JPWO2016178431A1 - ポリイオンコンプレックス型ポリマーソームを用いたナノリアクタとその製造方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、ポリイオンコンプレックス型ポリマーソームを用いたナノリアクタ（ナノサイズの反応場）とその製造方法を提供する。本発明は、例えば、酵素を内包したポリイオンコンプレックス型ポリマーソームであって、酵素は、ポリイオンコンプレックス型ポリマーソームの膜を透過する物質を基質とする酵素である、ポリイオンコンプレックス型ポリマーソームを提供する。

Description

本発明は、ポリイオンコンプレックス型ポリマーソームを用いたナノリアクタとその製造方法に関する。

血中や体内で目的タンパク質を安定的に維持し、その酵素活性を血中で発揮させることに関して、医療・産業界からのニーズが存在し、様々な技術が開発されている。例えば、特許文献１は、アルコールオキシダーゼ酵素およびカタラーゼ酵素を内包したナノカプセルを提供する。特許文献１のナノカプセルは、血中アルコールを分解し、二日酔いや急性アルコール中毒などの症状を処置するためのものとして提案されている。特許文献２には、薬剤送達に用いるベシクルに薬剤や核酸を内包させる技術が記載されている。また、特許文献３には、ベシクル作成時の環境負荷や手順を低減する技術として、水溶性であり、かつ荷電した重合体により形成されるベシクルが記載されている。

ＷＯ２０１３／６７６３ ＷＯ２０１１／１４５７４５ ＷＯ２０１２／１４９４２

本発明は、内包した分子のベシクル外への漏洩を防止し、血中において長期に安定して酵素活性を発揮させる技術として、ポリイオンコンプレックス型ポリマーソームを用いたナノリアクタ（ナノサイズの反応場）とその製造方法を提供する。

本発明者らは、酵素を内包したポリイオンコンプレックス型ポリマーソームが、血中において内包する酵素を長期にわたり安定化できること、および、酵素の活性を長期にわたり維持できることを見いだした。本発明者らはまた、ポリイオンコンプレックス型ポリマーソームを構成するカチオン性ポリマーおよびアニオン性ポリマーの架橋の度合いによって物質の透過性を制御できることを見いだした。本発明者らはさらにまた、Ｌ−アスパラギナーゼ内包ポリイオンコンプレックス型ポリマーソームが、血中のアスパラギンを極めて効率よく加水分解できることを明らかにした。本発明者らは、その他の酵素でもポリイオンコンプレックス型ポリマーソームに内包することができ、内包すると血中滞留時間が向上すること、およびその酵素活性が良好に維持されることを明らかにした。本発明はこれらの知見に基づくものである。

すなわち、本発明では以下の発明が提供される。
（１）酵素を内包したポリイオンコンプレックス型ポリマーソームであって、
酵素は、ポリイオンコンプレックス型ポリマーソームの膜を透過する物質を基質とする酵素である、ポリイオンコンプレックス型ポリマーソーム。
（２）酵素の分子量が、５ｋＤａ以上である、上記（１）に記載のポリイオンコンプレックス型ポリマーソーム。
（３）酵素の基質の分子量が、１ｋＤａ以下である、上記（１）または（２）に記載のポリイオンコンプレックス型ポリマーソーム。
（４）酵素が、球状タンパク質である、上記（１）〜（３）のいずれかに記載のポリイオンコンプレックス型ポリマーソーム。
（５）酵素が、Ｌ−アスパラギナーゼ、ウリカーゼ、α−ガラクトシダーゼおよびα−グルコシダーゼから選択される酵素である、上記（１）に記載のポリイオンコンプレックス型ポリマーソーム。
（６）ポリイオンコンプレックス型ポリマーソームが、
ＣＯＯＨ基を側鎖に有するアミノ酸を単量体単位として含む重合体（Ａ）と、
ＮＨ₂基を側鎖に有するアミノ酸を単量体単位として含む重合体（Ｂ）と
のポリイオンコンプレックス型ポリマーソームである、上記（１）〜（５）のいずれかに記載のポリイオンコンプレックス型ポリマーソーム。
（７）重合体（Ａ）に存在するＣＯＯＨ基の５０％以上が重合体（Ｂ）のＮＨ₂基と架橋されている、上記（６）に記載のポリイオンコンプレックス型ポリマーソーム。
（８）１０ｍＭ リン酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）中において３７℃条件下で測定した場合に、内包した酵素の累積放出率（％）が前記水溶液と接触後７日目に２０％以下である、上記（１）〜（７）のいずれかに記載のポリイオンコンプレックス型ポリマーソーム。
（９）１０ｍＭ リン酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）中において３７℃条件下で測定した場合に、数平均分子量２ｋＤａの直鎖状ポリエチレングリコールの放出速度定数ｋが５×１０^-3以下である、上記（７）に記載のポリイオンコンプレックス型ポリマーソーム。
（１０）上記（１）〜（９）のいずれかに記載のポリイオンコンプレックス型ポリマーソームであって、内包される酵素が、血漿成分を基質とする、ポリイオンコンプレックス型ポリマーソーム。
（１１）上記（１０）のポリイオンコンプレックス型ポリマーソームを含んでなる、医薬組成物。
（１２）医薬組成物が、酵素欠損または異常を起因とする疾患に罹患している患者に投与するための医薬組成物であり、酵素が、該対象において欠損した、または異常を有する酵素である、上記（１１）に記載の医薬組成物。
（１３）酵素が、Ｌ−アスパラギナーゼ、ウリカーゼ、α−ガラクトシダーゼおよびα−グルコシダーゼから選択される酵素である、上記（１１）に記載の医薬組成物。
（１４）酵素が、新生物または微生物の生育に必要な栄養素を分解する酵素である、上記（１１）に記載の医薬組成物。
（１５）酵素が、Ｌ−アスパラギナーゼであり、アスパラギン要求性腫瘍を処置するための、上記（１３）に記載の医薬組成物。
（１６）アスパラギン要求性腫瘍が、アスパラギン産生酵素の発現量が、正常細胞における該酵素の発現量に対して８０％以下である腫瘍である、上記（１５）に記載の医薬組成物。
（１７）アスパラギン要求性腫瘍が、急性リンパ性白血病、Ｔ細胞悪性リンパ腫、ＮＫ細胞性白血病および急性骨髄性白血病からなる群から選択される、上記（１５）または（１６）に記載の医薬組成物。
（１８）酵素が、α−ガラクトシダーゼであり、α−ガラクトシダーゼの異常を原因とする疾患を処置することに用いるための、上記（１１）または（１２）に記載の医薬組成物。
（１９）酵素が、ウリカーゼであり、高尿酸血症または高尿酸血症を原因とする疾患を処置することに用いるための、上記（１１）または（１２）に記載の医薬組成物。
（２０）酵素が、α−グルコシダーゼであり、α−グルコシダーゼの異常を原因とする疾患を処置することに用いるための、上記（１１）または（１２）に記載の医薬組成物。

本発明によれば、本発明の医薬組成物により補充された酵素は、血中安定性が高く、また、異種生物で生成した酵素による免疫原性を削減できる点で有利である。

図１は、Ｌ−アスパラギナーゼを内包したポリイオンコンプレックス型ポリマーソームの粒径分布（図１Ａ）およびその透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）像を示す。 図２は、ポリイオンコンプレックス型ポリマーソーム中に内包させたＬ−アスパラギナーゼ、および裸のＬ−アスパラギナーゼを蛍光相関分光法により解析した結果を示す。 図３は、裸のＬ−アスパラギナーゼのミカエリス・メンテンプロット（図３Ａ）およびラインウィーバー・バークプロット（図３Ｂ）を示す。 図４は、ポリイオンコンプレックス型ポリマーソームに内包させたＬ−アスパラギナーゼにおけるミカエリス・メンテンプロット（図４Ａ）およびラインウィーバー・バークプロット（図４Ｂ）を示す。 図５は、ポリイオンコンプレックス型ポリマーソームに内包させたＬ−アスパラギナーゼの血中滞留性を示す。 図６は、Ｌ−アスパラギナーゼの酵素反応速度の経時変化を示す。 図７は、Ｌ−アスパラギナーゼを尾静脈投与したマウスにおける血中アンモニア窒素濃度（図７Ａ）および血中アンモニア窒素濃度の上昇量（図７Ｂ）を示す。 図８は、架橋剤であるＥＤＣ等量と得られたポリイオンコンプレックス型ポリマーソームのＦＴ−ＩＲスペクトル（図８Ａ）および架橋割合（％）とＥＤＣ等量との関係（図８Ｂ）を示す。 図９は、架橋前と架橋後におけるポリイオンコンプレックス型ポリマーソームの粒径（図９Ａ）、多分散度（ＰＤＩ）（図９Ｂ）およびそのＴＥＭ像（図９Ｃ）を示す。 図１０は、内包させる分子のサイズおよび分子の使用濃度と、得られるポリイオンコンプレックス型ポリマーソームの粒径との関係を示す。 図１１は、図中で示される様々な架橋割合（％）のポリイオンコンプレックス型ポリマーソームにおける、内包物の放出割合の経時的変化（図１１Ａ）および架橋割合と放出速度定数との関係（図１１Ｂ）を示す。 図１２は、分子量の異なるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のポリイオンコンプレックス型ポリマーソームからの放出割合の経時的変化を示す。図１２では、ＰＥＧ６（分子量６ｋ）、ＰＥＧ２０（分子量２０ｋ）、ＰＥＧ４２（分子量４２ｋ）が示されている。図中のＬＣは、架橋率４０％未満のポリイオンコンプレックス型ポリマーソームにおける放出割合を示し、ＨＣは架橋率８０％以上のポリイオンコンプレックス型ポリマーソームにおける放出割合を示す。ＦＰＥＧは、フルオレセイン標識されたＰＥＧを意味する。 図１３は、直鎖ＰＥＧと分岐ＰＥＧとの放出率の差を示す図である。 図１４は、ポリイオンコンプレックス型ポリマーソームからのＰＥＧの放出速度定数と温度との関係を示す図である。図中のＬＣは、架橋率４０％未満のポリイオンコンプレックス型ポリマーソームにおける放出割合を示し、ＨＣは架橋率８０％以上のポリイオンコンプレックス型ポリマーソームにおける放出割合を示す。 図１５は、ＰＥＧの分子量と放出定数との関係を示す図である。図１５では、丸印は４℃、三角印は２５℃、四角印は３７℃、ひし形印は５０℃での放出速度定数を示し、白抜きの印は低架橋率、黒塗りは高架橋率のＰＩＣｓｏｍｅにおける放出速度定数であることを示す。 図１６は、時刻ｔにおける累積放出量（％）と時刻ｔとの関係を示す。図において傾きがポリイオンコンプレックス型ポリマーソームの膜中での分子の拡散係数に比例する。 図１７は、α−ガラクトシダーゼ（以下、「α−ＧＡＬ」ともいう）を内包したＰＩＣｓｏｍｅの粒径分布（図１７Ａ）と、蛍光相関分光法による裸の遊離型α−ガラクトシダーゼとＰＩＣｓｏｍｅ内包型α−ガラクトシダーゼの分析結果を示す。 図１８は、蛍光相関分光法によるＰＩＣｓｏｍｅ内包型α−グルコシダーゼまたはウリカーゼの蛍光相関分光法による解析結果を示す。 図１９は、ＰＩＣｓｏｍｅ内包型α−ＧＡＬの血中滞留性（図１９Ａ）とその酵素活性の測定スキームを示す（図１９Ｂ）。

