WO2016190386A1 - 転写制御因子の強化により取り出しやすい形でセルロースを効率よく産生する植物を生産する方法 - Google Patents

転写制御因子の強化により取り出しやすい形でセルロースを効率よく産生する植物を生産する方法 Download PDF

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acid sequence
nucleic acid
cellulose
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展隆 光田
坂本　真吾
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/02—Monosaccharides

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a plant that highly accumulates cellulose in a form that can be easily taken out by enhancing the expression of a specific transcription control factor in the plant.
  • Cellulose is a polymer in which glucose is repeatedly ⁇ -1,4-linked. Since glucose is obtained by treatment with cellulase derived from fungi or the like, ethanol is obtained by fermenting it with yeast. In recent years, a method of mixing cellulose itself as a nanocellulose fiber with a resin and using it as a reinforcing agent is being developed. Cellulose is contained in large amounts in the primary and secondary cell walls of plants, but the cellulose in the secondary cell wall is intricately intertwined with lignin and hemicellulose, and only cellulose is taken out or decomposed to obtain glucose. It is not easy to do. On the other hand, the cellulose in the primary cell wall can be easily taken out and decomposed to easily obtain glucose.
  • NST transcription factor gene discovered by the present inventors is well known as a gene that regulates secondary cell wall formation in plants (Non-patent Document 1).
  • NST transcription factor is a gene found in the model experimental plant Arabidopsis thaliana, and the nst1 nst3 double mutant does not form any wood (secondary cell wall) except for the canal.
  • cellulose having low crystallinity is contained only in the primary cell wall and the enzymatic saccharification by cellulase is enhanced (Patent Document 1, Non-Patent Document 2), but the amount of cellulose per individual is reduced, and the final sugar Yield decreases. In addition, the strength of the stem is greatly reduced and cannot stand upright.
  • Patent Document 2 and Non-Patent Document 3 are cited as prior arts for enhancing biomass for biofuel.
  • a human sugar nucleotide (UDP-galactose) transporter is expressed in tobacco to achieve an overall increase in biomass, but it is not focused on cellulose, but everything increases.
  • Patent Document 3 is a technique for thickening the secondary cell wall.
  • the secondary cell wall contains not only cellulose but also lignin and hemicellulose, and it is not easy to efficiently extract cellulose therefrom. Thus, it is not easy to selectively produce cellulose in such a form that it can be easily taken out, and a reliable method has not yet been established.
  • an object of the present invention is to provide a technique for causing a plant to produce cellulose in an easy-to-take-out form and increasing the production amount of cellulose which is cellulose or a decomposition product thereof.
  • glucose can be a raw material for the synthesis of various compounds.
  • Cellulose itself can also be used for various applications such as paper pulp and additives. The promotion of production of these biofuels and materials can contribute to the realization of a low-carbon society.
  • NAC family transcription factor group which is a plant-specific transcription factor, in Arabidopsis thaliana
  • NST1, NST1, NST2 and NST3 were discovered (Non-patent Document 1).
  • Non-patent Document 1 the nst1 nst3 double mutant of Arabidopsis thaliana no longer formed wood in the flower stem and hypocotyl wood fiber cells, and the strength of the flower stem was greatly reduced, so that it could not stand upright. However, in the same way, in the canal where the wood is formed, wood loss does not occur and the survival of the plant is not affected (Non-patent Document 1).
  • the present inventors have extensively studied the transcription factor genes of Arabidopsis thaliana that control cellulose synthesis in the nst1 nst3 double mutant, and the function of CEF2 or CEF4 gene, which is one of AP2 / ERF transcriptional regulator genes, is made of wood fiber.
  • CEF1, CEF3, CEF5, or CEF6 gene which is one of transcriptional control genes having a conserved motif in common with these, has a similar function. Based on the above findings, the present invention has been completed.
  • a method for producing a plant containing increased cellulose comprising the step of enhancing the function of a transcriptional regulatory factor shown in any of (a) to (e) below in a wood fiber cell of a target plant: About; (A) a transcriptional regulatory factor consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, 3, 33, 35, 37, or 39, (A) One or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 1, 3, 33, 35, 37, or 39, and activity for controlling cellulose synthesis A transcriptional regulator having (C) a transcriptional regulator consisting of an amino acid sequence having at least 60% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, 3, 33, 35, 37, or 39, and controlling the synthesis of cellulose A transcription factor having an activity of (D) a transcriptional regulatory factor encoded by the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4, 34, 36, 38, or 40, (E) a transcriptional regulatory factor encoded by a
  • a plant containing increased cellulose comprising a step of enhancing the function of a transcriptional regulatory factor shown in any of (a ′) to (mi ′) below in the wood fiber cells of the target plant Production method;
  • a ′ a transcriptional regulatory factor consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1,
  • a ′ a transcriptional regulatory factor in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and have an activity to control cellulose synthesis;
  • C ' A transcription factor comprising an amino acid sequence having at least 60% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and having an activity of controlling the synthesis of cellulose.
  • (F ') a transcriptional regulatory factor consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3,
  • Gi ′ a transcriptional regulatory factor in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 and have an activity to control cellulose synthesis;
  • H ' A transcription factor comprising an amino acid sequence having at least 60% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, and having an activity of controlling cellulose synthesis.
  • (K ') a transcriptional regulatory factor encoded by the base sequence shown in SEQ ID NO: 4
  • (Co ') a transcriptional regulator encoded by a base sequence that hybridizes with a complementary sequence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 under stringent conditions and having an activity of controlling the amount of cellulose synthesized Control factor.
  • a nucleic acid encoding a polypeptide comprising a sequence and having an activity of increasing the amount of cellulose synthesized (D) a nucleic acid comprising a base sequence in which the first base sequence shown in SEQ ID NO: 2, 4, 34, 36, 38 or 40 and the second base sequence shown in SEQ ID NO: 6 are linked; (E) In the nucleic acid of (d), the first base sequence and / or the second base sequence is represented by SEQ ID NO: 2, 4, 34, 36, 38, or 40 and / or SEQ ID NO: 6.
  • this invention relates to the following method in one Embodiment.
  • [2 ′] The plant production method according to [1 ′] above,
  • the step of enhancing the function of the transcription control factor is operably linked to the nucleic acid according to any one of the following (a ′) to (m′1) downstream of a promoter that induces gene expression in wood fiber cells.
  • a step of transforming a plant with a vector containing the expressed expression cassette (A ′) a nucleic acid encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence in which the first amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and the second amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 are linked; (A′1) In the nucleic acid described in (a ′) above, the first amino acid sequence and / or the second amino acid sequence has a deletion, substitution or addition of one or several amino acids, And a nucleic acid encoding a polypeptide having an activity of increasing the amount of cellulose synthesized, (A′2) In the nucleic acid of (a ′), the first amino acid sequence and / or the second amino acid sequence is at least 60% identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and / or SEQ ID NO: 5.
  • a nucleic acid encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence having the activity of increasing the amount of cellulose synthesized (B ′) a nucleic acid comprising a base sequence in which the first base sequence shown in SEQ ID NO: 2 and the second base sequence shown in SEQ ID NO: 6 are linked; (B′1) In the nucleic acid of (b ′), the first base sequence and / or the second base sequence is stringent with a complementary sequence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 and / or SEQ ID NO: 6.
  • C ′ a nucleic acid encoding a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which the first amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 and the second amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 are linked,
  • C′1 In the nucleic acid described in (c ′) above, the first amino acid sequence and / or the second amino acid sequence has a deletion, substitution or addition of one or several amino acids,
  • a nucleic acid encoding a polypeptide having an activity of increasing the amount of cellulose synthesized (C′2) In the nucleic acid of (c ′), the first amino acid sequence and / or the second amino acid sequence is at least 60% identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 and / or SEQ ID NO: 5.
  • a nucleic acid encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence having the activity of increasing the amount of cellulose synthesized (D ′) a nucleic acid comprising a base sequence in which the first base sequence shown in SEQ ID NO: 4 and the second base sequence shown in SEQ ID NO: 6 are linked; (D′ 1) In the nucleic acid of (d ′), the first base sequence and / or the second base sequence is stringent with a complementary sequence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 and / or SEQ ID NO: 6.
  • (E ′) a nucleic acid encoding a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which the first amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 33 and the second amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 are linked;
  • (E′1) In the nucleic acid described in (e ′) above, the first amino acid sequence and / or the second amino acid sequence has a deletion, substitution or addition of one or several amino acids, And a nucleic acid encoding a polypeptide having an activity of increasing the amount of cellulose synthesized,
  • (F ′) a nucleic acid comprising a base sequence in which the first base
  • a nucleic acid encoding a polypeptide that has a base sequence that hybridizes under conditions and has an activity of increasing the amount of cellulose synthesized (G ′) a nucleic acid encoding a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which the first amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 35 and the second amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 are linked; (G′1) In the nucleic acid described in (g ′) above, the first amino acid sequence and / or the second amino acid sequence has a deletion, substitution or addition of one or several amino acids, And a nucleic acid encoding a polypeptide having an activity of increasing the amount of cellulose synthesized, (G′2) In the nucleic acid of (g ′), the first amino acid sequence and / or the second amino acid sequence is at least 60% identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 35 and / or SEQ ID NO: 5.
  • a nucleic acid encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence having the activity of increasing the amount of cellulose synthesized (H ′) a nucleic acid comprising a base sequence in which the first base sequence shown in SEQ ID NO: 36 and the second base sequence shown in SEQ ID NO: 6 are linked, (H′1) In the nucleic acid of (h ′), the first base sequence and / or the second base sequence is stringent with a complementary sequence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 36 and / or SEQ ID NO: 6.
  • (I′1) In the nucleic acid described in (i ′) above, the first amino acid sequence and / or the second amino acid sequence has a deletion, substitution or addition of one or several amino acids,
  • a nucleic acid encoding a polypeptide having an activity of increasing the amount of cellulose synthesized (I′2) In the nucleic acid of (i ′) above, the first amino acid sequence and / or the second amino acid sequence is at least 60% identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 37 and / or SEQ ID NO: 5
  • a nucleic acid encoding a polypeptide that has a base sequence that hybridizes under conditions and has an activity of increasing the amount of cellulose synthesized (K ′) a nucleic acid encoding a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which the first amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 39 and the second amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 are linked, (K′1) In the nucleic acid described in (k ′) above, the first amino acid sequence and / or the second amino acid sequence has a deletion, substitution or addition of one or several amino acids, And a nucleic acid encoding a polypeptide having an activity of increasing the amount of cellulose synthesized, (K′2) In the nucleic acid of (k ′), the first amino acid sequence and / or the second amino acid sequence is at least 60% identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 39 and / or SEQ ID NO: 5.
  • a nucleic acid encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence having the activity of increasing the amount of cellulose synthesized (L ′) a nucleic acid comprising a base sequence in which the first base sequence shown in SEQ ID NO: 40 and the second base sequence shown in SEQ ID NO: 6 are linked; (L′ 1) In the nucleic acid of (l ′), the first base sequence and / or the second base sequence is stringent with a complementary sequence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 40 and / or SEQ ID NO: 6.
  • a nucleic acid encoding a polypeptide that has a base sequence that hybridizes under conditions and has an activity of increasing the amount of cellulose synthesized (M ′) a nucleic acid encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence in which a polypeptide comprising the first amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 41 and a second amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 are linked, (M′1) In the nucleic acid described in (m ′), the first amino acid sequence and / or the second amino acid sequence has a deletion, substitution or addition of one or several amino acids, And a nucleic acid encoding a polypeptide having an activity of increasing the amount of cellulose synthesized.
  • the promoter that induces gene expression in wood fiber cells is a promoter of NST1 or NST3 gene.
  • [4] including a step of preparing a plant produced by the method according to any one of [1] to [3] above, or a progeny thereof, and a step of obtaining at least a part thereof and subjecting it to an enzymatic saccharification treatment.
  • the present invention relates to a method for producing glucose.
  • [5] An expression cassette used in the plant production method according to [2] or [3] above, wherein the following (a) to (e) An expression cassette to which the nucleic acid according to any one of the above is operably linked; (A) encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence in which the first amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, 3, 33, 35, 37, or 39 and the second amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 are linked Nucleic acid to (B) in the nucleic acid described in (a), the first amino acid sequence and / or the second amino acid sequence has a deletion, substitution or addition of one or several amino acids, and cellulose A nucleic acid encoding a polypeptide having an activity of increasing the amount of synthesis of (C) In the nucleic acid of (a), the first amino acid sequence and / or the second amino acid sequence has at least 60% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and / or SEQ ID NO: 5.
  • a nucleic acid encoding a polypeptide comprising a sequence and having an activity of increasing the amount of cellulose synthesized (D) a nucleic acid comprising a base sequence in which the first base sequence shown in SEQ ID NO: 2, 4, 34, 36, 38 or 40 and the second base sequence shown in SEQ ID NO: 6 are linked; (E) In the nucleic acid of (d), the first base sequence and / or the second base sequence is represented by SEQ ID NO: 2, 4, 34, 36, 38, or 40 and / or SEQ ID NO: 6.
  • this invention relates to the following method in one Embodiment.
  • [5 ′] An expression cassette used in the method for producing a plant according to [2 ′] or [3] above, wherein the following (a ′) To an expression cassette to which the nucleic acid according to any one of (m′1) is operably linked; (A ′) a nucleic acid encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence in which the first amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and the second amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 are linked; (A′1) In the nucleic acid described in (a ′) above, the first amino acid sequence and / or the second amino acid sequence has a deletion, substitution or addition of one or several amino acids, And a nucleic acid encoding a polypeptide having an activity of increasing the amount of cellulose synthesized, (A′2) In the nucleic acid of (a ′), the first amino acid sequence and / or the second amino acid sequence is at least 60% identical to the amino acid
  • a nucleic acid encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence having the activity of increasing the amount of cellulose synthesized (B ′) a nucleic acid comprising a base sequence in which the first base sequence shown in SEQ ID NO: 2 and the second base sequence shown in SEQ ID NO: 6 are linked; (B′1) In the nucleic acid of (b ′), the first base sequence and / or the second base sequence is stringent with a complementary sequence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 and / or SEQ ID NO: 6.
  • C ′ a nucleic acid encoding a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which the first amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 and the second amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 are linked,
  • C′1 In the nucleic acid described in (c ′) above, the first amino acid sequence and / or the second amino acid sequence has a deletion, substitution or addition of one or several amino acids,
  • a nucleic acid encoding a polypeptide having an activity of increasing the amount of cellulose synthesized (C′2) In the nucleic acid of (c ′), the first amino acid sequence and / or the second amino acid sequence is at least 60% identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 and / or SEQ ID NO: 5.
  • a nucleic acid encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence having the activity of increasing the amount of cellulose synthesized (D ′) a nucleic acid comprising a base sequence in which the first base sequence shown in SEQ ID NO: 4 and the second base sequence shown in SEQ ID NO: 6 are linked; (D′ 1) In the nucleic acid of (d ′), the first base sequence and / or the second base sequence is stringent with a complementary sequence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 and / or SEQ ID NO: 6.
  • (E ′) a nucleic acid encoding a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which the first amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 33 and the second amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 are linked;
  • (E′1) In the nucleic acid described in (e ′) above, the first amino acid sequence and / or the second amino acid sequence has a deletion, substitution or addition of one or several amino acids, And a nucleic acid encoding a polypeptide having an activity of increasing the amount of cellulose synthesized,
  • (F ′) a nucleic acid comprising a base sequence in which the first base
  • a nucleic acid encoding a polypeptide that has a base sequence that hybridizes under conditions and has an activity of increasing the amount of cellulose synthesized (G ′) a nucleic acid encoding a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which the first amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 35 and the second amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 are linked; (G′1) In the nucleic acid described in (g ′) above, the first amino acid sequence and / or the second amino acid sequence has a deletion, substitution or addition of one or several amino acids, And a nucleic acid encoding a polypeptide having an activity of increasing the amount of cellulose synthesized, (G′2) In the nucleic acid of (g ′), the first amino acid sequence and / or the second amino acid sequence is at least 60% identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 35 and / or SEQ ID NO: 5.
  • a nucleic acid encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence having the activity of increasing the amount of cellulose synthesized (H ′) a nucleic acid comprising a base sequence in which the first base sequence shown in SEQ ID NO: 36 and the second base sequence shown in SEQ ID NO: 6 are linked, (H′1) In the nucleic acid of (h ′), the first base sequence and / or the second base sequence is stringent with a complementary sequence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 36 and / or SEQ ID NO: 6.
  • (I′1) In the nucleic acid described in (i ′) above, the first amino acid sequence and / or the second amino acid sequence has a deletion, substitution or addition of one or several amino acids,
  • a nucleic acid encoding a polypeptide having an activity of increasing the amount of cellulose synthesized (I′2) In the nucleic acid of (i ′) above, the first amino acid sequence and / or the second amino acid sequence is at least 60% identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 37 and / or SEQ ID NO: 5
  • a nucleic acid encoding a polypeptide that has a base sequence that hybridizes under conditions and has an activity of increasing the amount of cellulose synthesized (K ′) a nucleic acid encoding a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which the first amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 39 and the second amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 are linked, (K′1) In the nucleic acid described in (k ′) above, the first amino acid sequence and / or the second amino acid sequence has a deletion, substitution or addition of one or several amino acids, And a nucleic acid encoding a polypeptide having an activity of increasing the amount of cellulose synthesized, (K′2) In the nucleic acid of (k ′), the first amino acid sequence and / or the second amino acid sequence is at least 60% identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 39 and / or SEQ ID NO: 5.
  • a nucleic acid encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence having the activity of increasing the amount of cellulose synthesized (L ′) a nucleic acid comprising a base sequence in which the first base sequence shown in SEQ ID NO: 40 and the second base sequence shown in SEQ ID NO: 6 are linked; (L′ 1) In the nucleic acid of (l ′), the first base sequence and / or the second base sequence is stringent with a complementary sequence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 40 and / or SEQ ID NO: 6.
  • a nucleic acid encoding a polypeptide that has a base sequence that hybridizes under conditions and has an activity of increasing the amount of cellulose synthesized (M ′) a nucleic acid encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence in which a polypeptide comprising the first amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 41 and a second amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 are linked, (M′1) In the nucleic acid described in (m ′), the first amino acid sequence and / or the second amino acid sequence has a deletion, substitution or addition of one or several amino acids, And a nucleic acid encoding a polypeptide having an activity of increasing the amount of cellulose synthesized.
  • [6] relates to a vector comprising the expression cassette according to [5] above.
  • [7] relates to a kit containing the vector according to [6] above.
  • [8] The present invention relates to a plant or a progeny thereof, or a part thereof transformed by the vector according to [6] above.
  • a transcriptional regulatory factor encoded by “CEF2 gene”, “CEF4 gene”, “CEF1 gene”, “CEF3 gene”, “CEF5 gene”, or “CEF6 gene” By strengthening the function of the homologue, it becomes possible to thicken the primary cell wall and produce a plant with enhanced cellulose production ability in a form that is easy to remove. Thereby, the quantity of the cellulose which can be extracted from per plant individual can be increased. If these can be increased, biofuel and material production can be increased.
  • Figure 1 shows the Arabidopsis wild strain (Col-O), the nst1 nst3 double mutant, and the nst1 nst3 NST3pro: CEF2-VP16 strain (CEF2 transcription factor added with a VP16 transcriptional activation domain by the Arabidopsis thaliana NST3 promoter).
  • Nst1 nst3 double mutant strain stems were observed in bright field (top row), lignin autofluorescence under ultraviolet light (second row), and fluorescent with anti-xylan antibody.
  • a labeled image (third stage) and an image fluorescently labeled with a crystallized cellulose binding protein (lower stage) are shown.
  • CEF2-VP16 complementary line a vector containing a nucleic acid encoding CEF2-VP16 (hereinafter also referred to as CEF2-VP16 complementary line). Showed thickening similar to the wild type. However, when the distribution of lignin by autofluorescence under ultraviolet light and the distribution of xylan by xylan antibodies were observed, none of them could be confirmed. On the other hand, when the distribution of crystallized cellulose was observed with the crystallized cellulose antibody, the CEF2-VP16 complementary line showed crystallized cellulose deposition as in the wild strain.
