WO2016159068A1 - マイクロウェルアレイ及びその製造方法、マイクロ流体デバイス、マイクロウェルアレイのウェル内に水性液体を封入する方法及び水性液体の分析方法 - Google Patents

マイクロウェルアレイ及びその製造方法、マイクロ流体デバイス、マイクロウェルアレイのウェル内に水性液体を封入する方法及び水性液体の分析方法 Download PDF

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wells
hydrophobic
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圭佑 後藤
牧野　洋一
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Toppan Printing Co Ltd
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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
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    • B81B1/00—Devices without movable or flexible elements, e.g. microcapillary devices
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B81—MICROSTRUCTURAL TECHNOLOGY
    • B81C—PROCESSES OR APPARATUS SPECIALLY ADAPTED FOR THE MANUFACTURE OR TREATMENT OF MICROSTRUCTURAL DEVICES OR SYSTEMS
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    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
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    • C12M1/34—Measuring or testing with condition measuring or sensing means, e.g. colony counters
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    • G—PHYSICS
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    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N37/00—Details not covered by any other group of this subclass

Definitions

  • the present invention relates to a microwell array and a manufacturing method thereof, a microfluidic device, a method for enclosing an aqueous liquid in the wells of the microwell array, and a method for analyzing an aqueous liquid.
  • microwell arrays having various types of fine channel structures formed by using etching techniques, photolithography techniques, and the like used in semiconductor circuit manufacturing techniques have been studied.
  • the wells of these microwell arrays are used as chemical reaction vessels for causing various biochemical or chemical reactions in a small volume of fluid.
  • Patent Documents 1 to 4 describe the use of such a microfluidic system as various microchips and biochips.
  • digital PCR technology involves PCR amplification by dividing a mixture of a reagent and nucleic acid into countless microdroplets so that a signal such as fluorescence can be detected from the droplet containing nucleic acid. This is a technique for performing quantification by counting the number of detected droplets.
  • a method for producing a microdroplet As a method for producing a microdroplet, a method for producing a microdroplet by dividing with a sealing liquid, or a reagent is put into a hole formed on a substrate, and then a microdroplet is made by adding a sealing liquid.
  • a manufacturing method (see, for example, Patent Document 4) has been studied.
  • the microwell array according to the first aspect of the present invention includes a plurality of wells having a hydrophilic portion and a hydrophobic portion on the well surface.
  • the capacity of each of the plurality of wells may be 1 fL to 6 nL.
  • the density of the plurality of wells may be 100,000 to 10 million / cm 2 .
  • the plurality of wells may have the hydrophobic portion at the top of the well and have the hydrophilic portion at a position closer to the well bottom than the hydrophobic portion.
  • the plurality of wells may be provided on a substrate that is transparent to electromagnetic waves.
  • the electromagnetic waves may be X-rays, ultraviolet rays, visible rays, or infrared rays.
  • the substrate may be formed of a material that does not substantially have autofluorescence.
  • the contact angle of the hydrophilic portion measured in accordance with the sessile drop method defined in JIS R3257-1999 may be less than 70 degrees.
  • the hydrophilic portion may be formed of a siloxane polymer.
  • the contact angle of the hydrophobic part measured according to the sessile drop method defined in JIS R3257-1999 may be 70 degrees or more.
  • the hydrophobic portion may be formed of a novolac resin.
  • the microfluidic device includes a flow path and the microwell array according to the above aspect disposed in the flow path.
  • a method for enclosing an aqueous liquid in a well by preparing a microfluidic device including a flow path and the microwell array according to the above aspect disposed in the flow path.
  • An aqueous liquid is sent to the flow path of the fluidic device, the aqueous liquid is introduced to the well of the microwell array, a sealing liquid is sent to the flow path, and the aqueous liquid introduced into the well A sealing liquid layer is formed on the upper layer, and the aqueous liquid is sealed in the well.
  • the method for producing a microwell array according to the fourth aspect of the present invention includes forming a hydrophilic layer by laminating a hydrophilic material on a substrate having electromagnetic wave permeability, and laminating a hydrophobic material on the hydrophilic layer. Forming a layer and drilling the hydrophobic layer to form a plurality of wells;
  • the plurality of wells may be formed by excavating the hydrophobic layer and the hydrophilic layer.
  • the method for analyzing an aqueous liquid according to the fifth aspect of the present invention detects the fluorescence or phosphorescence emitted from the well by irradiating electromagnetic waves to the wells of the microwell array according to the above aspect in which the aqueous liquid is enclosed.
  • the fluorescence or the phosphorescence may be detected on the substrate of the microwell array according to the above aspect.
  • a microwell array in which an aqueous liquid can be easily sealed in a well.
  • the manufacturing method of the microwell array which concerns on the said aspect, a microfluidic device, the method of enclosing aqueous liquid in the well of a microwell array, and the analysis method of aqueous liquid can be provided.
  • FIG. 1A is a perspective view showing a microfluidic device according to a second embodiment.
  • 1B is a cross-sectional view taken along line bb in the microfluidic device of FIG. 1A.
  • 1C is a cross-sectional view taken along line cc of the microfluidic device of FIG. 1A.
  • FIG. 2A is a perspective view showing a microfluidic device according to a third embodiment.
  • 2B is a cross-sectional view taken along line bb in the microfluidic device of FIG. 2A.
  • 2C is a cross-sectional view taken along line cc in the microfluidic device of FIG. 2A. It is sectional drawing which shows the structure of the microwell array concerning 5th Embodiment.
  • FIG. 6 is a cross-sectional view showing the structure of a microwell array of Comparative Example 1.
  • FIG. It is sectional drawing which shows the state which enclosed the aqueous liquid in the microwell array of the microfluidic device of Experimental example 1.
  • FIG. It is a photograph which shows the result of having observed the microwell array of the microfluidic device of Experimental example 1 from the board
  • FIG. It is sectional drawing which shows the state which enclosed the aqueous liquid in the microwell array of the microfluidic device of Experimental example 2.
  • FIG. It is a photograph which shows the result of having observed the microwell array of the microfluidic device of Experimental example 2 from the board
  • the first embodiment of the present invention provides a microwell array comprising a plurality of wells having a hydrophilic portion and a hydrophobic portion on a well surface.
  • enclosing the aqueous liquid means introducing the aqueous liquid into a plurality of wells constituting the microwell array, and further isolating the liquids introduced into the wells so as not to be mixed with each other.
  • the isolation method include forming an oil layer on the upper portion of the well after introducing an aqueous liquid into the well.
  • microwell array it is possible to easily enclose an aqueous liquid in 90% or more, for example, 95% or more, for example, 99% or more, for example, 100%, of the plurality of wells constituting the microwell array. .
  • the volume per well is, for example, 1 femtoliter (fL) to 6 nanoliters (nL), preferably 1 fL to 5 picoliters (pL), and more preferably Is 1 fL to 300 fL.
  • an enzymatic reaction such as digital PCR or invader reaction can be suitably performed.
  • gene mutation detection can be performed by the digital PCR.
  • the reaction volume is smaller even if the number of wells is the same.
  • the material of the microwell array is preferably a material that does not inhibit the enzyme reaction.
  • the shape and size of the wells of the microwell array are not particularly limited. For example, when various biochemical reactions are performed in microdroplets, one to several biomolecules or carriers can be accommodated. It preferably has a shape and size.
  • the carrier may be a bead, for example, and a biomolecule as a sample may be bound to the carrier.
  • the shape of the well is, for example, a cylindrical shape, a polyhedron composed of a plurality of surfaces (eg, rectangular parallelepiped, hexagonal prism, octagonal prism, etc.), inverted cone, inverted pyramid (inverted triangular pyramid, inverted quadrangular pyramid, inverted A pentagonal pyramid, an inverted hexagonal pyramid, an inverted polygonal pyramid with a heptagon or more), or a combination of two or more of these shapes.
  • a cylindrical shape a polyhedron composed of a plurality of surfaces (eg, rectangular parallelepiped, hexagonal prism, octagonal prism, etc.), inverted cone, inverted pyramid (inverted triangular pyramid, inverted quadrangular pyramid, inverted A pentagonal pyramid, an inverted hexagonal pyramid, an inverted polygonal pyramid with a heptagon or more), or a combination of two or more of these shapes.
  • a part may be cylindrical and the rest may be an inverted cone.
  • the bottom of the cone or pyramid is the entrance (opening) of the well, but the reverse cone shape or the inverted pyramid shape may be partially cut off from the top. .
  • the bottom of the microwell is flat.
  • the bottom of the microwell is usually flat, but may be a curved surface (convex surface or concave surface).
  • the bottom of the microwell can be curved as in the case of a shape obtained by cutting a part from the top of an inverted cone or inverted pyramid.
  • the diameter When the well is cylindrical, the diameter may be 3 to 10 ⁇ m for the purpose of enclosing an aqueous liquid containing biomolecules.
  • the depth may be 3 to 10 ⁇ m.
  • the size of a carrier such as a bead to which a biomolecule is attached, and a suitable ratio between the dimensions of the well, etc., the size of the well is one per microwell, or It is determined appropriately so that several biomolecules are accommodated.
  • the detection target to be detected using the microwell array according to the present embodiment may be, for example, a sample collected from a living body such as blood, a PCR product, or the like, or an artificially synthesized compound or the like.
  • the well may have a shape and size that allow one molecule of DNA to enter.
  • biomolecules include proteins, RNA (including RNA such as miRNA, mtRNA, tRNA), sugars, and amino acids (including peptides).
  • the density of a plurality of wells is, for example, 100,000 to 10 million pieces / cm 2 , preferably 100,000 to 5 million pieces / cm 2 , and more preferably 100,000. ⁇ 1 million pieces / cm 2 .
  • the density of the well is in such a range (100,000 to 10,000,000 / cm 2 )
  • the presence ratio of the mutation to be detected to the wild type is about 0.01%, about 100,000 to 5 million pieces / cm 2 , more preferably 100,000 to 1 million.
  • the number of cells / cm 2 is present, rapid measurement is possible even if all wells are detected without impairing the detection accuracy.
  • each well (out of a plurality of wells) has the hydrophobic portion at the top of the well, and the hydrophilic portion is positioned closer to the well bottom (bottom side) than the hydrophobic portion. It is preferable to have a sex part. As will be described later, the inventors have found that such a configuration makes it very easy to enclose an aqueous liquid in the wells of the microwell array.
  • the above-mentioned hydrophilic part (material of the hydrophilic part) may have a contact angle of less than 70 degrees measured according to the sessile drop method defined in JIS R3257-1999.
