JP6501105B2 - 茎が肥大化した植物の生産方法 - Google Patents
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Description
これらのうちシロイヌナズナのnst1 nst3二重変異体では、花茎や胚軸の木質繊維細胞で木質がまったく形成されなくなり、花茎の強度が大幅に低下するほか、直立することができなかった。しかし、同様に木質が形成される導管においては木質の欠損が起こることはなく、植物の生存には影響がなかった(非特許文献3)。また、これらのうち、NST3遺伝子のプロモータは繊維細胞のごく形成初期から遺伝子発現を誘導できることがわかり、形成層の細胞でも遺伝子発現を誘導できると推測された(非特許文献3)。
本発明者らは、NST3遺伝子のプロモータが形成層細胞でも遺伝子発現を誘導しうることに着目し、発現させる遺伝子としては広く植物転写因子全般について検討するなかで、シロイヌナズナのAP2/ERFファミリーのひとつであるSGF1転写因子を、NST3プロモータによって、植物の形成層にて発現させたときに顕著に茎を肥大化させる効果があることを見出した(図1)。
以上の知見を得たことから、本発明を完成した。
〔1〕形成層細胞で遺伝子発現を誘導するプロモータの下流に、以下の(a)〜(e)のいずれかに記載の形成層細胞の細胞分裂活性を制御する転写制御因子をコードする核酸が作動可能に連結された発現カセットを含むベクターを用いて植物を形質転換する工程を含む、肥大した茎を有する植物の生産方法に関する;
(a)配列番号1に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸、
(b)配列番号1に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、形成層細胞内で発現した際に形成層細胞の細胞分裂を促進する活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列からなる核酸、
(c)配列番号1に示されるアミノ酸配列と少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、形成層細胞内で発現した際に形成層細胞の細胞分裂を促進する活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列からなる核酸、
(d)配列番号2に示される塩基配列からなる核酸、
(e)配列番号2に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、形成層細胞で発現した際に形成層細胞の細胞分裂を促進する活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列からなる核酸。
また、〔3〕本発明の肥大した茎を有する植物の生産方法の一実施の形態においては、発現カセットが、転写活性化ドメインをコードする塩基配列からなる核酸をさらに含むことを特徴とする。
なお、本発明の肥大した茎を有する植物の生産方法において、上記の特徴の1つまたは複数を組み合わせて有するものも、当該植物の生産方法に含まれる。
〔4〕形成層細胞で遺伝子発現を誘導するプロモータと、以下の(a)〜(e)のいずれかに記載の核酸とを含む発現カセットであって、
前記核酸が前記プロモータに作動可能に連結されている発現カセットに関する;
(a)配列番号1に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸、
(b)配列番号1に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、形成層細胞内で発現した際に形成層細胞の細胞分裂を促進する活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列からなる核酸、
(c)配列番号1に示されるアミノ酸配列と少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、形成層細胞内で発現した際に形成層細胞の細胞分裂を促進する活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列からなる核酸、
(d)配列番号2に示される塩基配列からなる核酸、
(e)配列番号2に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、形成層細胞で発現した際に形成層細胞の細胞分裂を促進する活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列からなる核酸。
また、〔6〕本発明の発現カセットの一実施の形態においては、転写活性化ドメインをコードする塩基配列からなる核酸をさらに含むことを特徴とする。
なお、本発明の発現カセットにおいて、上記の特徴の1つまたは複数を組み合わせて有するものも、当該発現カセットに含まれる。
また、〔7〕本発明の別の態様によれば、上記〔4〕、〔5〕、又は〔6〕に記載の発現カセットを含むベクターに関する。
また、〔8〕本発明の別の態様によれば、上記〔7〕に記載のベクターを含むキットに関する。
また、〔9〕本発明の別の態様によれば、上記〔7〕のベクターにより形質転換された、形質転換植物若しくはその子孫、又はそれらの一部に関する。
1.本発明における茎を肥大させた植物について
(1)本発明における茎を肥大させる遺伝子について
