WO2016178431A1 - ポリイオンコンプレックス型ポリマーソームを用いたナノリアクタとその製造方法 - Google Patents

ポリイオンコンプレックス型ポリマーソームを用いたナノリアクタとその製造方法 Download PDF

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WO2016178431A1
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picsome
polyion complex
asp
pharmaceutical composition
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片岡　一則
泰孝 安楽
大輝 末吉
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国立大学法人 東京大学
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    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/0102—Alpha-glucosidase (3.2.1.20)

Definitions

  • the present invention relates to a nanoreactor using a polyion complex type polymersome and a method for producing the nanoreactor.
  • Patent Document 1 provides a nanocapsule encapsulating an alcohol oxidase enzyme and a catalase enzyme.
  • the nanocapsules of Patent Document 1 have been proposed as those for degrading blood alcohol and treating symptoms such as hangover and acute alcoholism.
  • Patent Document 2 describes a technique for encapsulating a drug or nucleic acid in a vesicle used for drug delivery.
  • Patent Document 3 describes a vesicle formed of a water-soluble and charged polymer as a technique for reducing an environmental load and a procedure when creating a vesicle.
  • the present invention is a nanoreactor using a polyion complex type polymersome (nano-sized reaction field) as a technique for preventing leakage of encapsulated molecules to the outside of a vesicle and stably exhibiting enzyme activity in blood for a long period of time. And a manufacturing method thereof.
  • the present inventors have found that a polyion complex type polymersome encapsulating an enzyme can stabilize the enzyme encapsulated in blood for a long period of time and can maintain the activity of the enzyme for a long period of time.
  • the present inventors have also found that the permeability of a substance can be controlled by the degree of crosslinking of the cationic polymer and anionic polymer constituting the polyion complex type polymersome.
  • the present inventors have revealed that the L-asparaginase-encapsulating polyion complex type polymersome can hydrolyze asparagine in blood extremely efficiently.
  • the present inventors have clarified that other enzymes can be encapsulated in the polyion complex type polymersome, and that the entrapment improves the residence time in blood and maintains the enzyme activity well.
  • the present invention is based on these findings.
  • a polyion complex-type polymersome encapsulating an enzyme The enzyme is an enzyme whose substrate is a substance that permeates the membrane of a polyion complex polymersome.
  • the polyion complex type polymersome according to (1) wherein the molecular weight of the enzyme is 5 kDa or more.
  • Polyion complex type polymersome is A polymer (A) containing an amino acid having a COOH group in the side chain as a monomer unit;
  • a pharmaceutical composition comprising the polyion complex polymersome of (10) above.
  • the pharmaceutical composition is a pharmaceutical composition for administration to a patient suffering from a disease caused by an enzyme deficiency or abnormality, and the enzyme is an enzyme that is deficient or has an abnormality in the subject
  • the pharmaceutical composition according to (11) above, wherein the enzyme is an enzyme selected from L-asparaginase, uricase, ⁇ -galactosidase and ⁇ -glucosidase.
  • the enzyme is an enzyme that degrades nutrients necessary for growth of a neoplasm or a microorganism.
  • the pharmaceutical composition according to the above (13), wherein the enzyme is L-asparaginase, and for treating an asparagine-requiring tumor.
  • the asparagine-requiring tumor is a tumor in which the expression level of the asparagine-producing enzyme is 80% or less with respect to the expression level of the enzyme in normal cells.
  • the enzyme is ⁇ -galactosidase and used for treating a disease caused by abnormality of ⁇ -galactosidase.
  • the pharmaceutical composition according to (11) or (12) above, wherein the enzyme is uricase and is used for treating hyperuricemia or a disease caused by hyperuricemia.
  • the enzyme supplemented with the pharmaceutical composition of the present invention is advantageous in that it has high blood stability and can reduce the immunogenicity of the enzyme produced in a different organism.
  • FIG. 1 shows the particle size distribution (FIG. 1A) of a polyion complex-type polymersome encapsulating L-asparaginase and its transmission electron microscope (TEM) image.
  • FIG. 2 shows the results of analysis by fluorescence correlation spectroscopy of L-asparaginase and naked L-asparaginase encapsulated in polyion complex type polymersomes.
  • FIG. 3 shows a Michaelis-Menten plot (FIG. 3A) and a Lineweaver-Burk plot (FIG. 3B) of naked L-asparaginase.
  • FIG. 4 shows a Michaelis-Menten plot (FIG. 4A) and a Lineweaver-Burk plot (FIG.
  • FIG. 4B shows L-asparaginase encapsulated in polyion complex type polymersomes.
  • FIG. 5 shows the blood retention of L-asparaginase encapsulated in polyion complex polymersomes.
  • FIG. 6 shows the time course of the enzyme reaction rate of L-asparaginase.
  • FIG. 7 shows the blood ammonia nitrogen concentration (FIG. 7A) and the increase in blood ammonia nitrogen concentration (FIG. 7B) in mice administered with L-asparaginase via the tail vein.
  • FIG. 8 shows the EDC equivalent as a crosslinking agent, the FT-IR spectrum (FIG. 8A) of the obtained polyion complex type polymersome, and the relationship between the crosslinking ratio (%) and the EDC equivalent (FIG.
  • FIG. 9 shows the particle size (FIG. 9A), polydispersity (PDI) (FIG. 9B), and TEM image (FIG. 9C) of the polyion complex type polymersome before and after crosslinking.
  • FIG. 10 shows the relationship between the size of molecules to be encapsulated and the concentration of the molecules used, and the particle size of the resulting polyion complex-type polymersome.
  • FIG. 11 shows changes over time in the release rate of inclusions (FIG. 11A) and the relationship between the cross-linking rate and the release rate constant in polyion complex type polymersomes having various cross-linking rates (%) shown in the figure (FIG. 11B). ).
  • FIG. 11A shows the release rate of inclusions (FIG. 11A) and the relationship between the cross-linking rate and the release rate constant in polyion complex type polymersomes having various cross-linking rates (%) shown in the figure (FIG. 11B).
  • FIG. 12 shows the change over time in the release ratio of polyethylene glycol (PEG) having different molecular weights from polyion complex-type polymersomes.
  • PEG6 molecular weight 6k
  • PEG20 molecular weight 20k
  • PEG42 molecular weight 42k
  • LC indicates the release rate in the polyion complex type polymersome having a crosslinking rate of less than 40%
  • HC indicates the release rate in the polyion complex type polymersome having a crosslinking rate of 80% or more.
  • FPEG means fluorescein labeled PEG.
  • FIG. 13 is a diagram showing the difference in the release rate between linear PEG and branched PEG.
  • FIG. 14 is a diagram showing the relationship between the release rate constant of PEG from the polyion complex type polymersome and the temperature.
  • LC in the figure indicates the release rate in the polyion complex type polymersome having a crosslinking rate of less than 40%
  • HC indicates the release rate in the polyion complex type polymersome having a crosslinking rate of 80% or more.
  • FIG. 15 is a graph showing the relationship between the molecular weight of PEG and the release constant.
  • the circle mark indicates the release rate constant at 4 ° C.
  • the triangle mark indicates 25 ° C.
  • the square mark indicates 37 ° C.
  • the diamond mark indicates the release rate constant at 50 ° C. It shows that it is a release rate constant in PICsome.
  • FIG. 16 shows the relationship between the cumulative release amount (%) at time t and time t. In the figure, the slope is proportional to the diffusion coefficient of the molecules in the membrane of the polyion complex type polymersome.
  • FIG. 17 shows the particle size distribution (FIG. 17A) of PICsome encapsulating ⁇ -galactosidase (hereinafter also referred to as “ ⁇ -GAL”), and naked free ⁇ -galactosidase and PICsome-encapsulated ⁇ -particles by fluorescence correlation spectroscopy. The analysis result of galactosidase is shown.
  • FIG. 17A particle size distribution of PICsome encapsulating ⁇ -galactosidase
  • FIG. 18 shows the analysis results of PICsome-encapsulated ⁇ -glucosidase or uricase by fluorescence correlation spectroscopy by fluorescence correlation spectroscopy.
  • FIG. 19 shows a measurement scheme for retention in blood of PICsome-encapsulated ⁇ -GAL (FIG. 19A) and its enzyme activity (FIG. 19B).
  • polymer or “polymer” refers to a molecule formed by polymerizing monomer units, and is used to include homopolymers, copolymers, and block copolymers.
  • homopolymer or “homopolymer” refers to a polymer obtained by polymerizing one type of monomer unit.
  • copolymer refers to a polymer obtained by polymerizing two or more types of monomer units, and is used to include a block copolymer.
  • block copolymer is a copolymer formed by linking a block in which the same type of monomer units are continuously formed and a block in which another type of monomer units is continuously formed. Say polymer.
  • polyion complex type polymersome is also called PICsome and means hollow fine particles formed by the polyion complex. It is known that the outer surface of PICsome is preferably modified with polyethylene glycol from the viewpoint of residence time in blood.
  • polyion complex means that a copolymer of PEG and an anionic block and a copolymer of PEG and a cationic block are charged in an aqueous solution. It is an ionic layer formed between the cationic block and the anionic block of both block copolymers when mixed so as to neutralize.
  • the significance of linking PEG and the above-mentioned charged chain is that the polyion complex is prevented from aggregating and precipitating, and thereby the polyion complex has a monodisperse core-shell structure with a particle size of several tens of nm. Forming nano-particles.
  • one charged block copolymer does not require a PEG moiety and may be replaced with a homopolymer, surfactant, nucleic acid and / or enzyme.
  • at least one of the anionic polymer and the cationic polymer forms a copolymer with PEG, and both of them may form a copolymer with PEG. Further, when the PEG content is reduced, PICsome is likely to be formed.
  • PICsome and the enzyme can be mixed and vigorously stirred. Stirring can be performed using a stirring device such as a vortex mixer (trademark). Moreover, even if an enzyme coexists at the time of PICsome formation, the enzyme can be included in PICsome.
  • enzyme means a protein having catalytic activity. It is known that the molecular weight of an enzyme is generally widely distributed around 10 kDa to 200 kDa.
  • subject refers to mammals including humans.
  • the subject may be a healthy subject or a subject suffering from some disease.
  • the present inventors encapsulated the enzyme in PICsome and brought the substrate of the enzyme into contact with the PICsome from the outside of the PICsome.
  • the enzyme was kept inside the PICsome, but the substrate permeates the PICsome membrane. Furthermore, it was found that a substrate outside of PICsome can react with an enzyme in PICsome, and that the reaction product is released out of PICsome.
  • the present inventors have also found that an enzyme encapsulated in PICsome has a significantly improved retention in blood compared with a naked enzyme.
  • the enzyme can be an enzyme that uses a substance that permeates the membrane of the polyion complex polymersome as a substrate.
  • the enzyme has a molecular weight of 5 kDa or more, 10 kDa or more, 20 kDa or more, 30 kDa or more, 40 kDa or more, 50 kDa or more, 60 kDa or more, 70 kDa or more, 80 kDa or more, 90 kDa or more, 100 kDa or more, 110 kDa or more, 120 kDa.
  • an enzyme of 130 kDa or more or 140 kDa or more can be used. If the molecular weight is 5 kDa or more, it can be retained inside the PICsome, but the larger the molecular weight, the less likely to pass through the PICsome and the easier it is to be retained inside.
  • the enzyme substrate can have a molecular weight of less than 5 kDa, 4 kDa or less, 3 kDa or less, 2 kDa or less, 1 kDa or less, 750 Da or less, 500 Da or less, 400 Da or less, 300 Da or less, or 200 Da or less. If the molecular weight is less than 5 kDa, it can permeate the PICsome membrane. However, the smaller the molecular weight, the easier it is to contact the enzyme through the PICsome membrane, and the reaction efficiency increases.
  • the fibrous polymer is also advantageously held in the PICsome, but in the branched polymer, the membrane permeability of the PICsome is further lowered and is more advantageously held in the interior. Therefore, in the present invention, a fibrous protein can be used as the enzyme, but a globular protein can be preferably used.
  • the enzyme encapsulated in PICsome is more stable than the naked enzyme under physiological conditions and in blood.
  • an enzyme encapsulated in PICsome is more stable in blood than a naked enzyme.
  • the enzyme can be an enzyme whose substrate is a plasma component. By doing in this way, the substrate in blood can be processed effectively, maintaining an enzyme and its activity stably in the blood.
  • L-asparaginase can be used as the enzyme.
  • L-asparaginase (hereinafter sometimes referred to as “L-ASP”) is a protein having a molecular weight of about 141 kDa, and hydrolyzes asparagine to produce aspartic acid and NH 3 .
  • L-ASP is commercially available for the treatment of acute lymphoblastic leukemia, for example, commercially available from Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. under the trade name Leinase (trademark).
  • Leinase trademark
  • L-ASP is also used to treat mastocytoma.
  • L-ASP can be administered by intravenous injection.
  • L-ASP is thought to exert an anti-tumor effect by hydrolyzing L-asparagine in the blood and bringing the asparagine-requiring tumor cells into a nutrient-deficient state.
  • asparaginase one derived from Escherichia coli or one derived from Erwinia chrysanthemi can be used.
  • asparaginase derived from these bacteria can cause allergic reactions in humans.
  • asparaginase is encapsulated in PICsome and allergic reaction problems are reduced.
  • L-ASP PEG asparaginase modified with PEG may be used.
  • L-ASP encapsulated in PICsome (hereinafter sometimes referred to as “encapsulated L-ASP”) is referred to as naked L-ASP (hereinafter referred to as “free L-ASP”). Compared to (A), it showed higher blood retention and NH 3 production ability (ie, asparagine hydrolyzing ability). Therefore, according to the present invention, it can be used more effectively than conventional L-ASP in the treatment of asparagine-requiring or sensitive tumor cells. Therefore, according to the present invention, there is provided a pharmaceutical composition containing PICsome, wherein the encapsulated enzyme is L-ASP.
  • the pharmaceutical composition of the present invention containing PICsome whose encapsulating enzyme is L-ASP can be used for treating an asparagine-requiring tumor.
  • Asparagine-requiring tumors include acute leukemias such as acute lymphoblastic leukemia, acute lymphoblastic leukemia, particularly childhood acute lymphoblastic leukemia, acute myeloid leukemia, other acute leukemias, and malignant lymphomas such as T cells Examples include malignant lymphoma, Hodgkin's disease, reticulosarcoma and lymphosarcoma.
  • asparagine-requiring tumors can be identified by examining the expression of asparagine-producing enzymes.
  • an asparagine-requiring tumor has an expression of an asparagine-producing enzyme of 80% or less, 70% or less, 60% or less, 50% or less, 40% or less, or 30% relative to normal cells.
  • the tumor can be 20% or less, 10% or less, 5% or less, 3% or less, or 1% or less.
  • the asparagine-requiring tumor can be either NK cell leukemia or acute myeloid leukemia.
  • the pharmaceutical composition containing PICsome whose encapsulated enzyme is L-ASP according to the present invention is administered to a tumor patient who has developed allergic symptoms (for example, anaphylactic symptoms) by chemotherapy using L-ASP. be able to.
  • PICsome encapsulates enzymes that break down nutrients required by microorganisms such as bacteria and viruses, and induces death and reduction of neoplasms and microorganisms. be able to.
  • uricase can be used as the enzyme to be encapsulated.
  • Uricase EC1.7.33
  • urate oxidase can break down uric acid involved in purine metabolism and caffeine metabolism.
  • uricase can be used for the treatment of hyperuricemia and high uric acidemia (for example, complications) in which the blood uric acid level is high.
  • Diseases caused by hyperuricemia include gout (eg gout nodules and gout arthritis) and hyperuricemia such as urate deposition and uric acid stones, interstitial nephritis, renal failure, and arteriosclerosis. Examples include the cause of the disease
  • a pharmaceutical composition comprising PICsome whose encapsulated enzyme is uricase, and used for treating hyperuricemia or diseases caused by hyperuricemia. Is done.
  • the enzyme encapsulated in PICsome is stable in blood, it can be effectively used to transport the enzyme from the blood into cells by encapsulating the enzyme in PICsome.
  • Numerous enzymes are present in cells, particularly lysosomes, and lysosomal diseases are caused by the deficiency or abnormality of the enzymes. Therefore, in one aspect of the present invention, an enzyme that causes lysosomal disease due to a deficiency or abnormality (for example, a decrease in enzyme activity) is encapsulated in PICsome, and the subject suffers from lysosomal disease due to the enzyme deficiency or abnormality. Can be administered.
  • an enzyme in lysosome for example, ⁇ -galactosidase (hereinafter also referred to as “ ⁇ -GAL”) can be used as an enzyme to be encapsulated.
  • ⁇ -Galactosidase (EC 3.2.1.22) has an activity of hydrolyzing ⁇ -D-galactoside and has an activity of promoting O-transfer of ⁇ -D-galactoside to various alcohol derivatives.
  • ⁇ -Galactosidase which lacks its activity, causes a type of lysosomal disease, Fabry disease.
  • ⁇ -Galactosidase can suppress the improvement and progression of Fabry disease in replacement therapy by infusion.
  • a pharmaceutical composition comprising PICsome whose encapsulating enzyme is ⁇ -galactosidase is a disease caused by an abnormality of ⁇ -galactosidase, for example, an ⁇ -galactosidase such as lysosomal disease (eg, Fabry disease). It can be used to treat diseases caused by decreased activity or defects.
  • a pharmaceutical composition comprising PICsome whose enzyme to be encapsulated is ⁇ -galactosidase, which is used for treating a disease caused by abnormality of ⁇ -galactosidase (for example, lysosomal disease) A composition is provided.
