WO2016182311A1 - Hpv 바이러스의 발암 유전자 발현 저해물질을 유효성분으로 포함하는 암세포 감작용 조성물 - Google Patents

Hpv 바이러스의 발암 유전자 발현 저해물질을 유효성분으로 포함하는 암세포 감작용 조성물 Download PDF

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김영덕
정헌순
김득애
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Definitions

  • Cancer cell sensitizing composition comprising an oncogenic gene expression inhibitor of HPV virus as an active ingredient
  • the present invention relates to a cancer cell sensitizing composition
  • a cancer cell sensitizing composition comprising an oncogenic gene expression inhibitor of HPV virus as an active ingredient, and more specifically, an oligonucleotide having any one nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-10. It comprises a as an active ingredient, and relates to a composition for radiation sensitization used in the treatment of cancer caused by HPV infection.
  • High-risk Human Papilloma Virus (HPV) types 16 and 18 are major causes of cervical cancer and cervical dysplasia, and other genital cancers and head and neck squamous epithelial cells. Causes cancer. Cervical cancer is one of the most common types of weak tumors in women. The incidence of invasive cervical cancer is slowly decreasing, but it is the most frequent cancer for all women in developing countries, accounting for 25% of female cancers. HPV is a small DNA virus that causes benign malignancies with approximately 8,000 sequences.
  • HPV subtypes have been identified according to genome differences, and approximately 90 HPV subtypes have been fully genotyped.
  • the high-risk HPV type eg HPV-16, 18, 31, 33, 35, 45, 51, 52, 56
  • HPV type 16 is associated with more than 5 HPV-infected cervical cancers, followed by HPV type 18 (12%), HPV type 45 (8%), and HPV type 31 (5%).
  • HPV type 18 is associated with more than 5 HPV-infected cervical cancers, followed by HPV type 18 (12%), HPV type 45 (8%), and HPV type 31 (5%).
  • This HPV encodes two oncogenic proteins E6 and E7. These proteins are all involved in cell immortalization and cell transformation through HPV. Carcinogenic E6 protein binds to wild type P53 tumor suppressor protein and degrades p53 via the ubiquitin pathway.
  • E7 protein directly binds to Rb for hyperphosphorylation.
  • E6 forms a complex with E6-AP (E6_associated protein), which is an E3 ubiquitin in-protein ligase.
  • E6-AP E6_associated protein
  • the E6 / E6-AP complex binds to the wild type p53 and ubiquitizes, thereby interfering with the reaction of p53-mediated cells against DNA damage.
  • p53 tumor suppressor protein is regulated by Mdm2-mediated ubiquitination, but in HPV-infected cervical cancer cells, the degradation of p53 is completely replaced by M6 and U6 ubiquitination.
  • cervical cancer infected with HPV almost all have the wild type p53 gene.
  • the expression level of the p53 protein is very low.
  • HPV E6 protein has received considerable attention because it is a specific target capable of killing only cervical cancer cells.
  • siRNA targeting E6 oncogenic genes of viruses, and combinations thereof.
  • siRNA has been demonstrated to be able to selectively silence genes of virus among diseases caused by virus as well as selectively silence internal genes in animal cells. RA interference caused by transfection of siRNAs has emerged as a new therapy for treating viral infections in humans.
  • RNAi targeting the E6 and E7 cancer genes of the virus was found to selectively silence the expression of these proteins.
  • the inventors of the present invention as a result of the effort to find a siRNA specific to E6 / E7 that can be synergistic by being treated together when performing radiation therapy, the sense ligonucleotide selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to 10 and Made by the hybridization of an antisense oligonucleotide that complementarily binds to the sense sequence.
  • the present invention was completed by confirming that siRNA was combined treatment in performing radiation therapy, resulting in a significantly higher synergistic effect than single treatment.
  • an object of the present invention comprises an oligonucleotide having any one nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 10 as an active ingredient, and for the radiation treatment of cancer caused by HPV human papi l loma virus) infection It is to provide a sensitizing composition for.
  • Another object of the present invention comprises an oligonucleotide having any one nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to 10 as an active ingredient, for the radiation treatment of cancer caused by HPVChuman papi l loma virus) infection To provide sensitizers.
  • Another object of the present invention is an oligonucleotide having any one nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 10 for the preparation of a sensitizing agent for the radiation therapy of cancer caused by HPVChuman papi l loma virus) infection It is to provide a use.
  • Another object of the present invention is a composition comprising an oligonucleotide having any one nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to 10 HPV (human papi l), characterized in that for administering to a subject in need thereof loma virus) provides a method of sensitizing radiotherapy for cancer caused by infection.
  • Another object of the present invention is to "
  • composition comprising an oligonucleotide having any one nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-10;
  • HPVChuman papi l loma virus comprising a radiotherapy method of cancer caused by infection.
  • the present invention comprises an oligonucleotide having any one nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to 10 as an active ingredient, HPV human papi l loma virus) of cancer caused by infection It provides a sensitizing composition for radiotherapy.
  • the present invention comprises an oligonucleotide having any one nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to 10 as an active ingredient, by human papi l loma virus (HPV) infection It provides a sensitizer for radiotherapy of the induced cancer.
  • any one nucleic acid sequence selected from the group consisting of low sequence numbers 1 to 10 for the preparation of a sensitizing agent for the radiation treatment of cancer caused by HPVChuman papi l loma virus) infection It provides the use of oligonucleotide having.
  • HPVChuman characterized in that the composition comprising an oligonucleotide having any one nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to 10 in an effective amount to the individual in need thereof papi l loma virus) provides a method of sensitizing radiotherapy for cancer caused by infection.
  • composition comprising an oligonucleotide having one of the nucleic acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 10;
  • HPVChuman papi l loma virus comprising a radiotherapy method of cancer caused by infection.
  • HPV human papi l loma virus
  • the present invention also comprises an oligonucleotide having any one of the nucleic acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 10 as an active ingredient, sensitization for radiotherapy of cancer caused by human papi l loma virus (HPV) infection Provide offerings.
  • the radiation sensitizing composition or sensitizer means a composition that can enhance the effect of treatment by improving the sensitivity of damage to radiation of cancer cells in the treatment of cancer. That is, a composition or a formulation which can be called as easily inhibits the cancer cell's resistance to radiation to induce the death of cancer cells by radiation.
  • the cancer caused by the HPV infection is cervical cancer, vagina cancer, vulvacancer, vulvacancer, anal cancer, penis cancer, tonsill cancer, pharynx It may be characterized in that it is selected from the group consisting of cancer (pharynx cancer), larynx cancer, head & neck cancer and lung adenocarcinoma, preferably cervical cancer However, it is not limited thereto.
  • the oligonucleotide is characterized in that the sense oligonucleotide and complementary antisense oligonucleotides are siRNA (smal l interfering RNA) complementaryly, but are not limited thereto.
  • the siRNA of the present invention may have a structure in which the sense strand and the antisense strand are located opposite to each other to form a double chain.
  • the siRNA molecules of the present invention may have a single chain structure with sel f-complementary sense and antisense strands.
  • the present invention provides a composition, characterized in that the oligonucleotide is a small interfering RNA (siRNA) where the sense ligation nucleotide and its complementary antisense oligonucleotide are complementarily common.
  • the oligonucleotide of the present invention is E6, a tumorous protein of HPV virus And expression of E7.
  • E6 and E7 are oncogenic proteins, of High-risk Human Papilloma Virus (HPV) types 16 and 18.
  • HPV Human Papilloma Virus
  • siRNA against the same target gene is an antisense oligonucleotide (ASO), which inhibits mRNA expression in vitro and in vivo.
  • ASO antisense oligonucleotide
  • the effect was found to include long lasting effects (Comparison of ant i sense oligonucleotides and siRNAs in cell culture and in vivo. Biochem. Biophys. Res. Comm. 2002. 296: 1000-1004).
  • the siRNA action mechanism complementarily binds to the target mRNA and regulates the expression of the target gene in a sequence-specific manner, which is why it is possible to apply a target to the antibody-based drug or a small molecule drug. (Progress Towards in Vivo Use of siRNAs. MOLECULAR THERAPY. 2006 13 (4): 664-670).
  • siRNAs must be effectively delivered to target cells by improving their stability and improving cell delivery efficiency in order for siRNAs to be developed as therapeutic agents.
  • Some nucleotides or backbones of siRNA are modified to have nuclease resistance or viral vectors, liposomes or nanoparticles to improve the stability in the body. Studies on the use of the carrier such as) have been actively attempted.
  • the oligonucleotide in order to improve the stability of the oligonucleotide in vivo, it provides an oligonucleotide made of various modifications for imparting nucleic acid degrading enzyme resistance and reducing nonspecific immune response.
  • the modification of the oligonucleotides is characterized by the fact that the 0H group at the 2 'carbon position of the sugar structure in one or more nucleotides is -CH3 (methyl), -0CH3 (methoxy), -NH2, -F (fluorine), -0—2—methoxyethyl —0-propyl, -0-2-methyl thioethyl, -0-3, aminopropyl, -0-3-dimethylaminopropyl, -0-N- Modification by substitution with methylacetamido or -0-dimethylamidooxyethyl; Modifications in which the oxygen in the sugar structure in the nucleotides is replaced by sulfur;
  • boranophosphate one or more modifications selected from modifications to methyl phosphonate bonds can be used in combination, in the form of peptide ide nucleic acid (PNA), locked nucleic acid (LNA), or unlocked nucleic acid (UNA). Variations to the same can also be used (Ann. Rev. Med. 55, 61-65 2004; US 5,660, 985; US 5,958,691; US 6,531,584; US 5,808,023; US 6,326,358; US 6, 175,001; Bioorg. Med. Chem. Lett. 14: 1139-1143, 2003; RNA, 9: 1034-1048, 2003; Nucleic Acid Res.
  • PNA peptide ide nucleic acid
  • LNA locked nucleic acid
  • UPA unlocked nucleic acid
  • the modified base of the present invention comprises one or more modifications selected from the group consisting of methyl at ion, glycosyllat ion and halogenated ion. More preferably, the modified base of the present invention is a 2'-0 methylat ion or a 2'-fluorinated base.
  • 2'-0 methylation means methylation at the hydroxyl group bound to the second carbon of the ribose of the RNA molecule, which is transformed into a 2'-methoxy group, and 2'-fluorination is the ribose of the RNA molecule It means that the hydroxyl group bonded to the carbon 2 of is substituted with a fluoro group is modified to a 2'-fluoro group.
  • the base 2'-0 methylated in the nucleotides of the invention is U or G.
  • the base 2 '-fluorinat ion in the nucleotide of the present invention is C.
  • the present inventors prepared modified siRNAs by introducing 2'-OMe and / or 2'-F modification to the oligonucleotide disclosed in the prior invention Korean Patent No. 10-1197627.
  • HeLa, HPV type 18 positive cervical cancer cell line Cells or HPV type 16 positive cervical cancer cell line SiHa cells were treated with chemically modified siRNAs to evaluate tumor cell proliferation inhibitory ability, and TP53, E6 and E7 protein expression inhibitory results. And inhibited the expression of E6 and E7 proteins and increased the expression of TP53 protein. (Examples 3 to 5).