  • FIG. 2 shows the Arabidopsis wild strain (Col-O), the nst1stnst3 double mutant, and the nst1 nst3 NST3pro: CEF4-VP16 strain (the Arabidopsis thaliana NST3 promoter added with the VP16 transcriptional activation domain)
  • An image obtained by observing bright field observation (upper row) and an image obtained by observing autofluorescence of lignin (lower row) of the stems of the nst1stnst3 double mutant) are shown.
  • FIG. 3 shows a graph comparing the cell wall content in the lower 10 cm of the stem of the wild strain of Arabidopsis (Col-O), the nst1stnst3 double mutant, and the CEF2-VP16 complementary line (DR2342-8).
  • the CEF2-VP16 complementary line the cell wall content was restored to the same level as the wild type.
  • FIG. 4 shows the enzymatic saccharification rate by cellulase for cell wall components extracted from the lower 10 cm of the stem of the wild strain of Arabidopsis (Col-O), nst1nnst3 double mutant, and CEF2-VP16 complementary line (DR2342-8) ( Saccharification (efficiency) (FIG.
  • FIG. 4 (a) glucose yield per fresh weight
  • FIG. 4 (b) glucose yield per fresh weight
  • the enzyme saccharification rate has increased to the same level as that of the nst1stnst3 double mutant having only the primary cell wall, but as shown in FIG. 3, the cell wall content is equivalent to that of the wild strain.
  • the final glucose yield increased by about 70% (1.7 times) compared to the wild type.
  • Figure 5 compares the expression of cellulose synthase gene by RT-PCR using RNA extracted from stems of wild strains of Arabidopsis (Col-O), nst1stnst3 double mutant, and CEF2-VP16 complementary lines. It is a graph.
  • FIG. 6 compares the state of primary cell wall regeneration with CEF2 gene, CEF2-VP16 gene, and CEF2-SRDX (added SRDX transcription repression domain to CEF2 transcription factor) gene in Arabidopsis protoplasts with control
  • FIG. 6B is a photograph visualized with calcoflow white (FIG.
  • FIG. 6A shows images of the wild-type Arabidopsis thaliana (Wild-type) and nst1 nst3 double mutant stems observed in bright field (upper row) and lignin autofluorescence (lower row), respectively.
  • FIG. 7 shows images of the wild-type Arabidopsis thaliana (Wild-type) and nst1 nst3 double mutant stems observed in bright field (upper row) and lignin autofluorescence (lower row), respectively.
  • nst1 nst3 NST3pro CEF1-VP16 strain (a strain expressed by adding an VP16 transcriptional activation domain to the CEF1 transcription factor and expressed in Arabidopsis thaliana nst1 nst3 double mutant) by using an Arabidopsis thaliana NST3 promoter.
  • the images of the stems of the strains nst1nnst3 NST3pro: CEF5-VP16 strain and nst1 nst3 NST3pro: CEF3-VP16 strain were observed in the bright field (upper row) and the images of the lignin autofluorescence (lower row), respectively.
  • FIG. 9 shows an Arabidopsis wild-type strain (Wild-type), nst1 nst3 double mutant, CEF4-VP16 complementary line, CEF5-VP16 complementary line, CEF6-VP16 complementary line, CEF1-VP16 complementary line, and CEF3-VP16.
  • Cell wall content at the bottom 10 cm of the stem in the complementary line Fig.
  • CEF4-VP16 complementary line, CEF5-VP16 complementary line, CEF6-VP16 complementary line, CEF1-VP16 complementary line or CEF3-VP16 complementary line has the same level of enzymatic glycation as the nst1 nst3 double mutant with only primary cell wall However, since the cell wall content is equivalent to that of the wild strain, the final glucose yield was greatly increased compared to the wild strain.
  • the genes that control the accumulation of cellulose are typically “CEF2 gene” represented by SEQ ID NO: 2 derived from Arabidopsis thaliana, “CEF4 gene” represented by SEQ ID NO: 4, and “CEF5 represented by SEQ ID NO: 34”.
  • “CEF2 gene”, “CEF4 gene”, “CEF5 gene”, “CEF3 gene”, “CEF1 gene” and “CEF6 gene” encoded by “CEF2 protein”, “CEF4 protein”, “CEF5 protein”, “CEF3” “Protein”, “CEF1 protein” and “CEF6 protein” are proteins belonging to the same AP2 / ERF family and have a common consensus sequence represented by SEQ ID NO: 41.
  • ⁇ CEF2 gene '', ⁇ CEF4 gene '', ⁇ CEF5 gene '', ⁇ CEF3 gene '', ⁇ CEF1 gene '', or ⁇ CEF6 gene '' Means “CEF2 gene” represented by SEQ ID NO: 2, “CEF4 gene” represented by SEQ ID NO: 4, “CEF5 gene” represented by SEQ ID NO: 33, and “CEF3 gene” represented by SEQ ID NO: 35.
  • CEF1 gene represented by SEQ ID NO: 37 or the “CEF6 gene” represented by SEQ ID NO: 39, but also homologs such as orthologs, paralogs, etc. included. And strengthen the function of the protein (transcription regulatory factor) encoded by the "CEF2 gene”, “CEF4 gene”, “CEF5 gene”, “CEF3 gene”, “CEF1 gene” or “CEF6 gene” or their homologues By doing so, a plant with improved cellulose productivity can be obtained.
  • CEF2 gene and CEF4 gene have the same function, and about 60% homology is recognized at the amino acid level in the alignable region. From this, homologous genes in Arabidopsis thaliana or other plant genomes, or even among the genes introduced with mutations in part, "CEF2 gene” or “CEF4 gene” and at least 60% at the amino acid level, preferably 70%, It is clear that similar genes having a homology of 80%, more preferably 90%, can be used as well. Moreover, as long as the same function is hold
  • the method for producing a plant containing increased cellulose according to the present invention includes “CEF2 gene”, “CEF4 gene”, “ Including a step of enhancing the function of a transcriptional regulatory factor encoded by a “CEF5 gene”, “CEF3 gene”, “CEF1 gene”, or “CEF6 gene”, and obtaining a plant containing cellulose increased by the step it can.
  • the transcriptional regulatory factor encoded by the “CEF2 gene”, which is the target of functional enhancement is, for example, the following (A ′) to (O ′) Can be described; (A ′) a transcriptional regulatory factor consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, (A ′) a transcriptional regulatory factor consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and having an activity of controlling the accumulation of cellulose, (C ') A transcription factor comprising an amino acid sequence having at least 60% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and having an activity of controlling the accumulation of cellulose.
  • the transcriptional regulatory factor encoded by the “CEF4 gene” that is the target of functional enhancement includes, for example, the following (f ') to (c ′): Can be described as: (F ') a transcriptional regulatory factor consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, (Gi ') a transcriptional regulatory factor consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, and having an activity of controlling the accumulation of cellulose, (G ′) A transcription factor comprising an amino acid sequence having at least 60% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, and having an activity of controlling the accumulation of cellulose.
  • (K ') a transcriptional regulatory factor encoded by the base sequence shown in SEQ ID NO: 4
  • (Co ') A transcriptional regulator encoded by a base sequence that hybridizes with a complementary sequence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 under stringent conditions and has an activity of controlling the amount of accumulated cellulose Control factor.
  • the transcriptional regulatory factor encoded by the “CEF5 gene” that is the target of functional enhancement is, for example, the following (sa ′) to (so ′): Can be described as: (Sa ′) a transcriptional regulatory factor comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 33, (Si ′) a transcriptional regulatory factor consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 33, and having an activity of controlling the accumulation of cellulose; (Su ′) A transcription factor comprising an amino acid sequence having at least 60% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 33, and having an activity of controlling the accumulation of cellulose.
  • C ′ a transcriptional regulatory factor encoded by the base sequence represented by SEQ ID NO: 34
  • Se ' A transcriptional regulatory factor encoded by a base sequence that hybridizes with a complementary sequence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 34 under stringent conditions and has an activity of controlling the amount of cellulose accumulated Control factor.
  • the transcriptional regulatory factor encoded by the “CEF3 gene” that is the target of functional enhancement includes, for example, the following (ta ′) to (g ′) Can be described as: (Ta ′) a transcriptional regulatory factor consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 35, (H ') a transcriptional regulatory factor consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 35, and having an activity of controlling the accumulation of cellulose; (Tu ') A transcription factor comprising an amino acid sequence having at least 60% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 35, and having an activity of controlling the accumulation of cellulose.
  • (Te ′) a transcriptional regulatory factor encoded by the base sequence shown in SEQ ID NO: 36
  • G ′ Transcription that is a transcriptional regulatory factor encoded by a base sequence that hybridizes under stringent conditions with a complementary sequence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 36, and that has an activity of controlling the amount of accumulated cellulose Control factor.
  • the transcriptional regulatory factor encoded by the “CEF1 gene” that is the target of functional enhancement includes, for example, the following (na ′) to (no ′): Can be described as: (Na ′) a transcriptional regulatory factor consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 37, (D ') a transcriptional regulatory factor consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 37, and having an activity of controlling the accumulation of cellulose; (Nu ′) a transcription factor comprising an amino acid sequence having at least 60% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 37, and having an activity of controlling the accumulation of cellulose.
  • the transcriptional regulatory factor encoded by the “CEF6 gene” that is the target of functional enhancement is, for example, the following (ha ′) to (e ′): Can be described as: (C ′) a transcription factor consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 39, (H ') a transcriptional regulatory factor consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 39, and having an activity of controlling the accumulation of cellulose; (F ′) A transcription factor comprising an amino acid sequence having at least 60% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 39, and having an activity of controlling the accumulation of cellulose.
  • amino acid in the amino acid sequence is modified without significantly affecting the structure or function of the polypeptide. Refers to what you are doing.
  • severe refers to the presence of 2 to 50, preferably 2 to 20, more preferably 2 to 10 mutations.
  • transcriptional regulators having at least 60% identity with the amino acid sequence of the transcriptional factor encoded by and having activity to control cellulose expression.
  • the amino acid of the transcriptional regulatory factor encoded by “CEF2 gene” or “CEF4 gene” or “CEF5 gene” or “CEF3 gene” or “CEF1 gene” or “CEF6 gene” A transcriptional regulatory factor having at least 60% identity with the sequence may be a fragment thereof.
  • the identity of the transcriptional regulatory factor encoded by the “CEF2 gene” or “CEF4 gene” or “CEF5 gene” or “CEF3 gene” or “CEF1 gene” or “CEF6 gene” to the amino acid sequence is at least 60%, 70% 80% is preferable.
  • Examples of “deleted, substituted or added amino acids” and “having at least 60% identity” include, but are not limited to, for example, “CEF2 gene”, “CEF4 gene”, “CEF5
  • the amino acid sequences of transcriptional regulatory factors encoded by the ⁇ gene '', ⁇ CEF3 gene '', ⁇ CEF1 gene '', or ⁇ CEF6 gene '' are aligned, the corresponding amino acids do not coincide with each other.
  • amino acids Mention may be made of amino acids that have been mutated to mismatched amino acids.
  • amino acid sequence of a transcriptional regulatory factor encoded by “CEF2 gene”, “CEF4 gene”, “CEF5 gene”, “CEF3 gene”, “CEF1 gene”, or “CEF6 gene” The sequence having a mutation in is one having the consensus sequence shown in SEQ ID NO: 41.
  • the stringent condition refers to a condition in which a so-called specific hybrid is formed and a non-specific hybrid is not formed.
  • nucleic acids having high homology that is, nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, or SEQ ID NO: 40, 90% or more, preferably 95% or more homology.
  • the complementary strand of DNA which consists of a base sequence which has property is hybridized, and the conditions which the complementary strand of a nucleic acid with lower homology does not hybridize are mentioned.
  • T. Maniatis et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd ed.
  • dicotyledonous plants such as potatoes, beans, and solanaceae can be applied in general.
  • dicotyledonous plants such as poplar, eucalyptus, and acacia are used. preferable.
  • the present invention is not limited to these plants, and can also be applied to general breeding of monocotyledonous energy plants such as Miscanthus, Elianthus, Danchiku, Sorghum and Susuki.
  • a plant containing increased cellulose can be obtained for the plants listed above.
  • the term “plant progeny” refers to a progeny obtained by sexual reproduction or asexual reproduction of the plant, including clones of the plant.
  • propagation materials for example, seeds, fruits, cuttings, tubers, tuberous roots, strains, callus, protoplasts, etc.
  • the “activity for controlling cellulose synthesis” means “CEF2 gene”, “CEF4 gene”, “CEF5 gene”, “CEF3 gene”, “CEF1 gene”, or “CEF6 gene”.
  • the transcriptional control activity of a gene related to the biosynthesis of cellulose inherently provided by the transcriptional regulatory factor encoded by.
  • the transcription regulatory factor or homologue or variant thereof it can be said that the body has an activity to control the synthesis of cellulose.
  • the transcriptional control activity inherently provided by the transcriptional regulatory factor is used synonymously with the function of the transcriptional regulatory factor.
  • the technique for enhancing the function of the transcription factor is to enhance the expression of the gene or protein of the target transcription factor in the plant, the expression of the downstream target gene controlled by the transcription factor is enhanced. It may be.
  • a method for enhancing the function of the transcriptional regulatory factor may be any technique known in the art. The expression of the gene encoding the transcriptional regulatory factor is enhanced, and the transcriptional activation domain is added to the gene encoding the transcriptional regulatory factor. And the like. However, the present invention is not limited to these.
  • it when enhancing the function of a transcription factor, it is preferably a technique for enhancing the function of the transcription factor specifically for woody fiber cells of a plant. Such a technique can be appropriately performed by those skilled in the art, for example, by using a wood fiber cell specific promoter in a technique for introducing a nucleic acid together with a promoter.
  • a method for enhancing the function of a transcriptional regulatory factor encoded by the “CEF2 gene” using the method of adding a transcription activation domain will be specifically described as an example.
  • the present invention is not limited to the method described below, and “CEF2 gene”, “CEF4 gene”, “CEF5 gene”, “CEF1 gene”, “CEF3 gene” or “CEF6 gene”, or a homologue thereof. Any method that can enhance the function of the transcriptional regulatory factor encoded by (including orthologs and paralogs) can be used, including those listed above.
  • a transcription control domain encoded by an Arabidopsis-derived “CEF2 gene” has a “transcription activation domain”.
  • Nucleic acids encoding the added polypeptide can be used.
  • VP16 (SEQ ID NO: 5) is preferably used as the polypeptide used as the transcription activation domain.
  • a nucleic acid (transgene) introduced to express a cellulose-enhanced trait is, for example, Can be expressed as: (A ′) a nucleic acid encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence in which the first amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and the second amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 are linked; (A′1) In the nucleic acid described in (a ′) above, the first amino acid sequence and / or the second amino acid sequence has a deletion, substitution or addition of one or several amino acids, And a nucleic acid encoding a polypeptide having an activity of increasing the amount of cellulose synthesized, (A′2) In the nucleic acid of (a ′), the first amino acid sequence and / or the second amino acid sequence is at least 60% identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and /
  • a nucleic acid encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence having the activity of increasing the amount of cellulose synthesized (B ′) a nucleic acid comprising a base sequence in which the first base sequence shown in SEQ ID NO: 2 and the second base sequence shown in SEQ ID NO: 6 are linked; (B′1) In the nucleic acid of (b ′), the first base sequence and / or the second base sequence is stringent with a complementary sequence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 and / or SEQ ID NO: 6.
  • a nucleic acid (transgene) introduced to express a cellulose-enhanced trait is for example, it can be expressed as: (C ′) a nucleic acid encoding a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which the first amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 and the second amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 are linked, (C′1) In the nucleic acid described in (c ′) above, the first amino acid sequence and / or the second amino acid sequence has a deletion, substitution or addition of one or several amino acids, And a nucleic acid encoding a polypeptide having an activity of increasing the amount of cellulose synthesized, (C′2) In the nucleic acid of (c ′), the first amino acid sequence and / or the second amino acid sequence is at least 60% identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 and
  • a nucleic acid encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence having the activity of increasing the amount of cellulose synthesized (D ′) a nucleic acid comprising a base sequence in which the first base sequence shown in SEQ ID NO: 4 and the second base sequence shown in SEQ ID NO: 6 are linked; (D′ 1) In the nucleic acid of (d ′), the first base sequence and / or the second base sequence is stringent with a complementary sequence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 and / or SEQ ID NO: 6.
  • a nucleic acid (transgene) introduced to express a cellulose-enhanced trait is for example, it can be expressed as: (E ′) a nucleic acid encoding a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which the first amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 33 and the second amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 are linked; (E′1) In the nucleic acid described in (e ′) above, the first amino acid sequence and / or the second amino acid sequence has a deletion, substitution or addition of one or several amino acids, And a nucleic acid encoding a polypeptide having an activity of increasing the amount of cellulose synthesized, (E′2) In the nucleic acid of (e ′), the first amino acid sequence and / or the second amino acid sequence is at least 60% identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 33 and
  • a nucleic acid (transgene) introduced to express a cellulose-enhanced trait is for example, it can be expressed as: (G ′) a nucleic acid encoding a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which the first amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 35 and the second amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 are linked; (G′1) In the nucleic acid described in (g ′) above, the first amino acid sequence and / or the second amino acid sequence has a deletion, substitution or addition of one or several amino acids, And a nucleic acid encoding a polypeptide having an activity of increasing the amount of cellulose synthesized, (G′2) In the nucleic acid of (g ′), the first amino acid sequence and / or the second amino acid sequence is at least 60% identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 35 and
  • a nucleic acid encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence having the activity of increasing the amount of cellulose synthesized (H ′) a nucleic acid comprising a base sequence in which the first base sequence shown in SEQ ID NO: 36 and the second base sequence shown in SEQ ID NO: 6 are linked, (H′1) In the nucleic acid of (h ′), the first base sequence and / or the second base sequence is stringent with a complementary sequence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 36 and / or SEQ ID NO: 6.
  • a nucleic acid (transgene) introduced to express a cellulose-enhanced trait is for example, it can be expressed as: (I ′) a nucleic acid encoding a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which the first amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 37 and the second amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 are linked, (I′1) In the nucleic acid described in (i ′) above, the first amino acid sequence and / or the second amino acid sequence has a deletion, substitution or addition of one or several amino acids, And a nucleic acid encoding a polypeptide having an activity of increasing the amount of cellulose synthesized, (I′2) In the nucleic acid of (i ′) above, the first amino acid sequence and / or the second amino acid sequence is at least 60% identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 37
  • a nucleic acid (transgene) introduced to express a cellulose-enhanced trait is for example, it can be expressed as: (K ′) a nucleic acid encoding a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which the first amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 39 and the second amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 are linked, (K′1) In the nucleic acid described in (k ′) above, the first amino acid sequence and / or the second amino acid sequence has a deletion, substitution or addition of one or several amino acids, And a nucleic acid encoding a polypeptide having an activity of increasing the amount of cellulose synthesized, (K′2) In the nucleic acid of (k ′), the first amino acid sequence and / or the second amino acid sequence is at least 60% identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 39 and
  • a nucleic acid encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence having the activity of increasing the amount of cellulose synthesized (L ′) a nucleic acid comprising a base sequence in which the first base sequence shown in SEQ ID NO: 40 and the second base sequence shown in SEQ ID NO: 6 are linked; (L′ 1) In the nucleic acid of (l ′), the first base sequence and / or the second base sequence is stringent with a complementary sequence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 40 and / or SEQ ID NO: 6.
  • the first amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 means “CEF2 gene”, “CEF4 gene” An amino acid sequence of a transcriptional regulator encoded by a “CEF5 gene”, “CEF3 gene”, “CEF1 gene”, or “CEF6 gene”, which is linked in-frame with a second amino acid sequence It is an amino acid sequence that may lack a part on the C-terminal side.
