WO2016147839A1 - ハイドロフォビンの定量方法及び発泡麦芽飲料の噴き性予測方法 - Google Patents

ハイドロフォビンの定量方法及び発泡麦芽飲料の噴き性予測方法 Download PDF

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malt
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久美子 猪本
規央 土井
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アサヒビール株式会社
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Definitions

  • the present invention relates to a method for quantifying hydrophobin which is a causative agent of squirting in sparkling beverages such as beer, and a method for predicting squirtability of sparkling malt beverages based on the quantification results obtained by the method About.
  • Hydrophobin is an amphiphilic low-molecular protein produced by filamentous fungi infected with barley and malt, and directly causes the eruption of effervescent malt beverages such as beer. About 10% of the hydrophobin protein in the raw malt is transferred to the product beer, and among the hydrophobins, the hydrophobin produced by Fusarium spp. Is known to induce the eruption of beer. In addition, it is reported that spraying is caused when the beer is contained in about 3 ⁇ g / L (see Non-Patent Document 1).
  • Quantification of the hydrophobin protein in the sparkling beverage makes it possible to evaluate the sprayability of the beverage. In order to more accurately evaluate jetting properties, it is necessary to quantify hydrophobin with high specificity.
  • a method for quantifying hydrophobin protein an ELISA method using a polyclonal antibody has been used (see Non-Patent Document 1), but the specificity of the used polyclonal antibody is insufficient. Since other than the bin protein is recognized, improvement in the accuracy of quantification is desired. Further, the conventional ELISA method has a problem that, from the viewpoint of sensitivity, the amount of hydrophobin protein in the malt can be quantified, but the amount of hydrophobin protein in the sparkling beverage cannot be quantified.
  • the present invention provides a method for specifically and highly sensitively determining hydrophobin which causes the spraying of the foamed malt beverage, and a method for predicting the ease of the spraying of the foamed malt beverage using the method.
  • the purpose is to do.
  • the present inventors decomposed the peptide bond on the amino group side of the aspartic acid residue in hydrophobin, and among the obtained degradation products, represented by SEQ ID NO: 1 It is possible to detect hydrophobin more specifically than the ELISA method by quantifying the peptide fragment consisting of the amino acid sequence to be determined, and in particular, the peptide fragment can be quantified by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. The inventors have found that hydrophobin can be detected with high sensitivity, and have completed the present invention.
  • the hydrophobin quantification method and the foamability prediction method for foamed malt beverages according to the present invention are the following [1] to [8].
  • [1] A method for quantifying the hydrophobin content in a test sample, (A) decomposing a peptide bond on the amino group side of an aspartic acid residue in a test sample to prepare a peptide fragment mixture; (B) quantifying a peptide fragment consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 from the peptide fragment mixture prepared in the step (A);
  • a method for quantifying hydrophobin comprising: [2]
  • the step (B) is a step of quantifying a peptide fragment consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and a peptide fragment consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 from the peptide fragment mixture, [1]
  • the quantification in the step (B) is performed by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry.
  • hydrophobin can be specifically quantified. Furthermore, by quantifying the peptide fragment by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry, hydrophobin can be quantified with higher sensitivity than ever before.
  • the foamed malt beverage in the present invention and the specification of the present application means a beverage produced using malt as a raw material and having a sparkling property by carbon dioxide gas.
  • an effervescent malt drink both what was manufactured through the fermentation process and what was manufactured without passing through the fermentation process are contained. Further, it may be an alcoholic beverage, a so-called non-alcoholic beverage having an ethanol content of less than 0.05% by volume, or a so-called non-alcoholic beverage having an ethanol content of less than 1% by volume.
  • beer, happoshu, non-alcoholic beer-taste beverages and the like can be mentioned.
  • the hydrophobin quantification method according to the present invention is a method for quantifying the hydrophobin content in a test sample, comprising the following steps ( A) and (B).
  • the quantification method according to the present invention targets a peptide fragment consisting of an amino acid sequence specific to hydrophobin among peptide fragments generated by decomposing a peptide bond on the amino group side of an aspartic acid residue of a hydrophobin protein. Quantify as. Therefore, the quantification method according to the present invention can detect and quantify hydrophobin specifically and with high sensitivity.
  • step (B) of the quantification method according to the present invention at least a peptide fragment (peptide fragment 1) consisting of the amino acid sequence (DVLGVA) represented by SEQ ID NO: 1 is specifically detected and quantified.
  • FIG. 1 is an alignment of amino acid sequences of hydrophobin proteins of each microorganism. As shown in FIG. 1, peptide fragment 1 is an amino acid sequence that is widely conserved in hydrophobin proteins.
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • the partial sequence consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is a hydrophobin derived from Fusarium spp. It is an amino acid sequence that is widely conserved in proteins. For this reason, in step (B) of the quantification method according to the present invention, in addition to peptide fragment 1, a peptide fragment consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (peptide fragment 2) is also specifically detected and quantified.
  • the hydrophobin protein derived from the genus Fusarium can be specifically quantified.
  • the hydrophobin to be quantified in the quantification method according to the present invention is not particularly limited as long as it has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, but Fusarium graminealum, Fusarium carmoram, Fusarium Verticillioides, Fusarium pseudograminearum, Fusarium fujikuroi, Fusarium oxysporam, Fusarium ⁇ poae and other Fusarium species; Trichoderma reesei and other Trichoderma species; Derived from Cryphonectria spp. Such as Cryphonectria parasitica; Claviceps spp. Fusiformis, etc .; Neurospora crassa (Acapangabi), etc.
  • hydrophobin derived from the genus Fusarium is preferably a hydrophobin derived from Fusarium spp. More preferably.
  • the amino acid sequences of hydrophobins derived from each filamentous fungus are shown in Tables 1 and 2. In the table, the sequence surrounded by a square is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and the underlined sequence is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • a peptide bond on the amino group side of an aspartic acid residue of a protein in a test sample is decomposed to prepare a peptide fragment mixture.
  • the degradation method is not particularly limited as long as it is a method capable of cleaving the peptide bond on the amino group side of the aspartic acid residue of the protein, but the peptide on the amino group side of the aspartic acid residue under relatively mild conditions. Since it is possible to specifically decompose only the bond, it is preferable to perform enzymatic degradation with a digestive enzyme. Examples of the digestive enzyme that degrades the peptide bond on the amino group side of the aspartic acid residue of the protein include Asp-N digestive enzyme.
  • both peptide fragment 1 and peptide fragment 2 are sandwiched between aspartic acid residues, and are obtained by hydrolyzing peptide bonds on the amino group side of aspartic acid residues.
  • hydrophobin protein is digested with only Asp-N digestive enzyme, neither peptide fragment 1 nor peptide fragment 2 can be obtained, and Asp-N digestive enzyme and The peptide fragment 1 and the peptide fragment 2 can be obtained by decomposing hydrophobin protein only by using trypsin digestion enzyme together.
  • the enzymatic digestion of the protein in the test sample with trypsin digestive enzyme and Asp-N digestive enzyme may be performed simultaneously with trypsin digestive enzyme and enzymatic digestion with Asp-N digestive enzyme. Thereafter, the digested product may be further subjected to enzymatic digestion with an Asp-N digestive enzyme.
  • Enzymatic degradation with trypsin digestive enzyme and Asp-N digestive enzyme can be performed by a conventional method.
  • Asp-N digestive enzyme has enzyme activity within a wide range of pH 4.0 to 9.0, and the optimum pH of trypsin digestive enzyme is 8.0 to 9.0. For this reason, enzyme digestion is performed in a solution obtained by diluting a test sample with a weak alkaline solution such as an ammonium hydrogen carbonate solution.
  • the peptide fragment mixture obtained in the step (A) may be subjected to the step (B) after being purified and concentrated using a reverse phase chromatography column such as an ODS column (C18 column).
  • a reverse phase chromatography column such as an ODS column (C18 column).
  • test sample used in the quantification method according to the present invention is not particularly limited as long as it is a sample suspected of containing hydrophobin, but it is not suitable for filamentous fungi that produce hydrophobin.
  • Contaminated cereals, foods and drinks manufactured using the cereals as raw materials are preferable, and barley, malt, clarified wort, and foamed malt beverage are more preferable.
  • Malt-derived hydrophobins may be contained in foods and drinks made from malt contaminated with filamentous fungi that produce hydrophobins.