  • being hydrophilic means that the contact angle measured according to the sessile drop method defined in JIS R3257-1999 is less than 70 degrees.
  • the hydrophobic part (the material of the hydrophobic part) may have a contact angle of 70 degrees or more measured according to the sessile drop method defined in JIS R3257-1999.
  • being hydrophobic means that the contact angle measured according to the sessile drop method specified in JIS R3257-1999 is 70 degrees or more.
  • hydrophilic resin The resin forming the hydrophilic portion (hereinafter sometimes referred to as “hydrophilic resin”) is not particularly limited as long as the effect of the present invention is exerted. Examples thereof include resins having a group. Examples of the hydrophilic group include a hydroxyl group, a carboxyl group, a sulfone group, a sulfonyl group, an amino group, an amide group, an ether group, and an ester group.
  • a siloxane polymer an epoxy resin; a polyethylene resin; a polyester resin; a polyurethane resin; a polyacrylamide resin; a polyvinylpyrrolidone resin; an acrylic resin such as a polyacrylic acid copolymer; a cationized polyvinyl alcohol, a silanolated polyvinyl alcohol, Polyvinyl alcohol resins such as sulfonated polyvinyl alcohol; polyvinyl acetal resins; polyvinyl butyral resins; polyethylene polyamide resins; polyamide polyamine resins; cellulose derivatives such as hydroxymethyl cellulose and methyl cellulose; polyalkylenes such as polyethylene oxide and polyethylene oxide-polypropylene oxide copolymers Oxide derivatives; maleic anhydride copolymer; ethylene-vinyl acetate copolymer; At least one resin having a contact angle of less than 70 degrees measured according to the sessile drop method specified in JIS R3257-1999 is
  • the hydrophilic resin may be a thermoplastic resin, a thermosetting resin, a resin curable by an active energy ray such as an electron beam or UV light, or an elastomer. .
  • the hydrophilic layer may also have a function of bringing the substrate and the hydrophobic layer into close contact when a substrate described later is present.
  • the hydrophilic layer may be formed by applying a thermosetting silane coupling agent or the like to the substrate and thermally curing to form a siloxane polymer.
  • hydrophobic resin The resin that forms the hydrophobic portion (hereinafter sometimes referred to as “hydrophobic resin”) is not particularly limited as long as the effects of the present invention are exhibited.
  • novolak resin acrylic resin; methacrylic resin; styrene resin; Polyvinyl resin; Polyamide resin; Polyacetal resin; Polycarbonate resin; Polyphenylene sulfide resin; Polysulfone resin; Fluorine resin; Silicone resin; Yuria resin; Melamine resin; Any of the above resin combinations can be appropriately selected from at least one resin having a contact angle of 70 degrees or more measured according to the sessile drop method defined in JIS R3257-1999. .
  • the hydrophobic resin may be a thermoplastic resin, a thermosetting resin, a resin curable by an active energy ray such as an electron beam or UV light, or an elastomer. .
  • the hydrophobic portion may be formed of a resist, for example.
  • the resist may be a photoresist from the viewpoint of easily forming a fine structure.
  • the photoresist may be, for example, a photosensitive novolac resin.
  • the microwell array according to this embodiment may be formed on a substrate.
  • the substrate may be a substrate having electromagnetic wave permeability or a substrate having no electromagnetic wave permeability.
  • examples of the electromagnetic wave include X-rays, ultraviolet rays, visible rays, and infrared rays.
  • electromagnetic waves can be used to analyze the results of experiments performed on the microwell array. For example, fluorescence, phosphorescence, and the like generated as a result of irradiation with electromagnetic waves can be measured from the substrate side (via the substrate and on the substrate).
  • the fluorescence and phosphorescence include light having different wavelengths at the time of irradiation and detection (wavelengths are converted).
  • wavelength conversion include a case where fluorescence or phosphorescence in the visible light region is generated as a result of irradiation with ultraviolet light, and a case where fluorescence or phosphorescence in the infrared region is generated as a result of irradiation with visible light.
  • a fluorescence microscope can be used.
  • the electromagnetic wave may be irradiated, for example, from the substrate side (to the substrate), or may be irradiated, for example, from the entrance side of the well (to the entrance of the well).
  • Examples of the substrate having electromagnetic wave permeability include glass and resin.
  • Examples of the resin substrate include ABS resin, polycarbonate resin, COC (cycloolefin copolymer), COP (cycloolefin polymer), acrylic resin, polyvinyl chloride, polystyrene resin, polyethylene resin, polypropylene resin, polyvinyl acetate, and PET (polyethylene). Terephthalate), PEN (polyethylene naphthalate) and the like. These resins may contain various additives, and a plurality of resins may be mixed.
  • the substrate does not substantially have autofluorescence.
  • substantially having no autofluorescence means that the substrate has no autofluorescence of the wavelength used for detection of the experimental results, or even if it has autofluorescence, the detection of the experimental results is affected. It means that it is so weak as not. For example, if the autofluorescence is about 1/10 or less and 1/100 or less as compared with the fluorescence to be detected, it can be said that it is so weak that it does not affect the detection of the experimental result.
  • quartz glass As a material that has electromagnetic wave transparency and does not emit autofluorescence at all, for example, quartz glass can be cited.
  • materials that have weak autofluorescence and that do not interfere with detection of experimental results using electromagnetic waves include low fluorescent glass, acrylic resin, COC (cycloolefin copolymer), and COP (cycloolefin polymer).
  • fluorescent substances such as fluorescent dyes, FRET (fluorescence resonance energy transfer), reaction of fluorescently labeled avidin and streptavidin, enzyme reaction using horseradish peroxidase, FRET such as Invader (registered trademark) method
  • FRET fluorescent resonance energy transfer
  • Invader registered trademark
  • the observation of the fluorescence emitted from the biomolecule accommodated in the well can be performed from the substrate side of the microwell array (via the substrate and from the substrate) using, for example, an inverted microscope.
  • the number of target molecules can be specified by counting the number of microwells emitting predetermined fluorescence.
  • the biomolecule may be treated with a fluorescent label that specifically labels the target molecule before being accommodated in the well.
  • the bead is accommodated in the well and brought into contact with a fluorescent label capable of specifically labeling the target molecule, and the target molecule is placed in the well. May be fluorescently labeled.
  • the thickness of the substrate can be appropriately determined.
  • the fluorescence is observed from the substrate side (on the substrate) using a fluorescence microscope, it is, for example, 5 mm or less, for example, 2 mm or less, for example, 1.6 mm or less. Is preferred.
  • Turbidity can be used in addition to fluorescence. Turbidity can be measured, for example, by the transmittance of light having a wavelength of about 400 to 1000 nm in the detection target.
  • Microfluidic device One embodiment of the present invention provides a microfluidic device comprising a flow path and the above-described microwell array disposed in the flow path. By using such a microfluidic device, it becomes easy to enclose an aqueous liquid in the wells of the microwell array.
  • FIG. 1A is a perspective view showing a microfluidic device according to a second embodiment.
  • 1B is a cross-sectional view taken along line bb in the microfluidic device of FIG. 1A.
  • 1C is a cross-sectional view taken along line cc of the microfluidic device of FIG. 1A.
  • the microfluidic device 1000 includes a bottom member 1100, a lid member 1200, a flow channel 1300, a flow channel inlet 1210 provided at one end (first end) of the flow channel 1300, and the flow channel 1300.
  • a flow path outlet 1220 provided at the other end (second end), a sealing member 1400 that forms part of the inner wall of the flow path 1300, and a microwell array m disposed inside the flow path 1300 are provided.
  • the fluid may be introduced from the channel inlet 1210 and discharged from the channel outlet 1220 using a syringe or the like.
  • the microwell array m is provided inside the flow path 1300.
  • the structure of the microwell array m will be described later.
  • the substrate 1100 of the microwell array m and the bottom member 1100 of the microfluidic device 1000 may be integrated. Further, the hydrophilic layer 1120 and the hydrophobic layer 1130 of the microwell array m may be integrally formed on the bottom member 1100 of the microfluidic device 1000. That is, the microwell array m may be formed on the bottom member 1100 of the microfluidic device 1000.
  • the same material as that of the substrate of the microwell array described above can be used.
  • the material of the sealing member 1400 is not particularly limited.
  • a double-sided pressure-sensitive adhesive tape in which an acrylic pressure-sensitive adhesive is laminated on both sides of a core material film formed of silicone rubber or acrylic foam, or an adhesive is laminated.
  • spacer members resin, metal, paper, inorganic materials such as glass
  • these sealing members those which do not easily react with the liquid to be fed can be appropriately selected.
  • what coated the surface of the sealing member so that it may become difficult to react with the liquid sent can also be employ
  • a double-sided adhesive tape was used.
  • FIG. 2A is a perspective view showing a microfluidic device according to a third embodiment of the present invention.
  • 2B is a cross-sectional view taken along line bb in the microfluidic device of FIG. 2A.
  • 2C is a cross-sectional view taken along line cc in the microfluidic device of FIG. 2A.
  • the microfluidic device 2000 has a configuration in which a part of the flow channel 1300 is enlarged in a plan view of the microfluidic device 1000 according to the first embodiment described above.
  • the microwell array m (second microwell array m-2) in the microfluidic device 2000 has a larger area in plan view than the microwell array m in the microfluidic device 1000.
  • Other configurations of the microfluidic device 2000 are the same as those of the microfluidic device 1000.
  • plan view means a state in which the microfluidic device or the microwell array is viewed from a direction perpendicular to the bottom member of the microfluidic device or the substrate of the microwell array.
  • a microfluidic device including a flow path and the microwell array according to the above-described embodiment disposed in the flow path is prepared, and the flow path of the microfluidic device is aqueous. Liquid is fed, the aqueous liquid is introduced into the wells of the microwell array, the sealing liquid is fed into the flow path, and the sealing liquid layer is formed on the upper layer of the aqueous liquid introduced into the well.
  • a method is provided for encapsulating an aqueous liquid within a well of a microwell array, wherein the aqueous liquid is encapsulated within the well.
  • the aqueous liquid means water, a biological sample such as a buffer solution containing a biomolecule to be detected, an enzyme reaction solution, or the like.
  • the biological sample is generally an aqueous liquid.
  • the aqueous liquid may be, for example, a PCR reaction solution containing a biological sample as a template and SYBR Green as a detection reagent.
  • an additive such as a surfactant may be contained in the aqueous liquid. By adding a surfactant to the aqueous liquid, the aqueous liquid can be easily enclosed in the wells of the microwell array.
  • the sealing liquid means a liquid used for isolating the liquid introduced into each well (among a plurality of wells) of the microwell array so that they are not mixed with each other.