  • ⁇ CEF2 gene '', ⁇ CEF4 gene '', ⁇ CEF5 gene '', ⁇ CEF3 gene '', ⁇ CEF1 gene '', or ⁇ amino acid sequence of a transcriptional regulatory factor encoded by the CEF6 gene '' used in the present invention In addition to the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, or SEQ ID NO: 39, either of the following (i) or (ii) And a polypeptide having a function of a transcriptional regulator encoded by “CEF2 gene”, “CEF4 gene”, “CEF5 gene”, “CEF3 gene”, “CEF1 gene”, or “CEF6 gene” (I) a deletion, substitution or addition of one or several amino acids in the amino acid sequence, or (ii) the amino acid sequence, at least 60%, more preferably 70%, 80 % More preferably,
  • ⁇ CEF2 gene '', ⁇ CEF4 gene '', ⁇ CEF5 gene '', ⁇ CEF3 gene '', ⁇ CEF1 gene '' Or when referring to a polypeptide having the function of a transcriptional regulatory factor encoded by the “CEF6 gene”, it is preferably a polypeptide having the DNA binding ability of the transcriptional regulatory factor. That is, if the polypeptide includes a DNA binding region of the transcriptional regulatory factor, the amino acid sequence of the transcriptional regulatory factor fragment is also the amino acid sequence of the transcriptional regulatory factor encoded by the “CEF2 gene” used in the present invention. included.
  • the “second amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5” is a “transcription activation domain” added to enhance the function of the transcription regulatory factor encoded by the “CEF2 gene”.
  • the “transcription activation domain” used in the present invention in addition to the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, any of the following (i) or (ii), and the first Also included are polypeptides that can enhance the function of the transcription factor encoded by the amino acid sequence; (i) a deletion, substitution, or addition of one or several amino acids in the amino acid sequence, or (ii) the An amino acid sequence having an identity of at least 80% or more, more preferably 90% or more, and still more preferably 95%.
  • (a′2) includes the following one form: (A′2-1)
  • the first amino acid sequence is at least 60% (more preferably 70% or more, 80% or more, more preferably) with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • Consists of amino acid sequences having identity of 90% or more (A′2-2)
  • the second amino acid sequence is at least 80% (more preferably 90% or more, more preferably 95% or more) with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5
  • a nucleic acid encoding a polypeptide having an activity of increasing the amount of cellulose synthesized Consisting of amino acid sequences having the identity of and a nucleic acid encoding a polypeptide having an activity of increasing the amount of cellulose synthesized.
  • the above (c′2) includes the following one form: (C′2-1)
  • the first amino acid sequence is at least 60% (more preferably 70% or more, 80% or more, more preferably) with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 Consists of amino acid sequences having identity of 90% or more)
  • C′2-2 In the nucleic acid of (c ′) above, the second amino acid sequence is at least 80% (more preferably 90% or more, more preferably 95% or more) with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 Consisting of amino acid sequences having the identity of And a nucleic acid encoding a polypeptide having an activity of increasing the amount of cellulose synthesized.
  • the above (e′2) includes the following one form: (E′2-1)
  • the first amino acid sequence is at least 60% (more preferably 70% or more, 80% or more, more preferably) with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 33 Consists of amino acid sequences having identity of 90% or more)
  • the second amino acid sequence is at least 80% (more preferably 90% or more, more preferably 95% or more) with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 Consisting of amino acid sequences having the identity of And a nucleic acid encoding a polypeptide having an activity of increasing the amount of cellulose synthesized.
  • the above (g′2) includes the following one form: (G′2-1)
  • the first amino acid sequence is at least 60% (more preferably 70% or more, 80% or more, more preferably) with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 35 Consists of amino acid sequences having identity of 90% or more)
  • the second amino acid sequence is at least 80% (more preferably 90% or more, more preferably 95% or more) with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 Consisting of amino acid sequences having the identity of And a nucleic acid encoding a polypeptide having an activity of increasing the amount of cellulose synthesized.
  • the above (i′2) includes the following one form: (I′2-1)
  • the first amino acid sequence is at least 60% (more preferably 70% or more, 80% or more, more preferably) with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 37 Consists of amino acid sequences having identity of 90% or more)
  • the second amino acid sequence is at least 80% (more preferably 90% or more, more preferably 95% or more) with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 Consisting of amino acid sequences having the identity of And a nucleic acid encoding a polypeptide having an activity of increasing the amount of cellulose synthesized.
  • the above (k′2) includes the following one form: (K′2-1)
  • the first amino acid sequence is at least 60% (more preferably 70% or more, 80% or more, more preferably) with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 33 Consists of amino acid sequences having identity of 90% or more)
  • K′2-2 In the nucleic acid of (k ′), the second amino acid sequence is at least 80% (more preferably 90% or more, more preferably 95% or more) with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 Consisting of amino acid sequences having the identity of And a nucleic acid encoding a polypeptide having an activity of increasing the amount of cellulose synthesized.
  • the first amino acid sequence and / or the second amino acid sequence has a deletion, substitution or addition of one or several amino acids
  • the first amino acid sequence and the second amino acid sequence are In the linked amino acid sequence, (1) when a part of the first amino acid sequence has deletion, substitution or addition of one or several amino acids, (2) one or several parts of the second amino acid sequence And (3) deletion, substitution or addition of one or several amino acids in the entire amino acid sequence in which the first amino acid sequence and the second amino acid sequence are linked. Including.
  • the first base sequence and / or the second base sequence is a base sequence that hybridizes with a complementary sequence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 and / or SEQ ID NO: 6 under stringent conditions”
  • a portion of the first base sequence is a stringent condition with a complementary sequence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2
  • the second base sequence portion is a base sequence that hybridizes with a complementary sequence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 6 under stringent conditions
  • the whole base sequence in which the first base sequence and the second base sequence are linked is the base sequence in which the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 and the base sequence shown in SEQ ID NO: 6 are linked.
  • a hybridizing nucleotide sequence comprises.
  • the first base sequence and / or the second base sequence is a base sequence that hybridizes under stringent conditions with a complementary sequence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 and / or SEQ ID NO: 6.”
  • the first base sequence and / or the second base sequence is a base sequence that hybridizes under stringent conditions with a complementary sequence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 34 and / or SEQ ID NO: 6.
  • the first base sequence and / or the second base sequence is a base sequence that hybridizes with a complementary sequence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 36 and / or SEQ ID NO: 6 under stringent conditions.
  • the first base sequence and / or the second base sequence is stringent with the complementary sequence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 38 and / or SEQ ID NO: 6
  • the first base sequence and / or the second base sequence is stringent with the complementary sequence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 40 and / or SEQ ID NO: 6
  • the case of “base sequence hybridizing below” includes the cases (4) to (6) above.
  • first amino acid sequence and the “second amino acid sequence”, or the “first base sequence” and the “second base sequence” are respectively passed through the “polypeptide linker” or the “polynucleotide linker”. May be connected.
  • the use of the linker is not essential, and can be appropriately designed and used as necessary.
  • the amino acid sequence or base sequence of the linker is not particularly limited as long as a polypeptide capable of enhancing the function of the transcription control factor can be produced.
  • a polypeptide linker consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 8 A polynucleotide linker consisting of the base sequence shown in the above can be preferably used.
  • the linker can also contain a sequence generated as a result of gateway cloning of the transcriptional regulatory factor into the vector.
  • a sequence generated as a result of gateway cloning of the transcriptional regulatory factor into the vector For example, an attB sequence generated by the gateway LR reaction can be included. Accordingly, the linker is not limited to the above-described sequence, and those skilled in the art can appropriately design a preferable linker depending on the type of vector used.
  • first amino acid sequence or base sequence and the second amino acid sequence or base sequence may be arranged on the N-terminal side or 5 'side.
  • first amino acid sequence or base sequence (2) polypeptide linker or polynucleotide linker, and (3) second amino acid sequence or base sequence from the N-terminal side or 5 'side.
  • second amino acid sequence or base sequence from the N-terminal side or 5 'side.
  • the “expression cassette” refers to one expression system unit capable of expressing a nucleic acid (mainly a gene or a fragment thereof) contained in the cassette.
  • the expression cassette has an expression regulatory region necessary for gene expression in addition to the region containing the nucleic acid.
  • Such expression regulatory regions include, for example, promoters and terminators.
  • an enhancer, a poly A addition signal, a 5'-UTR (untranslated region), a label or selection marker gene, a multicloning site, a replication origin, and the like can be included.
  • the expression cassette was artificially constructed by combining a single expression system unit necessary for expressing a specific gene, etc., as it was from the genome, or by combining expression control regions derived from various organisms. Things exist. Any expression cassette can be used in the present invention.
  • a structure known in the art can be appropriately selected unless otherwise described in the present specification.
  • an “expression cassette” provides an effect of enhancing the activity of a transcriptional regulatory factor encoded by a “CEF2 gene” or the like in a target plant, and has a function of increasing the amount of cellulose synthesized in the plant. Have.
  • a promoter for expressing a transgene used in a technique of adding a transcriptional activation domain is “wood fiber cell”
  • the promoter of NST3 promoter or its ortholog gene, an artificial promoter in which NST binding sequence (SNBE) is repeated and placed upstream of the core promoter secondary cell wall cellulose synthase Promoters of enzymes involved in lignin synthesis and promoters of enzymes involved in xylan synthesis.
  • the promoters of NST1 and NST3 genes derived from Arabidopsis thaliana are preferred in that they promote strong expression specific to wood fiber cells.
  • the “vector” includes the expression cassette, and is a vector introduced into Escherichia coli or the like used for the propagation of a nucleic acid comprising the base sequence contained in the expression cassette, or a plant transformation. Contains vectors to do.
  • a vector known in the art can be used, and it may be appropriately selected according to the plant to be introduced and the technique and purpose of the vector.
  • pDEST_NST3p_VP16_HSP_GWB5 used in the following examples can be used, but is not limited thereto.
  • kits for producing a plant containing increased cellulose As specific examples of the kit, the function of a transcriptional regulatory factor encoded by CEF2 gene, CEF4 gene, CEF1 gene, CEF3 gene, CEF5 gene, or CEF6 gene is enhanced. Can be mentioned.
  • a kit including such a vector includes an expression cassette in which the nucleic acid according to any one of the above (a) to (e) is operably linked downstream of a promoter that induces gene expression in wood fiber cells. It is sufficient if it contains at least a vector, and it is more preferable if it contains a group of reagents for introducing the vector into plant cells. Examples of the reagent group include enzymes, buffers and the like corresponding to the type of transformation. In addition, an experimental material such as a microcentrifuge tube may be attached as necessary.
  • the Agrobacterium method is typical, but the PEG-calcium phosphate method, electroporation method, liposome method, particle gun method, microinjection method, etc. The method can be applied.
  • Enzymatic saccharification treatment is a well-known technique for evaluating how easily glucose can be extracted from cellulose contained in cell wall components, and obtains glucose released by an enzymatic reaction catalyzed by cellulase. After obtaining the cell wall purified powder by sampling the lower 10 cm of the flower stem of the CEF2-VP16 complementary line Arabidopsis thaliana plant obtained by the following example, enzymatic saccharification treatment was performed, and the amount of glucose obtained per fresh weight was compared. However, it was found that about 70% (1.7 times) more of the CEF2-VP16 complementary line was obtained than the wild type (FIG. 4).
  • the plant obtained by the present invention having an increased cellulose accumulation amount is 30% (1.3 times) or more, preferably 50% (1. 5%) or more, more preferably 70% (1.7 times) or more, and increased cellulose in a form that is easy to take out.
  • Example 1 nst1 nst3 duplex transformed with ProNST3: CEF2-VP16, ProNST3: CEF4-VP16, ProNST3: CEF5-VP16, ProNST3: CEF3-VP16, ProNST3: CEF1-VP16, or ProNST3: CEF6-VP16 Production of Mutant Arabidopsis Plant (1-1) Transformation Vector ProNST3: CEF2-VP16, ProNST3: CEF4-VP16, ProNST3: CEF5-VP16, ProNST3: CEF3-VP16, ProNST3: CEF1-VP16, or ProNST3: CEF6 -Construction of VP16
  • a transformation vector was constructed as follows.
  • the CEF2 or CEF4 protein coding region derived from Arabidopsis excluding the stop codon was amplified by PCR using the following oligonucleotide pair as a primer, and cloned into a gateway donor vector pDONR207 vector (Invitrogen) by BP clonase.
  • the pDEST_NST3p_VP16_HSP_GWB5 vector includes the protein coding region and VP16 transcription of the “CEF2 gene”, “CEF4 gene”, “CEF1 gene”, “CEF3 gene”, “CEF5 gene”, or “CEF6 gene” downstream of the NST3 promoter.
  • the nucleotide sequence encoding the activation domain is arranged in a state of being linked via a polynucleotide linker.
  • SEQ ID NO: 13 (CEF2-VP16), SEQ ID NO: 14 (CEF4-VP16), SEQ ID NO: 50 (CEF5-VP16), SEQ ID NO: 51
  • a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by (CEF3-VP16), SEQ ID NO: 52 (CEF1-VP16), or SEQ ID NO: 53 (CEF6-VP16) is expressed.
  • the introduced bacteria were cultured for 2 days in an LB medium containing 200 ml of antibiotics (spectinomycin (Spe) 50 mg / L, gentamicin (Gm) 25 mg / L and rifampicillin (Rif) 50 mg / L). Subsequently, the cells were collected from the culture and suspended in 500 ml of an infiltration medium (see Patent Document 1).
  • antibiotics spectinomycin (Spe) 50 mg / L
  • Gm gentamicin
  • Rif rifampicillin
  • an Arabidopsis thaliana nst1 nst3 double mutant prepared by crossing the T-DNA tag lines SALK_123077 and SALK_149909 ordered from the Arabidopsis BioResource Center (ABRC) for 45 days or more It was grown for 60 days to bloom, and after cutting the main stem, it was grown for another 10 days and used for transformation.
  • the Arabidopsis thaliana nst1 nst3 double mutant was infected for 2 minutes in an infiltration medium in which bacterial cells were suspended, and was grown as usual, and T1 seeds were harvested.
  • T1 seeds were sterilized with 50% bleach and 0.02% Triton X-100 solution for 7 minutes, rinsed three times with sterilized water, and sown in MS selective medium containing 30 mg / l hygromycin (Hg).
  • Transformed plants growing on the hygromycin plate (ProNST3: CEF2-VP16 nst1 nst3, ProNST3: CEF4-VP16 nst1 nst3, ProNST3: CEF5-VP16 nst1 nst3, ProNST3: CEF3-VP16 nst1 nst3, ProNST3: CEF1-VP16 nst1 nst3, ProNST3: CEF6-VP16 nst1 nst3, T1) were selected and grown by replanting in soil, seeds were collected and sown, and the next generation (T2) Arabidopsis thaliana plant was obtained.
  • T2 Arabidopsis thaliana plant was obtained.
  • Example 2 Sectional observation of flower stem of ProNST3: CEF2-VP16 nst1 nst3 Arabidopsis thaliana plant A 50 ⁇ m-thick cross section was prepared at a height of about 3 cm above the ground using a vibration microtome, and the cell walls of wood fiber cells were observed under bright field conditions. As a result, cell wall thickening at the same level as that of the wild type was observed in the CEF2-VP16 complementary line (FIG. 1). On the other hand, the cross section was placed under ultraviolet irradiation, and the autofluorescence of lignin was observed.
  • ProNST3 CEF4-VP16 nst1 nst3, ProNST3: CEF5-VP16 nst1 nst3, ProNST3: CEF3-VP16 nst1 nst3, ProNST3: CEF1-VP16 nst1 nst3, and ProNST3: CEF6-VP16 nst1 nst3 flower stem of Arabidopsis plant Sectional observation ProNST3: CEF4-VP16 nst1 nst3, ProNST3: CEF5-VP16 nst1 nst3, ProNST3: CEF3-VP16 nst1 nst3, ProNST3: CEF1-VP16 nst1 nst3, and ProNST3: CEF6 obtained in Example (1-2) above -VP16 nst1 nst3 Arabidopsis thaliana T1 plants, flower stems are collected
  • ProNST3 CEF2-VP16 nst1 nst3 Cell wall component analysis of Arabidopsis plants (4-1) Extraction and weighing of cell wall components
  • ProNST3 CEF2-VP16 nst1 nst3 Arabidopsis T1 obtained in Example (1-2) above Approximately 10 days after sowing in a plant, a 10 cm portion is collected from the base, and after measuring the fresh weight, the flower stalk is immediately chopped to a length of 1 cm or less, soaked in methanol and allowed to stand overnight for a new methanol. The chlorophyll was removed by rinsing twice. After boiling at 80 ° C. for 10 minutes, it was replaced with fresh methanol.
  • (4-2) Analysis of glucose yield
  • the alcohol-insoluble residue obtained in (4-1) was pulverized at 2000 rpm for 10 minutes using a homogenizer (Shake Master Neo; Biomedical Science) to obtain a cell wall powder.
  • the obtained cell wall powder was suspended in 1 ml of 50 mM maleic acid, 2 mM calcium chloride, 0.02% sodium azide solution and gelatinized with starch at 70 ° C. for 10 minutes, and then 4 ml of 50 mM maleic acid, 2 mM calcium chloride, 0.02% Sodium azide solution was added and allowed to stand at room temperature for 10 minutes.
  • 500U ⁇ -amylase (ALPHA-AMYLASE (Porcine pancreas); manufactured by Megazyme), 0.33U amyloglucosidase (Amyloglucosidase (Aspergillus niger); manufactured by Megazyme), 50 mM maleic acid, 2 mM calcium chloride, 0.02% azidation
  • starch was hydrolyzed at 37 ° C. for 18 hours to remove starch.
  • the cell wall powder suspension subjected to destarching was rinsed three times with distilled water and twice with 100% ethanol, and then dried overnight at 70 ° C. to obtain a purified cell wall powder.
  • ProNST3 CEF4-VP16 nst1 nst3, ProNST3: CEF5-VP16 nst1 nst3, ProNST3: CEF3-VP16 nst1 nst3, ProNST3: CEF1-VP16 nst1 nst3, and ProNST3: CEF6-VP16 nst1 nst3 plant cell wall Analysis (5-1) Extraction and weighing of cell wall components
  • the chlorophyll was removed by rinsing twice with fresh methanol after immersing in methanol and leaving it to stand overnight. After boiling at 80 ° C. for 10 minutes, it was replaced with fresh methanol. This operation was repeated twice, immersed in a 50% chloroform / 50% methanol solution and boiled at 70 ° C., and then replaced with a new 50% chloroform / 50% methanol solution. This operation was repeated twice, then immersed in an acetone solution, boiled at 70 ° C., and then replaced with a new acetone solution. This operation was repeated twice, followed by rinsing with a 100% ethanol solution three times, followed by drying at 70 ° C. for 2 days.
  • NST3pro CEF4-VP16 nst1 nst3, NST3pro: CEF5-VP16 nst1 nst3, NST3pro: CEF3-VP16 nst1 nst3, NST3pro: CEF1-VP16 nst1 nst3, and NST3pro: CEF6-VP16 nst1 nst3 plant line N : CEF2-VP16 nst1 nst3 Similar to the Arabidopsis plant line, more glucose was obtained per unit cultivation area than the control line, which was considered advantageous for bioethanol production and the like.
  • ProNST3 Measurement of downstream gene expression in CEF2-VP16 nst1 nst3 Arabidopsis plants
  • ProNST3 CEF2-VP16 nst1 nst3 after planting in Arabidopsis T1 plants obtained in Example (1-2) above About 30-40 days, a 10 cm portion was collected from the tip and stored at -80 ° C until RNA was extracted. In extracting RNA, the sample was crushed with a homogenizer (Shake Master Neo; Biomedical Science) in liquid nitrogen, and RNA was extracted using the RNeasy Plant kit (QIAGEN).
  • the purified RNA was subjected to reverse transcription reaction using PrimeScript RT Enzyme Mix I (Takara) of PrimeScript TM RT reagent Kit to synthesize cDNA.
  • Mix the cDNA and the oligonucleotide pair that amplifies the cellulose synthase of the primary and secondary cell walls, and the kit of SYBR Green Real-Time PCR Master Mix (Life Technology). was done.
  • the relative expression level of cellulose synthase was calculated by correcting using the average expression levels of UBQ1, ACT2, and PP2AA3.
  • the primer sequences of cellulose synthase and UBQ1, ACT2, and PP2AA3 used for Real-Time PCR are as follows.
