WO2016159334A1 - 多孔質セルロース媒体の製造方法 - Google Patents

多孔質セルロース媒体の製造方法 Download PDF

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WO2016159334A1
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徹 柴田
康人 森下
啓二 西原
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株式会社ダイセル
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    • C08J2301/00—Characterised by the use of cellulose, modified cellulose or cellulose derivatives
    • C08J2301/02—Cellulose; Modified cellulose

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a porous cellulose medium.
  • Polysaccharides such as cellulose and their derivatives are used for various purposes. These microporous bodies themselves can serve as adsorbents, and can be given adsorption or separation functions by performing some chemical modification on the surface.
  • chromatography a separating agent is used in which some atomic group (often called a selector) that interacts with a target substance or impurities to be removed is bound to a solid called a matrix.
  • polysaccharides are used as a matrix for that purpose.
  • polysaccharides have many hydroxyl groups in the molecule, it is possible to easily bind selectors via ether bonds or ester bonds using this as a scaffold, which is also a major factor in the heavy use of polysaccharides. .
  • a target molecule and a selector having some affinity are bound to a matrix, and the target molecule is adsorbed by some method after adsorbing the target molecule.
  • a method of releasing and recovering is used.
  • the matrix can freely enter and exit the target molecule. It is required to have a porous structure. In other words, when the matrix is packed in a column and subjected to size exclusion chromatography, it is necessary to exhibit an exclusion limit larger than the combined size of the molecule to be purified and the ligand.
  • Such a matrix is often used by being packed in a tube called a column as particles.
  • a new form attracting attention in recent years is an integral porous body called a monolith. This can be used for the same purpose by being stored in a capillary such as a capillary or a container such as a column.
  • a relatively thin monolithic monolith can be used as a filtration membrane.
  • the physical strength of the matrix can be cited as a factor for ease of use of such a matrix. That is, a matrix having a low elastic modulus is subjected to compressive deformation or fracture when a liquid or gas is flowed in chromatography or filtration, resulting in non-uniform flow of the liquid in the chromatography column and further clogging. This significantly reduces the separation efficiency of the column. In this respect, high physical strength is an important characteristic, and in this respect, cellulose is an excellent material among polysaccharides.
  • cellulose has an alcoholic hydroxyl group on its surface as a general feature of polysaccharides, it is possible to combine various atomic groups by chemical reaction, and a large amount of high-purity materials are compared. There are advantages such as being available at a reasonable price.
  • porous cellulose particles have been developed mainly for the separation and purification of biopolymers.
  • a method for producing this there are many methods in which cellulose is dissolved by some method and then regenerated, but there are several methods using organic acid esters as starting materials. This is because it is difficult to directly dissolve cellulose itself, which requires a special solvent or the viscosity of the solution is very high, whereas the organic acid ester can be dissolved in many solvents, Cellulose organic acid ester can be supplied industrially with stable quality, with various bond ratios with various organic acids, and degree of polymerization, and it can easily break down ester bonds and regenerate cellulose Etc. are utilized.
  • Patent Document 1 discloses that a solution in which a cellulose organic acid ester is dissolved in an organic solvent such as a halogenated hydrocarbon is dispersed in an aqueous medium to form a fine solution of the ester solution. It is described that droplets are formed and a hydrolysis accelerator such as an ammonium salt is added thereto to hydrolyze the ester to form cellulose microparticles.
  • a hydrolysis accelerator such as an ammonium salt is added thereto to hydrolyze the ester to form cellulose microparticles.
  • Patent Document 2 cellulose fatty acid ester and cellulose fatty acid ester gelling agent are dissolved in an organic solvent to form a solution, and the solution is stirred and added to an aqueous medium to form droplets, further promoting coagulation.
  • a method for producing porous spherical particles by adding an agent to make cellulose fatty acid ester in droplets into gel particles and removing the gelling agent, coagulation accelerator and solvent from the generated particles is described.
  • Patent Document 3 cellulose is dissolved in a mixed solution of paraformaldehyde and dimethyl sulfoxide, and the dissolved solution is dispersed in a dispersion medium, and then a silicon compound is added as a coagulant to gel dispersed droplets of cellulose.
  • a method for producing a solid cellulose gel by solidification and solidification is described.
  • Non-Patent Document 1 discloses that cellulose acetate is dissolved in a water-soluble organic solvent (mixed solvent of acetone and DMSO) and dispersed in water so that the solution containing cellulose acetate comes into contact with water and solidifies. And forming porous particles.
  • a water-soluble organic solvent mixed solvent of acetone and DMSO
  • Non-Patent Document 2 describes that cellulose diacetate is dissolved in DMSO, then anhydrous sodium sulfate is added and stirred, and the mixture is put into an acid aggregation bath (hydrochloric acid) to obtain cellulose particles (beads). ing. Further, there is described a means for removing sodium sulfate by immersing the collected beads in a large amount of warm water in order to increase the porosity of the beads.
  • a solvent containing a halogenated hydrocarbon is used in any of the methods, and in order to remove the solvent by vaporization during the production of particles, a large amount of energy is required. An apparatus for recovering the solvent is required.
  • a dense cellulose fatty acid ester film is formed in a portion of the formed droplet in contact with the coagulation accelerator. This can lead to an irregular particle shape. Therefore, as described in Patent Documents 2 and 3, when gelation is performed after forming droplets, the reaction may be biased.
  • Non-Patent Document 1 describes that the formed beads are subjected to a crosslinking reaction using formaldehyde and hydrochloric acid to crosslink the beads.
  • Non-Patent Document 2 describes the use of a pore forming agent in order to provide pores in the particles.
  • Both Non-Patent Document 1 and Non-Patent Document 1 include a step of treating the surface when forming the particles, and in order to obtain porous cellulose particles, the substance used for the surface treatment is removed. There is a need.
  • the main object of the present invention is to provide a technique for producing a porous cellulose medium without using a special gelling agent for a solution in which cellulose acetate as a raw material is dissolved. That is, the present invention relates to a homogeneous composition containing cellulose acetate as a raw material, a basic substance, and a solvent containing water in the production of a porous cellulose medium that can be applied to a separating agent. It is an object of the present invention to provide a technique for producing a porous cellulose medium obtained by causing an acetyl reaction to cause gelation without transferring a substance out of the system.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances. It has been reported in a paper that a homogeneous composition containing a solvent containing water and cellulose acetate undergoes a phase transition (liquid-gel form) and gelates when the temperature falls below a certain temperature (Non-patent Document 3).
  • the present inventors separately contain a cellulose acetate, a basic substance, and a solvent containing water as a uniform composition, and cause deacetylation of the cellulose acetate, thereby providing a non-solvent (gelling agent). It was found that a gel having a shape suitable for the purpose, such as a lump or a particle, can be obtained regardless of the addition of), and a cellulose medium having excellent characteristics while maintaining a porous structure can be obtained. That is, the gist of the present invention is as follows.
  • a porous material comprising a step of preparing a fluid uniform composition containing cellulose acetate, a basic compound, and a solvent containing water, and gelling the composition by deacetylation of cellulose acetate.
  • a method for producing a cellulose medium [2] A fluid homogeneous composition containing cellulose acetate, a basic compound, and a solvent containing water is dispersed in a dispersion medium immiscible with the homogeneous composition to obtain a dispersion, and the obtained dispersion
  • a method for producing spherical porous cellulose particles comprising a step of forming gelled particles composed of the composition by gelling the composition by deacetylation of cellulose acetate contained in the liquid.
  • the separation solvent is water, methanol, ethanol, 2-propanol, acetamide, formamide, or a mixture of at least two of these.
  • a flowable uniform composition containing cellulose acetate, a basic compound, and a solvent containing water is put into a molding container, and the uniform composition is gelled in the molding container by a deacetylation reaction of cellulose acetate.
  • the manufacturing method of the porous cellulose monolith including the process to make.
  • the manufacturing method in any one.
  • [8] A porous cellulose medium obtained by using the production method according to [1], spherical porous cellulose particles obtained by using the production method according to any of [2] to [4], or The manufacturing method of an adsorbent including the process of fix
  • [9] The method for producing an adsorbent according to [8], wherein the affinity ligand is at least one selected from protein A, protein G, protein L, and functional mutants thereof.
  • a first step of bringing the adsorbent according to [8] or [9] into contact with the mixture containing the target substance to bind the target substance to the affinity ligand immobilized on the adsorbent; and the affinity of the adsorbent A method for purifying a target substance, comprising a second step of separating the target substance bound to the ligand.
  • a porous cellulose medium such as porous cellulose particles
  • an organic chlorine-based solvent such as a halogenated hydrocarbon
  • gelation associated with the deacetylation reaction is utilized in the uniform composition, so that the pore size of the resulting cellulose medium can be made uniform.
  • a homogeneous composition containing cellulose acetate, a basic substance, and a solvent containing water causes a liquid-gel phase transition by a deacetylation reaction.
  • a gel composed of the homogeneous composition, and the gel converted to cellulose by deacetylation is used as the porous medium.
  • the liquid-gel phase transition by deacetylation is a phenomenon in which a liquid composition having fluidity loses fluidity as the deacetylation proceeds.
  • a phenomenon in which the viscosity increases as the temperature decreases is observed in many homogeneous solution compositions, but in gelation from a liquid, the fluidity is completely lost and often becomes cloudy.
  • a reagent other than the basic substance is not added, and gelation is caused by a deacetylation reaction.
  • the cellulose acetate used in the present invention may be any as long as the composition containing a basic substance, a solvent containing water, and the cellulose acetate causes a phase transition by deacetylation.
  • Typical physical properties of cellulose acetate include the degree of polymerization and the degree of substitution.
  • the degree of polymerization is preferably 50 or more on a weight average in order to increase the mechanical strength of the obtained porous cellulose particles and prevent elution into a solvent during use.
  • any upper limit can be used as long as it is available.
  • the degree of substitution has a strong influence on the solubility of cellulose acetate.
  • the degree of substitution is a numerical value indicating how many of three hydroxyl groups of one glucose residue of cellulose are substituted, and in the case of acetate, it is expressed by acetic acid content or acetyl group content. However, they can be converted to each other. Generally, those having a substitution degree of about 2.8 to 2.9 are distributed as triacetate, and those having a degree of substitution of about 2.5 are distributed as diacetate. In the present invention, any substitution degree may be used as long as it provides a composition that causes a phase transition.
  • Cellulose acetate is generally used as a fiber material, and so-called cellulose diacetate (among other typical products has a degree of acetyl substitution of 2.5, and the content of acetic acid) (Acetation degree around 55%) and triacetate used as a film material for photographs and liquid crystal displays (acetyl substitution degree is 2.8 to 2.9, expressed as acetic acid content) (Degree of acetylation) around 60%).
  • Those having a degree of substitution near 1 (which should be called monoacetate but are not generally established because it is not generally distributed) may be soluble in water and have a wide choice of polar solvent systems.
  • grades that are not generally distributed are, for example, solvolysis by adding a calculated amount of base to a solution of cellulose acetate having a higher degree of substitution, and the hydrous acetic acid solution by an acid catalyst such as sulfuric acid It can be obtained by hydrolysis and stopping the reaction at an appropriate timing (neutralizing sulfuric acid). For example, it can be obtained by using diacetate (cellulose diacetate) as a starting material and allowing 1.5 equivalents of base per glucose unit to act.
  • a base hydrazine and hydroxylamine are easy to use in many organic solvents because they are neutral molecules, and quick reaction is easy to use.
  • quaternary ammonium hydroxide can be used.
  • triacetate, diacetate and monoacetate in the degree of acetylation is not clearly distinguished, but in the present invention, for convenience, 2.7 or more is triacetate, 1.5 or more and less than 2.7 is diacetate, 0 .5 or more and less than 1.5 is defined as monoacetate.
  • composition used in the production method of the present invention is a uniform composition containing the above-mentioned cellulose acetate, a basic substance, an organic solvent, and water.
  • the homogeneous composition is a composition in a state where a basic substance, a solvent containing water and cellulose acetate are uniformly mixed.
  • the liquid-gel phase transition by deacetylation is a phenomenon in which a liquid composition having fluidity before deacetylation loses fluidity by performing deacetylation.
  • the composition of the composition and the polymerization degree and substitution degree of the cellulose acetate to be contained by appropriately adjusting the composition of the composition and the polymerization degree and substitution degree of the cellulose acetate to be contained, conditions for deacetylation causing a liquid-gel phase transition can be adjusted.