  • oils are used. Can do.
  • the oil for example, trade name “FC40” manufactured by Sigma, trade name “HFE-7500” manufactured by 3M, mineral oil used for PCR reaction, or the like can be used.
  • FC40 trade name “FC40” manufactured by Sigma
  • HFE-7500” manufactured by 3M mineral oil used for PCR reaction, or the like
  • mineral oil used for PCR reaction, or the like can be used.
  • mineral oil used for PCR reaction, or the like can be used in a conventional microwell array.
  • mineral oil In a conventional microwell array, it may be difficult to use mineral oil as a sealing liquid.
  • an aqueous liquid is added to the well. Can be enclosed.
  • the sealing liquid preferably has a contact angle of 5 to 80 degrees with respect to the material of the hydrophobic layer of the microwell array.
  • the contact angle of the sealing liquid is within this range (5 to 80 degrees)
  • the aqueous liquid can be sealed in the wells of the microwell array.
  • the contact angle of the sealing liquid may be measured using a sealing liquid instead of water, for example, according to the sessile drop method defined in JIS R3257-1999.
  • a liquid other than the specific oil described above can also be used as the sealing liquid by appropriately selecting the combination of the material forming the hydrophobic layer of the microwell array and the sealing liquid.
  • an aqueous liquid such as a PCR reaction solution or an invader reaction solution is fed from the flow channel inlet 1210 of the microfluidic device 1000 using a syringe, a micropipette, or the like.
  • an aqueous liquid is introduced into each well of the microwell array m arranged inside the flow path 1300.
  • the sealing liquid is fed into the microfluidic device 1000 from the flow path inlet 1210 using a syringe or the like.
  • a sealing liquid layer is formed in the vicinity of the well entrance of each well of the microwell array m arranged in the flow path 1300, and the aqueous liquid is sealed in the well. Since the microwell array m has the above-described configuration, an aqueous liquid can be easily enclosed in each well of the microwell array m by the method of the present embodiment.
  • an enzyme reaction such as a PCR reaction or an invader reaction can be performed using a thermal cycler or the like.
  • a hydrophilic material is formed on a substrate having electromagnetic wave permeability to form a hydrophilic layer, and a hydrophobic material is formed on the hydrophilic layer to form a hydrophobic layer.
  • a method of manufacturing a microwell array is provided in which a layer is drilled to form a plurality of wells.
  • FIG. 3 is a cross-sectional view showing the structure of the microwell array 100 according to the fifth embodiment.
  • the hydrophilic layer 120 is formed on the surface 115 of the substrate 110.
  • the substrate 110 may be a glass substrate, for example.
  • the hydrophilic layer 120 may be, for example, a siloxane polymer formed from a silane coupling agent or a curable resin.
  • the hydrophilic layer 120 is formed by applying the curable resin onto the substrate 110 and curing it by heat treatment or the like.
  • a silane coupling agent may be added to the curable resin.
  • the adhesion of the hydrophilic layer 120 to the substrate 110 is improved.
  • a hydrophobic resin as a material for the hydrophobic layer 130 is applied on the hydrophilic layer 120.
  • a photoresist may be used as the hydrophobic resin.
  • a photoresist is applied on the hydrophilic layer 120 by spin coating or the like. After the spin coating, the photoresist is prebaked by applying heat and solidified to generate the hydrophobic layer 130.
  • the hydrophobic layer 130 is excavated to form a well.
  • the excavation can be performed by developing a photoresist, for example.
  • a pattern mask is attached on the hydrophobic layer 130 and exposed to ultraviolet rays or the like to be exposed.
  • the photoresist for example, a positive type photoresist is used.
  • a positive type photoresist is decomposed when exposed to light and dissolved in a developer.
  • a pattern mask having a design in which a hole of a target pattern is opened at a position where a microwell is to be formed is used as the pattern mask.
  • the exposure time and conditions may be appropriately determined with reference to the photoresist data sheet to be used.
  • the microwell array 100 is formed.
  • the development time is appropriately determined with reference to the data sheet of the photoresist to be used.
  • stop the development with a rinse solution and wash. For example, pure water or the like may be used as the rinse liquid.
  • post-baking is performed to stabilize the photoresist.
  • the microwell array 100 according to this embodiment can be manufactured.
  • the bottom of the well of the microwell array is formed by the hydrophilic layer 120.
  • a plurality of wells may be formed by excavating the hydrophobic layer 130 and the hydrophilic layer 120.
  • FIG. 4 is a cross-sectional view showing the structure of a microwell array 200 according to the sixth embodiment.
  • the microwell array 200 having wells where the surface 115 of the substrate 110 is exposed can be manufactured.
  • the seventh embodiment of the present invention is a method for analyzing an aqueous liquid in which an aqueous liquid is enclosed, the wells of the microwell array according to the above embodiment are irradiated with electromagnetic waves, and fluorescence or phosphorescence emitted from the wells is detected. provide.
  • the analysis method according to the present embodiment can measure how many of the wells constituting the microwell array emit fluorescence or phosphorescence. For example, by performing a PCR reaction in a microwell array and detecting fluorescence of SYBR Green in wells in which PCR amplification was observed, the proportion of wells in which amplification was observed can be calculated.
  • the analysis method according to the present embodiment may be performed using, for example, a fluorescence microscope.
  • the electromagnetic wave irradiation may be performed from the substrate side of the microwell array, from the well side, or from any other direction.
  • Detection of fluorescence or phosphorescence generated as a result of irradiation with electromagnetic waves may be performed from the substrate side of the microwell array, may be performed from the well side, or may be performed from any other direction.
  • detecting fluorescence or phosphorescence using a fluorescence microscope it is convenient to detect fluorescence or phosphorescence from the substrate side of the microwell array.
  • Example 1 The microwell array of Example 1 was manufactured according to the manufacturing method of the fifth embodiment described above.
  • the microwell array of Example 1 had a cylindrical well having a diameter of about 5 ⁇ m and a height of about 3 ⁇ m, and the bottom surface of the well was formed of a hydrophilic resin (hydrophilic layer).
  • the well density was 1 million / cm 2 .
  • a glass substrate was used as the substrate.
  • a silane coupling agent model number “Z6094”, manufactured by Toray Dow Corning Co., Ltd., contact angle measured according to the sessile drop method defined in JIS R3257-1999: 55.3 degrees
  • hydrophobic resin a positive photoresist (model number “S1818”, manufactured by Dow, contact angle measured according to the sessile drop method defined in JIS R3257-1999: 88.4 degrees) was used. Therefore, the wells of the microwell array of Example 1 have a hydrophobic portion near the well entrance on the well surface, and the hydrophilic portion is located closer to the bottom of the well (position closer to the bottom of the well) than the hydrophobic portion. And the well bottom was also hydrophilic.
  • Example 2 The microwell array of Example 2 was produced according to the manufacturing method of the sixth embodiment described above.
  • the microwell array of Example 2 had a cylindrical well having a diameter of about 5 ⁇ m and a height of about 3 ⁇ m.
  • the well density was 1 million / cm 2 .
  • a glass substrate contact angle measured according to the sessile drop method defined in JIS R3257-1999: 65.0 degrees
  • hydrophilic resin a silane coupling agent (model number “Z6094”, manufactured by Toray Dow Corning Co., Ltd., contact angle measured according to the sessile drop method defined in JIS R3257-1999: 55.3 degrees) was used. .
  • hydrophobic resin a positive photoresist (model number “S1818”, manufactured by Dow, contact angle measured according to the sessile drop method defined in JIS R3257-1999: 88.4 degrees) was used. Therefore, the wells of the microwell array of Example 2 have a hydrophobic portion near the well entrance on the well surface, and the hydrophilic portion is located closer to the bottom of the well (position closer to the bottom of the well) than the hydrophobic portion. Had.
  • FIG. 5 is a cross-sectional view showing the structure of the microwell array 300 of the first comparative example.
  • the microwell array of Comparative Example 1 had a cylindrical well having a diameter of about 5 ⁇ m and a height of about 3 ⁇ m.
  • a glass substrate was used as the substrate.
  • a positive photoresist (model number “S1818”, manufactured by Dow, contact angle measured according to the sessile drop method defined in JIS R3257-1999: 88.4 degrees) was used. As shown in FIG.
  • the microwell array 300 has a structure in which the hydrophobic layer 130 is directly laminated on the substrate 110, and the well is formed inside the hydrophobic layer 130. Therefore, the wells of the microwell array of Comparative Example 1 all had well surfaces formed from hydrophobic portions.
  • Example 1 A microfluidic device comprising the microwell array of Example 1 was assembled. Subsequently, an aqueous solution in which a proper amount of FITC (fluorescein isothiocyanate), which is a fluorescent substance, and a surfactant were dissolved was sent to the microfluidic device using a syringe. Thereafter, oil (model number “FC40”, manufactured by Sigma, contact angle of 7.0 ° with respect to positive photoresist (model number “S1818”)) was sent to the microfluidic device using a syringe.
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • S1818 contact angle of 7.0 ° with respect to positive photoresist
  • FIG. 6 is a cross-sectional view showing a state after oil is fed to the microfluidic device of this experimental example.
  • the microfluidic device 400 was provided with a bottom member 410 that holds a microwell array, a lid member 420, and a microchannel 430.
  • the bottom member 410 was integrated with the substrate 110 of the microwell array 100 of Example 1. That is, the microwell array 100 of Example 1 was formed using the bottom member 410 as the substrate 110.
  • the aqueous liquid 440 (an aqueous solution in which an appropriate amount of FITC and a surfactant was dissolved) was sent to the microfluidic device 400 from the channel inlet (not shown), the aqueous liquid 440 was introduced into the wells of the microwell array 100. Subsequently, when the oil 450 is supplied to the microfluidic device 400 from a channel inlet (not shown), a layer of the oil 450 is formed near the well inlet of the well while the aqueous liquid 440 is held in the well of the microwell array 100. Been formed. That is, the aqueous liquid 440 was sealed in the wells of the microwell array 100. Each well functions as a chemical reaction vessel that performs various biochemical or chemical reactions in a small volume of aqueous liquid 440.
  • FIG. 7 is a photograph showing the result of fluorescence microscopic observation of the microwell array of Example 1 from the substrate side (on the substrate, the bottom of the microfluidic device) after the oil was fed.
  • FITC-derived fluorescence was regularly observed in the well pattern of the microwell array of Example 1.
  • the white portion is a fluorescent well
  • the black portion is a substrate. This result shows that the FITC solution could be encapsulated in each well of the microwell array of Example 1.
