma. Se describe también un método de detección de S. aureus mediante anticuerpos generados por inoculación de los inmunogenos obtenidos a partir de la bioconjugacion de los haptenos de la presente invención a una proteína; dicho método disminuye significativamente el tiempo de análisis y es de fácil implementación.
En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula general (I):
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(l)
donde:
se selecciona de entre OH y NHR'; donde R' se selecciona de entre H o alquilo n es un número entero seleccionado de entre 0 y 1 ;
m es un número entero seleccionado de entre 0 y 7;
X! y X2 se seleccionan, cada uno independientemente, de entre D-Glu, D-GIn, D-γ- Glu y D-y-GIn;
Z y Z' se seleccionan, cada uno independientemente, de entre un aminoácido, que puede ser L o D, seleccionado de la lista que consiste en Gly (glicina), Ala (alanina), Leu (leucina), lie (isoleucina) o Val (valina); p y q son, cada uno independientemente, un número entero seleccionado de entre 0 y 1 ;
Y e Y' se seleccionan, cada uno independientemente, de entre R4, COR4 y Cys (cisteína), opcionalmente la cisteina puede contener un grupo protector de tioles; R2 y R3 se seleccionan, independientemente, de entre H, alquilo (C C4) y CO- alquilo (C C2);
r, s, t ó v son, independientemente, un número entero seleccionado de entre 0 y 1 ; R4 es un alquilo (C C5), sustituido con un grupo -SH, -halógeno, -CECH, -N3 o -COR5;
R5 se selecciona de entre H o OR"; donde R" se selecciona de entre H o alquilo con la condición de que:
si r es 1 , s es 0 y
si s es 1 , r es 0, y
si Y o Y' se selecciona entre R4 o COR4, entonces t ó v, respectivamente, es 0. En adelante nos referiremos a éste como al "compuesto de la invención". En una realización preferida del compuesto de la invención p y q son 0.
En otra realización preferida del compuesto de la invención, m es de 3 a 6 y más preferiblemente m es 5.
En otra realización preferida del compuesto de la invención, n es 0 y/o es NHR' y R' se selecciona de entre H o metilo. En otra realización preferida del compuesto de la invención, n es 1 y/o es OH .
En otra realización preferida del compuesto de la invención, X! y/o X2 son D-GIn o D- Gln.
En otra realización preferida del compuesto de la invención, X! y X2 son iguales. D-Glu o D-ácido glutámico es el grupo:
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D-GIn o D-glutamina es el grupo:
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D-y-Glu o D-y-ácido glutámico o D-iGlu es el grupo:
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D-y-GIn o D-y-glutamina o D-YGIU-N H2 O D-iGIn es el grupo:
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En otra realización preferida del compuesto de la invención Y o Y' es Cys, opcionalmente sustituida por un grupo protector de tioles.
Cuando Y o Y' es Cys, este aminoácido puede estar libre o protegido mediante un grupo protector de tioles, como por ejemplo y sin limitarse a -alquilo(CrC6), -COalquilo(Ci-C3), -CH2Oalquilo(Ci-C3), -COC6H5, -CONHalquilo(C C3),
-COOCH3Ph, preferiblemente el grupo protector de tioles es -COCH3.
En otra realización preferida, t y/o v son 1 , más preferiblemente R2 y/o R3 son COalquilo(CrC2), y más preferiblemente COCH3. Más preferiblemente R2 y R3 son COalquilo(CrC2), y más preferiblemente COCH3.
En otra realización preferida, el compuesto de la invención se selecciona de entre:
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PSau3
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PSau7
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PSau8
Por "alquilo(CrC4)" se refiere, en la presente invención, a cadenas hidrocarbonadas saturadas, lineales o ramificadas, que tienen de 1 a 4 átomos de carbono, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, /'-propilo, n-butilo, tere-butilo o sec-butilo. Preferiblemente el grupo alquilo tiene entre 1 y 2 átomos de carbono o alquilo(CrC2), más preferiblemente es un metilo. Por "alquilo(CrC5) sustituido" se refiere, en la presente invención, a cadenas hidrocarbonadas saturadas, lineales o ramificadas, que tienen de 1 a 5 átomos de carbono, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, /'-propilo, n-butilo, tere-butilo, sec-butilo, pentilo, etc., que se encuentra sustituido por al menos un sustituyente seleccionado de la lista que consiste en-SH, -halógeno, -CECH, -N3,-CHO, -COOH, -COOalquilo(C C4).
Un segundo aspecto de la invención se refiere al uso del compuesto de formula (I) del primer aspecto de la invención como hapteno (en adelante "hapteno de la invención").
El término "hapteno", tal como se emplea en la presente invención, hace referencia a una molécula que por sí sola no es capaz de generar una respuesta inmune en un animal y necesita estar unida a una macromolécula para generar una respuesta inmune. En la presente invención, el hapteno se selecciona de un compuesto de fórmula (I) del primer aspecto de la presente invención.
En una realización preferida, el hapteno se puede seleccionar de la lista que consiste en PSau3, PSau4, PSau6 y PSau8. El término "antígeno" hace referencia a una molécula, tal como un péptido, un hidrato de carbono, un glicolípido, una glicoproteína o una molécula que es reconocida y se une a un anticuerpo. La parte del antígeno que es la diana de la unión del anticuerpo corresponde al determinante antigénico. En el contexto de la presente invención, el antígeno hace referencia a S. aureus, o un analito derivado de S. aureus, es decir, a una parte peptídica de la estructura química del peptidoglicano de la pared bacteriana de S. aureus o a un hapteno de la invención conjugado con una macromolécula.
Un tercer aspecto de la invención se refiere a un conjugado (a partir de ahora conjugado de la invención) que comprende al menos un hapteno seleccionado de un compuesto de fórmula (I) del primer aspecto de la invención (el hapteno de la invención) junto con al menos un componente seleccionado de la lista que consiste en: una macromolécula, tal como una proteína o un fragmento de la misma, un oligonucleótido o un polisacárido; una etiqueta detectable o un soporte, en particular el soporte puede ser un polímero o un material inorgánico. El término "conjugado" hace referencia en la presente invención al complejo formado por la unión covalente de un hapteno seleccionado de un compuesto de fórmula (I) y un segundo componente seleccionado del grupo formado por una macromolécula, tal como una proteína o un fragmento de la misma, un oligonucleótido o un polisacárido; una etiqueta detectable o un soporte, como un polímero o un material inorgánico. En particular hace referencia al complejo hapteno-macromolécula. Métodos para la obtención de conjugados hapteno-macromolécula son conocidos por el experto enla materia. El término "inmunógeno" hace referencia a un conjugado de acuerdo a la invención capaz de generar una respuesta inmune de generación de anticuerpos, es decir, un conjugado formado por un hapteno de la invención, seleccionado de un compuesto de fórmula (I), y un segundo componente que comprende una macromolécula que confiere antigenicidad, siendo dicha macromolécula la responsable del carácter inmunogénico del conjugado.
Las macromoléculas en la presente invención pueden ser proteínas o fragmentos de las mismas, oligonucleótidos o polisacáridos. Las proteínas útiles tienen una masa superior a 10 kDA, preferiblemente superior a 15 kDa. Cuando los conjugados de la invención se utilizan para inmunizar un animal, dichas proteínas deben proceder de una especie animal distinta de la especie que se desea inmunizar. Entre las proteínas útiles se incluyen, sin limitación, seroalbúminas de varias especies, por ejemplo bovina (BSA), de conejo (RSA); hemocianinas de molusco, por ejemplo la hemocianina de cangrejo (HCH) o la hemocianina de lapa (KLH); peroxidasa de rábano (HRP), ovoalbúmina (OVA), conalbúmina (CONA), tiroglobulina y fibrinógeno, así como fragmentos de dichas proteínas que confieren antigenicidad, etc. Preferiblemente la proteína se selecciona de la lista que consiste en hemocianina de cangrejo herradura (HCH), albúmina de suero bovino (BSA), ovoalbúmina (OVA) y, conalbúmina (CONA). Más preferiblemente BSA y HCH.
En los conjugados de la invención entre un hapteno y una proteína, las proteínas se unen al hapteno de forma covalente por medio de los aminoácidos accesibles en su superficie, preferiblemente aquellos aminoácidos con cadenas laterales de tipo nucleófilo. El aminoácido reactivo de las proteínas se selecciona de la lista que consiste en, pero sin limitarse a, cisteína, serina, tirosina y lisina; preferiblemente es lisina. Los procedimientos para lograr la conjugación de haptenos a otras moléculas portadoras dependen del grupo funcional presente en la molécula de hapteno en cuestión. También hay que tener en cuenta la estabilidad y la solubilidad del hapteno.
El término "oligonucleótido" se refiere a un ácido nucleico de al menos 4, preferiblemente al menos 10, preferiblemente al menos 15, preferiblemente no más de 100 nucleótidos. Se contemplan tanto oligonucleótidos formados por nucleótidos convencionales unidos por enlaces fosfodiéster convencionales como variantes de los mismos que incluyen modificaciones en los restos de purina o pirimidina y modificaciones en los restos de ribosa o desoxirribosa.
En una realización particular del conjugado de la invención, el hapteno y la macromolécula están unidos mediante un agente de entrecruzamiento.
En una realización preferida de la presente invención, el hapteno de la invención, seleccionado de un compuesto de fórmula (I), se conjuga a la macromolécula a través del grupo Y o Y'.
En una realización particular el conjugado de la invención está formado por el hapteno y una proteína.
Cuando el grupo Y o Y' del hapteno es una cisteína, el grupo -SH se conjuga a proteínas con maleimidas, o bien por activación de las proteínas con haloacetilos (tales como yodoacetilo).
Cuando el grupo Y o Y' del hapteno contiene ácido carboxílico (-COOH), para la conjugación puede utilizarse, entre otros, el método del anhídrido mixto, el método de la carbodiimida (CDI) o el método del éster-/V-hidroxisuccinimida (NHS) (este último también conocido como método del éster activo). Cuando el grupo Y o Y' del hapteno contiene un aldehido (-CHO), este puede ser transformado en grupo carboxilo mediante la formación de 0-(carboximetil)oximas. La reacción se efectúa tratando el hapteno con 0-(carboximetil)hidroxilamina. La reacción del ácido carboxílico formado con la proteína se continúa por uno de los métodos antes mencionados. Los haptenos que presentan grupos formilo también pueden ser acoplados directamente a través de la formación de las bases de Schiff, que son transformadas a aminas por reducción con borohidruro de sodio. Cuando el grupo Y o Y' contiene un halógeno la conjugación se realiza sobre una proteína o péptido previamente modificado de forma que tenga grupos tiol reactivos.