  • the CEF2-VP16 complementary line was found to have higher expression levels of cellulose synthase (CESA1, CESA3, CESA6) related to cellulose synthesis in the primary cell wall than the original nst1 nst3 double mutant ( ( Figure 5).
  • Example 7 Construction of protoplast transient transformation vector 35S: CEF2-VP16 or 35S: CEF2 or 35S: CEF2-SRDX Construction of 35S: CEF2 and 35S: CEF2-VP16 was performed as follows. The entry clone obtained by the above (1-1) in which the CEF2 protein coding region derived from Arabidopsis excluding the stop codon was cloned into pDONR207 was combined with the pDEST_35SHSP vector and pDEST_35SVP16HSP vector and LR clonase described in Non-Patent Document 5. By changing, a part of the vector used for transformation was constructed.
  • the protein coding region of the CEF2 gene and the base sequence encoding the VP16 transcription activation domain are arranged downstream of the CaMV 35S promoter in a state of being linked via a polynucleotide linker.
  • a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13 (CEF2-VP16) is expressed in the protoplast of the plant transformed with the vector.
  • 35S: CEF2-SRDX was constructed as follows.
  • the CEF2 protein-coding region derived from Arabidopsis excluding the stop codon was amplified by PCR using the following oligonucleotide pair as a primer, and ligated to the site cleaved with SmaI of the p35SSRDXG vector described in Non-Patent Document 6.
  • Example 8 Measurement of the effect of CEF2 transcriptional regulatory factor on the recovery of primary cell wall when transfection of Arabidopsis mesophyll cell protoplasts
  • Protoplasts are filtered through a nylon filter with a pore size of 70 ⁇ m, collected in a 50 ml tube, and centrifuged at 100 xg for 10 minutes to collect the protoplasts. The supernatant is discarded, and 150 mM NaCl, 125 mM CaCl 2 , 5 mM KCl And resuspended in 2 mM MES (pH 5.7) buffer (W5 buffer). The resuspended protoplast was centrifuged at 100 ⁇ g for 5 minutes and then resuspended in the same buffer. This washing with buffer was repeated twice and then incubated at 4 ° C. for 10 minutes.
  • the protoplasts were centrifuged at 100 ⁇ g for 5 minutes, and then resuspended in 400 mM mannitol, 15 mM MgCl 2 , 4 mM MES (pH 5.7) buffer. Thereafter, the protoplast was recovered by centrifugation at 100 ⁇ g for 5 minutes, and then the cell concentration was adjusted with the same buffer so as to be 2.0 to 3.0 ⁇ 10 5 cells / ml to obtain a protoplast suspension for transformation. .
  • protoplasts are 1 ⁇ Gamborg's B5 mixed salt (manufactured by Nippon Pharmaceutical), 1 ⁇ Gamborg's B5 vitamin (manufactured by Sigma), 250 mM mannitol, 200 mM glucose, 1.0 mg / L 2,4-D, 0.022 mg / L thidiazuron, 200 mg / L ampicillin, 1.0 mg / L fungizone (Amphotericin B, manufactured by Sigma) and 0.1% ethanol solution were resuspended and incubated at 22 ° C. for 2 days to regenerate the protoplast cell wall.
  • the regenerated cell wall was stained with a 10 mg / L calcoflow solution, the fluorescence emitted under UV irradiation was observed with a fluorescence microscope, and the degree of cell wall regeneration was quantified using the fluorescence intensity as an index.
  • protoplasts expressing CEF2 and CEF2-VP16 showed stronger fluorescence of calcoflow compared to controls (protoplasts without a plasmid), and protoplasts expressing CEF2-SRDX were more effective than controls.
  • the fluorescence of calcoflow was weak (FIG. 6). This indicates that the CEF2 transcription factor is involved in protoplast cell wall regeneration, that is, control of primary cell wall formation.
  • the function of the transcriptional regulatory factor encoded by the “CEF2 gene”, “CEF4 gene”, “CEF1 gene”, “CEF3 gene”, “CEF5 gene”, or “CEF6 gene” is used.
  • the nst1 nst3 double mutant was used as the plant to be enhanced. This is to facilitate detection of a partially thickened cell wall.
  • Those skilled in the art will enhance the functions of transcriptional regulatory factors encoded by the “CEF2 gene”, “CEF4 gene”, “CEF1 gene”, “CEF3 gene”, “CEF5 gene”, or “CEF6 gene”.
  • the amount of cellulose synthesized can be increased even in a wild-type plant.

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Abstract

本発明の課題は、バイオ燃料、バイオマテリアルの原料となるセルロースを取り出しやすい形で高生産する能力を有する植物を提供することにある。　本発明は、対象とする植物において、シロイヌナズナ由来の「CEF2遺伝子」、「CEF4遺伝子」、「CEF5遺伝子」、「CEF1遺伝子」、「CEF3遺伝子」、又は、「CEF6遺伝子」によりコードされる転写制御因子、又はそのホモログの機能を強化することでセルロースの生産を増加させる方法を提供する。

Description

転写制御因子の強化により取り出しやすい形でセルロースを効率よく産生する植物を生産する方法
　本発明は、植物において特定の転写制御因子の発現を強化させることにより、取り出しやすい形でセルロースを高蓄積する植物の生産方法に関する。
　昨今、過剰な二酸化炭素の放出による地球温暖化の進行と化石燃料の枯渇に対する危機感、及びそれに伴う化石燃料の価格上昇、などの要因により、再生可能エネルギーやマテリアルの利用が注目を集めている。とくに植物由来バイオ燃料やバイオマテリアルは燃焼、廃棄等によって生じる二酸化炭素を新たな放出と捉える必要がない(カーボンニュートラル)ことから、非常に期待されている。しかし、従来のバイオ燃料やバイオマテリアルはトウモロコシのデンプンなど食糧になり得るものを原料として生産されており、世界人口の増加により食糧の需給が逼迫しつつある現況から考えて持続可能なものとは言いがたい。そこで、非可食であるセルロースを原料とした次世代バイオエタノール、バイオマテリアルの実用化が求められている。セルロースはグルコースが繰り返しβ-1,4-結合したポリマーである。菌類などを由来とするセルラーゼによって処理することによってグルコースが得られるので、それを酵母で発酵させることによりエタノールが得られる。また、近年ではセルロースそのものをナノセルロースファイバーとして樹脂などに混ぜ、強化剤として用いる方策も開発されつつある。セルロースは植物の一次細胞壁及び二次細胞壁中に大量に含まれているが、二次細胞壁中のセルロースはリグニンやヘミセルロースと複雑に絡み合っており、セルロースだけを取り出したり、分解してグルコースを得たりするのは容易ではない。一方で一次細胞壁中のセルロースは取り出しやすく、分解してグルコースを得るのも容易である。
　植物の二次細胞壁形成を制御する遺伝子は本発明者らが発見したNST転写因子遺伝子がよく知られている(非特許文献１)。NST転写因子はモデル実験植物シロイヌナズナにおいて発見された遺伝子で、nst1 nst3二重変異体では、道管を除いて木質(二次細胞壁)がまったく形成されなくなる。そのような植物では結晶性の低いセルロースが一次細胞壁にしか含まれず、セルラーゼによる酵素糖化性が高まる(特許文献１、非特許文献２)が、個体あたりのセルロース量は少なくなり、最終的な糖収量は減少してしまう。しかも茎の強度が大幅に低下して直立することができない。逆に、NST転写因子を植物体全体で過剰に発現させると、あらゆる細胞で異所的な木質形成が起きてしまい、植物の成長が著しく阻害されてしまう。
　バイオ燃料用にバイオマスを増強させる先行技術としては特許文献２及び非特許文献３があげられる。この文献ではヒトの糖ヌクレオチド(UDP-ガラクトース)輸送体をタバコに発現させることにより、全体的なバイオマスの増加を実現させているが、セルロースに焦点を絞ったものではなく、あらゆるものが増加している。
　特許文献３は二次細胞壁を肥厚させる技術であるが、二次細胞壁はセルロースだけでなくリグニンやヘミセルロースを多く含み、そこからセルロースを効率よく取り出すのは容易ではない。
　このようにセルロースを取り出しやすい形で選択的に生産させるのは容易ではなく、未だ確実な方法が確立されていない。
ＷＯ２００７／１０２３４６ 特開２０１０－５１２５２号公報 特開２０１４－１３２８５８号公報
The Plant Cell,2007 19,270-280 Journal of Biotechnology,2009 142,279-284 Journal of Bioscience and Bioengineering,2010 109,159-169 Plant Cell Physiol,2014, 56,299-310 Plant Cell,2013, 25,1609-1624 Methods Mol. Biol.,2011, 754,87-105
　本発明においては、セルロースを取り出しやすい形で植物に生産させ、セルロース又はその分解物であるグルコースの生産量を増やす技術を提供することを目的とする。グルコースはエタノールの原料となるほか、様々な化合物の合成原材料となりうる。また、セルロースそのものも紙パルプや添加剤等など様々な用途に利用できる。これらバイオ燃料、マテリアルの生産促進により低炭素化社会の実現に向けて貢献できる。
　セルロースを取り出しやすい形で増産させるためには、なるべくセルロースだけの生合成を制御する遺伝子を強化するか、一次細胞壁を肥厚させる遺伝子を強化するなどして木質を蓄積する繊維細胞(以下、本明細書において「木質繊維細胞」という)で発現させるのが望ましいと考えられる。本発明者らは植物特異的な転写因子であるNACファミリー転写因子群をシロイヌナズナにおいて網羅的に機能解析する過程で、木質形成を根本的に制御する転写因子遺伝子として、NST転写因子群(NST1、NST2、NST3)を発見した(非特許文献１)。
　これらのうちシロイヌナズナのnst1 nst3二重変異体では花茎や胚軸の木質繊維細胞で木質がまったく形成されなくなり、花茎の強度が大幅に低下した結果、直立することができなかった。しかし同様に木質が形成される道管においては木質の欠損が起こることはなく、植物の生存には影響がなかった(非特許文献１)。
　本発明者らはnst1 nst3二重変異体においてセルロース合成を制御するシロイヌナズナの転写因子遺伝子について広く検討するなかで、AP2/ERF転写制御因子遺伝子の一つであるCEF2又はCEF4遺伝子の機能を木質繊維細胞において強化した植物体を作製したところ、主にセルロースから成る一次細胞壁が大きく肥厚することを見出した。また、これらと共通する保存モチーフを持つ転写制御遺伝子の一つである、CEF1又はCEF3又はCEF5又はCEF6遺伝子も同様の機能を持つことを見出した。以上の知見から、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は、
〔１〕対象となる植物の木質繊維細胞内において、下記(ア)～(オ)のいずれかに示される転写制御因子の機能を強化する工程を含む、増加したセルロースを含有する植物の生産方法に関する；
(ア)配列番号１、３、３３、３５、３７、又は、３９に示されるアミノ酸配列からなる転写制御因子、
(イ)配列番号１、３、３３、３５、３７、又は、３９に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しており、かつ、セルロースの合成を制御する活性を有する転写制御因子、
(ウ)配列番号１、３、３３、３５、３７、又は、３９に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなる転写制御因子であって、かつ、セルロースの合成を制御する活性を有する転写制御因子、
(エ)配列番号２、４、３４、３６、３８、又は、４０に示される塩基配列によりコードされる転写制御因子、
(オ)配列番号２、４、３４、３６、３８、又は、４０に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされる転写制御因子であり、かつ、セルロースの合成量を制御する活性を有する転写制御因子。
　また、本発明は、一実施の形態においては、下記方法に関する。
〔１’〕対象となる植物の木質繊維細胞内において、下記(ア’)～(ミ’)のいずれかに示される転写制御因子の機能を強化する工程を含む、増加したセルロースを含有する植物の生産方法；
（ア’）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる転写制御因子、
（イ’）配列番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しており、かつ、セルロースの合成を制御する活性を有する転写制御因子、
（ウ’）配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなる転写因子であって、かつ、セルロースの合成を制御する活性を有する転写制御因子。
（エ’）配列番号２に示される塩基配列によりコードされる転写制御因子、
（オ’）配列番号２に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされる転写制御因子であり、かつ、セルロースの合成量を制御する活性を有する転写制御因子。
（カ’）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる転写制御因子、
（キ’）配列番号３に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しており、かつ、セルロースの合成を制御する活性を有する転写制御因子、
（ク’）配列番号３に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなる転写因子であって、かつ、セルロースの合成を制御する活性を有する転写制御因子。
（ケ’）配列番号４に示される塩基配列によりコードされる転写制御因子、
（コ’）配列番号４に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされる転写制御因子であり、かつ、セルロースの合成量を制御する活性を有する転写制御因子。
（サ’）配列番号３３に示されるアミノ酸配列からなる転写制御因子、
（シ’）配列番号３３に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しており、かつ、セルロースの合成を制御する活性を有する転写制御因子、
（ス’）配列番号３３に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなる転写因子であって、かつ、セルロースの合成を制御する活性を有する転写制御因子、
（セ’）配列番号３４に示される塩基配列によりコードされる転写制御因子、
（ソ’）配列番号３４に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされる転写制御因子であり、かつ、セルロースの合成量を制御する活性を有する転写制御因子、
（タ’）配列番号３５に示されるアミノ酸配列からなる転写制御因子、
（チ’）配列番号３５に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しており、かつ、セルロースの合成を制御する活性を有する転写制御因子、
（ツ’）配列番号３５に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなる転写因子であって、かつ、セルロースの合成を制御する活性を有する転写制御因子、
（テ’）配列番号３６に示される塩基配列によりコードされる転写制御因子、
（ト’）配列番号３６に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされる転写制御因子であり、かつ、セルロースの合成量を制御する活性を有する転写制御因子、
（ナ’）配列番号３７に示されるアミノ酸配列からなる転写制御因子、
（ニ’）配列番号３７に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しており、かつ、セルロースの合成を制御する活性を有する転写制御因子、
（ヌ’）配列番号３７に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなる転写因子であって、かつ、セルロースの合成を制御する活性を有する転写制御因子、
（ネ’）配列番号３８に示される塩基配列によりコードされる転写制御因子、
（ノ’）配列番号３８に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされる転写制御因子であり、かつ、セルロースの合成量を制御する活性を有する転写制御因子、
（ハ’）配列番号３９に示されるアミノ酸配列からなる転写制御因子、
（ヒ’）配列番号３９に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しており、かつ、セルロースの合成を制御する活性を有する転写制御因子、
（フ’）配列番号３９に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなる転写因子であって、かつ、セルロースの合成を制御する活性を有する転写制御因子、
（ヘ’）配列番号４０に示される塩基配列によりコードされる転写制御因子、
（ホ’）配列番号４０に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされる転写制御因子であり、かつ、セルロースの合成量を制御する活性を有する転写制御因子、
（マ’）配列番号４１に示されるコンセンサスアミノ酸配列を有する転写制御因子、
（ミ’）配列番号４１に示されるコンセンサスアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加した配列を有し、かつ、セルロースの合成を制御する活性を有する転写制御因子。
　また、本発明の増加したセルロースを含有する植物の生産方法における一実施の形態によれば、
　〔２〕上記〔１〕に記載の植物の生産方法であって、
　前記転写制御因子の機能を強化する工程が、木質繊維細胞で遺伝子発現を誘導するプロモータの下流に、以下の(ａ)～(ｅ)のいずれかに記載の核酸が作動可能に連結された発現カセットを含むベクターを用いて、植物を形質転換する工程であることを特徴とする；
（ａ）配列番号１、３、３３、３５、３７、又は、３９に示される第一のアミノ酸配列と配列番号５に示される第二のアミノ酸配列とが連結したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、
（ｂ）前記(ａ)に記載の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有しており、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｃ）前記(ａ)の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、配列番号１及び／又は配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｄ）配列番号２、４、３４、３６、３８、又は、４０に示される第一の塩基配列と配列番号６に示される第二の塩基配列とが連結した塩基配列からなる核酸、
（ｅ）前記(ｄ)の核酸において、第一の塩基配列及び／又は第二の塩基配列が、配列番号２、４、３４、３６、３８、若しくは、４０及び／又は配列番号６に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸。
　また、本発明は、一実施の形態において、下記方法に関する。
〔２’〕上記〔１’〕に記載の植物の生産方法であって、
　前記転写制御因子の機能を強化する工程が、木質繊維細胞で遺伝子発現を誘導するプロモータの下流に、以下の(ａ’)～(ｍ’１)のいずれかに記載の核酸が作動可能に連結された発現カセットを含むベクターを用いて、植物を形質転換する工程であることを特徴とする；
（ａ’）配列番号１に示される第一のアミノ酸配列と配列番号５に示される第二のアミノ酸配列とが連結したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、
（ａ’１）前記(ａ’)に記載の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有しており、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ａ’２）前記(ａ’)の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、配列番号１及び／又は配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｂ’）配列番号２に示される第一の塩基配列と配列番号６に示される第二の塩基配列とが連結した塩基配列からなる核酸、
（ｂ’１）前記(ｂ’)の核酸において、第一の塩基配列及び／又は第二の塩基配列が、配列番号２及び／又は配列番号６に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｃ’）配列番号３に示される第一のアミノ酸配列と配列番号５に示される第二のアミノ酸配列とが連結したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、