発明の具体的な説明

本明細書では、「重合体」または「ポリマー」とは、モノマー単位が重合してできる分子をいい、ホモ重合体、共重合体およびブロック共重合体を包含する意味で用いられる。本明細書では、「ホモ重合体」または「ホモポリマー」とは、１種類の単量体単位を重合させて得られる重合体を言う。本明細書では、「共重合体」とは、２種類以上のモノマー単位を重合させて得られるポリマーを言い、ブロック共重合体を包含する意味で用いられる。本明細書では、「ブロック共重合体」とは、同種の単量体単位が連続して形成されたブロックと別種の単量体単位が連続して形成されたブロックとが連結してなる共重合体を言う。

本発明では、「ポリイオンコンプレックス型ポリマーソーム」とは、ＰＩＣｓｏｍｅとも呼ばれ、ポリイオンコンプレックスにより形成される中空の微粒子を意味する。ＰＩＣｓｏｍｅは、血中滞留時間の観点では、その外表面をポリエチレングリコールで修飾することが好ましいと知られている。

本明細書では、「ポリイオンコンプレックス」（以下、「ＰＩＣ」ともいう）とは、ＰＥＧとアニオン性ブロックとの共重合体と、ＰＥＧとカチオン性ブロックとの共重合体とを水溶液中で荷電を中和するように混合すると両ブロック共重合体のカチオン性ブロックとアニオン性ブロックとの間で形成されるイオン層である。ＰＥＧと上記の荷電性連鎖とを結合させる意義は、ポリイオンコンプレックスが凝集して沈殿することを抑制すること、および、それにより、ポリイオンコンプレックスが粒径数十ｎｍの単分散なコア−シェル構造を有するナノ微粒子を形成することである。この際、ＰＥＧはナノ微粒子の外殻（シェル）を覆うため、生体適合性が高く、血中滞留時間を向上させる点で都合がよいことでも知られている。また、ポリイオンコンプレックス形成において、一方の荷電性ブロックコポリマーは、ＰＥＧ部分を必要とせず、ホモポリマー、界面活性剤、核酸および／または酵素に置き換えてもよいことが明らかとなっている。そして、ポリイオンコンプレックス形成においては、アニオン性ポリマーおよびカチオン性ポリマーの少なくとも１つがＰＥＧとの共重合体を形成しており、その両方がＰＥＧとの共重合体を形成していてもよい。また、ＰＥＧ含有量を低減させるとＰＩＣｓｏｍｅが形成されやすい。ＰＩＣｓｏｍｅに酵素を内包させるためには、ＰＩＣｓｏｍｅと酵素を混合して、激しく攪拌することができる。攪拌は、ボルテックスミキサー（商標）などの攪拌装置などを用いて行うことができる。また、ＰＩＣｓｏｍｅ形成時に酵素を共存させてもＰＩＣｓｏｍｅに酵素を内包させることができる。

本明細書では、「酵素」とは、触媒活性を有するタンパク質を意味する。酵素の分子量は、一般的に１０ｋＤａ〜２００ｋＤａを中心として広く分布していることが知られている。

本明細書では、「対象」とは、ヒトを含む哺乳動物である。対象は、健常の対象であってもよいし、何らかの疾患に罹患した対象であってもよい。

本発明者らは、ＰＩＣｓｏｍｅに酵素を内包させて、ＰＩＣｓｏｍｅの外部から該酵素の基質をＰＩＣｓｏｍｅと接触させたところ、酵素はＰＩＣｓｏｍｅの内部に保たれたが、基質はＰＩＣｓｏｍｅの膜を透過するために、ＰＩＣｓｏｍｅ外の基質がＰＩＣｓｏｍｅ内の酵素と反応しうること、反応生成物はＰＩＣｓｏｍｅの外に放出されることを見いだした。本発明者らはまた、ＰＩＣｓｏｍｅに内包させた酵素は、裸の酵素と比較して血中滞留性が顕著に向上することも見いだした。

従って、本発明によれば、酵素を内包したポリイオンコンプレックス型ポリマーソームが提供される。本発明によれば、酵素は、ポリイオンコンプレックス型ポリマーソームの膜を透過する物質を基質とする酵素とすることができる。

本発明によれば、分子量６ｋＤａのＰＥＧはＰＩＣｓｏｍｅの膜に対する透過性は低かった。また、繊維型でないタンパク質はさらにＰＩＣｓｏｍｅの膜に対する透過性が低いと予想される。従って、本発明のある態様では、酵素は、分子量５ｋＤａ以上、１０ｋＤａ以上、２０ｋＤａ以上、３０ｋＤａ以上、４０ｋＤａ以上、５０ｋＤａ以上、６０ｋＤａ以上、７０ｋＤａ以上、８０ｋＤａ以上、９０ｋＤａ以上、１００ｋＤａ以上、１１０ｋＤａ以上、１２０ｋＤａ以上、１３０ｋＤａ以上または１４０ｋＤａ以上の酵素を用いることができる。分子量は５ｋＤａ以上であればＰＩＣｓｏｍｅ内部に保持することができるが、分子量が大きいほどＰＩＣｓｏｍｅを通過しにくく内部に保持されやすい。

本発明によれば、酵素の基質は、分子量５ｋＤａ未満、４ｋＤａ以下、３ｋＤａ以下、２ｋＤａ以下、１ｋＤａ以下、７５０Ｄａ以下、５００Ｄａ以下、４００Ｄａ以下、３００Ｄａ以下または２００Ｄａ以下とすることができる。分子量は、５ｋＤａ未満であればＰＩＣｓｏｍｅの膜を透過することができるが、分子量が小さいほどＰＩＣｓｏｍｅの膜を通過して酵素と接触し易くなり、反応効率が高まる。

本発明によれば、繊維状ポリマーもＰＩＣｓｏｍｅ内に有利に保持されたが、分岐状ポリマーにおいてＰＩＣｓｏｍｅの膜透過性がより低下して内部により有利に保持される。従って、本発明では酵素として、繊維状タンパク質を用いることも可能であるが、好ましくは球状タンパク質を用いることができる。

本発明によれば、ＰＩＣｓｏｍｅに内包された酵素は、生理的条件下および血中において、裸の酵素と比較して安定である。特に、本発明によれば、ＰＩＣｓｏｍｅに内包された酵素は、血中において、裸の酵素と比較して安定である。従って、本発明のある態様では、酵素は、その基質が血漿成分である酵素とすることができる。このようにすることで、血中において安定的に酵素およびその活性を維持しながら、血中の基質を効果的に処理することができる。

本発明のある態様では、酵素として、Ｌ−アスパラギナーゼを用いることができる。Ｌ−アスパラギナーゼ（以下「Ｌ−ＡＳＰ」ということがある）は、分子量約１４１ｋＤａのタンパク質であり、アスパラギンを加水分解してアスパラギン酸とＮＨ₃を生成する。Ｌ−ＡＳＰは、急性リンパ性白血病の処置用に市販されており、例えば協和発酵キリン社からロイナーゼ（商標）の商品名で市販されている。Ｌ−ＡＳＰは、肥満細胞腫の処置にも用いられる。Ｌ−ＡＳＰは、静脈内注射により投与することができる。

Ｌ−ＡＳＰは、血中のＬ−アスパラギンを加水分解し、アスパラギン要求性の腫瘍細胞を栄養欠乏状態にすることにより抗腫瘍効果を発揮すると考えられている。アスパラギナーゼとしては、大腸菌（Escherichia coli）由来のものや、エルウィニア・クリサンテミ（Erwinia chrysanthemi）由来のものを用いることができる。しかし、これらの細菌由来のアスパラギナーゼは、ヒトにアレルギー反応を引き起こさせる可能性がある。本発明によれば、アスパラギナーゼは、ＰＩＣｓｏｍｅ中に内包され、アレルギー反応の問題は低減される。Ｌ−ＡＳＰとしては、ＰＥＧで修飾されたＰＥＧアスパラギナーゼを用いてもよい。

本発明によれば、ＰＩＣｓｏｍｅ中に内包されたＬ−ＡＳＰ（以下、「内包型Ｌ−ＡＳＰ」ということがある）は、裸のＬ−ＡＳＰ（以下、「遊離型Ｌ−ＡＳＰ」ということがある）と比較して高い血中滞留性とＮＨ₃生成能（すなわち、アスパラギン加水分解能）を示した。従って、本発明によれば、アスパラギン要求性または感受性の腫瘍細胞の処置において、従来のＬ−ＡＳＰよりも効果的に用いることができる。従って、本発明によれば、内包させる酵素がＬ−ＡＳＰである、ＰＩＣｓｏｍｅを含む医薬組成物が提供される。

本発明の、内包させる酵素がＬ−ＡＳＰであるＰＩＣｓｏｍｅを含む医薬組成物は、アスパラギン要求性の腫瘍を処置することに用いることができる。アスパラギン要求性の腫瘍としては、急性白血病、例えば、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、特に小児急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、その他の急性白血病、および悪性リンパ腫、例えば、Ｔ細胞悪性リンパ腫、ホジキン氏病、細網肉腫およびリンパ肉腫が挙げられる。

近年、細胞内のアスパラギン産生酵素の欠損または低発現を示すＮＫ細胞性白血病および急性骨髄性白血病では、アスパラギナーゼ投与によりアスパラギンを枯渇させやすく、腫瘍細胞に細胞死を誘導させることができることが明らかとなった。従って、本発明のある態様では、アスパラギン要求性の腫瘍は、アスパラギン産生酵素の発現を調べることにより同定することができる。例えば、本発明のある態様では、アスパラギン要求性の腫瘍は、アスパラギン産生酵素の発現が、正常細胞に対して８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、３％以下または１％以下の腫瘍とすることができる。本発明のある態様では、アスパラギン要求性の腫瘍は、ＮＫ細胞性白血病および急性骨髄性白血病のいずれかとすることができる。

本発明の、内包させる酵素がＬ−ＡＳＰであるＰＩＣｓｏｍｅを含む医薬組成物は、Ｌ−ＡＳＰを用いた化学療法によりアレルギー症状（例えば、アナフィラキシー症状）を呈するに至った腫瘍患者を対象として投与することができる。
腫瘍のような新生物以外にも、細菌およびウイルスなどの微生物が必要とする栄養源を分解する酵素をＰＩＣｓｏｍｅに内包して生体に投与することにより、新生物や微生物の死滅・減少を誘導することができる。