本発明において植物の茎を肥大させる遺伝子は、典型的にはシロイヌナズナ由来の配列番号2で表される「SGF1遺伝子」であり、対応するアミノ酸配列は配列番号1で表される。当該遺伝子は、これまでにその機能がよく知られていない。なお、本明細書において、植物の茎を肥大させる遺伝子として「SGF1遺伝子」というときは、配列番号2で示されるシロイヌナズナ由来の「SGF1遺伝子」に限られず、そのオルソログ、パラログなどのホモログやそれらの塩基配列の一部に変異が導入されたものも含まれる。すなわち、シロイヌナズナ由来の「SGF1遺伝子」若しくはそのホモログ、又はそれらの塩基配列の一部に変異が導入されたものを形成層細胞で発現するように導入することで、茎が肥大した形質転換植物を得ることができる。
(a)配列番号1に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸、
(b)配列番号1に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、形成層細胞内で発現した際に形成層細胞の細胞分裂を促進する活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列からなる核酸、
(c)配列番号1に示されるアミノ酸配列と少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、形成層細胞内で発現した際に形成層細胞の細胞分裂を促進する活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列からなる核酸、
(d)配列番号2に示される塩基配列からなる核酸、
(e)配列番号2に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、形成層細胞で発現した際に形成層細胞の細胞分裂を促進する活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列からなる核酸。
なお、以下の本発明の説明にあたっては、「茎の肥大」の形質を付与する遺伝子として典型的な「SGF1遺伝子」の名称を用いて説明する。
茎が肥大した植物の作出方法は、SGF1遺伝子を形成層細胞で誘導可能なプロモータの下流に作動可能に連結した発現カセットを含むベクターを構築し、野生株又はNST転写因子若しくはそのオルソログ転写因子の機能が抑制された植物(NST転写因子若しくはそのオルソログ転写因子の機能が抑制された植物としては、例えば、nst1及びnst3のいずれか一方、または両方が変異や欠損したものが挙げられる)に形質転換して作出する。
本発明において用いられる転写制御因子のSGF1遺伝子を発現させるためのプロモータは、「形成層細胞で遺伝子発現を誘導するプロモータ」である。具体的には、NST3プロモータもしくはそのオルソログ遺伝子のプロモータを挙げることができるが、形成層細胞で当該遺伝子の発現を誘導可能なプロモータであればこれらに限定されない。NST3プロモータもしくはそのオルソログ遺伝子のプロモータとしては、特に、シロイヌナズナ由来のNST1及びNST3遺伝子のプロモータを好適に用いることができる。
なお、本明細書において、「転写活性化ドメインをコードする核酸」というとき、具体的に特定される塩基配列からなる核酸(例えば、配列番号4で示されるVP16)に限定されない。例えば、VP16を転写活性化ドメインとして使用する際には、形成層細胞内で「SGF1タンパク質」とともに発現した際に形成層細胞の細胞分裂を促進する活性を有するポリペプチドをコードする限りにおいて、下記(i)又は(ii)に記載の核酸も含む;
(i)配列番号3に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸、又は
(ii)配列番号3に示されるアミノ酸配列と、80%、好ましくは90%、より好ましくは95%以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸
なお、VP16のような転写活性化ドメインを使用しない場合には、「SGF1遺伝子」の塩基配列に終止コドンを含ませてもよいし、発現カセットに終止コドンを適宜配置してもよい。
なお、転写活性化ドメインの付加位置は、SGF1タンパク質のC末側であることが好ましいが、SGF1タンパク質の形成層細胞における細胞分裂を促進させる活性を阻害しない限りにおいて、N末側に付加しても良い。
(a)配列番号1に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸、
(b)配列番号1に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、形成層細胞内で発現した際に形成層細胞の細胞分裂を促進する活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列からなる核酸、
(c)配列番号1に示されるアミノ酸配列と少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、形成層細胞内で発現した際に形成層細胞の細胞分裂を促進する活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列からなる核酸、
(d)配列番号2に示される塩基配列からなる核酸、
(e)配列番号2に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、形成層細胞で発現した際に形成層細胞の細胞分裂を促進する活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列からなる核酸。