  • a liquid such as an effervescent malt beverage or wort
  • it can be used as a test sample to be subjected to the quantification method according to the present invention as it is or as appropriate as necessary.
  • the extract obtained by extracting hydrophobin protein from the solids is used as a test sample to be subjected to the quantification method according to the present invention as it is or after being appropriately concentrated as necessary.
  • the extraction solvent used for the extraction of hydrophobin protein include alcohols such as ethanol, mixed solvents of alcohol and water, and the like.
  • the protein in the test sample used in the quantification method according to the present invention is obtained by cleaving disulfide bonds by reduction treatment and capping SH groups by alkylation treatment in advance. It is preferable to keep it.
  • the protein reduction treatment can be performed by a conventional method using a known reducing agent such as DTT (dithiothreitol), mercaptoethanol, tris (2-carboxyethyl) phosphine.
  • the protein alkylation treatment can be performed by a conventional method using a known alkylating agent such as iodoacetamide or iodoacetic acid.
  • test sample to be subjected to the quantification method according to the present invention may be preliminarily reduced in the content of proteins other than hydrophobin using various purification methods.
  • the test sample after the reduction / alkylation treatment can be fractionated by a liquid chromatography method, and only the fraction containing hydrophobin protein can be subjected to step (A).
  • the fraction containing hydrophobin protein is separated by a liquid chromatography method using a column for reverse phase chromatography such as an ODS column, and this is subjected to step (A).
  • the peptide fragment quantification method in step (B) of the quantification method according to the present invention is not particularly limited as long as it is a method capable of specifically quantifying a specific peptide fragment. For example, it can be quantified using an immune reaction using a monoclonal antibody that specifically recognizes peptide fragment 1.
  • quantification is preferably performed by a method combining high performance liquid chromatography and mass spectrometry, and high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC / MS / It is more preferable to quantify by MS).
  • mass spectrometry By detecting and quantifying peptide fragments by mass spectrometry, it is possible to quantify not only hydrophobin proteins in malt but also trace amounts of hydrophobin protein in foamed malt beverages.
  • the target peptide fragment can be quantified with high sensitivity from a mixture of peptide fragments containing a wide variety of peptide fragments by MRM analysis.
  • the peptide fragment 1 and the peptide fragment 2 are quantified using the MRM mode of a commercially available high-performance liquid chromatograph triple quadrupole mass spectrometer equipped with a reverse phase chromatography column such as an ODS column. It can be carried out by a conventional method.
  • MRM analysis method hydrophobin protein of about several ⁇ g / L in the foamed malt beverage and hydrophobin protein of less than 1 ⁇ g per 1 g of malt (less than 1 ⁇ g / g malt) can be quantified with high sensitivity.
  • foamed malt beverages such as beer
  • how much is squirted when squirting occurs in the foamed malt beverage Depends on the hydrophobin content.
  • the foamed malt beverage or the hydrophobin content in the malt is quantified by the quantitative method according to the present invention, and the foamed malt produced using the foamed malt beverage or the malt as a raw material based on the obtained quantitative result.
  • the squirtability of the beverage can be predicted. For example, when the hydrophobin content in the foamed malt beverage is 5.6 ppb or more, it can be predicted that the foamed malt beverage is likely to be sprayed.
  • a digestion enzyme that is highly likely to produce a peptide fragment with a length of about 6 to 16 amino acids from the amino acid sequence of hydrophobin was examined.
  • the peptide bond on the terminal side of the carboxyl group of glutamic acid and aspartic acid was cleaved by hydrolysis.
  • V8 protease yields a peptide fragment of VLGVAD (SEQ ID NO: 19) that is in the range of 6-16 amino acids in length, has no post-translational modification sites, and other proteins do not have the same amino acid sequence The possibility was suggested.
  • hydrophobin protein was enzymatically digested with V8 protease, and the obtained peptide fragment mixture was analyzed in the MRM mode of LC / MS / MS to examine whether it could be identified as hydrophobin.
  • HFB-producing transformant was prepared by introducing a gene encoding a hydrophobin derived from Fusarium graminealum into Aspergillus oryzae. The transformant was cultured, and 10 mL of 170 mM Tris / HCl (pH 9.0) containing 1% SDS was added to the obtained bacterial cells, followed by extraction at room temperature for 1 hour. Next, after centrifuging at 8,000 ⁇ g for 25 minutes, 40% amount of 2M KCl was added to the obtained supernatant, and centrifuging was performed at 8,000 ⁇ g for 25 minutes. The filtrate obtained by filtering the obtained supernatant using a filter (DISMIC (registered trademark) -25CS-0.20 ⁇ m, manufactured by ADVANTEC) was used as a purified HFB solution.
  • DISMIC registered trademark
  • ⁇ Reduction / alkylation treatment Specifically, first, 300 ⁇ L of a reducing agent (100 mM ammonium bicarbonate aqueous solution containing 10 mM DTT) was added to and mixed with 20 ⁇ L of purified HFB solution, and incubated at 56 ° C. for 30 minutes. After returning the mixed solution after the incubation to room temperature, 300 ⁇ L of an alkylating agent (55 mM iodoacetamide aqueous solution) was added and mixed, and incubated at room temperature for 30 minutes. The mixture after the incubation was centrifuged and dried at room temperature to obtain a purified HFB dry powder that had been reduced and alkylated.
  • a reducing agent 100 mM ammonium bicarbonate aqueous solution containing 10 mM DTT
  • ⁇ Digestion> The obtained dry powder was dissolved in a 50 mM aqueous solution of ammonium bicarbonate (224 ⁇ L) to which V8 protease was added, and then incubated at 37 ° C. for 24 hours for enzyme digestion.
  • the peptide fragment mixture obtained after the digestion treatment was centrifuged and dried at room temperature, and then dissolved in 100 ⁇ L of a 0.1 vol% formic acid aqueous solution.
  • Example 1 In order to examine peptide fragments of hydrophobin that can be analyzed by LC / MS / MS, hydrophobin protein was digested with various digestive enzymes, and the obtained peptide fragment mixture was analyzed by LC / MS / MS. It was examined whether the bottle was identifiable.
  • an HFB-producing transformant of Aspergillus oryzae was cultured to produce a hydrophobin protein derived from Fusarium graminealum, and a cell culture of the transformant
  • the hydrophobin protein extracted from was separated by SDS-PAGE, and the gel fragment of the hydrophobin protein band was cut out.
  • 100 ⁇ L of a 100 mM ammonium hydrogen carbonate aqueous solution and 10 ⁇ L of a reduction treatment solution (a solution in which 1.5 mg of DTT is dissolved in 1 mL of 100 mM ammonium hydrogen carbonate aqueous solution) are added to the cut gel piece, and the gel piece is removed at 56 ° C. Incubated for minutes. 10 ⁇ L of an alkylation solution (10 mg of iodoacetamide dissolved in 1 mL of 100 mM aqueous ammonium hydrogen carbonate solution) was added to the solution after incubation and incubated at room temperature for 30 minutes.
  • a reduction treatment solution a solution in which 1.5 mg of DTT is dissolved in 1 mL of 100 mM ammonium hydrogen carbonate aqueous solution
  • trypsin digestion enzyme, Asp-N digestion enzyme, Glu-C digestion enzyme that hydrolyzes the peptide bond on the carboxyl group side of glutamic acid residue, and carboxyl group of arginine residue as shown in Table 3
  • Arg-C digestive enzyme that hydrolyzes the peptide bond on the side and Lys-C digestive enzyme that hydrolyzes the peptide bond on the carboxyl side of the lysine residue are added in one or a combination and incubated at 37 ° C for 16 hours The enzyme digestion reaction was performed.
  • the peptide fragment mixture obtained after the digestion treatment was centrifuged and dried at room temperature, and then dissolved in 7 ⁇ L of a 0.1 volume% formic acid aqueous solution.
  • Example 2 A purified HFB solution prepared in the same manner as in Reference Example 1 was used as a test sample and digested with the digestive enzymes shown in Table 4 in solution without separation by SDS-PAGE. It was analyzed by MS / MS to determine whether hydrophobin could be identified. Specifically, first, 150 ⁇ L of a reduction treatment solution (100 mM ammonium bicarbonate aqueous solution containing 10 mM DTT) was added to 8 ⁇ L of purified HFB solution, mixed, and incubated at 56 ° C. for 30 minutes.
  • a reduction treatment solution 100 mM ammonium bicarbonate aqueous solution containing 10 mM DTT
  • alkylation solution 55 mM iodoacetamide aqueous solution
  • alkylation solution 55 mM iodoacetamide aqueous solution
  • Reduced and alkylated purified HFB dry powder Prepared.