本発明のある態様では、内包させる酵素として、ウリカーゼを用いることができる。ウリカーゼ（EC1.7.33）は、尿酸オキシダーゼともよばれ、プリン代謝およびカフェイン代謝に関与すし尿酸を分解することができる。そのため、血中の尿酸値が高値を示す高尿酸血症および高尿酸血症を原因とする疾患（例えば、合併症）の処置にウリカーゼを用いることができる。高尿酸血症を原因とする疾患としては、痛風（例えば、痛風結節および痛風関節炎）並びに尿酸塩沈着症および尿酸結石、間質性腎炎、腎不全、および動脈硬化症などの高尿酸血症を原因とする疾患が挙げられる。本発明によれば、内包させる酵素がウリカーゼであるＰＩＣｓｏｍｅを含む医薬組成物であって、高尿酸血症または高尿酸血症を原因とする疾患を処置することに用いるための医薬組成物が提供される。

さらに、ＰＩＣｓｏｍｅに内包された酵素は血中で安定であることから、ＰＩＣｓｏｍｅに酵素を内包することにより、酵素を血中から細胞内に輸送させることにも有効に利用できる。細胞内、特にライソゾーム内には多数の酵素が存在し、その酵素の欠損又は異常によりライソゾーム病が生じる。従って、本発明のある態様では、欠損又は異常（例えば、酵素活性の低下）によりライソゾーム病を生じる酵素を、ＰＩＣｓｏｍｅに内包させて、当該酵素の欠損又は異常によりライソゾーム病に罹患した対象に対して投与することができる。
本発明のある態様では、内包させる酵素として、ライソゾーム内の酵素、例えば、α−ガラクトシダーゼ（以下、「α−ＧＡＬ」ともいう）を用いることができる。α−ガラクトシダーゼ（EC3.2.1.22）は、α−Ｄ−ガラクトシドを加水分解する活性を有しており、種々のアルコール誘導体へのα−Ｄ−ガラクトシドのＯ−転移を促進する活性を有する。α−ガラクトシダーゼは、その活性が欠乏するとライソゾーム病の一種、ファブリー病の原因となる。α−ガラクトシダーゼは、点滴投与による補充療法において、ファブリー病の症状の改善や進行を抑えることができる。

本発明によれば、内包させる酵素がα−ガラクトシダーゼであるＰＩＣｓｏｍｅを含む医薬組成物は、α−ガラクトシダーゼの異常を原因とする疾患、例えば、ライソゾーム病（例えば、ファブリー病）などのα−ガラクトシダーゼの活性低下または欠損を原因とする疾患を処置することに用いることができる。本発明によれば、内包させる酵素がα−ガラクトシダーゼであるＰＩＣｓｏｍｅを含む医薬組成物であって、α−ガラクトシダーゼの異常を原因とする疾患（例えば、ライソゾーム病）を処置することに用いるための医薬組成物が提供される。

本発明のある態様では、内包させる酵素として、α−グルコシダーゼを用いることができる。α−グルコシダーゼ（EC3.2.1.20）は、糖のα−１，４−グルコシド結合を加水分解する活性を有している。α−グルコシダーゼは、その活性が欠乏するとライソゾーム病（例えば、ポンベ病（OMIM No.: 232300））の原因となる。従って、α−グルコシダーゼは、α−グルコシダーゼの異常（例えば、活性低下または欠損）を原因とする疾患の処置に用いることができる。α−グルコシダーゼの活性低下または欠損を原因とする疾患としては、ライソゾーム病（例えば、ポンベ病）などのα−グルコシダーゼの活性低下または欠損を原因とする疾患が挙げられる。従って、本発明によれば、内用される酵素がα−グルコシダーゼであるＰＩＣｓｏｍｅを含む医薬組成物であって、α−グルコシダーゼの活性低下または欠損を原因とする疾患を処置することに用いるための医薬組成物が提供される。
本発明の酵素は、ここに記載した酵素に限定されるものではなく、生体内で欠損又は異常により、不足している酵素を補うための酵素補充療法に広く利用することできる。

ＰＩＣｓｏｍｅを形成するブロック共重合体としては、ＰＥＧブロックとポリカチオンブロックとのブロック共重合体およびホモポリアニオン、または、ＰＥＧブロックとポリアニオンブロックとのブロック共重合体およびホモポリカチオンが挙げられる。ブロック共重合体としては、生分解性であるブロック共重合体を用いることが好ましく、そのような共重合体としては様々な共重合体が知られ、いずれを用いることも原理的に可能である。

本発明では、ポリカチオンブロックとしては、例えば、カチオン性天然アミノ酸およびカチオン性非天然アミノ酸、例えば、ヒスチジン、トリプトファン、オルニチン、アルギニンおよびリジンなどのカチオン性天然アミノ酸、および／または、−（ＮＨ−（ＣＨ₂）₂）_p−ＮＨ₂で表される基｛ここで、ｐは１〜５の整数である。｝をカチオン性の側鎖として有するポリマーブロック、例えば、上記カチオン性の側鎖を有するカチオン性非天然アミノ酸のポリマーブロック、例えば、上記カチオン性の側鎖を有するアスパラギン酸またはグルタミン酸などのカチオン性非天然アミノ酸のポリマーブロックが挙げられる。本発明のある態様では、ポリカチオンブロックは、−（ＮＨ−（ＣＨ₂）₂）_p−ＮＨ₂で表される基｛ここで、ｐは１〜５の整数である。｝を側鎖として有するポリマーブロックである。ここで、カチオン性天然アミノ酸としては、好ましくはヒスチジン、トリプトファン、オルニチン、アルギニンおよびリジンが挙げられ、より好ましくはアルギニン、オルニチンおよびリジンが挙げられ、さらに好ましくはオルニチンおよびリジンが挙げられ、さらにより好ましくはリジンが挙げられる。生体適合性が高く、生分解性であるブロック共重合体としては、例えば、ポリ（アスパラギン酸−テトラエチレンペンタアミン）ブロック共重合体、および、ポリエチレングリコール−ポリ（（５−アミノペンチル）−アスパラギン酸）ブロック共重合体を用いることができる。

ポリカチオンブロックには、カチオン性アミノ酸およびカチオン性の側鎖を有するアミノ酸が混在していてもよい。すなわち、本発明のある態様では、ポリカチオンブロックは、カチオン性天然アミノ酸、カチオン性非天然アミノ酸、または、カチオン性天然アミノ酸およびカチオン性非天然アミノ酸を含むモノマー単位の重合体である。本発明のある態様では、ポリカチオンブロック中のモノマー単位間の結合はペプチド結合である。本発明の好ましい態様では、カチオン性非天然アミノ酸が、側鎖として−（ＮＨ−（ＣＨ₂）₂）_p−ＮＨ₂で表される基｛ここで、ｎは１〜５の整数である｝を有するアミノ酸である。また、本発明のある態様では、ポリカチオンブロックは、カチオン性天然アミノ酸並びに−（ＮＨ−（ＣＨ₂）₂）_p−ＮＨ₂で表される基｛ここで、ｐは１〜５の整数である。｝で修飾されたアスパラギン酸およびグルタミン酸が任意の順番で重合してなるポリカチオンブロックとすることができる。本発明のある態様では、ポリマー中のモノマー単位の４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または１００％が側鎖として−（ＮＨ−（ＣＨ₂）₂）_p−ＮＨ₂で表される基｛ここで、ｐは１〜５の整数である。｝を有する。

本発明のある態様では、ＰＩＣｓｏｍｅはＰＥＧブロックとポリカチオンブロックとのブロック共重合体およびホモポリアニオンとのポリイオンコンプレックスにより形成できる。本発明のある特定の態様では、ＰＥＧブロックとポリカチオンブロックとのブロック共重合体は、ＰＥＧブロックとポリ（アミノペンチル−アスパラギン酸）との共重合体とすることができる。本発明のある特定の態様では、ホモポリアニオンは、ポリアスパラギン酸とすることができる。本発明のさらなる特定の態様では、ＰＩＣｓｏｍｅはＰＥＧブロックとポリカチオンブロックとのブロック共重合体およびホモポリアニオンはそれぞれ、ＰＥＧブロックとポリ（アミノペンチル−アスパラギン酸）との共重合体およびポリアスパラギン酸とすることができる。このさらなる特定の態様において、ＰＥＧブロック、ポリアスパラギン酸ブロックおよびポリ（アミノペンチル−アスパラギン酸）ブロックの重合度は、それぞれ独立して、５〜２０，０００の整数、好ましくは１０〜５，０００の整数、より好ましくは４０〜５００の整数、さらに好ましくは５〜１，０００の整数、さらにより好ましくは１０〜２００の整数とすることができる。

本発明では、ポリカチオンブロックとしては、例えば、ＰＥＧ−ポリ（Ｎ’−［Ｎ−（２−アミノエチル）−２−アミノエチル］−アスパラギン酸）ブロック共重合体（ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ−ＤＥＴ））を用いることができる。ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ−ＤＥＴ）は、常法に従って調製することができる（Chem. Med. Chem. 1 (2006) 439−444参照）。

Ｐ（Ａｓｐ−ＤＥＴ）において、Ａｓｐ−ＤＥＴは、側鎖のカルボキシル基がジエチルトリアミン（ＤＥＴ）基（−ＮＨ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＮＨ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＮＨ₂）で置換されたアスパラギン酸である。Ｐ（Ａｓｐ−ＤＥＴ）の構造は以下の化学式で示される。

Ｐ（Ａｓｐ−ＤＥＴ）

｛式中、
Ｒ¹は、水酸基、保護基、疎水性基、または重合性基であり、
Ｒ⁴は、Ｈ、保護基、疎水性基、または重合性基であり、
Ｒ³は、−（ＮＨ−（ＣＨ₂）₂）₂−ＮＨ₂で表される基であり、
ｎは、０〜５０００のいずれかの整数であり、例えば、０〜５００のいずれかの整数であり、
ｍは、０〜５０００のいずれかの整数であり、例えば、０〜５００のいずれかの整数であり、
ｍ＋ｎは、２〜５０００のいずれかの整数であり、例えば、２〜５００のいずれかの整数であり、
ｎ−ｍは、０以上の整数であり、
式中の各繰り返し単位は記載の都合上特定の順で示しているが、各繰り返し単位は順不同に存在することができ、各繰り返し単位はランダムに存在してもよく、また、各繰り返し単位は同一であっても異なっていてもよい。｝
ポリカチオンブロックが、ポリエチレングリコールと共重合体を形成している場合には、Ｒ¹またはＲ⁴が結合を表し、ポリエチレングリコールは、該結合を介してポリカチオンブロックと共重合体を形成させることができる。なお、上記一般式（Ｉ）のポリマーでは、各繰り返し単位がペプチド結合により結合している。

本発明のある態様では、ＰＩＣｓｏｍｅは、ＰＩＣｓｏｍｅを形成後にカチオン性重合体とアニオン性重合体とを架橋してもよい。架橋は、当業者に周知の方法を用いて適宜行うことができる。例えば、本発明のＰＩＣｓｏｍｅは、ＰＥＧで修飾されていてもよいカチオン性重合体とＰＥＧで修飾されていてもよいアニオン性重合体を用いて形成し、その後、カチオン性重合体とアニオン性重合体とを架橋して得ることができる。本発明のある態様では、カチオン性重合体は、側鎖にＮＨ₂基を有するカチオン性アミノ酸を単量体単位として含み、ＰＥＧで修飾されていてもよい重合体と側鎖にＣＯＯＨ基を有するアニオン性アミノ酸を単量体単位として含み、ＰＥＧで修飾されていてもよい重合体とを水溶液中で混合してＰＩＣｓｏｍｅを形成させ、その後、架橋剤として１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩を用いてカチオン性重合体とアニオン性重合体とを架橋して得てもよい。架橋は、ＰＩＣｓｏｍｅに酵素を内包させた後に行うことができる。