  • Example 2 As a microwell array, FITC and a surfactant were dissolved in appropriate amounts in the microwell array in the same manner as in Experimental Example 1, except that the microwell array of Example 2 was used instead of the microwell array of Example 1. An aqueous solution was enclosed.
  • FIG. 8 is a cross-sectional view showing a state after oil is fed to the microfluidic device of this experimental example.
  • the microfluidic device 600 includes a bottom member 610 that holds a microwell array, a lid member 620, and a microchannel 630.
  • the bottom member 610 was integrated with the substrate 110 of the microwell array 200 of Example 2. That is, the microwell array 200 of Example 2 was formed using the bottom member 610 as the substrate 110.
  • aqueous liquid 440 an aqueous solution in which an appropriate amount of FITC and a surfactant was dissolved
  • the aqueous liquid 440 was introduced into the wells of the microwell array 200.
  • the oil 450 is supplied to the microfluidic device 600 from a channel inlet (not shown)
  • a layer of the oil 450 is formed near the well inlet of the well while the aqueous liquid 440 is held in the well of the microwell array 200. Been formed. That is, the aqueous liquid 440 was sealed in the wells of the microwell array 200.
  • FIG. 9 is a photograph showing a result of observing the microwell array of Example 2 from the substrate side with a fluorescence microscope after feeding the oil. As a result, as shown in FIG. 9, FITC fluorescence was regularly observed in the well pattern of the microwell array of Example 2. In FIG. 9, the white portion is a well emitting fluorescence, and the black portion is a substrate. This result shows that the FITC solution could be encapsulated in each well of the microwell array of Example 2.
  • the novolak resin used as the hydrophobic resin has autofluorescence, but the fluorescence value of the novolac resin is sufficiently low, and is the detection value and the fluorescence value of the novolac resin. Since there was a sufficient difference from the fluorescence value of FITC, there was no problem in the detection of FITC fluorescence.
  • Example 3 As a microwell array, FITC and a surfactant were dissolved in appropriate amounts in the same manner as in Experimental Example 1, except that the microwell array of Comparative Example 1 was used instead of the microwell array of Example 1. An aqueous solution was enclosed.
  • FIG. 10 is a cross-sectional view showing a state after oil is fed to the microfluidic device of this experimental example.
  • the microfluidic device 700 was provided with a bottom member 710 for holding a microwell array, a lid member 720, and a microchannel 730.
  • the bottom member 710 was formed integrally with the substrate 110 of the microwell array 300 of Comparative Example 1. That is, the microwell array 300 of Comparative Example 1 was formed using the bottom member 710 as the substrate 110.
  • aqueous liquid 440 an aqueous solution in which an appropriate amount of FITC and a surfactant is dissolved
  • the oil 450 is fed from an unillustrated channel inlet
  • Liquid 440 could not be retained in the wells of microwell array 300. That is, in the microwell array 300 of Comparative Example 1, it was difficult to enclose the aqueous liquid 440 in the well.
  • FIG. 11 is a photograph showing a result of observing the microwell array of Comparative Example 1 from the substrate side with a fluorescence microscope after feeding the oil.
  • fluorescence was observed across a plurality of wells, and regular FITC fluorescence along the well pattern was not observed.
  • This result shows that the FITC solution could not be encapsulated in the microwell array of Comparative Example 1. That is, when the microwell is formed only by the hydrophobic layer, it becomes difficult to hold the aqueous solution, and when the oil is fed, it becomes clear that all the aqueous solution in the well is replaced with the oil. It was.
  • a microwell array in which an aqueous liquid can be easily enclosed in a well.
  • the manufacturing method of said microwell array, a microfluidic device, the method of enclosing aqueous liquid in the well of a microwell array, and the analysis method of aqueous liquid can be provided.
  • diagnosis is performed by detecting DNA or RNA derived from a living body, a nucleic acid can be put together with a reagent into a minute space.

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Abstract

　マイクロウェルアレイであって、ウェル表面に親水性部分及び疎水性部分を有する複数のウェルを備える。

Description

マイクロウェルアレイ及びその製造方法、マイクロ流体デバイス、マイクロウェルアレイのウェル内に水性液体を封入する方法及び水性液体の分析方法
　本発明は、マイクロウェルアレイ及びその製造方法、マイクロ流体デバイス、マイクロウェルアレイのウェル内に水性液体を封入する方法及び水性液体の分析方法に関する。
　本願は、２０１５年３月３０日に日本に出願された特願２０１５－０６７９６０号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　近年、半導体回路の製造技術に用いられているエッチング技術やフォトリソグラフィ技術等を用いて形成された、種々の形態の微細な流路構造を有するマイクロウェルアレイが検討されている。これらのマイクロウェルアレイのウェルは、微小体積の流体中で種々の生化学的又は化学的反応をさせるための化学反応容器として用いられている。