  • the obtained dry powder was dissolved in a 50 mM aqueous ammonium hydrogen carbonate solution (224 ⁇ L) to which each digestive enzyme was added, and then incubated at 37 ° C. for 16 hours for enzyme digestion treatment.
  • the peptide fragment mixture obtained after the digestion treatment was centrifuged and dried at room temperature, and then dissolved in 100 ⁇ L of a 0.1 vol% formic acid aqueous solution.
  • Reference Example 2 A purified HFB solution prepared in the same manner as in Reference Example 1 was added to commercially available beer, and then filled in a container (bottle), and the sprayability was examined. Specifically, the sprayability was measured as follows. First, container beer was set in a rotating machine, and after rotating and stirring at 25 ° C. for 24 hours, the beer was allowed to stand at 25 ° C. for 10 minutes. Subsequently, the mixture was stirred by overturning 3 times for 10 seconds, and then left to stand for 30 seconds with the lid on top. Thereafter, the lid was opened and the amount of beer sprayed was measured.
  • Table 5 shows the measurement results of the concentration (ppb) and the amount of spray (mL) of purified HFB added to beer.
  • “H” means a state in which bubbles are raised from the bottle mouth (hat).
  • Example 3 The amount of hydrophobin in beer was analyzed by LC / MS / MS. Peptide fragment 1 (labeled peptide fragment 1) and peptide fragment 2 (labeled peptide fragment 2) using leucine labeled with 13 C 6 and 15 N were used as stable isotope-labeled hydrophobin preparations, respectively. .
  • Sample beer was prepared by adding 7 ⁇ L of purified HFB solution to 50 mL of commercial beer.
  • ⁇ Reduction / alkylation treatment The prepared sample beer was reduced and alkylated. Specifically, first, in 20 ⁇ L of beer, 2 ⁇ L of labeled peptide fragment 1 solution (1 nmol of labeled peptide fragment 1 dissolved in 100 mM ammonium bicarbonate aqueous solution (500 ⁇ L)) and 2 ⁇ L of labeled peptide fragment 2 A solution (a solution obtained by dissolving 1 nmol of labeled peptide fragment 2 in 100 mM ammonium bicarbonate aqueous solution (500 ⁇ L)) and 300 ⁇ L of a reducing agent (100 mM ammonium bicarbonate aqueous solution containing 10 mM DTT) are added and mixed, and 56 Incubated for 30 minutes at ° C.
  • a reducing agent 100 mM ammonium bicarbonate aqueous solution containing 10 mM DTT
  • the formic acid solution of the prepared peptide fragment mixture was purified by applying it to a MonoSpin (registered trademark) C18 column (manufactured by GL Sciences Inc.). Specifically, first, a MonoSpin C18 column was set in a waste tube, 100 ⁇ L of methanol was applied to the column, centrifuged at room temperature of 5000 ⁇ g for 2 minutes, and then 100 ⁇ L of the column was further added. Ultrapure water was applied and centrifuged at room temperature and 5000 ⁇ g for 2 minutes.
  • a formic acid solution of the prepared peptide fragment mixture was applied to the column, centrifuged at room temperature and 5000 ⁇ g for 2 minutes, and further 300 ⁇ L of 0.1 volume% formic acid containing 5% was added to the column.
  • a volume% methanol solution was applied and centrifuged at room temperature, 5000 ⁇ g for 2 minutes.
  • 100 ⁇ L of methanol was applied to the column, and centrifuged at room temperature, 5000 ⁇ g for 2 minutes to recover the elution solution.
  • the recovered elution solution was centrifuged and dried at room temperature, and then dissolved in 100 ⁇ L of a 0.1 vol% formic acid aqueous solution.
  • the obtained lysate was centrifuged at 20000 ⁇ g for 10 minutes, and the resulting supernatant was subjected to LC / MS / MS.
  • the peptide fragment 1 obtained by digesting the hydrophobin protein in beer with trypsin digestive enzyme and Asp-N digestive enzyme was quantified by LC / MS / MS, thereby obtaining a very small amount of hydrophobine of 2.0 ppb. It was confirmed that the phobin can be accurately quantified.
  • Example 4 The amount of hydrophobin in the malt was quantified by the quantification method and the ELISA method according to the present invention, and the sprayability of beer produced using the malt was examined.
  • the malt used 5 types from different lots.