（ｃ’１）前記(ｃ’)に記載の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有しており、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｃ’２）前記(ｃ’)の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、配列番号３及び／又は配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｄ’）配列番号４に示される第一の塩基配列と配列番号６に示される第二の塩基配列とが連結した塩基配列からなる核酸、
（ｄ’１）前記(ｄ’)の核酸において、第一の塩基配列及び／又は第二の塩基配列が、配列番号４及び／又は配列番号６に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸。
（ｅ’）配列番号３３に示される第一のアミノ酸配列と配列番号５に示される第二のアミノ酸配列とが連結したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、
（ｅ’１）前記(ｅ’)に記載の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有しており、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｅ’２）前記(ｅ’)の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、配列番号３３及び／又は配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｆ’）配列番号３４に示される第一の塩基配列と配列番号６に示される第二の塩基配列とが連結した塩基配列からなる核酸、
（ｆ’１）前記(ｆ’)の核酸において、第一の塩基配列及び／又は第二の塩基配列が、配列番号３４及び／又は配列番号６に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｇ’）配列番号３５に示される第一のアミノ酸配列と配列番号５に示される第二のアミノ酸配列とが連結したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、
（ｇ’１）前記(ｇ’)に記載の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有しており、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｇ’２）前記(ｇ’)の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、配列番号３５及び／又は配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｈ’）配列番号３６に示される第一の塩基配列と配列番号６に示される第二の塩基配列とが連結した塩基配列からなる核酸、
（ｈ’１）前記(ｈ’)の核酸において、第一の塩基配列及び／又は第二の塩基配列が、配列番号３６及び／又は配列番号６に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｉ’）配列番号３７に示される第一のアミノ酸配列と配列番号５に示される第二のアミノ酸配列とが連結したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、
（ｉ’１）前記(ｉ’)に記載の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有しており、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｉ’２）前記(ｉ’)の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、配列番号３７及び／又は配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｊ’）配列番号３８に示される第一の塩基配列と配列番号６に示される第二の塩基配列とが連結した塩基配列からなる核酸、
（ｊ’１）前記(ｊ’)の核酸において、第一の塩基配列及び／又は第二の塩基配列が、配列番号３８及び／又は配列番号６に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｋ’）配列番号３９に示される第一のアミノ酸配列と配列番号５に示される第二のアミノ酸配列とが連結したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、
（ｋ’１）前記(ｋ’)に記載の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有しており、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｋ’２）前記(ｋ’)の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、配列番号３９及び／又は配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｌ’）配列番号４０に示される第一の塩基配列と配列番号６に示される第二の塩基配列とが連結した塩基配列からなる核酸、
（ｌ’１）前記(ｌ’)の核酸において、第一の塩基配列及び／又は第二の塩基配列が、配列番号４０及び／又は配列番号６に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｍ’）配列番号４１に示される第一のアミノ酸配列を含むポリペプチドと配列番号５に示される第二のアミノ酸配列とが連結したアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸、
（ｍ’１）前記(ｍ’)に記載の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有しており、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸。
 
　また、本発明の増加したセルロースを含有する植物の生産方法における一実施の形態によれば、
　〔３〕上記〔２〕の生産方法において、木質繊維細胞で遺伝子発現を誘導するプロモータが、NST1又はNST3 遺伝子のプロモータであることを特徴とする。
　また、本発明の別の態様によれば、
　〔４〕上記〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の方法により生産された植物又はその子孫を用意する工程と、その少なくとも一部を取得して酵素糖化処理を施す工程とを含む、グルコースの製造方法に関する。
　また、本発明の別の態様によれば、
　〔５〕上記〔２〕又は〔３〕に記載の植物の生産方法に使用される発現カセットであって、木質繊維細胞で遺伝子発現を誘導するプロモータの下流に、以下の(ａ)～(ｅ)のいずれかに記載の核酸が作動可能に連結された発現カセットに関する；
（ａ）配列番号１、３、３３、３５、３７、又は、３９に示される第一のアミノ酸配列と配列番号５に示される第二のアミノ酸配列とが連結したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、
（ｂ）前記(ａ)に記載の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有しており、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｃ）前記(ａ)の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、配列番号１及び／又は配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｄ）配列番号２、４、３４、３６、３８、又は、４０に示される第一の塩基配列と配列番号６に示される第二の塩基配列とが連結した塩基配列からなる核酸、
（ｅ）前記(ｄ)の核酸において、第一の塩基配列及び／又は第二の塩基配列が、配列番号２、４、３４、３６、３８、若しくは、４０及び／又は配列番号６に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸。
　また、本発明は、一実施の形態において、下記方法に関する。
　〔５’〕上記〔２’〕又は〔３〕に記載の植物の生産方法に使用される発現カセットであって、木質繊維細胞で遺伝子発現を誘導するプロモータの下流に、以下の(ａ’)～(ｍ’１)のいずれかに記載の核酸が作動可能に連結された発現カセットに関する；
（ａ’）配列番号１に示される第一のアミノ酸配列と配列番号５に示される第二のアミノ酸配列とが連結したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、
（ａ’１）前記(ａ’)に記載の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有しており、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ａ’２）前記(ａ’)の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、配列番号１及び／又は配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｂ’）配列番号２に示される第一の塩基配列と配列番号６に示される第二の塩基配列とが連結した塩基配列からなる核酸、
（ｂ’１）前記(ｂ’)の核酸において、第一の塩基配列及び／又は第二の塩基配列が、配列番号２及び／又は配列番号６に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｃ’）配列番号３に示される第一のアミノ酸配列と配列番号５に示される第二のアミノ酸配列とが連結したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、
（ｃ’１）前記(ｃ’)に記載の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有しており、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｃ’２）前記(ｃ’)の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、配列番号３及び／又は配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｄ’）配列番号４に示される第一の塩基配列と配列番号６に示される第二の塩基配列とが連結した塩基配列からなる核酸、
（ｄ’１）前記(ｄ’)の核酸において、第一の塩基配列及び／又は第二の塩基配列が、配列番号４及び／又は配列番号６に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸。
（ｅ’）配列番号３３に示される第一のアミノ酸配列と配列番号５に示される第二のアミノ酸配列とが連結したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、
（ｅ’１）前記(ｅ’)に記載の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有しており、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｅ’２）前記(ｅ’)の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、配列番号３３及び／又は配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｆ’）配列番号３４に示される第一の塩基配列と配列番号６に示される第二の塩基配列とが連結した塩基配列からなる核酸、
（ｆ’１）前記(ｆ’)の核酸において、第一の塩基配列及び／又は第二の塩基配列が、配列番号３４及び／又は配列番号６に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｇ’）配列番号３５に示される第一のアミノ酸配列と配列番号５に示される第二のアミノ酸配列とが連結したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、
（ｇ’１）前記(ｇ’)に記載の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有しており、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｇ’２）前記(ｇ’)の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、配列番号３５及び／又は配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｈ’）配列番号３６に示される第一の塩基配列と配列番号６に示される第二の塩基配列とが連結した塩基配列からなる核酸、
（ｈ’１）前記(ｈ’)の核酸において、第一の塩基配列及び／又は第二の塩基配列が、配列番号３６及び／又は配列番号６に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｉ’）配列番号３７に示される第一のアミノ酸配列と配列番号５に示される第二のアミノ酸配列とが連結したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、
（ｉ’１）前記(ｉ’)に記載の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有しており、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｉ’２）前記(ｉ’)の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、配列番号３７及び／又は配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｊ’）配列番号３８に示される第一の塩基配列と配列番号６に示される第二の塩基配列とが連結した塩基配列からなる核酸、
（ｊ’１）前記(ｊ’)の核酸において、第一の塩基配列及び／又は第二の塩基配列が、配列番号３８及び／又は配列番号６に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｋ’）配列番号３９に示される第一のアミノ酸配列と配列番号５に示される第二のアミノ酸配列とが連結したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、
（ｋ’１）前記(ｋ’)に記載の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有しており、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｋ’２）前記(ｋ’)の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、配列番号３９及び／又は配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｌ’）配列番号４０に示される第一の塩基配列と配列番号６に示される第二の塩基配列とが連結した塩基配列からなる核酸、
（ｌ’１）前記(ｌ’)の核酸において、第一の塩基配列及び／又は第二の塩基配列が、配列番号４０及び／又は配列番号６に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｍ’）配列番号４１に示される第一のアミノ酸配列を含むポリペプチドと配列番号５に示される第二のアミノ酸配列とが連結したアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸、
（ｍ’１）前記(ｍ’)に記載の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有しており、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸。
　また、本発明の別の態様によれば、
　〔６〕上記〔５〕に記載の発現カセットを含むベクターに関する。
　また、本発明の別の態様によれば、
　〔７〕上記〔６〕に記載のベクターを含むキットに関する。
　また、本発明の別の態様によれば、
　〔８〕上記〔６〕に記載のベクターにより形質転換された、植物若しくはその子孫、又はそれらの一部に関する。
　本発明の植物の生産方法によれば、「CEF2遺伝子」、「CEF4遺伝子」、「CEF1遺伝子」、「CEF3遺伝子」、「CEF5遺伝子」、又は、「CEF6遺伝子」によりコードされる転写制御因子又はそのホモログの機能を強化することで一次細胞壁を肥厚させ、取り出しやすい形でセルロースの産生能が増強した植物を生産することが可能となる。これにより、植物一個体あたりから抽出できるセルロースの量を増加することができる。これらを増加できればバイオ燃料やマテリアル生産量を増やすことができる。
図１は、シロイヌナズナの野生株(Col-O)、nst1 nst3二重変異体、及び、nst1 nst3 NST3pro:CEF2-VP16株(CEF2転写因子にVP16転写活性化ドメインを付加してシロイヌナズナNST3プロモータによりシロイヌナズナnst1 nst3二重変異体において発現させた株)の茎を、それぞれ、明視野観察した画像(最上段)、紫外線下でリグニンの自家蛍光を観察した画像(２段目)、抗キシラン抗体により蛍光標識した画像(３段目)、結晶化セルロース結合タンパク質により蛍光標識した画像(最下段)を示す。　茎の横断切片における細胞壁の肥厚の様子を観察したところ、シロイヌナズナnst1 nst3二重変異体をCEF2-VP16をコードする核酸を含むベクターにより形質転換したシロイヌナズナ(以下、CEF2-VP16相補ラインともいう。)では野生株と同様の肥厚が見られた。しかし、紫外線下での自家蛍光によるリグニンの分布やキシラン抗体によるキシランの分布を観察したところ、いずれの存在も確認できなかった。一方で、結晶化セルロースの抗体により結晶化セルロースの分布を観察したところ、CEF2-VP16相補ラインでは野生株同様に結晶化セルロースの沈着が見られた。 図２は、シロイヌナズナの野生株(Col-O)、nst1 nst3二重変異体、及び、nst1 nst3 NST3pro:CEF4-VP16株(CEF4転写因子にVP16転写活性化ドメインを付加してシロイヌナズナNST3プロモータによりシロイヌナズナnst1 nst3二重変異体において発現させた株)の茎を、それぞれ、明視野観察した画像(上段)、リグニンの自家蛍光を観察した画像(下段)、を示す。　茎の横断切片における細胞壁の肥厚の様子を観察したところ、シロイヌナズナnst1 nst3二重変異体をCEF4-VP16をコードする核酸を含むベクターにより形質転換したシロイヌナズナ(以下、CEF4-VP16相補ラインともいう。)では野生株と同様の肥厚が見られた。しかし、紫外線下での自家蛍光によるリグニンの分布を観察したところ、その存在が確認できなかった。このことから、CEF4-VP16相補ラインでもCEF2-VP16相補ラインと同様に、セルロースを中心とした細胞壁が肥厚していると考えられる。 図３は、シロイヌナズナの野生株(Col-O)、nst1 nst3二重変異体、及び、CEF2-VP16相補ライン(DR2342-8)の茎の下部10cmの細胞壁含量を比較したグラフを示す。CEF2-VP16相補ラインでは細胞壁含量が、野生株と同等レベルまで回復していた。 図４は、シロイヌナズナの野生株(Col-O)、nst1 nst3二重変異体、及び、CEF2-VP16相補ライン(DR2342-8)の茎の下部10cmから抽出した細胞壁成分についてセルラーゼによる酵素糖化率(Saccharification efficiency)(図４(ａ))、鮮重量あたりのグルコース収量(Glc yield)(図４(ｂ))を比較したグラフを示す。CEF2-VP16相補ラインでは酵素糖化率が、一次細胞壁しか持たないnst1 nst3二重変異体と同等レベルにまで高まっているが、図３で示したように細胞壁含量は野生株と同等であるから、最終的なグルコース収量は野生株に比べて約70％(１.７倍)増えていた。 図５は、シロイヌナズナの野生株(Col-O)、nst1 nst3二重変異体、及び、CEF2-VP16相補ラインの茎から抽出したRNAを用いて、RT-PCRによりセルロース合成酵素遺伝子の発現を比較したグラフである。CEF2-VP16相補ラインでは一次細胞壁のセルロース合成に関与するCESA1、CESA3、CESA6の発現が亢進しているが、二次細胞壁のセルロース合成に関与するCESA4、CESA7、CESA8の発現はnst1 nst3二重変異体同様に低いままであった。 図６は、シロイヌナズナのプロトプラストにおいて、CEF2遺伝子、CEF2-VP16遺伝子、CEF2-SRDX(CEF2転写因子にSRDX転写抑制化ドメインを付加したもの)遺伝子を導入した際の一次細胞壁再生の様子をコントロールと比較してカルコフローホワイトで可視化した写真(図６(a))、および一定時間経過後のカルコフローホワイトでの蛍光強度の度合いを表現したグラフ(図６(b))である。CEF2遺伝子、CEF2-VP16遺伝子を導入したプロトプラストでは一次細胞壁の再生が亢進しているが、逆にCEF2-SRDX遺伝子を導入したプロトプラストでは抑制されている。 図７は、シロイヌナズナの野生株(Wild-type)、nst1 nst3二重変異体の茎を、それぞれ、明視野観察した画像(上段)、リグニンの自家蛍光を観察した画像(下段)、を示す。 図８はnst1 nst3 NST3pro:CEF1-VP16株(CEF1転写因子にVP16転写活性化ドメインを付加してシロイヌナズナNST3プロモータによりシロイヌナズナnst1 nst3二重変異体において発現させた株) 、nst1 nst3 NST3pro:CEF6-VP16株、nst1 nst3 NST3pro:CEF5-VP16株、nst1 nst3 NST3pro:CEF3-VP16株の茎を、それぞれ、明視野観察した画像(上段)、リグニンの自家蛍光を観察した画像(下段)、を示す。　茎の横断切片における細胞壁の肥厚の様子を観察したところ、シロイヌナズナnst1 nst3二重変異体をCEF1-VP16又はCEF6-VP16又はCEF5-VP16又はCEF3-VP16をコードする核酸を含むベクターにより形質転換したシロイヌナズナ(以下、CEF1-VP16相補ライン又はCEF6-VP16相補ライン又はCEF5-VP16相補ライン又はCEF3-VP16相補ラインともいう。)では野生株と同様の肥厚が見られた。しかし、紫外線下での自家蛍光によるリグニンの分布を観察したところ、その存在が確認できなかった。このことから、CEF1-VP16相補ライン又はCEF6-VP16相補ライン又はCEF5-VP16相補ライン又はCEF3-VP16相補ラインでもCEF2-VP16相補ラインと同様に、セルロースを中心とした細胞壁が肥厚していると考えられる。 図９は、シロイヌナズナの野生株(Wild-type)、nst1 nst3二重変異体、CEF4-VP16相補ライン、CEF5-VP16相補ライン、CEF6-VP16相補ライン、CEF1-VP16相補ライン、及び、CEF3-VP16相補ラインにおける茎の下部10cmの細胞壁含量(図８(ａ))、抽出した細胞壁成分についてセルラーゼによる酵素糖化率(Saccharification efficiency)(図８(ｂ))、鮮重量あたりのグルコース収量(Glc yield)(図８(ｃ))を比較したグラフを示す。CEF4-VP16相補ライン又はCEF5-VP16相補ライン又はCEF6-VP16相補ライン又はCEF1-VP16相補ライン又はCEF3-VP16相補ラインでは酵素糖化率が、一次細胞壁しか持たないnst1 nst3二重変異体と同等レベルにまで高まっているが、細胞壁含量は野生株と同等であるから、最終的なグルコース収量は野生株に比べて大幅に増えていた。
　以下、本発明をさらに詳細に説明する。
１．本発明における一次細胞壁を肥厚させてセルロースの蓄積を増強した植物について
（１）本発明における一次細胞壁を肥厚させてセルロースの蓄積を制御する遺伝子について
　本発明において植物に対して一次細胞壁を肥厚させてセルロースの蓄積を制御する遺伝子は、典型的には、シロイヌナズナ由来の配列番号２で表される「CEF2遺伝子」、配列番号４で表される「CEF4遺伝子」、配列番号３４で表される「CEF5遺伝子」、配列番号３６で表される「CEF3遺伝子」、配列番号３８で表される「CEF1遺伝子」、又は、配列番号４０で表される「CEF6遺伝子」である。「CEF2遺伝子」、「CEF4遺伝子」、「CEF5遺伝子」、「CEF3遺伝子」、「CEF1遺伝子」及び「CEF6遺伝子」によりコードされる「CEF2タンパク」、「CEF4タンパク」、「CEF5タンパク」、「CEF3タンパク」、「CEF1タンパク」及び「CEF6タンパク」は、同じAP2/ERFファミリーに属するタンパク質であり、配列番号４１で表される共通するコンセンサス配列を持つ。本願明細書において、一次細胞壁を肥厚させてセルロースの蓄積を制御する遺伝子として「CEF2遺伝子」、「CEF4遺伝子」、「CEF5遺伝子」、「CEF3遺伝子」、「CEF1遺伝子」、又は、「CEF6遺伝子」を意味する際には、配列番号２で示される「CEF2遺伝子」、配列番号４で示される「CEF4遺伝子」、配列番号３３で示される「CEF5遺伝子」、配列番号３５で示される「CEF3遺伝子」、配列番号３７で示される「CEF1遺伝子」、又は、配列番号３９で示される「CEF6遺伝子」に限られず、そのオルソログ、パラログなどのホモログやその塩基配列の一部に変異が導入されたものも含まれる。そして、当該「CEF2遺伝子」、「CEF4遺伝子」、「CEF5遺伝子」、「CEF3遺伝子」、「CEF1遺伝子」若しくは「CEF6遺伝子」又はそれらのホモログによりコードされるタンパク質(転写制御因子)の機能を強化することで、セルロースの生産能が向上した植物を得ることができる。
　たとえば「CEF2遺伝子」と「CEF4遺伝子」は、同じ機能を持っており、アライン可能領域内のアミノ酸レベルで約60％の相同性が認められる。このことから、シロイヌナズナ又は他の植物ゲノム中の相同遺伝子、又は一部に変異が導入された遺伝子のうちでも「CEF2遺伝子」又は「CEF4遺伝子」とアミノ酸レベルで少なくとも60％、好ましくは70％、80％、より好ましくは90％、のホモロジーを有する類似遺伝子であれば同様に用いられることが明らかである。また同一機能を保持している限り、そのフラグメントでもよい。そのような遺伝子は、アミノ酸配列では配列番号２又は配列番号４と少なくとも60％、好ましくは70％、80％、より好ましくは90％以上のホモロジーを有する。