  • ⁇ -glucosidase can be used as an enzyme to be encapsulated.
  • ⁇ -Glucosidase (EC 3.2.1.20) has an activity to hydrolyze ⁇ -1,4-glucoside bond of sugar. If the activity of ⁇ -glucosidase is deficient, it causes lysosomal disease (eg Pombe disease (OMIM No .: 232300)). Therefore, ⁇ -glucosidase can be used to treat diseases caused by abnormalities (eg, decreased activity or deficiency) of ⁇ -glucosidase.
  • abnormalities eg, decreased activity or deficiency
  • Examples of the disease caused by decreased activity or deficiency of ⁇ -glucosidase include diseases caused by decreased activity or deficiency of ⁇ -glucosidase, such as lysosomal disease (eg, Pombe disease). Therefore, according to the present invention, a pharmaceutical composition comprising PICsome whose internal enzyme is ⁇ -glucosidase, which is used for treating a disease caused by decreased activity or deficiency of ⁇ -glucosidase.
  • a pharmaceutical composition is provided.
  • the enzyme of the present invention is not limited to the enzymes described herein, and can be widely used for enzyme replacement therapy for compensating for a deficient enzyme due to deficiency or abnormality in vivo.
  • Examples of the block copolymer forming PICsome include a block copolymer of a PEG block and a polycation block and a homopolyanion, or a block copolymer of a PEG block and a polyanion block and a homopolycation.
  • As the block copolymer it is preferable to use a biodegradable block copolymer, and various copolymers are known as such copolymers, and any of them can be used in principle. .
  • the polycation block includes, for example, cationic natural amino acids and cationic unnatural amino acids, for example, cationic natural amino acids such as histidine, tryptophan, ornithine, arginine and lysine, and / or — (NH— ( A group represented by CH 2 ) 2 ) p —NH 2 , wherein p is an integer of 1 to 5.
  • a cationic side chain for example, a cationic non-natural amino acid polymer block having the cationic side chain, for example, a cationic non-chain such as aspartic acid or glutamic acid having the cationic side chain. Examples include natural amino acid polymer blocks.
  • the polycation block is a group represented by — (NH— (CH 2 ) 2 ) p —NH 2 , where p is an integer of 1 to 5.
  • p is an integer of 1 to 5.
  • the cationic natural amino acid is preferably histidine, tryptophan, ornithine, arginine and lysine, more preferably arginine, ornithine and lysine, still more preferably ornithine and lysine, and still more preferably. Includes lysine.
  • block copolymers having high biocompatibility and biodegradability examples include poly (aspartic acid-tetraethylenepentamine) block copolymers and polyethylene glycol-poly ((5-aminopentyl) -asparagine. Acid) block copolymers can be used.
  • the polycation block In the polycation block, a cationic amino acid and an amino acid having a cationic side chain may be mixed. That is, in one embodiment of the present invention, the polycation block is a polymer of monomer units containing a cationic natural amino acid, a cationic unnatural amino acid, or a cationic natural amino acid and a cationic unnatural amino acid. In some embodiments of the invention, the bond between monomer units in the polycation block is a peptide bond.
  • the cationic unnatural amino acid is a group represented by — (NH— (CH 2 ) 2 ) p —NH 2 as a side chain ⁇ where n is an integer of 1 to 5 ⁇ It is an amino acid having
  • the polycation block includes a cationic natural amino acid and a group represented by — (NH— (CH 2 ) 2 ) p —NH 2 , where p is an integer of 1 to 5. is there.
  • 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, or 100% of the monomer units in the polymer have-(NH- (CH 2 2 ) a group represented by p- NH 2 ⁇ wherein p is an integer of 1 to 5. ⁇ .
  • PICsome can be formed by a block copolymer of a PEG block and a polycation block and a polyion complex of a homopolyanion.
  • the block copolymer of PEG block and polycation block can be a copolymer of PEG block and poly (aminopentyl-aspartic acid).
  • the homopolyanion can be polyaspartic acid.
  • PICsome is a block copolymer of PEG block and polycation block and homopolyanion is a copolymer of PEG block and poly (aminopentyl-aspartic acid) and polyaspartic acid, respectively. can do.
  • the degree of polymerization of the PEG block, polyaspartic acid block and poly (aminopentyl-aspartic acid) block is each independently an integer from 5 to 20,000, preferably from 10 to 5,000. It can be an integer, more preferably an integer of 40 to 500, still more preferably an integer of 5 to 1,000, and even more preferably an integer of 10 to 200.
  • examples of the polycation block include a PEG-poly (N ′-[N- (2-aminoethyl) -2-aminoethyl] -aspartic acid) block copolymer (PEG-P (Asp-DET)). ))
  • PEG-P (Asp-DET) can be prepared according to a conventional method (see Chem. Med. Chem. 1 (2006) 439-444).
  • Asp-DET has a side chain carboxyl group substituted with a diethyltriamine (DET) group (—NH—CH 2 —CH 2 —NH—CH 2 —CH 2 —NH 2 ). Aspartic acid.
  • the structure of P (Asp-DET) is represented by the following chemical formula.
  • R 1 is a hydroxyl group, a protecting group, a hydrophobic group, or a polymerizable group
  • R 4 is H, a protecting group, a hydrophobic group, or a polymerizable group
  • R 3 is a group represented by — (NH— (CH 2 ) 2 ) 2 —NH 2
  • n is an integer of 0 to 5000, for example, an integer of 0 to 500
  • m is an integer from 0 to 5000, for example, an integer from 0 to 500
  • m + n is an integer from 2 to 5000, for example, an integer from 2 to 500
  • n ⁇ m is an integer of 0 or more
  • Each repeating unit in the formula is shown in a specific order for convenience of description, but each repeating unit can be present in any order, each repeating unit may be present randomly, and each repeating unit is They may be the same or different.
  • R 1 or R 4 represents a bond
  • the polyethylene glycol forms a copolymer with the polycation block via the bond.
  • each repeating unit is bonded by a peptide bond.
  • the PICsome may crosslink the cationic polymer and the anionic polymer after forming the PICsome.
  • Crosslinking can be suitably performed using a method well known to those skilled in the art.
  • the PICsome of the present invention is formed using a cationic polymer that may be modified with PEG and an anionic polymer that may be modified with PEG, and then the cationic polymer and the anionic polymer. And can be obtained by crosslinking.
  • the cationic polymer contains a cationic amino acid having an NH 2 group in the side chain as a monomer unit, and has a polymer that may be modified with PEG and a COOH group in the side chain.
  • a polymer containing an anionic amino acid as a monomer unit and optionally modified with PEG is mixed in an aqueous solution to form PICsome, and then 1-ethyl-3- (3-dimethylamino as a crosslinking agent. It may be obtained by crosslinking a cationic polymer and an anionic polymer using propyl) carbodiimide hydrochloride. Crosslinking can be performed after encapsulating the enzyme in PICsome.
  • PICsome is A polymer (A) containing an amino acid having a COOH group in the side chain as a monomer unit; PICsome with a polymer (B) containing an amino acid having an NH 2 group in the side chain as a monomer unit may be used.
  • PICsome with a polymer (B) containing an amino acid having an NH 2 group in the side chain as a monomer unit may be used.
  • 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) can be used to crosslink the polymer (A) and the polymer (B).
  • the crosslinking rate (%) between the cationic polymer and the anionic polymer in PICsome refer to the spectrum of the PEG-PAsp polymer (uncrosslinked) by, for example, Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR) And the ratio of the peak derived from the carboxyl group (1600 cm ⁇ 1 ; derived from the stretching vibration of the COO ⁇ group) to the peak derived from PEG (1460 cm ⁇ 1 ; derived from the bending vibration of the C—H group). Can be calculated.
  • the crosslinking rate can be increased by increasing the amount of crosslinking agent used.
  • a method is provided.
  • the permeability to molecules of less than 5 kDa, 4 kDa or less, 3 kDa or less, 2 kDa or less, 1 kDa or less, 750 Da or less, 500 Da or less, 400 Da or less, 300 Da or less or 200 Da or less is 50% or more and 60% or more. 70% or more, 80% or more, 90% or more, or substantially maintained.
  • a molecule that decreases permeability or a molecule that decreases release rate is 5 kDa or more, 10 kDa or more, 20 kDa or more, 30 kDa or more, 40 kDa or more, 50 kDa or more, 60 kDa or more, 70 kDa or more, 80 kDa or more, 90 kDa or more.
  • an enzyme of 100 kDa or more, 110 kDa or more, 120 kDa or more, 130 kDa or more, or 140 kDa or more can be used.
  • the crosslinking rate (%) between the cationic polymer and the anionic polymer constituting PICsome increases, the release rate of molecules from the inside of PICsome decreases and the release rate constant decreases.
  • the crosslinking rate (%) can be 25% or more, 30% or more, 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70% or more, or 80% or more.
  • the crosslinking rate may be 90% or more.
  • the crosslinking rate (%) is preferably large, and can be preferably 50% or more, 60% or more, 70% or more, or 80% or more.
  • the present invention by increasing the crosslinking rate of the cationic polymer and anionic polymer constituting PICsome, it is possible to reduce the release amount of the encapsulated enzyme to the outside of PICsome, and a 10 mM phosphate buffer solution ( When measured at 37 ° C in pH 7.4), the cumulative release rate (%) of the encapsulated enzyme is 60% or less, 50% or less, 40% or less, 30% on the seventh day after contact with the aqueous solution.
  • PICsome that is 20% or less, 10% or less, or 5% or less is provided.
  • the release rate constant k of a linear polyethylene glycol having a number average molecular weight of 2 kDa is 5 ⁇ 10 ⁇ 3 or less when measured in a 10 mM phosphate buffer solution (pH 7.4) at 37 ° C.
  • a PICsome is provided that is 4 ⁇ 10 ⁇ 3 or less, 3 ⁇ 10 ⁇ 3 or less, 2 ⁇ 10 ⁇ 3 or less, or 1 ⁇ 10 ⁇ 3 or less.
  • the enzyme is 5 kDa or more, 10 kDa or more, 20 kDa or more, 30 kDa or more, 40 kDa or more, 50 kDa or more, 60 kDa or more, 70 kDa or more, 80 kDa or more, 90 kDa or more, 100 kDa or more, 110 kDa or more, 120 kDa or more, 130 kDa or more, or 140 kDa.
  • the above enzymes can be used.
  • a composition containing PICsome for use in encapsulating L-ASP in this aspect, in some embodiments, the PICsome can be a PICsome of the present invention.
  • the composition can be incorporated into PICsome by mixing with L-ASP. Even asparagine outside PICsome can penetrate the PICsome membrane and reach the inside, the composition of the present invention can be used for hydrolysis of asparagine by contacting with asparagine.
  • a composition containing PICsome for use in encapsulating ⁇ -galactosidase in some embodiments, can be a PICsome of the present invention.
  • the composition of the present invention can encapsulate ⁇ -galactosidase inside PICsome by mixing with ⁇ -galactosidase. Since a substrate other than PICsome (for example, globotriaosylceramide) can penetrate the PICsome membrane and reach the inside, the composition of the present invention can be hydrolyzed asparagine by contacting with ⁇ -galactosidase. Can be used.
  • a composition containing PICsome for use in encapsulating uricase is provided.
  • the PICsome can be a PICsome of the present invention.
  • the composition of the present invention can be encapsulated in PICsome by mixing with uricase. Since a substrate other than PICsome (for example, uric acid) can penetrate the PICsome membrane and reach the inside, the composition of the present invention can be used for hydrolysis of urea by contacting with uricase.
  • a composition containing PICsome for use in encapsulating ⁇ -glucosidase is provided.
  • the PICsome can be a PICsome of the present invention.
  • the composition of the present invention can encapsulate ⁇ -glucosidase inside PICsome by mixing with ⁇ -glucosidase. Since a substrate other than PICsome (for example, glycogen) can penetrate the PICsome membrane and reach the inside, the composition of the present invention can be linked to ⁇ -1,4-glucoside by contacting with ⁇ -galactosidase. It can be used for hydrolysis of.
  • a composition containing L-ASP for use in inclusion in PICsome in some embodiments, can be a PICsome of the present invention.
  • the composition can be incorporated into PICsome by mixing with L-ASP. Even asparagine outside PICsome can penetrate the PICsome membrane and reach the inside, the composition of the present invention can be used for hydrolysis of asparagine by contacting with asparagine.
  • a composition containing ⁇ -galactosidase for use in inclusion in PICsome in this aspect, in some embodiments, the PICsome can be a PICsome of the present invention.
  • the composition can include ⁇ -galactosidase within the PICsome by mixing with ⁇ -galactosidase. Since even a substrate outside of PICsome can penetrate the PICsome membrane and reach the inside, the composition of the present invention can be used for hydrolysis of the substrate by contacting with ⁇ -galactosidase.
  • a composition containing uricase for use in inclusion in PICsome is provided.
  • the PICsome can be a PICsome of the present invention.
  • the composition can be encapsulated in PICsome by mixing with uricase. Even urea outside PICsome can penetrate the PICsome membrane and reach the inside, so that the composition of the present invention can be used for hydrolysis of urea by contacting with uricase.
  • a composition containing ⁇ -glucosidase is provided for use in inclusion in PICsome.
  • the PICsome can be a PICsome of the present invention.
  • the composition can encapsulate ⁇ -glucosidase in the interior of PICsome by mixing with uricase. Since even a substrate outside of PICsome can penetrate the PICsome membrane and reach the inside, the composition of the present invention can be used for hydrolysis of the substrate by contacting with ⁇ -glucosidase.
  • a combination of a polycation that may be PEGylated, a polyanion, and L-ASP.
  • a combination of a polycation, an optionally PEGylated polyanion, and L-ASP there is provided a combination of a polycation, an optionally PEGylated polyanion, and L-ASP.
  • the combination of the present invention can be used to prepare a PICsome containing L-ASP.
  • a combination of a polycation that may be PEGylated, a polyanion, and ⁇ -galactosidase is provided.
  • a combination of a polycation that may be PEGylated, a polyanion, and a uricase is provided.
  • a combination of a polycation that may be PEGylated, a polyanion, and an ⁇ -glucosidase is provided.
  • a combination of a polycation, a polyanion that may be PEGylated, and ⁇ -galactosidase is provided.
  • a combination of a polycation, an optionally PEGylated polyanion, and a uricase is provided.
  • a combination of a polycation, an optionally PEGylated polyanion, and ⁇ -glucosidase is provided. These combinations can be used to prepare PICsome containing the enzyme as described above.
  • a method for treating a subject comprising administering a PICsome of the present invention encapsulating an enzyme to a subject in need of administration of the enzyme.
  • a subject can be a subject suffering from a disease due to lack of a specific enzyme or reduced expression thereof.
  • Enzymes include L-ASP, and diseases include asparagine-requiring tumors.
  • diseases include asparagine-requiring tumors.
  • a method of treating an asparagine-requiring tumor comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of PICsome containing L-ASP.
  • Asparagine-requiring tumors include acute leukemias such as acute lymphoblastic leukemia, acute lymphoblastic leukemia, particularly childhood acute lymphoblastic leukemia, acute myeloid leukemia, other acute leukemias, and malignant lymphomas such as T cell malignancies. Examples include lymphoma, Hodgkin's disease, reticulosarcoma and lymphosarcoma.
  • Asparagine-requiring tumors have an expression of asparagine-producing enzyme that is 80% or less, 70% or less, 60% or less, 50% or less, 40% or less, 30% or less, compared to normal cells.
  • the tumor may be 20% or less, 10% or less, 5% or less, 3% or less, or 1% or less.
  • the subject can be a tumor patient who has developed allergic symptoms (for example, anaphylactic symptoms) by chemotherapy using L-APS.
  • the enzyme includes ⁇ -galactosidase
  • the disease includes a disease caused by abnormality of ⁇ -galactosidase (for example, Fabry disease).
  • a method for treating a disease caused by an abnormality in ⁇ -galactosidase for example, a disease caused by decreased activity or deficiency of ⁇ -galactosidase such as lysosomal disease (eg, Fabry disease)).
  • a method comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of PICsome comprising ⁇ -galactosidase.
  • the subject can be a tumor patient who has developed allergic symptoms (eg, anaphylactic symptoms) by chemotherapy using ⁇ -galactosidase.
  • the enzyme includes uricase, and the disease can be used to treat hyperuricemia and diseases caused by hyperuricemia.
  • gout eg gout nodules and gout arthritis
  • hyperuricemia such as urate deposition and uric acid stones, interstitial nephritis, renal failure, and arteriosclerosis. Examples include the disease that causes it. Therefore, according to the present invention, a method for treating hyperuricemia and diseases caused by hyperuricemia, comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of PICsome containing uricase.
  • a method comprising:
  • the subject can be a tumor patient who has developed allergic symptoms (for example, anaphylactic symptoms) by chemotherapy using uricase.
  • the enzyme includes ⁇ -glucosidase
  • the disease includes a disease caused by abnormality of ⁇ -glucosidase (for example, Pombe disease). Therefore, according to the present invention, a method for treating a disease caused by an abnormality in ⁇ -glucosidase (for example, a disease caused by decreased activity or deficiency of ⁇ -glucosidase such as lysosomal disease (eg, Pombe disease)).
  • a method comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of PICsome comprising ⁇ -glucosidase.
  • the subject can be a tumor patient who has developed allergic symptoms (for example, anaphylactic symptoms) by chemotherapy using ⁇ -glucosidase.
