WO2016140419A1 - 코리네박테리움 속 박테리아 및 이로부터 유래된 미니셀 그리고 이의 용도 - Google Patents

코리네박테리움 속 박테리아 및 이로부터 유래된 미니셀 그리고 이의 용도 Download PDF

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이진영
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Definitions

  • the present invention relates to a drug delivery composition
  • a drug delivery composition comprising a bacteria of the genus Corynebacterium, minicells derived therefrom or both.
  • minicells can be loaded with various kinds of drugs as bacteria-derived materials (US 2003/0198996 A1), and are particularly attracting attention because of their high stability and biocompatibility.
  • Bacterial minicells are cells that lack a chromosome of about 100 to 400 nm in size, with little or no chromosome, and RNAs and protein cell wall material have the same cellular components as parent cells.
  • the production of minicell-producing strains can generally be produced by genetically inactivating or overexpressing genes related to cell division so that unequal division occurs in the cell division process.
  • Escherichia coli Salmonella typhimurium
  • Salmonella typhimurium Strains producing minicells from various strains, such as Salmonella typhimurium , Shigella flexnery , Bacillus subtilis and Listeria monocytogenes , have been produced (MacDiarmid JA, et al. , Cancer Cell , 11: 431-445 (2007).
  • minicells When minicells are used as drug carriers, lipids and various channel proteins of cell wall components can be used for drug loading or release. It is also possible to promote cancer cell targeting and endocytosis into animal cells by altering cell wall constituents through antibodies or adhesion molecules.
  • E. coli-derived minicells were coated with bispecific antibodies to enhance cancer cell orientation and were sequentially treated with si / shRNA and anticancer drugs, respectively.
  • a tumor regression effect has been identified (MacDiarmid JA et al. , Nat. Biotechnol. , 27: 643-697 (2009)).
  • the minisel producing strain of Salmonella typhimurium S.
  • typhimurium used in this study is the LPS released from the minisel when applied to the human body to have a phosphorus LPS (Lipopolysaccharide) LPS (endotoxin) in the cell wall constituents, the drug delivery system It can act as a pyrogen, causing unexpected immune reactions (inflammation) and fever.
  • LPS Lipopolysaccharide
  • endotoxin endotoxin
  • Corynebacterium glutamicum is one of the normal flora strains present in the human body and is adapted to the body's immune system and is one of GRAS (Generally recognized as safe) strains. It is mainly used for nucleic acid production and is a highly industrially available strain (Nakayama K et al. , Adv. Exp. Med. Biol., 105: 649-661 (1978)). It is a Gram-positive strain that has no LPS layer on the cell wall, does not form spores, and is easier to culture and genetically manipulate than other wild-type strains.
  • corynebacteria is typically the sacB screen system (pK19mobsacB) using homologous recombination, which allows the insertion and deletion of desired genes on chromosomes (Schafer A, et al. ., Gene, 145: 69-73 ( 1994)).
  • the introduction and expression experiments of foreign genes can be performed using shuttle vectors (pCES208, pXMJ19, etc.) of Escherichia coli and Corynebacteria.
  • An example is the study of overexpressing human proteins in Corynebacterium glutamicum (Date M et al. , Lett. Appl. Microbiol ., 42: 66-70 (2006)). Positive effects are also expected in the production of drug proteins derived from various eukaryotic cells.
  • the present invention is derived from the above requirements, the present inventors can not only deliver the drug more safely and effectively in delivery of the drug, but also the environment (eg, nucleic acid, protein, cells, tissue, etc.) during drug delivery In particular, efforts have been made to develop drug carriers that show little toxicity in the human body. As a result, the present invention has been completed by identifying that bacteria of Corynebacterium and minicells of Corynebacterium are effective in delivering drugs and showing little toxicity in vitro and in vivo .
  • the present invention provides a drug delivery agent comprising (1) Corynebacterium sp. Bacteria, (2) Corynebacterium bacteria-derived minicells, or (3) all of them. To provide a composition.
  • the present invention provides a pharmaceutical carrier and a pharmaceutically effective amount of (1) Corynebacterium sp. Bacteria, (2) minicells derived from Corynebacterium sp. Bacteria or (3) all of them. It provides an anticancer pharmaceutical composition comprising an anticancer drug.
  • the present invention relates to a drug carrier comprising a Corynebacterium genus bacteria and Corynebacterium genus bacteria-derived minicells, including other bacteria (eg, E. coli , Salmonella genus bacteria, Bacillus genus bacteria). Etc.) or other bacteria-derived drug carriers, which are relatively safer to use in the human body.