  • the variants were also found to have excellent serum stability (Example 6).
  • the effect of the modified siRNAs as sensitizers on radiation therapy was evaluated. That is, the combination of siRNA having a nucleic acid sequence of SEQ ID NOS: 1 to 10 and radiation therapy in cervical cancer cell lines resulted in better tumor cell proliferation inhibitory effect, TP53 protein expression inducing effect, and E7 protein compared with radiotherapy alone. It showed expression suppression effect, apoptosi s inducing effect, and cell aging promoting effect.
  • _ si ⁇ A modified body strains ⁇ HE ⁇ can be shown to be an excellent effect as a sensitizer for radiation therapy in the treatment of cancer caused by Ares infection. (Examples 7 to 10).
  • Oligonucleotides having a nucleic acid sequence of SEQ ID NOS: 1 to 10 of the present invention are treated as a combination therapy for radiation therapy for the treatment of cancer caused by HPV infection, and thus excellent as a sensitizer capable of maximizing the therapeutic effect of radiation therapy. It is effective.
  • the combination therapy may be a method of administering the radiation sensitizing composition of the present invention sequentially or simultaneously with radiation therapy, and the sequential irradiating the radiation after administering the sensitizing composition or the radiation sensitizing composition after radiation. Means that. Or it may be a method of administering the radiation-sensitive composition twice after 1 day and 2 days after irradiation, but is not limited thereto.
  • the present invention thus provides a sensitizing composition for radiation therapy, characterized in that administered sequentially or simultaneously with radiation therapy.
  • the present invention also includes an oligonucleotide having any one nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 10 as an active ingredient, and concurrent anti-cancer chemoradiotherapy of cancer caused by HPVQiuman papi l loma virus infection
  • CCRT chemoradiat ion therapy
  • Concurrent chemoradiotherapy is known to be a major treatment for locally advanced cervical cancer by improving overall survival and disease-free survival over radiotherapy alone.
  • Simultaneous chemoradiotherapy has the advantage that the effects of radiation and anticancer agents are synergistic and shorten the duration of treatment and reduce the likelihood of cross resistance.
  • Anticancer drugs play a large role as radio-sensit isers, and cisplat in, 5-FU, and pacl itaxel are mainly used.
  • the sensitizing composition according to the present invention exhibits the sensitizing effect of reducing the side effects while maximizing the therapeutic effect by improving the sensitivity of damage to the radiation and anticancer agents of cancer cells in the concurrent anticancer chemoradiotherapy treatment of cancer caused by the HPV infection. It was.
  • the present invention also provides a radiosensitizing composition characterized by comprising both siRNA molecules in which SEQ ID NOs: 1 and 2 are localized, siRNA molecules in which SEQ ID NOs: 3 and 4 are localized.
  • the present invention also provides a radiosensitization which comprises both siRNA molecules with SEQ ID NOs. 5 and 6, siRNA molecules with SEQ ID NOs. 7 and 8, and siRNA molecules with SEQ. To provide a composition. EMBODIMENT OF THE INVENTION Hereinafter, the figure of this invention is demonstrated.
  • GFP-specific siRNA control siRNA was used as a control;
  • FIGS. 3 and 4 E7 expression and silencing efficiency of TP53 qkfgusdml qusghkdp eogks 2′-OMe modified siRNA derivatives were confirmed by Western blot. ⁇ -act in was used as loading control;
  • FIG. 9 Gel electrophoresis analysis shows the serum stabi li ty of 2′-0Me modified siRNA derivatives. Unmodified siRNAGane 0) and modified siRNA 426 derivatives or siRNA 497 derivatives were analyzed via electrophoresis under 15% polyacrylamide gel conditions. 10 to 13 show the synergistic effect of HPV type 16 or type 18 E6 / E7-specific and chemically modified siRNA treatment and radiation combination therapy on cervical cancer cells.
  • HeLa cells were transfected into the cells with siRNA variant pairs selected from the group consisting of 20 nM SEQ ID NOS 1 to 10 or siRNA Pool (SP) of ⁇ , and additionally gamma-irradiation ( ⁇ -irradiat ion).
  • siHa cells were also transfected with siRNA variant pairs selected from the group consisting of 20 nM SEQ ID NOS: 1-10 or 7 nM siRNA Pool (SP), and further gamma irradiation ( ⁇ —irradiat ion).
  • the cell number of cancer cells was determined by siRNA alone (non-IR) or siRNA combined with gamma irradiation. Cells in which siRNA was introduced into the cells and controls that did not have intracellular transfection were used as controls. More specifically,
  • FIG. 10 Traypan blue detection test shows cells in which siRNA pool has been transfected, siRNA alone, and live cells in radiation-siRNA conditions;
  • FIG. 11 Western blotting analysis showing TP53 and HPV E7 protein left expression (M, mock; C, control siRNA; SP, siRNA pool.);
  • FIG. 12 Annexin-V and PI binding detection test results showing a percentage analogy of dead cells in which selected siRNA derivatives were transfected into cells.
  • FIG. 13 Results showing the effect of HPV E6 / E7-specific siRNA on cell aging.
  • the present invention provides the use of an oligonucleotide having any one nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 10 for the preparation of a sensitizing agent for the radiation therapy of cancer caused by HPVOiuman papi l loma virus) infection. to provide.
  • the present invention provides a composition comprising an oligonucleotide having any one nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 10 to an individual in need thereof.
  • Provided is a method for sensitizing radiotherapy of cancer caused by HPV human papi l loma virus) infection, which is administered in an effective amount.
  • the present invention provides the use of an oligonucleotide having any one nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 10 for the preparation of a sensitizing agent for the radiation therapy of cancer
  • composition comprising a ligonucleotide having a nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 10;
  • HPVChuman papi l loma virus comprising a radiotherapy method of cancer caused by infection.
  • the term 'effective amount' of the present invention when administered to an individual, generically refers to an amount that enhances the effect of cancer treatment, which may include treating, substantially preventing, or ameliorating the cancer.
  • the term 'individual' may be an animal, preferably an animal including a mammal, particularly a human, or may be a cell, tissue, organ or the like derived from the animal. The subject may be a patient in need of treatment.
  • treatment' of the present invention refers generically to ameliorating symptoms caused by cancer, which may include treating, substantially preventing, or ameliorating the condition, wherein one symptom is fraught with cancer. Or alleviate, heal, or prevent most of the symptoms.
  • 'sensitization' refers to increasing the therapeutic effect of radiation or anticancer drugs by improving the sensitivity of cancer cells to radiation or anticancer drugs when treating cancer with radiation or an anticancer agent. Preferably it is to improve the sensitivity of cancer cells caused by HPV infection to radiation and anticancer agents.
  • the oligonucleotide of the present invention inhibits the expression of E6 and E7, which are carcinogenic proteins of HPV virus, inhibits the proliferation of tumor cells and enhances the sensitivity of tumor cells to radiation, thereby maximizing apoptosis effect. As an excellent effect.
  • [Brief Description of Drawings] 1 is a diagram confirming the cell proliferation inhibitory effect of cervical cancer cell lines infected with HPV type 18 or type 16 virus by siRNA treatment of the present invention
  • FIG. 1A Effect on HeLa cell lines infected with HPV type 18, Comparative Examples (1, 2, 3, 4, 6 and 7), siRNA 426 (No. 5), localized to SEQ ID NOs: 1 and 2)
  • Figure IB Effect on SiHa cell lines infected with HPV type 16, Comparative Examples (1, 3 and 4), siRNA 497 (No. 2) localized to SEQ ID NOs: 9 and 10)
  • Figure 2 is a result of evaluating the expression changes of TP53 and E7 protein in cervical cancer cell line infected with HPV type 18 or type 16 virus by siRNA treatment of the present invention (Figure 2A: Effect in HeLa cell line infected with HPV type 18, 2B: Effect on SiHa cell lines infected with HPV type 16).
  • Figure 3 is a result of evaluating the expression changes of E6 mRNA in cervical cancer cell lines infected with HPV type 18 or type 16 virus by siRNA treatment of the present invention (Figure 3A: Effect in HeLa cell lines infected with HPV 18, Figure 3B: Effect on SiHa cell lines infected with HPV 16).
  • FIG. 4 is a result of evaluating the expression changes of CDKN1A mRNA in cervical cancer cell lines infected with HPV type 18 or type 16 virus by siRNA treatment of the present invention (FIG. 4A: Effect in HeLa cell line infected with HPV 18, FIG. 4B: Effect on SiHa cell lines infected with HPV 16).
  • FIG. 5 is a result of evaluating the plasma stability of the siRNA of the present invention (Fig. 5A: 426 siRNA, Fig. 5B: 497 siRNA).
  • FIG. 6 is a diagram confirming the cell proliferation inhibitory effect of cervical cancer cell line infected with HPV type 18 or type 16 and virus by the combination treatment of siRNA and radiation of the present invention (FIG. 6A: Effect in HeLa cell line infected with HPV type 18; 6B: Effect on SiHa cell lines infected with HPV type 16).
  • FIG. 7 is a result of evaluating expression changes of TP53 and E7 proteins in cervical cancer cell lines infected with HPV type 18 or type 16 virus by co-treatment with siRNA and radiation of the present invention (FIG. 7A: HeLa cell line infected with HPV type 18). Effect in FIG. 7B: Effect on SiHa cell line infected with HPV type 16).
  • FIG. 8 shows the results of evaluating the effect of apoptosis on cervical cancer cell lines infected with HPV type 18 or type 16 virus by co-treatment with siRNA of the present invention
  • FIG. 8A HeLa cell line infected with HPV 18
  • FIG. 8B Effect on SiHa cell line infected with HPV 16 times
  • 9 is a result of confirming the effect of inducing cell aging of cervical cancer cell lines infected with HPV type 18 or type 16 virus by the combination treatment of siRNA and radiation of the present invention
  • Figure 9A Effect in HeLa cell line infected with HPV type 18
  • 9B Effect on SiHa cell lines infected with HPV type 16).
  • HeLa cells are HPV18-positive human cervical cancer cell lines.
  • HeLa-Luc a bioluminescent human tumor cell line stably transduced from HeLa cell line
  • SiHa an HPV16-positive human cervical cancer cell line
  • Amer ican Type Culture Collect ion Manassas, VA, USA
  • the membrane was blocked using 53 ⁇ 4> skim milk, incubated with TP53, E7, and ⁇ -act in primary antibody and horseradish peroxidase-con j ugat ed IgG. Finally, the expression level of the protein was detected using the ECL solution.
  • siRNA transfection and gamma irradiation SiRNAs and controls for HPV18 E6 / E7C426, 450) and HPV16 E6 / E7 (366, 448, 497) were synthesized in BIONEER (Dae-joen, Korea).
  • siRNA transfection was performed with DharmaFect (Dharmacon, Lafayette, Co., USA) and was performed according to the manufacturer's instructions. It was designed and synthesized in chemically modified (2'-sugar modification by 2'-OMe, 2-F ') siRNA duplex derivatives ⁇ BIONEER (Dae-jeon, Korea). All siRNAs were grafted in DEPC treated water, with a final concentration of 5yg / y L.