  • treatment means to cure, prevent or ameliorate a disease or disorder or to reduce the rate of progression of the disease or disorder. Treatment can be accomplished by administering a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition.
  • Example 1 Preparation of PICsome Encapsulating Enzyme
  • PICsome encapsulating the enzyme L-asparaginase (hereinafter also referred to as “L-ASP”) was prepared.
  • PEG-P polyethylene glycol-poly ( ⁇ -benzyl-L-aspartate) block copolymer
  • PEG-PBLA polyethylene glycol-poly ( ⁇ -benzyl-L-aspartate) block copolymer
  • BLA-NCA ⁇ -benzyl-L-aspartate-N-carboxylic acid anhydride
  • PEG-P polyethylene glycol-polyaspartic acid block copolymer
  • poly ( ⁇ -benzyl-L-aspartate) (homo PBLA polymer) was obtained by polymerization of BLA-NCA. Specifically, 20 g of ⁇ -benzyl-L-aspartate-N-carboxylic anhydride (BLA-NCA) is dissolved in 33.3 mL of N, N′-dimethylformamide (DMF) and 300 mL of dichloromethane. Add 89.0 ⁇ L of N-butylamine to the BLA-NCA solution. The mixed solution was polymerized for 40 hours while maintaining at 35 ° C.
  • BLA-NCA ⁇ -benzyl-L-aspartate-N-carboxylic anhydride
  • Cy5-labeled L-ASP 75 mg of L-ASP was dissolved in 50 mL of 10 mM phosphate buffer (PB, pH 7.4, 0 mM NaCl).
  • Cy5-N-hydroxysuccinimide ester dye pack (manufactured by GE Healthcare, product number: PA25001) 20Vial was dissolved in 5 mL of DMSO, added to the L-ASP solution, and reacted at 25 ° C. for 4 hours. Thereafter, unreacted Cy5-N-hydroxysuccinimide ester molecules were removed using an ultrafiltration tube with a membrane having a fractional molecular weight of 10,000.
  • a 10 mM phosphate buffer (PB, pH 7.4, 0 mM NaCl) solution of DyLight 488 labeled L-ASP or Cy5 labeled L-ASP is concentrated by ultrafiltration, and a fluorescent label of 5.6 mg / mL
  • a modified L-ASP solution was prepared.
  • 5.6 mg / mL L-ASP solution or 5.0 mL of fluorescence-labeled L-ASP solution was mixed with 9.0 mL of an empty PICsome solution and stirred by vortexing (2000 rpm) for 2 minutes.
  • Example 2 Characterization of PICsome
  • the size (Z average particle diameter) and polydispersity index (PDI) of the obtained PICsome were measured with a Zetasizer (Malvern).
  • the shape of PICsome was observed after staining with uranyl acetate using a transmission electron microscope (TEM, JEM-1400).
  • the size (Z average particle diameter) and polydispersity index (PDI) of the obtained L-ASP-encapsulated PICsome were measured with a zeta sizer (Malvern). Size was measured by the diffusion of particles moving by Brownian motion, and the measurement results were converted to particle size and particle size distribution using Stokes-Einstein equation. The micelle shape was evaluated using a transmission electron microscope (TEM, JEM-1400).
  • TEM transmission electron microscope
  • JEM-1400 transmission electron microscope
  • the Z average particle diameter is data obtained by analyzing measurement data of a dynamic light scattering method such as a particle dispersion using a cumulant analysis method.
  • an average value of the particle diameter and a polydispersity index (PDI) are obtained.
  • this average particle diameter is defined as the Z average particle diameter.
  • LN (G1) a + bt + ct 2 + dt 3 + et 4 +...
  • the constant b in is called the second-order cumulant or Z-average diffusion coefficient.
  • the value obtained by converting the value of the Z average diffusion coefficient into the particle size using the viscosity of the dispersion medium and some device constants is the Z average particle size, and is a value suitable for quality control purposes as an index of dispersion stability.
  • the particle size distribution and transmission electron microscope (TEM) image of the PICsome containing the obtained L-ASP were as shown in FIGS. 1A and 1B, respectively.
  • the obtained PICsome containing L-ASP shows a monodisperse particle size distribution having a mode value of about 100 nm in diameter, and as shown in FIG. Many PICsomes having a diameter of about 100 nm were observed.
  • Fluorescence correlation spectroscopy was performed as follows. A confocal laser scanning microscope (LSM 510 META / Confocal3, Carl Zeiss) equipped with a 488 nm Ar laser line was used. The sample solution was dropped into an 8-well chamber, and excitation light irradiation and fluorescence detection were performed through a water immersion objective lens. The fluctuation of the fluorescence intensity was analyzed using an autocorrelation function, and the diffusion time and the fluorescence intensity per particle were calculated.
  • the enzyme activity was evaluated for each of free L-ASP and encapsulated L-ASP.
  • a Michaelis-Menten plot and a Lineweaver-Burk plot for the reaction with 7-amido-4-methylcoumarin) also referred to as “Asp-AMC” were generated. Specifically, first, each solution of Asp-AMC, free L-ASP, and encapsulated L-ASP (in PBS) was allowed to stand at 37 ° C. in a thermostatic bath.
  • the Asp-AMC solution was mixed with each solution of free L-ASP or encapsulated L-ASP, and a predetermined amount was quickly poured into a 96-well plate (Tecan).
  • the plate was placed in a multi-plate reader that had been kept warm at 37 ° C., and the fluorescence intensity was measured over time for a certain time.
  • the reaction rate V was determined by converting a change in fluorescence intensity into a product production rate using a calibration curve prepared using a standard solution of AMC prepared in advance.
  • the Michaelis-Menten coefficient (K m ) was calculated by varying the substrate concentration [S], taking [S] on the horizontal axis, V on the vertical axis, and applying the following equation to the plot results.
  • FIG. 5 shows the relative fluorescence intensity at each time point with the fluorescence intensity immediately after administration as 100%. As shown in FIG. 5, the blood retention of encapsulated L-ASP was much higher than that of free L-ASP.
  • the concentration of ammonia nitrogen in plasma was overwhelmingly higher in the group administered with encapsulated L-ASP than in the group administered with free L-ASP (FIG. 7A). Further, the amount of increase in ammonia nitrogen in the plasma was calculated from the ammonia nitrogen concentration before and after administration, and as shown in FIG. 7B, the plasma ammonia nitrogen concentration hardly increased in the group administered with free L-ASP. On the other hand, in the group administered with the encapsulated L-ASP, the plasma ammonia nitrogen concentration increased dramatically. As described above, the encapsulated L-ASP reacted with the plasma component upon administration, and the plasma component was converted by the enzyme activity to efficiently produce ammonia nitrogen.
  • Example 3 Effect of Chemical Modification of PICsome on Enzyme Reaction
  • L-ASP-encapsulated PICsome was prepared as described in Example 1 except that the concentration of EDC as a cross-linking agent was changed, and the crosslinking rate and the properties of PICsome I investigated the relationship.
  • FIG. 8A shows the FT-IR spectrum of PICsome obtained by treating the EDC concentration of Example 1 with an EDC of 0.5 times, 3 times, 5 times or 10 times that of EDC.
  • the relationship of the crosslinking ratio is shown in FIG. 8B.
  • the crosslinking ratio was calculated by FT-IR.
  • PEG-poly present in Asp copolymer COO - of the group the proportion (%) as a crosslinking ratio of those cross-linked.
  • FIG. 9 shows the relationship between the amount of EDC used for crosslinking and the particle size, the relationship between the EDC amount and polydispersity (PDI), and the relationship between the EDC amount and the PICsome shape.
  • FIG. 9A As a result, as shown in FIG. 9A, no significant difference was observed in particle size (FIG. 9A), polydispersity (FIG. 9B), and PICsome shape (FIG. 9C) at any EDC amount. Moreover, in any EDC amount, the particle size distribution showing monodispersion was obtained with the particle size of 100 nm being the mode value.
  • Example 4 The molecular weight of the substance to be encapsulated and the shape number of the obtained PICsome PEGs of various sizes ranging from 6000 to 42000 in average molecular weight were encapsulated in the PICsome, and the shape of the obtained PICsome was confirmed.
  • PEG was labeled with fluorescein and included in PICsome by the method described in Example 1 at a concentration of 0.5 mg / mL, 1 mg / mL, 3 mg / mL, 5 mg / mL, or 10 mg / mL.
  • PEG6 NOF Corporation, MEPA-50H
  • PEG6 having a number average molecular weight of 6k
  • 12k PEG12 NOF Corporation, MEPA-12T
  • 20k PEG20 NOF Corporation, MEPA-20T
  • 42k PEG42 NOF Corporation, MEPA-40T
  • the particle size was approximately 100 nm, and PICsome having a monodispersed particle size distribution was formed.
  • Example 5 Material permeability of cross-linked PICsome
  • PEG12-encapsulated PICsome was prepared as described in Example 1 except that fluorescein-labeled PEG12 was used at a concentration of 4 mg / mL to crosslink at various EDC amounts. The amount of PEG12 released from PICsome was examined.
  • the cumulative release amount of PEG12 from PEG12-encapsulated PICsome obtained by adjusting the crosslinking rate by adjusting the EDC equivalent amount from Example 3 was determined by size exclusion chromatography and fluorescence intensity analysis. Size exclusion chromatography was performed using a gel filtration chromatography column: Superdex 200-10 / 300GL, GE Healthcare, and a high performance liquid chromatograph: JASCO Corporation, LC-2000plus. The fluorescence intensity was determined by comparing the fraction with an earlier retention time (PEG encapsulated in PICsome) and the later fraction (released PEG) with the fluorescence intensity of fluorescein by a conventional method. The solution conditions were 10 mM phosphate buffer solution (pH 7.4, 37 ° C.). The result was as shown in FIG. 11A.
  • the amount of PEG12 released from PICsome varied depending on the crosslinking rate. Specifically, the higher the crosslinking rate, the more PEG12 was retained in the PICsome.
  • the release rate constant was calculated by applying the obtained cumulative release rate result to the following equation obtained from the primary release model.
  • the release rates of PEG6, PEG20 and PEG42 were examined with a PICsome having a low crosslinking rate (LC) with a crosslinking rate of 40% or less and a PICsome with a high crosslinking rate (HC) having a crosslinking rate of 80% or more. All PEGs were labeled with fluorescein, and the release rate constant was determined as described above. The result was as shown in FIG.
  • PEG6 observed a large release of PEG from PICsome within 1 day, while PEG20 and PEG42 slowly released PEG from PICsome at a constant rate over 0-7 days. It was done. Also, the higher the crosslinking rate, the more the release of PEG from PICsome was suppressed. From this, it was clarified that small molecules easily pass through PICsome and large molecules hardly pass through PICsome. Further, it was revealed that the permeability is relatively high at a molecular weight of 6000 or less, and the permeability is relatively low at a molecular weight of 20000 or more.
  • Example 6 Relationship between molecular structure and PICsome permeability
  • linear PEG PEG12 labeled with fluorescein was used at 4 mg / mL (concentration when mixed with PICsome solution)
  • branched PEG 4-branched PEG (NOF Corporation, PTE-100PA, several PICsome was obtained in the same manner as in Example 1 except that the average molecular weight 10k) was used at 4 mg / mL (concentration when mixed with the PICsome solution).
  • Example 7 Temperature dependence of release rate constant In Examples 5 and 6, the release of inclusions from PICsome was examined under 37 ° C conditions. In this example, the temperature dependence of the release rate constant was clarified.
  • the temperature dependence of the release rate constant was remarkable in the PICsome having a low crosslinking rate of less than 40%.
  • the circle indicates the release rate constant at 4 ° C.
  • the triangle indicates 25 ° C.
  • the square indicates 37 ° C.
  • the rhombus indicates 50 ° C.
  • the white mark indicates the low crosslinking rate and the black indicates the high crosslinking rate in PICsome. Indicates a release rate constant.
  • the left side represents the cumulative release amount (%) at time t
  • D represents the diffusion coefficient of the encapsulated substance in the PICsome film
  • l represents the thickness ( ⁇ 15 nm) of the PICsome film.
  • PICsome due to the nature of PICsome, if PICsome encapsulates a large molecular weight enzyme with a small molecular weight as a substrate to dramatically improve the retention in blood, PICsome can It was revealed that it was possible to continue to react with the substrate in the blood while maintaining a stable state.
  • L-ASP is known to have a growth inhibitory effect on asparagine-requiring tumor cells, and is clinically used as a therapeutic agent for childhood acute lymphoblastic leukemia.
  • This Example shows that the L-ASP-encapsulating PICsome of the present invention has a high effect as a therapeutic drug for childhood acute lymphoblastic leukemia.
  • Example 8A Encapsulation of other enzymes and evaluation of stability
  • ⁇ -galactosidase, ⁇ -glucosidase and uricase were examined for blood stability.
  • ⁇ -GAL-encapsulated PICsome solution As in item 5 of Example 1, an empty PICsome solution was obtained, and then 11.4 mg of ⁇ -galactosidase (hereinafter also referred to as “ ⁇ -GAL”) was added to 10 mM phosphate buffer.
  • the solution (PB, pH 7.4, 0 mM NaCl) was dissolved in 5.7 mL to prepare a 2 mg / mL ⁇ -GAL solution.
  • 1 mL of a 2 mg / mL ⁇ -GAL solution was mixed with 1 mL of an empty PICsome solution and stirred by vortexing for 2 minutes (2000 rpm).
  • ⁇ -Glucosidase and uricase-encapsulating PICsome were prepared in the same manner. As above, an empty PICsome solution was obtained and then 6.2 mg and 10.4 mg of ⁇ -glucosidase and uricase, respectively, 3.1 mL and 5 mg of 10 mM phosphate buffer (PB, pH 7.4, 0 mM NaCl). Dissolve in 2 mL to prepare a 2 mg / mL ⁇ -glucosidase solution and a 2 mg / mL uricase solution.
  • PB phosphate buffer
  • a 2 mg / mL ⁇ -glucosidase solution and a 2 mg / mL uricase solution were each mixed with 1 mL of an empty PICsome solution and vortexed for 2 minutes (2000 rpm). Thereafter, 5.6 mL of a PB solution containing EDC (10 mg / mL), which is a water-soluble condensing agent, was added and allowed to stand overnight to crosslink the polyion complex. Thereafter, using an ultrafiltration tube with a membrane having a molecular weight cut off of 300,000, polymers not involved in PICsome formation, ⁇ -glucosidase and uricase not encapsulated in PICsome, EDC, and the like were removed. Fluorescently labeled ⁇ -glucosidase and uricase solutions were similarly prepared.
  • FCS fluorescence correlation spectroscopy
  • each solution of Gal-AMC, free ⁇ -GAL, and encapsulated ⁇ -GAL was allowed to stand at 37 ° C. in a thermostatic bath. Thereafter, a solution of Gal-AMC was mixed with each solution of free ⁇ -GAL or encapsulated ⁇ -GAL, and a predetermined amount was quickly poured into a 96-well plate (Tecan). The plate was placed in a multi-plate reader that had been kept warm at 37 ° C., and the fluorescence intensity was measured over time for a certain time. Enzyme activity was evaluated by creating a Michaelis-Menten plot and a Lineweaver-Burk plot.
  • reaction rate V was determined by converting a change in fluorescence intensity into a product production rate using a calibration curve prepared using a standard solution of AMC prepared in advance.
  • the Michaelis-Menten coefficient (K m ) was calculated by varying the substrate concentration [S], taking [S] on the horizontal axis, V on the vertical axis, and applying the following equation to the plot results. The results were as shown in Table 2.
  • ⁇ -GAL encapsulated in PICsome was stable in vivo and maintained enzyme activity equivalent to that of free ⁇ -GAL.