  • the peptide fragment 1 obtained by digesting hydrophobin protein in malt with trypsin digestive enzyme and Asp-N digestive enzyme was quantified by LC / MS / MS to obtain 12.3 ppb ( It was confirmed that a very small amount of hydrophobin (0.12 ⁇ g / g malt) can be accurately quantified in terms of malt.
  • the hydrophobin content in the malt extract was measured by competitive ELISA using an antibody against Fusarium poae hydrophobin (FpGUSH) as an anti-hydrophobin antibody (Sarlin, “Detection and characterization of Fusarium hydrophobins”). inducing gushing in beer ”, VTT SCIENCE 13, 2012).
  • FpGUSH Fusarium poae hydrophobin
  • a 5 g malt sample finely pulverized with a disk mill was suspended in 50 mL of PBS (phosphate physiological saline) buffer for 1 hour, the resulting extract was centrifuged, and the recovered supernatant was treated with a malt extract (measurement sample). ).

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Abstract

本発明は、発泡麦芽飲料の噴きの原因となるハイドロフォビンを、高感度に定量する方法、及び当該方法を利用して発泡麦芽飲料の噴き性を予測する方法を提供する。本発明は、被検試料中のハイドロフォビン含有量を定量する方法であって、（Ａ）被検試料中のタンパク質のアスパラギン酸残基のアミノ基側のペプチド結合を分解し、ペプチド断片混合物を調製する工程と、（Ｂ）前記工程（Ａ）で調製されたペプチド断片混合物から、少なくとも配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド断片を定量する工程とを有する、ハイドロフォビンの定量方法である。

Description

ハイドロフォビンの定量方法及び発泡麦芽飲料の噴き性予測方法
　本発明は、ビール等の発泡性飲料において噴きの原因物質であるハイドロフォビン（Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｎ）を定量する方法、及び当該方法により得られた定量結果に基づいて発泡麦芽飲料の噴き性を予測する方法に関する。
　本願は、２０１５年３月１７日に、日本に出願された特願２０１５－０５２８６８号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　ビール等の発泡性飲料においては、「噴き」という開栓時に飲料が噴きこぼれる現象がある。噴きは、ブランドイメージを損なう恐れのある品質上の問題であり、発泡性飲料においては、噴きの抑制が重要である。発泡性飲料における噴きを抑制するための方法として、例えば、ホップ由来苦味成分の添加量と噴きの程度の相関関係を利用する方法がある（例えば、特許文献１参照。）。ホップ由来苦味成分の添加量を、噴きが生じ難い濃度に調整することによって容器に充填される発泡性飲料の噴きを抑制できる。
　ハイドロフォビンは、大麦や麦芽に感染した糸状菌が産生する両親媒性低分子タンパク質であり、ビール等の発泡性麦芽飲料の噴きの直接的な原因となる。原料麦芽中のハイドロフォビンタンパク質の１０％程度が製品ビール中に移行し、ハイドロフォビンの中でもフザリウム（Fusarium）属菌が産生するハイドロフォビンは特にビールの噴きを誘発することが知られており、ビール中に３μｇ／Ｌ程度含まれていると噴きが引き起こされると報告されている（非特許文献１参照）。
　発泡性飲料中のハイドロフォビンタンパク質を定量することによって、当該飲料の噴き性の評価が可能となる。より正確に噴き性を評価する為には、特異性高くハイドロフォビンを定量する必要がある。従来、ハイドロフォビンタンパク質の定量方法としては、ポリクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ法が使用されているが（非特許文献１参照）、使用されているポリクローナル抗体は、特異性が充分ではなく、ハイドロフォビンタンパク質以外も認識してしまうことから、定量の精度としては改善が望まれている。また、従来のＥＬＩＳＡ法では、感度の点から、麦芽中のハイドロフォビンタンパク質量は定量できるものの、発泡性飲料中のハイドロフォビンタンパク質を定量することができない、という問題があった。
特開２０１３－７４８３８号公報
Sarlin et al.，Journal of the Institute of Brewing，2005，vol.111(2)，p.105-111
　本発明は、発泡麦芽飲料の噴きの原因となるハイドロフォビンを、特異的かつ高感度に定量する方法、及び当該方法を利用して発泡麦芽飲料の噴きの生じやすさを予測する方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、ハイドロフォビン中のアスパラギン酸残基のアミノ基側のペプチド結合を分解し、得られた分解物のうち、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド断片を定量することにより、ＥＬＩＳＡ法よりも特異的にハイドロフォビンを検出できること、特に、当該ペプチド断片の定量を高速液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析法により行うことによって高感度にハイドロフォビンを検出できることを見出し、本発明を完成させた。
　本発明に係るハイドロフォビンの定量方法及び発泡麦芽飲料の噴き性予測方法は、下記［１］～［８］である。
［１］　被検試料中のハイドロフォビン含有量を定量する方法であって、
（Ａ）被検試料中のアスパラギン酸残基のアミノ基側のペプチド結合を分解し、ペプチド断片混合物を調製する工程と、
（Ｂ）前記工程（Ａ）で調製されたペプチド断片混合物から、少なくとも配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド断片を定量する工程と、
を有する、ハイドロフォビンの定量方法。
［２］　前記工程（Ｂ）が、ペプチド断片混合物から少なくとも配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド断片及び配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド断片を定量する工程である、前記［１］のハイドロフォビンの定量方法。
［３］　前記ハイドロフォビンが、フザリウム属菌、トリコデルマ属菌、クリフォネクトリア属菌、クラビセプス属菌、又はニューロスポラ属菌由来である、前記［１］又は［２］のハイドロフォビンの定量方法。
［４］　工程（Ａ）における分解が、トリプシン消化酵素及びＡｓｐ－Ｎ消化酵素による酵素分解である、前記［１］～［３］のいずれかのハイドロフォビンの定量方法。
［５］　工程（Ｂ）における定量を、高速液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析法により行う、前記［１］～［４］のいずれかのハイドロフォビンの定量方法。
［６］　工程（Ｂ）における定量を、高速液体クロマトグラフ三連四重極型質量分析計のＭＲＭ分析法により行う、前記［１］～［４］のいずれかのハイドロフォビンの定量方法。
［７］　発泡麦芽飲料又は麦芽中のハイドロフォビン含有量を、前記［１］～［６］のいずれかのハイドロフォビンの定量方法により定量し、得られた定量結果に基づき、前記発泡麦芽飲料又は前記麦芽を原料として製造された発泡麦芽飲料の噴きの生じやすさを予測する、発泡麦芽飲料の噴き性予測方法。
［８］　発泡麦芽飲料中のハイドロフォビンを定量し、ハイドロフォビン含有量が５．６ｐｐｂ以上の場合には、前記発泡麦芽飲料は噴きを生じやすいと予測する、前記［７］の発泡麦芽飲料の噴き性予測方法。
　本発明に係るハイドロフォビンの定量方法は、ハイドロフォビンに特徴的なアミノ酸配列からなるペプチド断片を標的とするため、ハイドロフォビンを特異的に定量することができる。さらに、当該ペプチド断片の定量を、高速液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析法により行うことによって、従来になく高感度にハイドロフォビンを定量できる。
各微生物のハイドロフォビンタンパク質のアミノ酸配列のアラインメント図である。