  • cells were incubated at a density of 5 ⁇ 10 5 cells / 100 ⁇ s dish. After 24 hours, cells were exposed to gamma rays of 2-3 GY in GC 3000 Elan iraadiator (MDS Nordion, Canada). The following day, the cells were trypsinized and the cells were re-plated at a density of 3 ⁇ 10 5 cell / 100 mm dish.
  • Apoptotic cells were stained with annex in V-f luorescence isothiocyanate (FITC) and Propidium iodide (BD PharMingen, San Diego, Calif., USA) according to the manufacturer's instructions and quantified by flow cytometry.
  • FITC V-f luorescence isothiocyanate
  • BD PharMingen Propidium iodide
  • Cells were fixed in 2% formaldehyde / 0.2% glutaaldehyde for sensence analysis, and cells were analyzed for X-Gal (5-bromo-4-chloro-3- for sensence analysis). indolyl-pD-galactopyranoside) at pH 6.0.
  • SA_P_Gal positive cells were counted in three representative fields.
  • Serum Stability siRNA double strands (9 U g) were maintained in 90 y L of 10% human serum at 37 ° C. After each hour (0, 1, 2, 3, 4, 24h), take samples of 12 ⁇ 1 and immediately freeze at _70 ° C. RNAs were separated using 15% polyacrylamide-TBE under undenatured conditions, and after EtBr staining, the results were photographed using a UV-translutor.
  • siRNAs for E6 / E7 tumorous proteins of HPV type 16 and 18 constructed siRNAs for E6 / E7 tumorous proteins of HPV type 16 and 18 as shown in the table below.
  • the siRNA sequence represented by denotes a base substituted with a 2'-0_Me modified nucleotide in which a methyl group is bonded to a base residue. That is, it is expressed as' mU 'for 2' -0-Me modified U or mG 'for 2' -0-Me modified G.
  • HPV type 18 SEQ ID NO: 1 5 '-CAACCmGAmGCACmGACAmGmGAA-3'
  • HPV type 18 SEQ ID NO: 3 5 '-CCAACraGACmGCAmGAmGAAACA-3'
  • HPV type 16 SEQ ID NO: 5 5 '-GCAAAGACAUCmUmGmGACAAA-3'
  • HPV type 16 SEQ ID NO: 7 5 '-UCAAraGAACACmGUAmGAmGAM-3'
  • HPV type 16 SEQ ID NO: 9 5 '-GACCGGUCGAUGUAUGUCUUG-3'
  • siRNA sequences denoted by 'm' represent bases substituted with 2'-0-Me modified nucleotides in which a methyl group is bonded to a base moiety
  • siRNA sequences denoted by T are 2'-fluorinated.
  • Base is shown. Ie mU 'for 2'-0-Me modified U,' raG 'for 2'_0_Me modified G, or' fC for 2'-fluorinated C. It was.
  • HeLa cervical cancer cell lines infected with cervical cancer cells and HPV type 18 virus (HeLa; ATCC CCL-2), and SiHa (SiHa; ATCC HTB-35) cervical cancer cell lines infected with HPV type 16 virus in 5-well plates After dispensing with a cell number of 4 or 1 ⁇ 10 5, the cells were incubated for 24 hours in RPMI1640 or DMEM medium at 37 ° C. and 5% carbon dioxide. siRNA transfection was performed by E> harmaFect (Dhaniiacon, Lafayette, Co., USA) and was performed according to the manufacturer's instructions.
  • siRNA 426 localized to SEQ ID NOs: 1 and 2 in HeLa cell lines infected with HPV type 18 showed an excellent cell proliferation inhibitory effect (No. 5 in FIG. 1A).
  • This effect was achieved by siRNAs localized to SEQ ID NOs: 11 and 12 (No. 1 of FIG. 1A), siRNAs localized to SEQ ID NOs: 13 and 14 (No. 2 of FIG. SiRNA (No. 3 of FIG. 1A), siRNA hybridized to SEQ ID NOs: 17 and 18, siRNA (No. 6 of FIG. 1A), sequenced to SEQ ID NOs: 19 and 20, and SEQ ID NO: 21
  • the effect was best when compared to siRNA localized to 22 (No. 7 of FIG. 1A).
  • siRNA 497 localized to SEQ ID NOs. 9 and 10 in the SiHa cell line infected with HPV type 16 virus showed an excellent cell proliferation inhibitory effect (No. 2 in FIG. 1B).
  • These effects were siRNA localized to SEQ ID NOs: 23 and 24 (No. 1 in FIG. 1B), siRNA localized to SEQ ID NOs: 25 and 26 (No. 3 in FIG. 1B), SEQ ID NOs: 27 and 28 prepared in Comparative Examples. The effect was best when compared to the constructed siRNA (No. 4 in FIG. 1A).
  • E6 and E7 oncoproteins encoded by HPV play an important role in the development of cervical cancer.
  • siRNA 426 localized to SEQ ID NOs: 1 and 2 in HeLa cell lines infected with HPV type 18 virus, and sequenced 9 and 10 in SiHa cell lines infected with HPV type 16 virus. It was confirmed that siRNA 497 strongly induces the expression of TP53 protein and simultaneously inhibits the expression of E7 protein. These effects were found to be remarkably excellent compared to the siRNA produced as a comparative example.
  • siRNA according to the present invention on the mRNA expression of E6 and CDKN1A in HPV infected cervical cancer cell lines was confirmed.
  • the expression of CDKN1A is regulated by p53 protein, a tumor suppressor gene, and CDKN1A is closely related to p53-dependent Gl phase cel l cycle arrest in cells.
  • the expression levels of the E6 and CDKN1A mRNAs were analyzed using TaqMan Quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR). The results are shown in FIGS. 3 and 4.
  • siRNA 426 amplified by SEQ ID NOs: 1 and 2 in HeLa cell lines infected with HPV type 18 virus, and SEQ ID NOs: 9 and 10 in SiHa cell lines infected with HPV type 16 virus. It was confirmed that the siRNA 497 was most effectively inhibited the expression of E6 mRNA and induced the expression of CDKN1A mRNA most effectively.
  • FIG. 5 the serum stability of siRNA 426 localized to SEQ ID NOs: 1 and 2 and siRNA 497 localized to SEQ ID NOs: 9 and 10 were not chemically modified by siRNA (SEQ ID NOs: 11 and 12).
  • siRNAs having nucleic acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 10 exhibited the effect as a sensitizer on radiation combination therapy.
  • SiRNAs of SEQ ID NOs: 1 to 10 were transduced into HeLa cells or Si Ha cells, respectively, according to the same method as in Example 3, and the effects of the combination therapy were evaluated by irradiation. The results for this are shown in FIG. 6.
  • siRNA 426 or siRNA 4.5 alone in the group using siRNA 426 (426_d5 in FIG. 6A) or siRNA 450 (450_d4 in FIG. 6A) treatment and irradiation were applied to HeLa cells infected with HPV type 18 virus.
  • the cell proliferation inhibitory effect was more than doubled.
  • siRNA-42 ⁇ ⁇ siRNA 450 was found to be more than twice as effective in proliferating JL compared with siRNA 426 or siRNA 450 treatment and radiation compared to the radiation-only moc k control group. It was confirmed that the excellent sensitizing effect.
  • siRNA 366 (366_d2 in FIG. 6B), siRNA 488 (448_d2 in FIG. 6B) and siRNA 497 (497_d2 in FIG. 6B) compared to the mock control irradiated with only the radiation to SiHa cells infected with HPV type 16 virus. It was confirmed that siRNA 366, siRNA 488 and siRNA 497 exhibited a good sensitizing effect on radiation therapy in the combination of treatment and irradiation.
  • annexin-V-positive apoptosis was significantly increased in the group treated with radiation alone with siRNA 426, siRNA 450 s iRNA 366, siRNA 488, or siRNA 497 compared to the mock control treated with radiation only. It was confirmed that the siRNA of the present invention is effective as a sensitizer to increase the apoptosis effect of cancer cells by radiation therapy.
  • HeLa cells or SiHa cell lines were transduced with siRNA alone or co-treated with radiation therapy and cultured for one day.
  • cells were treated with 2% formaldehyde / 0.
  • the cells were fixed to glutamate and stained in H 6.0 using X-Gal (5-bromo-4-chIoro-3-indolyl— ⁇ -D-galactopyranoside) as previously performed in the method.
  • SA- -Gal positive cells were counted in three representat ive f i elds. The results are shown in FIG. 9.
  • siRNA 426, siRNA 450 siRNA 366, siRNA 488 or siRNA 497 in combination with the radiation group showed a 10-20-fold increased SA- Gal activity compared to the mock control treated with radiation only It was confirmed that the siRNA variants according to the present invention showed an excellent sensitizing effect on radiation therapy.
  • siRNA variants according to the present invention showed an excellent sensitizing effect on radiation therapy.
  • siRNA pool Evaluation of the radiation sensitization effect of siRNA pool (siRNA pool, SD)
  • siRNAs generated by Dicer represent siRNAs po, which function to silence the expression of genes together.
  • the siRNAs po obtained in this way are efficient silencers and have low drug side effects (of f-target effect).
  • the inventors of the present invention evaluated the apoptosis effects of the HPV type 18 siRNA pool (SP) and the 7 nM and ⁇ HPV type 16 siRNA pool (SP).
  • siRNA combination group (sp) has a superior cell proliferation inhibitory effect, TP53 protein expression inducing effect, E7 protein expression inhibitory effect, apoptosis inducing effect and cell aging induction compared to siRNA alone group It was found that the effect was maximized by radiation combination therapy. Therefore, the siRNA combination group in which each of the siRNA variants according to the present invention is mixed may exhibit excellent radiation sensitizing effect while exhibiting low side effects.
  • the oligonucleotide of the present invention inhibits the expression of the oncogenic proteins E6 and E7 of HPV virus, inhibits the proliferation of tumor cells, and enhances the sensitivity of tumor cells to radiation, thereby maximizing apoptosis effect. As it has an excellent effect, the industrial applicability is high.

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Abstract

본 발명은 HPV 바이러스의 발암 유전자 발현 저해물질을 유효성분으로 포함 하는 암세포 감작용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 서열번호 1 내지 10으 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하며, HPV 감염에 의해 유발된 암 치료에 이용되는 방사선 감작 용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 HPV 바이러스의 발암성 단백질인 E6 및 E7 의 발현을 저해하여 종양세포의 증식을 억제하며, 방사선에 대한 종양세포의 민감 도를 증진시켜 세포사멸 효과를 극대화할 수 있는 감작제로서 우수한 효과가 있다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
HPV 바이러스의 발암 유전자 발현 저해물질을 유효성분으로 포함하는 암세포 감작용 조성물
【기술분야】
본 발명은 HPV 바이러스의 발암 유전자 발현 저해물질을 유효성분으로 포함 하는 암세포 감작용 조성물에 관한 것으로， 보다 상세하게는 서열번호 1 내지 10으 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하고， HPV 감염에 의해 유발된 암 치료에 이용되는 방사선 감작 용 조성물에 관한 것이다.