  • the content of the solvent containing cellulose acetate, basic substance, and water in the composition may be any as long as it causes deacetylation of cellulose acetate.
  • the cellulose acetate content in the composition is preferably 1 to 20% by weight, more preferably 4 to 15%, in order that the obtained porous cellulose has a pore diameter suitable for practical use and an appropriate hardness. It is preferable that it is weight%.
  • Basic compounds to be included in the composition are ammonia, hydrazine and their alkyl-substituted products, guanidines and amidines and their substituted products, diamines, hydroxyalkylamines such as hydroxylamine and ethanolamine, ethylamine and propylamine.
  • Examples include amines such as alkylamines, metal hydroxides such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, lithium hydroxide, inorganic bases such as quaternary ammonium hydroxide, metal alcoholates, hydroxamates, etc. it can.
  • the content of the basic substance in the composition may be 0.5 to 10 mol times with respect to the acetyl group of cellulose acetate, and preferably 1 to 5 mol times. When a basic substance is contained in such a ratio, deacetylation can be favorably caused.
  • a flowable uniform composition containing cellulose acetate, a basic compound, and a solvent containing water is prepared, and the composition is prepared by deacetylation of cellulose acetate. Gelate. That is, as the deacetylation of cellulose acetate in the uniform composition proceeds, the uniform composition gels.
  • each component may be mixed at one time, but generally it takes time to dissolve the cellulose derivative, and it is not desirable that the deacetylation reaction proceeds partially before complete dissolution. Therefore, prepare a solution in which cellulose acetate is previously dissolved in a solvent containing water. Separately, prepare a solution in which a basic compound is dissolved in a solvent containing water, and mix these solutions uniformly. It is preferable to prepare.
  • water can be used alone (without including an organic solvent) as a solvent.
  • the homogeneous composition begins to undergo deacetylation when its preparation is complete.
  • the speed of the deacetylation reaction can be adjusted by adjusting the temperature of the uniform composition or adjusting the type and concentration of the basic compound.
  • Examples of the solvent containing water to be contained in the composition include an embodiment in which an organic solvent is included in addition to water.
  • About the ratio of water and an organic solvent arbitrary ratios can be employ
  • an embodiment having a weight ratio of 5:95 to 90:10 can be given.
  • solvent containing water As the solvent containing water, an acetone / water mixed system for CDA reported in Non-Patent Document 3 mentioned above, and also a dioxane / water mixed system can be used, but the organic solvent contained in these systems is liquid paraffin. It is difficult to handle due to the fact that a considerable amount of water dissolves and the vapor pressure is high, which causes factors such as mass transfer other than temperature in the process of dispersion, causing unexpected gelation. Therefore, it is desirable that the solvent has low solubility in non-polar liquids such as liquid paraffin and the concentration does not easily change due to evaporation. Solvents having such attributes include saturated hydrocarbons such as hexane. Those that are not uniformly mixed are preferred.
  • Organic solvents having a high dissolving power for cellulose acetate in general and having the above-mentioned properties include many so-called aprotic polar solvents, and include DMSO, sulfolane, dimethyl sulfone, N-methylpyrrolidone, N, N Examples thereof include one or more selected from halogen-free solvents such as dimethylacetamide, N, N′-dimethylformamide, N, N′-dimethylimidazolidinone, hexamethylphosphorotriamide, and tetramethylurea. Among these, an embodiment in which one or more selected from DMSO, N-methylpyrrolidone, and N, N-dimethylacetamide is preferably used.
  • the temperature at which the deacetylation reaction is preferably performed in the ease of handling in the production of the porous cellulose medium is ⁇ 10 to 100 ° C., more preferably 0 to 70 ° C.
  • the reaction temperature is in the range of ⁇ 10 to 50 ° C. can be mentioned in order to prevent the reaction from proceeding faster than necessary.
  • the solubility in the solvent of the above compound and the reaction rate are different, so it cannot be determined uniquely.
  • a known method can be used, and the acetyl group is removed to the extent appropriate for the purpose of use. Just do it.
  • the time required for deacetylation that is, the time until the uniform composition gels can be 1 minute to 48 hours, preferably about 5 minutes to 24 hours.
  • the shorter time required for deacetylation is desirable from the viewpoint of dispersion stability when particles are obtained by dispersing in a dispersion.
  • the resultant is washed with a solvent that does not adversely affect the obtained porous cellulose, and a preservative is added as necessary.
  • the porous cellulose medium produced by the production method of the present invention can be used as a spherical particle or a monolith.
  • the process for controlling the shape of the particular composition described above before deacetylating and gelling the cellulose acetate is different.
  • a phase transition of the homogeneous composition is caused in a container having an arbitrary shape.
  • a solution-like homogeneous composition is usually not mixed with this.
  • the temperature is changed while dispersed in the dispersion medium to cause a phase transition.
  • ⁇ Spherical particles> As a method for producing the spherical porous cellulose particles of the present invention, a fluid homogeneous composition containing cellulose acetate, a basic compound, and a solvent containing water is dispersed in a dispersion medium that is not miscible with the homogeneous composition. And a step of forming a gelled particle composed of the composition by gelling the composition by deacetylation of cellulose acetate contained in the obtained dispersion. Can be mentioned.
  • the method may include a step of adding a separation solvent for separating the obtained gelled particles to the dispersion liquid on which the gelled particles are formed and separating the gelled particles in the separation solvent after the step. Good.
  • a dispersion medium for dispersing the composition is used.
  • the dispersion medium that can be used in the present invention mixing with water or an organic solvent in the composition causes unintended gelation of the composition or an extreme change in the phase transition temperature. Any material may be used as long as it does not adversely affect the pore size of the modified cellulose particles.
  • the dispersion medium preferably has a certain degree of viscosity when the composition is dispersed.
  • the viscosity of the dispersion medium include 0.2 to 20 Pa ⁇ s at 25 ° C.
  • the dispersion medium is preferably nonpolar so as not to be miscible with water or an organic solvent contained in the composition, for example, hydrocarbons having 20 or more carbon atoms such as liquid paraffin and petrolatum, silicone oil, Mention may be made of fluorinated hydrocarbons.
  • the softening temperature of petrolatum differs depending on the type and can be selected as appropriate.
  • the basic compound to be contained in the composition those described above can be used.
  • the range shown above can be employed as the content of cellulose acetate with respect to the acetyl group.
  • the above-mentioned range shown in ⁇ Composition in the present invention> can also be used for the content of other components in the uniform composition.
  • composition containing cellulose acetate in the present invention needs to maintain a dispersed state after being dispersed in a dispersion medium and then deacetylated and gelled. Therefore, it is preferable to add an appropriate dispersion stabilizer to the dispersion medium.
  • the dispersion stabilizer may be any as long as it has an effect of increasing the stability of the dispersion state of the composition and delaying the rate at which particles composed of the composition are aggregated.
  • examples of such dispersion stabilizers include esters of polyhydric alcohols such as glycerin, sorbitan, polyglycerin and sucrose and higher carboxylic acids, modified silicones containing a small amount of polar groups, and other commercially available products. Dispersion stabilizers can also be used.
  • the method for dispersing the composition containing cellulose acetate in the dispersion medium various methods can already be mentioned, and various methods can be used, such as those giving a wide range of particle size distribution to those giving a monodisperse particle size. It is. For example, a method of injecting a uniform composition gelled from a finer nozzle while flowing a liquid dispersion medium at an appropriate speed using what is generally called a microreactor has a uniform particle size. Suitable for making.
  • a method of extruding the fluid uniform composition of the present invention from a membrane having a constant pore diameter into a dispersion medium the fluid uniform composition of the present invention is placed in an inner cylinder having a hole of a certain size, A method in which this is rotated in a dispersion medium and a gelled homogeneous composition is extruded by centrifugal force.
  • a dispersion medium containing a dispersion stabilizer and fluidity as necessary.
  • Various methods can be used, such as a method of feeding a uniform composition of the above, a method of injecting a fluid uniform composition into a dispersion medium through a vibrating nozzle, and a method of using (ultra) sonic waves.
  • composition dispersed in the dispersion medium can be an embodiment in which the composition is allowed to stand for 1 to 48 hours, preferably about 10 to 30 hours, and the deacetylation reaction proceeds in particles composed of the uniform composition.
  • the aspect made into the temperature which the said composition maintains a liquid state can be mentioned.
  • the temperature of the dispersion medium is set to about 50 to 80 ° C.
  • the composition can be easily stirred and mixed. It is preferable that the uniform composition is added to a dispersion medium and dispersed in a state where the uniform composition maintains fluidity.
  • the subsequent process is not particularly limited, but examples of the present invention include an embodiment in which a separation solvent is used to take out the gelatinized cellulose particles from the dispersion medium.
  • a separation solvent is used to take out the gelatinized cellulose particles from the dispersion medium.
  • an aspect of adding a separation solvent to the dispersion medium in which the composition is dispersed in order to separate only the cellulose particles from the dispersion medium as gel-like particles among the particles composed of the gelled composition can be mentioned.
  • the separation solvent a solvent that is immiscible with the dispersion medium and does not dissolve cellulose among the gelled composition but is miscible with water and an organic solvent that may be contained in the composition is used. Thereby, it can prevent that a cellulose melt
  • Such a separation solvent examples include water, methanol, ethanol, 2-propanol, acetamide, formamide, or a mixture thereof.
  • the aspect using water can be mentioned from the ease of handling.
  • the cellulose gel particles dispersed in the dispersion medium can be directly filtered, since the dispersion medium generally has a high viscosity, pressure is applied during filtration, which increases the risk of deformation or destruction of the gel particles. It is also possible to reduce the pressure during filtration by adding a low viscosity liquid that is miscible with the dispersion medium.
  • the obtained porous cellulose particles are washed by an appropriate method using water, ethanol or the like, and are usually stored in a wet state. When drying, add an appropriate amount of sugar, glycerin, etc. Add preservatives such as alcohol and sodium azide to prevent spoilage when stored for long periods in water and humidity. Moreover, it can also dry in the state which added glycerol, saccharides, urea, etc. When used, the column is packed by a conventional method.
  • porous cellulose particles obtained by the production method of the present invention those having a substantially spherical to spherical shape with a particle size (maximum diameter) of 30 to 300 ⁇ m are selected by a known appropriate classification and chromatographed. It can be used as a filler for lithography. Chromatography can include size exclusion chromatography.
  • the fact that it can be used for size exclusion chromatography means that it can also be used for chromatographic separation in various modes other than size exclusion by binding an appropriate ligand. These include modes such as ion exchange, hydrophobicity, and affinity.
  • a matrix having a pore size sufficient to allow these substances to enter is preferable. That is, when gel filtration chromatography is performed using a column packed with the particles and water as the mobile phase, fractionation occurs in some molecular weight range of approximately 10 3 to 10 7 in terms of the molecular weight of polyethylene glycol. Can be expected.
  • the standard substance polyethylene glycol having a molecular weight of 10 4 to 10 6 is eluted at different times.
  • the pore diameter of the matrix that can be prepared by this method is suitable for separation and purification of these substances. It shows that it is a thing.
  • the size of the pores varies depending on the solvent containing water to be gelled, the concentration of cellulose acetate in the composition containing cellulose acetate, and the gelation conditions (for example, adjusting the cooling rate of the uniform composition). Fine adjustments can be made.
  • a protein can be used as the affinity ligand.
  • the protein that can be used in the present invention includes a substance having a molecular weight of 3 to 300 kDa, preferably 30 to 150 kDa, and having affinity for a protein such as an antibody to be separated.
  • protein A, protein G, protein L, and functional mutants thereof as affinity ligands are preferred because of their high selectivity when used to separate antibody proteins.
  • the functional variant refers to a protein having at least one modification in the native amino acid sequence and still maintaining at least one function associated with the native sequence.
  • Natural sequences include amino acid sequences that naturally occur in nature. Amino acid changes can include substitution of one or more amino acids for another amino acid, deletion of one or more amino acids, and / or addition of one or more amino acids, or any combination thereof. Embodiments such as combinations of additions, deletions and substitutions made to the native sequence are also included.
  • a functional variant can also include a fragment or domain of a protein.
  • the amino acid sequence of the functional variant is at least 70% identical, at least 75% identical, at least 80% identical, at least 85% identical, at least 90% identical, at least 95% identical, at least 98% identical to the natural amino acid sequence Well, it still retains at least one function associated with the native sequence.