　本発明及び本願明細書における発泡麦芽飲料とは、麦芽を原料として製造される飲料であって、炭酸ガスによる発泡性を有する飲料を意味する。発泡麦芽飲料としては、発酵工程を経て製造されたものと発酵工程を経ずに製造されたものの両方が含まれる。また、アルコール飲料であってもよく、エタノール含有量が０．０５容量％未満であるいわゆるノンアルコール飲料であってもよく、エタノール含有量が１容量％未満であるいわゆるノンアルコール飲料であってもよい。具体的には、ビール、発泡酒、ノンアルコールビールテイスト飲料等が挙げられる。
　本発明に係るハイドロフォビンの定量方法（以下、「本発明に係る定量方法」ということがある。）は、被検試料中のハイドロフォビン含有量を定量する方法であって、下記工程（Ａ）及び（Ｂ）を有する。
（Ａ）被検試料中のタンパク質のアスパラギン酸残基のアミノ基側のペプチド結合を分解し、ペプチド断片混合物を調製する工程と、
（Ｂ）前記工程（Ａ）で調製されたペプチド断片混合物から、少なくとも配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド断片を定量する工程。
　本発明に係る定量方法は、ハイドロフォビンタンパク質のアスパラギン酸残基のアミノ基側のペプチド結合を分解することによって生じるペプチド断片のうち、ハイドロフォビンに特異的なアミノ酸配列からなるペプチド断片を標的として定量する。このため、本発明に係る定量方法は、ハイドロフォビンを特異的かつ高感度に検出して定量することができる。
　具体的には、本発明に係る定量方法の工程（Ｂ）においては、少なくとも、配列番号１で表されるアミノ酸配列（ＤＶＬＧＶＡ）からなるペプチド断片（ペプチド断片１）を特異的に検出して定量する。図１は、各微生物のハイドロフォビンタンパク質のアミノ酸配列のアラインメントである。図１に示すように、ペプチド断片１は、ハイドロフォビンタンパク質において広く保存されているアミノ酸配列である。また、ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）のデータベースで検索したところ、ペプチド断片１と同一配列を有するタンパク質が複数存在したが、ペプチド断片１及びペプチド断片２の配列を有するタンパク質はフザリウム・グラミネアルム（Fusarium graminearum）（赤カビ）、フザリウム・カルモラム（Fusarium culmorum）、フザリウム・バーティシリオイデス（Fusarium verticillioides）、フザリウム・シュードグラミネアラム（Fusariumpseudograminearum）、フザリウム・フジクロイ（Fusarium fujikuroi）、及びフザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）のいずれかに由来するＨＦＢタンパク質に限定された。
　また、図１に示すように、配列番号２で表されるアミノ酸配列（ＤＱＧＩＬＣＮＴＰＴＧＶＱＤ）からなる部分配列は、ビール等の発泡性麦芽飲料の噴きの主な原因であるフザリウム属菌由来のハイドロフォビンタンパク質において広く保存されているアミノ酸配列である。このため、本発明に係る定量方法の工程（Ｂ）において、ペプチド断片１に加えて、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド断片（ペプチド断片２）も特異的に検出して定量することにより、フザリウム属菌由来のハイドロフォビンタンパク質を特異的に定量することができる。
　本発明に係る定量方法において定量されるハイドロフォビンとしては、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するものであれば特に限定されるものではないが、フザリウム・グラミネアルム、フザリウム・カルモラム、フザリウム・バーティシリオイデス、フザリウム・シュードグラミネアラム、フザリウム・フジクロイ、フザリウム・オキシスポラム、フザリウム・ポアエ（Fusarium poae）等のフザリウム属菌；トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）等のトリコデルマ属菌；クリフォネクトリア・パラシチカ（Cryphonectria parasitica）等のクリフォネクトリア属菌；クラビセプス・フシホルミス（Claviceps fusiformis）等のクラビセプス属菌；ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）（アカパンカビ）等のニューロスポラ属菌等に由来するハイドロフォビンであることが好ましく、フザリウム属菌由来のハイドロフォビンであることがより好ましく、フザリウム・グラミネアルム、フザリウム・カルモラム、フザリウム・バーティシリオイデス、又はフザリウム・オキシスポラム由来のハイドロフォビンであることがさらに好ましい。各糸状菌由来のハイドロフォビンのアミノ酸配列を表１及び２に示す。表中、四角で囲われた配列は配列番号１のアミノ酸配列であり、下線を付した配列が配列番号２のアミノ酸配列である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　本発明に係る定量方法は、まず、工程（Ａ）として、被検試料中のタンパク質のアスパラギン酸残基のアミノ基側のペプチド結合を分解し、ペプチド断片混合物を調製する。分解方法は、タンパク質のアスパラギン酸残基のアミノ基側のペプチド結合を切断可能な方法であれば特に限定されるものではないが、比較的穏和な条件でアスパラギン酸残基のアミノ基側のペプチド結合のみを特異的に分解することが可能であることから、消化酵素による酵素分解であることが好ましい。タンパク質のアスパラギン酸残基のアミノ基側のペプチド結合を分解する消化酵素としては、例えば、Ａｓｐ－Ｎ消化酵素が挙げられる。
　図１のアミノ酸配列に示すように、ペプチド断片１とペプチド断片２は、いずれもアスパラギン酸残基で挟まれており、アスパラギン酸残基のアミノ基側のペプチド結合を加水分解することによって得られる。ただし、後記実施例において示すように、ハイドロフォビンタンパク質をＡｓｐ－Ｎ消化酵素のみで消化した場合には、ペプチド断片１とペプチド断片２のいずれも得ることができず、Ａｓｐ－Ｎ消化酵素とトリプシン消化酵素を併用することによってはじめてハイドロフォビンタンパク質を分解してペプチド断片１とペプチド断片２を得ることができる。アミノ酸配列からは、Ａｓｐ－Ｎ消化酵素のみによってペプチド断片１とペプチド断片２が得られると想定されるにもかかわらず、Ａｓｐ－Ｎ消化酵素のみではこれらのペプチド断片が得られない理由は明らかではないが、配列番号１及び２で表されるアミノ酸配列からなる領域はハイドロフォビンタンパク質の内部に折りたたまれているためではないかと推察される。トリプシン消化酵素によりハイドロフォビンタンパク質が消化されることにより、配列番号１及び２で表されるアミノ酸配列が表面に露出してはじめてＡｓｐ－Ｎ消化酵素により消化される。
　被検試料中のタンパク質のトリプシン消化酵素及びＡｓｐ－Ｎ消化酵素による酵素分解は、トリプシン消化酵素による酵素消化とＡｓｐ－Ｎ消化酵素による酵素消化を同時に行ってもよく、トリプシン消化酵素による酵素消化の後、得られた消化物に対してさらにＡｓｐ－Ｎ消化酵素による酵素消化を行ってもよい。トリプシン消化酵素及びＡｓｐ－Ｎ消化酵素による酵素分解は、常法により行うことができる。Ａｓｐ－Ｎ消化酵素は、ｐＨ４．０～９．０の広い範囲内で酵素活性を有しており、トリプシン消化酵素の至適ｐＨは８．０～９．０である。このため、被検試料を炭酸水素アンモニウム溶液等の弱アルカリ性溶液で希釈した溶液中にて酵素消化を行う。
　工程（Ａ）において得られたペプチド断片混合物は、ＯＤＳカラム（Ｃ１８カラム）等の逆相クロマトグラフィー用カラムを用いて精製・濃縮を行った後に工程（Ｂ）に供されてもよい。
　本発明に係る定量方法に供される被検試料としては、ハイドロフォビンを含有していることが疑われる試料であれば特に限定されるものではないが、ハイドロフォビンを生産する糸状菌に汚染された穀物類や、当該穀物類を原料として製造された飲食品等であることが好ましく、大麦、麦芽、清澄化した後の麦汁、発泡麦芽飲料であることがより好ましい。ハイドロフォビンを生産する糸状菌に汚染された麦芽を原料とした飲食品中には、麦芽由来のハイドロフォビンが含有されているおそれがある。
　発泡麦芽飲料や麦汁のような液体の場合には、そのまま又は必要に応じて適宜濃縮したものを、本発明に係る定量方法に供される被検試料として用いることができる。麦等の固形分の場合には、当該固形分からハイドロフォビンタンパク質を抽出した抽出液を、そのまま又は必要に応じて適宜濃縮した後、本発明に係る定量方法に供される被検試料として用いることができる。ハイドロフォビンタンパク質の抽出に用いられる抽出溶媒としては、エタノール等のアルコール、アルコールと水との混合溶媒等が挙げられる。
　タンパク質の分解を安定的に行うために、本発明に係る定量方法に供される被検試料中のタンパク質は、予め、ジスルフィド結合を還元処理により切断し、ＳＨ基をアルキル化処理によりキャップしておくことが好ましい。タンパク質の還元処理は、ＤＴＴ（ジチオトレイトール）、メルカプトエタノール、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン等の公知の還元剤を利用して常法により行うことができる。また、タンパク質のアルキル化処理は、ヨードアセトアミド、ヨード酢酸等の公知のアルキル化剤を利用して常法により行うことができる。