Todos estos métodos de conjugación son bien conocidos del estado de la técnica y se describen de modo resumido en Guerra et al. 2003 (Guerra M., Morris H. 2003. Revista Cubana de Química, vol. XV, n° 2). Dichos métodos se muestran aquí a título orientativo y no en sentido limitativo, ya que pueden emplearse otros métodos de conjugación conocidos por el experto en la materia.
En otra realización particular, el hapteno de la invención, seleccionado de un compuesto de fórmula (I), puede estar unido a un agente de mareaje, a modo de marcador para su detección. En una realización particular alternativa, el hapteno puede estar unido a un soporte, como por ejemplo un polímero o a un material inorgánico.
El término "soporte", según se usa en la presente invención, se refiere a cualquier material sólido al que los componentes de la invención, en particularlos anticuerpos, los haptenos o los conjugados de la invención, se encuentran unidos físicamente, quedando así inmovilizados. Se puede emplear cualquiera de una amplia variedad de soportes sólidos en los inmunoensayos de la presente invención. Los materiales adecuados para el soporte sólido son sintéticos como poliestireno, cloruro de polivinilo, poliamida u otros polímeros sintéticos, polímeros naturales tales como celulosa, así como polímeros naturales derivados tales como acetato de celulosa o nitrocelulosa, y vidrio, especialmente fibras de vidrio. El soporte puede tomar la forma de esferas, bastones, tubos, y placas de microensayo o microtitulación. Las estructuras similares a láminas tales como tiras de papel, placas pequeñas y membranas también son adecuadas. La superficie de los soportes puede ser permeable e impermeable para soluciones acuosas. Materiales sólidos inorgánicos adicionales adecuados para su uso en la presente invención incluyen, sin limitación, silicona, cristal, cuarzo, cerámica, metales y sus óxidos, silicio, silicatos, siliciuros, nitruros, carburo de silicio amorfo así como cualquier otro material adecuado para microfabricación o microlitografía. Soportes sólidos orgánicos adicionales adecuados para su uso en la presente invención incluyen, sin limitación polímeros como poliimida, acrilato, polimetilmetacrilato, poliestireno o nitrocelulosa. El término "etiqueta detectable" o "agente de mareaje" hace referencia a una etiqueta molecular quepermite la detección, localización y/o identificación de la molécula a la que está unido, mediante procedimientos y equipamiento adecuados para la detección, bien mediantemedios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos o químicos. Ejemplosde etiquetas detectables para el mareaje de compuestos incluyen, aunque no se limitan aisótopos radiactivos, sustratos enzimáticos, co-factores, ligandos, agentes quimioluminiscentes, fluoróforos, enzimas y combinaciones de éstos. Métodos para el mareaje y guía para la elección de mareajes adecuados para diferentes propósitos son conocidos por el experto en la materia.
En otra realización particular de cualquiera de las anteriores, el conjugadode la invención tiene carácter inmunógeno, es decir, induce la formación de anticuerpos.
Así, un cuarto aspecto de la invención se refiere al uso de un conjugado del tercer aspecto de la invención que comprende un hapteno de la invención, seleccionado de un compuesto de fórmula general (I), y una macromolécula, que confiere antigenicidad para la obtención de anticuerpos.
El término "anticuerpo", tal como aquí se utiliza en la presente invención, se refiere a moléculas de inmunoglobulinas y porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulinas, es decir, moléculas que contienen un sitio de fijación de antígeno que se une específicamente (inmunorreacciona) con un antígeno, tal como, por ejemplo, una proteína. Tal y como es conocido por el experto en la materia, hay 5 isotipos o clases principales de inmunoglobulinas: inmunoglobulina M (IgM), inmunoglobulina D (IgD), inmunoglobulina G (IgG), inmunoglobulina A (IgA) e inmunoglobulina E (IgE). El término "anticuerpo" comprende anticuerpos monoclonales, o anticuerpos policlonales, intactos, o fragmentos de ellos; e incluye anticuerpos humanos, humanizados y de origen no humano. En el contexto de esta invención el término anticuerpo se refiere a la inmunoglobulina que el animal o una célula híbrida ha sintetizado de forma específica contra elinmunógenode la invención.
Un quinto aspecto de la invención se refiere a un anticuerpo (a partir de ahora "anticuerpo de la invención") obtenido mediante la inmunización con el conjugado de la invención, este anticuerpo reconoce específicamente al hapteno del conjugado del tercer aspecto de la presente invención, a S. aureus y/o un analito derivado de S. aureus. Preferiblemente el anticuerpo es monoclonal o policlonal. En una realización preferida, el anticuerpo de la invención está unido a un agente de mareaje que permita su localización y/o identificación, mediante medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos o químicos. Los "anticuerpos monoclonales" son poblaciones homogéneas de anticuerpos idénticos, producidos por una célula híbrida producto de la fusión de un clon de linfocitos B descendiente de una sola y única célula madre y una célula plasmática tumoral, que están dirigidos contra un único sitio o determinante antigénico. El procedimiento de obtención de los anticuerpos monoclonales de la invención puede realizarse según métodos convencionales, conocidos en el estado de la técnica. Básicamente, el método consiste en inmunizar un animal con un conjugado según la invención que comprende un hapteno, seleccionado de un compuesto de fórmula (I), y una macromolécula que confiere inmunogenicidad, y posteriormente extraer células del bazo del animal inmunizado, que se fusionan con células de mieloma en presencia de un inductor de la fusión, tal como PEG-1500 por procedimientos estándar (Harlow D y Lañe D. Antibodies: a laboratory manual. 1988. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor New York). Los hibridomas se seleccionan y se subclonan por dilución. Los clones aptos para su expansión se constituyen en una línea celular de hibridoma. A continuación, dicha línea celular de hibridoma se cultiva en un medio de cultivo adecuado para que las células de hibridoma produzcan anticuerpos y los secreten al medio, y se recoge posteriormente el sobrenadante del medio de cultivo que contiene los anticuerpos monoclonales producidos. Opcionalmente, dichos anticuerpos pueden purificarse por medios convencionales, tales como cromatografía de afinidad, proteína A-Sepharosa, cromatografía con hidroxiapatito, electroforesis en gel o diálisis. Por lo tanto, en una realización de la invención la obtención de anticuerpos comprende la administración de un conjugado de la invención y la recolección de células tisulares de dicho animal capaces de producir dichos anticuerpos. Los "anticuerpos policlonales" son poblaciones heterogéneas de anticuerpos que reconocen varios epítopos de un mismo antígeno, es decir frente a diferentes determinantes antigénicos. Para la obtención de anticuerpos policlonales contra un hapteno de la invención, seleccionado de un compuesto de fórmula (I), se inmuniza un animal no humano con un conjugado de la invención según métodos conocidos por el experto en la técnica. Una vez obtenido un título de anticuerpos aceptable, el animal es exanguinado y se recoge el antisuero que contiene los anticuerpos séricos formados por dicho animal.
En una realización preferida el conjugado de la invención utilizado para la producción de anticuerpos es un hapteno de la invención, preferiblemente PSau3, PSau4, PSau6 o PSau8, conjugado con HCH.
Un sexto aspecto de la invención se refiere a un antisuero que comprende el anticuerpo del quinto aspecto de la presente invención.
El término "antisuero" se refiere a un suero obtenido tras la inmunización de un animal con un inmunógeno. El antisuero comprende anticuerpos específicos de dicho inmunógeno generados tras la respuesta inmune producida en el animal. En el contexto de la presente invención, el inmunógeno es el conjugado de la invención y el antisuero comprende anticuerpos específicos generados frente al conjugado de la invención, los anticuerpos de la invención.
Un séptimo aspecto de la invención se refiere al uso del hapteno del segundo aspecto de la invención, seleccionado de un compuesto de fórmula (I), o del conjugado del tercer aspecto de la invención, o del anticuerpo del quinto aspecto de la invención o del antisuero del sexto aspecto de la invención para la detección de S. aureus en una muestra biológica aislada de un sujeto.
Un octavo aspecto de la invención se refiere al uso del hapteno del segundo aspecto de la invención, seleccionado de un compuesto de fórmula (I), o del conjugado del tercer aspecto de la invención, o del anticuerpo del quinto aspecto de la invención o del antisuero del sexto aspecto de la invención para la detección de S. aureus en una muestra alimentaria. Un noveno aspecto de la presente invención se refiere a un método para detectar S. aureus o un analito derivado de S. aureus en una muestra (a partir de ahora "método de la invención") que comprende la utilización de un anticuerpo del quinto aspecto de la invención o de un fragmento del mismo con capacidad de unión al antígeno o de un antisuero del sexto aspecto de la invención que comprende el anticuerpo anterior y la detección de la unión de dicho anticuerpo a S. aureus. Preferiblemente además comprende el uso del conjugado de la invención.
El término "muestra", tal como se emplea en la presente invención, hace referencia a la muestra a analizar por el método de la invención, susceptible de contener el analito a detectar, en esta invención se entiende por analito a S. aureus o un analito derivado de esta bacteria. Cualquier tipo de muestra puede analizarse según el método de la invención. Así, se contempla el análisis de muestras biológicas aisladas tanto de procedencia animal como humana, ya sea con finalidad clínica (por ejemplo, para detectar infecciones provocadas por la presencia de S. aureus y establecer un método terapéutico para combatirla) o en el ámbito de la seguridad alimentaria para el análisis de contaminantes en muestras alimentarias o seguridad ambiental tales como agua, suelo o superficie, o de muestras procedentes de cultivos celulares. Por "analito derivado de S. aureus" se entiende en esta invención un compuesto químico que mantiene una parte peptídica de la estructura química del peptidoglicano de la pared bacteriana de S.aureus, que puede ser reconocido específicamente por parte de los anticuerpos de la invención. En una realización preferida el analito derivado del peptidoglicano de S. aureus es un compuesto de fórmula (I), y en una realización más preferida es un compuesto de formula (I) seleccionado entre PSau5 y PSau7. Estos analitos se utilizan como muestra patrón para hacer la recta de calibrado en el ensayo ELISA.
En una realización preferida la muestra biológica puede ser, por ejemplo, sin limitarse, sangre, suero, plasma, saliva, orina, esputo, lavados broncoalveolares (BAL) y broncoaspirados (BAS). En una realización más preferida, la muestra en la que se detecta infecciones provocadas por S. aureus es una muestra de BAL o BAS.