  • a Corynebacterium genus bacteria and Corynebacterium genus bacteria-derived minicells including other bacteria (eg, E. coli , Salmonella genus bacteria, Bacillus genus bacteria). Etc.) or other bacteria-derived drug carriers, which are relatively safer to use in the human body.
  • the present invention provides a targeting technique through overexpression of an anticancer drug protein, effective protein expression control in vivo, expression of a target in the case of including an anticancer drug protein expression construct (protein expression recombinant vector, etc.).
  • the present invention can reliably deliver the drug in vivo, thereby maximizing the anticancer treatment effect.
  • Figure 1 shows the phenotype of wild type Corynebacterium glutamicum and mutant strains (parA, NCgl1366) through a microscope.
  • mutant strains abnormal divisions result in the formation of long cells together with small spherical minicells.
  • SYTO9 stains the chromosomal DNA and confirms that the small spherical cells produced by the mutant strains You can see that it is a minicell.
  • FIG. 3 shows the structure of surface expression constructs using autotransporter proteins and sortase dependent surface expression constructs.
  • target proteins for surface expression affibody and rebody are used as examples.
  • Figure 4 was a culture of the construct transformed Corynebacteria glutamicum recombinant strain prepared in Example 5 to express the target protein and confirmed the expression of the recombinant protein through Western.
  • Figure 5 confirmed the functionality of the surface expression target of Corynebacteria glutamicum recombinant strain through ELISA. As shown by the ELISA results, both affibody and rebody on the surface of Corynebacteria glutamicum can confirm the specificity for HER2 and EGFR, respectively.
  • Figure 7 In order to confirm the expression of the drug protein in Corynebacterium glutamicum, pXMJ19 / asparaginase, pXMJ19 / IL32 ⁇ , pXMJ19 / IL32 ⁇ was produced by the recombinant strain transformed to confirm the expression.
  • FIG. 8 illustrates the production of Corynebacterium glutamicum recombinant strains by applying a ramp tag to IL32 ⁇ and IL32 ⁇ , and then comparing the expression amounts of Corynebacterium glutamicum recombinant strains with no lamp tag. It was.
  • Figure 9 confirms the operation of the quorum sensing expression system from the corynebacterial glutamicum recombinant strain transformed with pCES208 / luxR-luxI-mCherry and pCES208 / luxR-luxI-asparaginase, asparaginase as a drug protein asparaginase ) Expression was confirmed by applying a quorum sensing system to the expression.
  • FIG. 10 shows the growth of recombinant strains and quorum-sensing expression system when pCES208 / luxR-luxI-asparaginase transformed Corynebacterium glutamicum together with animal cells in an animal cell culture medium.
  • Breast cancer cell MDA-MB-453 was used as an animal cell.
  • Figure 11 shows the change in cell activity of the animal cells by the drug protein asparaginase generated from the recombinant strain when incubated with the animal cells and Corynebacteria glutamicum recombinant strain as in Example 11 through MTT assay It was.
  • FIG. 12 is a test for culturing Corynebacterium glutamicum recombinant strains transformed with pCES208 / luxR-luxI-asparaginase, and administering to mice transplanted with breast cancer cell lines MDA-MB-453 and SKBR-3. Tumor size Check the graph.
  • the invention is a drug comprising (1) Corynebacterium sp. Bacteria, (2) Corynebacterium bacteria-derived minicells or (3) all of them Provides a delivery composition.
  • the inventors have found that bacteria from Corynebacterium and minicells from Corynebacterium can deliver drugs more safely and effectively in drug delivery, as well as the environment (eg, nucleic acids, proteins, cells, tissues) during drug delivery. Etc.)
  • the present invention has been completed based on the fact that there is almost no toxicity in the human body.
  • the drug carrier Corynebacterium genus is a Gram-positive strain, which has no LPS layer on the cell wall and does not form spores, and has characteristics that are easier to culture and genetically manipulate than other wild-type strains. Due to the characteristics of such bacteria in Corynebacterium does not show toxicity to the surrounding environment during drug delivery, and has the advantage of effectively delivering the drug.
  • the bacteria in the Corynebacterium as a drug carrier are Corynebacterium glutamicum , Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium casei , Corynebacterium casei .
  • one or more Corynebacterium genus bacteria selected from the group consisting of Corynebacterium efficiens more preferably one selected from the group consisting of Corynebacterium glutamicum and Corynebacterium cassia
  • the above is a genus of Corynebacterium, most preferably Corynebacterium glutamicum.