　本発明に係る定量方法に供される被検試料は、予め、各種精製方法を利用して、ハイドロフォビン以外のタンパク質の含有量を低下させておいてもよい。例えば、還元・アルキル化処理後の被検試料を液体クロマトグラフィー法により分画し、ハイドロフォビンタンパク質を含む画分のみを工程（Ａ）に供することができる。例えば、ＯＤＳカラム等の逆相クロマトグラフィー用カラムを用いた液体クロマトグラフィー法により、ハイドロフォビンタンパク質を含む画分を分離し、これを工程（Ａ）に供する。
　本発明に係る定量方法の工程（Ｂ）におけるペプチド断片の定量方法は、特定のペプチド断片を特異的に定量可能な方法であれば特に限定されるものではない。例えば、ペプチド断片１を特異的に認識するモノクローナル抗体を用いた免疫反応を利用して定量することができる。本発明に係る定量方法においては、高感度に定量できることから、高速液体クロマトグラフィー法と質量分析法を組み合わせた方法により定量することが好ましく、高速液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析法（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）により定量することがより好ましい。ペプチド断片を質量分析法により検出し定量することにより、麦芽中のハイドロフォビンタンパク質のみならず、発泡麦芽飲料中の極微量のハイドロフォビンタンパク質も定量可能となる。
　本発明に係る定量方法の工程（Ｂ）におけるペプチド断片の定量方法としては、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳのうち、特に、高速液体クロマトグラフ三連四重極型質量分析計のＭＲＭ（Multiple Reaction Monitoring）分析法により行うことが好ましい。ＭＲＭ分析法は、２回の質量選択を行うため、Ｓ／Ｎ比が高い測定が可能である。このため、ＭＲＭ分析法により、多種多様なペプチド断片を含むペプチド断片混合物の中から、目的のペプチド断片を高感度に定量することができる。具体的には、ペプチド断片１及びペプチド断片２の定量は、ＯＤＳカラム等の逆相クロマトグラフィー用カラムを設置した市販の高速液体クロマトグラフ三連四重極型質量分析計のＭＲＭモードを用いて常法により実施することができる。ＭＲＭ分析法により、発泡麦芽飲料中の数μｇ／Ｌ程度のハイドロフォビンタンパク質や、麦芽１ｇ当り１μｇ未満（１μｇ／ｇ　ｍａｌｔ未満）のハイドロフォビンタンパク質を高感度に定量することができる。
　ビール等の発泡麦芽飲料の噴き性、すなわち、容器詰された発泡性飲料の開栓時に噴きが生じるかどうか、噴きが生じた場合にはどの程度の量が噴くかは、当該発泡麦芽飲料中のハイドロフォビン含有量に依存する。発泡麦芽飲料中のハイドロフォビン含有量が少なければすくないほど、噴きが生じ難く、ハイドロフォビン含有量が多くなるほど、噴きが生じやすく、噴く量も多くなる。このため、発泡麦芽飲料又は麦芽中のハイドロフォビン含有量を、本発明に係る定量方法により定量し、得られた定量結果に基づき、前記発泡麦芽飲料又は前記麦芽を原料として製造された発泡麦芽飲料の噴き性を予測することができる。例えば、発泡麦芽飲料中のハイドロフォビン含有量が５．６ｐｐｂ以上の場合には、前記発泡麦芽飲料は噴きを生じやすいと予測することができる。
　次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［参考例１］
　本発明者等は、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによるハイドロフォビンの高感度定量を目的として、定量対象となるハイドロフォビンのペプチド断片の選択を試みた。
　一般的には、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより検出するためにペプチド断片は、トリプシン消化された物を用いる。しかし、ＭＳにより安定的に検出可能なペプチド断片としては、６～１６アミノ酸程度の長さであり、翻訳語修飾部位を含まないことが好ましいが、ハイドロフォビンタンパク質をトリプシン消化した場合に得られるペプチド断片は２１アミノ酸以上と長く、不適当であった。
　ハイドロフォビンのアミノ酸配列から、６～１６アミノ酸程度の長さのペプチド断片が得られる可能性の高い消化酵素を調べたところ、グルタミン酸及びアスパラギン酸のカルボキシル基末端側のペプチド結合を加水分解により切断するＶ８プロテアーゼにより、長さが６～１６アミノ酸の範囲内であり、翻訳後修飾部位がなく、他のタンパク質が同一のアミノ酸配列を有していないＶＬＧＶＡＤ（配列番号１９）のペプチド断片が得られる可能性が示唆された。そこで、ハイドロフォビンタンパク質をＶ８プロテアーゼにより酵素消化し、得られたペプチド断片混合物をＬＣ／ＭＳ／ＭＳのＭＲＭモードで分析し、ハイドロフォビンであると同定できるかどうかを調べた。
＜精製ＨＦＢ液の調製＞
　アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）にフザリウム・グラミネアルム由来のハイドロフォビンをコードする遺伝子を導入したＨＦＢ産生形質転換体を作製した。当該形質転換体を培養し、得られた菌体に、１％ＳＤＳを含有する１７０ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ９．０）１０ｍＬを添加し、室温にて１時間抽出した。次に、８，０００×ｇ で２５分間遠心分離処理した後、取得した上清に対して４０％量の２Ｍ　ＫＣｌを添加し、８，０００×ｇで２５分間遠心分離処理した。得られた上清をフィルター（ＤＩＳＭＩＣ（登録商標）－２５ＣＳ－０．２０μｍ、ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）を用いて濾過した濾液を、精製ＨＦＢ液とした。
＜還元・アルキル化処理＞
　具体的には、まず、２０μＬの精製ＨＦＢ液に、３００μＬの還元剤（１０ｍＭ ＤＴＴを含有する１００ｍＭ　炭酸水素アンモニウム水溶液）を添加して混合し、５６℃で３０分間インキュベートした。インキュベート後の混合液を室温に戻した後、３００μＬのアルキル化剤（５５ｍＭ　ヨードアセトアミド水溶液）を添加して混合し、室温で３０分間インキュベートした。インキュベート後の混合液を室温で遠心乾燥させることにより、還元・アルキル化処理済の精製ＨＦＢ乾燥粉末を得た。
＜消化＞
　得られた乾燥粉末を、Ｖ８プロテアーゼを添加した５０ｍＭ　炭酸水素アンモニウム水溶液（２２４μＬ）に溶解させた後、３７℃で２４時間インキュベートし酵素消化処理を行った。消化処理後に得られたペプチド断片混合物を、室温で遠心乾燥させた後、１００μＬの０．１容量％ギ酸水溶液に溶解させた。
＜ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ＞
　調製されたペプチド断片混合物のギ酸溶液を、下記の条件でＬＣ／ＭＳ／ＭＳを行った。
（ＬＣ条件）
装置：ＥＺＣｈｒｏｍ　Ｅｌｉｔｅ　Ｃｌｉｅｎｔ（日立ハイテクノロジーズ社製）
カラム：ＸＳＥＬＥＣＴ　ＣＳＨ１３０　Ｃ１８（２．１ｍｍ（ＩＤ）×１５０ｍｍ、粒子径２．５μｍ）（ウォーターズ社製）
移動相Ａ：０．１容量％ギ酸水溶液
移動相Ｂ：０．１容量％ギ酸－アセトニトリル溶液
グラジエント条件：
０～５分 ５容量％移動相Ｂ、５～６０分　５～６０容量％移動相Ｂ、６０～６５分　６０～９０容量％移動相Ｂ、６５～７０分　９０容量％移動相Ｂ
カラム：６０℃、流速：０．２ｍＬ／分
（ＭＳ／ＭＳ条件）
装置：ＥＳＩ－ＱｑＴＯＦ　ＱＳＴＡＲ　Ｅｌｉｔｅ（ＡＢ　Ｓｃｉｅｘ社製）
Ｐｏｌａｒｉｔｙ：Ｐｏｓｉｔｉｖｅ モード
ＩｏｎＳｐｒａｙ電圧：５５００Ｖ
Ｉｏｎ　Ｓｏｕｒｃｅ　Ｇａｓ１：５０
Ｉｏｎ　Ｓｏｕｒｃｅ　Ｇａｓ２：５０
Ｃｕｒｔａｉｎ　Ｇａｓ：３０
　ＭＳ／ＭＳの結果、ＨＦＢ由来のペプチド断片は検出されず、また、検出されたペプチド断片について、データベースＰｒｏｔｅｉｎ　Ｐｉｌｏｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてデータベース検索したところ、ＨＦＢタンパク質を同定することはできなかった。
［実施例１］
　ＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより分析可能なハイドロフォビンのペプチド断片を調べるために、ハイドロフォビンタンパク質を各種消化酵素により消化し、得られたペプチド断片混合物をＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより分析し、ハイドロフォビンが同定可能かどうかを調べた。
　具体的には、まず、参考例１と同様にして、アスペルギルス・オリゼのＨＦＢ産生形質転換体を培養してフザリウム・グラミネアルム由来のハイドロフォビンタンパク質を製造させ、当該形質転換体の菌体培養物から抽出したハイドロフォビンタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離し、ハイドロフォビンタンパク質のバンドのゲル片を切り出した。
　切り出されたゲル片に対して、１００μＬの１００ｍＭ炭酸水素アンモニウム水溶液及び１０μＬの還元処理液（１．５ｍｇのＤＴＴを１ｍＬの１００ｍＭ　炭酸水素アンモニウム水溶液に溶解させた溶液）を添加して５６℃で３０分間インキュベートした。インキュベート後の溶液に１０μＬのアルキル化処理液（１０ｍｇのヨードアセトアミドを１ｍＬの１００ｍＭ　炭酸水素アンモニウム水溶液に溶解させた溶液）を添加して室温で３０分間インキュベートした。