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Abstract

本発明は、ポリイオンコンプレックス型ポリマーソームを用いたナノリアクタ（ナノサイズの反応場）とその製造方法を提供する。本発明は、例えば、酵素を内包したポリイオンコンプレックス型ポリマーソームであって、酵素は、ポリイオンコンプレックス型ポリマーソームの膜を透過する物質を基質とする酵素である、ポリイオンコンプレックス型ポリマーソームを提供する。

Description

ポリイオンコンプレックス型ポリマーソームを用いたナノリアクタとその製造方法
　本発明は、ポリイオンコンプレックス型ポリマーソームを用いたナノリアクタとその製造方法に関する。
　血中や体内で目的タンパク質を安定的に維持し、その酵素活性を血中で発揮させることに関して、医療・産業界からのニーズが存在し、様々な技術が開発されている。例えば、特許文献１は、アルコールオキシダーゼ酵素およびカタラーゼ酵素を内包したナノカプセルを提供する。特許文献１のナノカプセルは、血中アルコールを分解し、二日酔いや急性アルコール中毒などの症状を処置するためのものとして提案されている。特許文献２には、薬剤送達に用いるベシクルに薬剤や核酸を内包させる技術が記載されている。また、特許文献３には、ベシクル作成時の環境負荷や手順を低減する技術として、水溶性であり、かつ荷電した重合体により形成されるベシクルが記載されている。
ＷＯ２０１３／６７６３ ＷＯ２０１１／１４５７４５ ＷＯ２０１２／１４９４２
　本発明は、内包した分子のベシクル外への漏洩を防止し、血中において長期に安定して酵素活性を発揮させる技術として、ポリイオンコンプレックス型ポリマーソームを用いたナノリアクタ（ナノサイズの反応場）とその製造方法を提供する。
　本発明者らは、酵素を内包したポリイオンコンプレックス型ポリマーソームが、血中において内包する酵素を長期にわたり安定化できること、および、酵素の活性を長期にわたり維持できることを見いだした。本発明者らはまた、ポリイオンコンプレックス型ポリマーソームを構成するカチオン性ポリマーおよびアニオン性ポリマーの架橋の度合いによって物質の透過性を制御できることを見いだした。本発明者らはさらにまた、Ｌ－アスパラギナーゼ内包ポリイオンコンプレックス型ポリマーソームが、血中のアスパラギンを極めて効率よく加水分解できることを明らかにした。本発明者らは、その他の酵素でもポリイオンコンプレックス型ポリマーソームに内包することができ、内包すると血中滞留時間が向上すること、およびその酵素活性が良好に維持されることを明らかにした。本発明はこれらの知見に基づくものである。
　すなわち、本発明では以下の発明が提供される。
（１）酵素を内包したポリイオンコンプレックス型ポリマーソームであって、
　酵素は、ポリイオンコンプレックス型ポリマーソームの膜を透過する物質を基質とする酵素である、ポリイオンコンプレックス型ポリマーソーム。
（２）酵素の分子量が、５ｋＤａ以上である、上記（１）に記載のポリイオンコンプレックス型ポリマーソーム。
（３）酵素の基質の分子量が、１ｋＤａ以下である、上記（１）または（２）に記載のポリイオンコンプレックス型ポリマーソーム。
（４）酵素が、球状タンパク質である、上記（１）～（３）のいずれかに記載のポリイオンコンプレックス型ポリマーソーム。
（５）酵素が、Ｌ－アスパラギナーゼ、ウリカーゼ、α－ガラクトシダーゼおよびα－グルコシダーゼから選択される酵素である、上記（１）に記載のポリイオンコンプレックス型ポリマーソーム。
（６）ポリイオンコンプレックス型ポリマーソームが、
　ＣＯＯＨ基を側鎖に有するアミノ酸を単量体単位として含む重合体（Ａ）と、
　ＮＨ2基を側鎖に有するアミノ酸を単量体単位として含む重合体（Ｂ）と
のポリイオンコンプレックス型ポリマーソームである、上記（１）～（５）のいずれかに記載のポリイオンコンプレックス型ポリマーソーム。
（７）重合体（Ａ）に存在するＣＯＯＨ基の５０％以上が重合体（Ｂ）のＮＨ2基と架橋されている、上記（６）に記載のポリイオンコンプレックス型ポリマーソーム。
（８）１０ｍＭ　リン酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）中において３７℃条件下で測定した場合に、内包した酵素の累積放出率（％）が前記水溶液と接触後７日目に２０％以下である、上記（１）～（７）のいずれかに記載のポリイオンコンプレックス型ポリマーソーム。
（９）１０ｍＭ　リン酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）中において３７℃条件下で測定した場合に、数平均分子量２ｋＤａの直鎖状ポリエチレングリコールの放出速度定数ｋが５×１０-3以下である、上記（７）に記載のポリイオンコンプレックス型ポリマーソーム。
（１０）上記（１）～（９）のいずれかに記載のポリイオンコンプレックス型ポリマーソームであって、内包される酵素が、血漿成分を基質とする、ポリイオンコンプレックス型ポリマーソーム。
（１１）上記（１０）のポリイオンコンプレックス型ポリマーソームを含んでなる、医薬組成物。
（１２）医薬組成物が、酵素欠損または異常を起因とする疾患に罹患している患者に投与するための医薬組成物であり、酵素が、該対象において欠損した、または異常を有する酵素である、上記（１１）に記載の医薬組成物。
（１３）酵素が、Ｌ－アスパラギナーゼ、ウリカーゼ、α－ガラクトシダーゼおよびα－グルコシダーゼから選択される酵素である、上記（１１）に記載の医薬組成物。
（１４）酵素が、新生物または微生物の生育に必要な栄養素を分解する酵素である、上記（１１）に記載の医薬組成物。
（１５）酵素が、Ｌ－アスパラギナーゼであり、アスパラギン要求性腫瘍を処置するための、上記（１３）に記載の医薬組成物。
（１６）アスパラギン要求性腫瘍が、アスパラギン産生酵素の発現量が、正常細胞における該酵素の発現量に対して８０％以下である腫瘍である、上記（１５）に記載の医薬組成物。
（１７）アスパラギン要求性腫瘍が、急性リンパ性白血病、Ｔ細胞悪性リンパ腫、ＮＫ細胞性白血病および急性骨髄性白血病からなる群から選択される、上記（１５）または（１６）に記載の医薬組成物。
（１８）酵素が、α－ガラクトシダーゼであり、α－ガラクトシダーゼの異常を原因とする疾患を処置することに用いるための、上記（１１）または（１２）に記載の医薬組成物。
（１９）酵素が、ウリカーゼであり、高尿酸血症または高尿酸血症を原因とする疾患を処置することに用いるための、上記（１１）または（１２）に記載の医薬組成物。
（２０）酵素が、α－グルコシダーゼであり、α－グルコシダーゼの異常を原因とする疾患を処置することに用いるための、上記（１１）または（１２）に記載の医薬組成物。
　本発明によれば、本発明の医薬組成物により補充された酵素は、血中安定性が高く、また、異種生物で生成した酵素による免疫原性を削減できる点で有利である。
図１は、Ｌ－アスパラギナーゼを内包したポリイオンコンプレックス型ポリマーソームの粒径分布（図１Ａ）およびその透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）像を示す。 図２は、ポリイオンコンプレックス型ポリマーソーム中に内包させたＬ－アスパラギナーゼ、および裸のＬ－アスパラギナーゼを蛍光相関分光法により解析した結果を示す。 図３は、裸のＬ－アスパラギナーゼのミカエリス・メンテンプロット（図３Ａ）およびラインウィーバー・バークプロット（図３Ｂ）を示す。 図４は、ポリイオンコンプレックス型ポリマーソームに内包させたＬ－アスパラギナーゼにおけるミカエリス・メンテンプロット（図４Ａ）およびラインウィーバー・バークプロット（図４Ｂ）を示す。 図５は、ポリイオンコンプレックス型ポリマーソームに内包させたＬ－アスパラギナーゼの血中滞留性を示す。 図６は、Ｌ－アスパラギナーゼの酵素反応速度の経時変化を示す。 図７は、Ｌ－アスパラギナーゼを尾静脈投与したマウスにおける血中アンモニア窒素濃度（図７Ａ）および血中アンモニア窒素濃度の上昇量（図７Ｂ）を示す。 図８は、架橋剤であるＥＤＣ等量と得られたポリイオンコンプレックス型ポリマーソームのＦＴ－ＩＲスペクトル（図８Ａ）および架橋割合（％）とＥＤＣ等量との関係（図８Ｂ）を示す。 図９は、架橋前と架橋後におけるポリイオンコンプレックス型ポリマーソームの粒径（図９Ａ）、多分散度（ＰＤＩ）（図９Ｂ）およびそのＴＥＭ像（図９Ｃ）を示す。 図１０は、内包させる分子のサイズおよび分子の使用濃度と、得られるポリイオンコンプレックス型ポリマーソームの粒径との関係を示す。 図１１は、図中で示される様々な架橋割合（％）のポリイオンコンプレックス型ポリマーソームにおける、内包物の放出割合の経時的変化（図１１Ａ）および架橋割合と放出速度定数との関係（図１１Ｂ）を示す。 図１２は、分子量の異なるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のポリイオンコンプレックス型ポリマーソームからの放出割合の経時的変化を示す。図１２では、ＰＥＧ６（分子量６ｋ）、ＰＥＧ２０（分子量２０ｋ）、ＰＥＧ４２（分子量４２ｋ）が示されている。図中のＬＣは、架橋率４０％未満のポリイオンコンプレックス型ポリマーソームにおける放出割合を示し、ＨＣは架橋率８０％以上のポリイオンコンプレックス型ポリマーソームにおける放出割合を示す。ＦＰＥＧは、フルオレセイン標識されたＰＥＧを意味する。 図１３は、直鎖ＰＥＧと分岐ＰＥＧとの放出率の差を示す図である。 図１４は、ポリイオンコンプレックス型ポリマーソームからのＰＥＧの放出速度定数と温度との関係を示す図である。図中のＬＣは、架橋率４０％未満のポリイオンコンプレックス型ポリマーソームにおける放出割合を示し、ＨＣは架橋率８０％以上のポリイオンコンプレックス型ポリマーソームにおける放出割合を示す。 図１５は、ＰＥＧの分子量と放出定数との関係を示す図である。図１５では、丸印は４℃、三角印は２５℃、四角印は３７℃、ひし形印は５０℃での放出速度定数を示し、白抜きの印は低架橋率、黒塗りは高架橋率のＰＩＣｓｏｍｅにおける放出速度定数であることを示す。 図１６は、時刻ｔにおける累積放出量（％）と時刻ｔとの関係を示す。図において傾きがポリイオンコンプレックス型ポリマーソームの膜中での分子の拡散係数に比例する。 図１７は、α－ガラクトシダーゼ（以下、「α－ＧＡＬ」ともいう）を内包したＰＩＣｓｏｍｅの粒径分布（図１７Ａ）と、蛍光相関分光法による裸の遊離型α－ガラクトシダーゼとＰＩＣｓｏｍｅ内包型α－ガラクトシダーゼの分析結果を示す。 図１８は、蛍光相関分光法によるＰＩＣｓｏｍｅ内包型α－グルコシダーゼまたはウリカーゼの蛍光相関分光法による解析結果を示す。 図１９は、ＰＩＣｓｏｍｅ内包型α－ＧＡＬの血中滞留性（図１９Ａ）とその酵素活性の測定スキームを示す（図１９Ｂ）。
発明の具体的な説明
　本明細書では、「重合体」または「ポリマー」とは、モノマー単位が重合してできる分子をいい、ホモ重合体、共重合体およびブロック共重合体を包含する意味で用いられる。本明細書では、「ホモ重合体」または「ホモポリマー」とは、１種類の単量体単位を重合させて得られる重合体を言う。本明細書では、「共重合体」とは、２種類以上のモノマー単位を重合させて得られるポリマーを言い、ブロック共重合体を包含する意味で用いられる。本明細書では、「ブロック共重合体」とは、同種の単量体単位が連続して形成されたブロックと別種の単量体単位が連続して形成されたブロックとが連結してなる共重合体を言う。
　本発明では、「ポリイオンコンプレックス型ポリマーソーム」とは、ＰＩＣｓｏｍｅとも呼ばれ、ポリイオンコンプレックスにより形成される中空の微粒子を意味する。ＰＩＣｓｏｍｅは、血中滞留時間の観点では、その外表面をポリエチレングリコールで修飾することが好ましいと知られている。
　本明細書では、「ポリイオンコンプレックス」（以下、「ＰＩＣ」ともいう）とは、ＰＥＧとアニオン性ブロックとの共重合体と、ＰＥＧとカチオン性ブロックとの共重合体とを水溶液中で荷電を中和するように混合すると両ブロック共重合体のカチオン性ブロックとアニオン性ブロックとの間で形成されるイオン層である。ＰＥＧと上記の荷電性連鎖とを結合させる意義は、ポリイオンコンプレックスが凝集して沈殿することを抑制すること、および、それにより、ポリイオンコンプレックスが粒径数十ｎｍの単分散なコア－シェル構造を有するナノ微粒子を形成することである。この際、ＰＥＧはナノ微粒子の外殻（シェル）を覆うため、生体適合性が高く、血中滞留時間を向上させる点で都合がよいことでも知られている。また、ポリイオンコンプレックス形成において、一方の荷電性ブロックコポリマーは、ＰＥＧ部分を必要とせず、ホモポリマー、界面活性剤、核酸および／または酵素に置き換えてもよいことが明らかとなっている。そして、ポリイオンコンプレックス形成においては、アニオン性ポリマーおよびカチオン性ポリマーの少なくとも１つがＰＥＧとの共重合体を形成しており、その両方がＰＥＧとの共重合体を形成していてもよい。また、ＰＥＧ含有量を低減させるとＰＩＣｓｏｍｅが形成されやすい。ＰＩＣｓｏｍｅに酵素を内包させるためには、ＰＩＣｓｏｍｅと酵素を混合して、激しく攪拌することができる。攪拌は、ボルテックスミキサー（商標）などの攪拌装置などを用いて行うことができる。また、ＰＩＣｓｏｍｅ形成時に酵素を共存させてもＰＩＣｓｏｍｅに酵素を内包させることができる。
　本明細書では、「酵素」とは、触媒活性を有するタンパク質を意味する。酵素の分子量は、一般的に１０ｋＤａ～２００ｋＤａを中心として広く分布していることが知られている。
　本明細書では、「対象」とは、ヒトを含む哺乳動物である。対象は、健常の対象であってもよいし、何らかの疾患に罹患した対象であってもよい。
　本発明者らは、ＰＩＣｓｏｍｅに酵素を内包させて、ＰＩＣｓｏｍｅの外部から該酵素の基質をＰＩＣｓｏｍｅと接触させたところ、酵素はＰＩＣｓｏｍｅの内部に保たれたが、基質はＰＩＣｓｏｍｅの膜を透過するために、ＰＩＣｓｏｍｅ外の基質がＰＩＣｓｏｍｅ内の酵素と反応しうること、反応生成物はＰＩＣｓｏｍｅの外に放出されることを見いだした。本発明者らはまた、ＰＩＣｓｏｍｅに内包させた酵素は、裸の酵素と比較して血中滞留性が顕著に向上することも見いだした。
　従って、本発明によれば、酵素を内包したポリイオンコンプレックス型ポリマーソームが提供される。本発明によれば、酵素は、ポリイオンコンプレックス型ポリマーソームの膜を透過する物質を基質とする酵素とすることができる。
　本発明によれば、分子量６ｋＤａのＰＥＧはＰＩＣｓｏｍｅの膜に対する透過性は低かった。また、繊維型でないタンパク質はさらにＰＩＣｓｏｍｅの膜に対する透過性が低いと予想される。従って、本発明のある態様では、酵素は、分子量５ｋＤａ以上、１０ｋＤａ以上、２０ｋＤａ以上、３０ｋＤａ以上、４０ｋＤａ以上、５０ｋＤａ以上、６０ｋＤａ以上、７０ｋＤａ以上、８０ｋＤａ以上、９０ｋＤａ以上、１００ｋＤａ以上、１１０ｋＤａ以上、１２０ｋＤａ以上、１３０ｋＤａ以上または１４０ｋＤａ以上の酵素を用いることができる。分子量は５ｋＤａ以上であればＰＩＣｓｏｍｅ内部に保持することができるが、分子量が大きいほどＰＩＣｓｏｍｅを通過しにくく内部に保持されやすい。
　本発明によれば、酵素の基質は、分子量５ｋＤａ未満、４ｋＤａ以下、３ｋＤａ以下、２ｋＤａ以下、１ｋＤａ以下、７５０Ｄａ以下、５００Ｄａ以下、４００Ｄａ以下、３００Ｄａ以下または２００Ｄａ以下とすることができる。分子量は、５ｋＤａ未満であればＰＩＣｓｏｍｅの膜を透過することができるが、分子量が小さいほどＰＩＣｓｏｍｅの膜を通過して酵素と接触し易くなり、反応効率が高まる。
　本発明によれば、繊維状ポリマーもＰＩＣｓｏｍｅ内に有利に保持されたが、分岐状ポリマーにおいてＰＩＣｓｏｍｅの膜透過性がより低下して内部により有利に保持される。従って、本発明では酵素として、繊維状タンパク質を用いることも可能であるが、好ましくは球状タンパク質を用いることができる。