【배경기술】
본 출원은 2015년 5월 12일에 출원된 대한민국 특허출원 계 10-2015-0066218 호를 우선권으로주장하고, 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다. 고위험성 (High— risk) 인간 유두종 바이러스 (Human Papi l loma Virus : 이하， HPV) type 16， 18 은 자궁경부암 및 자궁경부이형화의 주된 원인이 되는 요인이며 다른 생식기 암과 머리와 목 편평상피세포 암을 일으키는 원인이 된다. 자궁경부암 은 여성에게 약성종양의 가장 일반적인 타입 중의 하나이다. 침윤성 자궁경부암의 발병률은 서서히 감소하고 있지만， 개발도상국의 모든 여성에게는 가장 빈번한 암 으로 여성암의 25%를 차지한다. HPV는 대략 8， 000개의 염기서열을 가진 양성 악성 종양을 일으키는 작은 DNA 바이러스이다. 현재까지 게놈의 차이에 따라 100여개 이 상의 HPV 아류형이 확인되었으며， 대략 90개 정도의 HPV는 유전자형이 완전하게 분 석되어있다. 이러한 타입 중에서 고위험성 HPV type (예를 들면， HPV-16, 18， 31 , 33， 35， 45, 51， 52, 56)은 자궁경부암의 거의 90 »에 관계하고 있다. HPV에 감염된 자궁경부암의 5 이상은 HPV type 16 이 관련이 있으며 다음으로 HPV type 18(12%) , HPV type 45(8%) , HPV type 31(5%) 이 관련이 있다. 이러한 HPV는 2개의 발암성 (oncogenic) 단백질 E6 와 E7을 코드화한다. 이 단백질들은 모두 HPV를 매개 로 한 세포의 불멸화 및 세포 형질 전환에 관계한다. 발암성 E6 단백질은 야생형의 P53 종양 억제 단백질에 결합하여 유비퀴틴 경로를 통하여 p53을 분해시킨다. 한편, E7 단백질은 직접 Rb에 결합하여 과-인산화를 시킨다. 먼저 E6는 E3 유비퀴틴-단백질 리가아제 (ubi qui t in-protein l igase)인 E6-AP(E6_associated protein)와 복합체를 형성한다. 그 후， E6/E6-AP 복합체는 야생형의 p53과 결합하 여 유비퀴틴화 시킴으로 DNA 손상에 대한 p53을 매개로 하는 세포의 반웅을 방해한 다. 주로， p53 종양억제 단백질은 Mdm2를 매개로 하는유비퀴틴화에 의해서 조절되 지만， HPV에 감염된 자궁경부암 세포에서는 p53의 분해는 Mdm2에서 E6를 매개로 하 는 유비퀴틴화로 완전하게 교체된다. 따라서 다른 많은 암과 달리， HPV에 감염된 자궁경부암은 거의 모두 야생형의 p53 유전자를 가진다. 그러나 일관적으로 E6 단 백질에 의해서 분해되므로, p53 단백질의 발현 레벨은 매우 낮다. 특히， HPV E6단 백질은 오로지 자궁경부암 세포만을 죽일 수 있는 특정 타깃이기에 상당한 주목을 받고 있다. Έ6 흑은 E6/E6-AP복합체를 타깃으로 하는 이러한 전략들은 여러 가지 치료를 포함하고 있다. 세포 독소 약의 사용， 바이러스의 E6 발암성 단백질의 아연을 방출하는 억제 제， E6-AP의 모방의 에피토프펩티드 (mimotope) , 항 -E6 리보자임， 바이러스의 E6 발 암성 단백질을 타깃으로 하는 펩티드 압타머， 바이러스의 E6 발암 유전자를 타깃으 로 하는 siRNA 및 이들의 병용처리 등이 있다. 최근, siRNA는 동물 세포에서 선택 적으로 내부 유전자를 침묵시키는 것뿐만이 아니라， 바이러스에 의해 발생된 질병 중에서도 바이러스의 유전자를 선택적으로 침묵시킬 수 있음이 증명되었다. siRNA 의 형질감염에 의해서 일어난 R A 간섭 (RNAi )은 인간의 바이러스 감염을 치료하기 위한 새로운 치료법으로서 등장했다. HPV에 감염된 자궁경부암 세포에서 E6와 E7의 유전자를 타깃으로 하는 siRNA는 p53과 pRb의 축적을 일으켜 아픕토시스 (apoptosi s) 또는 세포노화를 일으킨다. HPV-16에 감염된 자궁경부암 세포주와 HPV-18에 감염된 세포주의 경우에는 바이러스의 E6 및 E7암 유전자를 타깃으로 하 는 RNAi가 선택적으로 이들 단백질의 발현을 침묵시키는 것이 밝혀졌다.
【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
이에, 본 발명자들은 방사선 요법의 수행 시， 함께 처리됨으로써 상승 효과 를 낼 수 있는 E6/E7에 특이적인 siRNA를 찾고자 예의 노력한 결과， 서열번호 1 내 지 10으로 이루어진 군에서 선택되는 센스 을리고뉴클레오티드 및 상기 센스 서열 에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 흔성화하여 이루어진 siRNA가 방사선 요법의 수행 시 병용 치료됨으로써, 단일 치료에 비해 유의하게 높 은 상승 효과를 내는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다. 따라서, 본 발명의 목적은 서열번호 1 내지 10으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하며， HPV human papi l loma virus) 감염에 의해 유발된 암의 방사선 치료를 위한 감작용 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 서열번호 1 내지 10으로 이루어진 군에서 선택된 어 느 하나의 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하며， HPVChuman papi l loma virus) 감염에 의해 유발된 암의 방사선 치료를 위한 감작제 를 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 HPVChuman papi l loma virus) 감염에 의해 유발된 암 의 방사선 치료를 위한 감작용 제제를 제조하기 위한 서열번호 1 내지 10으로 이루 어진 군에서 선택된 어느 하나의 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드의 용도를 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 서열번호 1 내지 10으로 이루어진 군에서 선택된 어 느 하나의 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물은 이를 필요로 하는 개체에 유효량으로 투여하는 것을 특징으로 하는 HPV(human papi l loma virus) 감염에 의해 유발된 암의 방사선 치료의 감작 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 "
(a) 서열번호 1 내지 10으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 핵산 서열 을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 유효량 으로 투여하는 단계 ; 및
(b) 상기 개체에 방사선 요법 치료를 수행하는 단계;
를 포함하는 HPVChuman papi l loma virus) 감염에 의해 유발된 암의 방사선 치료 방법을 제공하는 것이다.
【기술적 해결방법】 상기 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 서열번호 1 내지 10으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하며, HPV human papi l loma virus) 감염에 의해 유발된 암의 방사선 치료를 위 한 감작용 조성물을 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 서열번호 1 내지 10으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 유효 성분으로 포함하며， HPV(human papi l loma virus) 감염에 의해 유발된 암의 방사선 치료를 위한 감작제를 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여， HPVChuman papi l loma virus) 감염 에 의해 유발된 암의 방사선 치료를 위한 감작용 제제를 제조하기 위한저열번호 1 내지 10으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레 오티드의 용도를 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 제공하기 위하여， 서열번호 1 내지 10으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성 물은 이를 필요로 하는 개체에 유효량으로 투여하는 것올 특징으로 하는 HPVChuman papi l loma virus) 감염에 의해 유발된 암의 방사선 치료의 감작 방법을 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 제공하기 위하여，
(a) 서열번호 1 내지 10으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 핵산 서열 을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 유효량 으로투여하는 단계 ; 및
(b) 상기 개체에 방사선 요법 치료를 수행하는 단계;
를 포함하는 HPVChuman papi l loma virus) 감염에 의해 유발된 암의 방사선 치료 방법을 제공한다. 이하 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명은 서열번호 1 내지 10으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 핵 산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하며， HPV(human papi l loma virus) 감염에 의해 유발된 암의 방사선 치료를 위한 감작용 조성물 (sensi t izing composit ion)^- 제공한다 . 본 발명은 또한 서열번호 1 내지 10으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 의 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하며， HPV(human papi l loma virus) 감염에 의해 유발된 암의 방사선 치료를 위한 감작제를 제공한 다. 상기 방사선 감작용 조성물 또는 감작제란 암의 치료시에 암세포의 방사선에 대한 손상 민감도를 향상시켜 치료의 효과를 보다 상승시킬 수 있는 조성물을 의미 한다. 즉， 방사선에 대한 암세포의 내성을 억제하여 방사선에 의한 암세포의 사멸 유도가 쉽게 발생하도톡처라할 수 있는 조성물 또는제제를 와미한다. 본 발명에서 상기 HPV 감염에 의해 유발된 암은 자궁경부암， 질암 (vagina cancer) , 외음부암 (vulvacancer )， 항문암 (anal cancer) , 음경암 (penis cancer) , 편 도암 (tonsi l cancer) , 인두암 (pharynx cancer ) , 후두암 ( larynx cancer) , 머리와 목 암 (head & neck) 및 폐의 선암 ( lung adenocarcinoma)으로 이루어진 군으로부터 선 택되는 것을 특징으로 할 수 있으며， 바람직하게는 자궁경부암일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 상기 올리고뉴클레오티드는 센스 올리고뉴클레오티드 및 이에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드가 상보적으로 흔상화된 siRNA(smal l interfering RNA)인 것을 특징으로 하지만， 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 상기 siRNA는 센스 가닥과 안티센스 가닥이 서로 반대쪽에 위치하여 이중쇄를 이루 는 구조를 가질 수 있다. 또한, 본 발명의 siRNA 분자는, 자기-상보성 (sel f- complementary) 센스 및 안티센스 가닥을 가지는 단일쇄 구조를 가질 수 있다. 바람직하게는, 본 발명은 상기 올리고뉴클레오티드는 센스 을리고뉴클레오티 드 및 이에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드가 상보적으로 흔상화된 siRNA(smal l interfering RNA)인 것을 특징으로 하는 조성물을 제공한다. 본 발명의 상기 올리고뉴클레오티드는 HPV 바이러스의 종양성 단백질인 E6 및 E7의 발현을 저해할 수 있다. 본 발명의 발명자는 본 발명에 앞서 고위험성 (High-risk) 인간 유두종 바이러스 (Human Papilloma Virus: 이하， HPV) type 16, 18의 2개의 발암성 (oncogenic) 단백질인 E6와 E7에 특이적으로 결합할 수 있는 siRNA를 개발한 바가 있다 (한국 등록특허 제 10-1197627호 참조). 한편， 베르트랑 (Bertrand) 연구진에 따르면 동일한 타겟 유전자에 대한 siRNA가 안티센스 을리고뉴클레오티드 (Ant i sense oligonucleotide, ASO)에 바하여 생체 내 /외 (in vitro 및 in vivo)에서 mRNA 발현의 저해효과가 뛰어나고， 해당 효 과가 오랫동안 지속되는 효과를 포함하는 것으로 밝혀졌다 (Comparison of ant i sense oligonucleotides and siRNAs in cell culture and in vivo. Biochem. Biophys. Res.Commun. 2002. 296： 1000-1004) . 또한 siRNA의 작용 기작은 타겟 mRNA와 상보적으로 결합하여 서열 특이적으로 타겟 유전자의 발현을 조절하기 때문 에， 기존의 항체 기반 의약품이나 화학물질 (small molecule drug)에 비하여 적용 할 수 있는 대상이 획기적으로 확대될 수 있다는 장점을 가진다 (Progress Towards in Vivo Use of siRNAs. MOLECULAR THERAPY. 2006 13(4) :664-670) .