  • the amount of protein supported on the porous cellulose particles is preferably 1.0 to 25 parts by weight with respect to 100 parts by weight of the porous cellulose particles. Further, an embodiment in which the amount is 1 to 50 mg per 1 ml of the volume of the porous cellulose particles can be mentioned.
  • an adsorbent to which the affinity ligand is bound can be produced by further including the step of immobilizing the affinity ligand.
  • This adsorbent can also be used as a separation agent for affinity chromatography.
  • the porous cellulose particles produced by the production method described above may include a step of causing a crosslinking reaction using a crosslinking agent.
  • the crosslinking method is not particularly limited, and for example, a halohydrin such as epichlorohydrin, epibromohydrin, dichlorohydrin, a crosslinking agent such as bisoxirane or polyoxirane can be used.
  • a step of activating the crosslinked cellulose particles may be included.
  • crosslinked cellulose particles can be activated.
  • the functional group can be changed to a functional group that can be easily reacted with the compound to be immobilized as a ligand.
  • immobilized as a ligand after that, and fixing a ligand and porous cellulose particle can be mentioned.
  • a method for producing an adsorbent a system in which porous cellulose particles and a compound to be immobilized as a ligand exist, a condensing reagent such as carbodiimide, or a plurality of functional groups in the molecule such as glutaraldehyde is used.
  • a condensing reagent such as carbodiimide, or a plurality of functional groups in the molecule such as glutaraldehyde
  • Examples include a method of immobilizing porous cellulose particles and a ligand to obtain an adsorbent by adding a reagent having the condensation and crosslinking.
  • a formyl group is introduced into cellulose and cellulose particles and the formyl group reacts with an amino group of a protein.
  • the reaction for introducing a formyl group include a method in which a polysaccharide having a vicinal hydroxyl group is oxidized by a periodate oxidation method to form a formyl group on a sugar chain.
  • a method of introducing a formyl group through various spacers obtained by a method of allowing periodate to act on a glyceryl group obtained by ring opening of an epoxy group can be mentioned.
  • an amino sugar such as glucosamine can be used as the spacer.
  • a known method can be used as a method for binding a formyl group of porous cellulose particles and a protein such as protein A.
  • a mode in which cellulose particles and a solution containing protein A are reacted can be exemplified. Examples of such a method include the method described in JP-A-2008-279366.
  • a monolith is an integral lump of porous material.
  • the developing solution also passes through the fine pores of the particles, but more passes through the interparticle gaps.
  • the fine pores of the integral porous body are passed. Therefore, in general, it is often the case that the solid content is lower than that of the particulate filler to reduce the resistance to the flow of the developing solution.
  • the mechanism is completely the same as that of the filler.
  • a flowable homogeneous composition containing cellulose acetate, a basic compound, and a solvent containing water is placed in a molding container, and deacetylation reaction is performed in the molding container.
  • a step of gelling the homogeneous composition As the solvent containing cellulose acetate, basic compound, and water used in this method, the same solvent as used for producing spherical particles can be used. Moreover, the same conditions as those used for producing the spherical particles can be used for the content of each component in the uniform composition.
  • the generated porous structure is uniform in the direction perpendicular to the flow of the developing liquid and that there is no gap between the monolith and the container where the liquid can easily flow. It is. Preparation of a porous body uniform in the perpendicular direction described here cannot be performed by contact with a gelling agent (precipitating agent) or evaporation of a solvent which is a known technique.
  • the method using gelation by deacetylation of cellulose acetate of the present invention can provide a uniform gel if the temperature of the raw material composition is uniform, compared to the gelation rate. Is preferred.
  • the above-described uniform composition containing the basic compound, the solvent containing water and the cellulose acetate is put into a molding container of an arbitrary shape, and then at a temperature of about 0 to 100 ° C. for 10 minutes to 48.
  • the mixture is allowed to stand for a period of time, preferably about 1 to 24 hours, to cause a deacetylation reaction of cellulose acetate to form a gel comprising the composition, which is left as it is or after being removed from the mold, and then with an appropriate solvent. It can be washed and used as a separating agent.
  • drying may cause deformation of the shape of the monolith or lose the microporous structure, which is avoided, but can be achieved by coexisting an appropriate non-volatile additive.
  • a non-volatile additive sugars such as glycerin, sucrose, trehalose, and syrup, sugar alcohols, various amides, and polar compounds such as DMSO are suitable.
  • ⁇ To evaluate the prepared monolith it is necessary to put it in an appropriate container so that there are no gaps or local consolidation. Any known method may be used for this purpose. Usually, when a monolith is formed by gelation, some shrinkage occurs, and a gap is often formed between the container and the container. In such a case, modify the container wall surface to a chemical structure that has a strong affinity for cellulosic materials (for example, to bind cellulose to the surface) to prevent gaps, or use shrinkage and swelling due to changes in the gel environment. However, by making the container size adaptable (adjustable), etc., it becomes possible to fit without gaps.
  • the prepared monolith can be used as a separation agent or adsorbent for affinity chromatography by binding an affinity ligand, as in the case of the spherical particles described above.
  • the affinity ligand that can bind to the monolith is the same as in the case of spherical particles, and the affinity ligand can be bound by the same method as in the case of spherical particles.
  • target molecules include proteins such as immunoglobulins.
  • immunoglobulins include polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, and functional fragments thereof.
  • the purification method of the present invention includes the following steps.
  • Examples of the method for separating the target substance bound to the affinity ligand of the adsorbent include changing the pH and changing the salt concentration between the first step and the second step.
  • the pH of the first step is set to neutral such as 6 to 8, and the pH is set to less than 6 in the second step.
  • the salt concentration is less than 0.1 M in the first step, 0.1 M or more in the second step, or 0.1 M or more in the first step. It can be mentioned to be less than 1M.
  • Example 1 Preparation of porous cellulose particles> 360 g of white petrolatum (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Wako first grade) and 0.63 g of emulsifier TSG10 (manufactured by Nippon Emulsion) were placed in a separable flask, and kept at 70 ° C. in an oil bath and melted. While maintaining 30.0 g of the DMSO solution of cellulose acetate at 60 ° C., a mixed solution of 2.0 g of hydrazine monohydrate, 2.1 g of water and 6.4 g of DMSO was added and mixed well.
  • the cellulose diacetate solution was added to the above separable flask, and stirred at about 600 rpm for 5 minutes using a 4 cm diameter disperser.
  • the obtained dispersion was cooled to 40 ° C. in an ice bath to solidify the dispersion, and left at 40 ° C. for 24 hours to be deacetylated and gelled.
  • 300 mL of water was added to the dispersion, heated to 70 ° C. to dissolve the dispersion, and then slowly stirred to extract and separate fine particles. After the aqueous phase was separated, 300 mL of water was added again, and the mixture was slowly stirred and extracted and separated.
  • the extracted aqueous phase was filtered through a glass filter and washed repeatedly with ethanol and water.
  • grains with the microscope is shown in FIG. 1, and it turns out that it is a shape close
  • Example 2 Preparation of porous cellulose particles> 733 g of white petrolatum (Wako first grade, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and 1.1 g of emulsifier TSG10 (manufactured by Nippon Emulsion) were placed in a separable flask, and kept at 70 ° C. in an oil bath and melted. While maintaining 60.1 g of the DMSO solution of cellulose diacetate prepared in Example 1 at 60 ° C., a mixed solution of 3.8 g of hydrazine monohydrate, 8.8 g of water, and 26.9 g of DMSO was added and mixed well.
  • This mixed solution was added to the above separable flask, a disperser with a diameter of 80 mm was inserted, and the mixture was stirred at about 400 rpm for 5 minutes.
  • the obtained dispersion was cooled to 40 ° C. in an ice bath to solidify the dispersion, and left at 40 ° C. for 24 hours to be deacetylated and gelled.
  • 300 mL of water was added to the dispersion, heated to 70 ° C. to dissolve the dispersion, and then slowly stirred to extract and separate fine particles. After separation of the aqueous phase, 200 mL of water was added again, and the mixture was slowly stirred and extracted and separated.
  • the extracted aqueous phase was filtered through a glass filter and washed repeatedly with ethanol and water.
  • a photomicrograph of the resulting particles is shown in FIG.
  • a part of the obtained particles was replaced with 30% ethanol, 50% ethanol, 70% ethanol, 90% ethanol, ethanol, and t-butyl alcohol / ethanol 5/5, 7/3, 9/1, 10 /
  • freeze-drying treatment was performed.
  • FIG. 3 When the freeze-dried particles were confirmed with an electron micrograph, a porous surface was observed (FIG. 3).
  • This mixed solution was added to the above separable flask, a disperser with a diameter of 80 mm was inserted, and the mixture was stirred at about 325 rpm for 5 minutes.
  • the obtained dispersion was cooled to 40 ° C. in an ice bath to solidify the dispersion, and left at 40 ° C. for 24 hours to be deacetylated and gelled.
  • 300 mL of water was added to the dispersion, heated to 70 ° C. to dissolve the dispersion, and then slowly stirred to extract and separate fine particles. After the aqueous phase was separated, 200 mL of water was added again, and the mixture was slowly stirred and extracted and separated.
  • the extracted aqueous phase was filtered through a glass filter and washed repeatedly with ethanol and water.
  • the obtained cellulose particles were classified with stainless steel sieves of 150 ⁇ m, 106 ⁇ m, and 53 ⁇ m while being dispersed in water.
  • FIG. 4 shows a photomicrograph of the particles of 53 ⁇ m to 106 ⁇ m stained with Congo red.
  • an electron micrograph of the freeze-dried particles confirmed porous cellulose particles.
  • Example 4 Production of cellulose particles using cellulose monoacetate> (1) Synthesis of cellulose monoacetate Cellulose acetate (trade name “L-50” manufactured by Daicel Corporation, total acetyl substitution degree: 2.43, 6% viscosity: 110 mPa ⁇ s) Part by weight acetic acid and 2.0 parts by weight water were added and the mixture was stirred for 3 hours to dissolve. 0.13 parts by weight of sulfuric acid was added to this solution, and the resulting solution was kept at 70 ° C. for hydrolysis. After 1 hour, 0.67 parts by weight of water was added over 5 minutes, and after another 2 hours, 1.33 parts by weight of water was added over 10 minutes and the reaction was continued for another 6 hours.
  • reaction solution was cooled to 25 ° C., and 15 parts by weight of an acetone-methanol equal volume mixed solution was added to form a precipitate, which was centrifuged to remove liquid using a filter cloth.
  • Water corresponding to 14 parts by weight of the raw material cellulose acetate was added to the solvent-containing cake having a solid content of about 15% by weight and stirred to dissolve the precipitate.
  • methanol corresponding to 4 times the weight of the obtained solution was added to the solution, precipitation occurred again, and this was recovered by liquid removal. Further, the operation of adding water to dissolve, adding methanol to precipitate and recovering by liquid removal was repeated twice.
  • the obtained solvent-containing precipitate was dispersed in 0.004% potassium carbonate-containing methanol equivalent to 8 parts by weight, and the operation of recovering and collecting the liquid was repeated twice, followed by vacuum drying at 50 ° C. to obtain cellulose monoacetate as a raw material Got.
  • the disperser was inserted and stirred at about 350 rpm for 2 minutes.
  • the obtained dispersion was allowed to stand for 10 minutes to be deacetylated and gelled.
  • 100 mL of water was added to the dispersion, heated to 25 ° C., and slowly stirred for 3 hours to extract and separate fine particles.
  • 100 mL of water was added again, and the mixture was slowly stirred and extracted and separated.
  • a small amount of potassium hydroxide was added to the extracted aqueous phase to slowly expand sales, and then allowed to stand overnight.
  • the mixture was neutralized by adding acetic acid, passed through a 25 ⁇ m sieve, filtered through a glass filter, and repeatedly washed with ethanol and water.
  • FIG. 6 shows a photomicrograph of the particles of 53 ⁇ m to 106 ⁇ m stained with Congo red.
  • Example 5 Size Exclusion Chromatography
  • the cellulose particles prepared in Examples 2 and 3 were classified with stainless steel sieves of 150 ⁇ m, 106 ⁇ m, and 53 ⁇ m while being dispersed in water. About 7 mL of a 53 ⁇ m to 106 ⁇ m portion is packed in a column having an inner diameter of 10 mm and a height of 100 mm, and a sample of standard polyethylene oxide shown in Table 1 is injected using ultrapure water as a mobile phase in the following manner, and a differential refraction detector Detected by. A calibration curve drawn according to a conventional method is shown in FIG.