　インキュベート後の混合液に、表３に記載の通り、トリプシン消化酵素、Ａｓｐ－Ｎ消化酵素、グルタミン酸残基のカルボキシル基側のペプチド結合を加水分解するＧｌｕ－Ｃ消化酵素、アルギニン残基のカルボキシル基側のペプチド結合を加水分解するＡｒｇ－Ｃ消化酵素、リジン残基のカルボキシル基側のペプチド結合を加水分解するＬｙｓ－Ｃ消化酵素を１種類又は２種類組み合わせて添加し、３７℃で１６時間インキュベートすることにより酵素消化反応を行った。消化処理後に得られたペプチド断片混合物を、室温で遠心乾燥させた後、７μＬの０．１容量％ギ酸水溶液に溶解させた。
＜ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ＞
　調製されたペプチド断片混合物のギ酸溶液を、下記の条件でＬＣ／ＭＳ／ＭＳを行った。
（ｎａｎｏＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ条件）
装置：ｎａｎｏＵＰＬＣＥＳＩ－ＭＳ（ウォーターズ社製）
トラップカラム：５．０μｍ　Ｓｙｍｍｅｔｒｙ　Ｃ１８（１８０μｍＩＤ×２ｃｍ、Ｓ／Ｎ ０２６３１１２６３１Ｄ１　２５）（ウォーターズ社製）
カラム：１．７μｍ　ＢＥＨ　１３０　Ｃ１８（１００μｍＩＤ×２５ｃｍ、Ｓ／Ｎ　０１８３１１２６６１Ｅ１　１４）（ウォーターズ社製）
移動相Ａ：０．１容量％ギ酸水溶液
移動相Ｂ：０．１容量％ギ酸－アセトニトリル溶液
グラジエント条件：
０～１分 １容量％移動相Ｂ、１～１２０分　１～５０容量％移動相Ｂ、１２０～１２１分　５０～８５容量％移動相Ｂ、１２１～１４５分　８５容量％移動相Ｂ
カラム：３０℃、流速：３００ｎＬ／分
（ＭＳ条件）
装置：Ｑ－Ｔｏｆ　ｍｉｃｒｏ（マイクロマス社製）
ＭＳ測定：Ｍａｓｓｌｙｎｘ（マイクロマス社製）のサーベイモード
キャピラリー電圧：２３００Ｖ
コーン電圧：４５Ｖ
ＣＩＤ（Collision-induced dissociation）ガス：アルゴン
コリジョンエネルギー：２５～３５ｅＶ
　ＭＳ／ＭＳの結果、検出されたペプチド断片について、データベースＭａｓｃｏｔ（Ｍａｔｒｉｘ　Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いてデータベース検索した。この結果、Ａｒｇ－Ｃ消化酵素で消化されたサンプル１－４以外では、ハイドロフォビンタンパク質のペプチド断片が検出された。検出された各ペプチド断片のスコアを表３に示す。トリプシン消化酵素とＡｓｐ－Ｎ消化酵素を組み合わせたサンプル１－７が、他のサンプルよりも明らかにスコアが高かった。サンプル１－７ではペプチド断片１とペプチド断片２が検出されており、かつこれらのペプチド断片のＭＳ／ＭＳピークを確認したところ、ＣＩＤ後の断片ピークがシャープに検出されており、定量用のペプチド断片として好適であることがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
［実施例２］
　参考例１と同様にして調製された精製ＨＦＢ液を被検試料とし、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離せずにｉｎ　ｓｏｌｕｔｉｏｎで表４に記載の消化酵素により消化し、得られたペプチド断片混合物をＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより分析し、ハイドロフォビンが同定可能かどうかを調べた。
　具体的には、まず、８μＬの精製ＨＦＢ液に１５０μＬの還元処理液（１０ｍＭ ＤＴＴを含有する１００ｍＭ　炭酸水素アンモニウム水溶液）を添加して混合し、５６℃で３０分間インキュベートした。インキュベート後の混合液を室温に戻した後、１５０μＬのアルキル化処理液（５５ｍＭ　ヨードアセトアミド水溶液）を添加して混合し、室温で３０分間インキュベートし、還元・アルキル化処理済の精製ＨＦＢ乾燥粉末を調製した。
　得られた乾燥粉末を、各消化酵素を添加した５０ｍＭ　炭酸水素アンモニウム水溶液（２２４μＬ）に溶解させた後、３７℃で１６時間インキュベートし酵素消化処理を行った。消化処理後に得られたペプチド断片混合物を、室温で遠心乾燥させた後、１００μＬの０．１容量％ギ酸水溶液に溶解させた。
　調製されたペプチド断片混合物のギ酸溶液を、実施例１と同じ条件でＬＣ／ＭＳ／ＭＳを行った。ＭＳ／ＭＳの結果、検出されたペプチド断片について、データベースＭａｓｃｏｔ（Ｍａｔｒｉｘ　Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いてデータベース検索した。検出された各ペプチド断片のスコアを表４に示す。この結果、全てのサンプルにおいてハイドロフォビンタンパク質のペプチド断片が検出されたが、実施例２と同様に、トリプシン消化酵素とＡｓｐ－Ｎ消化酵素を組み合わせたサンプル２－４が、他のサンプルよりも明らかにスコアが高かった。ただし、サンプル２－４では、ペプチド断片１とペプチド断片２に加えて、ＤＮＦＳＡＶＣＡＥＩＧＱＲ（配列番号２０）からなるペプチド断片も検出された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
［参考例２］
　市販のビールに、参考例１と同様にして調製された精製ＨＦＢ液を添加した後、容器（瓶）に充填し、噴き性を調べた。
　噴き性は、具体的には、次のようにして測定した。まず、容器詰ビールを回転機に設置し、２５℃で２４時間回転撹拌した後、蓋を上にして２５℃で１０分間静置した。次いで、１０秒間で３回ゆっくりと転倒撹拌した後、蓋を上にして３０秒間静置した。その後、蓋を開栓し、噴いたビールの量を測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　ビールに添加した精製ＨＦＢの濃度（ｐｐｂ）と噴き量（ｍＬ）の測定結果を表５に示す。表５中、「Ｈ」は、泡が瓶口から盛り上がった状態（ハット）を意味する。この結果、ハイドロフォビンタンパク質濃度が５ｐｐｂ以上になると、ビール噴き試験において噴き性を示し、飲料中のハイドロフォビン量から噴き性を予測できることが確認できた。
［実施例３］
　ビール中のハイドロフォビン量を、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより分析した。安定同位体標識ハイドロフォビン標品として、１３Ｃ６と１５Ｎで標識されたロイシンを用いたペプチド断片１（標識済ペプチド断片１）とペプチド断片２（標識済ペプチド断片２）をそれぞれ用いた。
＜サンプルビールの調製＞
　市販ビール５０ｍＬに精製ＨＦＢ液を７μＬ添加したものをサンプルビールとした。
＜還元・アルキル化処理＞
　調製されたサンプルビールを、還元・アルキル化処理した。具体的には、まず、２０μＬのビールに、２μＬの標識済ペプチド断片１溶液（１ｎｍｏｌの標識済ペプチド断片１を１００ｍＭ　炭酸水素アンモニウム水溶液（５００μＬ）で溶解した溶液）と２μＬの標識済ペプチド断片２溶液（１ｎｍｏｌの標識済ペプチド断片２を１００ｍＭ　炭酸水素アンモニウム水溶液（５００μＬ）で溶解した溶液）と、３００μＬの還元剤（１０ｍＭ ＤＴＴを含有する１００ｍＭ　炭酸水素アンモニウム水溶液）とを添加して混合し、５６℃で３０分間インキュベートした。インキュベート後の混合液を室温に戻した後、３００μＬのアルキル化剤（５５ｍＭ　ヨードアセトアミド水溶液）を添加して混合し、室温で３０分間インキュベートした。インキュベート後の混合液を室温で遠心乾燥させることにより、還元・アルキル化処理済のＨＦＢ乾燥粉末を得た。
＜酵素消化＞
　還元・アルキル化処理したＨＦＢ乾燥粉末に、１６０μＬの５０ｍＭ　炭酸水素アンモニウム水溶液と、３２μＬのトリプシン消化酵素溶液（２０μｇのトリプシンを５０ｍＭ　炭酸水素アンモニウム水溶液（６００μＬ）で溶解した溶液）と、３２μＬのＡｓｐ－Ｎ消化酵素溶液（２μｇのＡｓｐ－Ｎを５０ｍＭ　炭酸水素アンモニウム水溶液（６００μＬ）で溶解した溶液）とを添加して混合し、３７℃で２４時間インキュベートし、酵素消化反応を行った。消化処理後に得られたペプチド断片混合物を、室温で遠心乾燥させた後、１００μＬの０．１容量％ギ酸水溶液に溶解させた。
＜精製＞
　調製されたペプチド断片混合物のギ酸溶液を、ＭｏｎｏＳｐｉｎ（登録商標）　Ｃ１８カラム（ジーエルサイエンス社製）にかけて精製した。
　具体的には、まず、ＭｏｎｏＳｐｉｎ　Ｃ１８カラムを廃液チューブにセットし、当該カラムに１００μＬのメタノールをアプライし、室温、５０００×ｇで２分間、遠心分離処理を行った後、当該カラムにさらに１００μＬの超純水をアプライし、室温、５０００×ｇで２分間、遠心分離処理を行った。次いで、当該カラムに、調製されたペプチド断片混合物のギ酸溶液をアプライし、室温、５０００×ｇで２分間、遠心分離処理を行った後、当該カラムにさらに３００μＬの０．１容量％ギ酸含有５容量％メタノール溶液をアプライし、室温、５０００×ｇで２分間、遠心分離処理を行った。当該カラムの受け用チューブを回収チューブに替えた後、当該カラムに１００μＬのメタノールをアプライし、室温、５０００×ｇで２分間、遠心分離処理を行い、溶出溶液を回収した。回収された溶出溶液を室温で遠心乾燥させた後、１００μＬの０．１容量％ギ酸水溶液に溶解させた。得られた溶解液を、２００００×ｇで１０分間遠心分離処理し、得られた上清をＬＣ／ＭＳ／ＭＳに供した。
＜ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ＞
　前記上清を、下記の条件でＬＣ／ＭＳ／ＭＳで分析した。
（ＨＰＬＣ条件）
装置：超高速液体クロマトグラフＮｅｘｅｒａ（島津製作所製）
カラム：Ｌ－ｃｏｌｕｍｎ２　ＯＤＳ（２．１ｍｍＩＤ×５ｃｍ、粒子径２．５μｍ）（（一財）化学物質評価研究機構製）