従って、本発明のある態様では、ＰＩＣｓｏｍｅは、
ＣＯＯＨ基を側鎖に有するアミノ酸を単量体単位として含む重合体（Ａ）と、
ＮＨ₂基を側鎖に有するアミノ酸を単量体単位として含む重合体（Ｂ）と
のＰＩＣｓｏｍｅとしてもよい。この態様では、重合体（Ａ）と重合体（Ｂ）とを架橋するために、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を用いることができる。

ＰＩＣｓｏｍｅ中でのカチオン性重合体とアニオン性重合体との架橋率（％）は、例えば、フーリエ変換赤外分光法（ＦＴ−ＩＲ）により、ＰＥＧ−ＰＡｓｐのポリマー（未架橋）のスペクトルを参照とし、ＰＥＧに由来するピーク（１４６０ｃｍ^-1；Ｃ−Ｈ基の変角振動に由来）に対するカルボキシル基に由来するピーク（１６００ｃｍ^-1；ＣＯＯ^-基の伸縮振動に由来）の比を求めることにより算出することができる。架橋率は架橋剤の使用量を増加させることで高めることができる。

本発明によれば、ＰＩＣｓｏｍｅを構成するカチオン性重合体とアニオン性重合体とを架橋することを含む、ＰＩＣｓｏｍｅの膜に対する分子の透過性を低下させる方法またはＰＩＣｓｏｍｅ内部からの分子の放出速度を低下させる方法が提供される。本発明のある態様では、５ｋＤａ未満、４ｋＤａ以下、３ｋＤａ以下、２ｋＤａ以下、１ｋＤａ以下、７５０Ｄａ以下、５００Ｄａ以下、４００Ｄａ以下、３００Ｄａ以下または２００Ｄａ以下の分子に対する透過性は、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または実質的に保たれる。本発明のある態様では、透過性を低下させる分子または放出速度を低下させる分子は、５ｋＤａ以上、１０ｋＤａ以上、２０ｋＤａ以上、３０ｋＤａ以上、４０ｋＤａ以上、５０ｋＤａ以上、６０ｋＤａ以上、７０ｋＤａ以上、８０ｋＤａ以上、９０ｋＤａ以上、１００ｋＤａ以上、１１０ｋＤａ以上、１２０ｋＤａ以上、１３０ｋＤａ以上または１４０ｋＤａ以上の酵素を用いることができる。

本発明によれば、ＰＩＣｓｏｍｅを構成するカチオン性重合体とアニオン性重合体との架橋率（％）が高まるほど、ＰＩＣｓｏｍｅ内部からの分子の放出速度が低下して放出速度定数が低下する。例えば、架橋率（％）は、２５％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上または８０％以上とすることができる。架橋率は９０％以上であってもよい。このうち、架橋率が４０％を超えると放出速度定数が大きく低下する。従って、架橋率（％）は、大きいことが好ましく、好ましくは、５０％以上、６０％以上、７０％以上または８０％以上とすることができる。

本発明によれば、ＰＩＣｓｏｍｅを構成するカチオン性重合体とアニオン性重合体架橋率を高めることにより、内包される酵素のＰＩＣｓｏｍｅ外への放出量を低減することができ、１０ｍＭ リン酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）中において３７℃条件下で測定した場合に、内包した酵素の累積放出率（％）が前記水溶液と接触後７日目に６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下または５％以下である、ＰＩＣｓｏｍｅが提供される。本発明によれば、１０ｍＭ リン酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）において３７℃条件下で測定した場合に、数平均分子量２ｋＤａの直鎖状ポリエチレングリコールの放出速度定数ｋが５×１０^-3以下、４×１０^-3以下、３×１０^-3以下、２×１０^-3以下または１×１０^-3以下である、ＰＩＣｓｏｍｅが提供される。ある態様では、酵素として、５ｋＤａ以上、１０ｋＤａ以上、２０ｋＤａ以上、３０ｋＤａ以上、４０ｋＤａ以上、５０ｋＤａ以上、６０ｋＤａ以上、７０ｋＤａ以上、８０ｋＤａ以上、９０ｋＤａ以上、１００ｋＤａ以上、１１０ｋＤａ以上、１２０ｋＤａ以上、１３０ｋＤａ以上または１４０ｋＤａ以上の酵素を用いることができる。

本発明の別の側面によれば、Ｌ−ＡＳＰを内包させることに用いるための、ＰＩＣｓｏｍｅを含む組成物が提供される。この側面において、ある態様では、ＰＩＣｓｏｍｅは、本発明のＰＩＣｓｏｍｅとすることができる。この側面において、組成物は、Ｌ−ＡＳＰと混合することにより、Ｌ−ＡＳＰをＰＩＣｓｏｍｅの内部に内包させることができる。ＰＩＣｓｏｍｅ外のアスパラギンであってもＰＩＣｓｏｍｅの膜を透過して内部に到達できるので、本発明の組成物は、アスパラギンと接触させることにより、アスパラギンの加水分解に用いることができる。

本発明の別の側面によれば、α−ガラクトシダーゼを内包させることに用いるための、ＰＩＣｓｏｍｅを含む組成物が提供される。この側面において、ある態様では、ＰＩＣｓｏｍｅは、本発明のＰＩＣｓｏｍｅとすることができる。この側面において、本発明の組成物は、α−ガラクトシダーゼと混合することにより、α−ガラクトシダーゼをＰＩＣｓｏｍｅの内部に内包させることができる。ＰＩＣｓｏｍｅ外の基質（例えば、グロボトリアオシルセラミド）であってもＰＩＣｓｏｍｅの膜を透過して内部に到達できるので、本発明の組成物は、α−ガラクトシダーゼと接触させることにより、アスパラギンの加水分解に用いることができる。

本発明のある態様では、ウリカーゼを内包させることに用いるための、ＰＩＣｓｏｍｅを含む組成物が提供される。この側面において、ある態様では、ＰＩＣｓｏｍｅは、本発明のＰＩＣｓｏｍｅとすることができる。この側面において、本発明の組成物は、ウリカーゼと混合することにより、ウリカーゼをＰＩＣｓｏｍｅの内部に内包させることができる。ＰＩＣｓｏｍｅ外の基質（例えば、尿酸）であってもＰＩＣｓｏｍｅの膜を透過して内部に到達できるので、本発明の組成物は、ウリカーゼと接触させることにより、尿素の加水分解に用いることができる。

本発明のある態様では、α−グルコシダーゼを内包させることに用いるための、ＰＩＣｓｏｍｅを含む組成物が提供される。この側面において、ある態様では、ＰＩＣｓｏｍｅは、本発明のＰＩＣｓｏｍｅとすることができる。この側面において、本発明の組成物は、α−グルコシダーゼと混合することにより、α−グルコシダーゼをＰＩＣｓｏｍｅの内部に内包させることができる。ＰＩＣｓｏｍｅ外の基質（例えば、グリコーゲン）であってもＰＩＣｓｏｍｅの膜を透過して内部に到達できるので、本発明の組成物は、α−ガラクトシダーゼと接触させることにより、α−１，４−グルコシド結合の加水分解に用いることができる。

本発明の別の側面によれば、ＰＩＣｓｏｍｅに内包させることに用いるための、Ｌ−ＡＳＰを含む組成物が提供される。この側面において、ある態様では、ＰＩＣｓｏｍｅは、本発明のＰＩＣｓｏｍｅとすることができる。この側面において、組成物は、Ｌ−ＡＳＰと混合することにより、Ｌ−ＡＳＰをＰＩＣｓｏｍｅの内部に内包させることができる。ＰＩＣｓｏｍｅ外のアスパラギンであってもＰＩＣｓｏｍｅの膜を透過して内部に到達できるので、本発明の組成物は、アスパラギンと接触させることにより、アスパラギンの加水分解に用いることができる。

本発明のある態様では、ＰＩＣｓｏｍｅに内包させることに用いるための、α−ガラクトシダーゼを含む組成物が提供される。この側面において、ある態様では、ＰＩＣｓｏｍｅは、本発明のＰＩＣｓｏｍｅとすることができる。この側面において、組成物は、α−ガラクトシダーゼと混合することにより、α−ガラクトシダーゼをＰＩＣｓｏｍｅの内部に内包させることができる。ＰＩＣｓｏｍｅ外の基質であってもＰＩＣｓｏｍｅの膜を透過して内部に到達できるので、本発明の組成物は、α−ガラクトシダーゼと接触させることにより、基質の加水分解に用いることができる。

本発明のある態様では、ＰＩＣｓｏｍｅに内包させることに用いるための、ウリカーゼを含む組成物が提供される。この側面において、ある態様では、ＰＩＣｓｏｍｅは、本発明のＰＩＣｓｏｍｅとすることができる。この側面において、組成物は、ウリカーゼと混合することにより、ウリカーゼをＰＩＣｓｏｍｅの内部に内包させることができる。ＰＩＣｓｏｍｅ外の尿素であってもＰＩＣｓｏｍｅの膜を透過して内部に到達できるので、本発明の組成物は、ウリカーゼと接触させることにより、尿素の加水分解に用いることができる。

本発明のある態様では、ＰＩＣｓｏｍｅに内包させることに用いるための、α−グルコシダーゼを含む組成物が提供される。この側面において、ある態様では、ＰＩＣｓｏｍｅは、本発明のＰＩＣｓｏｍｅとすることができる。この側面において、組成物は、ウリカーゼと混合することにより、α−グルコシダーゼをＰＩＣｓｏｍｅの内部に内包させることができる。ＰＩＣｓｏｍｅ外の基質であってもＰＩＣｓｏｍｅの膜を透過して内部に到達できるので、本発明の組成物は、α−グルコシダーゼと接触させることにより、基質の加水分解に用いることができる。

本発明の別の側面によれば、ＰＥＧ化されていてもよいポリカチオンと、ポリアニオンと、Ｌ−ＡＳＰとの組合せが提供される。本発明の別の側面によれば、ポリカチオンと、ＰＥＧ化されていてもよいポリアニオンと、Ｌ−ＡＳＰとの組合せが提供される。本発明の組合せは、Ｌ−ＡＳＰを内包したＰＩＣｓｏｍｅを調製することに用いることができる。

本発明のある態様では、ＰＥＧ化されていてもよいポリカチオンと、ポリアニオンと、α−ガラクトシダーゼの組合せが提供される。本発明のある態様では、ＰＥＧ化されていてもよいポリカチオンと、ポリアニオンと、ウリカーゼの組合せが提供される。ＰＥＧ化されていてもよいポリカチオンと、ポリアニオンと、α−グルコシダーゼの組合せが提供される。
本発明のある態様では、ポリカチオンと、ＰＥＧ化されていてもよいポリアニオンと、α−ガラクトシダーゼとの組合せが提供される。本発明のある態様では、ポリカチオンと、ＰＥＧ化されていてもよいポリアニオンと、ウリカーゼとの組合せが提供される。本発明のある態様では、ポリカチオンと、ＰＥＧ化されていてもよいポリアニオンと、α−グルコシダーゼとの組合せが提供される。これらの組合せは、上記の通り、前記酵素を内包したＰＩＣｓｏｍｅを調製することに用いることができる。