（２）本発明における一次細胞壁が肥厚してセルロースが増強された形質を有する植物の作出方法
　本発明の増加したセルロースを含有する植物の生産方法は、「CEF2遺伝子」、「CEF4遺伝子」、「CEF5遺伝子」、「CEF3遺伝子」、「CEF1遺伝子」、又は、「CEF6遺伝子」によりコードされる転写制御因子の機能を強化する工程を含み、当該工程により増加したセルロースを含有する植物を得ることができる。
　本発明の増加したセルロースを含有する植物の生産方法において、機能強化の対象である「CEF2遺伝子」によりコードされる転写制御因子とは、例えば、下記(ア’)～(オ’)のように記載することができる；
（ア’）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる転写制御因子、
（イ’)配列番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、セルロースの蓄積を制御する活性を有する転写制御因子、
（ウ’）配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなる転写因子であって、かつ、セルロースの蓄積を制御する活性を有する転写制御因子。
（エ’）配列番号２に示される塩基配列によりコードされる転写制御因子、
（オ’）配列番号２に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされる転写制御因子であり、かつ、セルロースの発現量を制御する活性を有する転写制御因子。
　また、本発明の増加したセルロースを含有する植物の生産方法において、機能強化の対象である「CEF4遺伝子」によりコードされる転写制御因子とは、例えば、下記(カ’)～(コ’)のように記載することができる；
（カ’）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる転写制御因子、
（キ’）配列番号３に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、セルロースの蓄積を制御する活性を有する転写制御因子、
（ク’）配列番号３に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなる転写因子であって、かつ、セルロースの蓄積を制御する活性を有する転写制御因子。
（ケ’）配列番号４に示される塩基配列によりコードされる転写制御因子、
（コ’）配列番号４に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされる転写制御因子であり、かつ、セルロースの蓄積量を制御する活性を有する転写制御因子。
　また、本発明の増加したセルロースを含有する植物の生産方法において、機能強化の対象である「CEF5遺伝子」によりコードされる転写制御因子とは、例えば、下記(サ’)～(ソ’)のように記載することができる；
（サ’）配列番号３３に示されるアミノ酸配列からなる転写制御因子、
（シ’）配列番号３３に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、セルロースの蓄積を制御する活性を有する転写制御因子、
（ス’）配列番号３３に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなる転写因子であって、かつ、セルロースの蓄積を制御する活性を有する転写制御因子。
（セ’）配列番号３４に示される塩基配列によりコードされる転写制御因子、
（ソ’）配列番号３４に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされる転写制御因子であり、かつ、セルロースの蓄積量を制御する活性を有する転写制御因子。
　また、本発明の増加したセルロースを含有する植物の生産方法において、機能強化の対象である「CEF3遺伝子」によりコードされる転写制御因子とは、例えば、下記(タ’)～(ト’)のように記載することができる；
（タ’）配列番号３５に示されるアミノ酸配列からなる転写制御因子、
（チ’）配列番号３５に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、セルロースの蓄積を制御する活性を有する転写制御因子、
（ツ’）配列番号３５に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなる転写因子であって、かつ、セルロースの蓄積を制御する活性を有する転写制御因子。
（テ’）配列番号３６に示される塩基配列によりコードされる転写制御因子、
（ト’）配列番号３６に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされる転写制御因子であり、かつ、セルロースの蓄積量を制御する活性を有する転写制御因子。
　また、本発明の増加したセルロースを含有する植物の生産方法において、機能強化の対象である「CEF1遺伝子」によりコードされる転写制御因子とは、例えば、下記(ナ’)～(ノ’)のように記載することができる；
（ナ’）配列番号３７に示されるアミノ酸配列からなる転写制御因子、
（ニ’）配列番号３７に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、セルロースの蓄積を制御する活性を有する転写制御因子、
（ヌ’）配列番号３７に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなる転写因子であって、かつ、セルロースの蓄積を制御する活性を有する転写制御因子。
（ネ’）配列番号３８に示される塩基配列によりコードされる転写制御因子、
（ノ’）配列番号３８に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされる転写制御因子であり、かつ、セルロースの蓄積量を制御する活性を有する転写制御因子。
　また、本発明の増加したセルロースを含有する植物の生産方法において、機能強化の対象である「CEF6遺伝子」によりコードされる転写制御因子とは、例えば、下記(ハ’)～(ホ’)のように記載することができる；
（ハ’）配列番号３９に示されるアミノ酸配列からなる転写制御因子、
（ヒ’）配列番号３９に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、セルロースの蓄積を制御する活性を有する転写制御因子、
（フ’）配列番号３９に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなる転写因子であって、かつ、セルロースの蓄積を制御する活性を有する転写制御因子。
（ヘ’）配列番号４０に示される塩基配列によりコードされる転写制御因子、
（ホ’）配列番号４０に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされる転写制御因子であり、かつ、セルロースの蓄積量を制御する活性を有する転写制御因子。
　ここで、「アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加」しているとは、当該アミノ酸配列中のアミノ酸が、そのポリペプチドの構造又は機能に有意に影響することなく改変していることを指す。また、「数個」とは、2～50個，好ましくは2～20個、より好ましくは2～10個の変異が存在することを指す。
　また、上述のように、機能強化の対象となる転写制御因子としては、「CEF2遺伝子」又は「CEF4遺伝子」、「CEF5遺伝子」、「CEF3遺伝子」、「CEF1遺伝子」、又は、「CEF6遺伝子」によりコードされる転写制御因子のアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有し、かつ、セルロースの発現を制御する活性を有する転写制御因子も含まれる。また、同一の機能を保持している限り、「CEF2遺伝子」又は「CEF4遺伝子」又は「CEF5遺伝子」又は「CEF3遺伝子」又は「CEF1遺伝子」又は「CEF6遺伝子」によりコードされる転写制御因子のアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有する転写制御因子は、そのフラグメントであってもよい。「CEF2遺伝子」又は「CEF4遺伝子」又は「CEF5遺伝子」又は「CEF3遺伝子」又は「CEF1遺伝子」又は「CEF6遺伝子」によりコードされる転写制御因子のアミノ酸配列に対する同一性は、少なくとも60％、70％、80％であることが好ましい。
　ここで、「CEF2遺伝子」、「CEF4遺伝子」、「CEF5遺伝子」、「CEF3遺伝子」、「CEF1遺伝子」、又は、「CEF6遺伝子」によりコードされる転写制御因子のアミノ酸配列において、「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加したもの」や「少なくとも60％の同一性を有するもの」の例としては、以下に限定されないが、例えば、「CEF2遺伝子」、「CEF4遺伝子」、「CEF5遺伝子」、「CEF3遺伝子」、「CEF1遺伝子」、又は、「CEF6遺伝子」によりコードされる転写制御因子のアミノ酸配列同士をアライメントした際に、対応するアミノ酸同士が不一致となっている位置において、当該不一致となったアミノ酸へ互いに変異しているものを挙げることができる。なお、好ましい一実施の形態において、「CEF2遺伝子」、「CEF4遺伝子」、「CEF5遺伝子」、「CEF3遺伝子」、「CEF1遺伝子」、又は、「CEF6遺伝子」によりコードされる転写制御因子のアミノ酸配列において変異を有する配列は、配列番号４１に示されるコンセンサス配列を有するものである。
＜コンセンサス配列（配列番号４１）＞
[YF][RVK]G[VA]R[MKRQ]R[QSNTNAREK]WG[KRS]WV[SC]EIR[EQ]P[RKGN][KR][KR][STNKR]RIWLG[TS][FY][SPVADNE][TSKN][PA][DEQ][MK]A[AM][RS]A[HY]D[AV]AA[LMVIF][ASTCYH][IL][KR][GK][GTSANHRCDEK][SATPNKM]
　なお、上記コンセンサス配列中、[]は、[]内のいずれかのアミノ酸であることを示す。例えば、[MK]は、MまたはKのいずれかのアミノ酸であることを示す。
　また、ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、相同性が高い核酸、すなわち配列番号２、配列番号４、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、又は、配列番号４０に示す塩基配列と90％以上、好ましくは95％以上の相同性を有する塩基配列からなるDNAの相補鎖がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸の相補鎖がハイブリダイズしない条件が挙げられる。このようなストリンジェントな条件については、T.Maniatisら編、Molecular Cloning:A Laboratory Manual 2nd ed.(1989)Cold Spring Harbor Laboratoryなどに記載の通常のハイブリダイゼーション操作におけるTm値を高めた条件として当業者には自明である。例えば、0.5％SDS、5×デンハルツ［Denhardt’s,0.1％ウシ血清アルブミン(BSA)、0.1％ポリビニルピロリドン、0.1％フィコール400］及び100μg/mlサケ精子DNAを含む6×SSC(1×SSCは0.15M NaCl、0.015Mクエン酸ナトリウム、pH7.0)中で、50℃で4時間～一晩保温を行う条件などである。
　また、本発明の対象となる植物としては、イモ類、豆類、ナス科類などの双子葉植物一般に適用できるが、特にバイオマス資源の観点からは、ポプラ、ユーカリ、アカシアなどの双子葉木本植物が好ましい。ただし、本発明は、これらの植物に限定されるものではなく、ミスカンザス、エリアンサス、ダンチク、ソルガム、ススキなどの単子葉エネルギー植物の育種一般にも適用できる。
　本発明によれば、例えば、上記に列挙するような植物について、増加したセルロースを含有する植物を得ることができる。また、本明細書において、「植物の子孫」というとき、当該植物の有性生殖又は無性生殖により得られる子孫をいい、当該植物のクローンを含む。例えば、当該植物体やその子孫から繁殖材料(例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等)を得て、それらを基に当該植物の子孫を作出することが可能である。また、本明細書において、「植物若しくはその子孫、又はそれらの一部」というときは、特別な場合を除き、当該植物又はその子孫の植物における、種子(発芽種子、未熟種子を含む)、器官又はその部分(葉、根、茎、花、雄蕊、雌蘂、それらの片を含む)、植物培養細胞、カルス、プロトプラストを含む。
　また、本明細書において、「セルロースの合成を制御する活性」とは、「CEF2遺伝子」、「CEF4遺伝子」、「CEF5遺伝子」、「CEF3遺伝子」、「CEF1遺伝子」、又は、「CEF6遺伝子」によりコードされる転写制御因子が本来的に備えているセルロースの生合成に関係する遺伝子の転写制御活性をいう。本明細書においては、とりわけ、当該転写制御因子又はそのホモログや変異体において、その機能を強化した際に、植物体内においてセルロースの合成が増す場合、当該転写制御因子若しくはそのホモログ、又はそれらの変異体は、セルロースの合成を制御する活性を有しているということができる。また、当該転写制御因子が本来的に備えている転写の制御活性は、当該転写制御因子の機能と同義で使用される。
　転写制御因子の機能を強化する手法は、植物体内における目的の転写因子の遺伝子又はタンパク質の発現を増強することであっても、当該転写因子により制御される下流の標的遺伝子の発現を増強させることであってもよい。なお、転写制御因子の機能を強化する方法は、当該分野において周知の技術が用いられればよく、当該転写制御因子をコードする遺伝子の発現増強、当該転写制御因子をコードする遺伝子に転写活性化ドメインをコードする遺伝子を付加するなどを挙げることができるが、これらに限定されない。
　なお、本発明において、転写制御因子の機能を強化する場合、好ましくは、植物の木質繊維細胞特異的に当該転写因子の機能を強化する手法である。そのような手法は、当業者であれば、例えば、プロモータとともに核酸を導入する手法において、木質繊維細胞特異的プロモータの利用などにより適宜実施することができる。
　なお、以下では、本発明の一実施の形態である転写活性化ドメインを付加する手法を用いた「CEF2遺伝子」によりコードされる転写制御因子の機能を強化する方法を、一例として具体的に説明する。しかしながら、本発明は、下記で説明する手法に限られず、「CEF2遺伝子」、「CEF4遺伝子」、「CEF5遺伝子」、「CEF1遺伝子」、「CEF3遺伝子」若しくは「CEF6遺伝子」、又は、それらのホモログ(オルソログ及びパラログを含む)によりコードされる転写制御因子の機能を強化できる方法であれば上記に挙げたものを含めて採用することができる。
　本発明の一実施の形態である転写活性化ドメインを付加する手法を用いた形質転換植物の作出方法では、シロイヌナズナ由来の「CEF2遺伝子」によりコードされる転写制御因子に「転写活性化ドメイン」が付加されたポリペプチドをコードする核酸を使用することができる。転写活性化ドメインとして用いられるポリペプチドとしてはVP16(配列番号５)が好ましく用いられている。
　本発明の一実施の形態において、転写活性化ドメインを付加する手法を用いて「CEF2遺伝子」の機能を強化する場合、セルロース増強形質を発現するために導入される核酸(導入遺伝子)は、例えば、以下のように表現することができる；
（ａ’）配列番号１に示される第一のアミノ酸配列と配列番号５に示される第二のアミノ酸配列とが連結したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、
（ａ’１）前記(ａ’)に記載の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有しており、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ａ’２）前記(ａ’)の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、配列番号１及び／又は配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｂ’）配列番号２に示される第一の塩基配列と配列番号６に示される第二の塩基配列とが連結した塩基配列からなる核酸、
（ｂ’１）前記(ｂ’)の核酸において、第一の塩基配列及び／又は第二の塩基配列が、配列番号２及び／又は配列番号６に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸。
　なお、本発明の一実施の形態において、転写活性化ドメインを付加する手法を用いて「CEF4遺伝子」の機能を強化する場合、セルロース増強形質を発現するために導入される核酸(導入遺伝子)は、例えば、以下のように表現することができる；
（ｃ’）配列番号３に示される第一のアミノ酸配列と配列番号５に示される第二のアミノ酸配列とが連結したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、
（ｃ’１）前記(ｃ’)に記載の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有しており、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｃ’２）前記(ｃ’)の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、配列番号３及び／又は配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｄ’）配列番号４に示される第一の塩基配列と配列番号６に示される第二の塩基配列とが連結した塩基配列からなる核酸、
（ｄ’１）前記(ｄ’)の核酸において、第一の塩基配列及び／又は第二の塩基配列が、配列番号４及び／又は配列番号６に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸。
　なお、本発明の一実施の形態において、転写活性化ドメインを付加する手法を用いて「CEF5遺伝子」の機能を強化する場合、セルロース増強形質を発現するために導入される核酸(導入遺伝子)は、例えば、以下のように表現することができる；
（ｅ’）配列番号３３に示される第一のアミノ酸配列と配列番号５に示される第二のアミノ酸配列とが連結したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、
（ｅ’１）前記(ｅ’)に記載の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有しており、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｅ’２）前記(ｅ’)の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、配列番号３３及び／又は配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｆ’）配列番号３４に示される第一の塩基配列と配列番号６に示される第二の塩基配列とが連結した塩基配列からなる核酸、
（ｆ’１）前記(ｆ’)の核酸において、第一の塩基配列及び／又は第二の塩基配列が、配列番号３４及び／又は配列番号６に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸。
　なお、本発明の一実施の形態において、転写活性化ドメインを付加する手法を用いて「CEF3遺伝子」の機能を強化する場合、セルロース増強形質を発現するために導入される核酸(導入遺伝子)は、例えば、以下のように表現することができる；
（ｇ’）配列番号３５に示される第一のアミノ酸配列と配列番号５に示される第二のアミノ酸配列とが連結したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、
（ｇ’１）前記(ｇ’)に記載の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有しており、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｇ’２）前記(ｇ’)の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、配列番号３５及び／又は配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｈ’）配列番号３６に示される第一の塩基配列と配列番号６に示される第二の塩基配列とが連結した塩基配列からなる核酸、
（ｈ’１）前記(ｈ’)の核酸において、第一の塩基配列及び／又は第二の塩基配列が、配列番号３６及び／又は配列番号６に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸。
　なお、本発明の一実施の形態において、転写活性化ドメインを付加する手法を用いて「CEF1遺伝子」の機能を強化する場合、セルロース増強形質を発現するために導入される核酸(導入遺伝子)は、例えば、以下のように表現することができる；
（ｉ’）配列番号３７に示される第一のアミノ酸配列と配列番号５に示される第二のアミノ酸配列とが連結したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、
（ｉ’１）前記(ｉ’)に記載の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有しており、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｉ’２）前記(ｉ’)の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、配列番号３７及び／又は配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｊ’）配列番号３８に示される第一の塩基配列と配列番号６に示される第二の塩基配列とが連結した塩基配列からなる核酸、
（ｊ’１）前記(ｊ’)の核酸において、第一の塩基配列及び／又は第二の塩基配列が、配列番号３８及び／又は配列番号６に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸。
　なお、本発明の一実施の形態において、転写活性化ドメインを付加する手法を用いて「CEF6遺伝子」の機能を強化する場合、セルロース増強形質を発現するために導入される核酸(導入遺伝子)は、例えば、以下のように表現することができる；
（ｋ’）配列番号３９に示される第一のアミノ酸配列と配列番号５に示される第二のアミノ酸配列とが連結したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、
（ｋ’１）前記(ｋ’)に記載の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有しており、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｋ’２）前記(ｋ’)の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、配列番号３９及び／又は配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｌ’）配列番号４０に示される第一の塩基配列と配列番号６に示される第二の塩基配列とが連結した塩基配列からなる核酸、
（ｌ’１）前記(ｌ’)の核酸において、第一の塩基配列及び／又は第二の塩基配列が、配列番号４０及び／又は配列番号６に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸。
　ここで、「配列番号１に示される第一のアミノ酸配列」、「配列番号３に示される第一のアミノ酸配列」、「配列番号３３に示される第一のアミノ酸配列」、「配列番号３５に示される第一のアミノ酸配列」、「配列番号３７に示される第一のアミノ酸配列」、又は、「配列番号３９に示される第一のアミノ酸配列」とは、「CEF2遺伝子」、「CEF4遺伝子」、「CEF5遺伝子」、「CEF3遺伝子」、「CEF1遺伝子」、又は、「CEF6遺伝子」によりコードされる転写制御因子のアミノ酸配列であって、第二のアミノ酸配列とインフレームに連結するためにそのＣ末端側の一部を欠いていてもよいアミノ酸配列である。本発明に使用される「CEF2遺伝子」、「CEF4遺伝子」、「CEF5遺伝子」、「CEF3遺伝子」、「CEF1遺伝子」、又は、「CEF6遺伝子」によりコードされる転写制御因子のアミノ酸配列」としては、配列番号１、配列番号３、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、又は、配列番号３９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド以外に、下記(ｉ)又は(ｉｉ)のいずれかであって、かつ、「CEF2遺伝子」、「CEF4遺伝子」、「CEF5遺伝子」、「CEF3遺伝子」、「CEF1遺伝子」、又は、「CEF6遺伝子」によりコードされる転写制御因子の機能を有するポリペプチドも含まれる；（ｉ）当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加したもの、又は、（ｉｉ）当該アミノ酸配列であって、少なくとも60％、より好ましくは、70％、80％、さらに好ましくは、90％以上の同一性を有するアミノ酸配列。本発明の一実施の形態である転写活性化ドメインを付加する手法を用いた植物の作出方法において、「CEF2遺伝子」、「CEF4遺伝子」、「CEF5遺伝子」、「CEF3遺伝子」、「CEF1遺伝子」、又は、「CEF6遺伝子」によりコードされる転写制御因子の機能を有するポリペプチドという場合、好ましくは、当該転写制御因子のDNA結合能を有するポリペプチドである。すなわち、当該転写制御因子のDNA結合領域を含むポリペプチドであれば、当該転写制御因子の断片のアミノ酸配列も、本発明に使用される「CEF2遺伝子」によりコードされる転写制御因子のアミノ酸配列に含まれる。