  • Kav (Ve ⁇ V0) / (Vt ⁇ V0)
  • Ve is the sample holding capacity (mL)
  • Vt is the empty column volume (mL)
  • V 0 is the SE-150 holding capacity (mL).
  • Example 6 (1) Preparation of crosslinked porous cellulose particles To a 100 mL three-necked flask, a solution of 10 mL of porous cellulose particles obtained in Example 3 and 10.6 g of sodium sulfate in 28.8 g of water was added and stirred at 50 ° C. . A 45 wt% aqueous sodium hydroxide solution (0.37 g) and sodium borohydride (60 mg) were added and stirred. An amount of 5.42 g of 45 wt% sodium hydroxide aqueous solution and 5.55 g of epichlorohydrin each divided into 10 equal portions was added every 30 minutes over approximately 5 hours. After completion of the addition, the mixture was reacted at 50 ° C. for 19 hours. After cooling to 40 ° C. or lower, 0.62 g of acetic acid was added for neutralization. The reaction mixture was filtered to collect particles, and filtered and washed with pure water to obtain the desired crosslinked porous cellulose particles.
  • the activated carrier is transferred to a flask, 168 ⁇ L of protein A-containing solution containing 53.6 mg / mL of protein A (rSPA, Repligen) and 2 mL of coupling buffer are added, and fixed by shaking at 5 ° C. and 130 rpm for 22 hours. did.
  • the solution was filtered with a glass filter and washed with a coupling buffer.
  • As a result of measuring the filtrate after the reaction by the BradFord method it was found that 9.0 mg of protein A was immobilized per 1 mL of the carrier.
  • the carrier was transferred to the flask, 2 mL of 1M Tris-HCl (pH 8) was added, and the mixture was shaken at 25 ° C.
  • wash solution 1 0.1 M Tris-HCl, 0.5 M sodium chloride, pH 8.0
  • wash solution 2 0.1 M ammonium acetate buffer, 0.5 M sodium chloride, pH 4.0
  • the injection was continued until it reached 15% of the absorbance at 280 nm of the eluate, and after washing with the adsorption buffer, the adsorption buffer was replaced with 20 mM citric acid (pH 2.4) to elute the adsorbed components.
  • the dynamic adsorption capacity (DBC) was calculated from the amount of sample injected until the absorbance of non-adsorbed components at 280 nm of the eluate reached 10% of the absorbance of the injected sample.
  • Table 2 shows the DBC of each immobilization column.
  • a porous cellulose acetate medium is produced by utilizing the property that a specific composition containing cellulose acetate undergoes gelation by a deacetylation reaction.
  • the size of the pores becomes uniform.
  • the pore size of the obtained porous cellulose medium is as large as several thousand ⁇ .
  • the hardness of the porous cellulose medium obtained by the production method of the present invention is about the same as that of commercially available products.
  • the porous medium obtained by the production method of the present invention is useful as an adsorbent or a separating agent regardless of whether the shape is a spherical particle or a monolith.
  • an adsorbent bound with an affinity ligand can be used for separation of various target substances.

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Abstract

多孔質セルロース媒体の製造において、原料となるセルロースアセテートを溶解した溶液について、特別なゲル化剤を用いずに多孔質セルロース媒体を作製する技術と、その技術を用いて製造された多孔質セルロース媒体等を提供する。 セルロースアセテートと、塩基性化合物と、水を含む溶媒とを含む流動性の均一組成物を準備し、セルロースアセテートの脱アセチル化脱アセチル反応により、当該組成物をゲル化させる工程を含む、多孔質セルロース媒体の製造方法。

Description

多孔質セルロース媒体の製造方法
　本発明は、多孔質セルロース媒体の製造方法に関する。
　セルロースを代表とする多糖およびその誘導体は、さまざまな用途に利用されている。これらの微多孔質体は、それ自体が吸着剤となりうるし、またその表面に何らかの化学修飾を行うことにより、吸着や分離の機能が付与できる。
　以下にそのひとつの例を挙げる。酵素利用の普及、バイオ医薬の開発などにより、タンパク質を始めとする生体高分子の分離精製は、重要な技術的課題の一つとなっている。これを解決するための重要な手段がクロマトグラフィーである。クロマトグラフィーでは、目的物あるいは除去対象となる不純物と相互作用する何らかの原子団（しばしばこれをセレクタと呼ぶ）をマトリクスと呼ばれる固体に結合した分離剤が用いられる。
　タンパク質の非特異吸着がないことは、生体高分子を分離するための材料として極めて重要な特性であり、そのために多糖類がマトリクスとして重用されている。また、多糖類は分子内に水酸基を多く持つため、これを足場としてエーテル結合やエステル結合を介して容易にセレクタを結合することが出来、これも多糖類が重用される大きい要因となっている。
　また、生体高分子を分離精製するためには、一般的に、マトリクスに目的とする分子と何らかの親和性をもつセレクタを結合し、目的分子を吸着させた後に、何らかの方法で吸着させた目的分子を遊離させて回収する方法を用いる。多量の目的分子を得るためには、多量のセレクタを結合することができ、さらにそのセレクタと分子量の大きい生体高分子を効率よく相互作用させるために、マトリクスが、目的分子が自由に出入りできるような多孔質構造を備えていることが求められる。言い換えれば、該マトリクスをカラムに充填してサイズ排除クロマトグラフィーを行ったときに、精製したい分子とリガンドを併せたサイズよりも大きい排除限界を示すことが必要である。
　このようなマトリクスは、多くの場合、粒子としてカラムと呼ばれる管の中に充填して用いられる。しかし、近年注目されている新たな形態は、モノリスと呼ばれる一体の多孔質体である。これはキャピラーと呼ばれる細管や、カラムなどの容器に納めることにより、同じ用途に用いられる。比較的薄く面積の大きいモノリスは、ろ過膜として使うことも出来る。
　このようなマトリクスの使いやすさの要因として、分離対象に対する選択性に加えて、その物理強度の高さが挙げられる。すなわち、弾性率の低いマトリクスは、クロマトグラフィーやろ過において液体や気体を流したときに、圧縮変形や破断を被り、その結果クロマトグラフィーカラム内の液の流れが不均一になり、さらには閉塞することにより、カラムの分離効率を著しく低下させる。この点で、物理的強度の高さは重要な特性であり、この点において、セルロースは、多糖類の中でも優れた材料となっている。
　他にも、セルロースは、多糖の一般的な特徴としてその表面にアルコール性水酸基を持つため、化学反応によって多様な原子団を結合することが可能であること、純度の高い素材が多量に、比較的安価に入手できることなどの利点がある。
　以上の理由から、生体高分子の分離精製を主目的とする多孔質セルロース粒子が開発されている。これを製造するための方法としては、セルロースを何らかの方法で溶かした後、再生する方法が多いが、有機酸エステルを出発原料にする方法がいくつか見られる。これは、セルロースそのものを直接溶解することは、特殊な溶媒を必要としたり、溶液の粘度が非常に高いなどの難しさがあるのに対し、有機酸エステルは多くの溶媒に溶かすことができること、セルロースの有機酸エステルが、さまざまな有機酸とのさまざまな結合率、また重合度で、安定した品質の下、工業的に供給されること、また容易にエステル結合を分解し、セルロースを再生できることなどの利点を利用したものである。
　そのようなセルロース粒子の製造方法として、例えば特許文献１には、セルロース有機酸エステルをハロゲン化炭化水素のような有機溶媒に溶解させた溶液を、水性媒体中に分散してエステル溶液の微小液滴を形成させ、そこにアンモニウム塩などの加水分解促進剤を添加して該エステルの加水分解を行って、セルロース微小粒子を形成することが記載されている。
　また、特許文献２には、セルロース脂肪酸エステルと、セルロース脂肪酸エステルのゲル化剤とを有機溶媒に溶解して溶液として、その溶液を水性媒体に撹拌添加して液滴を形成させ、さらに凝固促進剤を加えて液滴中のセルロース脂肪酸エステルをゲル粒子とし、生成した粒子からゲル化剤、凝固促進剤及び溶媒を除去することで、多孔球状粒子を製造する方法が記載されている。
　特許文献３には、セルロースを、パラホルムアルデヒドと、ジメチルスルホキシドの混合液に溶解し、その溶解液を分散媒体に分散させた後、凝固剤としてケイ素化合物を投入してセルロースの分散液滴をゲル化凝固して、粒状セルロースゲルを作製する方法が記載されている。
　非特許文献１には、セルロースアセテートを水溶解性の有機溶媒（アセトンとＤＭＳＯの混合溶媒）に溶解させ、これを水に分散させることで、セルロールアセテートを含む溶液が水に接触して凝固し、多孔質の粒子を形成することが記載されている。