本発明のさらなる別の側面によれば、酵素を内包した本発明のＰＩＣｓｏｍｅを、その酵素の投与を必要とする対象に投与することを含む、対象を処置する方法が提供される。対象は、特定の酵素を欠損した、またはその発現が低下したことにより、疾患に罹患した対象とすることができる。

酵素としては、Ｌ−ＡＳＰが挙げられ、疾患としては、アスパラギン要求性の腫瘍が挙げられる。従って、本発明によれば、アスパラギン要求性の腫瘍を処置する方法であって、その必要のある対象に、Ｌ−ＡＳＰ含む有効量のＰＩＣｓｏｍｅを投与することを含んでなる、方法が提供される。アスパラギン要求性腫瘍としては、急性白血病、例えば、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、特に小児急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、その他の急性白血病、および悪性リンパ腫、例えば、Ｔ細胞悪性リンパ腫、ホジキン氏病、細網肉腫およびリンパ肉腫が挙げられる。アスパラギン要求性の腫瘍は、正常細胞と比較して、アスパラギン産生酵素の発現が、正常細胞に対して８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、３％以下または１％以下の腫瘍とすることもできる。本発明のある態様では、対象を、Ｌ−ＡＰＳを用いた化学療法によりアレルギー症状（例えば、アナフィラキシー症状）を呈するに至った腫瘍患者を対象とすることができる。
あるいは、酵素としては、α−ガラクトシダーゼが挙げられ、疾患としては、α−ガラクトシダーゼの異常を原因とする疾患（例えば、ファブリー病）が挙げられる。従って、本発明によれば、α−ガラクトシダーゼの異常を原因とする疾患（例えば、ライソゾーム病（例えば、ファブリー病）などのα−ガラクトシダーゼの活性低下または欠損を原因とする疾患）を処置する方法であって、その必要のある対象に、α−ガラクトシダーゼを含む有効量のＰＩＣｓｏｍｅを投与することを含んでなる、方法が提供される。本発明のある態様では、対象を、α−ガラクトシダーゼを用いた化学療法によりアレルギー症状（例えば、アナフィラキシー症状）を呈するに至った腫瘍患者を対象とすることができる。
あるいは、酵素としては、ウリカーゼが挙げられ、疾患としては、高尿酸血症および高尿酸血症を原因とする疾患の処置に用いることができる。高尿酸血症を原因とする疾患としては、痛風（例えば、痛風結節および痛風関節炎）並びに尿酸塩沈着症および尿酸結石、間質性腎炎、腎不全、および動脈硬化症などの高尿酸血症を原因とする疾患が挙げられる。従って、本発明によれば、高尿酸血症および高尿酸血症を原因とする疾患を処置する方法であって、その必要のある対象に、ウリカーゼを含む有効量のＰＩＣｓｏｍｅを投与することを含んでなる、方法が提供される。本発明のある態様では、対象を、ウリカーゼを用いた化学療法によりアレルギー症状（例えば、アナフィラキシー症状）を呈するに至った腫瘍患者を対象とすることができる。
あるいは、酵素としては、α−グルコシダーゼが挙げられ、疾患としては、α−グルコシダーゼの異常を原因とする疾患（例えば、ポンベ病）が挙げられる。従って、本発明によれば、α−グルコシダーゼの異常を原因とする疾患（例えば、ライソゾーム病（例えば、ポンベ病）などのα−グルコシダーゼの活性低下または欠損を原因とする疾患）を処置する方法であって、その必要のある対象に、α−グルコシダーゼを含む有効量のＰＩＣｓｏｍｅを投与することを含んでなる、方法が提供される。本発明のある態様では、対象を、α−グルコシダーゼを用いた化学療法によりアレルギー症状（例えば、アナフィラキシー症状）を呈するに至った腫瘍患者を対象とすることができる。

本明細書では、「処置」とは、疾患または障害を治癒、予防若しくは寛解、または、疾患または障害の進行速度の低下をもたらすことを意味する。処置は、治療上有効な量の医薬組成物を投与することにより達成され得る。

実施例１：酵素を封入したＰＩＣｓｏｍｅの調製
本実施例では、酵素Ｌ−アスパラギナーゼ（以下、「Ｌ−ＡＳＰ」とも言う）を封入したＰＩＣｓｏｍｅを調製した。

１．ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ）の合成
まず、ポリエチレングリコール−ポリ（β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート）ブロック共重合体（ＰＥＧ−ＰＢＬＡ）をβ−ベンジル−Ｌ−アスパルテート−Ｎ−カルボン酸無水物（ＢＬＡ−ＮＣＡ）（中央化製品社に製造委託して得た）の重合により得た。具体的には、ＢＬＡ−ＮＣＡ １８．９ｇをＮ，Ｎ'−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）２０ｍＬに溶解する。メトキシ基の末端とアミノエチル基の末端を有するポリエチレングリコール（Ｍｅ−Ｏ−ＰＥＧ−ＮＨ₂）（分子量２，０００）２．０ｇをＤＭＦ ２０ｍＬに溶解し、その溶液をＢＬＡ−ＮＣＡ溶液に加える。混合溶液を３５℃に保ちながら４０時間重合した。赤外分光（ＩＲ）分析で重合反応が終了したことを確認した後、反応混合物をジエチルエーテル２Ｌに滴下して沈澱したポリマーを吸引濾過により回収し、ジエチルエーテルで洗浄した後に真空乾燥してＰＥＧ−ＰＢＬＡ １５．５１ｇ（収率７９％）を得た。
次に、ＰＥＧ−ＰＢＬＡからポリエチレングリコール−ポリアスパラギン酸ブロック共重合体（ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ．）を合成した。具体的には、ＰＥＧ−ＰＢＬＡ １．０ｇを０．５Ｎ水酸化ナトリウムに懸濁しながら室温でベンジルエステルを加水分解した。コポリマーが溶解した後、透析膜（分画分子量６，０００−８，０００）を用いて水中で透析した。膜内の溶液を凍結乾燥してＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ） ６５４ｍｇ（収率７８％）を得た。

２．ホモＰ（Ａｓｐ−ＡＰ）の合成
まず、ポリ（β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート）（ホモＰＢＬＡポリマー）をＢＬＡ−ＮＣＡの重合により得た。具体的には、β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート−Ｎ−カルボン酸無水物（ＢＬＡ−ＮＣＡ）２０ｇをＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）３３．３ｍＬ、ジクロロメタン３００ｍＬに溶解する。Ｎ−ブチルアミン８９．０μＬを上記ＢＬＡ−ＮＣＡ溶液に加える。混合溶液を３５℃に保ちながら４０時間重合した。赤外分光（ＩＲ）分析で重合反応が終了したことを確認したのち、反応混合物をヘキサン／酢酸エチル溶液（ヘキサン：酢酸エチル＝６：４）１Ｌに滴下して沈澱したポリマーを吸引濾過により回収し、ジエチルエーテルで洗浄した後に真空乾燥してホモＰＢＬＡポリマー １４．８２ｇ（７９％）を得た。
次に、得られたホモＰＢＬＡポリマーからポリ（（５−アミノペンチル）−アスパラギン酸）（ホモＰ（Ａｓｐ．−ＡＰ））を合成した。具体的には、ベンゼン凍結乾燥をしたホモＰＢＬＡ １ｇをＮ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）１０ｍＬに溶解する。ＤＡＰ １７．２ｍＬをＮＭＰ １７．２ｍＬに溶解し、ホモＰＢＬＡ溶液に加える。混合溶液を５℃に保ちながら４０分反応した。その後、反応液に２０重量％の酢酸水溶液１０ｍＬを添加し、透析膜（分画分子量６，０００−８，０００）を用いて水中で透析した。膜内の溶液を凍結乾燥してＰ（Ａｓｐ．−ＡＰ） ０．７６ｇ（８２％）を得た。

３．ＤｙＬｉｇｈｔ ４８８ラベル化Ｌ−ＡＳＰの調製
Ｌ−アスパラギナーゼ（Ｌ−ＡＳＰ；Sigma-Aldrich製、製品番号：A3809） １５ｍｇを１０ｍＭ リン酸緩衝液（ＰＢ、ｐＨ ７．４、０ｍＭ ＮａＣｌ）１０ｍＬに溶解した。ＤｙＬｉｇｈｔ ４８８−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Thermo scientific社製、製品番号：46402）２ｍｇを、１ｍＬのＤＭＳＯに溶解し、Ｌ−ＡＳＰ溶液に加え、２５℃で４時間反応させた。その後、分画分子量１０，０００の膜のついた限外濾過チューブを用いて、未反応のＤｙＬｉｇｈｔ ４８８−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル分子を除去した。

４．Ｃｙ５ラベル化Ｌ−ＡＳＰの調製
Ｌ−ＡＳＰ ７５ｍｇを１０ｍＭ リン酸緩衝液（ＰＢ、ｐＨ ７．４、０ｍＭ ＮａＣｌ）５０ｍＬに溶解した。Ｃｙ５−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル ｄｙｅ ｐａｃｋ（GE Healthcare社製、製品番号：PA25001）２０Ｖｉａｌを、５ｍＬのＤＭＳＯに溶解し、Ｌ−ＡＳＰ溶液に加え、２５℃で４時間反応させた。その後、分画分子量１０，０００の膜のついた限外濾過チューブを用いて、未反応のＣｙ５−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル分子を除去した。

５．Ｌ−ＡＳＰ内包ＰＩＣｓｏｍｅの調製
ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ．）２０ｍｇを１０ｍＭ リン酸緩衝液（ＰＢ、ｐＨ７．４、０ｍＭ ＮａＣｌ）２０ｍＬに溶解し、１ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ．）溶液を調製した。また、ホモＰ（Ａｓｐ．−ＡＰ）３０ｍｇも同様にＰＢ ５０ｍＬに溶解し、１ｍｇ／ｍＬのホモＰ（Ａｓｐ．−ＡＰ）溶液を調製した。次に、ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ．）溶液およびホモＰ（Ａｓｐ．−ＡＰ）溶液のそれぞれ４．０ｍＬおよび５．０ｍＬを５０ｍＬのコニカルチューブ中で混合し、ボルテックスにより２分間撹拌した（２０００ｒｐｍ）。（以下、この溶液を空のＰＩＣｓｏｍｅ溶液と呼ぶ。）
その後、Ｌ−ＡＳＰ ３２ｍｇを１０ｍＭ リン酸緩衝液（ＰＢ、ｐＨ ７．４、０ｍＭ ＮａＣｌ）５．７ｍＬに溶解し、５．６ｍｇ／ｍＬのＬ−ＡＳＰ溶液を調製した。または、ＤｙＬｉｇｈｔ ４８８ラベル化Ｌ−ＡＳＰもしくはＣｙ５ラベル化Ｌ−ＡＳＰの１０ｍＭ リン酸緩衝液（ＰＢ、ｐＨ ７．４、０ｍＭ ＮａＣｌ）溶液を限外濾過により濃縮し、５．６ｍｇ／ｍＬの蛍光ラベル化Ｌ−ＡＳＰ溶液を調製した。
５．６ｍｇ／ｍＬのＬ−ＡＳＰ溶液もしくは蛍光ラベル化Ｌ−ＡＳＰ溶液５．０ｍＬを、空のＰＩＣｓｏｍｅ溶液９．０ｍＬに混合し、ボルテックスにより２分間撹拌した（２０００ｒｐｍ）。その後、水溶性の縮合剤であるＥＤＣ（１０ｍｇ／ｍＬ）を含有するＰＢ溶液５．６ｍＬを加え、一晩静置してポリイオンコンプレクスを架橋した。その後、分画分子量３００，０００の膜のついた限外濾過チューブを用いて、ＰＩＣｓｏｍｅ形成に関与していないポリマー、ＰＩＣｓｏｍｅに封入されなかったＬ−ＡＳＰ、およびＥＤＣなどを除去した。