상기와 같은 siRNA의 뛰어난 효과 및 다양한 사용범위에도 불구하고， siRNA 가 치료제로 개발되기 위해서는 체내에서의 siRNA의 안정성 (stability) 개선과 세 포 전달 효율 개선을 통해 siRNA가 타겟 세포에 효과적으로 전달되어야 한다는 과 제가 있다 (Harnessing in vivo siRNA delivery for drug discovery and therapeutic development . Drug Discov Today. 2006 Jan; 11(1-2) :67-73) . 상기 문제를 해결하기 위하여， 체내 안정성 개선을 위하여 siRNA의 일부 뉴 클레오티드 또는 골격 (backbone)을 핵산분해효소 저항성을 가지도록 변형 (modification)하거나 바이러스성 백터 (viral vector), 리포좀 또는 나노입자 (nanoparticle) 등의 전달체의 이용 등에 대한 연구가 활발하게 시도되고 있다. 본 발명에서는， 올리고뉴클레오티드의 생체 내 안정성 향상을 위해， 핵산 분 해효소 저항성 부여 및 비특이적 면역반웅 감소를 위한 다양한 변형 (modification) 이 이루어진 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 상기 을리고뉴클레오티드의 변형은 하나 이상의 뉴클레오티드 내 당 구조의 2' 탄소 위치에서 0H기가 -CH3(메틸)， -0CH3(methoxy), -NH2, -F(불소)， -0—2—메톡시에틸 —0-프로필 (propyl )， -0-2-메틸 티오에틸 (methyl thioethyl), -0—3—아미노프로필, -0-3-디메틸아미노프로필， -0-N- 메틸아세트아미도 또는 -0-디메틸아미도옥시에틸로의 치환에 의한 변형 ; 뉴클레오 티드 내 당 (sugar) 구조 내의 산소가 황으로 치환된 변형; 또는 뉴클레오티드결합 의 포스포로티오에이트 (phosphorothioate) 또는 보라노포스페이트
(boranophosphate) , 메틸포스포네이트 (methyl phosphonate) 결합으로의 변형에서 선택된 하나 이상의 변형이 조합되어 사용될 수 있으며， PNA(pept ide nucleic acid) , LNA( locked nucleic acid) 또는 UNA(unlocked nucleic acid) 형태로의 변형 도 사용이 가능하다 (Ann. Rev. Med. 55， 61-65 2004； US 5,660 , 985; US 5,958,691； US 6,531,584； US 5,808,023； US 6,326,358； US 6, 175,001； Bioorg. Med. Chem. Lett . 14: 1139-1143, 2003； RNA, 9: 1034-1048， 2003； Nucleic Acid Res . 31 :589— 595, 2003； Nucleic Acids Research, 38(17) 576175773, 2010； Nucleic Acids Research, 39(5) 182371832, 2011) . 바람직하게는, 본 발명의 변형된 염기는 메틸 화 (methyl at ion) , 글리코실화 (glycosylat ion) 및 할로겐화 (halogenat ion)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변형을 포함한다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 변형된 염기는 2' -0 메틸화 (methylat ion)되거나 2' -플루오로화 (f luorinat ion)된 염기이다.
2' -0 메틸화는 RNA 분자의 리보오스 (ribose)의 2번 탄소에 결합한 하이드록 시기에 메틸화가 되어가 2' -메톡시기로 변형되는 것을 의미하며， 2' -플루오로화 는 RNA 분자의 리보오스의 2번 탄소에 결합한 하이드톡시기가 플루오로기로 치환되 어 2' -플루오로기로 변형되는 것을 의미한다. 본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면， 본 발명의 뉴클레오타이드에서 2' - 0 메틸화 (methylat ion)된 염기는 U또는 G이다. 본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면， 본 발명의 뉴클레오타이드에서 2' - 플루오로화 (f luorinat ion)된 염기는 C 이다. 본 발명의 일실시예에 따르면， 본 발명자들은 선행발명인 한국 등록특허 제 10-1197627호에 개시된 올리고뉴클레오티드에 2' -OMe 및 /또는 2' -F 변형을 도입 하여 변형된 siRNAs를 제작하였다. 본 발명의 일실시예에 따르면， HPV 타입 18 양성 자궁경부암 세포주인 HeLa 세포 또는 HPV 타입 16 양성 자궁경부암 세포주인 SiHa 세포를 화학적으로 변형된 siRNA로 처리하여 종양세포 증식 억제능 평가， TP53 , E6 및 E7 단백질 발현 억제능 을 평가한 결과， 본 발명의 siRNA들은 우수한 종양세포 증식 억제능을 나타냈으며， E6 및 E7 단백질의 발현을 저해하고 TP53 단백질의 발현을 증가시키는 효과를 나타 내었다. (실시예 3 내지 5) . 또한， 상기 변형체들은 혈청 안정성도 매우 우수한 것 으로 확인되었다 (실시예 6) . 본 발명의 다른 일실시예에서는, 상기 변형된 siRNA들의 방사선 요법에 대한 감작제로서의 효과를 평가하였다. 즉， 서열번호 1 내지 10의 핵산서열을 갖는 siRNA 및 방사선 요법을 자궁경부암 세포주에 병용처리한 결과, 방사선 요법만을 단독으로 처리한 것과 비교해 더 우수한 종양세포 증식 억제능， TP53 단백질 발현 유도 효과， E7 단백질 발현 억제 효과， 세포사멸 (apoptosi s) 유발 효과 및 세포 노 화 촉진 효과를 나타내었다. 이를 통해 ：상기 _ si週 A 변ᅳ형ᅳ체ᅳ들^ HE¥ 브ᅵ:아레스ᅳ감염 에 의해 유발되는 암의 치료에 있어서， 방사선 요법에 대한 감작제로서 우수한 효 과를 나타낼 수 있음을 확인할 수 있었다 (실시예 7 내지 10) . 본 발명의 서열번호 1 내지 10의 핵산서열을 갖는 올리고뉴클레오티드는 HPV 감염에 의해 유발된 암의 치료를 위한 방사선 요법에 대한 병용요법으로 처리되어 방사선 요법의 치료효과를 극대화 할 수 있는 감작제로서 우수한 효과를 발휘한다. 상기 병용요법이란 방사선 치료와 순차적으로 또는 동시에 본 발명의 방사선 감작 용 조성물을 투여하는 방법일 수 있으며 상기 순차적으로란 방사선 조사 후 감작용 조성물을 투여하거나 방사선 감작용 조성물을 투여한 후 방사선을 조사하는 것을 의미한다. 또는 방사선 조사 1일 후 및 2일 후 두 차례에 걸쳐 방사선 감작용 조성 물을 투여하는 방법일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 이에 본 발명은 방사선 치료와 순차적으로 또는 동시에 투여되는 것을 특징 으로 하는 방사선 치료를 위한 감작용 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 서열번호 1 내지 10으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 의 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하며， HPVQiuman papi l loma virus) 감염에 의해 유발된 암의 동시항암화학 방사선요법 (concurrent chemoradiat ion therapy, CCRT) 치료를 위한 감작용 조성물을 제공한다. 동시항암화학 방사선요법 (CCRT)은 단독 방사선요법보다 전체 생존율과 무병 생존율을 향상시킴으로써 국소 진행된 자궁경부암의 주된 치료법으로 알려져 있다. 동시항암화학 방사선요법은 방사선과 항암제의 효과가 상호 상승작용을 나타내며， 치료기간을 단축시키고 교차내성의 가능성을 줄이는 이점을 가진다. 항암제는 방사 선민감제 (radio-sensit iser)로서의 역할이 크며 주로 사용하는 약제로는 cisplat in, 5-FU그리고 pacl itaxel 등이 있다. 본 발명에 따른 감작용 조성물은 상기 HPV 감염에 의한 암의 동시항암화학 방사선요법 치료에 있어서， 암세포의 방사선 및 항암제에 대한 손상 민감도를 향상 시켜 치료효과는 극대화하면서 부작용을 줄일 수 있는 감작효과를 나타내었다. 본 발명은 또한 서열번호 1 및 2가 흔성화된 siRNA 분자， 서열번호 3 및 4가 흔성화된 siRNA 분자를 모두 포함하는 것을 특징으로 하는 방사선 감작용 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 서열번호 5 및 6이 흔성화된 siRNA 분자, 서열번호 7 및 8이 흔성화된 siRNA 분자, 서열번호 9 및 10이 흔성화된 siRNA 분자를 모두 포함하는 것을 특징으로 하는 방사선 감작용 조성물을 제공한다. 이하 본 발명의 도면에 대하여 설명한다.
도 1 내지 도 9는 서열번호 1 내지 10의 핵산서열을 갖는 HPV type 16 또는 type 18의 E6/E7-특이적이며 화학적으로 변형된 siRNA의 활성 및 혈청 안정성을 나 타낸 결과이다. 구체적으로，
(a) 도 1 및 ： Trypan blue 검출시험은 siRNA 426의 2 '-OMe 변형 유도체 가 세포내 도입된 살아있는 HeLa 세포들의 수와 siRNA 497의 2' -0Me 변형 유도체가 세포내 도입된 살아있는 SiHa 세포의 수를 나타낸다. GFP-특이적 siRNA (컨트를 siRNA)는 대조군으로 이용되었다;
(b) 도 3 및 4 ： E7 발현과 TP53 qkfgusdml qusghkdp eogks 2' -OMe 변형 siRNA 유도체의 사일런싱 (Si lencing) 효율은 웨스턴 블랏 (western blot )을 이용하 여 확인하였다. β -act in은 로딩 컨트롤로써 이용되었다;
(c) 도 5 및 6 ： E6 및 CDKN1A mRNA 발현의 qRT— PCR 결과이다. (d)도 9 ： 젤 전기영동 분석결과는 2 ' -0Me 변형 siRNA 유도체의 혈청내 안정 성 (serum stabi l i ty)를 나타낸다. 변형되지 않은 siRNAGane 0) 및 변형된 siRNA 426 유도체 또는 siRNA 497 유도체는 15% 폴리아크릴아마이드 젤 조건의 전기영동 을 통해 분석되었다. 도 10 내지 도 13은 자궁경부암 세포들에 대해서 HPV type 16 또는 type 18 의 E6/E7-특이적이며 화학적으로 변형된 siRNA 처리 및 방사선 병용 요법의 상승효 과를 나타낸 결과이다. 즉， HeLa 세포들은 20nM의 서열번호 1 내지 10으로 이루어 진 군에서 선택된 siRNA 변형체 쌍 또는 ΙΟηΜ의 siRNA Pool (SP)로 세포 내 형질감 염 (transfect ion) 되었으며 , 추가적으로 감마선 조사 ( γ -irradiat ion)가 병행되었 다. 비슷하게 SiHa 세포들도 20nM의 서열번호 1 내지 10으로 이루어진 군에서 선 택된 siRNA 변형체 쌍 또는 각각 7nM의 siRNA Pool (SP)로 세포 내 형질감염 (transfect ion) 되었으며， 추가적으로 감마선 조사 ( γ— irradiat ion)가 병행되었다. 암세포의 세포 수는 siRNA 단독 (non-IR) 또는 감마선 조사가 병행된 siRNA으로 구 분되어 결정되었다. 세포 내 형질감염 (transfect ion)이 되지 않은 세포와 컨트를 siRNA가 세포 내 도입된 세포는 대조군으로 사용되었다. 보다 구체적으로,
(a) 도 10 ： Traypan blue 검출시험은 siRNA pool이 세포내 도입 (transfect ion)된 세포， siRNA 단독， 방사선 병행 -siRNA 조건에서의 살아있는 세포 들을 나타낸다;
(b) 도 11 ： TP53과 HPV E7 단백질왼 발현을 나타내고 있는 웨스턴 블로팅 분석 결과이다( M, mock; C, control siRNA; SP, siRNA pool . ) ;
(c) 도 12 ： 선별된 siRNA 유도체가 세포내 도입 (transfect ion)된 사멸세포 들의 퍼센트 비유을 나타내고 있는 Annexin-V 및 PI 결합 검출시험 결과이다.