　非特許文献２には、セルロースジアセテートを、ＤＭＳＯに溶解させ、その後無水硫酸ナトリウムを加えて撹拌し、混合物を酸凝集浴槽（塩酸）に投入してセルロース粒子（ビーズ）を得ることが記載されている。また、ビーズの多孔性を高めるために、採取後のビーズを多量の温水に浸漬して硫酸ナトリウムを除去する手段が記載されている。
特開昭６２－２７７４０１号公報 特開昭６３－９５２３７号公報 特開昭５７－１５９８０１号公報
Chen, L. F.; Tsao, G. T. Biotechnol. Bioeng. 1976, 18, 1507 Bai, Y.-X.; Li, Y.-F. Carbohydr. Polym. 2006, 64, 402 A. J. Reuvers他, J. Polym. Sci., 1986, 24, 793
　特許文献１及び２の技術では、いずれの方法においても、ハロゲン化炭化水素を含む溶媒を用いており、粒子の作製の際にその溶媒の除去を気化で行うために、大きなエネルギーと、気化させた溶媒を回収するための装置が必要になる。また、特許文献２や３に記載のような凝固促進剤や凝固剤を用いた方法では、形成された液滴の中で凝固促進剤等と接触した部分で緻密なセルロース脂肪酸エステルの膜が形成されることで、いびつな粒子形になることがある。このことから、特許文献２や３に記載のように、液滴を形成させた後にゲル化を行わせる場合には、反応に偏りが生じる可能性がある。
　また、非特許文献１では、形成させたビーズをホルムアルデヒドと塩酸を用いて架橋反応を起こさせてビーズを架橋させることが記載されている。また、非特許文献２では、粒子に細孔を設けるために細孔形成剤を用いることが記されている。非特許文献１及び非特許文献１のいずれも、粒子の形成の際にその表面を処理する工程を含ませており、多孔質セルロース粒子を得るためには、表面処理に用いた物質を除去する必要がある。
　本発明は、原料となるセルロースアセテートを溶解した溶液について、特別なゲル化剤を用いずに多孔質セルロース媒体を作製する技術を提供することを主な課題とする。すなわち、本発明は、分離剤に応用できるような多孔質セルロース媒体の製造において、原料となるセルロースアセテートと、塩基性物質と、水を含む溶媒とを含有する均一組成物について、セルロースアセテートの脱アセチル反応を起こさせることで、系外への物質の移動を伴わずにゲル化することにより得られる多孔質セルロース媒体を作製する技術を提供することを課題とする。
　本発明は、上記実情に鑑みてなされたものである。水を含む溶媒とセルロースアセテートを含む均一組成物が、ある温度以下になると相転移（液状－ゲル状）を起こし、ゲル化することは、論文に報告されている（非特許文献３）。
　本発明者らは、これとは別に均一組成物として、セルロースアセテート、塩基性物質、水を含む溶媒とを含有させ、そのセルロースアセテートについて脱アセチル化を起こさせることで、非溶媒（ゲル化剤）の添加などによらず、塊状、粒子状など、目的に応じた形状のゲルを得ることができ、多孔質構造を維持し優れた特質を持ったセルロース媒体が得られることを見出した。
　すなわち、本発明の要旨は以下の通りである。
[１]  セルロースアセテートと、塩基性化合物と、水を含む溶媒とを含む流動性の均一組成物を準備し、セルロースアセテートの脱アセチル反応により、当該組成物をゲル化させる工程を含む、多孔質セルロース媒体の製造方法。
[２]  セルロースアセテートと、塩基性化合物と、水を含む溶媒とを含む流動性の均一組成物を、該均一組成物と混和しない分散媒体に分散させて分散液を得て、得られた分散液に含まれるセルロースアセテートの脱アセチル反応により前記組成物をゲル化させることにより前記組成物から構成されるゲル化粒子を形成させる工程を含む、球状多孔質セルロース粒子の製造方法。
[３]  前記工程の後に、得られたゲル化粒子を分離するための分離溶媒を、ゲル化粒子が形成された分散液に添加して、分離溶媒中にゲル化粒子を分離する工程を含む、[２]に記載の球状多孔質セルロース粒子の製造方法。
[４]  前記分離溶媒が水、メタノール、エタノール、２－プロパノール、アセトアミド、ホルムアミド、またはこれらのうち少なくとも２種の混合物である［３］に記載の製造方法。
［５］　セルロースアセテートと、塩基性化合物と、水を含む溶媒とを含む流動性の均一組成物を成型容器に入れ、セルロースアセテートの脱アセチル反応により、該成型容器内で均一組成物をゲル化させる工程を含む多孔質セルロースモノリスの製造方法。
［６］　前記均一組成物における水を含む溶媒が有機溶媒を含み、該有機溶媒が、水と混和し、飽和炭化水素と混和しないものであることを特徴とする［１］～［５］のいずれかに記載の製造方法。
［７］　前記有機溶媒が、非プロトン性極性溶媒である、［６］に記載の製造方法。
［８］　［１］に記載の製造方法を用いて得られた多孔質セルロース媒体、［２］～［４］のいずれかに記載の製造方法を用いて得られた球状多孔質セルロース粒子、または［５］に記載の製造方法を用いて得られた多孔質セルロースモノリスに、アフィニティーリガンドを固定化する工程を含む、吸着体の製造方法。
［９］　アフィニティーリガンドが、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ及びこれらの機能性変異体から選ばれる一種以上である、［８］に記載の吸着体の製造方法。
［１０］
　［８］または［９］に記載の吸着体と、標的物質を含む混合物とを接触させて、吸着体に固定化されたアフィニティーリガンドに標的物質を結合させる第一の工程と、吸着体のアフィニティーリガンドに結合した標的物質を分離する第二の工程を含む、標的物質の精製法。
　本発明によれば、多孔質セルロース粒子のような多孔質セルロース媒体の製造にあたり、セルロースアセテートを溶解させるためにハロゲン化炭化水素のような有機塩素系の溶媒を用いる必要がなくなるばかりでなく、セルロースアセテートを含む組成物をゲル化する際に、均一組成物において、脱アセチル化反応に伴うゲル化を利用するので、得られるセルロース媒体の細孔の大きさを均一にすることができる。
本発明の製造方法を用いて得られた多孔質セルロース粒子（実施例１）の光学顕微鏡写真である。 本発明の製造方法を用いて得られた多孔質セルロース粒子（実施例２）の光学顕微鏡写真である。 本発明の製造方法を用いて得られた多孔質セルロース粒子（実施例２）の電子顕微鏡写真である。 本発明の製造方法を用いて得られた多孔質セルロース粒子（実施例３）の光学顕微鏡写真である。 本発明の製造方法を用いて得られた多孔質セルロース粒子（実施例３）の電子顕微鏡写真である。 本発明の製造方法を用いて得られた多孔質セルロース粒子（実施例４）の光学顕微鏡写真である。 実施例２，３で得た多孔質セルロース粒子を用いて、標準ポリエチレンオキシドの分離を行って得た検量線を示す図である。
　本発明の多孔質セルロース媒体の製造方法は、セルロースアセテートと、塩基性物質と、水を含む溶媒とを含む均一組成物が、脱アセチル反応により、液体－ゲルの相転移を起こすものであることを利用し、前記均一組成物からなるゲルを形成させ、脱アセチル化によりセルロースに変換されたゲルを多孔質媒体とするものである。
　本発明において、脱アセチル化による液体－ゲルの相転移とは、流動性を持つ液状の組成物が、脱アセチル反応が進むに従い流動性を失う現象である。例えば温度が下がると粘度が高くなる現象は多くの均一溶液組成物に認められるが、液体からのゲル化においては、流動性は完全になくなり、多くの場合白濁する。本発明では、ゲル化を起こさせるために、塩基性物質以外の試薬等は添加せず、脱アセチル反応によりゲル化を起こさせる。
＜セルロースアセテート＞
　本発明で用いるセルロースアセテートは、塩基性物質と、水を含む溶媒と、当該セルロースアセテートとを含む組成物が、脱アセチル化によって相転移を起こすものであればいかなるものであってもよい。セルロースアセテートの代表的物性として、重合度と置換度を挙げることができる。
　重合度については、得られる多孔質セルロース粒子の機械的強度を高め、使用時の溶媒等への溶出を防ぐために重量平均で５０以上であることが好ましい。一方、上限については入手可能なものであれば、いかなるものも使用できる。
　置換度は、セルロースアセテートの溶解性に強い影響を与える。置換度とは、セルロースのグルコース残基１個が有する３個の水酸基のうち、何個が置換されているかを示す数値であり、アセテートの場合には酢酸含量やアセチル基含量で表現される場合もあるが、これらは互いに換算することが出来る。一般的には、置換度が２．８～２．９付近のものがトリアセテート、２．５付近のものがジアセテートとして流通している。本発明においては、相転移を起こす組成物を与えるものであれば、いかなる置換度のものであってもよい。
　セルロースアセテートについて、一般に流通しているものには、繊維材料などとして汎用的に用いられる、いわゆるセルロースジアセテート（中でも典型的な製品はアセチル置換度が２．５のものであり、酢酸の含量として表すと（酢化度）５５％付近のもの）と、写真や液晶表示用のフィルム材料として用いられるトリアセテート（アセチル置換度が２．８～２．９のものであり、酢酸の含量として表すと（酢化度）６０％付近のもの）がある。置換度が１付近のもの（モノアセテートと呼ばれるべきものであるが、一般に流通していないため、通称として確立されていない）は、水にも溶ける場合があり、極性溶媒系の選択肢が広い。このように、一般に流通していないグレードは、例えば、それより置換度の高いセルロースアセテートの溶液に計算量の塩基を加えて加溶媒分解することや、その含水酢酸溶液を硫酸などの酸触媒によって加水分解し、適当なタイミングで反応を停止する（硫酸を中和する）ことなどによって得ることができる。例えば、ジアセテート（二酢酸セルロース）を出発物質とし、グルコース単位当り１．５当量の塩基を作用させて得ることができる。塩基としては、中性分子であるため多くの有機溶媒にも混和しやすく、かつ反応が速やかなヒドラジン、ヒドロキシルアミンが使いやすいが、要は原料溶液と混和する塩基であれば、水酸化物、例えば第四級アンモニウム水酸化物なども利用できる。
　アセチル化の程度におけるトリアセテート、ジアセテート、モノアセテートの境界は、明確に区別されていないが、本発明においては、便宜上２．７以上をトリアセテート、１．５以上２．７未満をジアセテート、０．５以上１．５未満をモノアセテートとする。
＜本発明における組成物＞
　本発明の製造方法において用いる組成物は、前述したセルロースアセテートと塩基性物質と有機溶媒と水を含有する均一組成物である。均一組成物とは、塩基性物質と水を含む溶媒とセルロースアセテートとが均一に混和している状態の組成物のことである。
　本発明において、脱アセチル化による液体－ゲルの相転移とは、脱アセチル化の前は流動性を持つ液状の組成物が、脱アセチル化を行うことで流動性を失う現象である。本発明では、この組成物の組成や、含有させるセルロースアセテートの重合度や置換度を適宜調整することで、液体－ゲルの相転移が起こる脱アセチル化が起きる条件を調整することができる。
　前記組成物におけるセルロースアセテート、塩基性物質、水を含む溶媒の含有量は、それぞれ、セルロースアセテートの脱アセチル化を起こすものであれば、いかなるものであってもよい。
　該組成物におけるセルロースアセテートの含有量は、得られる多孔質セルロースが実用に適した細孔径と適度な硬さを有するためには、好ましくは１～２０重量％であり、更に好ましくは４～１５重量％であることが好ましい。
　該組成物に含有させる塩基性化合物は、アンモニア、ヒドラジン及びそれらのアルキル置換体、グアニジン類やアミジン類及びその置換体、ジアミン類、ヒドロキシルアミン、エタノールアミン等のヒドロキシアルキルアミン類、エチルアミン、プロピルアミン等のアルキルアミンのようなアミン類、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム等の金属水酸化物、水酸化四級アンモニウム、金属アルコラート、ヒドロキサム酸塩などのような無機塩基を挙げることができる。
　該組成物における塩基性物質の含有量は、セルロースアセテートのアセチル基に対して、０．５～１０モル倍である態様を挙げることができ、１～５モル倍であることが好ましい。このような比率で塩基性物質を含有させると、脱アセチル化を良好に起させることができる。
　本発明の多孔質セルロース媒体の製造方法では、セルロースアセテートと、塩基性化合物と、水を含む溶媒とを含む流動性の均一組成物を準備し、セルロースアセテートの脱アセチル反応により、当該組成物をゲル化させる。つまり、均一組成物におけるセルロースアセテートの脱アセチル化が進行するに従い、均一組成物がゲル化する。