　マイクロ流体システムの製作のための材料としては、シリコン、ガラス等の硬質の物質、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）等の種々の高分子樹脂やシリコーンゴム等の軟質の物質等が用いられている。例えば、特許文献１～４には、このようなマイクロ流体システムを、種々のマイクロチップ、バイオチップとして用いることが記載されている。
　ところで、近年、微少量の容積を有する微小空間内で酵素反応を行うことにより生体物質の検査を行う技術が注目されている。例えば、核酸の検出及び定量における新しいアプローチの一つとして、デジタルＰＣＲ技術が挙げられる。デジタルＰＣＲ技術とは、試薬と核酸との混合物を無数の微小液滴に分割してＰＣＲ増幅を行い、核酸を含んだ液滴からは蛍光等のシグナルが検出されるようにしておき、シグナルが検出された液滴を数えることにより定量を行う技術である。
　微小液滴の作製方法として、封止液で分断化することにより微小液滴を作製する方法や、基板上に形成した孔に試薬を入れ、続いて封止液を入れることにより微小液滴を作製する方法（例えば特許文献４を参照。）等が検討されている。
日本国特開２０１４－０３９５３１号公報 日本国特開２００８－１１６２５４号公報 日本国特開２００４－３０９４０５号公報 国際公開第２０１４／０３４７８１号パンフレット
　しかしながら、従来のマイクロウェルアレイは、水性液体であるＰＣＲ反応液等の試料をウェル内に封入することが困難な場合がある。
　そこで、本発明は、ウェル内に水性液体を封入することが容易なマイクロウェルアレイを提供することを目的とする。本発明はまた、上記のマイクロウェルアレイの製造方法、マイクロ流体デバイス、マイクロウェルアレイのウェル内に水性液体を封入する方法及び水性液体の分析方法を提供することを目的とする。
　本発明の第一態様に係るマイクロウェルアレイは、ウェル表面に親水性部分及び疎水性部分を有する複数のウェルを備える。
　前記複数のウェルのうちそれぞれのウェルの容量が１ｆＬ～６ｎＬであってもよい。
　前記複数のウェルの密度が１０万～１０００万個／ｃｍ２であってもよい。
　前記複数のウェルは、ウェル上部に前記疎水性部分を有し、前記疎水性部分よりもウェル底部に近い位置に前記親水性部分を有していてもよい。
　前記複数のウェルが、電磁波に対し透過性を有する基板上に設けられていてもよい。
　前記電磁波が、Ｘ線、紫外線、可視光線又は赤外線であってもよい。
　前記基板は、自家蛍光を実質的に有しない材料で形成されていてもよい。
　前記親水性部分はＪＩＳ　Ｒ３２５７－１９９９に規定された静滴法に準じて測定した接触角が７０度未満であってもよい。
　前記親水性部分がシロキサンポリマーで形成されていてもよい。
　前記疎水性部分はＪＩＳ　Ｒ３２５７－１９９９に規定された静滴法に準じて測定した接触角が７０度以上であってもよい。
　前記疎水性部分がノボラック樹脂で形成されていてもよい。
　本発明の第二態様に係るマイクロ流体デバイスは、流路と、前記流路内に配置された上記態様に係るマイクロウェルアレイとを備える。
　本発明の第三態様に係るウェル内に水性液体を封入する方法は、流路と、前記流路内に配置された上記態様に係るマイクロウェルアレイとを備えるマイクロ流体デバイスを準備し、前記マイクロ流体デバイスの前記流路に水性液体を送液し、前記マイクロウェルアレイのウェルに前記水性液体を導入し、前記流路に封止液を送液し、前記ウェルに導入された前記水性液体の上層に封止液の層を形成させ、前記水性液体を前記ウェル内に封入する。
　本発明の第四態様に係るマイクロウェルアレイの製造方法は、電磁波透過性を有する基板上に親水性材料を積層して親水層を形成し、前記親水層上に疎水性材料を積層して疎水層を形成し、前記疎水層を掘削して複数のウェルを形成する。
　前記複数のウェルを形成する際に、前記疎水層及び前記親水層を掘削して複数のウェルを形成してもよい。
　本発明の第五態様に係る水性液体の分析方法は、水性液体が封入された、上記態様に係るマイクロウェルアレイのウェルに電磁波を照射し、前記ウェルから放出される蛍光又は燐光を検出する。
　前記蛍光又は前記燐光が、上記態様に係るマイクロウェルアレイの基板上で検出されてもよい。
　本発明の上記態様によれば、ウェル内に水性液体を封入することが容易なマイクロウェルアレイを提供することができる。また、上記態様に係るマイクロウェルアレイの製造方法、マイクロ流体デバイス、マイクロウェルアレイのウェル内に水性液体を封入する方法、及び水性液体の分析方法を提供することができる。
図１Ａは、第２実施形態に係るマイクロ流体デバイスを示す斜視図である。 図１Ｂは、図１Ａのマイクロ流体デバイスにおけるｂ－ｂ線断面図である。 図１Ｃは、図１Ａのマイクロ流体デバイスにおけるｃ－ｃ線断面図である。 図２Ａは、第３実施形態に係るマイクロ流体デバイスを示す斜視図である。 図２Ｂは、図２Ａのマイクロ流体デバイスにおけるｂ－ｂ線断面図である。 図２Ｃは、図２Ａのマイクロ流体デバイスにおけるｃ－ｃ線断面図である。 第５実施形態に係るマイクロウェルアレイの構造を示す断面図である。 第６実施形態に係るマイクロウェルアレイの構造を示す断面図である。 比較例１のマイクロウェルアレイの構造を示す断面図である。 実験例１のマイクロ流体デバイスのマイクロウェルアレイに水性液体を封入した状態を示す断面図である。 実験例１のマイクロ流体デバイスのマイクロウェルアレイを基板側から蛍光顕微鏡観した結果を示す写真である。 実験例２のマイクロ流体デバイスのマイクロウェルアレイに水性液体を封入した状態を示す断面図である。 実験例２のマイクロ流体デバイスのマイクロウェルアレイを基板側から蛍光顕微鏡観察した結果を示す写真である。 実験例３のマイクロ流体デバイスのマイクロウェルアレイに水性液体及びオイルを送液した後の状態を示す断面図である。 実験例３のマイクロ流体デバイスのマイクロウェルアレイを基板側から蛍光顕微鏡観察した結果を示す写真である。
　以下、場合により図面を参照しつつ、本発明の実施形態について詳細に説明する。なお、図面中、同一又は相当部分には同一符号を付し、重複する説明は省略する。なお、各図における寸法比は、説明のため誇張している部分があり、必ずしも実際の寸法比とは一致しない。
［マイクロウェルアレイ］
　本発明の第１実施形態は、ウェル表面に親水性部分及び疎水性部分を有する複数のウェルを備える、マイクロウェルアレイを提供する。後述するように、本実施形態に係るマイクロウェルアレイは、ウェル内に水性液体を封入することが非常に容易である。ここで、水性液体を封入するとは、マイクロウェルアレイを構成する複数のウェルに水性液体を導入し、更に、各ウェルに導入された液体同士が互いに混合しない状態に隔離することを意味する。隔離する方法としては、例えば、ウェルに水性液体を導入した後、ウェルの上部にオイル層を形成すること等が挙げられる。本実施形態に係るマイクロウェルアレイによれば、マイクロウェルアレイを構成する複数のウェルの９０％以上、例えば９５％以上、例えば９９％以上、例えば１００％に水性液体を容易に封入することができる。
　本実施形態に係るマイクロウェルアレイは、ウェル１つあたりの容量が、例えば１フェムトリットル（ｆＬ）～６ナノリットル（ｎＬ）であり、好ましくは１ｆＬ～５ピコリットル（ｐＬ）であり、更に好ましくは１ｆＬ～３００ｆＬである。ウェル１つあたりの容量がこのような範囲（１ｆＬ～６ｎＬ）であると、デジタルＰＣＲやインベーダー反応等の微小空間内で行う酵素反応を好適に行うことができる。また、当該デジタルＰＣＲにより、例えば遺伝子の変異検出等を行うことができる。
　例えば、セルフリーＤＮＡの変異を測定する場合において、検出対象の遺伝子を含んだサンプル量が決まっている際は、ウェル数が同じ場合でも反応容積がより小さいほうが好ましい。
　マイクロウェルアレイを用いた解析に酵素反応を利用する場合には、マイクロウェルアレイの材質が酵素反応を阻害しない材質であることが好ましい。あるいは、マイクロウェルアレイの材質（材料）表面に、酵素反応を阻害しない物質をコーティングすることも可能である。
　マイクロウェルアレイのウェルの形状や大きさに特に制限はないが、例えば、微小液滴中で種々の生化学的な反応を行う場合には、１～数個の生体分子又は担体を収容可能な形状と大きさを有していることが好ましい。担体は例えばビーズであってもよく、担体には試料である生体分子が結合されていてもよい。
　ウェルの形状は、例えば、円筒形、複数の面により構成される多面体（例えば、直方体、六角柱、八角柱等）、逆円錐形、逆角錐形（逆三角錐形、逆四角錐形、逆五角錐形、逆六角錐形、七角以上の逆多角錐形）等であってもよく、これらの形状の二つ以上を組み合わせた形状であってもよい。
　例えば、一部が円筒形であり、残りが逆円錐形であってもよい。また、逆円錐形、逆角錐形の場合、円錐や角錐の底面がウェルの入り口（開口部）となるが、逆円錐形、逆角錐形の頂上から一部を切り取った形状であってもよい。この場合、マイクロウェルの底部は平坦になる。
　ウェルの形状が円筒形、直方体である場合、マイクロウェルの底部は通常、平坦であるが、曲面（凸面や凹面）としてもよい。マイクロウェルの底部を曲面とすることができるのは、逆円錐形、逆角錐形の頂上から一部を切り取った形状の場合も同様である。
　ウェルが円筒形の場合、生体分子を含む水性液体を封入する目的のためには、直径は３～１０μｍであってもよい。また、深さは３～１０μｍであってもよい。ウェルの寸法は、ウェルに収容する水性液体の量や、生体分子を付着させたビーズ等の担体の大きさとウェルの寸法の好適な比等を考慮して、１つのマイクロウェルに１つ、もしくは数個の生体分子が収容されるように、適宜決定する。
　本実施形態に係るマイクロウェルアレイを使用して検出する検出対象は、例えば血液等の生体から採取した試料やＰＣＲ産物等であってもよく、人工的に合成された化合物等であってもよい。例えば、生体分子であるＤＮＡを検出対象とする場合、ウェルは、ＤＮＡが１分子入るような形状と大きさであってもよい。
　生体分子のほかの例として、タンパク質やＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ、ｍｔＲＮＡ、ｔＲＮＡなどのＲＮＡを含む）、糖、アミノ酸（ペプチドを含む）が挙げられる。
　本実施形態に係るマイクロウェルアレイにおいては、複数のウェルの密度が、例えば１０万～１０００万個／ｃｍ２であり、好ましくは１０万～５００万個／ｃｍ２であり、更に好ましくは１０万～１００万個／ｃｍ２である。ウェルの密度がこのような範囲（１０万～１０００万個／ｃｍ２）であると、所定数のウェルに試料である水性液体を封入させる操作が容易である。また、実験結果を解析するためのウェルの観察も容易である。
　例えば、前記容積でウェルを作製した場合、顕微鏡でウェルを観察する際は、１視野で取得できるウェル数は１万個程度となる。セルフリーＤＮＡの変異を測定する場合において、検出対象の変異の野生型に対する存在割合が０．０１％程度である場合、１０万～５００万個／ｃｍ２程度、更に好ましくは１０万～１００万個／ｃｍ２あると、検出精度を損なわずに全ウェルを検出したとしても迅速な測定が可能となる。
　例えば、セルフリーＤＮＡの変異を測定する場合において、検出対象の変異の野生型に対する存在割合が０．０１％程度である場合、例えば、１００万～２００万個のウェルを使用することが好適である。
　本実施形態に係るマイクロウェルアレイにおいて、（複数のウェルのうち）各ウェルは、ウェル上部に前記疎水性部分を有し、前記疎水性部分よりもウェル底部に近い位置（底側）に前記親水性部分を有することが好ましい。
　後述するように、発明者らは、このような構成とすることにより、マイクロウェルアレイのウェルに水性液体を封入させることが非常に容易になることを見出した。