　また、「配列番号５に示される第二のアミノ酸配列」とは、「CEF2遺伝子」によりコードされる転写制御因子の機能を強化するために付加される「転写活性化ドメイン」である。本発明に使用される「転写活性化ドメイン」としては、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド以外に、下記(ｉ)又は(ｉｉ)のいずれかであって、かつ、第一のアミノ酸配列によりコードされる転写制御因子の機能を強化可能なポリペプチドも含まれる；（ｉ）当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加したもの、又は、（ｉｉ）当該アミノ酸配列であって、少なくとも80％以上、より好ましくは、90％以上、さらに好ましくは95％の同一性を有するアミノ酸配列。
　すなわち、上記(ａ’２)には、下記の一形態が含まれる：
（ａ’２－１）前記(ａ’)の核酸において、第一のアミノ酸配列が、配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％(より好ましくは、70％以上、80％以上、さらに好ましくは、90％以上)の同一性を有するアミノ酸配列からなり、
（ａ’２－２）前記(ａ’)の核酸において、第二のアミノ酸配列が、配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも80％(より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上)の同一性を有するアミノ酸配列からなり、
　かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸。
　また、上記(ｃ’２)には、下記の一形態が含まれる：
（ｃ’２－１）前記(ｃ’)の核酸において、第一のアミノ酸配列が、配列番号３に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％(より好ましくは、70％以上、80％以上、さらに好ましくは、90％以上)の同一性を有するアミノ酸配列からなり、
（ｃ’２―２）前記(ｃ’)の核酸において、第二のアミノ酸配列が、配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも80％(より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上)の同一性を有するアミノ酸配列からなり、
　かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸。
　また、上記(ｅ’２)には、下記の一形態が含まれる：
（ｅ’２－１）前記(ｅ’)の核酸において、第一のアミノ酸配列が、配列番号３３に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％(より好ましくは、70％以上、80％以上、さらに好ましくは、90％以上)の同一性を有するアミノ酸配列からなり、
（ｅ’２―２）前記(ｅ’)の核酸において、第二のアミノ酸配列が、配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも80％(より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上)の同一性を有するアミノ酸配列からなり、
　かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸。
　また、上記(ｇ’２)には、下記の一形態が含まれる：
（ｇ’２－１）前記(ｇ’)の核酸において、第一のアミノ酸配列が、配列番号３５に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％(より好ましくは、70％以上、80％以上、さらに好ましくは、90％以上)の同一性を有するアミノ酸配列からなり、
（ｇ’２―２）前記(ｇ’)の核酸において、第二のアミノ酸配列が、配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも80％(より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上)の同一性を有するアミノ酸配列からなり、
　かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸。
　また、上記(ｉ’２)には、下記の一形態が含まれる：
（ｉ’２－１）前記(ｉ’)の核酸において、第一のアミノ酸配列が、配列番号３７に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％(より好ましくは、70％以上、80％以上、さらに好ましくは、90％以上)の同一性を有するアミノ酸配列からなり、
（ｉ’２―２）前記(ｉ’)の核酸において、第二のアミノ酸配列が、配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも80％(より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上)の同一性を有するアミノ酸配列からなり、
　かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸。
　また、上記(ｋ’２)には、下記の一形態が含まれる：
（ｋ’２－１）前記(ｋ’)の核酸において、第一のアミノ酸配列が、配列番号３３に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％(より好ましくは、70％以上、80％以上、さらに好ましくは、90％以上)の同一性を有するアミノ酸配列からなり、
（ｋ’２―２）前記(ｋ’)の核酸において、第二のアミノ酸配列が、配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも80％(より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上)の同一性を有するアミノ酸配列からなり、
　かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸。
　また、「第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有する」というとき、第一のアミノ酸配列と第二のアミノ酸配列とが連結したアミノ酸配列において、（１）第一のアミノ酸配列の部分が１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有する場合、（２）第二のアミノ酸配列の部分が１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有する場合、及び、（３）第一のアミノ酸配列と第二のアミノ酸配列とが連結したアミノ酸配列全体において、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有する場合、を含む。
　また、「第一の塩基配列及び／又は第二の塩基配列が、配列番号２及び／又は配列番号６に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列である」というとき、第一の塩基配列及び第二の塩基配列とが連結した塩基配列において、（４）第一の塩基配列の部分が、配列番号２に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列である場合、（５）第二の塩基配列の部分が、配列番号６に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列である場合、及び、（６）第一の塩基配列及び第二の塩基配列とが連結した塩基配列全体が、配列番号２に示される塩基配列と配列番号６に示される塩基配列とが連結した塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列である場合、を含む。なお、「第一の塩基配列及び／又は第二の塩基配列が、配列番号４及び／又は配列番号６に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列である」というときも「第一の塩基配列及び／又は第二の塩基配列が、配列番号３４及び／又は配列番号６に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列である」というときも「第一の塩基配列及び／又は第二の塩基配列が、配列番号３６及び／又は配列番号６に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列である」というときも「第一の塩基配列及び／又は第二の塩基配列が、配列番号３８及び／又は配列番号６に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列である」というときも「第一の塩基配列及び／又は第二の塩基配列が、配列番号４０及び／又は配列番号６に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列である」というときも同様に上記(４)～(６)の場合を含む。
　また、「第一のアミノ酸配列」と「第二のアミノ酸配列」、又は「第一の塩基配列」と「第二の塩基配列」は、それぞれ、「ポリペプチドリンカー」又は「ポリヌクレオチドリンカー」を介して連結されていてもよい。なお、当該リンカーの使用は必須ではなく、必要に応じて適宜設計・使用することができる。当該リンカーのアミノ酸配列又は塩基配列は、当該転写制御因子の機能を強化可能なポリペプチドを産生できる限りにおいて特に限定されず、例えば、配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドリンカー又は配列番号８に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドリンカーを好適に使用することができる。また、リンカーには、ベクターへの当該転写制御因子のゲートウェイクローニングの結果によって生じた配列を含ませることもできる。例えば、ゲートウェイLR反応によって生じたattＢ配列などを含ませることができる。従って、リンカーは上記の配列に限定されず、使用するベクターの種類等により、当業者であれば適宜好ましいリンカーを設計可能である。
　なお、第一のアミノ酸配列又は塩基配列と、第二のアミノ酸配列又は塩基配列との配置の順序は、どちらがＮ末側又は５’側に配置されてもよい。好ましくは、Ｎ末側又は５’側より、（１）第一のアミノ酸配列又は塩基配列、（２）ポリペプチドリンカー又はポリヌクレオチドリンカー、（３）第二のアミノ酸配列又は塩基配列の順である。なお、(１)と(３)の位置を入れ替える際には、１つのポリペプチドとして翻訳されるように、適宜開始コドンや終止コドンの設計を行う。
　また、本明細書において、「発現カセット」とは、そのカセットに内包された核酸(主に、遺伝子又はその断片)を発現することのできる一つの発現系単位をいう。発現カセットは、前記核酸を含む領域の他に、遺伝子発現に必要な発現調節領域を有する。そのような発現調節領域には、例えば、プロモータ及びターミネータが含まれる。また、その他の構成として、エンハンサ、ポリＡ付加シグナル、5’-UTR(非翻訳領域)、標識若しくは選抜マーカー遺伝子、マルチクローニング部位、複製開始点等を含むことができる。発現カセットには、特定の遺伝子等を発現させる上で必要な一つの発現系単位をゲノム上からそのまま取り出したものや、様々な生物由来の発現調節領域等を組み合わせる等して人工的に構築したものが存在する。本発明においては、いずれの発現カセットも利用することが可能である。また、上述する発現調節領域の構成については、本明細書中に記載のない限り、当該分野において公知の構成を適宜選択することが可能である。
　本明細書において「発現カセット」は、目的とする植物内の「CEF2遺伝子」などによりコードされる転写制御因子の活性を強化する効果を提供し、その植物においてセルロースの合成量を増加させる機能を有する。
（２－１）転写活性化ドメインを付加する手法によりセルロースの合成が増強された植物の作出方法
　転写活性化ドメインを付加する手法において用いられる導入遺伝子を発現させるためのプロモータは、「木質繊維細胞において遺伝子発現を誘導するプロモータ」であり、具体的には、NST3プロモータもしくはそのオルソログ遺伝子のプロモータ、NST結合配列(SNBE)を繰り返してコアプロモータの上流に配置した人工プロモータ、二次細胞壁セルロース合成酵素のプロモータ、リグニン合成に関与する酵素類のプロモータ、キシラン合成に関与する酵素類のプロモータである。特に、シロイヌナズナ由来のNST1及びNST3遺伝子のプロモータが、木質繊維細胞特異的に強い発現を促す点において好ましい。
　導入遺伝子を木質繊維細胞で発現するプロモータの下流に配置したコンストラクト(組換えベクター)を構築し、野生株もしくはNST転写因子もしくはそのオルソログ転写因子遺伝子の機能が抑制された植物に形質転換して作製する。
　本明細書において「ベクター」とは上記発現カセットを含むものであって、上記発現カセットに含まれる塩基配列からなる核酸の増殖に使用される大腸菌等へ導入されるベクターや、植物の形質転換を行うためのベクターを含む。本発明に使用されるベクターとしては、当該分野において公知のベクターを使用でき、導入する植物やベクターの使用する手法・目的に応じて適宜選択すればよい。ベクターとしては、例えば、下記実施例にて使用されるpDEST_NST3p_VP16_HSP_GWB5などを使用することができるが、これに限定されない。
　本発明は、一つの態様として、増加したセルロースを含有する植物を生産するためのキットを提供する。当該キットの具体例としては、CEF2遺伝子」、「CEF4遺伝子」、「CEF1遺伝子」、「CEF3遺伝子」、「CEF5遺伝子」、又は、「CEF6遺伝子」によりコードされる転写制御因子の機能を強化するために使用されるベクターを挙げることができる。このようなベクターを含むキットとしては、木質繊維細胞で遺伝子発現を誘導するプロモータの下流に、上記(ａ)～(ｅ)のいずれかに記載の核酸が作動可能に連結された発現カセットを含むベクターを少なくとも含んでいればよく、当該ベクターを植物細胞に導入するための試薬群を含んでいればより好ましい。当該試薬群としては、形質転換の種類に応じた酵素やバッファー等を挙げることができる。その他、必要に応じてマイクロ遠心チューブ等の実験用素材が添付されていてもよい。
　遺伝子又は組換えベクターを植物中に導入する方法としては、アグロバクテリウム法が典型的であるが、PEG-リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポソーム法、パーティクルガン法、マイクロインジェクション法等、従来周知の方法が適用できる。
（３）「CEF2遺伝子」によりコードされる転写制御因子の機能が強化された植物の形質的特徴の評価
（３－１）酵素糖化性の評価
　CEF2遺伝子」、「CEF4遺伝子」、「CEF1遺伝子」、「CEF3遺伝子」、「CEF5遺伝子」、又は、「CEF6遺伝子」によりコードされる転写制御因子の機能が強化された植物においては、下記の実施例で示すように、一次細胞壁中のセルロース(すなわち、取り出しやすいセルロース)の合成量が増加する。増加したそのようなセルロースを評価するには、例えば、「酵素糖化処理」によりグルコースを得て、得られたグルコースの量を測定することにより間接的に評価することができる。
　「酵素糖化処理」は、細胞壁成分に含まれるセルロースからどれだけ容易にグルコースを抽出できるかを評価するための周知の手法であり、セルラーゼが触媒する酵素反応によって遊離されたグルコースを取得する。
　下記の実施例により得られたCEF2-VP16相補ラインシロイヌナズナ植物の花茎の下部10cmをサンプリングして細胞壁精製粉末を得た後、酵素糖化処理を行い、鮮重量あたりで得られるグルコースの量を比較したところ、CEF2-VP16相補ラインでは野生株よりも約70％(１．７倍)も多く得られることがわかった(図４)。
　このように、本発明により得られる、セルロースの蓄積量が増加した植物は、好ましい実施形態において、野生株と比較した際に、30％(１.３倍)以上、好ましくは50％(１.５倍)以上、より好ましくは70％(１.７倍)以上取り出しやすい形で増加したセルロースを含有する。
（３－２）下流遺伝子発現の評価
　「CEF2遺伝子」、「CEF4遺伝子」、「CEF1遺伝子」、「CEF3遺伝子」、「CEF5遺伝子」、又は、「CEF6遺伝子」によりコードされる転写制御因子の機能が強化された植物においては、細胞壁が肥厚しており取り出しやすいセルロースの合成量が増加する。肥厚した細胞壁が一次細胞壁であるか二次細胞壁であるかは、下流遺伝子の発現プロファイルを調べることで推定することができる。
　CEF2-VP16相補ラインシロイヌナズナ植物の花茎からRNAを抽出して、一次細胞壁、二次細胞壁に含まれるセルロースそれぞれに特異的なセルロース合成酵素の発現をRT-PCRによって調べたところ、一次細胞壁のセルロース合成に関与するセルロース合成酵素の発現が、CEF2-VP16相補ラインにおいて、元株であるnst1 nst3二重変異体に比べて明らかに上昇していた(図５)。一方で二次細胞壁のセルロース合成に関与するセルロース合成酵素の発現は変化していなかった(図５)。
　このことから、本発明により得られる、セルロースの蓄積量が増加した植物では一次細胞壁が肥厚していると推定された。
２．その他
　本発明におけるその他の用語や概念は、当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものであり、本発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学的技術はJ. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis, Molecular Cloning： A Laboratory Manual (2nd edition), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989); D. M. Glover et al. ed., DNA Cloning, 2nd ed., Vol. 1 to 4, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995)などに記載の方法により、又はそれらと実質的に同様な方法や改変法により行うことができる。また、本発明で使用する各種蛋白質やペプチド、あるいはそれらをコードするDNAについては、既存のデータベース(URL：http：//www.arabidopsis.org/又はhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=pubmed等)から入手することができる。
　なお、本明細書中に引用した技術文献、特許公報及び特許出願明細書中の記載内容は、本発明の記載内容として参照されるものとする。
　以下、本発明の実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
（実施例１）ProNST3：CEF2-VP16、ProNST3：CEF4-VP16、ProNST3：CEF5-VP16、ProNST3：CEF3-VP16、ProNST3：CEF1-VP16、又は、ProNST3：CEF6-VP16で形質転換したnst1 nst3二重変異体シロイヌナズナ植物体の作成
（１－１）形質転換ベクターProNST3：CEF2-VP16、ProNST3：CEF4-VP16、ProNST3：CEF5-VP16、ProNST3：CEF3-VP16、ProNST3：CEF1-VP16、又は、ProNST3：CEF6-VP16の構築
　以下のように形質転換ベクターを構築した。
　終止コドンを除いたシロイヌナズナ由来のCEF2又はCEF4タンパク質コード領域を下記のオリゴヌクレオチドペアをプライマーとしたPCRで増幅し、ゲートウェイドナーベクターpDONR207ベクター(インビトロジェン社)に、BPクロナーゼによってクローニングした。
5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctccATGGGAAAACAAATCAACATAGAGAGTAG-3’(CEF2、配列番号９)
5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcGTCATTTTGCCAATTAAACGGCTCTTCAAA-3’(CEF2、配列番号１０)
5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctccATGGCAGAGGAATACTACAGCCTCCGCTC-3’(CEF4、配列番号１１)
5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcGAGATCCCATGACAAGCCATGGCCAAAATT-3’(CEF4、配列番号１２)
5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcATGACCGAGTCATCCATTATCTCCGTC-3’(CEF5、配列番号４２)
5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggttAGGAAAAAGGGGGCCAAAATTGGAAGAGTC-3’(CEF5、配列番号４３)
5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcATGATAGCTTCAGAGAGTACCAAG-3’(CEF3、配列番号４４)
5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggttATAATTATACAGTCCTTGAAGATCCC-3’(CEF3、配列番号４５)
5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcATGGAACGTGACGACTGCCGGAGATT-3’(CEF1、配列番号４６)
5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggttGTAACTTTGAGAGAGGAAGGGTTCTT-3’(CEF1、配列番号４７)
5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcATGACGTCACTCAACAGCTCTGCATCA-3’(CEF6、配列番号４８)
5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggttGTGATTAAAGCTCCACAATTCCAG-3’(CEF6、配列番号４９)
　つぎに非特許文献４に記載のpDEST_NST3p_VP16_HSP_GWB5ベクターにLRクロナーゼによって上記CEF2遺伝子」、「CEF4遺伝子」、「CEF1遺伝子」、「CEF3遺伝子」、「CEF5遺伝子」、又は、「CEF6遺伝子」のタンパク質コード領域を移し変えることによって、形質転換に使用したベクターを構築した。
　なお、pDEST_NST3p_VP16_HSP_GWB5ベクターには、NST3プロモータの下流に「CEF2遺伝子」、「CEF4遺伝子」、「CEF1遺伝子」、「CEF3遺伝子」、「CEF5遺伝子」、又は、「CEF6遺伝子」のタンパク質コード領域とVP16転写活性化ドメインをコードする塩基配列とがポリヌクレオチドリンカーを介して連結された状態で配置されている。これにより、当該ベクターを用いて形質転換された植物の木質繊維細胞内では、配列番号１３(CEF2-VP16)、配列番号１４(CEF4-VP16)、配列番号５０(CEF5-VP16)、配列番号５１(CEF3-VP16)、配列番号５２(CEF1-VP16)、又は、配列番号５３(CEF6-VP16)に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが発現される。
（１－２）フローラルディップ法を用いたProNST3：CEF2-VP16、ProNST3：CEF4-VP16、ProNST3：CEF5-VP16、ProNST3：CEF3-VP16、ProNST3：CEF1-VP16、又は、ProNST3：CEF6-VP16によるシロイヌナズナnst1 nst3二重変異体の形質転換
　上記実施例(１－１)で得られたプラスミドを、土壌細菌(Agrobacterium tumefaciens strain GV3101(C58C1 Rifr)pMP90(Gmr)(koncz and Schell 1986))株にエレクトロポレーション法で導入した。導入した菌を200mlの抗生物質(スペクチノマイシン(Spe)50mg/L、ゲンタマイシン(Gm)25mg/L及びリファンピシリン(Rif)50mg/L)を含むLB培地で2日間培養した。
　次いで、培養液から菌体を回収し、500mlの浸潤培地(Infiltration medium;特許文献１を参照)に懸濁した。形質転換させる植物体として、米国シロイヌナズナバイオリソースセンター(ABRC)から取り寄せたT-DNAタグラインSALK_123077、SALK_149909を掛け合わせて作成したシロイヌナズナnst1 nst3二重変異体(非特許文献１を参照)を45日間～60日間育てて花を咲かせ、主茎を切った後にさらに10日間育て形質転換に用いた。形質転換は、当該シロイヌナズナnst1 nst3二重変異体を菌体を懸濁させた浸潤培地に2分間浸して感染させ、通常通り育成しT1種子を収穫した。そののち、T1種子を50％ブリーチ、0.02％Triton X-100溶液で7分間滅菌した後、滅菌水で3回リンスし、30mg/lのハイグロマイシン(Hg)を含むMS選択培地に播種した。
　上記ハイグロマイシンプレートで生育する形質転換植物体(ProNST3：CEF2-VP16 nst1 nst3, ProNST3：CEF4-VP16 nst1 nst3, ProNST3：CEF5-VP16 nst1 nst3, ProNST3：CEF3-VP16 nst1 nst3, ProNST3：CEF1-VP16 nst1 nst3, ProNST3：CEF6-VP16 nst1 nst3, T1)を選抜し、土壌に植え換えて生育し、種子を採取して播種し、次世代(T2)のシロイヌナズナ植物を得た。