(d) 도 13 ： 세포 노화에 대한 HPV E6/E7-특이적 siRNA의 효과를 나타낸 결 과이다. 본 발명은 HPVOiuman papi l loma virus) 감염에 의해 유발된 암의 방사선 치 료를 위한 감작용 제제를 제조하기 위한 서열번호 1 내지 10으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드의 용도를 제공한다. 본 발명은 서열번호 1 내지 10으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 핵 산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물은 이를 필요로 하는 개체에 유효량으로 투여하는 것을 특징으로 하는 HPV human papi l loma virus) 감염에 의해 유발된 암의 방사선 치료의 감작 방법을 제공한다. 본 발명은
(a) 서열번호 1 내지 10으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 핵산 서열 을 갖는 을리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 유효량 으로 투여하는 단계 ; 및
(b) 상기 개체에 방사선 요법 치료를 수행하는 단계;
를 포함하는 HPVChuman papi l loma virus) 감염에 의해 유발된 암의 방사선 치료 방법을 제공한다. 본 발명의 상기 '유효량' 이란 개체에게 투여하였을 때, 암 치료 효과를 상 승시키는 양을 포괄적으로 지칭하고， 이는 암을 치유하거나, 실질적으로 예방하거 나， 또는 상태를 개선시키는 것을 포함할 수 있다. 상기 '개체' 란 동물, 바람직하 게는 포유동물， 특히 인간을 포함하는 동물일 수 있으며， 동물에서 유래한 세포， 조직， 기관 등일 수도 있다. 상기 개체는 치료가 필요한 환자 (pat ient ) 일 수 있 다.
본 발명의 상기 '치료' 는 암으로 인한 증상을 개선시키는 것을 포괄적으로 지칭하고， 이는 암을 치유하거나， 실질적으로 예방하거나， 또는 상태를 개선시키는 것을 포함할 수 있으며, 암으로부터 비릇된 한 가지 증상 또는 대부분의 증상을 완 화시키거나， 치유하거나 예방하는 것을 포함하나， 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 '감작 '은 방사선 또는 항암제로 암을 치료할 때， 방사선이 나 항암제에 대한 암세포의 감수성을 향상시킴으로써 방사선 또는 항암제의 치료효 과를 높이는 것을 의미한다. 바람직하게는 HPV 감염에 의해 유발된 암세포의 방사 선 및 항암제에 대한 감수성을 향상시키는 것이다.
【유리한 효과】
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 HPV 바이러스의 발암성 단백질인 E6 및 E7 의 발현올 저해하여 종양세포의 증식을 억제하며, 방사선에 대한 종양세포의 민감 도를 증진시켜 세포사멸 효과를 극대화할 수 있는 감작제로서 우수한 효과가 있다.
【도면의 간단한 설명】 도 1은 본 발명의 siRNA 처리 의한 HPV type 18 또는 type 16의 바이러스에 감염된 자궁경부암 세포주의 세포 증식 억제 효과를 확인한 도면이다;
(도 1A ： HPV type 18에 감염된 HeLa 세포주에서의 효과, 비교예 (1，2，3，4，6 및 7번)， 서열번호 1 및 2로 흔성화된 siRNA 426(5번)
도 IB: HPV type 16에 감염된 SiHa 세포주에서의 효과， 비교예 (1，3 및 4번)， 서열번호 9 및 10으로 흔성화된 siRNA 497(2번) )
도 2는 본 발명의 siRNA처리 의한 HPV type 18 또는 type 16의 바이러스에 감염된 자궁경부암 세포주에서 TP53 및 E7 단백질의 발현 변화를 평가한 결과이다( 도 2A ： HPV type 18에 감염된 HeLa 세포주에서의 효과, 도 2B: HPV type 16에 감 염된 SiHa 세포주에서의 효과) .
도 3은 본 발명의 siRNA처리 의한 HPV type 18 또는 type 16의 바이러스에 감염된 자궁경부암 세포주에서 E6 mRNA의 발현 변화를 평가한 결과이다 (도 3A ： HPV 18번 감염된 HeLa 세포주에서의 효과， 도 3B: HPV 16번 감염된 SiHa 세포주에 서의 효과) .
도 4는 본 발명의 siRNA처리 의한 HPV type 18 또는 type 16의 바이러스에 감염된 자궁경부암 세포주에서 CDKN1A mRNA의 발현 변화를 평가한 결과이다 (도 4A ： HPV 18번 감염된 HeLa 세포주에서의 효과， 도 4B: HPV 16번 감염된 SiHa 세포주 에서의 효과) .
도 5는 본 발명의 siRNA의 혈장 안정성을 평가한 결과이다 (도 5A :426 siRNA, 도 5B: 497 siRNA) .
도 6은 본 발명의 siRNA와 방사선의 병용처리 의한 HPV type 18 또는 type 16와 바이러스에 감염된 자궁경부암 세포주의 세포 증식 억제 효과를 확인한 도면 이다 (도 6A ： HPV type 18에 감염된 HeLa 세포주에서의 효과， 도 6B: HPV type 16 에 감염된 SiHa 세포주에서의 효과) .
도 7은 본 발명의 siRNA와 방사선의 병용처리 의한 HPV type 18 또는 type 16의 바이러스에 감염된 자궁경부암 세포주에서 TP53 및 E7 단백질의 발현 변화를 평가한 결과이다 (도 7A ： HPV type 18에 감염된 HeLa 세포주에서의 효과， 도 7B: HPV type 16에 감염된 SiHa 세포주에서의 효과) .
도 8는 본 발명의 siRNA와 방사선의 병용처리 의한 HPV type 18 또는 type 16의 바이러스에 감염된 자궁경부암 세포주에서 세포사멸 (apoptosis) 유발효과를 평가한 결과이다 (도 8A ： HPV 18번 감염된 HeLa 세포주에서의 효과, 도 8B: HPV 16 번 감염된 SiHa 세포주에서의 효과) . 도 9은 본 발명의 siRNA와 방사선의 병용처리 의한 HPV type 18 또는 type 16의 바이러스에 감염된 자궁경부암 세포주의 세포 노화 유도효과를 확인한 결과이 다 (도 9A ： HPV type 18에 감염된 HeLa 세포주에서의 효과， 도 9B: HPV type 16에 감염된 SiHa 세포주에서의 효과) .
【발명의 실시를 위한 형태】
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단， 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐， 본 발명의 내용이 하기 실 시예에 한정되는 것은 아니다.
<실험방법>
1. 세포주 및 웨스턴 블로팅
HeLa 세포들은 HPV18-양성 인간 자궁경부암 세포주이다. HeLa-Luc(HeLa 세포 주로부터 유래된 안정적으로 형질이 도입된 생체발광 하는 인간 종양 세포주)는 Xenogen Corp(Alameda, CA, USA)로 부터 입수하였다. HPV16-양성 인간 자궁경부암 세포주인 SiHa는 Amer ican Type Cul ture Col lect ion(Manassas , VA, USA)로부터 입 수하였으며, 짧은 염기서열반복을 통하여 검수가 이루어졌다. 세포들은 마이코플라 즈마에 대해 일반적으로 실험되어졌다.
Whole-cel l lysate는 RIPA 버퍼 (10 mM Tr is(pH .4) , 0.15 M NaCl , 5 mM EDTA, 1% Tri ton X-100, 0.5% deoxychol ic acid sodium salt 및 0.1% SDS)를 이용 하여 추출되었다. 원심분리 후， 상층액의 단백질 농도는 BCA 단백질 어세이 키트 (Thermo Fisher Scient i f ic Inc)를 이용하여 측정하였다. 단백질 샘플은 완전한 변 성 (denaturat ion)을 위해 샘플버퍼에 넣고 5분간 끓여졌다. 이 후 샘플들은 6%， 10%, 또는 15% 폴리아크릴아마이드겔에 적용했고， 0.4jtai PVDF membrane(Mi 1 ipore, Bi lerica)에 트랜스퍼 하였다. 트랜스퍼 후， 5¾> 탈지유를 이용하여 membrane을 블 로킹 하였으며, 절절한 농도의 TP53 , E7, β -act in에 대한 일차 항체 및 horseradish perox i dase-con j ugat ed IgG를 넣고 incubat ion 하였다. 최종적으로 ECL용액을 이용하여 단백질의 발현정도를 검출하였다.
2. siRNA 세포내 도입 (transfect ion) 및 감마선 조사 ( γ -irradiat ion) HPV18 E6/E7C426, 450), HPV16 E6/E7(366, 448， 497)에 대한 siRNA 및 컨트 를 siRNA는 BIONEER(Dae-joen, Korea)에서 합성되었다. siRNA 세포내 도입 (transfection)은 DharmaFect(Dharmacon, Lafayette, CO, USA)로 수행하였으며， 제 조사의 설명에 따라 수행하였다. 화학적으로 변형된 (2 '-OMe, 2-F'에 의한 2'- sugar modification) siRNA 이중가닥 유도체 (siRNA duplex derivatives)^ BIONEER(Dae-jeon, Korea)에서 디자인 및 합성되었다. 모든 siRNA들은 DEPC가 처리 된 물에 회석 되어졌으며， 최종 농도는 5yg/yL이다. 방사선 조사를 위해서， 세포 들은 5X105 cells/100隱 dish의 밀도로 배양되었다. 24시간 후, 세포들은 GC 3000 Elan iraadiator(MDS Nordion, Canada)에서 2—3 GY의 감마선에 노출되었다. 다음 날, 세포들은 트립신 처리되고, 3X105 cell/100 mm dish의 밀도로 세포를 분주 (re- plate)하였다.