　本発明によれば、ＰＩＣｓｏｍｅに内包された酵素は、生理的条件下および血中において、裸の酵素と比較して安定である。特に、本発明によれば、ＰＩＣｓｏｍｅに内包された酵素は、血中において、裸の酵素と比較して安定である。従って、本発明のある態様では、酵素は、その基質が血漿成分である酵素とすることができる。このようにすることで、血中において安定的に酵素およびその活性を維持しながら、血中の基質を効果的に処理することができる。
　本発明のある態様では、酵素として、Ｌ－アスパラギナーゼを用いることができる。Ｌ－アスパラギナーゼ（以下「Ｌ－ＡＳＰ」ということがある）は、分子量約１４１ｋＤａのタンパク質であり、アスパラギンを加水分解してアスパラギン酸とＮＨ3を生成する。Ｌ－ＡＳＰは、急性リンパ性白血病の処置用に市販されており、例えば協和発酵キリン社からロイナーゼ（商標）の商品名で市販されている。Ｌ－ＡＳＰは、肥満細胞腫の処置にも用いられる。Ｌ－ＡＳＰは、静脈内注射により投与することができる。
　Ｌ－ＡＳＰは、血中のＬ－アスパラギンを加水分解し、アスパラギン要求性の腫瘍細胞を栄養欠乏状態にすることにより抗腫瘍効果を発揮すると考えられている。アスパラギナーゼとしては、大腸菌（Escherichia coli）由来のものや、エルウィニア・クリサンテミ（Erwinia chrysanthemi）由来のものを用いることができる。しかし、これらの細菌由来のアスパラギナーゼは、ヒトにアレルギー反応を引き起こさせる可能性がある。本発明によれば、アスパラギナーゼは、ＰＩＣｓｏｍｅ中に内包され、アレルギー反応の問題は低減される。Ｌ－ＡＳＰとしては、ＰＥＧで修飾されたＰＥＧアスパラギナーゼを用いてもよい。
　本発明によれば、ＰＩＣｓｏｍｅ中に内包されたＬ－ＡＳＰ（以下、「内包型Ｌ－ＡＳＰ」ということがある）は、裸のＬ－ＡＳＰ（以下、「遊離型Ｌ－ＡＳＰ」ということがある）と比較して高い血中滞留性とＮＨ3生成能（すなわち、アスパラギン加水分解能）を示した。従って、本発明によれば、アスパラギン要求性または感受性の腫瘍細胞の処置において、従来のＬ－ＡＳＰよりも効果的に用いることができる。従って、本発明によれば、内包させる酵素がＬ－ＡＳＰである、ＰＩＣｓｏｍｅを含む医薬組成物が提供される。
　本発明の、内包させる酵素がＬ－ＡＳＰであるＰＩＣｓｏｍｅを含む医薬組成物は、アスパラギン要求性の腫瘍を処置することに用いることができる。アスパラギン要求性の腫瘍としては、急性白血病、例えば、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、特に小児急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、その他の急性白血病、および悪性リンパ腫、例えば、Ｔ細胞悪性リンパ腫、ホジキン氏病、細網肉腫およびリンパ肉腫が挙げられる。
　近年、細胞内のアスパラギン産生酵素の欠損または低発現を示すＮＫ細胞性白血病および急性骨髄性白血病では、アスパラギナーゼ投与によりアスパラギンを枯渇させやすく、腫瘍細胞に細胞死を誘導させることができることが明らかとなった。従って、本発明のある態様では、アスパラギン要求性の腫瘍は、アスパラギン産生酵素の発現を調べることにより同定することができる。例えば、本発明のある態様では、アスパラギン要求性の腫瘍は、アスパラギン産生酵素の発現が、正常細胞に対して８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、３％以下または１％以下の腫瘍とすることができる。本発明のある態様では、アスパラギン要求性の腫瘍は、ＮＫ細胞性白血病および急性骨髄性白血病のいずれかとすることができる。
　本発明の、内包させる酵素がＬ－ＡＳＰであるＰＩＣｓｏｍｅを含む医薬組成物は、Ｌ－ＡＳＰを用いた化学療法によりアレルギー症状（例えば、アナフィラキシー症状）を呈するに至った腫瘍患者を対象として投与することができる。
　腫瘍のような新生物以外にも、細菌およびウイルスなどの微生物が必要とする栄養源を分解する酵素をＰＩＣｓｏｍｅに内包して生体に投与することにより、新生物や微生物の死滅・減少を誘導することができる。
　本発明のある態様では、内包させる酵素として、ウリカーゼを用いることができる。ウリカーゼ（EC1.7.33）は、尿酸オキシダーゼともよばれ、プリン代謝およびカフェイン代謝に関与すし尿酸を分解することができる。そのため、血中の尿酸値が高値を示す高尿酸血症および高尿酸血症を原因とする疾患（例えば、合併症）の処置にウリカーゼを用いることができる。高尿酸血症を原因とする疾患としては、痛風（例えば、痛風結節および痛風関節炎）並びに尿酸塩沈着症および尿酸結石、間質性腎炎、腎不全、および動脈硬化症などの高尿酸血症を原因とする疾患が挙げられる。本発明によれば、内包させる酵素がウリカーゼであるＰＩＣｓｏｍｅを含む医薬組成物であって、高尿酸血症または高尿酸血症を原因とする疾患を処置することに用いるための医薬組成物が提供される。
　さらに、ＰＩＣｓｏｍｅに内包された酵素は血中で安定であることから、ＰＩＣｓｏｍｅに酵素を内包することにより、酵素を血中から細胞内に輸送させることにも有効に利用できる。細胞内、特にライソゾーム内には多数の酵素が存在し、その酵素の欠損又は異常によりライソゾーム病が生じる。従って、本発明のある態様では、欠損又は異常（例えば、酵素活性の低下）によりライソゾーム病を生じる酵素を、ＰＩＣｓｏｍｅに内包させて、当該酵素の欠損又は異常によりライソゾーム病に罹患した対象に対して投与することができる。
　本発明のある態様では、内包させる酵素として、ライソゾーム内の酵素、例えば、α－ガラクトシダーゼ（以下、「α－ＧＡＬ」ともいう）を用いることができる。α－ガラクトシダーゼ（EC3.2.1.22）は、α－Ｄ－ガラクトシドを加水分解する活性を有しており、種々のアルコール誘導体へのα－Ｄ－ガラクトシドのＯ－転移を促進する活性を有する。α－ガラクトシダーゼは、その活性が欠乏するとライソゾーム病の一種、ファブリー病の原因となる。α－ガラクトシダーゼは、点滴投与による補充療法において、ファブリー病の症状の改善や進行を抑えることができる。
　本発明によれば、内包させる酵素がα－ガラクトシダーゼであるＰＩＣｓｏｍｅを含む医薬組成物は、α－ガラクトシダーゼの異常を原因とする疾患、例えば、ライソゾーム病（例えば、ファブリー病）などのα－ガラクトシダーゼの活性低下または欠損を原因とする疾患を処置することに用いることができる。本発明によれば、内包させる酵素がα－ガラクトシダーゼであるＰＩＣｓｏｍｅを含む医薬組成物であって、α－ガラクトシダーゼの異常を原因とする疾患（例えば、ライソゾーム病）を処置することに用いるための医薬組成物が提供される。
　本発明のある態様では、内包させる酵素として、α－グルコシダーゼを用いることができる。α－グルコシダーゼ（EC3.2.1.20）は、糖のα－１，４－グルコシド結合を加水分解する活性を有している。α－グルコシダーゼは、その活性が欠乏するとライソゾーム病（例えば、ポンベ病（OMIM No.: 232300））の原因となる。従って、α－グルコシダーゼは、α－グルコシダーゼの異常（例えば、活性低下または欠損）を原因とする疾患の処置に用いることができる。α－グルコシダーゼの活性低下または欠損を原因とする疾患としては、ライソゾーム病（例えば、ポンベ病）などのα－グルコシダーゼの活性低下または欠損を原因とする疾患が挙げられる。従って、本発明によれば、内用される酵素がα－グルコシダーゼであるＰＩＣｓｏｍｅを含む医薬組成物であって、α－グルコシダーゼの活性低下または欠損を原因とする疾患を処置することに用いるための医薬組成物が提供される。
　本発明の酵素は、ここに記載した酵素に限定されるものではなく、生体内で欠損又は異常により、不足している酵素を補うための酵素補充療法に広く利用することできる。
　ＰＩＣｓｏｍｅを形成するブロック共重合体としては、ＰＥＧブロックとポリカチオンブロックとのブロック共重合体およびホモポリアニオン、または、ＰＥＧブロックとポリアニオンブロックとのブロック共重合体およびホモポリカチオンが挙げられる。ブロック共重合体としては、生分解性であるブロック共重合体を用いることが好ましく、そのような共重合体としては様々な共重合体が知られ、いずれを用いることも原理的に可能である。
　本発明では、ポリカチオンブロックとしては、例えば、カチオン性天然アミノ酸およびカチオン性非天然アミノ酸、例えば、ヒスチジン、トリプトファン、オルニチン、アルギニンおよびリジンなどのカチオン性天然アミノ酸、および／または、－（ＮＨ－（ＣＨ2）2）p－ＮＨ2で表される基｛ここで、ｐは１～５の整数である。｝をカチオン性の側鎖として有するポリマーブロック、例えば、上記カチオン性の側鎖を有するカチオン性非天然アミノ酸のポリマーブロック、例えば、上記カチオン性の側鎖を有するアスパラギン酸またはグルタミン酸などのカチオン性非天然アミノ酸のポリマーブロックが挙げられる。本発明のある態様では、ポリカチオンブロックは、－（ＮＨ－（ＣＨ2）2）p－ＮＨ2で表される基｛ここで、ｐは１～５の整数である。｝を側鎖として有するポリマーブロックである。ここで、カチオン性天然アミノ酸としては、好ましくはヒスチジン、トリプトファン、オルニチン、アルギニンおよびリジンが挙げられ、より好ましくはアルギニン、オルニチンおよびリジンが挙げられ、さらに好ましくはオルニチンおよびリジンが挙げられ、さらにより好ましくはリジンが挙げられる。生体適合性が高く、生分解性であるブロック共重合体としては、例えば、ポリ（アスパラギン酸－テトラエチレンペンタアミン）ブロック共重合体、および、ポリエチレングリコール－ポリ（（５－アミノペンチル）－アスパラギン酸）ブロック共重合体を用いることができる。
　ポリカチオンブロックには、カチオン性アミノ酸およびカチオン性の側鎖を有するアミノ酸が混在していてもよい。すなわち、本発明のある態様では、ポリカチオンブロックは、カチオン性天然アミノ酸、カチオン性非天然アミノ酸、または、カチオン性天然アミノ酸およびカチオン性非天然アミノ酸を含むモノマー単位の重合体である。本発明のある態様では、ポリカチオンブロック中のモノマー単位間の結合はペプチド結合である。本発明の好ましい態様では、カチオン性非天然アミノ酸が、側鎖として－（ＮＨ－（ＣＨ2）2）p－ＮＨ2で表される基｛ここで、ｎは１～５の整数である｝を有するアミノ酸である。また、本発明のある態様では、ポリカチオンブロックは、カチオン性天然アミノ酸並びに－（ＮＨ－（ＣＨ2）2）p－ＮＨ2で表される基｛ここで、ｐは１～５の整数である。｝で修飾されたアスパラギン酸およびグルタミン酸が任意の順番で重合してなるポリカチオンブロックとすることができる。本発明のある態様では、ポリマー中のモノマー単位の４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または１００％が側鎖として－（ＮＨ－（ＣＨ2）2）p－ＮＨ2で表される基｛ここで、ｐは１～５の整数である。｝を有する。
　本発明のある態様では、ＰＩＣｓｏｍｅはＰＥＧブロックとポリカチオンブロックとのブロック共重合体およびホモポリアニオンとのポリイオンコンプレックスにより形成できる。本発明のある特定の態様では、ＰＥＧブロックとポリカチオンブロックとのブロック共重合体は、ＰＥＧブロックとポリ（アミノペンチル－アスパラギン酸）との共重合体とすることができる。本発明のある特定の態様では、ホモポリアニオンは、ポリアスパラギン酸とすることができる。本発明のさらなる特定の態様では、ＰＩＣｓｏｍｅはＰＥＧブロックとポリカチオンブロックとのブロック共重合体およびホモポリアニオンはそれぞれ、ＰＥＧブロックとポリ（アミノペンチル－アスパラギン酸）との共重合体およびポリアスパラギン酸とすることができる。このさらなる特定の態様において、ＰＥＧブロック、ポリアスパラギン酸ブロックおよびポリ（アミノペンチル－アスパラギン酸）ブロックの重合度は、それぞれ独立して、５～２０，０００の整数、好ましくは１０～５，０００の整数、より好ましくは４０～５００の整数、さらに好ましくは５～１，０００の整数、さらにより好ましくは１０～２００の整数とすることができる。
　本発明では、ポリカチオンブロックとしては、例えば、ＰＥＧ－ポリ（Ｎ’－［Ｎ－（２－アミノエチル）－２－アミノエチル］－アスパラギン酸）ブロック共重合体（ＰＥＧ－Ｐ（Ａｓｐ－ＤＥＴ））を用いることができる。ＰＥＧ－Ｐ（Ａｓｐ－ＤＥＴ）は、常法に従って調製することができる（Chem. Med. Chem. 1 (2006) 439－444参照）。
　Ｐ（Ａｓｐ－ＤＥＴ）において、Ａｓｐ－ＤＥＴは、側鎖のカルボキシル基がジエチルトリアミン（ＤＥＴ）基（－ＮＨ－ＣＨ2－ＣＨ2－ＮＨ－ＣＨ2－ＣＨ2－ＮＨ2）で置換されたアスパラギン酸である。Ｐ（Ａｓｐ－ＤＥＴ）の構造は以下の化学式で示される。
　Ｐ（Ａｓｐ－ＤＥＴ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
 ｛式中、
　Ｒ1は、水酸基、保護基、疎水性基、または重合性基であり、
　Ｒ4は、Ｈ、保護基、疎水性基、または重合性基であり、
　Ｒ3は、－（ＮＨ－（ＣＨ2）2）2－ＮＨ2で表される基であり、
　ｎは、０～５０００のいずれかの整数であり、例えば、０～５００のいずれかの整数であり、
　ｍは、０～５０００のいずれかの整数であり、例えば、０～５００のいずれかの整数であり、
　ｍ＋ｎは、２～５０００のいずれかの整数であり、例えば、２～５００のいずれかの整数であり、
　ｎ－ｍは、０以上の整数であり、
　式中の各繰り返し単位は記載の都合上特定の順で示しているが、各繰り返し単位は順不同に存在することができ、各繰り返し単位はランダムに存在してもよく、また、各繰り返し単位は同一であっても異なっていてもよい。｝
　ポリカチオンブロックが、ポリエチレングリコールと共重合体を形成している場合には、Ｒ1またはＲ4が結合を表し、ポリエチレングリコールは、該結合を介してポリカチオンブロックと共重合体を形成させることができる。なお、上記一般式（Ｉ）のポリマーでは、各繰り返し単位がペプチド結合により結合している。
　本発明のある態様では、ＰＩＣｓｏｍｅは、ＰＩＣｓｏｍｅを形成後にカチオン性重合体とアニオン性重合体とを架橋してもよい。架橋は、当業者に周知の方法を用いて適宜行うことができる。例えば、本発明のＰＩＣｓｏｍｅは、ＰＥＧで修飾されていてもよいカチオン性重合体とＰＥＧで修飾されていてもよいアニオン性重合体を用いて形成し、その後、カチオン性重合体とアニオン性重合体とを架橋して得ることができる。本発明のある態様では、カチオン性重合体は、側鎖にＮＨ2基を有するカチオン性アミノ酸を単量体単位として含み、ＰＥＧで修飾されていてもよい重合体と側鎖にＣＯＯＨ基を有するアニオン性アミノ酸を単量体単位として含み、ＰＥＧで修飾されていてもよい重合体とを水溶液中で混合してＰＩＣｓｏｍｅを形成させ、その後、架橋剤として１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩を用いてカチオン性重合体とアニオン性重合体とを架橋して得てもよい。架橋は、ＰＩＣｓｏｍｅに酵素を内包させた後に行うことができる。
　従って、本発明のある態様では、ＰＩＣｓｏｍｅは、
　ＣＯＯＨ基を側鎖に有するアミノ酸を単量体単位として含む重合体（Ａ）と、
　ＮＨ2基を側鎖に有するアミノ酸を単量体単位として含む重合体（Ｂ）と
のＰＩＣｓｏｍｅとしてもよい。この態様では、重合体（Ａ）と重合体（Ｂ）とを架橋するために、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を用いることができる。
　ＰＩＣｓｏｍｅ中でのカチオン性重合体とアニオン性重合体との架橋率（％）は、例えば、フーリエ変換赤外分光法（ＦＴ－ＩＲ）により、ＰＥＧ－ＰＡｓｐのポリマー（未架橋）のスペクトルを参照とし、ＰＥＧに由来するピーク（１４６０ｃｍ-1；Ｃ－Ｈ基の変角振動に由来）に対するカルボキシル基に由来するピーク（１６００ｃｍ-1；ＣＯＯ-基の伸縮振動に由来）の比を求めることにより算出することができる。架橋率は架橋剤の使用量を増加させることで高めることができる。