Por tanto, el método de la invención comprende al menos las siguientes etapas: (a) poner en contacto la muestra a analizar con el anticuerpo de la invención o de un fragmento del mismo durante el tiempo necesario para su unión (o incubación),
(b) identificar la formación de los inmunocomplejos formados con dicho anticuerpo y/o medir la cantidad de dichos inmunocomplejos. Adicionalmente, dicho método puede requerir también un conjugado según la invención. Por tanto, en una realización particular, además del anticuerpo de la invención en el paso (a) se utiliza un conjugado; donde dicho conjugado comprende un hapteno de la invención, seleccionado de un compuesto de fórmula (I), y un segundo componente que puede ser una macromolécula, un agente de mareaje detectable o un soporte, como un polímero o un material inorgánico.
El término "método de detección" hace referencia a un método que permite establecer si una muestra determinada comprende o no comprende S. aureus o un analito derivado de S. aureus con una sensibilidad y especificidad adecuadas. Los intervalos típicos desensibilidad de detección pueden estar entre aproximadamente el 20% y aproximadamente el 90% de la señal máxima. La sensibilidad de un método de detección viene dada por la probabilidad de que la detección sea positiva en una muestra que contiene el compuesto que se pretende detectar. La sensibilidad, expresada en tanto por ciento, representa el porcentaje de casos de detección positiva respecto al total de casos en los que el compuesto a detectar está presente. A mayor sensibilidad, mayor número de casos positivos y menor número de falsos negativos. La especificidad de un método de diagnóstico viene dada por la probabilidad de que la detección sea negativa en una muestra que no contiene el compuesto que se pretende detectar. La especificidad, expresada en tanto por ciento, representa el porcentaje de casos de detección negativa respecto al total de casos en los que el compuesto a detectar está ausente. A mayor especificidad, menor es la probabilidad de obtener un falso positivo.
El término "inmunoensayo" o "técnica inmunoquímica de análisis" es un método inmunoquímico de análisis en el que se emplea un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno. El inmunoensayo se caracteriza por el uso de propiedades de unión específicas de un anticuerpo particular para aislar, dirigir y/o cuantificar el antígeno. Los inmunoensayos comprenden, sin limitarse a, técnicas inmunológicas tales como ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), Western- blot, RIA (radioinmunoensayo), EIA competitivo (inmunoensayo de enzima competitivo), DAS-ELISA (Double Antibody Sandwich-ELISA), cromatografía de inmunoafinidad, ensayos de tira o de flujo lateral (lateral-flow immunoassay), inmunoprecipitación, dot-blot, radio inmunoensayo, citometría de flujo, técnicas inmunocitoquímicas e inmunohistoquímicas, técnicas basadas en el uso de biochips de biomarcadores, de biosensores o microarrays que incluyan anticuerpos específicos o ensayos basados en la precipitación coloidal en formatos tales como los "dipsticks". Dentro de otros inmunoensayos también se encuentran los inmunosensores cuyo principio de transducción puede ser óptico, electroquímico, másico o termométrico. Igualmente, también se incluyen los inmunosorbentes o sistemas de extracción por inmunoafinidad, que permiten la extracción selectiva del analito en el seno de una mezcla compleja. Estos sistemas, suelen ser materiales biohíbridos, resultado de la unión estable del anticuerpo a un soporte sólido (polímero, material inorgánico, partículas metálicas, etc.), y que se utilizan para la separación o extracción del analito del resto de componentes de la matriz. Tales formatos pueden ser heterogéneos u homogéneos, secuenciales o simultáneos, competitivos o no competitivos.
En una realización preferida del método de la invención, la detección se realiza mediante una técnica inmunoquímica. Preferiblemente la técnica inmunoquímica es un ensayo tipo ELISA. Son conocidos diferentes tipos de ELISA, tales como el ELISA directo, ELISA indirecto o ELISA tipo sándwich, de carácter competitivo o no competitivo. Son métodos incluidos en la presente invención, aquellos ensayos ELISA en los que el conjugado de la invención está anclado al soporte, así como aquellos ensayos ELISA en los que lo anclado al soporte es el anticuerpo de la invención. Más preferiblemente, el método de detección es un ensayo ELISA competitivo indirecto.
El término "ELISA competitivo indirecto", se refiere a un ensayo en el que se añaden conjuntamente la muestraa analizar, susceptible de contener una concentración determinada de S. aureus o un analito derivado, y un anticuerpo específico según la invención que reconoce S. aureus, donde el analito presente en la muestra competirá por su unión al anticuerpo con un conjugado inmovilizado en un soporte sólido. Cuando la muestra contiene el analito no quedan anticuerpos disponibles para reaccionar con los conjugados inmovilizados y por tanto la reacción producida por el agente de mareaje es poco intensa. Mientras que cuando no hay analito presente en la muestra se unen una gran cantidad de anticuerpos al conjugado inmovilizado en la fase sólida. El término "ELISA competitivo directo" es similar y caracteriza el ensayo en el que se inmoviliza a la placa de ELISA el anticuerpo o antisuero específico y la muestra a analizar se mezcla con un conjugado del hapteno con un agente de mareaje detectable. Como en el caso del ensayo indirecto ambos compuestos compiten por los anticuerpos y la señal resultante del ensayo es inversamente proporcional a la cantidad de analito presente en la muestra. En una realización particular, el ensayo ELISA competitivo indirecto comprende las siguientes etapas:
a. inmovilizar en un soporte sólido un hapteno o el conjugado de la invención, preferiblemente un conjugado que comprende un hapteno de la invención y una macromolécula o un conjugado que comprende el hapteno de la invención y un polímero;
b. eliminar el hapteno o el conjugado no inmovilizado,
c. añadir la muestra a analizar y un primer anticuerpo anti-PSau obtenido al inmunizar un animal con un conjugado de la invención, o bien un antisuero que contiene el anticuerpo, al soporte sólido del apartado (a) e incubar, d. eliminar el primer anticuerpo y la muestra no unidos al conjugado o al hapteno,
e. añadir un segundo anticuerpo conjugado con un agente de mareaje detectable, reconociendo dicho segundo anticuerpo al primer anticuerpo que queda unido en el paso (c), e incubar,
f. eliminar el segundo anticuerpo no unido al primer anticuerpo,
g. identificar y/o medir la cantidad de complejo obtenido según el apartado (e) con una composición que contenga un sustrato indicador cromogénico, fluorogénico y/o quimioluminiscente.
En la primera etapa del método de la invención [etapa (a)] se inmoviliza sobre un soporte sólido un hapteno o un conjugado que comprende un hapteno de la invención y una macromolécula, preferiblemente una proteína, o bien un conjugado que comprende un hapteno de la invención y un polímero. Se puede emplear cualquiera de una amplia variedad de soportes sólidos en las técnicas inmunoquímicas de la presente invención tal y como se han descrito anteriormente. En el contexto de la presente realización el soporte sólido son placas para el análisis de inmunoensayos tipo ELISA. La inmovilización del conjugado en la superficie de un soporte como el plástico de poliestireno está dirigida por la química de la superficie. La capacidad de inmovilización de los conjugados que en este caso actúan como antígenos competidores, depende de muchos factores, tales como el tiempo y la temperatura. La etapa de inmovilización del hapteno o del conjugado puede incluir el bloqueo de los espacios de soporte que no hayan sido ocupados por dichos conjugados. El bloqueo se lleva a cabo mediante proteínas o detergentes, preferiblemente detergentes no iónicos. Con el fin de disminuir las interacciones inespecíficas, el conjugado que se inmoviliza debe comprender una macromolécula diferente a la empleada en el conjugado utilizado como inmunógeno. En una realización preferida el conjugado inmovilizado en esta etapa comprende un hapteno de la invención y una macromolécula, preferiblemente BSA.
Los componentes pueden encontrarse inmovilizados al soporte mediante enlaces covalentes omediante enlaces no covalentes tales como puentes de hidrógeno, interacciones hidrofóbicas o enlaces iónicos. Una revisión general de micromatrices y de soportes adecuados se ha descrito en Shalon et al. (Genome Res 1996, 6, 639). Alternativamente, es posible usar soportes activados mediante grupos epoxi, grupos vinil sulfónico, grupos éster activos, grupos aldehido, grupos carboxilo, grupos amino, grupos tiol, grupos isotiocianato y similares. En el caso de que el soporte se encuentre activado mediante grupos epoxi, estos grupos incluyen 3-glisidoxipropiltrimetoxisilano (GTMS), 2-(3,4 epoxiciclohexil)etiltrimetoxisilano, 3-glisidoxipropilmetildietoxisilano, 3- glisidoxipropil trietoxisilano y similares.
La etapa (b) del método consiste en eliminar el hapteno o el conjugado no inmovilizado. Típicamente, esto se lleva a cabo mediante lavados, habitualmente entre 1 y 10 lavados, preferiblementede 2 a 5 lavados. Los lavados tienen la finalidad de eliminar los conjugados que no se hayan inmovilizado, de forma que todo aquello que sea detectado sea específico y deseado.
La tercera etapa del método de la invención [etapa (c)] consiste en añadir la muestra aanalizar susceptible de contener el analito que se quiere detectar y/o cuantificar, es decir, S. aureus o un analito derivado, y un primer anticuerpo anti-PSau según la invención en el soporte sólido del apartado (a) e incubar. Esta etapa es la etapa competitiva del ensayo.
Por "primer anticuerpo anti-PSau" se entiende un anticuerpo según la invención, generado contra un conjugado que comprende un hapteno de la invención y una macromolécula que confiere antigenicidad, preferiblemente frente a un conjugado que comprende el hapteno de la invención y la proteína HCH. El S. aureus o el analito derivado presente en la muestra a analizar y el hapteno o el conjugado inmovilizado en el soporte sólido de la etapa (a) compiten por la unión del primer anticuerpo anti-PSau. El hapteno del conjugado inmovilizado de la etapa (a) y el hapteno del conjugado utilizado para laobtención de los anticuerpos de la etapa (c) puede o no ser el mismo.
La etapa (c) es la etapa crucial del ensayo. En una realización preferida la etapa (c) tiene una duración comprendida entre 10 minutos y 1 hora, preferiblemente 30 minutos. Este ensayo ha demostrado tolerar un amplio rango de fuerzas iónicas y valores de pH. Los inventores han optimizado el tampón utilizado en la etapa competitiva del ensayo [etapa (c)]. En una realización de la invención, la etapa (c) se realiza en presencia de un tampón que tiene las siguientes características: i. una concentración de detergente no iónico entre 0% y 0, 1 % preferiblemente de 0,05%;
¡i. un pH comprendido entre 5,5 y 9,5, preferiblemente de 7,5;
Ni. una conductividad comprendida entre 1 ,5 y 52,2 mS/cm, preferiblemente de 1 ,5 mS/cm.