　上記の親水性部分（親水性部分の材質）は、ＪＩＳ　Ｒ３２５７－１９９９に規定された静滴法に準じて測定した接触角が７０度未満であってよい。いいかえると、本明細書において、親水性であるとは、ＪＩＳ　Ｒ３２５７－１９９９に規定された静滴法に準じて測定した接触角が７０度未満であることを意味する。
　また、上記の疎水性部分（疎水性部分の材質）は、ＪＩＳ　Ｒ３２５７－１９９９に規定された静滴法に準じて測定した接触角が７０度以上であってよい。いいかえると、本明細書において、疎水性であるとは、ＪＩＳ　Ｒ３２５７－１９９９に規定された静滴法に準じて測定した接触角が７０度以上であることを意味する。
（親水性樹脂）
　親水性部分を形成する樹脂（以下「親水性樹脂」という場合がある。）としては、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、樹脂の構成成分の分子が、親水性を発現する親水性基を有する樹脂が挙げられる。親水性基としては、例えば、ヒドロキシル基、カルボキシル基、スルホン基、スルホニル基、アミノ基、アミド基、エーテル基、エステル基等が挙げられる。
　より具体的には、シロキサンポリマー；エポキシ樹脂；ポリエチレン樹脂；ポリエステル樹脂；ポリウレタン樹脂；ポリアクリルアミド樹脂；ポリビニルピロリドン樹脂；ポリアクリル酸共重合体等のアクリル樹脂；カチオン化ポリビニルアルコール、シラノール化ポリビニルアルコール、スルホン化ポリビニルアルコール等のポリビニルアルコール樹脂；ポリビニルアセタール樹脂；ポリビニルブチラール樹脂；ポリエチレンポリアミド樹脂；ポリアミドポリアミン樹脂；ヒドロキシメチルセルロース、メチルセルロース等のセルロース誘導体；ポリエチレンオキサイド、ポリエチレンオキサイド－ポリプロピレンオキサイド共重合体等のポリアルキレンオキサイド誘導体；無水マレイン酸共重合体；エチレン－酢酸ビニル共重合体；スチレン－ブタジエン共重合体；上記の樹脂の組み合わせ等の中から、ＪＩＳ　Ｒ３２５７－１９９９に規定された静滴法に準じて測定した接触角が７０度未満である樹脂を少なくとも１つ以上適宜選択して使用することができる。
　すなわち、親水性樹脂としては、上記樹脂のうち接触角が７０度未満である樹脂であれば、1種類の樹脂のみを用いてもよく、複数種類の樹脂を組み合わせて用いてもよい。
　親水性樹脂は、熱可塑性樹脂であってもよく、熱硬化性樹脂であってもよく、電子線やＵＶ光等の活性エネルギー線により硬化する樹脂であってもよく、エラストマーであってもよい。
　また、親水層は、後述する基板が存在する場合には、基板と疎水層とを密着させる機能も有していてもよい。例えば、熱硬化性のシランカップリング剤等を基板に塗布し、熱硬化させてシロキサンポリマーを形成することにより、親水層を形成してもよい。
（疎水性樹脂）
　疎水性部分を形成する樹脂（以下「疎水性樹脂」という場合がある。）としては、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、例えば、ノボラック樹脂；アクリル樹脂；メタクリル樹脂；スチレン樹脂；塩化ビニル樹脂；塩化ビニリデン樹脂；ポリオレフィン樹脂；ポリアミド樹脂；ポリイミド樹脂；ポリアセタール樹脂；ポリカーボネート樹脂；ポリフェニレンスルフィド樹脂；ポリスルフォン樹脂；フッ素樹脂；シリコーン樹脂；ユリヤ樹脂；メラミン樹脂；グアナミン樹脂；フェノール樹脂；セルロース樹脂；上記の樹脂の組み合わせ等の中から、ＪＩＳ　Ｒ３２５７－１９９９に規定された静滴法に準じて測定した接触角が７０度以上である樹脂を少なくとも１つ以上適宜選択して使用することができる。
　すなわち、疎水性樹脂としては、上記樹脂のうち接触角が７０度以上である樹脂であれば、1種類の樹脂のみを用いてもよく、複数種類の樹脂を組み合わせて用いてもよい。
　疎水性樹脂は、熱可塑性樹脂であってもよく、熱硬化性樹脂であってもよく、電子線やＵＶ光等の活性エネルギー線により硬化する樹脂であってもよく、エラストマーであってもよい。
　疎水性部分は、例えばレジストで形成されていてもよい。レジストは、微細構造を形成しやすい観点から、フォトレジストであってもよい。フォトレジストは、例えば、感光性のノボラック樹脂であってもよい。
（基板）
　本実施形態に係るマイクロウェルアレイは、基板上に形成されていてもよい。基板は、電磁波透過性を有する基板であってもよく、電磁波透過性を有しない基板であってもよい。ここで、電磁波としては、Ｘ線、紫外線、可視光線、赤外線等が挙げられる。マイクロウェルアレイが電磁波透過性を有する基板上に形成されていた場合には、マイクロウェルアレイ上で行った実験結果を解析するために、電磁波を利用することが可能になる。例えば、電磁波を照射した結果生じる蛍光、燐光等を基板側から（基板を介して、基板上で）計測することができる。本明細書において、蛍光及び燐光は、照射時と検出時の波長が異なる（波長が変換される）光も含む。波長が変換される例としては、紫外線を照射した結果、可視光領域の蛍光又は燐光が発生する場合、可視光線を照射した結果、赤外領域の蛍光又は燐光が発生する場合等が挙げられる。蛍光、燐光等の検出には、例えば蛍光顕微鏡等を利用することができる。この場合、電磁波は、例えば基板側から（基板に対して）照射してもよいし、例えばウェルの入り口側から（ウェルの入り口に対して）照射してもよい。
　例えば、マイクロウェルアレイにおいて、可視光領域である４００～７００ｎｍの波長範囲にピークを有する蛍光を検出する場合には、少なくとも上記可視光領域の光に対して良好な透過性を有する基板を用いればよい。
　電磁波透過性を有する基板としては、例えば、ガラス、樹脂等が挙げられる。樹脂基板としては、例えば、ＡＢＳ樹脂、ポリカーボネート樹脂、ＣＯＣ（シクロオレフィンコポリマー）、ＣＯＰ（シクロオレフィンポリマー）、アクリル樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリ酢酸ビニル、ＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）、ＰＥＮ（ポリエチレンナフタレート）等が挙げられる。これらの樹脂は各種添加剤を含んでいてもよく、複数の樹脂が混合されていてもよい。
　実験結果の検出に蛍光や燐光を利用する観点から、上記の基板は、自家蛍光を実質的に有しないことが好ましい。ここで、自家蛍光を実質的に有しないとは、基板が、実験結果の検出に使用する波長の自家蛍光を全く有しないか、自家蛍光を有していても実験結果の検出に影響を与えないほど微弱であることを意味する。例えば、検出対象の蛍光に比べて１／１０以下、１／１００以下程度の自家蛍光であれば、実験結果の検出に影響を与えないほど微弱であるといえる。
　電磁波透過性を有し、かつ自家蛍光を全く発しない素材としては、例えば、石英ガラスが挙げられる。自家蛍光が微弱であり、電磁波を用いた実験結果の検出に支障がない素材としては、低蛍光ガラス、アクリル樹脂、ＣＯＣ（シクロオレフィンコポリマー）、ＣＯＰ（シクロオレフィンポリマー）等が挙げられる。
　生体分子の検出に用いる蛍光としては、例えば蛍光分子（蛍光物質）を内包した蛍光ビーズや、ＤＮＡの二重らせんに特異的に入り込み、蛍光を発するＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ等のインターカレーター等に由来する蛍光が挙げられる。
　その他に、蛍光色素などの蛍光物質、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）、蛍光標識をつけたアビジンやストレプトアビジンの反応や、ホースラディッシュペルオキシダーゼを用いた酵素反応、インベーダー（登録商標）法のようなＦＲＥＴと酵素反応を組合わせた方法に由来する蛍光が挙げられる。
　ウェルに収容された生体分子から発せられる蛍光の観察は、例えば、倒立顕微鏡を用いて、マイクロウェルアレイの基板側から（基板を介して、基板上から）行うことができる。この蛍光観察により、所定の蛍光を発するマイクロウェルの個数を数えることで、目的分子の数を特定することができる。
　生体分子は、例えば、ウェルに収容する前に、目的分子を特異的に標識する蛍光標識で処理しておくとよい。あるいは、対象分子を特異的に認識するビーズを用いて、対象分子を補足した後に、ビーズをウェルに収容し、対象分子を特異的に標識し得る蛍光標識と接触させて、目的分子をウェル内で蛍光標識してもよい。
　基板の厚みは、適宜決定することが出来るが、例えば基板側（基板上）から蛍光顕微鏡を用いて蛍光を観察する場合には、例えば５ｍｍ以下、例えば２ｍｍ以下、例えば１．６ｍｍ以下であることが好ましい。
　本実施形態に係るマイクロウェルアレイを使用した生体分子の観察には、蛍光以外にも、例えば濁度等を利用することもできる。濁度は、例えば、検出対象における４００～１０００ｎｍ程度の波長の光の透過性により測定することができる。
［マイクロ流体デバイス］
　本発明の一実施形態は、流路と、前記流路内に配置された上記のマイクロウェルアレイとを備える、マイクロ流体デバイスを提供する。このようなマイクロ流体デバイスを用いることにより、マイクロウェルアレイのウェル内に水性液体を封入することが容易になる。
（第２実施形態）
　図１Ａは、第２実施形態に係るマイクロ流体デバイスを示す斜視図である。図１Ｂは、図１Ａのマイクロ流体デバイスにおけるｂ－ｂ線断面図である。図１Ｃは、図１Ａのマイクロ流体デバイスにおけるｃ－ｃ線断面図である。
　本実施形態に係るマイクロ流体デバイス１０００は、底部部材１１００と、蓋部材１２００と、流路１３００と、流路１３００の一端（第１端）に設けられた流路入口１２１０と、流路１３００の他端（第２端）に設けられた流路出口１２２０と、流路１３００の内壁の一部を形成する封止部材１４００と、流路１３００の内部に配置されたマイクロウェルアレイｍとを備える。流路１３００に流体を送液する場合には、例えば、シリンジ等を用いて、流路入口１２１０から流体を導入し、流路出口１２２０から排出するとよい。本実施形態に係るマイクロ流体デバイスでは、流路１３００の内部にマイクロウェルアレイｍが設けられている。
　マイクロウェルアレイｍの構造については後述する。マイクロウェルアレイｍの基板１１００と、マイクロ流体デバイス１０００の底部部材１１００は一体であってもよい。また、マイクロウェルアレイｍの親水層１１２０及び疎水層１１３０は、マイクロ流体デバイス１０００の底部部材１１００上に一体成型されていてもよい。すなわち、マイクロウェルアレイｍは、マイクロ流体デバイス１０００の底部部材１１００上に形成されていてもよい。
　底部部材１１００及び蓋部材１２００の材質としては、上述したマイクロウェルアレイの基板の材質と同様の材質を使用することができる。また、封止部材１４００の材質としては、特に制限されないが、例えばシリコーンゴム、アクリル発泡体から形成される芯材フィルムの両面にアクリル系粘着剤が積層された両面粘着テープ、接着剤を積層するなどして一定の厚みを有するもの、スペーサ部材（樹脂製、金属製、紙製、ガラス等の無機物）等が挙げられる。
　これら封止部材は、送液される液体と反応しにくいものを適宜選択できる。また、封止部材の表面に、送液される液体と反応しにくくなるように、コーティングをしたものも採用できる。
　本願では両面粘着テープを使用した。
（第３実施形態）
　図２Ａは、本発明の第３実施形態に係るマイクロ流体デバイスを示す斜視図である。図２Ｂは、図２Ａのマイクロ流体デバイスにおけるｂ－ｂ線断面図である。図２Ｃは、図２Ａのマイクロ流体デバイスにおけるｃ－ｃ線断面図である。