　本発明によれば、ＰＩＣｓｏｍｅを構成するカチオン性重合体とアニオン性重合体とを架橋することを含む、ＰＩＣｓｏｍｅの膜に対する分子の透過性を低下させる方法またはＰＩＣｓｏｍｅ内部からの分子の放出速度を低下させる方法が提供される。本発明のある態様では、５ｋＤａ未満、４ｋＤａ以下、３ｋＤａ以下、２ｋＤａ以下、１ｋＤａ以下、７５０Ｄａ以下、５００Ｄａ以下、４００Ｄａ以下、３００Ｄａ以下または２００Ｄａ以下の分子に対する透過性は、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または実質的に保たれる。本発明のある態様では、透過性を低下させる分子または放出速度を低下させる分子は、５ｋＤａ以上、１０ｋＤａ以上、２０ｋＤａ以上、３０ｋＤａ以上、４０ｋＤａ以上、５０ｋＤａ以上、６０ｋＤａ以上、７０ｋＤａ以上、８０ｋＤａ以上、９０ｋＤａ以上、１００ｋＤａ以上、１１０ｋＤａ以上、１２０ｋＤａ以上、１３０ｋＤａ以上または１４０ｋＤａ以上の酵素を用いることができる。
　本発明によれば、ＰＩＣｓｏｍｅを構成するカチオン性重合体とアニオン性重合体との架橋率（％）が高まるほど、ＰＩＣｓｏｍｅ内部からの分子の放出速度が低下して放出速度定数が低下する。例えば、架橋率（％）は、２５％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上または８０％以上とすることができる。架橋率は９０％以上であってもよい。このうち、架橋率が４０％を超えると放出速度定数が大きく低下する。従って、架橋率（％）は、大きいことが好ましく、好ましくは、５０％以上、６０％以上、７０％以上または８０％以上とすることができる。
　本発明によれば、ＰＩＣｓｏｍｅを構成するカチオン性重合体とアニオン性重合体架橋率を高めることにより、内包される酵素のＰＩＣｓｏｍｅ外への放出量を低減することができ、１０ｍＭ　リン酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）中において３７℃条件下で測定した場合に、内包した酵素の累積放出率（％）が前記水溶液と接触後７日目に６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下または５％以下である、ＰＩＣｓｏｍｅが提供される。本発明によれば、１０ｍＭ　リン酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）において３７℃条件下で測定した場合に、数平均分子量２ｋＤａの直鎖状ポリエチレングリコールの放出速度定数ｋが５×１０-3以下、４×１０-3以下、３×１０-3以下、２×１０-3以下または１×１０-3以下である、ＰＩＣｓｏｍｅが提供される。ある態様では、酵素として、５ｋＤａ以上、１０ｋＤａ以上、２０ｋＤａ以上、３０ｋＤａ以上、４０ｋＤａ以上、５０ｋＤａ以上、６０ｋＤａ以上、７０ｋＤａ以上、８０ｋＤａ以上、９０ｋＤａ以上、１００ｋＤａ以上、１１０ｋＤａ以上、１２０ｋＤａ以上、１３０ｋＤａ以上または１４０ｋＤａ以上の酵素を用いることができる。
　本発明の別の側面によれば、Ｌ－ＡＳＰを内包させることに用いるための、ＰＩＣｓｏｍｅを含む組成物が提供される。この側面において、ある態様では、ＰＩＣｓｏｍｅは、本発明のＰＩＣｓｏｍｅとすることができる。この側面において、組成物は、Ｌ－ＡＳＰと混合することにより、Ｌ－ＡＳＰをＰＩＣｓｏｍｅの内部に内包させることができる。ＰＩＣｓｏｍｅ外のアスパラギンであってもＰＩＣｓｏｍｅの膜を透過して内部に到達できるので、本発明の組成物は、アスパラギンと接触させることにより、アスパラギンの加水分解に用いることができる。
　本発明の別の側面によれば、α－ガラクトシダーゼを内包させることに用いるための、ＰＩＣｓｏｍｅを含む組成物が提供される。この側面において、ある態様では、ＰＩＣｓｏｍｅは、本発明のＰＩＣｓｏｍｅとすることができる。この側面において、本発明の組成物は、α－ガラクトシダーゼと混合することにより、α－ガラクトシダーゼをＰＩＣｓｏｍｅの内部に内包させることができる。ＰＩＣｓｏｍｅ外の基質（例えば、グロボトリアオシルセラミド）であってもＰＩＣｓｏｍｅの膜を透過して内部に到達できるので、本発明の組成物は、α－ガラクトシダーゼと接触させることにより、アスパラギンの加水分解に用いることができる。
　本発明のある態様では、ウリカーゼを内包させることに用いるための、ＰＩＣｓｏｍｅを含む組成物が提供される。この側面において、ある態様では、ＰＩＣｓｏｍｅは、本発明のＰＩＣｓｏｍｅとすることができる。この側面において、本発明の組成物は、ウリカーゼと混合することにより、ウリカーゼをＰＩＣｓｏｍｅの内部に内包させることができる。ＰＩＣｓｏｍｅ外の基質（例えば、尿酸）であってもＰＩＣｓｏｍｅの膜を透過して内部に到達できるので、本発明の組成物は、ウリカーゼと接触させることにより、尿素の加水分解に用いることができる。
　本発明のある態様では、α－グルコシダーゼを内包させることに用いるための、ＰＩＣｓｏｍｅを含む組成物が提供される。この側面において、ある態様では、ＰＩＣｓｏｍｅは、本発明のＰＩＣｓｏｍｅとすることができる。この側面において、本発明の組成物は、α－グルコシダーゼと混合することにより、α－グルコシダーゼをＰＩＣｓｏｍｅの内部に内包させることができる。ＰＩＣｓｏｍｅ外の基質（例えば、グリコーゲン）であってもＰＩＣｓｏｍｅの膜を透過して内部に到達できるので、本発明の組成物は、α－ガラクトシダーゼと接触させることにより、α－１，４－グルコシド結合の加水分解に用いることができる。
　本発明の別の側面によれば、ＰＩＣｓｏｍｅに内包させることに用いるための、Ｌ－ＡＳＰを含む組成物が提供される。この側面において、ある態様では、ＰＩＣｓｏｍｅは、本発明のＰＩＣｓｏｍｅとすることができる。この側面において、組成物は、Ｌ－ＡＳＰと混合することにより、Ｌ－ＡＳＰをＰＩＣｓｏｍｅの内部に内包させることができる。ＰＩＣｓｏｍｅ外のアスパラギンであってもＰＩＣｓｏｍｅの膜を透過して内部に到達できるので、本発明の組成物は、アスパラギンと接触させることにより、アスパラギンの加水分解に用いることができる。
　本発明のある態様では、ＰＩＣｓｏｍｅに内包させることに用いるための、α－ガラクトシダーゼを含む組成物が提供される。この側面において、ある態様では、ＰＩＣｓｏｍｅは、本発明のＰＩＣｓｏｍｅとすることができる。この側面において、組成物は、α－ガラクトシダーゼと混合することにより、α－ガラクトシダーゼをＰＩＣｓｏｍｅの内部に内包させることができる。ＰＩＣｓｏｍｅ外の基質であってもＰＩＣｓｏｍｅの膜を透過して内部に到達できるので、本発明の組成物は、α－ガラクトシダーゼと接触させることにより、基質の加水分解に用いることができる。
　本発明のある態様では、ＰＩＣｓｏｍｅに内包させることに用いるための、ウリカーゼを含む組成物が提供される。この側面において、ある態様では、ＰＩＣｓｏｍｅは、本発明のＰＩＣｓｏｍｅとすることができる。この側面において、組成物は、ウリカーゼと混合することにより、ウリカーゼをＰＩＣｓｏｍｅの内部に内包させることができる。ＰＩＣｓｏｍｅ外の尿素であってもＰＩＣｓｏｍｅの膜を透過して内部に到達できるので、本発明の組成物は、ウリカーゼと接触させることにより、尿素の加水分解に用いることができる。
　本発明のある態様では、ＰＩＣｓｏｍｅに内包させることに用いるための、α－グルコシダーゼを含む組成物が提供される。この側面において、ある態様では、ＰＩＣｓｏｍｅは、本発明のＰＩＣｓｏｍｅとすることができる。この側面において、組成物は、ウリカーゼと混合することにより、α－グルコシダーゼをＰＩＣｓｏｍｅの内部に内包させることができる。ＰＩＣｓｏｍｅ外の基質であってもＰＩＣｓｏｍｅの膜を透過して内部に到達できるので、本発明の組成物は、α－グルコシダーゼと接触させることにより、基質の加水分解に用いることができる。
　本発明の別の側面によれば、ＰＥＧ化されていてもよいポリカチオンと、ポリアニオンと、Ｌ－ＡＳＰとの組合せが提供される。本発明の別の側面によれば、ポリカチオンと、ＰＥＧ化されていてもよいポリアニオンと、Ｌ－ＡＳＰとの組合せが提供される。本発明の組合せは、Ｌ－ＡＳＰを内包したＰＩＣｓｏｍｅを調製することに用いることができる。
　本発明のある態様では、ＰＥＧ化されていてもよいポリカチオンと、ポリアニオンと、α－ガラクトシダーゼの組合せが提供される。本発明のある態様では、ＰＥＧ化されていてもよいポリカチオンと、ポリアニオンと、ウリカーゼの組合せが提供される。ＰＥＧ化されていてもよいポリカチオンと、ポリアニオンと、α－グルコシダーゼの組合せが提供される。
　本発明のある態様では、ポリカチオンと、ＰＥＧ化されていてもよいポリアニオンと、α－ガラクトシダーゼとの組合せが提供される。本発明のある態様では、ポリカチオンと、ＰＥＧ化されていてもよいポリアニオンと、ウリカーゼとの組合せが提供される。本発明のある態様では、ポリカチオンと、ＰＥＧ化されていてもよいポリアニオンと、α－グルコシダーゼとの組合せが提供される。これらの組合せは、上記の通り、前記酵素を内包したＰＩＣｓｏｍｅを調製することに用いることができる。
　本発明のさらなる別の側面によれば、酵素を内包した本発明のＰＩＣｓｏｍｅを、その酵素の投与を必要とする対象に投与することを含む、対象を処置する方法が提供される。対象は、特定の酵素を欠損した、またはその発現が低下したことにより、疾患に罹患した対象とすることができる。
　酵素としては、Ｌ－ＡＳＰが挙げられ、疾患としては、アスパラギン要求性の腫瘍が挙げられる。従って、本発明によれば、アスパラギン要求性の腫瘍を処置する方法であって、その必要のある対象に、Ｌ－ＡＳＰ含む有効量のＰＩＣｓｏｍｅを投与することを含んでなる、方法が提供される。アスパラギン要求性腫瘍としては、急性白血病、例えば、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、特に小児急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、その他の急性白血病、および悪性リンパ腫、例えば、Ｔ細胞悪性リンパ腫、ホジキン氏病、細網肉腫およびリンパ肉腫が挙げられる。アスパラギン要求性の腫瘍は、正常細胞と比較して、アスパラギン産生酵素の発現が、正常細胞に対して８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、３％以下または１％以下の腫瘍とすることもできる。本発明のある態様では、対象を、Ｌ－ＡＰＳを用いた化学療法によりアレルギー症状（例えば、アナフィラキシー症状）を呈するに至った腫瘍患者を対象とすることができる。
　あるいは、酵素としては、α－ガラクトシダーゼが挙げられ、疾患としては、α－ガラクトシダーゼの異常を原因とする疾患（例えば、ファブリー病）が挙げられる。従って、本発明によれば、α－ガラクトシダーゼの異常を原因とする疾患（例えば、ライソゾーム病（例えば、ファブリー病）などのα－ガラクトシダーゼの活性低下または欠損を原因とする疾患）を処置する方法であって、その必要のある対象に、α－ガラクトシダーゼを含む有効量のＰＩＣｓｏｍｅを投与することを含んでなる、方法が提供される。本発明のある態様では、対象を、α－ガラクトシダーゼを用いた化学療法によりアレルギー症状（例えば、アナフィラキシー症状）を呈するに至った腫瘍患者を対象とすることができる。
　あるいは、酵素としては、ウリカーゼが挙げられ、疾患としては、高尿酸血症および高尿酸血症を原因とする疾患の処置に用いることができる。高尿酸血症を原因とする疾患としては、痛風（例えば、痛風結節および痛風関節炎）並びに尿酸塩沈着症および尿酸結石、間質性腎炎、腎不全、および動脈硬化症などの高尿酸血症を原因とする疾患が挙げられる。従って、本発明によれば、高尿酸血症および高尿酸血症を原因とする疾患を処置する方法であって、その必要のある対象に、ウリカーゼを含む有効量のＰＩＣｓｏｍｅを投与することを含んでなる、方法が提供される。本発明のある態様では、対象を、ウリカーゼを用いた化学療法によりアレルギー症状（例えば、アナフィラキシー症状）を呈するに至った腫瘍患者を対象とすることができる。
　あるいは、酵素としては、α－グルコシダーゼが挙げられ、疾患としては、α－グルコシダーゼの異常を原因とする疾患（例えば、ポンベ病）が挙げられる。従って、本発明によれば、α－グルコシダーゼの異常を原因とする疾患（例えば、ライソゾーム病（例えば、ポンベ病）などのα－グルコシダーゼの活性低下または欠損を原因とする疾患）を処置する方法であって、その必要のある対象に、α－グルコシダーゼを含む有効量のＰＩＣｓｏｍｅを投与することを含んでなる、方法が提供される。本発明のある態様では、対象を、α－グルコシダーゼを用いた化学療法によりアレルギー症状（例えば、アナフィラキシー症状）を呈するに至った腫瘍患者を対象とすることができる。
　本明細書では、「処置」とは、疾患または障害を治癒、予防若しくは寛解、または、疾患または障害の進行速度の低下をもたらすことを意味する。処置は、治療上有効な量の医薬組成物を投与することにより達成され得る。
実施例１：酵素を封入したＰＩＣｓｏｍｅの調製
　本実施例では、酵素Ｌ－アスパラギナーゼ（以下、「Ｌ－ＡＳＰ」とも言う）を封入したＰＩＣｓｏｍｅを調製した。
　１．ＰＥＧ－Ｐ（Ａｓｐ）の合成
　まず、ポリエチレングリコール－ポリ（β－ベンジル－Ｌ－アスパルテート）ブロック共重合体（ＰＥＧ－ＰＢＬＡ）をβ－ベンジル－Ｌ－アスパルテート－Ｎ－カルボン酸無水物（ＢＬＡ－ＮＣＡ）（中央化製品社に製造委託して得た）の重合により得た。具体的には、ＢＬＡ－ＮＣＡ　１８．９ｇをＮ，Ｎ'－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）２０ｍＬに溶解する。メトキシ基の末端とアミノエチル基の末端を有するポリエチレングリコール（Ｍｅ－Ｏ－ＰＥＧ－ＮＨ2）（分子量２，０００）２．０ｇをＤＭＦ　２０ｍＬに溶解し、その溶液をＢＬＡ－ＮＣＡ溶液に加える。混合溶液を３５℃に保ちながら４０時間重合した。赤外分光（ＩＲ）分析で重合反応が終了したことを確認した後、反応混合物をジエチルエーテル２Ｌに滴下して沈澱したポリマーを吸引濾過により回収し、ジエチルエーテルで洗浄した後に真空乾燥してＰＥＧ－ＰＢＬＡ　１５．５１ｇ（収率７９％）を得た。
　次に、ＰＥＧ－ＰＢＬＡからポリエチレングリコール－ポリアスパラギン酸ブロック共重合体（ＰＥＧ－Ｐ（Ａｓｐ．）を合成した。具体的には、ＰＥＧ－ＰＢＬＡ　１．０ｇを０．５Ｎ水酸化ナトリウムに懸濁しながら室温でベンジルエステルを加水分解した。コポリマーが溶解した後、透析膜（分画分子量６，０００－８，０００）を用いて水中で透析した。膜内の溶液を凍結乾燥してＰＥＧ－Ｐ（Ａｓｐ）　６５４ｍｇ（収率７８％）を得た。
２．ホモＰ（Ａｓｐ－ＡＰ）の合成
　まず、ポリ（β－ベンジル－Ｌ－アスパルテート）（ホモＰＢＬＡポリマー）をＢＬＡ－ＮＣＡの重合により得た。具体的には、β－ベンジル－Ｌ－アスパルテート－Ｎ－カルボン酸無水物（ＢＬＡ－ＮＣＡ）２０ｇをＮ，Ｎ’－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）３３．３ｍＬ、ジクロロメタン３００ｍＬに溶解する。Ｎ－ブチルアミン８９．０μＬを上記ＢＬＡ－ＮＣＡ溶液に加える。混合溶液を３５℃に保ちながら４０時間重合した。赤外分光（ＩＲ）分析で重合反応が終了したことを確認したのち、反応混合物をヘキサン／酢酸エチル溶液（ヘキサン：酢酸エチル＝６：４）１Ｌに滴下して沈澱したポリマーを吸引濾過により回収し、ジエチルエーテルで洗浄した後に真空乾燥してホモＰＢＬＡポリマー　１４．８２ｇ（７９％）を得た。