　従来の方法、例えば特許文献１では、ゲル化を行った後に脱アセチル化を行っていたが、本発明では、脱アセチル化とゲル化が同時に起こる。前記均一組成物は、各成分を一度に混合してもよいが、一般にセルロース誘導体の溶解には時間がかかることが多く、完溶しないうちに部分的に脱アセチル反応が進行することは望ましくないので、あらかじめセルロースアセテートを、水を含む溶媒に溶解させた溶液を準備し、それとは別に、塩基性化合物を、水を含む溶媒に溶解させた溶液を準備し、それらの溶液を均一に混合して準備することが好ましい。なお、セルロースアセテートとして、セルロースモノアセテートを用いる場合は、水を単独（有機溶媒を含まずに）で溶媒として用いることができる。
　均一組成物は、その準備が完了したときから、脱アセチル反応が起こり始める。脱アセチル反応の速度は、均一組成物の温度を調整したり、塩基性化合物の種類やその濃度を調整したりすることで調整できる。
　前記組成物に含有させる水を含む溶媒については、水以外に有機溶媒を含ませる態様を挙げることができる。水と有機溶媒の比率については、当初セルロースアセテートが溶解し、反応によってゲル化を起こさせるものであれば、任意の割合を採用することができる。例えば、重量比で５：９５～９０：１０である態様を挙げることができる。
　水を含む溶媒として、前記の非特許文献３に報告されているＣＤＡに対するアセトン・水混合系、同じくジオキサン・水混合系を用いることも出来るが、これらの系に含まれる有機溶媒は、流動パラフィンにかなりの量が溶け込むことや、蒸気圧が高いことのため、分散処理の過程で温度以外の物質移動を伴なう要因で、予期しないゲル化を起こしやすいなど、扱いにくい。したがって、流動パラフィンなどの非極性液体に対しても溶解性が低く、かつ蒸発による濃度変化が起きにくいものであることが望ましく、そのような属性を持つ溶媒としては、ヘキサンのような飽和炭化水素に対して均一に混和しないものが好ましい。
　セルロースアセテート全般に対して溶解力が高く、且つ前記性質を備えた有機溶媒としては、非プロトン性極性溶媒といわれるものが多く該当し、ＤＭＳＯ、スルホラン、ジメチルスルホン、Ｎ－メチルピロリドン、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、Ｎ、Ｎ’－ジメチルホルムアミド、Ｎ、Ｎ’－ジメチルイミダゾリジノン、ヘキサメチルホスホロトリアミド、テトラメチルウレアなどのハロゲンを含有しない溶媒から選択される一種以上が例示される。その中でも、ＤＭＳＯ、Ｎ－メチルピロリドン、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミドから選ばれる１種以上を用いる態様を好ましく挙げることができる。
　多孔質セルロース媒体の製造における取り扱いやすさにおいて好ましい脱アセチル反応を起こさせる温度は、－１０～１００℃、更に好ましくは０～７０℃である。なお、塩基性物質として無機塩基を用いる場合、反応が必要以上に早く進まないようにするために、反応温度は－１０～５０℃の範囲で行わせる態様を挙げることができる。
　反応条件については、上記化合物が有する溶媒に対する溶解性、反応速度が異なるため、一義的に決めることはできないが、公知の方法を用いることができ、利用目的にふさわしい程度にアセチル基が除かれていればよい。
　脱アセチル化に要する時間、すなわち均一組成物がゲル化するまでの時間としては、１分～４８時間、好ましくは５分間～２４時間程度を挙げることができる。脱アセチル化に要する時間はできるだけ短い方が、分散液に分散させて粒子を得る場合、分散の安定性の観点から望ましい。
　反応終了後は、得られた多孔質セルロースに悪影響を及ぼさない溶媒で洗浄し、必要に応じて防腐剤を加える。
＜多孔質セルロース媒体の形状＞
　本発明の製造方法により製造される多孔質セルロース媒体は、球状粒子としてもモノリスとしても利用できる。球状粒子またはモノリスを作製する場合、上記の特定の組成物をセルロースアセテートについて脱アセチル化を起こさせ、ゲル化させる前に、形状を制御するためのプロセスが異なる。
　モノリスを製造するためには、任意形状を有する容器の中で前記均一組成物の相転移を起こさせるが、微粒子を製造するためには、通常、溶液状の均一組成物を、これと混和しない分散媒体の中に分散させた状態で温度変化させ、相転移を起こさせる。以下、これらの具体的な方法を簡単に説明する。
＜球状粒子＞
　本発明の球状多孔質セルロース粒子の製造方法としては、セルロースアセテートと、塩基性化合物と、水を含む溶媒とを含む流動性の均一組成物を、該均一組成物と混和しない分散媒体に分散させて分散液を得て、得られた分散液に含まれるセルロースアセテートの脱アセチル反応により、前記組成物をゲル化させることにより前記組成物から構成されるゲル化粒子を形成させる工程を含む態様を挙げることができる。
　また、前記工程の後に、得られたゲル化粒子を分離するための分離溶媒を、ゲル化粒子が形成された分散液に添加して、分離溶媒中にゲル化粒子を分離する工程を含んでもよい。
　本発明の球状多孔質セルロース粒子の製造方法においては、前記組成物を分散させるための分散媒体を用いる。本発明で用いることができる分散媒体としては、前記組成物中の水や有機溶媒と混和することによって前記組成物の意図しないゲル化や相転移温度の極端な変化を引き起こし、目的とする球状多孔質セルロース粒子の孔径に悪影響を与えるものでなければいかなるものであってもよい。
　前記組成物を分散させた際に、前記組成物が凝集することを防ぐために、分散媒体は、組成物の分散時にある程度の粘度を有していることが好ましい。分散媒体の粘度としては、２５℃において、０．２～２０Ｐａ・ｓを挙げることができる。
　分散媒体は、前記組成物に含まれる水や有機溶媒と混和しないように、非極性のものであることが好ましく、例えば、流動パラフィンやワセリンのような炭素数２０以上の炭化水素、シリコーンオイル、フッ素化炭化水素を挙げることができる。
　ワセリンは特定の軟化温度以下にすると速やかに流動性を失う。このため、分散させたゲル化液の粒子が再凝集して塊を作りやすい場合には、まず軟化温度以上で分散液を調製し、これをまず軟化温度以下に下げ、ゲル化液滴同士が移動、接触できなくし、粒子の収率を上げる目的に、ワセリンの使用は有効である。ワセリンの軟化温度は、その種類によって異なり、適宜選択することができる。
　組成物に含有させる塩基性化合物は、上記で説明したものを用いることができる。その含有量についても、セルロースアセテートのアセチル基に対する含有量として、上記で示した範囲を採用することができる。また、均一組成物における他の成分の含有量についても、＜本発明における組成物＞で示した上記範囲を用いることができる。
　本発明におけるセルロースアセテートを含む組成物は、分散媒体に分散させた後、脱アセチル化させてゲル化させるまでの間、分散状態を維持する必要がある。そのために、分散媒体に適当な分散安定剤を加えることが好ましい。
　分散安定剤は、前記組成物の分散状態の安定性を高め、組成物からなる粒子が凝集する速度を遅らせる効果があればいかなるものであってもよい。そのような分散安定剤として、グリセリン、ソルビタン、ポリグリセリン、ショ糖などの多価アルコールと高級カルボン酸とのエステル、極性基を少量含む変性シリコーンなどを挙げることができ、それ以外の市販されている分散安定剤も使用することができる。
　セルロースアセテートを含む前記組成物を、前記分散媒体に分散させる方法としては、すでに色々な方法を挙げることができ、広い範囲の粒子径分布を与えるものから単分散の粒子径を与えるものなど、様々である。例えば、一般的にマイクロリアクターと称されるものを用い、液状の分散媒体を適当な速度で流す中に、より細いノズルからゲル化した均一組成物を注入する方法は、粒子径がそろったものを作るのに適している。
　また、孔径の一定な膜から本発明の流動性の均一組成物を分散媒体中に押し出す方法、一定の大きさの孔を開けた内筒に、本発明の流動性の均一組成物を入れ、これを分散媒体中で回転させ、ゲル化した均一組成物を遠心力で押し出す方法、一定の大きさのビーズを充填したカラムの中に、必要に応じて分散安定剤を含む分散媒体と流動性の均一組成物を送液する方法、流動性の均一組成物を、振動ノズルを通して分散媒体中に注入する方法、（超）音波を用いる方法など、さまざまな方法を用いることができる。
　実施例においては、さまざまな粒子径の混合物を与えるが、もっとも簡単な撹拌による方法を例示する。これは、前記均一組成物を前記分散媒体に添加した後、前記組成物から構成される概ね球状の粒子を生成させるとともに、分散液滴となった均一組成物の脱アセチル化を起こさせ、ゲル化させるものである。撹拌混合の条件は、目的とする平均粒子径に応じて適宜選べばよい。
　分散媒体中で分散させた組成物は、１～４８時間、好ましくは１０～３０時間程度放置して、均一組成物から構成される粒子中で脱アセチル反応を進行させる態様を挙げることができる。
　なお、セルロースアセテートを含む前記組成物を前記分散媒体に添加する際の、前記分散媒体の温度については、前記組成物が液状を保つ温度にする態様を挙げることができる。具体的には、分散媒体の温度を５０～８０℃程度に設定する態様を挙げることができる。分散媒体をそのような温度に設定することで、前記組成物の撹拌混合が容易になる。前記均一組成物が流動性を保っている状態で、前記均一組成物を分散媒体に添加し、分散することが好ましい。
＜分離溶媒＞
　この後のプロセスは特に限定されるものではないが、本発明の実施例においては、分散媒体からゲル化したセルロース粒子を取り出すために分離溶媒を用いる態様を挙げることができる。例えば、ゲル化された前記組成物から構成される粒子のうち、セルロース粒子のみを分散媒体からゲル状粒子として分離させるために、分離溶媒を前記組成物が分散された分散媒体に添加する態様を挙げることができる。
　分離溶媒としては、分散媒体とは混和せず、ゲル化した前記組成物のうち、セルロースは溶解しないが、水および該組成物中に含まれてもよい有機溶媒とは混和するものを用いる。これにより、ゲル化した前記組成物のうち、セルロースがふたたび溶解することを防ぐことができる。
　このような分離溶媒としては、水、メタノール、エタノール、２－プロパノール、アセトアミド、ホルムアミド、またはこれらの混合物を挙げることができる。これらの中でも、取扱いの容易さから、水を用いる態様を挙げることができる。
　分散媒体中に分散した状態のセルロースのゲル粒子を直接ろ別することも出来るが、一般に分散媒体は粘度が高いため、ろ過において圧力がかかり、ゲル粒子を変形あるいは破壊する危険性が高くなる。分散媒体にこれと混和する低粘度の液体を加えることによってろ過時の圧力を下げることも可能である。
　得られた多孔質セルロース粒子は、水やエタノールなどを用いた適当な方法で洗浄し、通常水湿の状態で保存する。乾燥させる場合には糖類、グリセリンなどを適量加える。水湿で長期保存する場合には腐敗を防ぐためにアルコールやアジ化ナトリウムなどの防腐剤を加える。また、グリセリンや糖類、尿素などを加えた状態で乾燥することもできる。使用するときには、常法によってカラムに充填して用いる。
　本発明の製造方法により得られた多孔質セルロース粒子のうち、公知の適当な分級により、粒径（最大径）３０～３００μｍの略球状～球状の形状を有するものを選別して、それをクロマトグラフィー用の充填剤として用いることができる。クロマトグラフィーとしては、サイズ排除クロマトグラフィーを挙げることができる。
　サイズ排除クロマトグラフィーに利用できることは、とりもなおさず、適当なリガンドを結合することによって、サイズ排除以外のさまざまのモードによるクロマトグラフィー分離にも利用できることを示す。これらには、イオン交換、疎水性、アフィニティーなどのモードが含まれる。
　一般に、バイオテクノロジーで製造するような高分子、例えばホルモン、酵素、抗体医薬などを分離精製するには、それらの物質が十分進入できるような大きさの細孔を持つマトリクスが好ましい。すなわち、該粒子を充填したカラムを用い、水を移動相としてゲルろ過クロマトグラフィーを行うと、ポリエチレングリコールの分子量に換算して概ね１０3～１０7の範囲の何らかの分子量領域で分画が起きることが期待できる。
　実施例１のＧＰＣにおいて、分子量１０4～１０6の標準物質（ポリエチレングリコール）が異なった時間に溶出することは、本法によって作ることができるマトリクスの細孔径が、それら物質の分離精製に好適なものであることを示している。細孔の大きさは、ゲル化させる水を含む溶媒、セルロースアセテートを含む組成物中のセルロースアセテートの濃度を変えたり、ゲル化の条件（例えば、均一組成物の冷却速度の調整など）によって、微調整することができる。
　以下、アフィニティーのモードで用いる吸着体を作製する方法について説明する。アフィニティーリガンドとしては、タンパク質を用いることができる。本発明で用いることのできるタンパク質は、分子量３～３００ｋＤａ、好ましくは３０～１５０ｋＤａであって、分離対象とする例えば抗体のようなタンパク質に対して親和性のある物質が挙げられる。これらの中でも、アフィニティーリガンドとしてプロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ及びこれらの機能性変異体が抗体のタンパク質の分離に用いる際の選択率が高く好ましい。