3. Flow cytometry분석과 senescence-associ ted -galactosidaseCSA- - Gal) 검출시험
사멸세포들은 annex in V-f luorescence isothiocyanate(FITC) 및 Propidium iodide(BD PharMingen, San Diego, CA, USA)로 제조사의 설명에 따라 염색되었으 며, flow cytometry로 정량측정 되었다. 노화분석 (senesence analysis)를 위해 세 포들은 2% 포름알데히드 /0.2% 글루타알데히드에 고정되어졌으며， 노화분석 (senesence analysis)을 위해 세포들은 X-Gal(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-p-D- galactopyranoside)를 이용하여 pH 6.0에서 염색되었다. SA_P_Gal 양성 세포들은 three representative fields에서 세포수를 측정하였다.
4. Quantitative real-time PCR분석
총 RNA는 Trizol RNA 분리 방법 (invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 따라 세 포로부터 추출되었고, 이 후 oligo-dT 프라이머를 이용하여 역전사 되었다. PCR을 위한 프라이머 및 프로브는 TIB M0LBI0L(Berlin, Germany)에서 제작되었다. qRT- PCR은 LightCycler Real-time PCR 검출 시스템 (Roche Diagnostics, Basel, Switzerland)을 이용하여 수행되었다. 세포 및 조직에서 mRNA의 발현정도는 각각 530 nm 및 705 nm에서 측정되었다. PCR 조건은 다음과 같다: 95°C에서 10분， 95°C 에서 10초간 45사이클 반복， 55°C에서 30초， 및 마지막으로 40°C에서 30초.
5. 혈청 안정성 siRNA 이중가닥 (9 U g)은 37°C온도하에 10% 인간혈청 90 y L에서 유지되었다. 각 시간에 따라 (0， 1 , 2， 3， 4， 24h) 12 μ 1의 표본들을 따서 _70°C에서 즉시 냉동 보관한다. RNA들은 변성되지 않는조건의 15% polyacrylamide-TBE를 이용하여 분리 하고， EtBr 염색을 수행한 후에 자외선 투영기 (UV-transi l luminator)를 이용해 결 과를 촬영하였다.
<실시예 1>
HPV type 16 및 18의 E6/E7 siRNA의 제작
본 발명의 발명자들은 하기 표에 나타난 바와 같이 HPV type 16 및 18의 E6/E7 종양성 단백질에 대한 siRNA를 제작하였다. 하기 표에서 으로 표시된 siRNA 서열은 염기 잔기에 메틸기가 결합시킨 2 ' -0_Me 변형 뉴클레오타이드로 치환 된 염기를 나타낸다. 즉， 2 ' -0-Me 변형된 U의 경우 'mU' 로 표시 또는 2 ' -0-Me 변 형된 G의 경우 mG' 로 표시하였다.
【표 11
HPV type 16 및 18 에 대한 siRNA
이특 서¾번호 서염
HPV type 18 서열번호 1 5' -CAACCmGAmGCACmGACAmGmGAA-3'
siRNA 426
서열번호 2 5' -UUCCUGUCGUGCUCGGUUG-3'
HPV type 18 서열번호 3 5' -CCAACraGACmGCAmGAmGAAACA-3'
siRNA 450
서열번호 4 5' -UGUmUUCUCmUGCGmUCGmUUGG-3'
HPV type 16 서열번호 5 5' -GCAAAGACAUCmUmGmGACAAA-3'
siRNA 366
서열번호 6 5' -UUUGUCCAGAUGUCUUUGC-3'
HPV type 16 서열번호 7 5' -UCAAraGAACACmGUAmGAmGAM-3 '
siRNA 488
서열번호 8 5' -UUUCUCUACGUGUUCUUGA-3 '
HPV type 16 서열번호 9 5' -GACCGGUCGAUGUAUGUCUUG-3'
siRNA 497
서열번호 10 5' -AGACAmUACAmUCGACCGGmUCCA-3 ' <비교예 >
HPV type 16 및 18의 E6/E7 siRNA의 제작
본 발명의 발명자들은 상기 실시예 1에서 제작한 HPV type 18 siRNA 426 및 HPV type 16 siRNA 497과 다른 염기에 화학적 변형이 일어난 siRNA를 하기 표 2와 같이 제작하여 효과를 비교하였다. 하기 표에서 'm' 으로 표시된 siRNA 서열은 염 기 잔기에 메틸기가 결합시킨 2'-0-Me 변형 뉴클레오타이드로 치환된 염기를 나타 내며 T 로 표시된 siRNA 서열은 2' —플루오로화 (fluorination)된 염기를 나타낸 다. 즉， 즉， 2'-0-Me 변형된 U의 경우 mU' 로 표시, 2'_0_Me 변형된 G의 경우 ' raG' 로 또는 2' -플루오로화 (fluorination)된 C의 경우 'fC 로 표시하였다.
【표 2】
HPV type 16 및 18 에 대한 siRNA변형체
Figure imgf000019_0001
<실시예 2>
세포배양 및 siRNA 형질도입
자궁경부암세포와 HPV type 18의 바이러스에 감염된 HeLa 자궁경부암 세포주 (HeLa; ATCC CCL-2), HPV type 16의 바이러스에 감염된 SiHa(SiHa; ATCC HTB-35) 자궁경부암 세포주를 6-웰 플레이트에 5X104또는 1X105 의 세포수로 분주한 후 37 °C , 이산화탄소 5% 조건하에서 RPMI1640 또는 DMEM 배지에서 각각 24시간 동안 배 양하였다. siRNA 세포내 도입 (transfection)은 E>harmaFect(Dhaniiacon, Lafayette, CO, USA)로 수행하였으며， 제조사의 설명에 따라 수행하였다.
<실시예 3>
siRNA의 세포 증식 억제 효과 평가 상기 실시예 1의 HPV type 16 또는 type 18의 E6/E7을 표적으로 하는 siRNA 를 상기 실시예 2의 방법으로， HPV type 18의 바이러스에 감염된 HeLa 또는 HPV type 16의 바이러스에 감염된 SiHa 자궁경부암 세포주에 형질도입하였고， 추가로 하루 더 배양한 후， 다시 실시예 2의 방법으로 siRNA를 형질도입하였다. 형질도입 한 뒤 3일 동안 배양한 후 세포수를 측정하였다. 대조군으로는 GFP siRNA를 사용하 였다. 이에 대한 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1A에 나타낸 바와 같이， HPV type 18의 바이러스에 감염된 HeLa세포주에 서 서열번호 1 및 2로 흔성화된 siRNA 426 은 우수한 세포증식 억제효과를 나타내 었다 (도 1A의 5번) . 이러한 효과는 비교예에서 제작된 서열번호 11 및 12로 흔성화 된 siRNA (도 1A의 1번) , 서열번호 13 및 14로 흔성화된 siRNA (도 1A의 2번)， 서열 번호 15 및 16로 흔성화된 siRNA (도 1A의 3번) , 서열번호 17 및 18로 혼성화된 siRNA (도 1A의 4번)，서열번호 19 및 20으로 흔성화된 siRNA (도 1A의 6번) 및 서열 번호 21 및 22로 흔성화된 siRNA (도 1A의 7번)과 비교했을 때 그 효과가 가장 우수 하였다.
도 1B에 나타낸 바와 같이， HPV type 16의 바이러스에 감염된 SiHa 세포주에 서 서열번호 9 및 10으로 흔성화된 siRNA 497 은 우수한 세포증식 억제효과를 나타 내었다 (도 1B의 2번) . 이러한 효과는 비교예에서 제작된 서열번호 23 및 24로 흔성 화된 siRNA (도 1B의 1번)， 서열번호 25 및 26으로 흔성화된 siRNA (도 1B의 3번)， 서열번호 27 및 28로 흔성화된 siRNA (도 1A의 4번)와 비교했을 때 그 효과가 가장 우수하였다.
<실시예 4>
TP53 및 E7 단백질 발현에 미치는 영향
HPV에 의해 인코딩 된 E6와 E7 종양단백질은 자궁 경부암 발병에 중요한 역 할을 한다. 대부분의 HPV관련 자궁암은 다른 암과는 달리 야생형 TP53 유전자를 가 지며， 자궁암에서 TP53 단백질의 수준은 현저하게 낮게 유지된다. 왜냐하면， E6 바 이러스 단백질에 의해 지속적으로 분해 타겟이 되기 때문이다. 이에， 본 발명의 E6/E7 siRNA의 처리에 따른 HPV 18 또는 16 형태 감염 자궁경부암 세포주에서 TP53 및 E7 단백질의 발현 변화를 웨스턴 블롯을 통해 확인하였다. 이에 대한 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이 , HPV type 18의 바이러스에 감염된 HeLa세포주에서 는 서열번호 1 및 2로 흔성화된 siRNA 426이， HPV type 16의 바이러스에 감염된 SiHa 세포주에서는 서열번호 9 및 10으로 흔성화된 siRNA 497이 TP53 단백질의 발 현을 강하게 유도함과 동시에 E7 단백질의 발현을 억제하는 것을 확인하였다. 이러 한 효과는 비교예로 제작된 siRNA와 비교했을 때 현저히 우수한 효과임을 알 수 있 었다.
<실시예 5>
E6 및 CDKN1A mRNA 발현에 미치는 영향
본 발명에 따른 siRNA가 HPV 감염 자궁경부암 세포주에서 E6 및 CDKN1A의 mRNA 발현에 미치는 영향을 확인하였다. CDKN1A의 발현은 종양억제 유전자인 p53 단백질에 의해 조절되고 있으며， 상기 CDKN1A는 세포의 p53-의존적인 Gl phase cel l cycle arrest에 밀접하게 관련이 되어 있다. 상기 E6 및 CDKN1A mRNA의 발현 정도는 TaqMan quant i tat ive real-t ime PCR(qRT-PCR)을 이용하여 분석하였다. 이에 대한 결과를 도 3 및 도 4에 나타내었다.
도 3 및 4에 나타낸 바와 같이， HPV type 18의 바이러스에 감염된 HeLa세포 주에서는 서열번호 1 및 2로 흔성화된 siRNA 426이， HPV type 16의 바이러스에 감 염된 SiHa 세포주에서는 서열번호 9 및 10으로 흔성화된 siRNA 497이 E6 mRNA의 발 현을 가장 효과적으로 억제하며， CDKN1A mRNA의 발현을 가장 효과적으로 유도한다 는 것을 확인할 수 있었다.
<실시예 6>
siRNA의 혈청 안정성 평가
도 5에 나타낸 바와 같이， 서열번호 1 및 2로 흔성화된 siRNA 426 및 서열번 호 9 및 10으로 흔성화된 siRNA 497의 혈정 안정성은 화학적으로 변형되지 않은 siRNA (서열번호 11 및 12로 흔성화된 siRNA, 도 5A 1번 및 서열번호 23 및 24로 흔 성화된 siRNA, 도 5B 1번)와 비교해 더 우수하다는 것을 알 수 있었다.