実施例２：ＰＩＣｓｏｍｅのキャラクタリゼーション
本実施例では、得られたＰＩＣｓｏｍｅのサイズ（Ｚ平均粒子径）および多分散指数（ＰＤＩ）は、ゼータサイザー（Ｍａｌｖｅｒｎ）で測定した。また、ＰＩＣｓｏｍｅの形状は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ、ＪＥＭ−１４００）を用いて、酢酸ウラニルで染色後に観察した。

１．得られたＬ−ＡＳＰ内包ＰＩＣｓｏｍｅのゼータサイザーによる評価
得られたＬ−ＡＳＰ封入ＰＩＣｓｏｍｅのサイズ（Ｚ平均粒子径）および多分散指数（ＰＤＩ）は、ゼータサイザー（Ｍａｌｖｅｒｎ）で測定した。サイズはブラウン運動により移動している粒子の拡散を測定し、その測定結果をストークス・アインシュタインの式を用いて粒子径と粒度分布に変換した。またミセルの形状は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ、ＪＥＭ−１４００）を用いて評価した。ここで、Ｚ平均粒子径とは、粒子分散 物等の動的光散乱法の測定データを、キュムラント解析法を用いて解析したデータである。キュムラント解析においては、粒子径の平均値と多分散指数（ＰＤＩ）が得られ、本発明においては、この平均粒子径をＺ平均粒子径と定義する。厳密には、測定で得られたＧ１相関関数の対数に、多項式をフィットさせる作業を、キュムラント解析といい、下式：
ＬＮ（Ｇ１）＝ａ＋ｂｔ＋ｃｔ²＋ｄｔ³＋ｅｔ⁴＋・・・
における定数ｂが、二次キュムラントまたは、Ｚ平均拡散係数と呼ばれる。Ｚ平均拡散係数の値を分散媒の粘度と幾つかの装置定数を用いて粒子径に換算した値がＺ平均粒子径であり、分散安定性の指標として品質管理目的に適した値である。

得られたＬ−ＡＳＰを内包するＰＩＣｓｏｍｅの粒径分布および透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）像はそれぞれ、図１Ａおよび図１Ｂに示される通りであった。図１Ａに示されるように、得られたＬ−ＡＳＰを内包するＰＩＣｓｏｍｅは、直径１００ｎｍ程度に最頻値を有する単分散の粒径分布を示し、図１Ｂに示されるように、ＴＥＭ像においても直径１００ｎｍ程度の粒径を有するＰＩＣｓｏｍｅが多く観察された。

２．Ｌ−ＡＳＰがＰＩＣｓｏｍｅ中に内包されていることの確認
次に、Ｌ−ＡＳＰがＰＩＣｓｏｍｅ内に内包されていることを確認するため、遊離のＬ−ＡＳＰ（すなわち、ＰＩＣｓｏｍｅに内包されていないものをいい、「遊離型Ｌ−ＡＳＰ」とも言う）と、ＰＩＣｓｏｍｅ内に内包されているＬ−ＡＳＰ（「内包型Ｌ−ＡＳＰ」とも言う）の溶液中での拡散速度を蛍光相関分光法（ＦＣＳ）により評価した。

蛍光相関分光法は、以下のように行った。共焦点レーザー走査顕微鏡（LSM 510 META/Confocal3, Carl Zeiss社）で４８８ｎｍのＡｒレーザーラインを搭載したものを用いた。サンプル溶液は８ウェルチャンバーに滴下し、水浸の対物レンズを介して励起光の照射および蛍光の検出を行った。蛍光強度のゆらぎを自己相関関数を用いて解析し、拡散時間、および一粒子当たりの蛍光強度を算出した。

結果は、図２に示される通りであった。図２の試料（ｉ）は、ＤｙＬｉｇｈｔ４８８で標識した遊離型Ｌ−ＡＳＰを示し、試料（ｉｉ）は、ＤｙＬｉｇｈｔ４８８で標識した内包型Ｌ−ＡＳＰを示す。図２に示されるように、内包型Ｌ−ＡＳＰは、遊離型Ｌ−ＡＳＰよりも大きな拡散時間および一粒子当たりの蛍光強度（count per molecule）を示し、確かにＬ−ＡＳＰがＰＩＣｓｏｍｅ内に内包されていることが確認された（図２ＡおよびＢ）。また、一粒子当たりの蛍光強度の比較から、１つのＰＩＣｓｏｍｅ内にはＬ−ＡＳＰが２分子封入されていると見積もられた（図２Ｂ）。

次に、遊離型Ｌ−ＡＳＰと内包型Ｌ−ＡＳＰについてそれぞれ、酵素活性を評価した。Ｌ−ＡＳＰの酵素活性により分解されて７−アミノ−４−メチルクマリン（「ＡＭＣ」とも言う）を生じ、蛍光（Ex/Em=350 nm/450 nm）を発する基質Ｌ−アスパラギン酸β−（７−アミド−４−メチルクマリン）（「Ａｓｐ−ＡＭＣ」とも言う）との反応に関する、ミカエリス・メンテンプロットおよびラインウィーバー・バークプロットを作成した。具体的には、まず、Ａｓｐ−ＡＭＣ、遊離型Ｌ−ＡＳＰ、および内包型Ｌ−ＡＳＰの各溶液（ＰＢＳ中）を恒温槽に静置して３７℃とした。その後、Ａｓｐ−ＡＭＣの溶液を遊離型Ｌ−ＡＳＰもしくは内包型Ｌ−ＡＳＰの各溶液と混合し、速やかに所定量を９６ウェルプレート（テカン）に注いだ。プレートを予め３７℃に保温しておいたマルチプレートリーダーの内部に入れ、蛍光強度を一定時間経時的に測定した。この際、予め調製したＡＭＣの標準溶液を用いて作製した検量線を用い、蛍光強度の変化を生成物の生成速度に変換することで反応速度Ｖを求めた。基質濃度［Ｓ］を様々に変え、横軸に［Ｓ］を、縦軸にＶを取り、プロットの結果に次式を当てはめることでミカエリス・メンテン係数（Ｋ_m）を算出した。

遊離型Ｌ−ＡＳＰにおけるミカエリス・メンテンプロット（図３Ａ）およびラインウィーバー・バークプロット（図３Ｂ）と、内包型Ｌ−ＡＳＰにおけるミカエリス・メンテンプロット（図４Ａ）およびラインウィーバー・バークプロット（図４Ｂ）とを比較すると、酵素活性に大きな相違は見られなかった。また、ミカエリス・メンテン係数（Ｋｍ）をそれぞれ計算したところ、遊離型Ｌ−ＡＳＰのＫｍ値は１８６μＭであったのに対して内包型Ｌ−ＡＳＰのＫｍ値は１９４μＭであり、内包型Ｌ−ＡＳＰは遊離型Ｌ−ＡＳＰとほぼ同じ酵素活性を有していることが明らかとなった。

３．ＰＩＣｓｏｍｅ中に内包されたＬ−ＡＳＰの血中滞留性
さらに、マウスを用いて遊離型Ｌ−ＡＳＰと内包型Ｌ−ＡＳＰの血中滞留性を評価した。Ｃｙ５標識した遊離型Ｌ−ＡＳＰ ８ＵとＣｙ５標識した内包型Ｌ−ＡＳＰ ２５０μｇ（ＰＩＣｓｏｍｅを構成するポリマーの見積もり重量）をマウス（Balb/c、５週齢、ｎ＝５）に尾静脈投与し、投与から０時間後、３時間後および２４時間後にマウスを犠牲にして血液を採取した。血液は遠心分離して上澄みの蛍光強度（Ex/Em=650nm/670nm）を回収し、上澄みをマルチプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ、Ｍ１０００ＰＲＯ）を用いて測定した。結果は図５に示される通りであった。

図５では、投与直後の蛍光強度を１００％として、各時点での蛍光強度を相対的に示した。図５に示されるように、内包型Ｌ−ＡＳＰの血中滞留性は、遊離型Ｌ−ＡＳＰの血中滞留性と比較して格段に高かった。

４．生理的条件下での酵素活性の経時的変化
１０％ＦＢＳを含む水溶液中に遊離型Ｌ−ＡＳＰおよび内包型Ｌ−ＡＳＰをそれぞれ４．８μｇ／ｍＬまたは２ｍｇ／ｍＬ（ＰＩＣｓｏｍｅを構成するポリマーの見積もり濃度）の濃度で溶解させ、３７℃で０時間、３時間、６時間、１２時間または２４時間静置して、その後、１０００μＭのＬ−アスパラギン酸 β−７−アミド−４−メチルクマリン（Ａｓｐ−ＡＭＣ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａ１０５７）を基質として用いて各時点での酵素の反応速度を求めた。静置時間が０時間のサンプルの反応速度を１として、各時点での反応速度を標準化し、相対的反応速度を求めた。結果は、図６に示される通りであった。

図６に示されるように、インビトロでは、遊離型Ｌ−ＡＳＰおよび内包型Ｌ−ＡＳＰのいずれも長時間にわたって生理的条件下で酵素活性を維持することができた。

５．血中におけるＰＩＣｓｏｍｅに内包されたＬ−ＡＳＰの酵素活性
マウス（Balb/c、５週齢、ｎ＝３）に遊離型Ｌ−ＡＳＰまたは内包型Ｌ−ＡＳＰそれぞれ１００Ｕ／ｋｇを尾静脈投与し、２４時間後の血中アンモニア窒素濃度（ＮＨ₃−Ｎ）を測定した。投与２４時間後に、マウスを犠牲にして血液を採取した。採取した血液を遠心分離して得られた上澄み（血漿）を回収し、上澄み中のアンモニア窒素濃度を生化学自動分析装置（Drichem）を用いて測定し、予め作成した検量線を用いて値を較正した。結果は、図７に示される通りであった。なお、Ｌ−ＡＳＰは、Ｌ−アスパラギンを分解してＬ−アスパラギン酸とアンモニアを発生することが知られている。