La cuarta etapa del método de la invención [etapa (d)] consiste en eliminar el primer anticuerpo no unido al hapteno o al conjugado inmovilizado. Este anticuerpo no unido se habrá unido al analito. Típicamente, esto se realiza mediante lavados en las mismas condiciones que la etapa (b).
La siguiente etapa del método de la invención [etapa (e)] consiste en añadir un segundo anticuerpo conjugado con un agente de mareaje detectable, reconociendo dicho segundo anticuerpo al primer anticuerpo e incubar. Dicho segundo anticuerpo está conjugado con un compuesto capaz de reaccionar con algún sustrato, de forma que se derive de ello una detección cromogénica, fluorogénica y/o quimioluminiscente. Este compuesto puede unirse al anticuerpo directamente o a través de otro componente. El segundo anticuerpo puede ser una inmunoglobulina natural aislada de una especie no humana y diferente de la especie utilizada para producir el primer anticuerpo (por ejemplo, anticuerpo murino anti-lgG, anticuerpo de cabra anti-lgG, anticuerpo de cabra anti-lgM) o se puede producir de forma recombinante o sintética. Puede ser una inmunoglobulina o un fragmento de inmunoglobulina (por ejemplo, FAb, F[Ab]2). Según se desee, se pueden emplear otras moléculas de unión junto con o en lugar de tales segundos anticuerpos. En una realización preferida, el segundo anticuerpo está conjugado con un enzima, preferiblemente peroxidasa, más preferiblemente HRP. Las condiciones adecuadas para que tenga lugar la unión del segundo anticuerpo al primer anticuerpo son conocidas por los expertos en la materia. A continuación tiene lugar la etapa (f) que consiste en eliminar el segundo anticuerpo nounido al primer anticuerpo. Típicamente, esto se efectúa mediante un lavado en las mismas condiciones que en las etapas (b) y (d). Finalmente, la última etapa (g) consiste en la identificación y/o medir la cantidad del complejo obtenido según el apartado (e) con una composición que contenga un sustrato indicador cromogénico, fluorogénico y/o quimioluminiscente. Un sustrato indicador es una sustancia capaz de reaccionar con el agente de mareaje del segundo anticuerpo dando como resultado un compuesto cromóforo, fluorescente o quimioluminiscente que puede detectarse por métodos conocidos en el estado de la técnica. Sustratos indicadores adecuados para llevar a cabo la presente invención son conocidos por el experto en la materia y accesibles a partir de diversas fuentes comerciales. Preferiblemente, el sustrato indicador es cromogénico, como por ejemplo la 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB), el ácidoazino-bis(3-etilbenzotiazolina 6- sulfónico) o la fenilendiamina, sin limitación de utilizar otros sustratos como marcadores químicos (por ejemplo, marcadores de oro coloidal, bolas de látex). Cuando se emplean sustratos cromogénicos, la presencia de S. aureus o un analito derivado en la muestra se evidencia por la aparición de un color cuya intensidad es inversamente proporcional al número de moléculas de analito unidas al primer anticuerpo anti-PSau añadido en la etapa (c) y su cuantificación puede llevarse a cabo, por ejemplo, por medio de espectrofotometría. Si se emplea un sustrato fluorogénico la detección y cuantificación se realiza por medio de fluorimetría, y si el sustrato es quimioluminiscente, la señal se puede cuantificar por medio de un luminómetro. En una realización particular de la invención, el marcador enzimático es peroxidasa de rábano (HRP), el sustrato es cromogénico y la reacción es enzimática. En este caso, la reacción es inhibida pasado un tiempo desde que se añade el sustrato y para ello se cambian las condiciones óptimas de funcionamiento de la enzima que se está utilizando. El método puede comprender además un recta de calibrado preparada con concentraciones conocidas de analitos derivados de S. aureus (entre ellos se puede utilizar PSau5 y/o PSau7) que permite cuantificarla concentración de S. aureus detectada en una muestra. Un décimo aspecto de la presente invención se refiere a un kit o dispositivo para la detección de S. aureus o un analito derivado en una muestra que comprende al menos un hapteno de la invención, un conjugado del tercer aspecto de la invención, un anticuerpo del quinto aspecto de la invención o un antisuero del sexto aspecto de la invención, o combinaciones de los mismos. Preferiblemente el hapteno, el conjugado o el anticuerpo están inmovilizados sobre un soporte sólido. Aún más preferiblemente el kit comprende además un anticuerpo contra los anticuerpos anti-PSau según la invención. Un décimo aspecto de la presente invención se refiere al uso del kit o dispositivo del décimo aspecto de la invención para la detección de S. aureus o un analito derivado en una muestra biológica o en una muestra alimentaria.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
FIG. 1 Curvas de calibración normalizadas para el ELISA PSa¿v3-MP-BSA/As291. 1A: Curva de calibración obtenida con el PG de S. aureus comercial en PBT.1 B:Curvas de calibración de los epítopos peptídicos PSau5 y PSau7 en PBT, de PSau7 en PBST-D, el tampón del ensayo para muestras desglicosiladas y de muestras de BAL y BAS desglicosiladas. Medidas de N=2 o 3 días, donde cada día la medida está realizada por triplicado en tres pocilios. FIG. 2 Efectos de los diferentes parámetros físico-químicos del inmunoensayo PSau3- MP-BSA/As291. Los experimentos se realizaron usando estándares de PG en PBST. 2A: Efecto del pH del tampón del ensayo; 2B: Efecto de la fuerza iónica del tampón del ensayo; 3C: Efecto porcentaje de Tween 20 en el tampón del ensayo; 2D: Efecto del tiempo de preincubación entre el anticuerpo y el analito; 2E: Efecto del tiempo de la etapa de competencia. Los resultados se obtuvieron de la calibración de las curvas de calibrado realizadas en las diferentes condiciones mostradas. Las curvas de calibración se realizaron por triplicado en los pocilios de la placa por cada una de las concentraciones. Los valores de IC50 están expresados en μg mL"1. Leyenda: ■ Amax;
FIG. 3 Evaluación del efecto matriz del extracto de desglicosilación en el ELISA PSat/3-MP-BSA/As291.
FIG.4 Inmunoequivalentes de PSau7 medidos antes y despuésdel tratamiento de desglicosilación de PG comercial preparado a distintas concentraciones.
FIG.5 Respuesta inmunoquímica de S. aureus CECT 5190 respecto a P. aeruginosa CECT 1 10 y E. coli K12 CECT 433 antes y después del tratamiento de desglicosilación. Todas las suspensiones se prepararon a una concentración de 107 UFC mL"1.
FIG 6 Muestras de S. ai/rei/sCECT5190 dopadas a diferentes densidades en PBS, BAL y BAS. *lndica el límite de detección de las muestras desglicosiladas en PBS. EJEMPLOS
A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la efectividad del producto de la invención. Los compuestos de fórmula (I) pueden ser preparados siguiendo distintos métodos conocidos para cualquier persona experta en el campo de la síntesis orgánica, en particular por los procedimientos generales que se presentan en los esquemas siguientes. Los materiales de partida para los métodos preparativos están disponibles comercialmente o bien se pueden preparar mediante métodos descritos en la literatura.
Material y métodos: A. QUÍMICA Métodos generales e instrumentación. Para la síntesis de los péptidos PSau3- PSau8. El crudo de los péptidos se purificaron utilizando un método semipreparativo RP-HPLC Water 2487 y detector de doble longitud de onda XBridge BEH 130 y columna C18, 5 μηι, 10x100 mm con una velocidad de flujo de 16 ml_ min"1 en un gradiente de 0-50 durante 10 min, eluyentes agua con 1 % de TFA y MeCN con TFA al 1 %.
Síntesis de los péptidos: Los péptidos PSau3, PSau4, PSau5, PSauQ, PSau7 y PSau8 se sintetizaron manualmente en jeringas de polipropileno equipadas con discos porosos de polietileno usando el soporte polimérico adecuado en cada caso. PSau3, PSau4, PSau5 y PSau6 se sintetizaron en 2-cloro resina de tritilo (2-CTC, 600 mg; 1 mmol g"1) y resina H-Rink Amide ChemMatrix® (600 mg, 0,53 mmol g"1) se empleó para la síntesis de PSau7 y PSau8. Los disolventes y los reactivos solubles se eliminaron por succión. Los péptidos PSau se sintetizaron usando una estrategia Fmoc/tBu/Alloc, usando en todos los casos Fmoc-L-Lys(Alloc)-OH para la L-Lys en la tercera posición del primer péptido tallo y Fmoc-L-Lys(Boc) para otraL-Lyslocalizada en el segundo péptido tallo. Fmoc- DGIu-NH2 se usó para PSau5, PSau6, PSau7 y PSau8 y Fmoc-DGIn(Trt)-OH para PSai/3, PSai/4.Fmoc-LCys(Trt) se empleó para incorporar el LCys en estos cuatro péptidos.
Para PSau3, PSau4, PSau5 y PSau6, previamente a la introducción del primer aminoácido a la resina 2-CTC se lavó con DMF (3 x 5 mL x 1 min) y CH2CI2 (3 x 5 mL x 1 min). Fmoc-DAIa-OH (1 equiv.) y DIEA(10 equiv.) en CH2CI2 se añadió a la resina, y la mezcla se agitó durante 55 min a 25°C. La resina se bloqueó añadiendo MeOH durante 10 min a 25°C, después se lavó con DMF (3 x 5 mL x 1 mL) y CH2CI2 (3 x 5 mL x 1 min). Para PSau7 y PSau8 la introducción del primer aminoácido (DAIa) se logró usando condiciones de bloqueo estándares.
En todos los péptidos PSau, la secuencia del primer péptido tallo se sintetizó y se acetiló en la posición N-terminal. Después, el grupo Alloc se eliminó y los aminoácidos necesarios se introdujeron para sintetizar el puente pentaglicil y el segundo péptido tallo. Finalmente, el grupo Fmoc se eliminó de la posición /V-terminal del segundo péptido tallo y de la amina acetilada. Las reacciones de acoplamiento se realizaron con el correspondiente Fmoc-aminoácido (3 equiv.) y DIC (3 equiv.) en DMF durante 1 h. El grupo Fmoc se eliminó por tratamiento con una mezcla de piperidina-DMF (1 :4 v/v; 2 x 5 min). El ensayo colorimétrico de Kaiser fue utilizado para la detección de la incorporación de los aminoácidos. Cuando fue necesario el reacoplamiento se realizó con HBTU (3 equiv), HOAT (3 equiv) y DIEA (4 equiv) en DMF durante 40 min.