　抗体の分離を主目的とする場合、リガンドとしては、免疫グロブリンの一部と特異的に結合可能なものが好ましい。上記機能性変異体は、天然アミノ酸配列において少なくとも１つの変性を有し、天然配列に伴われている少なくとも１つの機能をなお維持しているタンパク質を指す。天然配列には、本来自然に発生するアミノ酸配列が含まれる。アミノ酸の変化としては、１つ以上のアミノ酸の別のアミノ酸への置換、１つ以上のアミノ酸の削除および／または１つ以上のアミノ酸の追加またはこれらのいずれかの組合せを挙げることができる。天然配列に対して行われる追加、削除および置換の組合せのような態様も挙げられる。機能性変異体は、タンパク質の断片またはドメインを含むこともできる。機能性変異体のアミノ酸配列は、天然アミノ酸配列と少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９８％同一であってもよく、天然配列に伴われている少なくとも１つの機能をなお維持している。
　上記多孔質セルロース粒子に対するタンパク質の担持量は、多孔質セルロース粒子１００重量部に対して１．０～２５重量部であることが好ましい。また、多孔質セルロース粒子の体積１ｍｌあたり、１～５０ｍｇである態様を挙げることができる。
　本発明の製造方法で作製された多孔質セルロース媒体を製造する方法において、前記のアフィニティーリガンドを固定化する工程をさらに含ませることで、アフィニティーリガンドが結合した吸着体を作製することができる。この吸着体は、アフィニティークロマトグラフィー用の分離剤としても利用することができる。
　その製造工程としては、以下のような態様を挙げることができる。まず、前記の製造方法で製造された多孔質セルロース粒子について、架橋剤を用いて架橋反応を起こさせる工程を含んでもよい。架橋方法については特に制限されることはなく、例えば、エピクロロヒドリン、エピブロモヒドリン、ジクロロヒドリン等のハロヒドリンやビスオキシランやポリオキシランのような架橋剤を用いることができる。
　次に、架橋させたセルロース粒子について、活性化させる工程を含んでもよい。例えば、公知の反応性官能基を導入することにより、架橋させたセルロース粒子を活性化することができる。例えば、臭化シアン（ＣＮＢｒ）、Ｎ,Ｎ’－ジスクシンイミジル炭酸エステル（ＤＳＣ）、エポキシド及び活性化カルボン酸（ＮＨＳエステル）などで活性化することで、多孔質セルロース粒子が元々持っている官能基よりも、リガンドとして固定化する化合物が反応しやすい官能基に変えることができる。そして、その後、リガンドとして固定化する化合物と反応させて、リガンドと多孔質セルロース粒子を固定化する工程を経て、吸着体を製造する方法を挙げることができる。
　上記とは別に、吸着体の製造方法として、多孔質セルロース粒子とリガンドとして固定化する化合物が存在する系にカルボジイミドのような縮合試薬、または、グルタルアルデヒドのように分子中に複数の官能基を持つ試薬を加えて縮合、架橋することで、多孔質セルロース粒子とリガンドを固定化し、吸着体を得る方法が挙げられる。
　多孔質セルロース粒子とアフィニティーリガンドとを結合させる別の態様として、セルロース、セルロース粒子にホルミル基を導入して、そのホルミル基とタンパク質のアミノ基とを反応させる態様を挙げることができる。ホルミル基を導入する反応については、例えば、ビシナルの水酸基を持つ多糖類を、過ヨウ素酸酸化法によって酸化し、糖鎖上にホルミル基を生成させる方法を挙げることができる。
　また、エポキシ基の開環により得られるグリセリル基に、過ヨウ素酸塩を作用させる方法等により得られる各種スペーサーを介して、ホルミル基を導入する方法が挙げられる。例えば、スペーサーとしてグルコサミン等のようなアミノ糖を用いることができる。
　そして、多孔質セルロース粒子のホルミル基と、プロテインＡのようなタンパク質を結合させる方法としては、公知の方法を用いることができ、例えば、グルコサミン等のようなアミノ糖をスペーサーとして導入された多孔質セルロース粒子と、プロテインＡを含有する溶液とを反応させる態様を挙げることができる。そのような方法として例えば、特開２００８－２７９３６６号公報に記載の方法を挙げることができる。
＜モノリス＞
　モノリスは、多孔質素材を一体の塊としたものである。前記の粒子状充填剤を用いたクロマトグラフィーにおいては、展開液は粒子の微細孔をも通過するが、より多く粒子間間隙を通過する。これに対しモノリスにおいては一体の多孔質体の微細孔を通過させる。したがって、一般的に粒子状充填剤の場合に比べて固形分含量を低めにして、展開液の流れに対する抵抗を減らすようにする場合が多いが、ろ過材料として用いる場合を除けば本質的な分離のメカニズムは充填剤の場合とまったく変わりがない。
　本発明の多孔質セルロースモノリスの製造方法は、セルロースアセテートと、塩基性化合物と、水を含む溶媒とを含む流動性の均一組成物を成型容器に入れ、脱アセチル反応により、該成型容器内で均一組成物をゲル化させる工程を含む。この方法で用いるセルロースアセテート、塩基性化合物、水を含む溶媒は、球状粒子の作製に用いるものと同じものを使用できる。また、均一組成物における、各成分の含有量についても、球状粒子の作製に用いる条件と同じ条件を用いることができる。
　液体クロマトグラフィーにおいては、分離剤の中のどの部分においても同様な速さで展開液が移動し、いわゆるピストン流を作ることが極めて重要である。充填剤においては、個々の粒子の特性のばらつきが混合によって平均化されるため、多少の粒子間の性質の違いは許容され、しかし液の流れの大きい部分を担う粒子間空隙の均一性が重要となる。これには、充填剤をカラムと呼ばれる容器に充填する際の技術が重要となる。
　これに対してモノリスにおいては、生成する多孔質構造が、展開液の流れに対して直角の方向において均一であることと、モノリスと容器の間に液が流れやすい隙間ができないことが、きわめて重要である。ここで述べた直角方向において均一な多孔質体の調製は、ゲル化剤（沈殿剤）との接触や、公知技術である溶媒の蒸発によって行うことはできない。
　本発明のセルロースアセテートの脱アセチル反応によるゲル化を用いる方法は、ゲル化速度に比べて原料組成物の温度の均一化が速ければ、均一なゲルを与えることができるため、モノリスを調製するには好適である。
　モノリスを作製する際には、前記した塩基性化合物、水を含む溶媒及びセルロースアセテートを含む均一組成物を、任意形状の成型容器に投入し、その後、温度０～１００℃程度で１０分間～４８時間、好ましくは１～２４時間程度放置することで、セルロースアセテートの脱アセチル反応を起こさせて、その組成物からなるゲルを形成させ、これをそのまま、あるいは型から外した後に、適切な溶媒によって洗浄し、分離剤として用いることができる。一般に乾燥は、モノリスの形状の変形を起こしたり、微細孔構造を失わせる場合があるため、これを避けるが、適切な不揮発性添加剤を共存させれば可能となる。この不揮発性添加剤としては、グリセリン、蔗糖、トレハロース、水あめなどの糖や糖アルコール、各種アミド、ＤＭＳＯなどの極性化合物が適している。
　調製したモノリスを評価するには、すでに述べたように、適切な容器に隙間や局部的な圧密化がないように納める必要がある。このための方法は、公知のどのようなものであってもよい。通常、ゲル化によってモノリスが生成するときには、多少の収縮が起こり、容器との間に隙間ができることが多い。そのような場合、容器壁面をセルロース系物質と親和性の強い化学構造に修飾し（例えば表面にセルロースを結合する）、隙間ができないようにするか、あるいはゲルの環境変化による収縮・膨潤を利用し、あるいは容器のサイズを適合可能（アジャスタブル）にすることなどによって、隙間なく納めることが可能になる。
　また、調製したモノリスは、前述した球状粒子の場合と同様に、アフィニティーリガンドを結合させることで、アフィニティークロマトグラフィー用の分離剤や吸着体として利用することもできる。モノリスに結合できるアフィニティーリガンドは、球状粒子の場合と同様であり、アフィニティーリガンドの結合方法についても、球状粒子の場合と同じ方法を用いることができる。
　＜本発明の多孔質セルロース媒体をアフィニティーモードで用いて行う精製法＞
　上記で説明した、本発明の製造方法により作製された多孔質セルロース媒体に、アフィニティーリガンドを結合させて得られた吸着体を用いることで、様々な標的分子を生成する方法を提供することができる。
　標的分子としては、例えば免疫グロブリンのようなタンパク質を挙げることができる。免疫グロブリンとしては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体およびその機能的断片を挙げることができる。
　本発明の精製法は、以下のような工程を含む。本発明の製造方法により作製された多孔質セルロース媒体にアフィニティーリガンドを結合させて得られた吸着体と、標的物質を含む混合物とを接触させて、アフィニティーリガンドに標的物質を結合させる第一の工程と、吸着体のアフィニティーリガンドに結合した標的物質を分離する第二の工程を含む。
　吸着体のアフィニティーリガンドに結合した標的物質を分離する方法としては、第一の工程と第二の工程との間で、ｐＨを変化させることや、塩濃度を変化させることが挙げられる。具体的には、第一の工程のｐＨを６～８のような中性に設定し、第二の工程の６未満のような酸性に設定することが挙げられる。また、塩濃度については、第一の工程で０．１Ｍ未満とし、第二の工程では０．１Ｍ以上としたり、第一の工程で０．１Ｍ以上としていたものを、第二の工程で０．１Ｍ未満にすることを挙げることができる。
　以下に、実施例をあげて、本発明について更に詳細に説明を加えるが、本発明の範囲がかかる実施例にのみ限定されないことはいうまでもない。
＜実験例＞
脱アセチル反応によるゲル化の確認
　ＶＴＲセルロースジアセテート（酢化度　５４．７５％、６％アセトン溶液粘度０．１１７Ｐａ・ｓ（２５）℃）　１５．５ｇをＤＭＳＯ １７４．４ｇに溶解した。上記のセルロースジアセテートのＤＭＳＯ溶液 ３０．０ｇを６０℃に保ちながら、ヒドラジン一水和物　２．０ｇと水　２．１ｇ、ＤＭＳＯ ６．４ｇの混合溶液を加えよく混合した。この一部を４０℃で加温して１２時間後、ゲル化しているのを確認した。
＜実施例１：多孔質セルロース粒子の調製＞
　白色ワセリン（和光純薬（株）製　和光一級）３６０ｇ、乳化剤ＴＳＧ１０（日本エマルジョン製）０．６３ｇをセパラブルフラスコに入れ、オイルバスで７０℃に保ち溶融した。上記セルロースアセテートのＤＭＳＯ溶液３０．０ｇを６０℃に保ちながら、ヒドラジン一水和物　２．０ｇと水２．１ｇ、ＤＭＳＯ６．４ｇの混合溶液を加えよく混合した。上記セルロースジアセテート溶液を上記のセパラブルフラスコに加え、直径４ｃｍのディスパージャーを用い、約６００ｒｐｍで５分間攪拌した。得られた分散液を氷浴で４０℃まで冷却し分散液を固化させ、４０℃で２４時間静置し脱アセチル化してゲル化させた。分散液に水３００ｍＬを加え、７０℃に加温して分散液が溶解後、ゆっくりと攪拌して微粒子を抽出分液した。水相を分液後、再度水３００ｍＬを加えゆっくりと攪拌して抽出分液した。抽出した水相をガラスフィルターでろ過し、エタノール及び水で繰り返し洗浄した。得られた粒子を顕微鏡で確認した写真を図１に示すが、ほぼ真球に近い形状であることが判る。
＜実施例２：多孔質セルロース粒子の調製＞
　白色ワセリン（和光純薬（株）製　和光一級）７３３ｇ、乳化剤ＴＳＧ１０（日本エマルジョン製）１．１ｇをセパラブルフラスコに入れ、オイルバスで７０℃に保ち溶融した。実施例１で調製したセルロースジアセテートのＤＭＳＯ溶液 ６０．１ｇを６０℃に保ちながら、ヒドラジン一水和物　３．８ｇと水　８．８ｇ、ＤＭＳＯ ２６．９ｇの混合溶液を加えよく混合した。この混合溶液を上記のセパラブルフラスコに加え、直径８０ｍｍのディスパーサを挿入し、約４００ｒｐｍで５分間攪拌した。得られた分散液を氷浴で４０℃まで冷却し分散液を固化させ、４０℃で２４時間静置し脱アセチル化してゲル化させた。分散液に水３００ｍＬを加え、７０℃に加温して分散液が溶解後、ゆっくりと攪拌して微粒子を抽出分液した。水相を分液後、再度水２００ｍLを加えゆっくりと攪拌して抽出分液した。抽出した水相をガラスフィルターでろ過し、エタノール及び水で繰り返し洗浄した。得られた粒子の顕微鏡写真を図２に示した。得られた粒子の一部を３０％エタノール、５０％エタノール、７０％エタノール、９０％エタノール、エタノールで置換し、さらにｔ－ブチルアルコール／エタノール５／５、７／３、９／１、１０／０の混合液で置換した後、凍結乾燥処理した。凍結乾燥した粒子を電子顕微鏡写真で確認すると、多孔質の表面が認められた（図３）。