（実施例２）ProNST3：CEF2-VP16 nst1 nst3シロイヌナズナ植物の花茎の切片観察
　上記実施例(１－２)で得られたProNST3：CEF2-VP16 nst1 nst3シロイヌナズナT1植物において播種後約80日で花茎を採取し、地上高約3cmのところで50μm厚の横断切片をバイブレーションミクロトームを用いて作成し、明視野条件化で木質繊維細胞の細胞壁を観察した。その結果、CEF2-VP16相補ラインでは野生株と同等レベルの細胞壁肥厚が見られた(図１)。一方、同横断切片を紫外線照射下に置きリグニンの自家蛍光を観察した。その結果、野生株では細胞壁肥厚が見られる木質繊維細胞及び維管束細胞で蛍光が観察されたのに対し、CEF2-VP16相補ラインでは維管束細胞でしか蛍光が認められなかった(図１)。また、同横断切片を抗キシラン抗体で抗体染色したところ、野生株では細胞壁肥厚が見られる木質繊維細胞及び維管束細胞で染色が観察されたのに対し、CEF2-VP16相補ラインでは維管束細胞でしか染色が認められなかった(図１)。しかし、同横断切片を結晶化セルロース結合タンパク質であるCBM3a(Plant probes社製)を用いて抗体染色したところ、CEF2-VP16相補ラインでも野生株と同様の染色が木質繊維細胞で認められた(図１)。このことは、CEF2-VP16相補ラインにおいて、セルロースが選択的に生産されていることを示している。
（実施例３）ProNST3：CEF4-VP16 nst1 nst3、ProNST3：CEF5-VP16 nst1 nst3、ProNST3：CEF3-VP16 nst1 nst3、ProNST3：CEF1-VP16 nst1 nst3、及びProNST3：CEF6-VP16 nst1 nst3シロイヌナズナ植物の花茎の切片観察
　上記実施例(１－２)で得られたProNST3：CEF4-VP16 nst1 nst3、ProNST3：CEF5-VP16 nst1 nst3、ProNST3：CEF3-VP16 nst1 nst3、ProNST3：CEF1-VP16 nst1 nst3、及びProNST3：CEF6-VP16 nst1 nst3シロイヌナズナT1植物において播種後約80日で花茎を採取し、地上高約3cmのところで50μm厚の横断切片をバイブレーションミクロトームを用いて作成し、明視野条件下で木質繊維細胞の細胞壁を観察した。その結果、CEF4-VP16相補ラインでは野生株と同等レベルの細胞壁肥厚が見られた(図２)。また、同様にCEF5-VP16、CEF3-VP16、CEF1-VP16、及びCEF6-VP16相補ラインでも野生株と同等レベルの細胞壁肥厚が見られた(図７および図８)。一方、同横断切片を紫外線照射下に置きリグニンの自家蛍光を観察した。その結果、野生株では細胞壁肥厚が見られる木質繊維細胞及び維管束細胞で蛍光が観察されたのに対し、CEF4-VP16相補ラインでは維管束細胞でしか蛍光が認められなかった(図２)。また、同様にCEF5-VP16、CEF3-VP16、CEF1-VP16、及びCEF6-VP16相補ラインでも維管束細胞でしか蛍光が認められなかった(図８)。
　このことから、CEF4-VP16、CEF5-VP16、CEF3-VP16、CEF1-VP16、及びCEF6-VP16相補ライン相補ラインでもCEF2-VP16相補ラインと同様に、セルロースを中心とした細胞壁が肥厚していると考えられる。
（実施例４）ProNST3：CEF2-VP16 nst1 nst3シロイヌナズナ植物の細胞壁成分分析
（４－１）細胞壁成分の抽出と秤量
　上記実施例(１－２)で得られたProNST3：CEF2-VP16 nst1 nst3シロイヌナズナT1植物において播種後約80日で基部より10cmの部分を採取し、新鮮重量を測定した後、直ちに1cm以下の長さになるよう花茎を刻み、メタノールに浸し一晩以上静置した後、新しいメタノールで２回リンスすることでクロロフィルを除去した。80℃で10分間煮沸した後、新しいメタノールに交換した。この操作を２度繰り返した後、50％クロロホルム、50％メタノール溶液に浸し70℃で煮沸した後、新しい50％クロロホルム、50％メタノール溶液に交換した。この操作を２度繰り返した後、アセトン溶液に浸し、70℃で煮沸した後、新しいアセトン溶液に交換した。この操作を２度繰り返した後、100％エタノール溶液で３回リンスした後、70℃で２日間乾燥させた。これをアルコール不溶性残渣とし、重量を測定した。新鮮重量あたりのアルコール不溶性残渣の割合を細胞壁含量として評価したところ、CEF2-VP16相補ラインの細胞壁含量は野生株のそれと同等レベルにまで回復していた(図３)。
（４－２）グルコース収量の分析
　前記(４－１)で得たアルコール不溶性残渣をホモジナイザー(シェイクマスターネオ；バイオメディカルサイエンス社)を用いて2000rpm 10分間の粉砕処理を行い、細胞壁粉末を得た。得られた細胞壁粉末を1mlの50mMマレイン酸、2mM 塩化カルシウム、0.02％アジ化ナトリウム溶液に懸濁し、70℃で10分間デンプンを糊化した後、4mlの50mMマレイン酸、2mM 塩化カルシウム、0.02％アジ化ナトリウム溶液を加えて、室温で10分間静置した。その次に、500U α-アミラーゼ（ALPHA-AMYLASE (Porcine pancreas)；メガザイム社製）、0.33Uアミログルコシダーゼ（Amyloglucosidase (Aspergillus niger) ；メガザイム社製）、50mMマレイン酸、2mM塩化カルシウム、0.02％アジ化ナトリウム溶液を1ml加えた後、37℃で18時間、デンプンを加水分解し、除デンプンを行った。除デンプンを行った細胞壁粉末懸濁液は、蒸留水で３回、100％エタノールで２回リンスした後、70℃で一晩乾燥させ、細胞壁精製粉末を得た。得られた細胞壁精製粉末2-3 mgを2mlマイクロチューブに分取した後、1mlの5mMクエン酸緩衝液(pH 4.8)、0.02％アジ化ナトリウム、0.4 FPU Celluclast 1.5L、0.8 CBU Novozyme 188溶液を加えて、50℃、200rpmで24時間振盪しながら、酵素糖化反応を行い得られるグルコース量を調べた。その結果CEF2-VP16相補ラインは野生株にくらべて酵素糖化性が約70％(１.７倍)高かった(図４(ａ))。この結果をもとに、新鮮重量あたりのグルコース収量を計算したところ、CEF2-VP16相補ラインは野生株にくらべて約70％(１.７倍)多くグルコースを得られると計算された(図４(ｂ))。この結果から、NST3pro: CEF2-VP16 nst1 nst3シロイヌナズナ植物系統はコントロール系統にくらべて単位栽培面積当たりより多くのグルコースを得ることができ、バイオエタノール生産等に有利であると考えられた。
（実施例５）ProNST3：CEF4-VP16 nst1 nst3、ProNST3：CEF5-VP16 nst1 nst3、ProNST3：CEF3-VP16 nst1 nst3、ProNST3：CEF1-VP16 nst1 nst3、及びProNST3：CEF6-VP16 nst1 nst3シロイヌナズナ植物の細胞壁成分分析
（５－１）細胞壁成分の抽出と秤量
　上記実施例(１－２)で得られたProNST3：CEF4-VP16 nst1 nst3、ProNST3：CEF5-VP16 nst1 nst3、ProNST3：CEF3-VP16 nst1 nst3、ProNST3：CEF1-VP16 nst1 nst3、及びProNST3：CEF6-VP16 nst1 nst3シロイヌナズナT1植物において播種後約80日で基部より10cmの部分を採取し、新鮮重量を測定した後、直ちに1cm以下の長さになるよう花茎を刻み、メタノールに浸し一晩以上静置した後、新しいメタノールで２回リンスすることでクロロフィルを除去した。80℃で10分間煮沸した後、新しいメタノールに交換した。この操作を２度繰り返した後、50％クロロホルム、50％メタノール溶液に浸し70℃で煮沸した後、新しい50％クロロホルム、50％メタノール溶液に交換した。この操作を２度繰り返した後、アセトン溶液に浸し、70℃で煮沸した後、新しいアセトン溶液に交換した。この操作を２度繰り返した後、100％エタノール溶液で３回リンスした後、70℃で２日間乾燥させた。これをアルコール不溶性残渣とし、重量を測定した。新鮮重量あたりのアルコール不溶性残渣の割合を細胞壁含量として評価したところ、CEF4-VP16、CEF5-VP16、CEF3-VP16、CEF1-VP16、及びCEF6-VP16相補ラインの細胞壁含量はnst1 nst3二重変異体より増えており、野生株のそれと同等レベルにまで回復していたものもあった(図９(ａ))。
（５－２）グルコース収量の分析
　前記(５－１)で得たアルコール不溶性残渣をホモジナイザー(シェイクマスターネオ；バイオメディカルサイエンス社)を用いて2000rpm 10分間の粉砕処理を行い、細胞壁粉末を得た。得られた細胞壁粉末を1mlの50mMマレイン酸、2mM 塩化カルシウム、0.02％アジ化ナトリウム溶液に懸濁し、70℃で10分間デンプンを糊化した後、4mlの50mMマレイン酸、2mM 塩化カルシウム、0.02％アジ化ナトリウム溶液を加えて、室温で10分間静置した。その次に、500U α-アミラーゼ、0.33Uアミログルコシダーゼ、50mMマレイン酸、2mM塩化カルシウム、0.02％アジ化ナトリウム溶液を1ml加えた後、37℃で18時間、デンプンを加水分解し、除デンプンを行った。除デンプンを行った細胞壁粉末懸濁液は、蒸留水で３回、100％エタノールで２回リンスした後、70℃で一晩乾燥させ、細胞壁精製粉末を得た。得られた細胞壁精製粉末2-3 mgを2mlマイクロチューブに分取した後、1mlの5mMクエン酸緩衝液(pH 4.8)、0.02％アジ化ナトリウム、0.4 FPU Celluclast 1.5L、0.8 CBU Novozyme 188溶液を加えて、50℃、200rpmで24時間振盪しながら、酵素糖化反応を行い得られるグルコース量を調べた。その結果CEF4-VP16、CEF5-VP16、CEF3-VP16、CEF1-VP16、及びCEF6-VP16相補ラインは野生株にくらべて酵素糖化性が高かった(図９(ｂ))。この結果をもとに、新鮮重量あたりのグルコース収量を計算したところ、CEF4-VP16、CEF5-VP16、CEF3-VP16、CEF1-VP16、及び、CEF6-VP16相補ラインは野生株にくらべて多くグルコースを得られると計算された(図９(ｃ))。この結果から、NST3pro: CEF4-VP16 nst1 nst3、NST3pro: CEF5-VP16 nst1 nst3、NST3pro: CEF3-VP16 nst1 nst3、NST3pro: CEF1-VP16 nst1 nst3、及びNST3pro: CEF6-VP16 nst1 nst3シロイヌナズナ植物系統は、NST3pro: CEF2-VP16 nst1 nst3シロイヌナズナ植物系統と同様に、コントロール系統にくらべて単位栽培面積当たりより多くのグルコースを得ることができ、バイオエタノール生産等に有利であると考えられた。
（実施例６）ProNST3：CEF2-VP16 nst1 nst3シロイヌナズナ植物での下流遺伝子発現の測定
上記実施例(１－２)で得られたProNST3：CEF2-VP16 nst1 nst3シロイヌナズナT1植物において播種後約30-40日で先端より10cmの部分を採取し、RNAを抽出するまで-80℃で保存した。RNAを抽出するにあたっては、サンプルを液体窒素中でホモジナイザー(シェイクマスターネオ；バイオメディカルサイエンス社)によって破砕し、RNeasy Plantキット(QIAGEN)を用いてRNAを抽出した。精製したRNAは、PrimeScriptTM RT reagent KitのPrimeScript RT Enzyme Mix I(タカラ社)を用いて逆転写反応を行ない、cDNAを合成した。
　cDNA、及び一次細胞壁、二次細胞壁のセルロース合成酵素を増幅させるオリゴヌクレオチドペア、SYBR Green Real-Time PCR Master Mix(Life Technology)のキットを混合し、ABI 7300(Life Technology)により、Real-Time PCRを行なった。UBQ1、ACT2、PP2AA3の平均発現量を用いて補正することで、セルロース合成酵素の相対的発現量を算出した。
　Real-Time PCRに用いたセルロース合成酵素、及びUBQ1、ACT2、PP2AA3のプライマー配列は下記の通りである。
＜UBQ1プライマー＞
5’-TGAGCCTTCCTTGATGATGCT-3’　　　(配列番号１５)
5’-GCACTTGCGGCAAATCATCT-3’ 　　　(配列番号１６)
＜ACT2 プライマー＞
5’-ACATTGTGCTCAGTGGTGGA-3’　　　 (配列番号１７)
5’-GAGATCCACATCTGCTGGAAT-3’　　　(配列番号１８)
＜PP2AA3 プライマー＞
5’-GACCAAGTGAACCAGGTTATTGG-3’　　(配列番号１９)
5’-TACTCTCCAGTGCCTGTCTTCA-3’　　 (配列番号２０)
＜CESA1 プライマー＞
5’-TGTCTCATCACCGACAGATTCATC-3’　 (配列番号２１)
5’-CATCTCAGCTCCAGGATTCCA-3’　　　(配列番号２２)
＜CESA3 プライマー＞
5’-CTCGATGACATAGAAGAGGGAGTT-3’　 (配列番号２３)
5’-CCAGGCTCATTTGCGACATTAAGA-3’　 (配列番号２４)
＜CESA4 プライマー＞
5’-CGGCAAGTTCATCATTCCTACGA-3’　　(配列番号２５)
5’-CACTCCACCGGAGTTCTAAGA-3’　　　(配列番号２６)
＜CESA6 プライマー＞
5’-CTCTCTACCGCTCATCGTTTAC-3’　　 (配列番号２７)
5’-GACGAGAAGAGCGCCATGAA-3’　　　 (配列番号２８)
＜CESA7 プライマー＞
5’-GGCAAACTCAAGTGGCTTGAGCG-3’　　(配列番号２９)
5’-TAACTCCGCTCCATCTCAATTCC-3’　　(配列番号３０)
＜CESA8 プライマー＞
5’-GTCACATCGAAAACCGCAGATGAT-3’ 　(配列番号３１)
5’-AAGTGACGTCGGAGGGATCAA-3’　　　(配列番号３２)
　UBQ1、ACT2、PP2AA3の平均発現量を用いて補正することで、セルロース合成酵素の相対的発現量を算出した。その結果、CEF2-VP16相補ラインでは一次細胞壁のセルロース合成に関係するセルロース合成酵素(CESA1、CESA3、CESA6)の発現量が、元株であるnst1 nst3二重変異体よりも高いことを発見した(図５)。
（実施例７）プロトプラスト一過的形質転換ベクター35S：CEF2-VP16又は35S：CEF2又は35S：CEF2-SRDXの構築
35S：CEF2及び35S:CEF2-VP16の構築は以下のように行った。
前記（１－１）で得た、終止コドンを除いたシロイヌナズナ由来のCEF2タンパク質コード領域がpDONR207にクローニングされたエントリークローンを、非特許文献５に記載されたpDEST_35SHSPベクター及びpDEST_35SVP16HSPベクターとLRクロナーゼによって組換えることにより、形質転換に使用したベクターの一部を構築した。
　なお、pDEST_35SVP16HSPベクターには、CaMV 35Sプロモータの下流に、CEF2遺伝子のタンパク質コード領域とVP16転写活性化ドメインをコードする塩基配列とがポリヌクレオチドリンカーを介して連結された状態で配置されている。これにより、当該ベクターを用いて形質転換された植物のプロトプラスト内では、配列番号１３(CEF2-VP16)に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが発現される。
35S：CEF2-SRDXの構築は以下のように行った。
　終止コドンを除いたシロイヌナズナ由来のCEF2タンパク質コード領域を下記のオリゴヌクレオチドペアをプライマーとしたPCRで増幅し、非特許文献６に記載のp35SSRDXGベクターをSmaIで切断した箇所にライゲーションした。
5’- gATGGGAAAACAAATCAACATAGAGAGTAG -3’(CEF2N、配列番号５４)
5’- GTCATTTTGCCAATTAAACGGCTCTTCAAA -3’(CEF2C、配列番号５５)
　なお、p35SSRDXG ベクターには、CaMV 35Sプロモータの下流に、CEF2遺伝子のタンパク質コード領域とSRDX転写抑制化ドメインをコードする塩基配列とが配置されている。これにより、当該ベクターを用いて形質転換された植物のプロトプラスト内では、配列番号５６(CEF2-SRDX)に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが発現される。
（実施例８）CEF2転写制御因子をシロイヌナズナ葉肉細胞のプロトプラストに遺伝子導入した際に一次細胞壁の回復に与える影響の測定
約20～30日間生育させたシロイヌナズナの葉を、セロハンテープにより表皮を剥ぎとり葉肉細胞を露出させた後、その葉を適量の1.0% セルラーゼ-オノズカ R10（ヤクルト社製）、0.25% マセロザイム R-10（ヤクルト社製）、10 mM メルカプトエタノール、400 mMマンニトール、20 mM KCl、10 mM CaCl2、20 mM MES (pH5.7)溶液に浸し、22℃、50 rpmで振とうしながら、1時間インキュベートし、プロトプラストを遊離させた。プロトプラストは孔径70 μmのナイロンフィルターで濾した後、50ml容チューブに集め、100×g、10分間遠心しプロトプラストを回収した後、上清を捨て、150 mM NaCl、125 mM CaCl2、5 mM KCl、2 mM MES (pH5.7)緩衝液（Ｗ５緩衝液）で再懸濁した。再懸濁したプロトプラストは100×g、5分間遠心後、同緩衝液で再度懸濁した。この緩衝液による洗浄を２度繰り返した後、4℃で10分間インキュベートした。インキュベート後のプロトプラストは、100×g、5分間遠心後、400 mMマンニトール、15 mM MgCl2、4 mM MES (pH5.7)緩衝液で再懸濁した。その後、100×g、5分間遠心することでプロトプラストを回収した後、2.0～3.0×105 cells/mlになるよう同緩衝液で細胞濃度を調製し、形質転換用プロトプラスト懸濁液を得た。得られた形質転換用プロトプラスト懸濁液35 μLに150 ng/μlのプラスミド溶液（35Spro:CEF2（CEF2ox）、35Spro:CEF2-VP16（CEF2-VP16）、35Spro:CEF2-SRDX(CEF2-SRDX)）を各10 μL、40% (w/v)PEG 4000、200 mM マンニトール、100 mM CaCl2溶液を45　μLずつ、それぞれ96穴プレート（ヌンク社製、丸底）に入れ、900 rpm、15秒間振とうし、溶液を混合した。混合液は10分間室温で静置した。静置後の混合液にＷ５緩衝液を200 μL勢いよく加えることでプロトプラストを懸濁させた後、100×g、5分間遠心し、プロトプラスト細胞をプレート底に集め、上清を200 μL捨てることで、プロトプラスト懸濁液を洗浄した。この作業を計４回行った後、各ウェルをパラフィルムでシールし、22℃で18時間静置し、一過的に導入された遺伝子を細胞内で発現させた。その後、プロトプラストは、１×Gamborg’s B5 混合塩（日本製薬社製）、1×Gamborg’s B5 ビタミン（シグマ社製）、250 mM マンニトール、200 mMグルコース、1.0 mg/L 2,4-D、0.022 mg/L thidiazuron, 200mg/Lアンピシリン、1.0 mg/L fungizone (Amphotericin B, シグマ社製)、0.1% エタノール溶液で再懸濁した後、22℃、2日間インキュベートし、プロトプラストの細胞壁を再生させた。再生した細胞壁は10 mg/Lカルコフロー溶液で染色し、UV照射下で発する蛍光を蛍光顕微鏡によって観察し、蛍光強度を指標に細胞壁の再生度合いを定量した。
　その結果、CEF2及びCEF2-VP16を発現させたプロトプラストでは、コントロール（プラスミドを導入していないプロトプラスト）に比べ、カルコフローの蛍光がコントロールに比べ強かった、CEF2-SRDXを発現させたプロトプラストではコントロールに比べカルコフローの蛍光は弱かった（図６）。このことは、CEF2転写制御因子がプロトプラストの細胞壁の再生、すなわち一次細胞壁形成の制御に関与していることを示している。
　なお、上記の実施例においては、「CEF2遺伝子」、「CEF4遺伝子」、「CEF1遺伝子」、「CEF3遺伝子」、「CEF5遺伝子」、又は、「CEF6遺伝子」によりコードされる転写制御因子の機能を強化する対象の植物としてnst1 nst3二重変異体を用いた。これは、部分的に肥厚した細胞壁を検出しやすくするためである。なお、当業者であれば、「CEF2遺伝子」、「CEF4遺伝子」、「CEF1遺伝子」、「CEF3遺伝子」、「CEF5遺伝子」、又は、「CEF6遺伝子」によりコードされる転写制御因子の機能を強化することで、野生型の植物内においてもセルロースの合成量を増加させることが可能であると理解することができる。

Claims (8)

  1. 　対象となる植物の木質繊維細胞内において、下記(ア)～(オ)のいずれかに示される転写制御因子の機能を強化する工程を含む、増加したセルロースを含有する植物の生産方法；
    (ア)配列番号１、３、３３、３５、３７、又は、３９に示されるアミノ酸配列からなる転写制御因子、
    (イ)配列番号１、３、３３、３５、３７、又は、３９に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しており、かつ、セルロースの合成を制御する活性を有する転写制御因子、
    (ウ)配列番号１、３、３３、３５、３７、又は、３９に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなる転写制御因子であって、かつ、セルロースの合成を制御する活性を有する転写制御因子、
    (エ)配列番号２、４、３４、３６、３８、又は、４０に示される塩基配列によりコードされる転写制御因子、
    (オ)配列番号２、４、３４、３６、３８、又は、４０に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされる転写制御因子であり、かつ、セルロースの合成量を制御する活性を有する転写制御因子。
  2. 　請求項１に記載の植物の生産方法であって、
    　前記転写制御因子の機能を強化する工程が、木質繊維細胞で遺伝子発現を誘導するプロモータの下流に、以下の(ａ)～(ｅ)のいずれかに記載の核酸が作動可能に連結された発現カセットを含むベクターを用いて、植物を形質転換する工程である、植物の生産方法；
    （ａ）配列番号１、３、３３、３５、３７、又は、３９に示される第一のアミノ酸配列と配列番号５に示される第二のアミノ酸配列とが連結したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、
    （ｂ）前記(ａ)に記載の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有しており、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
    （ｃ）前記(ａ)の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、配列番号１及び／又は配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
    （ｄ）配列番号２、４、３４、３６、３８、又は、４０に示される第一の塩基配列と配列番号６に示される第二の塩基配列とが連結した塩基配列からなる核酸、
    （ｅ）前記(ｄ)の核酸において、第一の塩基配列及び／又は第二の塩基配列が、配列番号２、４、３４、３６、３８、若しくは、４０及び／又は配列番号６に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸。
  3. 　木質繊維細胞で遺伝子発現を誘導するプロモータが、NST1又はNST3 遺伝子のプロモータである、請求項２に記載の植物の生産方法。
  4. 　請求項１～３のいずれか一項に記載の方法により生産された植物又はその子孫を用意する工程と、その少なくとも一部を取得して酵素糖化処理を施す工程とを含む、グルコースの製造方法。
  5. 　請求項２又は３に記載の植物の生産方法に使用される発現カセットであって、木質繊維細胞で遺伝子発現を誘導するプロモータの下流に、以下の(ａ)～(ｅ)のいずれかに記載の核酸が作動可能に連結された発現カセット；
    （ａ）配列番号１、３、３３、３５、３７、又は、３９に示される第一のアミノ酸配列と配列番号５に示される第二のアミノ酸配列とが連結したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、
    （ｂ）前記(ａ)に記載の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有しており、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
    （ｃ）前記(ａ)の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、配列番号１及び／又は配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
    （ｄ）配列番号２、４、３４、３６、３８、又は、４０に示される第一の塩基配列と配列番号６に示される第二の塩基配列とが連結した塩基配列からなる核酸、
    （ｅ）前記(ｄ)の核酸において、第一の塩基配列及び／又は第二の塩基配列が、配列番号２、４、３４、３６、３８、若しくは、４０及び／又は配列番号６に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸。
  6. 　請求項５に記載の発現カセットを含むベクター。
  7. 　請求項６に記載のベクターを含むキット。
  8. 　請求項６に記載のベクターにより形質転換された、植物若しくはその子孫、又はそれらの一部。

     
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