Las acetilaciones se llevaron a cabo con anhídrido acético (10 equiv), DIEA (10 equiv) en DCM durante 15 min. El grupo Alloc se eliminó con fenilsilano (10 equiv), tetraquistrifenilfosfina Pd cero (0, 1 equiv) en DCM (3 x 15 min). La escisión de los péptidos de la resina se llevó a cabo con una mezcla de TFA-H20-TIS (95: 2,5: 2,5) durante 1 hora. Después de este tiempo el TFA se eliminó por evaporación y los péptidos se precipitaron por adición de éter dietílico anhidro frío, se centrifugaron y el sobrenadante se descartó. El solidóse disolvió en H20-MeCN (1 : 1) y se liofilizó. Los péptidos se caracterizaron mediante HPLC y HPLC-MS.
El crudo de los péptidos PSau se purificó por cromatografía semipreparativa HPLC de fase reversa usando un gradiente linear de 0% B a 50% B en 10 min, a un flujo de 16 mL min"1 y detección por UV a 220 nm. El sistema de elución fue A:H20:TFA (99:1 , v/v) y B: CH3CN (99: 1), v/v).
PSau3. 62 mg, 98,3% pureza (determinado por HPLC a 220 nm). Masa teórica para C54H87N19Oi8S: 1358,48; encontrado por LC-MS(ES): 1359,0 [M+H]+
PSau4. 62 mg, 99,9% pureza (determinado por HPLC a 220 nm). Masa teórica para C54H87N19Oi8S: 1358,48; encontrado por LC-MS(ES): 1359,0 [M+H]+
PSau5. 35 mg, 96,2% pureza (determinado por HPLC a 220 nm). Masa teórica para C54H87N19Oi8S: 1358,48; encontrado porLC-MS(ES): 1359,0 [M+H]+ PSau6. 5 mg, 99,9% pureza (determinado por HPLC a 220 nm). Masa teórica para C54H87N19Oi8S: 1358,48; encontrado porLC-MS(ES): 1360,18 [M+H]+y 644,77 [M+2H]2+
PSau7. 38 mg; 99,9% pureza (determinado por HPLC a 220 nm). Masa teórica para C48H82N18O17: 1 183,28; encontrado por LC-MS(ES): 1184,65 [M+H]+y 593,04 [M+2H]2+ PSau8. 47 mg, 99,9% pureza (determinado por HPLC a 220 nm). Masa teórica para C5i H87N190i8S: 1286,42; encontrado por LC-MS(ES): 1287,69 [M+H]+y 644,5 [M+2H]2+
B. INMUNOQUIMICA
Métodos generales e Instrumentación. El MALDI-TOF/TOF-MS (espectrómetro de masas de tiempo de vuelo de desorción láser asistida por matriz de ionización) utilizado para caracterizar los conjugados de proteína fue AUTOFLEX (Bruker- Daltonics, Bremen, Alemania) equipado con láser SmartBeam que funciona a 200 Hz. El pH y la conductividad de todos los tampones y soluciones se midieron con un medidor de pH pH 540 GLP y un conductímetro LF 340, respectivamente (WTW, Weilheim, Alemania). La purificación de proteínas se realizó mediante diálisis utilizando membrana tubular de celulosa regenerada con una línea de corte de un peso molecular de 12.000-14.000 (Cellu Sep de la serie T membranas; Membrane filtration productes Inc., Seguin, EE.UU.) o mediante cromatografía de exclusión molecular (HiTrap® Sephadex® G-25 columna superfina; Amersham Biosciences). Placas de microtitulación de poliestireno se adquirieron de Nunc (Maxisorp, Roskilde, Dinamarca). Las etapas de lavado se llevaron a cabo usando un lavador de microplacas ELx405 HT (BioTek, Vinooski, Vermont, EE.UU.). Las absorbancias se leyeron usando un SpectamaxPlus (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) en un solo modo de longitud de onda de 450 nm. Las curvas en formato competitivo fueron analizadas con una ecuación logística de cuatro parámetros utilizando el software SoftmaxPro v2.6 (Molecular Devices), y GraphPad Prism® (GraphPad Sofware Inc., San Diego, CA). La curva estándar se ajustó a una ecuación logística de cuatro parámetros de acuerdo con la fórmula Y = [(AB) / 1 - (x / C) Λ D] + B, donde A es la señal máxima, B es el mínimo de la señal, C es la que produce el 50% de la señal máxima concentración, y D es la pendiente en el punto de inflexión de la curva.
Tampones. El PBS es tampón fosfato 10 mM en una solución de NaCI 140 mM, y el pH es 7,5. El PBST es PBS con 0,05% de Tween 20. PBT es PBST sin NaCI. El PBST-D es una solución de extracción en fase acuosa en blanco resultante del tratamiento desglicosilación química, realizado como se describe a continuación, se diluyó 1/3.5 con PBT. El tampón de tapizado es tampón carbonato-bicarbonato 50 mM pH 9,6. Tampón citrato es una solución 40 mM de citrato de sodio pH 5,5. La solución de sustrato contiene 0,01 % TMB (3,3 ', 5,5'-tetrametilbenzidina) y 0,004% de H202 en tampón citrato. El tampón borato es 0,2 M de ácido bórico / borato de sodio pH 8,7.
Reactivos y inmunorreactivos. Los péptidos PSau3, PSau4, PSau5, PSau6, PSau7 y PSau8 se sintetizaron como se describe en la sección química. El peptidoglicano de Staphylococcus aureus (77140) y el anti-lgG de conejo-peroxidasa (A8275) se adquirieron de Sigma-Aldrich. Staphylococcus aureus CECT 5190, Escherichia coli K12 CECT 433 y Pseudomonas aeruginosa CECT 1 10 fueron suministrados por la Plataforma de Producción de Proteínas (PPP, grupo de Microbiología Aplicada, Universidad Autónoma de Barcelona) previamente inactivado por calor a 100°C. Las muestras se suspendieron en PBS y se almacenaron a -40°C.
Síntesis de los bioconjugados. Los bioconjugados de proteína-péptido de haptenos con un residuo LCys se sintetizaron utilizando propanoato de N-succinimidil-3- maleimidilo (N-SMP) o yodoacetato de N-succinimidilo (N-SIA) como brazos espaciadores heterobifuncionales, utilizando el procedimiento general descrito a continuación, para obtener el péptido malimidopropilo correspondiente (péptido-MP) o péptido-yodoacetilo (péptido-IA-conjugados de proteína). PSau6 y PSau8 se acoplaron a HCH (hemocianina de cangrejo herradura) y BSA (albúmina de suero bovino), mientras que PSau3 y PSau4 sólo se acoplaron a BSA. La bioconjugación de los haptenos PSau3, PSau4, PSau6 y PSau8 se realizó a través de un procedimiento de dos pasos:
Paso 1 : Activación de las proteínas. Se añadió una solución de N-SMP (1 ,6 mol, 0,43 mg) o N-SIA (9,22 mol, 2,61 mg) en DMF seca (200 μί) gota a gota a una solución de la proteína (HCH o BSA, 10 mg cada uno) en tampón borato (1 ,8 mL). La mezcla se agitó 4 h a temperatura ambiente, y después se purificó por exclusión de tamaño molecular usando tampón borato como eluyente. Las fracciones eluidas (0,5 mL) de los correspondientes MP-proteína o IA-proteína conjugados se recogieron en tubos Eppendorf, y los que dieron positivo en la prueba de proteína de Bradford se combinaron (3 mL). Una parte de esta solución se reservó para análisis MALDI-TOF- MS, y el resto se usó para la conjugación como se describe en el paso 2.
Paso 2: Bioconjugación. Los haptenos PSau3 (2, 17 mg, 1 ,6 mmol), PSau4 (2, 17 mg, 1 ,6 mmol), PSauQ (6,26 mg, 4,6 mmol) y PSau8 (5,93 mg, 4,6 mmol) se disolvieron en 1 : 1 ACN: H20 MilliQ (200 μΙ_) y cada disolución se añadió gota a gota a las correspondientes soluciones de proteínas activadas purificadas (10 mg; véase la etapa 1). PSau3 y PSau4 se conjugaron a MP-proteína y PSau6 y PSau8 se conjugaron con IA-proteína a través del grupo SH. La mezcla se mantuvo bajo una ligera agitación durante 4 h a temperatura ambiente para obtener el correspondiente conjugado PSai/3-MP-proteína y PSai/4-MP-proteína o PSai/6-CH2CO-proteína y PSai 8-CH2CO- proteína. Para los conjugados PSai6-CH2CO-proteína y PSai/8-CH2CO-proteína, el bloqueo de los átomos de yodo que no reaccionaron se realizó mediante la adición de una solución de cisteína (80 mM, 200 μί) y agitar la mezcla durante 2 h más a temperatura ambiente. Finalmente, los conjugados se purificaron mediante diálisis frente a PBS 0,5 mM (4 χ 5 L) y agua MilliQ (1 x 5 L), se liofilizaron y se almacenaron a -80°C. Las alícuotas de trabajo se prepararon a 1 mg mL"1 en PBS y se mantuvieron a 4°C. Análisis de la densidad de hapteno. Las densidades de los conjugados de BSA se calcularon mediante MALDI-TOF/TOF-MS comparando el peso molecular de la proteína nativa con el correspondiente MP-o IA-proteína y con el conjugado péptido- MP-proteína o péptido-CH2CO-proteína. Los espectros de MALDI se obtuvieron mediante la mezcla de la matriz-trans-3,5-dimetoxi-4 hidroxicinámico (2 μί, 10 mg mL"1 en CH3CN/H20 70:30, ácido fórmico al 0, 1 %, recién preparada) y la solución de la conjugado o proteína (2 μΙ_, 10 mg mL"1 en CH3CN/H20 70:30, TFA al 0,1 %) (la tabla 1).