図７に示されるように、血漿中のアンモニア窒素の濃度は、内包型Ｌ−ＡＳＰを投与した群で、遊離型Ｌ−ＡＳＰを投与した群よりも圧倒的に高かった（図７Ａ）。また、投与前後のアンモニア窒素濃度から血漿中のアンモニア窒素の増加量を計算したところ、図７Ｂに示されるように、遊離Ｌ−ＡＳＰを投与した群では血漿アンモニア窒素濃度はほとんど上昇していなかったのに対して、内包型Ｌ−ＡＳＰを投与した群では血漿アンモニア窒素濃度は飛躍的に上昇していた。このように、内包型Ｌ−ＡＳＰは、投与することにより血漿成分と反応し、その酵素活性により該血漿成分を変換してアンモニア窒素を効率よく生成できた。

実施例３：ＰＩＣｓｏｍｅの化学修飾の酵素反応への影響
架橋剤であるＥＤＣの濃度を変える以外は実施例１に記載された通りにＬ−ＡＳＰ内包ＰＩＣｓｏｍｅを調製し、架橋率とＰＩＣｓｏｍｅの性質との関係を調べた。

実施例１のＥＤＣ濃度を１等量とし、その０．５倍、３倍、５倍または１０倍のＥＤＣにより処理して得たＰＩＣｓｏｍｅのＦＴ−ＩＲスペクトルを図８Ａに示し、ＥＤＣ等量と架橋割合の関係を図８Ｂに示す。架橋割合は、ＦＴ−ＩＲにより算出した。図８Ｂでは、ＰＥＧ−ポリＡｓｐ共重合体中に存在するＣＯＯ^-基のうち、架橋されたものの割合（％）を架橋率として示す。

図８に示されるように、架橋に用いるＥＤＣの量を変えることにより、ＰＩＣｓｏｍｅの構成分子間の架橋率の制御が可能であることが明らかとなった。０．５等量では、ＣＯＯ^-基のうち、３０．２％が架橋され、１等量では４４．５％が架橋され、３等量では６０．５％が架橋され、５等量では７７．１％が架橋され、１０等量では８９．１％が架橋された。

架橋に用いるＥＤＣの量と粒径との関係、ＥＤＣ量と多分散度（ＰＤＩ）との関係、ＥＤＣ量とＰＩＣｓｏｍｅ形状との関係を図９に示す。これらの粒径、多分散度、形状（ＴＥＭ像）の取得は、ＥＤＣ量を変えた以外は、実施例１および２と同様に行った。

その結果、図９Ａに示されるように、いずれのＥＤＣ量においても、粒径（図９Ａ）、多分散度（図９Ｂ）およびＰＩＣｓｏｍｅ形状（図９Ｃ）において、有意な相違は認められなかった。また、いずれのＥＤＣ量においても、粒径１００ｎｍを最頻値とし、単分散を示す粒径分布が得られた。

実施例４：内包させる物質の分子量と得られるＰＩＣｓｏｍｅの形状
数平均分子量６０００〜４２０００までの様々な大きさのＰＥＧをＰＩＣｓｏｍｅに内包させて、得られたＰＩＣｓｏｍｅの形状を確認した。

ＰＥＧは、フルオレセインで標識し、０．５ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、または１０ｍｇ／ｍＬの濃度で、実施例１に記載の方法でＰＩＣｓｏｍｅに内包させた。ＰＥＧとしては、数平均分子量６ｋのＰＥＧ６（日油株式会社、ＭＥＰＡ−５０Ｈ）、１２ｋのＰＥＧ１２（日油株式会社、ＭＥＰＡ−１２Ｔ）、２０ｋのＰＥＧ２０（日油株式会社、ＭＥＰＡ−２０Ｔ）、４２ｋのＰＥＧ４２（日油株式会社、ＭＥＰＡ−４０Ｔ）を用いた。

その結果、図１０に示されるように、添加濃度が５ｍｇ／ｍＬ以下の場合には、粒径は概ね１００ｎｍであり、単分散な粒径分布を有するＰＩＣｓｏｍｅが形成された。

実施例５：架橋ＰＩＣｓｏｍｅの物質透過性
本実施例では、フルオレセイン標識ＰＥＧ１２を４ｍｇ／ｍＬの濃度で用いて様々なＥＤＣ量で架橋する以外は実施例１に記載された通りにＰＥＧ１２内包ＰＩＣｓｏｍｅを調製し、ＰＩＣｓｏｍｅからのＰＥＧ１２の放出量を調べた。

実施例３からＥＤＣ等量を調整して架橋率を調整して得られたＰＥＧ１２内包ＰＩＣｓｏｍｅからのＰＥＧ１２の累積放出量をサイズ除外クロマトグラフィーおよび蛍光強度の分析により求めた。サイズ除外クロマトグラフィーは、ゲルろ過クロマトグラフィーカラム：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００−１０／３００ＧＬ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、および高速液体クロマトグラフ：日本分光株式会社、ＬＣ−２０００ｐｌｕｓを用いて行った。蛍光強度は、常法によりフルオレセインの蛍光強度により保持時間の早い分画（ＰＩＣｓｏｍｅに内包されたＰＥＧ）と遅い分画（放出されたＰＥＧ）とで比較して、累積放出量を求めた。溶液条件は、１０ｍＭ リン酸緩衝溶液（ｐＨ７．４、３７℃）とした。結果は、図１１Ａに示される通りであった。

図１１Ａに示される通り、架橋率に依存してＰＥＧ１２のＰＩＣｓｏｍｅからの放出量は変化した。具体的には、架橋率が高いほど、ＰＥＧ１２はＰＩＣｓｏｍｅ内に多く保持された。放出速度定数から算出したところ、結果は図１１Ｂに示される通りであった。なお、放出速度定数ｋは、得られた累積放出率の結果を、一次放出モデルから得られる次式に当てはめることにより算出した。

図１１Ｂに示される通り、架橋割合が高まるほど、放出速度定数が小さくなることが明らかとなった。また、架橋割合４５〜６０％を境にして、放出速度定数が大きく変動する様子が見られる（図１１Ｂ）。

次に、放出速度定数の分子量依存性について調べた。架橋率４０％以下の低架橋率（ＬＣ）のＰＩＣｓｏｍｅと、架橋率８０％以上の高架橋率（ＨＣ）のＰＩＣｓｏｍｅとで、ＰＥＧ６、ＰＥＧ２０およびＰＥＧ４２の放出速度を調べた。ＰＥＧはいずれもフルオレセインで標識し、放出速度定数は、上記の通りに求めた。結果は、図１２に示される通りであった。

図１２に示されるように、ＰＥＧ６では、１日以内にＰＩＣｓｏｍｅからのＰＥＧの大量の放出が観察されたが、ＰＥＧ２０およびＰＥＧ４２では、０〜７日にわたって一定した速度でゆっくりとＰＥＧがＰＩＣｓｏｍｅから放出された。また、架橋率が高い方がＰＥＧのＰＩＣｓｏｍｅからの放出が抑制された。このことから、小さい分子はＰＩＣｓｏｍｅを透過しやすく、大きい分子はＰＩＣｓｏｍｅを透過しにくいことが明らかとなった。また、分子量６０００以下では透過性が比較的高く、分子量２００００以上では透過性が比較的低いことが明らかとなった。

実施例６：分子構造とＰＩＣｓｏｍｅの透過性との関係
本実施例では、直鎖状ＰＥＧと分岐型ＰＥＧとでＰＩＣｓｏｍｅの透過性が相違するか否かを調べた。

直鎖状ＰＥＧとしては、フルオレセインで標識したＰＥＧ１２を４ｍｇ／ｍＬ（ＰＩＣｓｏｍｅ溶液との混合時の濃度）で用い、分岐型ＰＥＧとしては、４分岐のＰＥＧ（日油株式会社、ＰＴＥ−１００ＰＡ、数平均分子量１０ｋ）を４ｍｇ／ｍＬ（ＰＩＣｓｏｍｅ溶液との混合時の濃度）で用いた以外は、実施例１と同様にＰＩＣｓｏｍｅを得た。

実施例５と同様にＰＩＣｓｏｍｅからのＰＥＧの累積放出率を測定した。結果は図１３に示される通りであった。

図１３に示されるように、分岐型のＰＥＧは、線型のＰＥＧよりもＰＩＣｓｏｍｅの膜透過性が低いことが分かった。

実施例７：放出速度定数の温度依存性
実施例５および６では、ＰＩＣｓｏｍｅからの内包物の放出を３７℃条件下で調べた。本実施例では、放出速度定数の温度依存性を明らかにした。

実施例５と同様にフルオレセイン標識ＰＥＧ６、ＰＥＧ２０およびＰＥＧ４２をＰＩＣｓｏｍｅに内包させ、様々な温度条件下で放出速度定数を計算した。結果は図１４および１５に示される通りであった。

図１４および１５に示されるように、放出速度定数の温度依存性は４０％未満の低架橋率のＰＩＣｓｏｍｅにおいて顕著であった。なお、図１５では、丸は４℃、三角は２５℃、四角は３７℃、ひし形は５０℃での放出速度定数を示し、白抜きの印は低架橋率、黒塗りは高架橋率のＰＩＣｓｏｍｅにおける放出速度定数であることを示す。

｛式中、左辺は時刻ｔにおける累積放出量（％）を示し、Ｄは内包された物質のＰＩＣｓｏｍｅ膜中での拡散係数を示し、ｌはＰＩＣｓｏｍｅの膜の厚み（〜１５ｎｍ）を示す。｝

上記式により、時刻ｔにおける累積放出量と時刻ｔとの関係を対数プロットすると、図１６に示さるグラフが得られる。ここで、グラフ中の直線の傾きがＤに比例する。図１６中の記号の定義は、図１５と同じである。

図１６に示されるように、低架橋率ＰＩＣｓｏｍｅの膜中でより高い拡散係数を示すことが分かった。

これらの実施例から、分子量が１万を超える非線型タンパク質は、ＰＩＣｓｏｍｅ内に効果的に保持でき得ること、数千以下、好ましくは１０００以下の分子量が小さい分子は、ＰＩＣｓｏｍｅを効率よく通過することが示唆された。

また、このようなＰＩＣｓｏｍｅの性質により、分子量の小さな分子を基質とする分子量の大きな酵素をＰＩＣｓｏｍｅに内包させて血中滞留性を劇的に向上させれば、ＰＩＣｓｏｍｅは、内包した酵素を血中で安定に保持しながら、血液中の基質と反応し続けることが可能となることが明らかとなった。

Ｌ−ＡＳＰは、アスパラギン要求性腫瘍細胞に対して増殖抑制効果を有することで知られ、臨床では小児急性リンパ性白血病治療薬として用いられる。本実施例から、本発明のＬ−ＡＳＰ内包ＰＩＣｓｏｍｅは、小児急性リンパ性白血病治療薬として高い効果を奏することが示される。

実施例８Ａ：他の酵素の封入と安定性評価
本実施例では、α−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼおよびウリカーゼについて血中安定性を調べた。