　次に、得られたホモＰＢＬＡポリマーからポリ（（５－アミノペンチル）－アスパラギン酸）（ホモＰ（Ａｓｐ．－ＡＰ））を合成した。具体的には、ベンゼン凍結乾燥をしたホモＰＢＬＡ　１ｇをＮ－メチル－２－ピロリドン（ＮＭＰ）１０ｍＬに溶解する。ＤＡＰ　１７．２ｍＬをＮＭＰ　１７．２ｍＬに溶解し、ホモＰＢＬＡ溶液に加える。混合溶液を５℃に保ちながら４０分反応した。その後、反応液に２０重量％の酢酸水溶液１０ｍＬを添加し、透析膜（分画分子量６，０００－８，０００）を用いて水中で透析した。膜内の溶液を凍結乾燥してＰ（Ａｓｐ．－ＡＰ）　０．７６ｇ（８２％）を得た。
３．ＤｙＬｉｇｈｔ　４８８ラベル化Ｌ－ＡＳＰの調製
　Ｌ－アスパラギナーゼ（Ｌ－ＡＳＰ；Sigma-Aldrich製、製品番号：A3809）　１５ｍｇを１０ｍＭ　リン酸緩衝液（ＰＢ、ｐＨ　７．４、０ｍＭ　ＮａＣｌ）１０ｍＬに溶解した。ＤｙＬｉｇｈｔ　４８８－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（Thermo scientific社製、製品番号：46402）２ｍｇを、１ｍＬのＤＭＳＯに溶解し、Ｌ－ＡＳＰ溶液に加え、２５℃で４時間反応させた。その後、分画分子量１０，０００の膜のついた限外濾過チューブを用いて、未反応のＤｙＬｉｇｈｔ　４８８－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル分子を除去した。
４．Ｃｙ５ラベル化Ｌ－ＡＳＰの調製
　Ｌ－ＡＳＰ　７５ｍｇを１０ｍＭ　リン酸緩衝液（ＰＢ、ｐＨ　７．４、０ｍＭ　ＮａＣｌ）５０ｍＬに溶解した。Ｃｙ５－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル　ｄｙｅ　ｐａｃｋ（GE Healthcare社製、製品番号：PA25001）２０Ｖｉａｌを、５ｍＬのＤＭＳＯに溶解し、Ｌ－ＡＳＰ溶液に加え、２５℃で４時間反応させた。その後、分画分子量１０，０００の膜のついた限外濾過チューブを用いて、未反応のＣｙ５－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル分子を除去した。
５．Ｌ－ＡＳＰ内包ＰＩＣｓｏｍｅの調製
　ＰＥＧ－Ｐ（Ａｓｐ．）２０ｍｇを１０ｍＭ　リン酸緩衝液（ＰＢ、ｐＨ７．４、０ｍＭ　ＮａＣｌ）２０ｍＬに溶解し、１ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ－Ｐ（Ａｓｐ．）溶液を調製した。また、ホモＰ（Ａｓｐ．－ＡＰ）３０ｍｇも同様にＰＢ　５０ｍＬに溶解し、１ｍｇ／ｍＬのホモＰ（Ａｓｐ．－ＡＰ）溶液を調製した。次に、ＰＥＧ－Ｐ（Ａｓｐ．）溶液およびホモＰ（Ａｓｐ．－ＡＰ）溶液のそれぞれ４．０ｍＬおよび５．０ｍＬを５０ｍＬのコニカルチューブ中で混合し、ボルテックスにより２分間撹拌した（２０００ｒｐｍ）。（以下、この溶液を空のＰＩＣｓｏｍｅ溶液と呼ぶ。）
　その後、Ｌ－ＡＳＰ　３２ｍｇを１０ｍＭ　リン酸緩衝液（ＰＢ、ｐＨ　７．４、０ｍＭ　ＮａＣｌ）５．７ｍＬに溶解し、５．６ｍｇ／ｍＬのＬ－ＡＳＰ溶液を調製した。または、ＤｙＬｉｇｈｔ　４８８ラベル化Ｌ－ＡＳＰもしくはＣｙ５ラベル化Ｌ－ＡＳＰの１０ｍＭ　リン酸緩衝液（ＰＢ、ｐＨ　７．４、０ｍＭ　ＮａＣｌ）溶液を限外濾過により濃縮し、５．６ｍｇ／ｍＬの蛍光ラベル化Ｌ－ＡＳＰ溶液を調製した。
　５．６ｍｇ／ｍＬのＬ－ＡＳＰ溶液もしくは蛍光ラベル化Ｌ－ＡＳＰ溶液５．０ｍＬを、空のＰＩＣｓｏｍｅ溶液９．０ｍＬに混合し、ボルテックスにより２分間撹拌した（２０００ｒｐｍ）。その後、水溶性の縮合剤であるＥＤＣ（１０ｍｇ／ｍＬ）を含有するＰＢ溶液５．６ｍＬを加え、一晩静置してポリイオンコンプレクスを架橋した。その後、分画分子量３００，０００の膜のついた限外濾過チューブを用いて、ＰＩＣｓｏｍｅ形成に関与していないポリマー、ＰＩＣｓｏｍｅに封入されなかったＬ－ＡＳＰ、およびＥＤＣなどを除去した。
実施例２：ＰＩＣｓｏｍｅのキャラクタリゼーション
　本実施例では、得られたＰＩＣｓｏｍｅのサイズ（Ｚ平均粒子径）および多分散指数（ＰＤＩ）は、ゼータサイザー（Ｍａｌｖｅｒｎ）で測定した。また、ＰＩＣｓｏｍｅの形状は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ、ＪＥＭ－１４００）を用いて、酢酸ウラニルで染色後に観察した。
１．得られたＬ－ＡＳＰ内包ＰＩＣｓｏｍｅのゼータサイザーによる評価
　得られたＬ－ＡＳＰ封入ＰＩＣｓｏｍｅのサイズ（Ｚ平均粒子径）および多分散指数（ＰＤＩ）は、ゼータサイザー（Ｍａｌｖｅｒｎ）で測定した。サイズはブラウン運動により移動している粒子の拡散を測定し、その測定結果をストークス・アインシュタインの式を用いて粒子径と粒度分布に変換した。またミセルの形状は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ、ＪＥＭ－１４００）を用いて評価した。ここで、Ｚ平均粒子径とは、粒子分散　物等の動的光散乱法の測定データを、キュムラント解析法を用いて解析したデータである。キュムラント解析においては、粒子径の平均値と多分散指数（ＰＤＩ）が得られ、本発明においては、この平均粒子径をＺ平均粒子径と定義する。厳密には、測定で得られたＧ１相関関数の対数に、多項式をフィットさせる作業を、キュムラント解析といい、下式：
　ＬＮ（Ｇ１）＝ａ＋ｂｔ＋ｃｔ2＋ｄｔ3＋ｅｔ4＋・・・
における定数ｂが、二次キュムラントまたは、Ｚ平均拡散係数と呼ばれる。Ｚ平均拡散係数の値を分散媒の粘度と幾つかの装置定数を用いて粒子径に換算した値がＺ平均粒子径であり、分散安定性の指標として品質管理目的に適した値である。
　得られたＬ－ＡＳＰを内包するＰＩＣｓｏｍｅの粒径分布および透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）像はそれぞれ、図１Ａおよび図１Ｂに示される通りであった。図１Ａに示されるように、得られたＬ－ＡＳＰを内包するＰＩＣｓｏｍｅは、直径１００ｎｍ程度に最頻値を有する単分散の粒径分布を示し、図１Ｂに示されるように、ＴＥＭ像においても直径１００ｎｍ程度の粒径を有するＰＩＣｓｏｍｅが多く観察された。
２．Ｌ－ＡＳＰがＰＩＣｓｏｍｅ中に内包されていることの確認
　次に、Ｌ－ＡＳＰがＰＩＣｓｏｍｅ内に内包されていることを確認するため、遊離のＬ－ＡＳＰ（すなわち、ＰＩＣｓｏｍｅに内包されていないものをいい、「遊離型Ｌ－ＡＳＰ」とも言う）と、ＰＩＣｓｏｍｅ内に内包されているＬ－ＡＳＰ（「内包型Ｌ－ＡＳＰ」とも言う）の溶液中での拡散速度を蛍光相関分光法（ＦＣＳ）により評価した。
　蛍光相関分光法は、以下のように行った。共焦点レーザー走査顕微鏡（LSM 510 META/Confocal3, Carl Zeiss社）で４８８ｎｍのＡｒレーザーラインを搭載したものを用いた。サンプル溶液は８ウェルチャンバーに滴下し、水浸の対物レンズを介して励起光の照射および蛍光の検出を行った。蛍光強度のゆらぎを自己相関関数を用いて解析し、拡散時間、および一粒子当たりの蛍光強度を算出した。
　結果は、図２に示される通りであった。図２の試料（ｉ）は、ＤｙＬｉｇｈｔ４８８で標識した遊離型Ｌ－ＡＳＰを示し、試料（ｉｉ）は、ＤｙＬｉｇｈｔ４８８で標識した内包型Ｌ－ＡＳＰを示す。図２に示されるように、内包型Ｌ－ＡＳＰは、遊離型Ｌ－ＡＳＰよりも大きな拡散時間および一粒子当たりの蛍光強度（count per molecule）を示し、確かにＬ－ＡＳＰがＰＩＣｓｏｍｅ内に内包されていることが確認された（図２ＡおよびＢ）。また、一粒子当たりの蛍光強度の比較から、１つのＰＩＣｓｏｍｅ内にはＬ－ＡＳＰが２分子封入されていると見積もられた（図２Ｂ）。
　次に、遊離型Ｌ－ＡＳＰと内包型Ｌ－ＡＳＰについてそれぞれ、酵素活性を評価した。Ｌ－ＡＳＰの酵素活性により分解されて７－アミノ－４－メチルクマリン（「ＡＭＣ」とも言う）を生じ、蛍光（Ex/Em=350 nm/450 nm）を発する基質Ｌ－アスパラギン酸β－（７－アミド－４－メチルクマリン）（「Ａｓｐ－ＡＭＣ」とも言う）との反応に関する、ミカエリス・メンテンプロットおよびラインウィーバー・バークプロットを作成した。具体的には、まず、Ａｓｐ－ＡＭＣ、遊離型Ｌ－ＡＳＰ、および内包型Ｌ－ＡＳＰの各溶液（ＰＢＳ中）を恒温槽に静置して３７℃とした。その後、Ａｓｐ－ＡＭＣの溶液を遊離型Ｌ－ＡＳＰもしくは内包型Ｌ－ＡＳＰの各溶液と混合し、速やかに所定量を９６ウェルプレート（テカン）に注いだ。プレートを予め３７℃に保温しておいたマルチプレートリーダーの内部に入れ、蛍光強度を一定時間経時的に測定した。この際、予め調製したＡＭＣの標準溶液を用いて作製した検量線を用い、蛍光強度の変化を生成物の生成速度に変換することで反応速度Ｖを求めた。基質濃度［Ｓ］を様々に変え、横軸に［Ｓ］を、縦軸にＶを取り、プロットの結果に次式を当てはめることでミカエリス・メンテン係数（Ｋm）を算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
　遊離型Ｌ－ＡＳＰにおけるミカエリス・メンテンプロット（図３Ａ）およびラインウィーバー・バークプロット（図３Ｂ）と、内包型Ｌ－ＡＳＰにおけるミカエリス・メンテンプロット（図４Ａ）およびラインウィーバー・バークプロット（図４Ｂ）とを比較すると、酵素活性に大きな相違は見られなかった。また、ミカエリス・メンテン係数（Ｋｍ）をそれぞれ計算したところ、遊離型Ｌ－ＡＳＰのＫｍ値は１８６μＭであったのに対して内包型Ｌ－ＡＳＰのＫｍ値は１９４μＭであり、内包型Ｌ－ＡＳＰは遊離型Ｌ－ＡＳＰとほぼ同じ酵素活性を有していることが明らかとなった。
３．ＰＩＣｓｏｍｅ中に内包されたＬ－ＡＳＰの血中滞留性
　さらに、マウスを用いて遊離型Ｌ－ＡＳＰと内包型Ｌ－ＡＳＰの血中滞留性を評価した。Ｃｙ５標識した遊離型Ｌ－ＡＳＰ　８ＵとＣｙ５標識した内包型Ｌ－ＡＳＰ　２５０μｇ（ＰＩＣｓｏｍｅを構成するポリマーの見積もり重量）をマウス（Balb/c、５週齢、ｎ＝５）に尾静脈投与し、投与から０時間後、３時間後および２４時間後にマウスを犠牲にして血液を採取した。血液は遠心分離して上澄みの蛍光強度（Ex/Em=650nm/670nm）を回収し、上澄みをマルチプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ、Ｍ１０００ＰＲＯ）を用いて測定した。結果は図５に示される通りであった。
　図５では、投与直後の蛍光強度を１００％として、各時点での蛍光強度を相対的に示した。図５に示されるように、内包型Ｌ－ＡＳＰの血中滞留性は、遊離型Ｌ－ＡＳＰの血中滞留性と比較して格段に高かった。
４．生理的条件下での酵素活性の経時的変化
　１０％ＦＢＳを含む水溶液中に遊離型Ｌ－ＡＳＰおよび内包型Ｌ－ＡＳＰをそれぞれ４．８μｇ／ｍＬまたは２ｍｇ／ｍＬ（ＰＩＣｓｏｍｅを構成するポリマーの見積もり濃度）の濃度で溶解させ、３７℃で０時間、３時間、６時間、１２時間または２４時間静置して、その後、１０００μＭのＬ－アスパラギン酸　β－７－アミド－４－メチルクマリン（Ａｓｐ－ＡＭＣ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａ１０５７）を基質として用いて各時点での酵素の反応速度を求めた。静置時間が０時間のサンプルの反応速度を１として、各時点での反応速度を標準化し、相対的反応速度を求めた。結果は、図６に示される通りであった。
　図６に示されるように、インビトロでは、遊離型Ｌ－ＡＳＰおよび内包型Ｌ－ＡＳＰのいずれも長時間にわたって生理的条件下で酵素活性を維持することができた。
５．血中におけるＰＩＣｓｏｍｅに内包されたＬ－ＡＳＰの酵素活性
　マウス（Balb/c、５週齢、ｎ＝３）に遊離型Ｌ－ＡＳＰまたは内包型Ｌ－ＡＳＰそれぞれ１００Ｕ／ｋｇを尾静脈投与し、２４時間後の血中アンモニア窒素濃度（ＮＨ3－Ｎ）を測定した。投与２４時間後に、マウスを犠牲にして血液を採取した。採取した血液を遠心分離して得られた上澄み（血漿）を回収し、上澄み中のアンモニア窒素濃度を生化学自動分析装置（Drichem）を用いて測定し、予め作成した検量線を用いて値を較正した。結果は、図７に示される通りであった。なお、Ｌ－ＡＳＰは、Ｌ－アスパラギンを分解してＬ－アスパラギン酸とアンモニアを発生することが知られている。
　図７に示されるように、血漿中のアンモニア窒素の濃度は、内包型Ｌ－ＡＳＰを投与した群で、遊離型Ｌ－ＡＳＰを投与した群よりも圧倒的に高かった（図７Ａ）。また、投与前後のアンモニア窒素濃度から血漿中のアンモニア窒素の増加量を計算したところ、図７Ｂに示されるように、遊離Ｌ－ＡＳＰを投与した群では血漿アンモニア窒素濃度はほとんど上昇していなかったのに対して、内包型Ｌ－ＡＳＰを投与した群では血漿アンモニア窒素濃度は飛躍的に上昇していた。このように、内包型Ｌ－ＡＳＰは、投与することにより血漿成分と反応し、その酵素活性により該血漿成分を変換してアンモニア窒素を効率よく生成できた。
実施例３：ＰＩＣｓｏｍｅの化学修飾の酵素反応への影響
　架橋剤であるＥＤＣの濃度を変える以外は実施例１に記載された通りにＬ－ＡＳＰ内包ＰＩＣｓｏｍｅを調製し、架橋率とＰＩＣｓｏｍｅの性質との関係を調べた。
　実施例１のＥＤＣ濃度を１等量とし、その０．５倍、３倍、５倍または１０倍のＥＤＣにより処理して得たＰＩＣｓｏｍｅのＦＴ－ＩＲスペクトルを図８Ａに示し、ＥＤＣ等量と架橋割合の関係を図８Ｂに示す。架橋割合は、ＦＴ－ＩＲにより算出した。図８Ｂでは、ＰＥＧ－ポリＡｓｐ共重合体中に存在するＣＯＯ-基のうち、架橋されたものの割合（％）を架橋率として示す。
　図８に示されるように、架橋に用いるＥＤＣの量を変えることにより、ＰＩＣｓｏｍｅの構成分子間の架橋率の制御が可能であることが明らかとなった。０．５等量では、ＣＯＯ-基のうち、３０．２％が架橋され、１等量では４４．５％が架橋され、３等量では６０．５％が架橋され、５等量では７７．１％が架橋され、１０等量では８９．１％が架橋された。
　架橋に用いるＥＤＣの量と粒径との関係、ＥＤＣ量と多分散度（ＰＤＩ）との関係、ＥＤＣ量とＰＩＣｓｏｍｅ形状との関係を図９に示す。これらの粒径、多分散度、形状（ＴＥＭ像）の取得は、ＥＤＣ量を変えた以外は、実施例１および２と同様に行った。
　その結果、図９Ａに示されるように、いずれのＥＤＣ量においても、粒径（図９Ａ）、多分散度（図９Ｂ）およびＰＩＣｓｏｍｅ形状（図９Ｃ）において、有意な相違は認められなかった。また、いずれのＥＤＣ量においても、粒径１００ｎｍを最頻値とし、単分散を示す粒径分布が得られた。
実施例４：内包させる物質の分子量と得られるＰＩＣｓｏｍｅの形状
　数平均分子量６０００～４２０００までの様々な大きさのＰＥＧをＰＩＣｓｏｍｅに内包させて、得られたＰＩＣｓｏｍｅの形状を確認した。
　ＰＥＧは、フルオレセインで標識し、０．５ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、または１０ｍｇ／ｍＬの濃度で、実施例１に記載の方法でＰＩＣｓｏｍｅに内包させた。ＰＥＧとしては、数平均分子量６ｋのＰＥＧ６（日油株式会社、ＭＥＰＡ－５０Ｈ）、１２ｋのＰＥＧ１２（日油株式会社、ＭＥＰＡ－１２Ｔ）、２０ｋのＰＥＧ２０（日油株式会社、ＭＥＰＡ－２０Ｔ）、４２ｋのＰＥＧ４２（日油株式会社、ＭＥＰＡ－４０Ｔ）を用いた。
　その結果、図１０に示されるように、添加濃度が５ｍｇ／ｍＬ以下の場合には、粒径は概ね１００ｎｍであり、単分散な粒径分布を有するＰＩＣｓｏｍｅが形成された。
実施例５：架橋ＰＩＣｓｏｍｅの物質透過性
　本実施例では、フルオレセイン標識ＰＥＧ１２を４ｍｇ／ｍＬの濃度で用いて様々なＥＤＣ量で架橋する以外は実施例１に記載された通りにＰＥＧ１２内包ＰＩＣｓｏｍｅを調製し、ＰＩＣｓｏｍｅからのＰＥＧ１２の放出量を調べた。