Tabla 1. Densidades de hapteno de los conjugados péptido-proteína.
inmunoreactivo d-haptenoa % conjugación
PSau3-MP-BSA 2 5-6
PSau4-MP-BSA 2 5-6
PSau6-CH2CO-BSA 6 20-17
PSau8-CH2CO-BSA 9 26-30
Los análisis se realizaron mediante MALDI-TOF/TOF-MS.
a Moles de hapteno por moles de proteína. b La conjugación se calcula en base a la asunción que la BSA tiene entre 30-35 grupos lisina libres. Los anticuerpos policlonales. Cuatro conejos hembra New Zealand blancos que pesaban de 1-2 Kg fueron inmunizados de acuerdo con el protocolo de inmunización previamente reportado (Anal. Chim. Acta 1997, 347 (1-2), 139-147). El antisuero obtenido de la inmunización con PSai6-CH2CO-HCH fueron etiquetados como As288 y As289 y aquellos inmunizados con PSai 8-CH2CO-HCH como As290 y 291. La evolución de los títulos de anticuerpos se evaluó mediante la medición de la unión de diluciones en serie de los antisueros a placas de microtitulación recubiertas con el conjugado homólogo (PSai6-CH2CO-BSA y PSai 8-CH2CO-BSA). Después de obtener un título de anticuerpo aceptable, los conejos se desangraron y la sangre se recogió en tubos vacutainer provistos de un gel de separación de suero. El antisuero se obtuvo por centrifugación 15 min a 4000 rpm y se almacenó a -80 °C en presencia de 0,02% NaN3. Las alícuotas de trabajo se almacenaron a 4 °C.
Tratamiento Desglicosilacion. La desglicosilacion química del peptidoglicano (PG) a partir de preparados comerciales o de suspensiones bacterianas se realizó con ácido trifluorometanosulfónico (TFMSA). PG (1 mg), PSau7 (1 mg) o muestras bacterianas (S. aureus, E. co//' y P. aeruginosa; 1 mL de 109 UFCmL"1 de bacterias liofilizadas) se suspendieron en una solución 2: 1 de TFMSA: anisol (0,5 mL) y se agitó durante 1 hora a temperatura ambiente. Posteriormente, se añadió éter dietílico (1 ,5 mL) gota a gota a la suspensión y a continuación se añadió la mezcla a una solución 1 : 1 de piridina:agua Milli-Q (2,5 mL). La fase acuosa se lavó con éter dietílico (2,5 mL x 3) y se secó usando un flujo de nitrógeno durante 10 min.
Muestras de lavados broncoalvelolares (BAL) y broncoaspirados (BAS). BAL o BAS de 10 pacientes diagnosticados de no tener infección por S. aureus fueron tratados con ditiotreitol (DTT) para hidrolizar su estructura mucolítica. Las muestras de BAL o BAS se pesaron (50 mg) y se añadió una solución de DTT 0,1 % p/v (200 μί) y se agitó durante 30 min. Después, se añadieron 200 μ\- de PBS y la mezcla se filtró con un filtro de nailon de 48 μηι y se centrifugó (10 min, 4000 G). El sobrenadante se dividió en alícuotas y se almacenó a -40°C. Una muestra blanco representativa de BAL o BAS fue preparada mediante la mezcla a volúmenes iguales de BAL o BAS con muestras provenientes de 10 individuos diagnosticados de no tener S. aureus, respectivamente. Estudios del efecto Matriz Tratamiento de desglicosilación. Se determinaron las interferencias no específicas producidas por el tipo de muestra analizada
a. Blanco Un extracto acuoso blanco, preparado usando el procedimiento de desglicosilación en ausencia de muestra, se usó para preparar las curvas de calibración PSau7 PBST-D y se utilizó para comparar la respuesta en el ELISA, con respecto a la misma curva preparada en PBST,
b. BAL o BAS: se prepararon las curvas de calibración en BAL o BAS y se evaluó por ELISA para comparar el paralelismo con la curva estándar preparada en PBST-D. (Véase la figura 1 B y tabla 3)
Muestras dopadas no-desglicosiladas: a. Muestras preparadas en tampón. Se dopó PBS a varias concentraciones de PSau7, PG y S. aureus y se midieron los equivalentes de inmunorreactivos de PSau7en la curva de referencia PSau7 PBT mediante ELISA (figura 4 y 6 y tabla 4).
Muestras dopadas desglicosiladas: a. Muestras preparadas en tampón: Se dopó PBS a varias concentraciones de PSau7, PG, S. aureus, P. aeruginosa o E. coli. Se desglicosilaron como se describe anteriormente y se midieron los equivalentes de inmunorreactivos de PSau7en la curva de referencia PSau7 PBST-D mediante ELISA usando el procedimiento descrito para las muestras desglicosiladas (tabla 4 y figura 4 para PG; figura 5 P. aeruginosa y E. coli) b. Muestras dopadas de BAL o BAS. Se dopó BAL o BAS a varias concentraciones de S. aureus y se midieron en el ELISA PSau7 PBST-D. (Figura 6 para S. aureus dopado en PBS, BAL o BAS). ELISA competitivo indirecto: Se seleccionaron las concentraciones apropiadas de los antisueros (As288-As291) y de los bioconjugados (PSai/3-MP-BSA, PSai/4-ΜΡ- BSA, PSai6-CH2CO-BSA o PSai/8-CH2CO-BSA) para establecer las pruebas ELISA tras un ensayo de placa de titulación 2D que se realizó como está descrito (Anal. Chim Acta 1997, 347 (1-2), 139) (tabla 2). Con la mejor combinación As/bioconjugado se estableció el siguiente procedimiento cuantitativo:
Las placas de microtitulación se tapizaron con PSai/3-MP-BSA (0.125 mg mL"1 en tampón de tapizado, 100 μίροοΝΙο"1) 4 horas a 25°C. Después, las placas se lavaron con PBST (4 x 300 L pocilio"1) y se añadieron las soluciones estándares del péptido {PSau5 o PSau7, desde 1 ,500 nM a 0 nM en PBT) o PG (de 200 μg mL"1 a 0 μg mL"1 en PBST) o muestras (suspensiones bacterianas), previamente preincubados con el antisuero (As291 , 1/6000 diluido en PBT) durante 30 min a temperatura ambiente, (100 μΙ_ pocilio"1). Después de 30 min a temperatura ambiente, las placas se lavaron como antes y se añadió la solución anti-lgG-HRP (1/6000 en PBST, 100 μΙ_ pocilio"1) y se incubó durante 30 min más. Después de otro ciclo de lavados, se añadió la solución de sustrato (0,01 % TMB (3,3 ', 5,5'-tetrametilbenzidina) y 0,004% de H202 en tampón citrato) (100 μΙ_ pocilio"1), y la reacción enzimática se detuvo después de 30 min a temperatura ambiente con H2S044N (50 μΙ_ pocilio"1). Las absorbancias se midieron a 450 nm. Cuando las muestras a medir previamente habían sido tratadas con TFMSA, el tapizado de las microplacas se realizó con PSai/3-MP-BSA (1 ,5 mg mL"1 en tampón de tapizado, 100 μ\- pocilio"1) y las muestras o las soluciones estándar PSau7 (de 3350 nM a 0 nM en PBST-D, 90 pocilio"1) previamente preincubadas con As291 (1/500 diluido en PBT, 10 pocilio"1).
Tabla 2: Parámetros inmunoquímicos del ELISA competitivo indirecto usando soluciones de PG como estándares.
Hapteno de
inmunizaEnsayo AbSmax AbSm¡n IC50 Pendiente R2
(Mg mL"1)
ción
As288/PSau4-MP-BSA 1 ,033 0,225 3,08 -1 ,32 0,990
As288/PSau3-MP-BSA 1 ,055 0,251 2,63 -1 ,75 0,982
As288/PSau8-CH2CO-BSA 0,922 0,331 4,91 -1 ,06 0,993
As288/PSau6-CH2CO-BSA 0,936 0,208 2,58 -1 ,52 0,984
PSauQ
As289/PSau4- MP-BSA 0,820 0,208 2,58 -1 ,21 0,977
As289/PSau3- MP-BSA 1 ,343 0,226 1 ,23 -0,92 0,989
As289/PSau8-CH2CO-BSA 0,926 0,263 1 ,68 -0,98 0,995
As289/PSau6-CH2CO-BSA 1 , 167 0,325 2,26 -1 ,15 0,995
As290/PSau4- MP-BSA 0,718 0, 154 2,07 -1 ,73 0,977
As290/PSau3- MP-BSA 1 , 125 0,221 2,69 -1 ,66 0,989
As290/PSau6-CH2CO-BSA 1 ,441 0,239 3,44 -1 ,32 0,995
PSau8
As290/PSau8-CH2CO-BSA 1 ,661 0,296 6,61 -1 ,14 0,995
As291/PSau4- MP-BSA 0,806 0, 149 1 ,20 -1 ,31 0,987
As291/PSau3- MP-BSA 1 ,340 0, 165 1 ,59 -1 ,38 0,993 As291/PSau6-CH2CO-BSA 1 ,445 0,274 6,66 -1 ,02 0,997
As291/PSau8-CH2CO-BSA 1 ,790 0,299 12,43 -0,78 0,991
Tabla3. Parámetros del ELISA desarrollado basado en microplaca, utilizando distintos analitos {PSau5, PSau7 and PG) y distintas condiciones (PBT and PBST-D).
Figure imgf000034_0001
aEI peso molecular del PG no se conoce. Los ensayos se realizaron usando tres pocilios de replicado bajo las condiciones mostradas en la tabla. PBT indica que el protocolo del inmunoensayo se usó para muestras no-desglicosiladas, mientras PBST-D indica que el ensayo se realice bajo las condiciones de muestras desglicosiladas. bLos valores mostrados son el promedio y la desviación estándar de los parámetros de la curva de calibración obtenidos en dos días diferentes. cLos valores mostrados son el promedio y la desviación estándar de los parámetros de la curva de calibración obtenidos en tres días diferentes. dSe ha aplicado un factor de multiplicación de 2.5 a los valores de IC50 y LOD correspondiente al tratamiento de desglicosilación. eLos valores se expresan en nM. fLos valores se expresan en nmoles de PSau7Kg"1 BAL. 9Los valores se expresan en nmoles de PSau7Kg"1 BAS.