<실시예 7>
siRNA와 방사선 병용처리에 의한 세포 증식 억제 효과 서열번호 1 내지 10의 핵산서열을 갖는 siRNA들이 방사선 병용요법에 대한 감작제로서의 효과를 나타내는지 여부를 확인하기 위해 실험을 진행하였다. 서열번 호 1 내지 10의 siRNA를 실시예 3과 동일한 방법에 따라 각각 HeLa 세포 또는 Si Ha 세포에 형질도입 하였으며, 방사선을 조사하여 병용요법에 따른 효과를 평가하였 다. 이에 대한 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6A에 나타낸 바와 같이， HPV type 18 바이러스에 감염된 HeLa 세포에 siRNA 426(도 6A의 426_d5) 또는 siRNA 450(도 6A의 450_d4) 처리와 방사선 조사를 병용한 그룹에서 siRNA 426 또는 siRNA 450 만 단독으로 처리한 그룹과 비교해 두 배 이상 향상된 세포 증식 억제효과를 나타내었다. 또한， 방사선만을 조사한 mock 대조군과 비교해 siRNA 426 또는 siRNA 450 처리와 방사선 조사를 병용한 그룹에서 두 배 이상 우수한 세포 증식 억제 JL과가 나타난 것으로 보의 siRNA- 42β ^는 siRNA 450 이 방사선 요법에 대한 우수한 감작효과를 나타낸다는 것을 확인할 수 있었다.
도 6B에 나타낸 바와 같이， HPV type 16 바이러스에 감염된 SiHa세포에 방사 선만을 조사한 mock 대조군과 비교해 siRNA 366(도 6B의 366_d2), siRNA 488(도 6B의 448_d2) 및 siRNA 497(도 6B의 497_d2) 처리와 방사선 조사를 병용한 그룹에 서 두 배 이상 우수한 세포 증식 억제효과가 나타난 것으로 보아, siRNA 366， siRNA 488 및 siRNA 497 이 방사선 요법에 대한 우수한 감작효과를 나타낸다는 것 을 확인할 수 있었다.
<실시예 8>
siRNA와 방사선 병용처리에 의한 TP53 및 E7 단백질 발현변화
상기 실시예 4의 방법과 동일한 방법으로 siRNA와 방사선 병용처리에 의한 TP53 및 E7 단백질 발현변화를 평가하였다. 이에 대한 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이， siRNA 426， siRNA 450 siRNA 366, siRNA 488 또는 siRNA 497 과 방사선을 병용처리한 그룹에서 TP53 단백질의 발현이 현저히一증가하 였으며, E7 단백질의 발현은 현저히 감소하여 siRNA 426, siRNA 450 siRNA 366ᅳ siRNA 488 및 siRNA 497 의 방사선 요법에 대한 우수한 감작효과를 확인할 수 있었 다.
<실시예 9>
siRNA와 방사선 병용처리에 의한 세포사멸 (aDODtosis) 유발 효과
상기한 방법과 동일한 방법으로 HeLa 세포 또는 SiHa 세포주에 siRNA를 단독 으로 형질도입하거나， 방사선 요법과 병용처리한 후 하루 동안 배양하였다. 세포사 멸 측정 킷트 (BD, USA)를 이용하여 Annexin V와 PKpropidium iodide) 시약으로 염 색하여 상은에서 30분 반웅올 시킨 후， 유세포 분석기를 이용하여 세포의 사멸을 확인하였다. 이에 대한 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타낸 바와 같이， siRNA 426 , siRNA 450 s iRNA 366 , siRNA 488 또는 siRNA 497과 방사선을 병용처리한 그룹에서 방사선만을 처리한 mock 대조군과 비교 해 아넥신 -V-양성인 사멸세포가 현저히 증가함을 확인하여， 본 발명의 siRNA들이 방사선 요법에 의한 암 세포의 세포사멸 효과를 증가시키는 감작제로서 효과가 있 음을 확인하였다.
<실시예 10>
siRNA와 방사선 병용처리에 의한 세포 노화 유도 효과
상기한 방법과 동일한 방법으로 HeLa 세포 또는 SiHa 세포주에 siRNA를 단독 으로 형질도입하거나， 방사선 요법과 병용처리한 후 하루 동안 배양하였다. 노화분 석 (senesence analysi s)를 위해 세포들은 2% 포름알데히드 /0. 글루타말데히드에 고정 되어졌으며， 세포들은 이전에 방법에서 수행된 대로 X-Gal (5-bromo-4-chIoro- 3-indolyl— β -D-galactopyranoside)를 이용하여 H 6.0에서 염색되었다. SA- -Gal 양성 세포들은 three representat ive f i elds에서 세포수를 측정하였다. 이에 대한 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타낸 바와 같이， siRNA 426 , siRNA 450 siRNA 366 , siRNA 488 또는 siRNA 497 과 방사선을 병용처리한 그룹에서 방사선만을 처리한 mock 대조군과 비 교해 10-20배 정도 증가된 SA- Gal 활성을 보여주는 것으로 보아， 본 발명에 따 른 siRNA 변형체들이 방사선 요법에 대한 우수한 감작효과를 보여주는 것을 확인할 수 있었다. <실시예 11>
siRNA혼합군 (siRNA pool , SD)의 방사선 감작 효과 평가
자연에서, Dicer에 의해 발생된 siRNAs는 유전자의 발현을 함께 침묵시키는 기능을 하는 siRNAs po 을 나타낸다. 이러한 방식으로 얻어진 siRNAs po 은 효율 적인 사일런서 (si lencers)이자 낮은 약물 부작용 (of f-target effect )을 가진다. 본 발명의 발명자는 상기한 siRNA의 ΙΟηΜ를 사용하는 HPV type 18 siRNA 풀 (SP)과 7nM와 ΙΟηΜ HPV type 16 siRNA풀 (SP)의 세포사멸 효과를 평가하였다. 도 6 내지 9에 나타낸 바와 같이， siRNA흔합군 (sp)은 siRNA단독 처리한 그 룹과 비교해 우수한 세포 증식 억제효과， TP53 단백질 발현 유도 효과, E7 단백질 발현 억제효과， 세포사멸 유도효과 및 세포노화 유도효과를 나타냈으며， 이러한 효 과는 방사선 병용요법에 의해 보다극대화 되는 것을 확인할수 있었다. 따라서， 본 발명에 따른 siRNA 변형체들 각각을 흔합한 siRNA흔합군은 낮은 부작용을나타내면서 우수한 방사선 감작효과를 나타낼 수 있을 것으로사료된다.
【산업상 이용가능성】
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 HPV 바이러스의 발암성 단백질인 E6 및 E7 의 발현을 저해하여 종양세포의 증식을 억제하며， 방사선에 대한 종양세포의 민감 도를 증진시켜 세포사멸 효과를 극대화할 수 있는 감작제로서 우수한 효과가 있어 산업상 이용가능성이 높다.

Claims

【청구의 범위】
【청구항 11
서열번호 1 내지 10으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하며， HPV human papi l loma virus) 감염에 의해 유발된 암의 방사선 치료를 위한 감작용 조성물 .
【청구항 2]
제 1항에 있어서， 상기 을리고뉴클레오티드는 센스 올리고뉴클레오티드 및 이 에 상보적인 안티센스 을리고뉴클레오티드가 상보적으로 흔성화된 siRNA(smal l interfering RNA)인 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 3】
제 1항에 있어서， 상기 HPV 감염에 의해 유발된 암은 자궁경부암， 질암 (vaginal cancer) , 외음부암 (vulvar cancer) , 항문암 (anal cancer ) , 음경암 (peni s cancer) , 편도암 (tonsi 1 lar cancer) , 인두암 (pharynx cancer) , 후두암 ( laryngeal cancer) , 머리와 목암 (head & neck cancer) 및 폐선암 (adenocarcinoma of lung)으 로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 4】
제 1항에 있어서， 상기 조성물은 방사선 치료와 순차적으로 또는 동시에 투여 되는 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 5】
거 U항에 있어서， 상기 조성물은 동시항암화학 방사선요법 (concurrent cheraoradiat ion therapy) 치료를 위한 것임을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 6】
제 1항에 있어서， 상기 조성물은 서열번호 1 및 2가 흔성화된 siRNA 분자, 서 열번호 3 및 4가 흔성화된 siRNA 분자를 모두 포함하는 것을 특징으로 하는 조성 물
【청구항 7] 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 서열번호 5 및 6이 흔성화된 siRNA 분자， 서 열번호 7 및 8이 흔성화된 siRNA 분자, 서열번호 9 및 10이 흔성화된 siRNA 분자를 모두 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 8】
서열번호 1 내지 10으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하며， HPV human papi l loma virus) 감염에 의해 유발된 암의 방사선 치료를 위한 감작제 .
【청구항 9]
HPVChuman papi l loma virus) 감염에 의해 유발된 암의 방사선 치료를 위한 감작용 제제를 제조하기 위한 서열번호 1 내지 10으로 이루어진 군에서 선택된 어 느 하나의 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드의 용도.
【청구항 10]
서열번호 1 내지 10으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 핵산 서열올 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 유효량으 로 투여하는 것을 특징으로 하는 HPVChuman papi l loma virus) 감염에 의해 유발된 암의 방사선 치료의 감작 방법 .
【청구항 111
제 10항에 있어서， 상기 을리고뉴클레오티드는 센스 올리고뉴클레오티드 및 이에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드가 상보적으로 흔성화된 siRN smal l interfering RNA)인 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 12】
제 10항에 있어서， 상기 HPV 감염에 의해 유발된 암은 자궁경부암， 질암 (vaginal cancer) , 외음부암 (vulvar cancer) , 항문암 (anal cancer) , 음경암 (penis cancer) , 편도암 (tonsi 1 lar cancer) , 인두암 (pharynx cancer ) , 早두암 ( laryngeal cancer) , 머리와 목암 (head & neck cancer) 및 폐선암 (adenocarcinoma of lung)으 로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 13]
제 10항에 있어서， 상기 조성물은 방사선 치료와 순차적으로 또는 동시에 투 여되는 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 14]
제 10항에 있어서， 상기 조성물은 동시항암화학 방사선요법 (concurrent chemoradiat ion therapy) 치료를 위한 것임을 특징으로 하는 방법.
【청구항 15]
(a) 서열번호 1 내지 10으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 핵산 서열 을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 유효량 으로 투여하는 단계 ; 및
(b) 상기 개체에 방사선 요법 치료를 수행하는 단계;
를 포함하는 HPV human papi l loma virus) 감염에 의해 유발된 암의 방사선 치료 방법.
【청구항 16]
제 15항에 있어서， 상기 HPV 감염에 의해 유발된 암은 자궁경부암, 질암 (vaginal cancer ) , 외음부암 (vulvar cancer) , 항문암 (anal cancer) , 음경암 (penis cancer) , 편도암 (tonsi 1 lar cancer) , 인두암 (pharynx cancer) , 후두암 ( laryngeal cancer) , 머리와 목암 (head & neck cancer ) 및 폐선암 (adenocarcinoma of lung)으 로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 17】
제 15항에 있어서， 상기 방사선 치료는 동시항암화학 방사선요법 (concurrent chemoradiat ion therapy) 치료인 것을 특징으로 하는 방법.
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