　実施例３からＥＤＣ等量を調整して架橋率を調整して得られたＰＥＧ１２内包ＰＩＣｓｏｍｅからのＰＥＧ１２の累積放出量をサイズ除外クロマトグラフィーおよび蛍光強度の分析により求めた。サイズ除外クロマトグラフィーは、ゲルろ過クロマトグラフィーカラム：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　２００－１０／３００ＧＬ、ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、および高速液体クロマトグラフ：日本分光株式会社、ＬＣ－２０００ｐｌｕｓを用いて行った。蛍光強度は、常法によりフルオレセインの蛍光強度により保持時間の早い分画（ＰＩＣｓｏｍｅに内包されたＰＥＧ）と遅い分画（放出されたＰＥＧ）とで比較して、累積放出量を求めた。溶液条件は、１０ｍＭ　リン酸緩衝溶液（ｐＨ７．４、３７℃）とした。結果は、図１１Ａに示される通りであった。
　図１１Ａに示される通り、架橋率に依存してＰＥＧ１２のＰＩＣｓｏｍｅからの放出量は変化した。具体的には、架橋率が高いほど、ＰＥＧ１２はＰＩＣｓｏｍｅ内に多く保持された。放出速度定数から算出したところ、結果は図１１Ｂに示される通りであった。なお、放出速度定数ｋは、得られた累積放出率の結果を、一次放出モデルから得られる次式に当てはめることにより算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
　図１１Ｂに示される通り、架橋割合が高まるほど、放出速度定数が小さくなることが明らかとなった。また、架橋割合４５～６０％を境にして、放出速度定数が大きく変動する様子が見られる（図１１Ｂ）。
　次に、放出速度定数の分子量依存性について調べた。架橋率４０％以下の低架橋率（ＬＣ）のＰＩＣｓｏｍｅと、架橋率８０％以上の高架橋率（ＨＣ）のＰＩＣｓｏｍｅとで、ＰＥＧ６、ＰＥＧ２０およびＰＥＧ４２の放出速度を調べた。ＰＥＧはいずれもフルオレセインで標識し、放出速度定数は、上記の通りに求めた。結果は、図１２に示される通りであった。
　図１２に示されるように、ＰＥＧ６では、１日以内にＰＩＣｓｏｍｅからのＰＥＧの大量の放出が観察されたが、ＰＥＧ２０およびＰＥＧ４２では、０～７日にわたって一定した速度でゆっくりとＰＥＧがＰＩＣｓｏｍｅから放出された。また、架橋率が高い方がＰＥＧのＰＩＣｓｏｍｅからの放出が抑制された。このことから、小さい分子はＰＩＣｓｏｍｅを透過しやすく、大きい分子はＰＩＣｓｏｍｅを透過しにくいことが明らかとなった。また、分子量６０００以下では透過性が比較的高く、分子量２００００以上では透過性が比較的低いことが明らかとなった。
実施例６：分子構造とＰＩＣｓｏｍｅの透過性との関係
　本実施例では、直鎖状ＰＥＧと分岐型ＰＥＧとでＰＩＣｓｏｍｅの透過性が相違するか否かを調べた。
　直鎖状ＰＥＧとしては、フルオレセインで標識したＰＥＧ１２を４ｍｇ／ｍＬ（ＰＩＣｓｏｍｅ溶液との混合時の濃度）で用い、分岐型ＰＥＧとしては、４分岐のＰＥＧ（日油株式会社、ＰＴＥ－１００ＰＡ、数平均分子量１０ｋ）を４ｍｇ／ｍＬ（ＰＩＣｓｏｍｅ溶液との混合時の濃度）で用いた以外は、実施例１と同様にＰＩＣｓｏｍｅを得た。
　実施例５と同様にＰＩＣｓｏｍｅからのＰＥＧの累積放出率を測定した。結果は図１３に示される通りであった。
　図１３に示されるように、分岐型のＰＥＧは、線型のＰＥＧよりもＰＩＣｓｏｍｅの膜透過性が低いことが分かった。
実施例７：放出速度定数の温度依存性
　実施例５および６では、ＰＩＣｓｏｍｅからの内包物の放出を３７℃条件下で調べた。本実施例では、放出速度定数の温度依存性を明らかにした。
　実施例５と同様にフルオレセイン標識ＰＥＧ６、ＰＥＧ２０およびＰＥＧ４２をＰＩＣｓｏｍｅに内包させ、様々な温度条件下で放出速度定数を計算した。結果は図１４および１５に示される通りであった。
　図１４および１５に示されるように、放出速度定数の温度依存性は４０％未満の低架橋率のＰＩＣｓｏｍｅにおいて顕著であった。なお、図１５では、丸は４℃、三角は２５℃、四角は３７℃、ひし形は５０℃での放出速度定数を示し、白抜きの印は低架橋率、黒塗りは高架橋率のＰＩＣｓｏｍｅにおける放出速度定数であることを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000004
 ｛式中、左辺は時刻ｔにおける累積放出量（％）を示し、Ｄは内包された物質のＰＩＣｓｏｍｅ膜中での拡散係数を示し、ｌはＰＩＣｓｏｍｅの膜の厚み（～１５ｎｍ）を示す。｝
　上記式により、時刻ｔにおける累積放出量と時刻ｔとの関係を対数プロットすると、図１６に示さるグラフが得られる。ここで、グラフ中の直線の傾きがＤに比例する。図１６中の記号の定義は、図１５と同じである。
　図１６に示されるように、低架橋率ＰＩＣｓｏｍｅの膜中でより高い拡散係数を示すことが分かった。
　これらの実施例から、分子量が１万を超える非線型タンパク質は、ＰＩＣｓｏｍｅ内に効果的に保持でき得ること、数千以下、好ましくは１０００以下の分子量が小さい分子は、ＰＩＣｓｏｍｅを効率よく通過することが示唆された。
　また、このようなＰＩＣｓｏｍｅの性質により、分子量の小さな分子を基質とする分子量の大きな酵素をＰＩＣｓｏｍｅに内包させて血中滞留性を劇的に向上させれば、ＰＩＣｓｏｍｅは、内包した酵素を血中で安定に保持しながら、血液中の基質と反応し続けることが可能となることが明らかとなった。
　Ｌ－ＡＳＰは、アスパラギン要求性腫瘍細胞に対して増殖抑制効果を有することで知られ、臨床では小児急性リンパ性白血病治療薬として用いられる。本実施例から、本発明のＬ－ＡＳＰ内包ＰＩＣｓｏｍｅは、小児急性リンパ性白血病治療薬として高い効果を奏することが示される。
実施例８Ａ：他の酵素の封入と安定性評価
　本実施例では、α－ガラクトシダーゼ、α－グルコシダーゼおよびウリカーゼについて血中安定性を調べた。
１．α－ＧＡＬ内包ＰＩＣｓｏｍｅ溶液の調製
　実施例１の項目５と同様に、空のＰＩＣｓｏｍｅ溶液を得て、その後、α－ガラクトシダーゼ（以下、「α－ＧＡＬ」ともいう）１１．４ｍｇを１０ｍＭ　リン酸緩衝液（ＰＢ、ｐＨ　７．４、０ｍＭ　ＮａＣｌ）５．７ｍＬに溶解し、２ｍｇ／ｍＬのα－ＧＡＬ溶液を調製した。
　２ｍｇ／ｍＬのα－ＧＡＬ溶液１ｍＬを、空のＰＩＣｓｏｍｅ溶液１ｍＬに混合し、ボルテックスにより２分間撹拌した（２０００ｒｐｍ）。その後、水溶性の縮合剤であるＥＤＣ（１０ｍｇ／ｍＬ）を含有するＰＢ溶液５．６ｍＬを加え、一晩静置してポリイオンコンプレクスを架橋した。その後、分画分子量３００，０００の膜のついた限外濾過チューブを用いて、ＰＩＣｓｏｍｅ形成に関与していないポリマー、ＰＩＣｓｏｍｅに封入されなかったα－ＧＡＬおよびＥＤＣなどを除去した。蛍光ラベル化α－ＧＡＬ溶液も同様に調製した。
　α－グルコシダーゼおよびウリカーゼ内包ＰＩＣｓｏｍｅも同様に作製した。
　上記と同様に、空のＰＩＣｓｏｍｅ溶液を得て、その後、α－グルコシダーゼおよびウリカーゼそれぞれ６．２ｍｇおよび１０．４ｍｇを１０ｍＭ　リン酸緩衝液（ＰＢ、ｐＨ　７．４、０ｍＭ　ＮａＣｌ）３．１ｍＬおよび５．２ｍＬに溶解し、２ｍｇ／ｍＬのα－グルコシダーゼ溶液および２ｍｇ／ｍＬのウリカーゼ溶液を調製した。
　２ｍｇ／ｍＬのα－グルコシダーゼ溶液および２ｍｇ／ｍＬのウリカーゼ溶液をそれぞれ、空のＰＩＣｓｏｍｅ溶液１ｍＬに混合し、ボルテックスにより２分間撹拌した（２０００ｒｐｍ）。その後、水溶性の縮合剤であるＥＤＣ（１０ｍｇ／ｍＬ）を含有するＰＢ溶液５．６ｍＬを加え、一晩静置してポリイオンコンプレクスを架橋した。その後、分画分子量３００，０００の膜のついた限外濾過チューブを用いて、ＰＩＣｓｏｍｅ形成に関与していないポリマー、ＰＩＣｓｏｍｅに封入されなかったα－グルコシダーゼおよびウリカーゼ並びにＥＤＣなどを除去した。蛍光ラベル化α－グルコシダーゼおよびウリカーゼ溶液も同様に調製した。
２．α－ＧＡＬ内包ＰＩＣｓｏｍｅのゼータサイザーによる評価
　実施例２の項目１に記載されたように、得られたα－ＧＡＬ内包ＰＩＣｓｏｍｅのサイズ（Ｚ平均粒子径）および多分散指数（ＰＤＩ）は、ゼータサイザー（Ｍａｌｖｅｒｎ）で測定した。サイズはブラウン運動により移動している粒子の拡散を測定し、その測定結果をストークス・アインシュタインの式を用いて粒子径と粒度分布に変換した。結果は、図１７Ａに示される通りであった。図１７Ａに示されるように、Ｌ－ＡＳＰ内包ＰＩＣｓｏｍｅと同様に単分散でサイズの均質なＰＩＣｓｏｍｅが得られた。
３．α－ＧＡＬがＰＩＣｓｏｍｅ中に内包されていることの確認
　実施例２の項目２に記載されたように、α－ＧＡＬがＰＩＣｓｏｍｅ中に内包されていることを確認するため、遊離型α－ＧＡＬと内包型α－ＧＡＬの溶液を対象として、分子の拡散速度を蛍光相関分光法（ＦＣＳ）により評価した。結果は、図１７Ｂに示される砦あった。図１７Ｂに示されるように、内包型α－ＧＡＬは、遊離型α－ＧＡＬよりも大きな拡散時間および１粒子あたりの蛍光強度を示し、確かにα－ＧＡＬがＰＩＣｓｏｍｅ中に内包されていることが確認された。また、表１に示されるように、一粒子当たりの蛍光強度の比較から、１つのＰＩＣｓｏｍｅ内にはα－ＧＡＬが３分子封入されていると見積もられた。
　さらに、α－グルコシダーゼおよびウリカーゼについても、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）により、ＰＩＣｓｏｍｅ中に内包されていることが確認された（図１８）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
４．ＰＩＣｓｏｍｅ中に内包されたα－ＧＡＬの血中滞留性
　実施例２の項目３に記載されたように、遊離型α－ＧＡＬと内包型α－ＧＡＬの血中滞留性を評価した。マウス（Balb/c、６週齢、ｎ＝３）にＣｙ５－α－ＧＡＬを内包したＰＩＣｓｏｍｅを尾静脈投与し、１２時間後に採血して、上澄みの蛍光強度（Ex/Em=650nm/670nm）を測定した。結果は、図１９Ａに示される通りであった。図１９Ａに示されるように、内包型α－ＧＡＬの血中滞留性は、遊離型α－ＧＡＬの血中滞留性と比較して格段に高かった。
５．生理的条件下での酵素活性の維持
　次に、遊離型α－ＧＡＬと内包型α－ＧＡＬについてそれぞれ、酵素活性を評価した。α－ＧＡＬの酵素活性は、図１９Ｂに示されるように、基質α－ガラクトシル－β－（７－アミド－４－メチルクマリン）（「Ｇａｌ－ＡＭＣ」とも言う）との反応により確認した。Ｇａｌ－ＡＭＣは、α－ＧＡＬの酵素活性により分解されて７－アミノ－４－メチルクマリン（「ＡＭＣ」ともいう）を生じ、蛍光（Ｅｘ／Ｅｍ＝３５０　ｎｍ／４５０　ｎｍ）を発する。
　具体的には、まず、Ｇａｌ－ＡＭＣ、遊離型α－ＧＡＬ、および内包型α－ＧＡＬの各溶液（ＰＢＳ中）を恒温槽に静置して３７℃とした。その後、Ｇａｌ－ＡＭＣの溶液を遊離型α－ＧＡＬもしくは内包型α－ＧＡＬの各溶液と混合し、速やかに所定量を９６ウェルプレート（テカン）に注いだ。プレートを予め３７℃に保温しておいたマルチプレートリーダーの内部に入れ、蛍光強度を一定時間経時的に測定した。
　酵素活性は、ミカエリス・メンテンプロットおよびラインウィーバー・バークプロットを作成して評価した。この際、予め調製したＡＭＣの標準溶液を用いて作製した検量線を用い、蛍光強度の変化を生成物の生成速度に変換することで反応速度Ｖを求めた。基質濃度［Ｓ］を様々に変え、横軸に［Ｓ］を、縦軸にＶを取り、プロットの結果に次式を当てはめることでミカエリス・メンテン係数（Ｋｍ）を算出した。結果は、表２に示される通りであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表２に示されるように、ＰＩＣｓｏｍｅ中に内包されたα－ＧＡＬは、生体内で安定であり、遊離型α－ＧＡＬと同等の酵素活性を維持していた。
 

Claims (20)

  1. 　酵素を内包したポリイオンコンプレックス型ポリマーソームであって、
    　酵素は、ポリイオンコンプレックス型ポリマーソームの膜を透過する物質を基質とする酵素である、ポリイオンコンプレックス型ポリマーソーム。
  2. 　酵素の分子量が、５ｋＤａ以上である、請求項１に記載のポリイオンコンプレックス型ポリマーソーム。
  3. 　酵素の基質の分子量が、１ｋＤａ以下である、請求項１または２に記載のポリイオンコンプレックス型ポリマーソーム。
  4. 　酵素が、球状タンパク質である、請求項１～３のいずれか一項に記載のポリイオンコンプレックス型ポリマーソーム。
  5. 　酵素が、Ｌ－アスパラギナーゼ、ウリカーゼ、α－ガラクトシダーゼおよびα－グルコシダーゼから選択される酵素である、請求項１に記載のポリイオンコンプレックス型ポリマーソーム。
  6. 　ポリイオンコンプレックス型ポリマーソームが、
    　ＣＯＯＨ基を側鎖に有するアミノ酸を単量体単位として含む重合体（Ａ）と、
    　ＮＨ2基を側鎖に有するアミノ酸を単量体単位として含む重合体（Ｂ）と
    のポリイオンコンプレックス型ポリマーソームである、請求項１～５のいずれか一項に記載のポリイオンコンプレックス型ポリマーソーム。
  7. 　重合体（Ａ）に存在するＣＯＯＨ基の５０％以上が重合体（Ｂ）のＮＨ2基と架橋され
    ている、請求項６に記載のポリイオンコンプレックス型ポリマーソーム。
  8. 　１０ｍＭ　リン酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）中において３７℃条件下で測定した場合に、内包した酵素の累積放出率（％）が前記水溶液と接触後７日目に２０％以下である、請求項１～７のいずれか一項に記載のポリイオンコンプレックス型ポリマーソーム。
  9. 　１０ｍＭ　リン酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）中において３７℃条件下で測定した場合に、数平均分子量２ｋＤａの直鎖状ポリエチレングリコールの放出速度定数ｋが５×１０-3以下である、請求項７に記載のポリイオンコンプレックス型ポリマーソーム。
  10. 　請求項１～９のいずれか一項に記載のポリイオンコンプレックス型ポリマーソームであって、内包される酵素が、血漿成分を基質とする、ポリイオンコンプレックス型ポリマーソーム。
  11. 　請求項１０のポリイオンコンプレックス型ポリマーソームを含んでなる、医薬組成物。
  12. 　医薬組成物が、酵素欠損または異常を起因とする疾患に罹患している患者に投与するための医薬組成物であり、酵素が、該対象において欠損した、または異常を有する酵素である、請求項１１に記載の医薬組成物。
  13. 　酵素が、Ｌ－アスパラギナーゼ、ウリカーゼ、α－ガラクトシダーゼ、およびα－グルコシダーゼから選択される酵素である、請求項１１または１２に記載の医薬組成物。
  14. 　酵素が、新生物または微生物の生育に必要な栄養素を分解する酵素である、請求項１１に記載の医薬組成物。
  15. 　アスパラギン要求性腫瘍を処置するための、請求項１３に記載の医薬組成物。
  16. 　アスパラギン要求性腫瘍が、アスパラギン産生酵素の発現量が、正常細胞における該酵素の発現量に対して８０％以下である腫瘍である、１５に記載の医薬組成物。
  17. 　アスパラギン要求性腫瘍が、急性リンパ性白血病、Ｔ細胞悪性リンパ腫、ＮＫ細胞性白血病および急性骨髄性白血病からなる群から選択される、請求項１５または１６に記載の医薬組成物。
  18. 　酵素が、α－ガラクトシダーゼであり、α－ガラクトシダーゼの異常を原因とする疾患を処置することに用いるための、請求項１１または１２に記載の医薬組成物。
  19. 　酵素が、ウリカーゼであり、高尿酸血症または高尿酸血症を原因とする疾患を処置することに用いるための、請求項１１または１２に記載の医薬組成物。
  20. 　酵素が、α－グルコシダーゼであり、α－グルコシダーゼの異常を原因とする疾患を処置することに用いるための、請求項１１または１２に記載の医薬組成物。
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