当該ベクターに植物細胞に導入するための試薬群を含んでいればより好ましい。当該試薬群としては、形質転換の種類に応じた酵素やバッファー等を挙げることができる。その他、必要に応じてマイクロ遠心チューブ等の実験用素材が添付されていてもよい。
(3−1)茎の肥大
下記実施例2が示すように、「SGF1遺伝子」を用いて、非特許文献3に記載のnst1 nst3二重変異体を形質転換することにより得られたシロイヌナズナ株(以下、「SGF1相補ラインシロイヌナズナ植物」という)の花茎の下部10cmをサンプリングして横断切片を観察した結果、元株であるnst1 nst3二重変異体に比べて茎の断面積が約90%(約1.9倍)も増加していた(図1、2)。
このように、本発明により得られる茎が肥大した形質転換植物は、当該形質転換植物の元株であって、かつ、外来の「SGF1遺伝子」を導入していない植物体と花茎における断面積を比較した際に、70%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上断面積が増加している。
さらに、図1からは、形成層細胞から分裂して作られる導管がSGF1相補ラインシロイヌナズナ植物において著しく増加していることがわかる(図1)。茎の横断切片において導管の数を数えたところ、SGF1相補ラインシロイヌナズナでは元株であるnst1 nst3二重変異体よりも約4.5倍も有意に多かった(図3)。このことは、SGF1相補ラインシロイヌナズナでは形成層細胞の細胞分裂がより活性化されていることを示している。
このように、本発明により得られる茎が肥大した形質転換植物は、当該形質転換植物の元株であって、かつ、外来の「SGF1遺伝子」を導入していない植物体と花茎の横断切片における導管の数を比較した際に、2倍以上、好ましくは3倍以上、より好ましくは4倍以上導管の数が増加している。
本発明におけるその他の用語や概念は、当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものであり、本発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学的技術はJ.Sambrook, E.F.Fritsch & T.Maniatis, Molecular Cloning:A Laboratory Manual (2nd edition), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989); D.M.Glover et al. ed., DNA Cloning, 2nd ed., Vol. 1 to 4, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995)などに記載の方法により、またはそれらと実質的に同様な方法や改変法により行うことができる。また、本発明で使用する各種タンパク質やペプチド、あるいはそれらをコードするDNAについては、既存のデータベース(URL:http://www.arabidopsis.org/またはhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=pubmed等)から入手することができる。
なお、本明細書中に引用した技術文献、特許公報及び特許出願明細書中の記載内容は、本発明の記載内容として参照されるものとする。
(1−1)形質転換ベクターProNST3:SGF1-VP16の構築
以下のように形質転換ベクターを構築した。
終止コドンを除いたシロイヌナズナ由来のSGF1タンパク質コード領域を下記のオリゴヌクレオチドペアをプライマーとしたPCRで増幅し、かつてインビトロジェン社が販売していたゲートウェイドナーベクターpDONR207ベクターに、BPクロナーゼによってクローニングした。
5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGGATTACAGAGAATCCACCGG-3’ (配列番号7)
5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTAACGTGATCGTGGCCGCCCAG-3’ (配列番号8)
つぎに非特許文献4に記載のpDEST_NST3p_VP16_HSP_GWB5ベクターにLRクロナーゼによって上記SGF1のタンパク質コード領域を移し変えることによって、形質転換に使用したベクターを構築した。なお、本ベクター上には、SGF1とVP16とがポリヌクレオチドリンカーを介してインフレームで連結された状態(配列番号9)で含まれている。よって、当該ベクターを用いて形質転換した植物はその形成層細胞内に、配列番号10で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを発現する。
上記実施例(1−1)で得られたプラスミドを、土壌細菌(Agrobacterium tumefaciens strain GV3101(C58C1Rifr)pMP90(Gmr)(koncz and Schell 1986))株にエレクトロポレーション法で導入した。導入した菌を200mLの抗生物質(カナマイシン(Km)50mg/L、ゲンタマイシン(Gm)25mg/Lおよびリファンピシリン(Rif)50mg/L)を含むLB培地で2日間培養した。