移動相Ａ：０．１容量％ギ酸水溶液
移動相Ｂ：アセトニトリル
流速：０．３ｍＬ／分
グラジエント条件：
０～４分 ５～５０容量％移動相Ｂ、４～６分　５０～９５容量％移動相Ｂ、６～９分　９５～５容量％移動相Ｂ
（ＭＳ条件）
装置：三連四重極型質量分析計ＡＰＩ４０００（登録商標）（ＡＢ　Ｓｃｉｅｘ社製）
イオン化モード：ＥＳＩ　Ｐｏｓｉｔｉｖｅ モード
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表６中、「ＤＰ」はDeclustering potential、「ＣＥ」はcollision energy、「ＣＸＰ」はcollision cell exit potentialを表す。
　ペプチド断片１の定量結果からビール中のハイドロフォビン含有量測定の妥当性を確認した。結果を表７に示す。表７中、「併行精度（％）」と「日間変動（％）」は、ｎ＝６、３日間の測定結果に基づいて算出した。「添加回収率」は、ブランクビール測定試料と精製ＨＦＢ希釈液（７．７μＬの精製ＨＦＢ液を５０ｍＬの１０ｍＭリン酸バッファーで希釈した溶液）の測定値の比較により算出した。この結果、ビール中のハイドロフォビンタンパク質をトリプシン消化酵素とＡｓｐ－Ｎ消化酵素で消化して得られたペプチド断片１をＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって定量することにより、２．０ｐｐｂという極微量のハイドロフォビンを精度よく定量できることが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
［実施例４］
　麦芽中のハイドロフォビン量を本発明に係る定量方法とＥＬＩＳＡ法により定量し、当該麦芽を使用して製造されたビールの噴き性を調べた。麦芽は、ロットの異なる５種類を用いた。
＜麦芽抽出液の調整＞
　ディスクミルで微粉砕した麦芽サンプル５ｇを、５０ｍＬの６０容量％エタノール水と混合し、３０℃、２００ｒｐｍで一晩、振とう抽出した。得られた抽出液を室温、２００００×ｇで５分間遠心分離処理し、回収した上清（麦芽抽出液）を、測定サンプルとした。
＜還元・アルキル化処理・酵素消化・精製・ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ＞
　得られた測定サンプルを、実施例３と同様にして還元・アルキル化処理した後、トリプシン消化酵素とＡｓｐ－Ｎ消化酵素により酵素消化し、消化処理後に得られたペプチド断片混合物のギ酸溶液を、ＭｏｎｏＳｐｉｎ（登録商標）　Ｃ１８カラム（ジーエルサイエンス社製）にかけて精製し、最終的には１００μＬの０．１容量％ギ酸水溶液に溶解させた。得られた溶解液を、２００００×ｇで１０分間遠心分離処理し、得られた上清をＬＣ／ＭＳ／ＭＳに供した。得られた上清を、実施例３と同様にしてＬＣ／ＭＳ／ＭＳで分析した。
　ペプチド断片１の定量結果から麦芽抽出液中のハイドロフォビン含有量測定の妥当性を確認した。結果を表８及び９に示す。表８中、「併行精度（％）」と「日間変動（％）」は、ｎ＝６、３日間の測定結果に基づいて算出し、「添加回収率」は実施例３と同様にして算出した。また、表９中、「Ｎ．Ｄ．」は、ペプチド断片１が検出されず、ハイドロフォビン含有量が検出限界値以下であることを示す。この結果、麦芽中のハイドロフォビンタンパク質をトリプシン消化酵素とＡｓｐ－Ｎ消化酵素で消化して得られたペプチド断片１をＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって定量することにより、麦芽抽出液として１２．３ｐｐｂ（麦芽あたりに換算すると、０．１２μｇ／ｇ　ｍａｌｔ）という極微量のハイドロフォビンを精度よく定量できることが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
＜ＥＬＩＳＡ＞
　麦芽抽出物中のハイドロフォビン含有量は、抗ハイドロフォビン抗体としてフザリウム・ポアエ由来のハイドロフォビン（ＦｐＧＵＳＨ）に対する抗体を用い、競合的ＥＬＩＳＡにより測定した（Sarlin，“Detection and characterisation　of Fusarium hydrophobins　inducing gushing in beer”，VTT SCIENCE 13，2012）。
　ディスクミルで微粉砕した麦芽サンプル５ｇを、５０ｍＬのＰＢＳ（リン酸生理食塩水）バッファーで１時間懸濁し、得られた抽出液を遠心分離処理し、回収した上清を麦芽抽出物（測定サンプル）とした。
　麦芽抽出物に抗ハイドロフォビン抗体を添加した混合物をインキュベートした後、予め壁面にフザリウム・ポアエのハイドロフォビン抽出物をコートしておいた３つのウェルに分注し、インキュベートして免疫反応を行った。次いで、各ウェルにアルカリフォスファターゼ標識二次抗体とアルカリフォスファターゼのための基質を添加してインキュベートした。インキュベート後の各ウェルの４０５ｎｍの吸光度（Ａｂｓ）をマイクロプレートリーダーにより測定し、前記３つのウェルの測定値の平均値を求めた。各ウェルの４０５ｎｍの吸光度の測定値（平均値）の逆数を表９に示す。競合的ＥＬＩＳＡの性質上、吸光度が低いほど測定サンプル中のハイドロフォビンタンパク質含有量が高い事を示す。つまり、ハイドロフォビン含有量は、４０５ｎｍの吸光度の測定値の逆数で表される。
＜ビールの噴き性の測定＞
　各麦芽サンプル１００ｇを用いて、マイクロスケールビールをＶａａｇらの方法（ＥＢＣ　Ｃｏｎｇｒｅｓｓ、１９９３、ｐ．１５５～１６２）を参考に作製した。得られたビールを容器（瓶）に充填し、参考例２と同様にして噴き性を調べた。測定結果を表９に示す。表９中、「有」は噴きが観察されたことを、「無」は噴きが生じなかったことを意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　表９に示すように、従来のＥＬＩＳＡ法による定量結果では、麦芽中のハイドロフォビン含有量は、サンプル１はやや多いものの、残りの４種の麦芽サンプルでは同程度の量であるとの結果であり、麦芽サンプルから調製されたビールの噴き性とＥＬＩＳＡ法により定量された麦芽中のハイドロフォビン含有量の結果には相関がみられなかった。
　これに対して、同じ麦芽サンプルについて本発明に係る定量方法で定量した場合（表９の「ＬＣ／ＭＳ／ＭＳの測定結果（μｇ／ｇ　ｍａｌｔ）」）には、噴き性が有るビールが製造された麦芽サンプル１～３中のハイドロフォビン含有量は比較的多く、噴き性がないビールが製造された麦芽サンプル４と５にはハイドロフォビンが含有されていないか、検出限界値未満の極微量しか含有されていないとの結果であった。すなわち、麦芽サンプルから調製されたビールの噴き性と本発明に係る定量方法により定量された麦芽中のハイドロフォビン含有量の結果に相関があることが確認された。これらの結果から、麦芽中のハイドロフォビン含有量を本発明に係る定量方法により定量した結果に基づいて、当該麦芽を使用して製造された発泡麦芽飲料の噴き性を予測できることが明らかである。

Claims (8)

  1. 　被検試料中のハイドロフォビン含有量を定量する方法であって、
    （Ａ）被検試料中のタンパク質のアスパラギン酸残基のアミノ基側のペプチド結合を分解し、ペプチド断片混合物を調製する工程と、
    （Ｂ）前記工程（Ａ）で調製されたペプチド断片混合物から、少なくとも配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド断片を定量する工程と、
    を有する、ハイドロフォビンの定量方法。
  2. 　前記工程（Ｂ）が、ペプチド断片混合物から少なくとも配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド断片及び配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド断片を定量する工程である、請求項１に記載のハイドロフォビンの定量方法。
  3. 　前記ハイドロフォビンが、フザリウム属菌、トリコデルマ属菌、クリフォネクトリア属菌、クラビセプス属菌、又はニューロスポラ属菌由来である、請求項１又は２に記載のハイドロフォビンの定量方法。
  4. 　工程（Ａ）における分解が、トリプシン消化酵素及びＡｓｐ－Ｎ消化酵素による酵素分解である、請求項１～３のいずれか一項に記載のハイドロフォビンの定量方法。
  5. 　工程（Ｂ）における定量を、高速液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析法により行う、請求項１～４のいずれか一項に記載のハイドロフォビンの定量方法。
  6. 　工程（Ｂ）における定量を、高速液体クロマトグラフ三連四重極型質量分析計のＭＲＭ分析法により行う、請求項１～４のいずれか一項に記載のハイドロフォビンの定量方法。
  7. 　発泡麦芽飲料又は麦芽中のハイドロフォビン含有量を、請求項１～６のいずれか一項に記載のハイドロフォビンの定量方法により定量し、得られた定量結果に基づき、前記発泡麦芽飲料又は前記麦芽を原料として製造された発泡麦芽飲料の噴き性を予測する、発泡麦芽飲料の噴き性予測方法。
  8. 　発泡麦芽飲料中のハイドロフォビンを定量し、ハイドロフォビン含有量が５．６ｐｐｂ以上の場合には、前記発泡麦芽飲料は噴きを生じやすいと予測する、請求項７に記載の発泡麦芽飲料の噴き性予測方法。
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