＜実施例３：多孔質セルロース粒子の調製＞
　ＶＴＲセルロースジアセテート（酢化度　５４．７５％、６％アセトン溶液粘度０．１１７Ｐａ・ｓ（２５）℃）　１５．３ｇをＤＭＳＯ １７２．４ｇに溶解した。
　白色ワセリン（和光純薬（株）製　和光一級）７３３ｇ、乳化剤ＴＳＧ１０（日本エマルジョン製）１．４ｇをセパラブルフラスコに入れ、オイルバスで７０℃に保ち溶融した。上記セルロースジアセテートのＤＭＳＯ溶液 ６０．６ｇを６０℃に保ちながら、ヒドラジン一水和物９．１ｇと水　１３．３ｇ、ＤＭＳＯ ４０．７ｇの混合溶液を加えよく混合した。この混合溶液を上記のセパラブルフラスコに加え、直径８０ｍｍのディスパーサを挿入し、約３２５ｒｐｍで５分間攪拌した。得られた分散液を氷浴で４０℃まで冷却し分散液を固化させ、４０℃で２４時間静置し脱アセチル化してゲル化させた。分散液に水３００ｍＬを加え、７０℃に加温して分散液が溶解後、ゆっくりと攪拌して微粒子を抽出分液した。水相を分液後、再度水２００ｍＬを加えゆっくりと攪拌して抽出分液した。抽出した水相をガラスフィルターでろ過し、エタノール及び水で繰り返し洗浄した。得られたセルロース粒子を水分散したままでステンレス製ふるい１５０μｍ、１０６μｍ、５３μｍによって分級した。５３μｍ～１０６μｍの部分の粒子をコンゴーレッドで染色した顕微鏡写真を図４に示した。凍結乾燥した粒子の電子顕微鏡写真を図５に示したように多孔質のセルロース粒子を確認した。
＜実施例４：セルロースモノアセテートを用いたセルロース粒子の作製＞
（１）セルロースモノアセテートの合成
　酢酸セルロース（株式会社ダイセル製　商品名「L-50」、アセチル総置換度：２．４３、６％粘度：　１１０mPa・s）１重量部に対して、５．１重量部の酢酸および２．０重量部の水を加え、混合物を３時間撹拌して溶解した。この溶液に０．１３重量部の硫酸を加え、得られた溶液を７０℃に保持し、加水分解を行った。１時間後に０．６７重量部の水を５分間にわたって加え、さらに２時間後、１．３３重量部の水を１０分にわたって加え、さらに６時間、反応を継続した。この後、反応液を２５℃に冷却、１５重量部のアセトン－メタノール　等容混合液を加えて沈殿を生成させ、これをろ布を用いて遠心脱液した。得られた固形分約１５重量％の溶媒含有ケーキに、原料酢酸セルロースに対し１４重量部相当の水を加え、撹拌し、沈殿を溶解した。得られた溶液の４倍重量に当るメタノールを溶液に加えると、再び沈殿が生じ、これを脱液回収した。さらに水を加えて溶解、メタノールを加えて沈殿、脱液回収する操作を２回繰り返した。得られた溶媒含有沈殿物を、その８重量部にあたる０．００４％炭酸カリウム含有メタノールに分散、脱液回収する操作を２回繰り返した後、５０℃で真空乾燥し、原料となるセルロースモノアセテートを得た。
（２）多孔質セルロース粒子の調製
　上記で得られたセルロースモノアセテート２．０ｇを水 １１．３ｇに溶解した。
　流動パラフィン（関東化学株式会社製　鹿１級）１３２ｇ、乳化剤SPAN８０（東京化成製）０．６７ｇをセパラブルフラスコに入れ、氷浴で冷やしながら混合した。氷浴で５～１０℃に冷却した上記セルロースモノアセテート水溶液 １１．７ｇ及び４重量％水酸化ナトリウム水溶液６．７ｇをよく混合し、速やかにこの混合溶液を上記のセパラブルフラスコに加え、直径４０ｍｍのディスパーサを挿入し、約３５０ｒｐｍで２分間攪拌した。得られた分散液を１０分間静置して脱アセチル化してゲル化させた。分散液に水１００ｍＬを加え、２５℃に加温し、ゆっくりと３時間攪拌して微粒子を抽出分液した。水相を分液後、再度水１００ｍＬを加えゆっくりと攪拌して抽出分液した。抽出した水相に、少量の水酸化カリウムを添加してゆっくりと拡販した後一晩静置した。酢酸を添加して中和し、２５μｍの篩を通過させた後、ガラスフィルターでろ過し、エタノール及び水で繰り返し洗浄した。得られたセルロース粒子を水分散したままでステンレス製ふるい１５０μｍ、１０６μｍ、５３μｍによって分級した。５３μｍ～１０６μｍの部分の粒子をコンゴーレッドで染色した顕微鏡写真を図６に示した。
＜実施例５＞
サイズ排除クロマトグラフィー
　実施例２及び３で作製したセルロース粒子を水分散したままでステンレス製ふるい１５０μｍ、１０６μｍ、５３μｍによって分級した。５３μｍ～１０６μｍの部分約７ｍＬを内径１０ｍｍ、高さ１００ｍｍのカラムに充填し、下記の要領で、超純水を移動相とし、表１に示す標準ポリエチレンオキシドのサンプルを注入し、示差屈折検出器により検出した。常法に従って描いた検量線を図７に示す。
使用カラム　HR10/100（GEヘルスケア）
　Tricorn10/100（GEヘルスケア）
　流量　0.10ml/min
　溶離液　超純水（脱気）
　標準物質　TSKgel 標準ポリエチレンオキシド（（株）東ソーより購入）
　各試料を超純水で２ｍｇ/ｍLに希釈した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 　各標準物質の分配係数（Kav）を次式で算出した。
　Ｋａｖ＝（Ｖｅ－Ｖ０）／（Ｖｔ－Ｖ０）
　Ｖｅはサンプルの保持容量（ｍＬ）、Ｖｔは空カラム体積（ｍＬ）、Ｖ0はSE－150の保持　　容量（ｍL）
＜実施例６＞
（１）架橋多孔質セルロース粒子の調製
　１００ｍＬ三口フラスコに、実施例３で得られた多孔質セルロース粒子１０ｍＬ、硫酸ナトリウム １０．６ｇを水２８．８ｇに溶解した液を加え、５０℃で撹拌した。４５重量％水酸化ナトリウム水溶液０．３７ｇと水素化ホウ素ナトリウム６０ｍｇを加え、撹拌した。４５重量％水酸化ナトリウム水溶液５．４２ｇとエピクロロヒドリン５．５５ｇとをそれぞれ１０等分した量を３０分おきにおよそ５時間かけて添加した。添加終了後、５０℃で１９時間反応させた。４０℃以下に冷却した後、酢酸０．６２ｇを加え、中和した。反応混合物をろ過して粒子を回収し、純水でろ過洗浄し、目的の架橋多孔質セルロース粒子を得た。
（２）架橋多孔質セルロース粒子へのプロテインＡ固定化とカラム作製
　（１）で得られた架橋多孔質セルロース粒子をグラスフィルターでろ別し、アセトニトリルで洗浄して、担体３．３ｍＬを得た。フラスコに担体を移液し、アセトニトリル２．５ｍＬと炭酸ジ(N-スクシンイミジル)［N,N'-Disuccinimidyl carbonate］５５ｍｇを含むアセトニトリル溶液１０ｍＬを加え、４℃、１８０ｒｐｍで振とうした。次いでＮ，Ｎ－ジメチルアミノピリジン４０ｍｇを含むアセトニトリル溶液１ｍＬを加え１８時間振とうして反応させた。グラスフィルターでろ別して、アセトニトリル３０ｍＬ、５％酢酸を含むジオキサン３０ｍＬ、メタノール３０ｍＬ、2-プロパノール３０ｍＬの順に洗浄して活性化担体を得た。活性化担体１ｍＬをグラスフィルターに採取してカップリング緩衝液(０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０)で洗浄した。活性化担体をフラスコに移し、プロテインＡ（rSPA、Repligen）が５３．６ｍｇ／ｍＬのプロテインＡ含有溶液を１６８μＬ、カップリング緩衝液を２ｍＬ加え、５℃、１３０ｒｐｍで２２時間振とうして固定化した。グラスフィルターでろ別し、カップリング緩衝液で洗浄した。反応後のろ液をBradFord法で測定した結果、プロテインＡが担体１ｍＬあたり９．０ｍｇ固定化されていることがわかった。次いでフラスコに担体を移し、１Ｍトリス塩酸（ｐＨ８）２ｍＬを加え、２５℃、１３０ｒｐｍで２時間振とうして未反応活性基をマスクした。グラスフィルターでろ別し、洗浄液１（０．１Ｍトリス塩酸、０．５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ８．０）、洗浄液２（０．１Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液、０．５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ４．０）を交互に３サイクル洗浄した。固定化担体１ｍＬを純水で洗浄し、Tricorn 5/50 Columnにパッキングした。またSepharose 4FastFlow(GE Healthcare)も同様の操作でカラムを作製した(プロテインＡ固定化量10mg/mL-gel)。
（３）プロテインＡ固定化カラムの抗体吸着容量
　（２）で作製したプロテインＡ固定化カラムを液体クロマトグラフィー装置AKTA　explore(GE Healthcare Bioscience)にセットし、吸着緩衝液（２０ｍＭリン酸緩衝液、150mM塩化ナトリウム、ｐＨ７．２)を１ｍＬ／ｍｉｎ.もしくは０．４ｍＬ／ｍｉｎ.の条件で流し平衡化させた後、１ｍｇ／ｍＬに調製したヒト血清由来γ-globulin（和光純薬）を注入した。溶出液の２８０ｎｍにおける吸光度の１５％に到達するまで注入を続けた後、吸着緩衝液で洗浄後、吸着緩衝液を２０ｍＭクエン酸（ｐＨ２．４）へ置換し吸着成分を溶出した。
　動的吸着容量（ＤＢＣ）は、溶出液の２８０ｎｍにおける非吸着成分を除いた吸光度が注入サンプルの吸光度の１０％に到達するまでに注入されたサンプル量から計算された。各固定化カラムのＤＢＣを表２に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　本発明の製造方法では、セルロースアセテートを含む特定の組成物が脱アセチル反応によりゲル化が起こる性質を利用して多孔質セルロースアセテート媒体の製造を行う。
　これにより、セルロースアセテートのゲル化の過程において、細孔の大きさが均一になる。このことは、従来の多孔質セルロース媒体の製造方法において、細孔の形成の過程で溶媒の蒸発を起こさせ、物質の移動を生じさせる態様とは異なる。また、本発明の製造方法によれば、得られる多孔質セルロース媒体の細孔の大きさは数千Å程度の大きなものとなる。本発明の製造方法により得られた多孔質セルロース媒体の硬度は、従来から存在する市販品と同程度である。本発明の製造方法により得られた多孔質媒体は、その形状が球状粒子であっても、モノリスであっても、吸着体や分離剤として有用である。特に、アフィニティーリガンドを結合した吸着体は、様々な標的物質の分離に用いることができる。

Claims (10)

  1. 　セルロースアセテートと、塩基性化合物と、水を含む溶媒とを含む流動性の均一組成物を準備し、セルロースアセテートの脱アセチル反応により、当該組成物をゲル化させる工程を含む、多孔質セルロース媒体の製造方法。
  2. 　セルロースアセテートと、塩基性化合物と、水を含む溶媒とを含む流動性の均一組成物を、該均一組成物と混和しない分散媒体に分散させて分散液を得て、得られた分散液に含まれるセルロースアセテートの脱アセチル反応により前記組成物をゲル化させることにより、前記組成物から構成されるゲル化粒子を形成させる工程を含む、球状多孔質セルロース粒子の製造方法。
  3. 　前記工程の後に、得られたゲル化粒子を分離するための分離溶媒を、ゲル化粒子が形成された分散液に添加して、分離溶媒中にゲル化粒子を分離する工程を含む、請求項２に記載の球状多孔質セルロース粒子の製造方法。
  4. 　前記分離溶媒が水、メタノール、エタノール、２－プロパノール、アセトアミド、ホルムアミド、またはこれらのうち少なくとも２種の混合物である請求項３に記載の製造方法。
  5. 　セルロースアセテートと、塩基性化合物と、水を含む溶媒とを含む流動性の均一組成物を成型容器に入れ、セルロースアセテートの脱アセチル反応により、該成型容器内で均一組成物をゲル化させる工程を含む多孔質セルロースモノリスの製造方法。
  6. 　前記均一組成物における水を含む溶媒が有機溶媒を含み、該有機溶媒が、水と混和し、飽和炭化水素と混和しないものであることを特徴とする請求項１～５のいずれか一項に記載の製造方法。
  7. 　前記有機溶媒が、非プロトン性極性溶媒である、請求項６に記載の製造方法。
  8. 　請求項１に記載の製造方法を用いて得られた多孔質セルロース媒体、請求項２～４のいずれか一項に記載の製造方法を用いて得られた球状多孔質セルロース粒子、または請求項５に記載の製造方法を用いて得られた多孔質セルロースモノリスに、アフィニティーリガンドを固定化する工程を含む、吸着体の製造方法。
  9. 　前記アフィニティーリガンドが、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ及びこれらの機能性変異体から選ばれる一種以上である、請求項８に記載の吸着体の製造方法。
  10. 　請求項８または９に記載の吸着体と、標的物質を含む混合物とを接触させて、吸着体に固定化されたアフィニティーリガンドに標的物質を結合させる第一の工程と、吸着体のアフィニティーリガンドに結合した標的物質を分離する第二の工程を含む、標的物質の精製法。
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