１．α−ＧＡＬ内包ＰＩＣｓｏｍｅ溶液の調製
実施例１の項目５と同様に、空のＰＩＣｓｏｍｅ溶液を得て、その後、α−ガラクトシダーゼ（以下、「α−ＧＡＬ」ともいう）１１．４ｍｇを１０ｍＭ リン酸緩衝液（ＰＢ、ｐＨ ７．４、０ｍＭ ＮａＣｌ）５．７ｍＬに溶解し、２ｍｇ／ｍＬのα−ＧＡＬ溶液を調製した。
２ｍｇ／ｍＬのα−ＧＡＬ溶液１ｍＬを、空のＰＩＣｓｏｍｅ溶液１ｍＬに混合し、ボルテックスにより２分間撹拌した（２０００ｒｐｍ）。その後、水溶性の縮合剤であるＥＤＣ（１０ｍｇ／ｍＬ）を含有するＰＢ溶液５．６ｍＬを加え、一晩静置してポリイオンコンプレクスを架橋した。その後、分画分子量３００，０００の膜のついた限外濾過チューブを用いて、ＰＩＣｓｏｍｅ形成に関与していないポリマー、ＰＩＣｓｏｍｅに封入されなかったα−ＧＡＬおよびＥＤＣなどを除去した。蛍光ラベル化α−ＧＡＬ溶液も同様に調製した。

α−グルコシダーゼおよびウリカーゼ内包ＰＩＣｓｏｍｅも同様に作製した。
上記と同様に、空のＰＩＣｓｏｍｅ溶液を得て、その後、α−グルコシダーゼおよびウリカーゼそれぞれ６．２ｍｇおよび１０．４ｍｇを１０ｍＭ リン酸緩衝液（ＰＢ、ｐＨ ７．４、０ｍＭ ＮａＣｌ）３．１ｍＬおよび５．２ｍＬに溶解し、２ｍｇ／ｍＬのα−グルコシダーゼ溶液および２ｍｇ／ｍＬのウリカーゼ溶液を調製した。
２ｍｇ／ｍＬのα−グルコシダーゼ溶液および２ｍｇ／ｍＬのウリカーゼ溶液をそれぞれ、空のＰＩＣｓｏｍｅ溶液１ｍＬに混合し、ボルテックスにより２分間撹拌した（２０００ｒｐｍ）。その後、水溶性の縮合剤であるＥＤＣ（１０ｍｇ／ｍＬ）を含有するＰＢ溶液５．６ｍＬを加え、一晩静置してポリイオンコンプレクスを架橋した。その後、分画分子量３００，０００の膜のついた限外濾過チューブを用いて、ＰＩＣｓｏｍｅ形成に関与していないポリマー、ＰＩＣｓｏｍｅに封入されなかったα−グルコシダーゼおよびウリカーゼ並びにＥＤＣなどを除去した。蛍光ラベル化α−グルコシダーゼおよびウリカーゼ溶液も同様に調製した。

２．α−ＧＡＬ内包ＰＩＣｓｏｍｅのゼータサイザーによる評価
実施例２の項目１に記載されたように、得られたα−ＧＡＬ内包ＰＩＣｓｏｍｅのサイズ（Ｚ平均粒子径）および多分散指数（ＰＤＩ）は、ゼータサイザー（Ｍａｌｖｅｒｎ）で測定した。サイズはブラウン運動により移動している粒子の拡散を測定し、その測定結果をストークス・アインシュタインの式を用いて粒子径と粒度分布に変換した。結果は、図１７Ａに示される通りであった。図１７Ａに示されるように、Ｌ−ＡＳＰ内包ＰＩＣｓｏｍｅと同様に単分散でサイズの均質なＰＩＣｓｏｍｅが得られた。

３．α−ＧＡＬがＰＩＣｓｏｍｅ中に内包されていることの確認
実施例２の項目２に記載されたように、α−ＧＡＬがＰＩＣｓｏｍｅ中に内包されていることを確認するため、遊離型α−ＧＡＬと内包型α−ＧＡＬの溶液を対象として、分子の拡散速度を蛍光相関分光法（ＦＣＳ）により評価した。結果は、図１７Ｂに示される砦あった。図１７Ｂに示されるように、内包型α−ＧＡＬは、遊離型α−ＧＡＬよりも大きな拡散時間および１粒子あたりの蛍光強度を示し、確かにα−ＧＡＬがＰＩＣｓｏｍｅ中に内包されていることが確認された。また、表１に示されるように、一粒子当たりの蛍光強度の比較から、１つのＰＩＣｓｏｍｅ内にはα−ＧＡＬが３分子封入されていると見積もられた。

さらに、α−グルコシダーゼおよびウリカーゼについても、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）により、ＰＩＣｓｏｍｅ中に内包されていることが確認された（図１８）。

４．ＰＩＣｓｏｍｅ中に内包されたα−ＧＡＬの血中滞留性
実施例２の項目３に記載されたように、遊離型α−ＧＡＬと内包型α−ＧＡＬの血中滞留性を評価した。マウス（Balb/c、６週齢、ｎ＝３）にＣｙ５−α−ＧＡＬを内包したＰＩＣｓｏｍｅを尾静脈投与し、１２時間後に採血して、上澄みの蛍光強度（Ex/Em=650nm/670nm）を測定した。結果は、図１９Ａに示される通りであった。図１９Ａに示されるように、内包型α−ＧＡＬの血中滞留性は、遊離型α−ＧＡＬの血中滞留性と比較して格段に高かった。

５．生理的条件下での酵素活性の維持
次に、遊離型α−ＧＡＬと内包型α−ＧＡＬについてそれぞれ、酵素活性を評価した。α−ＧＡＬの酵素活性は、図１９Ｂに示されるように、基質α−ガラクトシル−β−（７−アミド−４−メチルクマリン）（「Ｇａｌ−ＡＭＣ」とも言う）との反応により確認した。Ｇａｌ−ＡＭＣは、α−ＧＡＬの酵素活性により分解されて７−アミノ−４−メチルクマリン（「ＡＭＣ」ともいう）を生じ、蛍光（Ｅｘ／Ｅｍ＝３５０ ｎｍ／４５０ ｎｍ）を発する。
具体的には、まず、Ｇａｌ−ＡＭＣ、遊離型α−ＧＡＬ、および内包型α−ＧＡＬの各溶液（ＰＢＳ中）を恒温槽に静置して３７℃とした。その後、Ｇａｌ−ＡＭＣの溶液を遊離型α−ＧＡＬもしくは内包型α−ＧＡＬの各溶液と混合し、速やかに所定量を９６ウェルプレート（テカン）に注いだ。プレートを予め３７℃に保温しておいたマルチプレートリーダーの内部に入れ、蛍光強度を一定時間経時的に測定した。
酵素活性は、ミカエリス・メンテンプロットおよびラインウィーバー・バークプロットを作成して評価した。この際、予め調製したＡＭＣの標準溶液を用いて作製した検量線を用い、蛍光強度の変化を生成物の生成速度に変換することで反応速度Ｖを求めた。基質濃度［Ｓ］を様々に変え、横軸に［Ｓ］を、縦軸にＶを取り、プロットの結果に次式を当てはめることでミカエリス・メンテン係数（Ｋ_ｍ）を算出した。結果は、表２に示される通りであった。

表２に示されるように、ＰＩＣｓｏｍｅ中に内包されたα−ＧＡＬは、生体内で安定であり、遊離型α−ＧＡＬと同等の酵素活性を維持していた。

Claims (20)

1. 酵素を内包したポリイオンコンプレックス型ポリマーソームであって、
   酵素は、ポリイオンコンプレックス型ポリマーソームの膜を透過する物質を基質とする酵素である、ポリイオンコンプレックス型ポリマーソーム。
2. 酵素の分子量が、５ｋＤａ以上である、請求項１に記載のポリイオンコンプレックス型ポリマーソーム。
3. 酵素の基質の分子量が、１ｋＤａ以下である、請求項１または２に記載のポリイオンコンプレックス型ポリマーソーム。
4. 酵素が、球状タンパク質である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリイオンコンプレックス型ポリマーソーム。
5. 酵素が、Ｌ−アスパラギナーゼ、ウリカーゼ、α−ガラクトシダーゼおよびα−グルコシダーゼから選択される酵素である、請求項１に記載のポリイオンコンプレックス型ポリマーソーム。
6. ポリイオンコンプレックス型ポリマーソームが、
   ＣＯＯＨ基を側鎖に有するアミノ酸を単量体単位として含む重合体（Ａ）と、
   ＮＨ₂基を側鎖に有するアミノ酸を単量体単位として含む重合体（Ｂ）と
   のポリイオンコンプレックス型ポリマーソームである、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリイオンコンプレックス型ポリマーソーム。
7. 重合体（Ａ）に存在するＣＯＯＨ基の５０％以上が重合体（Ｂ）のＮＨ₂基と架橋され
   ている、請求項６に記載のポリイオンコンプレックス型ポリマーソーム。
8. １０ｍＭ リン酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）中において３７℃条件下で測定した場合に、内包した酵素の累積放出率（％）が前記水溶液と接触後７日目に２０％以下である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリイオンコンプレックス型ポリマーソーム。
9. １０ｍＭ リン酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）中において３７℃条件下で測定した場合に、数平均分子量２ｋＤａの直鎖状ポリエチレングリコールの放出速度定数ｋが５×１０^-3以下である、請求項７に記載のポリイオンコンプレックス型ポリマーソーム。
10. 請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリイオンコンプレックス型ポリマーソームであって、内包される酵素が、血漿成分を基質とする、ポリイオンコンプレックス型ポリマーソーム。
11. 請求項１０のポリイオンコンプレックス型ポリマーソームを含んでなる、医薬組成物。
12. 医薬組成物が、酵素欠損または異常を起因とする疾患に罹患している患者に投与するための医薬組成物であり、酵素が、該対象において欠損した、または異常を有する酵素である、請求項１１に記載の医薬組成物。
13. 酵素が、Ｌ−アスパラギナーゼ、ウリカーゼ、α−ガラクトシダーゼ、およびα−グルコシダーゼから選択される酵素である、請求項１１または１２に記載の医薬組成物。
14. 酵素が、新生物または微生物の生育に必要な栄養素を分解する酵素である、請求項１１に記載の医薬組成物。
15. アスパラギン要求性腫瘍を処置するための、請求項１３に記載の医薬組成物。
16. アスパラギン要求性腫瘍が、アスパラギン産生酵素の発現量が、正常細胞における該酵素の発現量に対して８０％以下である腫瘍である、１５に記載の医薬組成物。
17. アスパラギン要求性腫瘍が、急性リンパ性白血病、Ｔ細胞悪性リンパ腫、ＮＫ細胞性白血病および急性骨髄性白血病からなる群から選択される、請求項１５または１６に記載の医薬組成物。
18. 酵素が、α−ガラクトシダーゼであり、α−ガラクトシダーゼの異常を原因とする疾患を処置することに用いるための、請求項１１または１２に記載の医薬組成物。
19. 酵素が、ウリカーゼであり、高尿酸血症または高尿酸血症を原因とする疾患を処置することに用いるための、請求項１１または１２に記載の医薬組成物。
20. 酵素が、α−グルコシダーゼであり、α−グルコシダーゼの異常を原因とする疾患を処置することに用いるための、請求項１１または１２に記載の医薬組成物。

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