RESULTADOS
Con el fin de mimetizar una parte del Peptidoglicano (PG) de la pared bacteriana de S. aureus se sintetizaron dos epítopos de péptidos correspondientes a las estructuras PSau5 y PSau7 que servirían como analitos en el proceso de optimización del método de detección de S. aureus. PSau5, contiene la secuencia de DAIa-DAla del peptidoglicano de la pared bacteriana de S. aureus, y PSau7 contiene un sólo residuo DAIa. Para la síntesis de estos péptidos, ambos residuos terminales carboxi y amino fueron amidados (-CONH2 y CH3CONH-, respectivamente). Sólo en el caso del segundo residuo DAIa del PSau5 el grupo carboxiterminal se dejó libre. Los haptenos de inmunización PSauQ y PSau8 fueron diseñados para mimetizar y maximizar el reconocimiento de estos epítopos mediante la colocación de un residuo LCys en el extremo amino, junto a uno de los residuos LAIa que están vinculados a los residuos MurNAc de PG. Otros dos haptenos peptídicos (PSau3 y PSau4), diferentes de los haptenos de inmunización, fueron diseñados y sintetizados introduciendo ligeras modificaciones con respecto al epítopo peptídico PSaub, para ser utilizados como competidoresy mejorar la capacidad de detección del ensayo. PSau2> es muy similar al hapteno de inmunización PSau6 excepto por el residuo DGIn que sustituye al D-YGIU-N H2, que está presente en la estructura del PG y en PSau6. Por lo tanto, como se puede observar en la PSau3, el DGIn forma un enlace amida normal con el ácido amino vecino a través del grupo α-COOH, a diferencia de D-YGIU-N H2 del PSau6, que está enlazado a través del grupo γ-COOH, como en la estructura real del PG de S. aureus. PSauA también posee esta modificación, pero además, el residuo Cys está situado en el lado opuesto dejando el DAIa-DAla terminal más accesible para el reconocimiento de anticuerpos. Se obtuvo una colección de cuatro bioconjugados proteína-péptido competidores con diferentes grados de heterología (PSai/4-MP-BSA>PSai/3-MP- BSA> PSai 6-CH2CO-BSA ~ PSai/8-CH2CO-BSA) para el desarrollo del inmunoensayo competitivo.
La afinidad de los antisueros para los diferentes bioconjugados se ensayó en experimentos de titulación. Todos los antisueros mostraron una mayor afinidad por los conjugados homólogos. Posteriormente, las combinaciones de antisueros/bioconjugado que mostraron buenos títulos fueron probados por su capacidad de reconocer el PG de S. aureus. Como resultado de ello, se obtuvieron dieciséis ensayos inmunoquímicos con detectabilidades similares (la tabla 2). Ambos haptenos de inmunización PSauQ y PSau8 resultaron obtener buenos inmunoensayos, lo que indica que ambos epítopos peptídicos son igualmente accesibles para el reconocimiento del anticuerpo en el PG. Sin embargo, si bien la heterología del hapteno no jugó un papel importante para los anticuerpos de PSau6, para aquellos contra PSau8, la detectabilidad fue ligeramente mejor utilizando competidores heterólogos (Tabla 2).PSai/3-BSA/As291 fue seleccionado para estudios posteriores, ya que fue una de las combinaciones que muestran un mejor valor de IC50 y relación Absmin/AbsMax-
Estudio parámetros físico-químicos en el ensayo
Con el objetivo de evaluar el efecto de los parámetros físico-químicos en el ensayo y mejorar la detectabilidad de la pared celular de S. aureus, se evaluaron parámetros como el pH (5,5 a 9,5), la fuerza iónica (1 ,5 a 52,2 mS cm"1), el tanto por ciento de Tween 20 (0-0,1 %) del tampón de ensayo como otros parámetros tales como la longitud de la etapa competitiva (10-60 min) o la introducción de una fase de preincubación (0-60 min) del analito con el antisuero. Como se puede observar en la figura 2, el ensayo es estable entre valores de pH de 5,5 y 8,5, valores de fuerza iónica bajos mejoran la detectabilidad del ensayo y el efecto el Tween20 no afecta significativamente el ensayo (figura 2A, 2B y 2C). Por otra parte, la introducción de una etapa de preincubación e incrementando el tiempo de la etapa de competencia, mejoran la detectabilidad del ensayo (figura 2D y 2E). Por lo tanto, se estableció una preincubación de 15 min seguido de 30 min de etapa competitiva, utilizando un tampón de ensayo con una fuerza iónica de 1 ,5 mS cm"1. Bajo estas condiciones, el ELISA es capaz de alcanzar un LOD de 120 ± 90 ng ml"1( ~ 3 ngpocillo"1 ; N = 2 días) con una IC50 de 1002 ± 920 ng ml_"1 (N = 2 días) de PG (figura 2A y tabla 3), y el tiempo total del ensayo es de 2,5 h, usando sólo 25 μΙ-de muestra.
Establecimiento de un ensayo inmunoquímico de tipo ELISA para la detección de epítopos peptídicos en la pared bacteriana de S. aureus
Debido a la falta de estandarización de los preparados comerciales de PG, que son diferentes en función del procedimiento utilizado para su extracción de la pared celular, en los estudios dirigidos a la determinación de preparados bacterianos se decidió usar los epítopos PSau7 o PSau5 como estándares de cuantificación. Contrariamente a los preparados comerciales, estas estructuras están bien definidas y químicamente caracterizadas, lo cual proporciona resultados más reproducibles que confieren una mayor fiabilidad al ensayo. Como se puede observar en la Figura 1 B y la tabla 3, los epítopos de péptido seleccionado (PSau5 y PSau7) fueron reconocidos en un grado comparable con valores de IC50 similares de alrededor de 0,7 nM (0,8 ng ml_"1). Se escogió PSau7 para calibrar el ensayo, expresando los resultados como equivalentes de inmunorreactividad de PSau7 (equiv IR PSau7). Por otra parte, el ensayo podría ser utilizado para caracterizar losdiferentes lotes de PG como una función de su respuesta inmunoquímica en el ensayo, expresados como equivs IR de PSau7.
Desglicosilación del peptidoglicano para incrementar la detectabilidad del método ELISA
El objetivo era desarrollar una herramienta inmunoquímicade diagnóstico capaz de detectar infecciones causadas por S. aureus sin necesidad de pre-enriquecimiento de la muestra.
Inicialmente, midiendo suspensiones de diluciones seriadas preparadas en PBS, se observó que en estas condiciones sólo los preparados con densidades celulares superiores a 107 UFC ml_"1 podían ser detectados con eficacia. Aunque esta detectabilidad se encuentra cerca de otros ensayos reportados mediante determinaciones inmunoquímicas de S. aureus (Diagn Microbiol Infect Dis 2013, 75 (1), 28-36), esta detectabilidad es insuficiente para fines de diagnóstico y por esta razón otros autores han desarrollado métodos de amplificación y otras técnicas para mejorar la sensibilidad. Para incrementar la detectabilidad del ensayo los inventores establecieron que los epítopos peptídicos estuvieran más accesibles para el anticuerpo mediante la rotura o desglicosilación de la pared celular del PG. Los métodos de escisión de la pared celular bacterianas se han estudiado ampliamente para elucidar la estructura PG o incluso para desarrollar nuevos agentes antimicrobianos pero no se han descrito para incrementar la detectabilidad del ensayo. El método de desglicosilación utilizado se basó en la hidrólisis química con TFMSA, aunque se podrían haber utilizado otros métodos descritos en la literatura. El TFMSA es no dependiente de las mutaciones, el enlace amida de los péptidos no se ve afectado y solo rompe los enlaces de las fracciones de glicano. Teniendo en cuenta que el tratamiento TFMSA podría alterar no sólo el PG, sino también las características físico-químicas de la muestra resultante, en una primera instancia, se evaluó el potencial de interferencias no específicas causadas por este tratamiento en el ELISA PSai/3-MP-BSA/As291. Para este propósito, se realizó el tratamiento de desglicosilación tal y como se describe en la sección experimental pero en ausencia de matriz, y se empleó la solución final para preparar las curvas de calibración. Como se puede observar en las figuras 3A y 3B, la señal fue completamente inhibida en este medio. El extracto tuvo que ser diluido al menos 80 veces con el fin de tener un ensayo utilizable, disminuyendo sustancialmente la detectabilidad. En su lugar, se optó por volver a ajusfar la concentración de los reactivos inmunitarios en este medio de desglicosiliación, llevando a cabo experimentos 2D utilizando el extracto TFMSA diluido 1/4 en PBT (pH de 5,5 y una conductividad de 28 mS cm"1). La figura 1 B muestra la curva de calibración registrada bajo estas condiciones y la Tabla 1 (columna titulada PBST-D) muestra los parámetros extraídos del ajuste de la curva de calibración a una ecuación de cuatro parámetros. El LOD para PSau7 en la matriz fue 1 ,37nM, un valor mayor que en el tampón de ensayo (figura 1 B), pero suficientemente buenopara seguir con nuestros estudios.
La robustez de ensayo, evaluada mediante la ejecución de las curvas de calibración de PSau7 durante varios días (N = 3 días) demostró que el ensayo es reproducible. Así, en el valor de IC50, el coeficiente de variación (% CV) es 7, 1 %, mientras que en el LOD es de 6,7 %. (figural B y tabla 3, columna titulada PBST-D).
Recuperación de PSau7 en el tratamiento de desglicosilación
Por otra parte, la recuperación de la desglicosilación se evaluó mediante el dopaje de muestras a concentraciones conocidas de PSau7, obteniendo recuperaciones próximas al 100%. Estos resultados indican que los epitopos peptídicos no se ven alterados por el tratamiento, ya que los equivalentes de inmunorreactividad (IR equiv.) medidos antes y después del tratamiento no difieren significativamente (tabla 4).
Tabla 4. Recuperación de la desglicosilación química. Medido, nM(% recuperación)
dopado, nM PBST PBST-D
22 19,5 ± 0,88 (88) 21 ,1 ± 0,99 (96)
23 25,1 ± 1 ,05 (109) 26,5 ± 0,98 (115)
Las muestras de doparon con PSau7y se midieron por ELISA antes y después del tratamiento de desglicosilacion. Los resultados mostrados son el promedio y la correspondiente desviación estándar de tres muestras dopadas a la misma concentración, cada uno de ellos medido por triplicado en tres pocilios de la placa.
Muestras de preparados comerciales de PG y de varias suspensiones bacterianas (S. aureus, P. aeruginosa y E. Coli, 108-10 UFC mL"1) se desglicosilaron siguiendo el procedimiento descrito anteriormente y se midieron los equiv IR de PSau7 antes y después del tratamiento. El tratamiento permitió aumentar significativamente la señal inmunoquímica en el preparado PG comercial (figura 4) y en muestras de cultivos de S. aureus (figura 6) lo que indica que el procedimiento de la desglicosilacion incrementa de manera eficiente la liberación de epítopos de péptidos que reaccionan con los anticuerpos. Mediante este procedimiento de desglicosilacion, S. aureus puede detectarse en concentraciones hasta 104 UFC mL"1 sin pre-enriquecimiento del cultivo celular (t-Test p< 0.05 (p= 0.04) respecto a la concentración celular de S. aureus de 0 CFU mL"1). En contraste, las muestras de E. coli y P. aeruginosa no muestran ninguna respuesta, ni antes ni después del tratamiento con TFMSA, en concentraciones de hasta 108 y 107 UFC mL"1 (figura 5) lo que demuestra la especificidad del protocolo inmunoquímico que se presenta aquí.