　本実施形態に係るマイクロ流体デバイス２０００は、上述した第１実施形態に係るマイクロ流体デバイス１０００の平面視において、流路１３００の一部が拡大された構成を有する。また、マイクロ流体デバイス２０００におけるマイクロウェルアレイｍ（第２のマイクロウェルアレイｍ－２）は、マイクロ流体デバイス１０００におけるマイクロウェルアレイｍと比較して、平面視における面積が大きくなっている。マイクロ流体デバイス２０００のその他の構成（第２のマイクロウェルアレイｍ－２以外の構成）においてはマイクロ流体デバイス１０００と同様である。
　なお、本明細書において平面視とは、マイクロ流体デバイスの底部部材又はマイクロウェルアレイの基板に対して垂直な方向からマイクロ流体デバイス又はマイクロウェルアレイを見た状態をいう。
［マイクロウェルアレイのウェル内に水性液体を封入する方法］
　本発明の第４実施形態は、流路と、前記流路内に配置された上記の実施形態に係るマイクロウェルアレイとを備えるマイクロ流体デバイスを準備し、前記マイクロ流体デバイスの前記流路に水性液体を送液し、前記マイクロウェルアレイのウェルに前記水性液体を導入し、前記流路に封止液を送液し、前記ウェルに導入された前記水性液体の上層に封止液の層を形成させ、前記水性液体を前記ウェル内に封入する、マイクロウェルアレイのウェル内に水性液体を封入する方法を提供する。
　ここで、水性液体とは、水、検出対象である生体分子を含有する緩衝液等の生体試料、酵素反応液等を意味する。生体試料は一般的に水性液体である。水性液体は、例えば、生体試料を鋳型とし、検出試薬としてＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎを含むＰＣＲ反応溶液等であってもよい。また、水性液体中には、界面活性剤等の添加物を含有させてもよい。水性液体に界面活性剤を添加することにより、マイクロウェルアレイのウェル内に水性液体を封入しやすくすることができる。
　また、封止液とは、マイクロウェルアレイの（複数のウェルのうち）各ウェルに導入された液体同士が互いに混合しない状態に隔離するために用いる液体を意味し、例えば、オイル類を用いることができる。オイルとしては、例えばシグマ社製の商品名「ＦＣ４０」や、３Ｍ社製の商品名「ＨＦＥ－７５００」、ＰＣＲ反応等に用いられるミネラルオイル等を用いることができる。従来のマイクロウェルアレイでは、ミネラルオイルを封止液に利用することは困難な場合があるが、上述したマイクロウェルアレイであれば、ミネラルオイルを封止液に利用しても、ウェルに水性液体を封入することができる。
　封止液は、マイクロウェルアレイの疎水層の材質に対する接触角が５～８０度であることが好ましい。封止液の接触角がこの範囲（５～８０度）であると、マイクロウェルアレイのウェルに水性液体を封入することができる。封止液の接触角は、例えば、ＪＩＳ　Ｒ３２５７－１９９９に規定された静滴法に準じて、水の代わりに封止液を用いて測定すればよい。
　マイクロウェルアレイの疎水層を形成する材料と封止液との組み合わせを適宜選択することにより、上述した具体的なオイル以外の液体も封止液として使用することができる。
　続いて、図１Ａ～図１Ｃを用いて、マイクロウェルアレイのウェル内に水性液体を封入する方法を説明する。まず、シリンジ、マイクロピペット等を用いて、マイクロ流体デバイス１０００の流路入口１２１０からＰＣＲ反応溶液、インベーダー反応溶液等の水性液体を送液する。その結果、流路１３００の内部に配置されたマイクロウェルアレイｍの各ウェル内に水性液体が導入される。
　次に、シリンジ等を用いて、流路入口１２１０からマイクロ流体デバイス１０００内に封止液を送液する。その結果、流路１３００の内部に配置されたマイクロウェルアレイｍの各ウェルのウェル入り口の近傍に封止液の層が形成され、ウェル内に水性液体が封入される。マイクロウェルアレイｍが上述した構成を備えていることにより、本実施形態の方法によって、マイクロウェルアレイｍの各ウェルに水性液体を容易に封入することができる。
　マイクロウェルアレイのウェル内に水性液体を封入した後、例えば、サーマルサイクラー等を用いてＰＣＲ反応やインベーダー反応等の酵素反応等を行うことができる。
［マイクロウェルアレイの製造方法］
（第５実施形態）
　本発明の第５実施形態は、電磁波透過性を有する基板上に親水性材料を積層して親水層を形成し、前記親水層上に疎水性材料を積層して疎水層を形成し、前記疎水層を掘削して複数のウェルを形成する、マイクロウェルアレイの製造方法を提供する。
　ここで、図３を参照しながら、本実施形態に係るマイクロウェルアレイ１００の製造方法について説明する。図３は、第５実施形態に係るマイクロウェルアレイ１００の構造を示す断面図である。まず、図３に示すように、基板１１０の表面１１５上に親水層１２０を形成する。基板１１０は、例えばガラス基板であってよい。親水層１２０は、例えばシランカップリング剤から形成されたシロキサンポリマーであってもよいし、硬化性樹脂であってもよい。親水層１２０を硬化性樹脂で形成する場合には、硬化性樹脂を基板１１０上に塗布し、熱処理等によって硬化させて親水層１２０を形成する。このとき、硬化性樹脂にシランカップリング剤を添加してもよい。これにより基板１１０への親水層１２０の密着が良好になる。
　続いて、親水層１２０上に、疎水層１３０の材料となる疎水性樹脂を塗布する。疎水性樹脂として、フォトレジストを使用してもよい。この場合、フォトレジストをスピンコート等により親水層１２０上に塗布する。スピンコート後、フォトレジストに熱を加えてプリベークを行い、固化させて疎水層１３０を生成する。
　続いて、疎水層１３０を掘削して、ウェルを形成する。掘削は、例えばフォトレジストの現像によって行うことができる。具体的には、疎水層１３０上にパターンマスクを取り付け、その上から紫外線等を照射して感光させる。フォトレジストとしては、例えばポジ型のフォトレジストを使用する。ポジ型のフォトレジストは、光が当たると分解し、現像液に溶解する。そのため、パターンマスクとしては、マイクロウェルを形成したい箇所に、目的のパターンの穴が開いているようなデザインのパターンマスクを使用する。露光時間や条件は、使用するフォトレジストのデータシートを参照して適宜決定するとよい。
　続いて、用いたフォトレジストに適した現像液を用いて現像を行い、マイクロウェルアレイ１００を形成する。現像時間は、使用するフォトレジストのデータシートを参照して適宜決定する。現像後、リンス液で現像を止め、洗浄する。リンス液としては、例えば純水等を使用すればよい。続いて、ポストベークを行い、フォトレジストを安定化させる。
　以上の操作により、本実施形態に係るマイクロウェルアレイ１００を製造することができる。
　本実施形態では、マイクロウェルアレイのウェルの底部は親水層１２０により形成されている。
（第６実施形態）
　本発明の第６実施形態においては、上記の第５実施形態におけるウェルを形成する際に、疎水層１３０及び親水層１２０を掘削して複数のウェルを形成してもよい。
　ここで、図４を参照しながら、第６実施形態に係るマイクロウェルアレイ２００の製造方法について説明する。図４は、第６実施形態に係るマイクロウェルアレイ２００の構造を示す断面図である。まず、上記の第５実施形態に係るマイクロウェルアレイ１００と同様の工程を全て行い、マイクロウェルアレイ１００を製造する。続いて、ドライエッチングを行い、マイクロウェルアレイ１００のウェル底面を構成している親水層１２０を掘削する。ドライエッチングとは、イオンを高速で対象物にぶつけて、当該イオンの運動エネルギーを利用してエッチングを行う方法である。以上の方法により、基板１１０の表面１１５が露出したウェルを有するマイクロウェルアレイ２００を製造することができる。
［水性液体の分析方法］
　本発明の第７実施形態は、水性液体が封入された、上記実施形態に係るマイクロウェルアレイのウェルに電磁波を照射し、ウェルから放出される蛍光又は燐光を検出する、水性液体の分析方法を提供する。
　本実施形態に係る分析方法により、マイクロウェルアレイを構成するウェルのうち、何個のウェルが蛍光又は燐光を発しているかを計測することができる。例えば、マイクロウェルアレイ内でＰＣＲ反応を行い、ＰＣＲ増幅が見られたウェルにおけるＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎの蛍光を検出することにより、増幅が見られたウェルの割合を算出することができる。
　本実施形態に係る分析方法は、例えば、蛍光顕微鏡を用いて行ってもよい。また、電磁波の照射は、マイクロウェルアレイの基板側から行ってもよく、ウェル側から行ってもよく、その他の任意の方向から行ってもよい。また、電磁波の照射の結果発生する蛍光又は燐光の検出は、マイクロウェルアレイの基板側から行ってもよく、ウェル側から行ってもよく、その他の任意の方向から行ってもよい。例えば蛍光顕微鏡を用いて蛍光又は燐光を検出する場合には、マイクロウェルアレイの基板側から蛍光又は燐光の検出を行うことが簡便である。
　次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
　上述した第５実施形態の製造方法にしたがって、実施例１のマイクロウェルアレイを作製した。実施例１のマイクロウェルアレイは、直径約５μｍ、高さ約３μｍの円柱状のウェルを有しており、ウェル底面は親水性樹脂（親水層）により形成されていた。また、ウェル密度は１００万個／ｃｍ２であった。基板としては、ガラス基板を使用した。また、親水性樹脂として、シランカップリング剤（型番「Ｚ６０９４」、東レダウコーニング社製、ＪＩＳ　Ｒ３２５７－１９９９に規定された静滴法に準じて測定した接触角：５５．３度）を使用した。また、疎水性樹脂として、ポジ型フォトレジスト（型番「Ｓ１８１８」、ダウ社製、ＪＩＳ　Ｒ３２５７－１９９９に規定された静滴法に準じて測定した接触角：８８．４度）を使用した。したがって、実施例１のマイクロウェルアレイのウェルは、ウェル表面のウェル入り口近傍に疎水性部分を有しており、疎水性部分よりもウェル底側（ウェルの底部に近い位置）に親水性部分を有しており、ウェル底も親水性であった。
（実施例２）
　上述した第６実施形態の製造方法にしたがって、実施例２のマイクロウェルアレイを作製した。実施例２のマイクロウェルアレイは、直径約５μｍ、高さ約３μｍの円柱状のウェルを有していた。また、ウェル密度は１００万個／ｃｍ２であった。基板としては、ガラス基板（ＪＩＳ　Ｒ３２５７－１９９９に規定された静滴法に準じて測定した接触角：６５．０度）を使用した。また、親水性樹脂として、シランカップリング剤（型番「Ｚ６０９４」、東レダウコーニング社製、ＪＩＳ　Ｒ３２５７－１９９９に規定された静滴法に準じて測定した接触角：５５．３度）を使用した。また、疎水性樹脂として、ポジ型フォトレジスト（型番「Ｓ１８１８」、ダウ社製、ＪＩＳ　Ｒ３２５７－１９９９に規定された静滴法に準じて測定した接触角：８８．４度）を使用した。したがって、実施例２のマイクロウェルアレイのウェルは、ウェル表面のウェル入り口近傍に疎水性部分を有しており、疎水性部分よりもウェル底側（ウェルの底部に近い位置）に親水性部分を有していた。
（比較例１）