次いで、培養液から菌体を回収し、500mLの浸潤培地(Infiltration medium;特許文献1を参照)に懸濁し、米国シロイヌナズナバイオリソースセンター(ABRC)から取り寄せたT-DNAタグラインSALK_120377、SALK_149909を掛け合わせて作成したシロイヌナズナnst1 nst3二重変異体(非特許文献3を参照)を45日間〜60日間育てて花を咲かせ、主茎を切った後にさらに10日間育てた後に2分間浸して感染させた後、通常通り育成しT1種子を収穫した。そののち、T1種子を50%ブリーチ、0.02%Triton X-100溶液で7分間滅菌した後、滅菌水で3回リンスし、30mg/lのハイグロマイシン(Hg)を含むMS選択培地に播種した。
上記ハイグロマイシンプレートで生育する形質転換植物体(ProNST3:SGF1-VP16 nst1 nst3シロイヌナズナT1植物)を選抜し、土壌に植え換えて生育し、種子を採取して播種し、次世代(T2)のシロイヌナズナ植物を得た。
上記実施例(1−2)で得られたProNST3:SGF1-VP16 nst1 nst3シロイヌナズナT1植物において播種後約40日で花茎を採取し、地上高約5cmのところで50mm厚の横断切片をバイブレーションミクロトームを用いて作成し、明視野および紫外線照射下で観察した(図1)。その結果、ProNST3:SGF1-VP16 nst1 nst3シロイヌナズナでは断面積が元株であるnst1 nst3二重変異体よりも約90%拡大している(約1.9倍になっている)ことがわかったほか(図2)、形成層細胞における細胞分裂が活発になった結果、導管の数が元株であるnst1 nst3二重変異体の約4.5倍にもなっていることがわかった(図3)。
Claims (9)
- 形成層細胞で遺伝子発現を誘導するプロモータの下流に、以下の(a)〜(e)のいずれかに記載の形成層細胞の細胞分裂活性を促進する転写制御因子をコードする核酸が作動可能に連結された発現カセットを含むベクターを用いて植物を形質転換する工程を含む、肥大した茎を有する植物の生産方法;
(a)配列番号1に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸、
(b)配列番号1に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、形成層細胞での発現により形成層細胞の細胞分裂を促進する活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列からなる核酸、
(c)配列番号1に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、形成層細胞で発現した際に形成層細胞の細胞分裂を促進する活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列からなる核酸、
(d)配列番号2に示される塩基配列からなる核酸、
(e)配列番号2に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、形成層細胞で発現した際に形成層細胞の細胞分裂を促進する活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列からなる核酸。 - 請求項1に記載の肥大した茎を有する植物の生産方法であって、
前記プロモータが、NST1又はNST3遺伝子のプロモータである、植物の生産方法。 - 請求項1または2に記載の肥大した茎を有する植物の生産方法であって、
前記発現カセットが、転写活性化ドメインをコードする塩基配列からなる核酸をさらに含む、植物の生産方法。 - 形成層細胞で遺伝子発現を誘導するプロモータと、以下の(a)〜(e)のいずれかに記載の核酸とを含む発現カセットであって、
前記核酸が前記プロモータに作動可能に連結された発現カセット;
(a)配列番号1に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸、
(b)配列番号1に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、形成層細胞での発現により形成層細胞の細胞分裂を促進する活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列からなる核酸、
(c)配列番号1に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、形成層細胞で発現した際に形成層細胞の細胞分裂を促進する活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列からなる核酸、
(d)配列番号2に示される塩基配列からなる核酸、
(e)配列番号2に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、形成層細胞で発現した際に形成層細胞の細胞分裂を促進する活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列からなる核酸。 - 請求項4に記載の発現カセットであって、
前記プロモータが、NST1又はNST3遺伝子のプロモータである発現カセット。 - 請求項4または5に記載の発現カセットであって、転写活性化ドメインをコードする塩基配列からなる核酸をさらに含む発現カセット。
- 請求項6に記載の発現カセットを含むベクター。
- 請求項7に記載のベクターを含むキット。
- 請求項7に記載のベクターにより形質転換された、形質転換植物若しくはその子孫、又はそれらの一部。
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