Evaluación en muestras reales
La incidencia y la importanciadeS. aureus en las vías respiratorias condujeron a la evaluación de la funcionalidad de esta técnica inmunoquímicaen muestras de BAL y BAS. Así, una mezcla demuestras de BAL o BAS obtenidas de pacientes no infectados por S. aureus se utilizaron para evaluar el rendimiento del ensayo.
Después de un tratamiento simple de BAL y BAS con DTT seguido del tratamiento de desglicosilacion se vio que bajo estas condiciones el ensayo seguía funcionando bien. Las muestras BAL y BAS desglicosiladas mostraron una respuesta similar comparándola con la curva ELISA de PSau7 PBST-D (figura 1 B) sin necesidad de realizar otro tratamiento para minimizar el efecto matriz.
La fracción peptídica específica del PG deS. aureus puede ser detectada en muestras de BAL y BAS con un LOD de 19,08 ± 7,35 nmoles Kg"1 (N = 3 días) y 18,8 ± 3,70 nmoles Kg"1 (N = 3 días), respectivamente.
Se prepararon unas muestras de BAL y BAS dopadas con S. aureus a diferentes concentraciones. Las muestras se trataron como antes y después se valoraron con la curva de referencia ELISA PSau7 PBST-D. Como se puede observar en la figura 6, la respuesta inmunoquímica de las muestras de BAL y BAS era muy similar a la obtenida a la de las muestras de S. aureus dopadas en PBST, excepto por el hecho de que la detectabilidad lograda fue menor (105 BAS y 106 para BAL), pero sigue siendo útil para el diagnóstico, teniendo en cuenta que el ELISA descrito no necesita pasos de cultivo de pre-enriquecimiento de células para alcanzar esta detectabilidad.
En la fibrosis quística (FQ), la bronquitis y la neumonía de pacientes a menudo se han reportado cargas bacterianas alrededor de 106 UFC mL"1. Como ejemplo, Corne et al. (J Clin Microbiol 2005, 43, 3491) en un estudio con pacientes con neumonía reportó concentraciones > 104 UFC mL"1 de S. aureus a partir de cultivos de BAL y concentraciones > 107 UFC mL"1 a partir de cultivos de BAS de los pacientes con neumonía. En pacientes con FQ, S. aureus es uno de los primeros agentes patogénicos que colonizan las vías respiratorias y las cargas bacterianas alcanzan hasta 108 UFC mL"1 en el esputo (J Clin Microbiol 2002, 40, 2300).
En la presente invención se presenta por primera vez un método de detección basado en un ELISA competitivo, utilizando anticuerpos específicos del PG de S. aureus, capaz de detectar este microorganismo a niveles de 104 UFC mL"1 , sin pre- enriquecimiento en cultivo celular. Documentos del estado de la técnica que abordaron el desarrollo de anticuerpos contra el PG de S. aureus no muestran resultados suficientes para demostrar la posibilidad de detectar bacterias en muestras clínicas, y con frecuencia sólo muestran los datos relativos a la detectabilidad de los preparativos de PG o de la pared celular. En este aspecto, la estrategia usada en este documento para generar anticuerpos contra epítopos sintéticos específicos del PG ha permitido la creación de un ensayo inmunoquímico con una mejor detectabilidad y capacidades de rendimiento de muestreo más alta, reduciendo significativamente el tiempo de ensayo y el volumen de muestra necesario. Así, mientras este ELISA es capaz de detectar 3 ng (120 ng mL"1) de PG (sin desglicosilacion) con tan sólo 50 μΙ y 2,5 h, el ensayo de aglutinación de látex reportado por Seidl y Schleife (European J. Biochem1977, 74, 353-363) detecta 10 ng usando 1 mL de muestra (el volumen total de ensayo es de 1 1 mL) después de 14 h (2 horas a 56°C), y Wergeland et al. (J Immunol Methods1987, 104, 57-63) desarrolló un ELISA sandwich alcanzando un LOD de 200 ng mL"1 después de un tiempo de ensayo total de aproximadamente 21 h. Más recientemente, Sandhu et al. (Analyst 2012, 137, 1 130-1 136) han reportado un ELISA de 4h basado en la detección de PG previamente adsorbido las placas de pocilios que alcanzan un valor detectabilidad que es dos órdenes de magnitud mayor que el ensayo aquí descrito.
Además, el ELISA aquí descrito, detecta S. aureus directamente (sin cultivo de células o pre-enriquecimiento) en muestras clínicas a densidades celulares, que puede ser útil para el diagnóstico en casi 2,5 horas (1 h de tratamiento de la muestra y 1 ,5 h para el ensayo). Por otra parte, el ensayo es fácil de realizar, tiene capacidad para un elevado análisis de muestras y necesita muy pequeños volúmenes de muestra.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Compuesto de fórmula general (I)
Figure imgf000042_0001
(I) donde:
Ri se selecciona de entre OH y NHR'; donde R' se selecciona de entre H o alquilo(C C4);
n es un número entero seleccionado de entre 0 y 1 ;
m es un número entero seleccionado de entre 1 y 7; X! y X2 se seleccionan, cada uno independientemente, de entre D-Glu, D-GIn, D-γ- Glu y D-y-GIn;
Z y Z' se seleccionan, cada uno independientemente, de entre un aminoácido seleccionado de la lista que consiste en Gly, Ala, Leu, lie y Val; p y q son, cada uno independientemente, un número entero seleccionado de entre 0 y 1 ;
Y e Y' se seleccionan, cada uno independientemente, de entre R4, COR4 y Cys, opcionalmente la cisteina puede contener un grupo protector de tioles;
R2 y R3 se seleccionan, independientemente, de entre H, alquilo(d-C4) y CO- alquilo(C C2);
r, s, t o v son, independientemente, un número entero seleccionadode entre 0 y 1 ;
R4 es un alquilo(CrC5), sustituido con un grupo -SH, -halógeno, -CECH, -N3 o -COR5;
R5 se selecciona de entre H o OR"; donde R" se selecciona de entre H o alquilo(C C4);
con la condición de que:
si r es 1 , s es 0,
si s es 1 , r es 0, y
si Y o Y' se selecciona entre R4 o COR4 entonces t ó v, respectivamente es 0.
2. Compuesto según la reivindicación 1 , donde p y q son 0.
3. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, donde m es 5.
4. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde n es 0.
5. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde R^ es NHR' y R' se selecciona de entre H o metilo.
6. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde n es 1.
7. Compuesto según la reivindicación anterior, donde R^ es OH.
8. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde X! y X2 son ¡guales.
9. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde X! y/o X2 son D- Gln o D-y-GIn.
10. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde Y o Y' son Cys.
1 1. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde R2 y/o R3 son el grupo-CO-alquilo(CrC2)
12. Compuesto según la reivindicación anterior, donde R2 y/o R3 son el grupo -COCH3.
13. Compuesto según la reivindicación 1 seleccionado de entre
Figure imgf000044_0001
Figure imgf000045_0001
Figure imgf000046_0001
14. Compuesto según la reivindicación anterior, donde el compuesto es PSau3, PSau4, PSau6 o PSau8.
15. Uso del compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 como hapteno.
16. Conjugado que comprende al menos un hapteno seleccionado de un compuesto de fórmula (I) según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 junto con al menos un segundo componente seleccionado de la lista que consiste en: una macromolécula, preferiblemente una proteína o un fragmento de la misma, un oligonucleótido o un polisacárido; una etiqueta detectable y un soporte.
17. Conjugado según la reivindicación 16, donde el segundo componente se selecciona de una macromolécula, preferiblemente una proteína.
18. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 16 o 17 donde la macromolécula se selecciona de la lista que consiste en: hemocianina de cangrejo herradura (HCH), hemocianina de lapa (KLH), albúmina de suero bovino (BSA), peroxidasa de rábano (HRP), ovoalbúmina (OVA), y conalbúmina (CONA), preferiblemente HCH y BSA.
19. Uso de un conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 17 o 18 para la obtención de anticuerpos.
20. Anticuerpo obtenido mediante la inmunización con un conjugado definido en cualquiera de las reivindicaciones 17 o 18.
21. Anticuerpo según la reivindicación 20 donde el anticuerpo es monoclonal o policlonal.
22. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 20 o 21 donde además el anticuerpo está unido a un agente de mareaje.
23. Antisuero que comprende el anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22.
24. Uso del hapteno seleccionado de un compuesto de fórmula (I) según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, o del conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, o del anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22 o del antisuero según la reivindicación 23 para la detección de S. aureus o un analito derivado en una muestra.
25. Uso según la reivindicación anterior, donde la muestra se selecciona de una muestra biológica aislada de un sujeto, una muestra alimentaria o ambiental.
26. Método in vitro para detectarS. aureus o un analito derivado de S. aureus en una muestra que comprende la utilización del anticuerpo descrito en cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22 o del antisuero según la reivindicación 23 y la detección de la unión de dicho anticuerpo o antisuero a S. aureus o un analito derivado de S. aureus.
27. Método según la reivindicación 26que además comprende el uso de un conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18.
28. Método según cualquiera de las reivindicaciones 26 o 27 donde la detección se realiza mediante una técnica inmunoquímica.
29. Método según la reivindicación 28 donde la técnica inmunoquímica es un ELISA, preferiblemente ELISA competitivo indirecto.
30. Método según cualquiera de las reivindicaciones 26 a 29 donde la muestra se selecciona de una muestra biológica aislada de un sujeto, una muestra alimentaria o ambiental.
31. Método según la reivindicación 30, donde la muestra biológica aislada se selecciona de la lista que consiste en: sangre, suero, plasma, saliva, orina, esputo, BAL y BAS.
32. Kit o dispositivo que comprende al menos un hapteno seleccionado de un compuesto de fórmula (I) según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, o un conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, o un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21 o un antisuero según la reivindicación 22 o cualquiera de sus combinaciones.
33. Kit o dispositivo según la reivindicación 32 en donde el hapteno, el conjugado o el anticuerpo están inmovilizados sobre un soporte sólido.
34. Kit o dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 32 o 33, que comprende al menos un conjugado y un anticuerpo.
35. Uso del kit o dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 32 a 34 para la detección de S. aureus en una muestra biológica aislada, alimentaria o ambiental.
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