　親水層を設けず、疎水層のみでマイクロウェルアレイを形成した以外は実施例１と同様にして、比較例１のマイクロウェルアレイを作製した。図５は、比較例１のマイクロウェルアレイ３００の構造を示す断面図である。比較例１のマイクロウェルアレイは、直径約５μｍ、高さ約３μｍの円柱状のウェルを有していた。基板としては、ガラス基板を使用した。また、疎水性樹脂として、ポジ型フォトレジスト（型番「Ｓ１８１８」、ダウ社製、ＪＩＳ　Ｒ３２５７－１９９９に規定された静滴法に準じて測定した接触角：８８．４度）を使用した。図５に示すように、マイクロウェルアレイ３００は、基板１１０に直接疎水層１３０が積層された構造を有しており、ウェルは、疎水層１３０の内部に形成されていた。したがって、比較例１のマイクロウェルアレイのウェルは、ウェル表面が全て疎水性部分から形成されていた。
（実験例１）
　実施例１のマイクロウェルアレイを備えるマイクロ流体デバイスを組み立てた。続いて、上記のマイクロ流体デバイスに、シリンジを用いて、蛍光物質であるＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）及び界面活性剤を適量溶解した水溶液を送液した。その後、上記のマイクロ流体デバイスに、シリンジを用いてオイル（型番「ＦＣ４０」、シグマ社製、ポジ型フォトレジスト（型番「Ｓ１８１８」）に対する接触角７．０度）を送液した。
　図６は、本実験例のマイクロ流体デバイスにオイルを送液した後の状態を示す断面図である。マイクロ流体デバイス４００は、マイクロウェルアレイを保持する底部部材４１０と、蓋部材４２０と、マイクロ流路４３０とを備えていた。本実験例においては、底部部材４１０は、実施例１のマイクロウェルアレイ１００の基板１１０と一体になっていた。
　すなわち、実施例１のマイクロウェルアレイ１００は、底部部材４１０を基板１１０として形成されていた。
　マイクロ流体デバイス４００に水性液体４４０（ＦＩＴＣ及び界面活性剤を適量溶解した水溶液）を不図示の流路入口から送液すると、マイクロウェルアレイ１００のウェル内に水性液体４４０が導入された。続いて、マイクロ流体デバイス４００にオイル４５０を不図示の流路入口から送液すると、マイクロウェルアレイ１００のウェル内に水性液体４４０を保持した状態で、ウェルのウェル入り口近傍にオイル４５０の層が形成された。すなわち、マイクロウェルアレイ１００のウェル内に水性液体４４０が封入された。各ウェルは、微小体積の水性液体４４０中で種々の生化学的又は化学的反応を行う化学反応容器として機能する。
　図７は、オイルを送液した後の、実施例１のマイクロウェルアレイを基板側（基板上、マイクロ流体デバイスの底部）から蛍光顕微鏡観察した結果を示す写真である。その結果、図７に示すように、実施例１のマイクロウェルアレイのウェルのパターンに、規則正しくＦＩＴＣ由来の蛍光が観察された。図７において、白く見える部分が蛍光を発しているウェルであり、黒い部分は基板である。この結果は、実施例１のマイクロウェルアレイの各ウェルに、ＦＩＴＣ溶液を封入することができたことを示す。
（実験例２）
　マイクロウェルアレイとして、実施例１のマイクロウェルアレイの代わりに、実施例２のマイクロウェルアレイを使用した以外は、実験例１と同様にして、マイクロウェルアレイにＦＩＴＣ及び界面活性剤を適量溶解した水溶液を封入した。
　図８は、本実験例のマイクロ流体デバイスにオイルを送液した後の状態を示す断面図である。マイクロ流体デバイス６００は、マイクロウェルアレイを保持する底部部材６１０と、蓋部材６２０と、マイクロ流路６３０とを備えていた。本実験例においては、底部部材６１０は、実施例２のマイクロウェルアレイ２００の基板１１０と一体になっていた。
　すなわち、実施例２のマイクロウェルアレイ２００は、底部部材６１０を基板１１０として形成されていた。
　マイクロ流体デバイス６００に水性液体４４０（ＦＩＴＣ及び界面活性剤を適量溶解した水溶液）を不図示の流路入口から送液すると、マイクロウェルアレイ２００のウェル内に水性液体４４０が導入された。続いて、マイクロ流体デバイス６００にオイル４５０を不図示の流路入口から送液すると、マイクロウェルアレイ２００のウェル内に水性液体４４０を保持した状態で、ウェルのウェル入り口近傍にオイル４５０の層が形成された。すなわち、マイクロウェルアレイ２００のウェル内に水性液体４４０が封入された。
　図９は、オイルを送液した後の、実施例２のマイクロウェルアレイを基板側から蛍光顕微鏡観察した結果を示す写真である。その結果、図９に示すように、実施例２のマイクロウェルアレイのウェルのパターンに、規則正しくＦＩＴＣの蛍光が観察された。図９において、白く見える部分が蛍光を発しているウェルであり、黒い部分は基板である。この結果は、実施例２のマイクロウェルアレイの各ウェルに、ＦＩＴＣ溶液を封入することができたことを示す。
　なお、実施例１および実施例２のマイクロウェルアレイにおいて、疎水性樹脂として使用したノボラック樹脂は自家蛍光を有するが、ノボラック樹脂の蛍光値は十分に低く、ノボラック樹脂の蛍光値と検出対象であるＦＩＴＣの蛍光値とは十分な差があるため、ＦＩＴＣの蛍光の検出には支障がなかった。
（実験例３）
　マイクロウェルアレイとして、実施例１のマイクロウェルアレイの代わりに、比較例１のマイクロウェルアレイを使用した以外は、実験例１と同様にして、マイクロウェルアレイにＦＩＴＣ及び界面活性剤を適量溶解した水溶液を封入した。
　図１０は、本実験例のマイクロ流体デバイスにオイルを送液した後の状態を示す断面図である。マイクロ流体デバイス７００は、マイクロウェルアレイを保持する底部部材７１０と、蓋部材７２０と、マイクロ流路７３０とを備えていた。本実験例においては、底部部材７１０は、比較例１のマイクロウェルアレイ３００の基板１１０と一体に形成されていた。すなわち、比較例１のマイクロウェルアレイ３００は、底部部材７１０を基板１１０として形成されていた。
　マイクロ流体デバイス７００に水性液体４４０（ＦＩＴＣ及び界面活性剤を適量溶解した水溶液）を不図示の流路入口から送液し、続いて、オイル４５０を不図示の流路入口から送液すると、水性液体４４０をマイクロウェルアレイ３００のウェル内に保持することができなかった。すなわち、比較例１のマイクロウェルアレイ３００では、ウェル内に水性液体４４０を封入することは困難であった。
　図１１は、オイルを送液した後の、比較例１のマイクロウェルアレイを基板側から蛍光顕微鏡観察した結果を示す写真である。その結果、図１１に示すように、比較例１のマイクロウェルアレイにおいては、複数のウェルにまたがって蛍光が観測され、ウェルのパターンに沿った規則正しいＦＩＴＣの蛍光は観察されなかった。この結果は、比較例１のマイクロウェルアレイには、ＦＩＴＣ溶液を封入することができなかったことを示す。すなわち、疎水層のみでマイクロウェルが形成されている場合、水性溶液を保持することが困難となり、オイルを送液した際に、ウェル内の水性溶液が全てオイルに置き換わってしまうことが明らかとなった。
　以上の結果は、疎水層のみで構成されたマイクロウェルアレイと比較して、ウェル表面に親水性部分及び疎水性部分を有するウェルを備えるマイクロウェルアレイは、水性溶液をウェル内に封入するために非常に有用であることを示す。
　本発明によれば、ウェル内に水性液体を封入することが容易なマイクロウェルアレイを提供することができる。また、上記のマイクロウェルアレイの製造方法、マイクロ流体デバイス、マイクロウェルアレイのウェル内に水性液体を封入する方法及び水性液体の分析方法を提供することができる。例えば、生体由来のＤＮＡやＲＮＡ等の検出により診断を行う場合等に、微小な空間内へ試薬とともに核酸を入れることが可能となる。
　１００，２００，３００，ｍ…マイクロウェルアレイ
　１１０，１１００…基板
　１１５…表面
　１２０，１１２０…親水層
　１３０，１１３０…疎水層
　４００，６００，７００，１０００，２０００…マイクロ流体デバイス
　４１０，６１０，７１０，１１００…底部部材
　４２０，６２０，７２０，１２００…蓋部材
　４３０，６３０，７３０，１３００…マイクロ流路
　４４０…水性液体
　４５０…オイル
　１２１０…流路入口
　１２２０流路出口
　１４００…封止部材

Claims (17)

  1. 　マイクロウェルアレイであって、
    　ウェル表面に親水性部分及び疎水性部分を有する複数のウェルを備える、
    　マイクロウェルアレイ。
  2. 　前記複数のウェルのうちそれぞれのウェルの容量が１ｆＬ～６ｎＬである、請求項１に記載のマイクロウェルアレイ。
  3. 　前記複数のウェルの密度が１０万～１０００万個／ｃｍ２である、請求項１又は２に記載のマイクロウェルアレイ。
  4. 　前記複数のウェルは、ウェル上部に前記疎水性部分を有し、前記疎水性部分よりもウェル底部に近い位置に前記親水性部分を有する、請求項１～３のいずれか一項に記載のマイクロウェルアレイ。
  5. 　前記複数のウェルが、電磁波に対し透過性を有する基板上に設けられている、請求項１～４のいずれか一項に記載のマイクロウェルアレイ。
  6. 　前記電磁波が、Ｘ線、紫外線、可視光線又は赤外線である、請求項５に記載のマイクロウェルアレイ。
  7. 　前記基板は、自家蛍光を実質的に有しない材料で形成されている、請求項５又は６に記載のマイクロウェルアレイ。
  8. 　前記親水性部分はＪＩＳ　Ｒ３２５７－１９９９に規定された静滴法に準じて測定した接触角が７０度未満である、請求項１～７のいずれか一項に記載のマイクロウェルアレイ。
  9. 　前記親水性部分がシロキサンポリマーで形成されている、請求項８に記載のマイクロウェルアレイ。
  10. 　前記疎水性部分はＪＩＳ　Ｒ３２５７－１９９９に規定された静滴法に準じて測定した接触角が７０度以上である、請求項１～９のいずれか一項に記載のマイクロウェルアレイ。
  11. 　前記疎水性部分がノボラック樹脂で形成されている、請求項１０に記載のマイクロウェルアレイ。
  12. 　流路と、前記流路内に配置された請求項１～１１のいずれか一項に記載のマイクロウェルアレイとを備える、マイクロ流体デバイス。
  13. 　ウェル内に水性液体を封入する方法であって、
    　流路と、前記流路内に配置された請求項１～１１のいずれか一項に記載のマイクロウェルアレイとを備えるマイクロ流体デバイスを準備し、
    　前記マイクロ流体デバイスの前記流路に水性液体を送液し、前記マイクロウェルアレイのウェルに前記水性液体を導入し、
    　前記流路に封止液を送液し、前記ウェルに導入された前記水性液体の上層に封止液の層を形成させ、前記水性液体を前記ウェル内に封入する、
    　ウェル内に水性液体を封入する方法。
  14. 　マイクロウェルアレイの製造方法であって、
    　電磁波透過性を有する基板上に親水性材料を積層して親水層を形成し、
    　前記親水層上に疎水性材料を積層して疎水層を形成し、
    　前記疎水層を掘削して複数のウェルを形成する、
    　マイクロウェルアレイの製造方法。
  15. 　前記複数のウェルを形成する際に、前記疎水層及び前記親水層を掘削して複数のウェルを形成する、請求項１４に記載のマイクロウェルアレイの製造方法。
  16. 　水性液体の分析方法であって、
    　水性液体が封入された、請求項１～１１のいずれか一項に記載のマイクロウェルアレイのウェルに電磁波を照射し、
    　前記ウェルから放出される蛍光又は燐光を検出する、
    　水性液体の分析方法。
  17. 　前記蛍光又は前記燐光が、請求項１～１１のいずれか一項に記載のマイクロウェルアレイの基板上で検出される、請求項１６に記載の水性液体の分析方法。
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