  • the drug carrier in the present invention includes (1) Corynebacterium spp., (2) minicells produced therefrom or (3) Corynebacterium spp. And minicells generated from Corynebacterium spp. Preferably, they include minicells produced from Corynebacterium spp. And Corynebacterium spp.
  • minicells which are one of the drug carriers in the present invention, are minicells derived from Corynebacterium spp. And are produced by overexpressing or inactivating some genes involved in cell division of Corynebacterium spp.
  • the search for genes related to cell division in bacteria belonging to Corynebacterium can be found by performing a homology search using the Blast P program based on the sequence information of known proteins related to cell division. Deletion may be performed with tools used in the art, but may typically utilize the SacB screening system (pK19mobsacB).
  • Corynebacterium genus bacteria The method for producing minicells from the present invention Corynebacterium genus bacteria is presented in one embodiment, the structural information and minicell production background for the Corynebacterium bacteria is as follows.
  • Corynebacterium bacteria have DivIVA, but lack FtsA, which is involved in the constriction of the septum, and regulate the formation of ZipA, ZapA and FtsZ rings, which play an important role in the polymerization of FtsZ.
  • MinC, MinD are also lacking (Michal et al. , Antonie van Leeuwenhoek 94: 99-109 (2008)).
  • cell division is thought to occur in a different way from other Gram-positive bacteria, and for the production of minicell-producing strains, DivIVA, or the genes involved in the formation of other septa as described above, may be produced to produce mutations or to change expression levels. It is possible to form a minicell by making it.
  • the present invention is characterized by providing a composition containing a minicell derived from Corynebacterium genus bacteria.
  • the minicell in the present invention is at least one corynebacterium selected from the group consisting of Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium ammonia genes, Corynebacterium casei and Corynebacterium epiciens Minicells derived from the genus bacteria, more preferably minicells derived from at least one Corynebacterium genus bacteria selected from the group consisting of Corynebacterium glutamicum and Corynebacterium cassia, most preferably Coryne Minicells derived from bacterium glutamicum.
  • the drug delivery agent in the present invention is an anticancer drug delivery agent, and can deliver a drug having activity against various cancers.
  • the cancer in the present invention is breast cancer, cervical cancer, ovarian cancer, endometrial cancer, melanoma, bladder cancer, lung cancer, pancreatic cancer, colon cancer, prostate cancer, leukemia, acute lymphocytic leukemia, chronic lymphocytic leukemia, B- Cell lymphoma, acute myeloid leukemia (AML), chronic myeloid leukemia, thyroid cancer, thyroid follicular cancer, kidney cancer, spleen cancer, bladder cancer, head and neck cancer, gastric cancer, liver cancer, bone cancer, brain cancer, bile duct cancer, small intestine cancer, uterine cancer and testicular cancer
  • the present invention includes drug carriers that exert an excellent function of delivering drugs, and in particular, has the advantage of very effectively and safely delivering drugs having anticancer activity.
  • the term 'anticancer agent' includes all without limitation as long as the substance has anticancer activity.
  • the drug in the present invention means an anticancer agent, and more preferably includes one or more drugs selected from the group consisting of chemical agents, proteins and nucleic acids.
  • the chemical agent when used as a drug delivery agent for delivering a chemical agent as an anticancer agent, is doxorubicin, paclitaxel, docetaxel, cisplatin, carboplatin, oxaliplatin ), Daunorubicin, epirubicin, epirubicin, idarubicin, valubicin, mitoxantrone, curcumin, gefitinib, erlotty It is preferable to include at least one chemical agent selected from the group consisting of erlotinib, irinotecan, topotecan, vinblastine and vincristine.
  • the method of incorporating the drug into the Corynebacterium genus bacteria of the present invention or minicells derived therefrom includes all methods that can be implemented by various methods known in the art.
  • the protein when the protein is delivered as an anticancer agent, the protein is an antibody, a transport protein, a structural protein, a regulatory protein, a hormone, a hormone analog, a cytokine-derived anticancer protein, a cytolytic protein, an amino acid degrading enzyme, or an angiogenic factor.
  • At least one protein selected from the group consisting of a cell adhesion molecule, an enzyme inhibitor, a receptor, a fragment of the receptor, and an immunotoxin is preferable.
  • the protein comprises at least one protein selected from the group consisting of antibodies, transport proteins, structural proteins, regulatory proteins and cytokine-derived anticancer proteins, even more preferably antibodies, amino acid degrading enzymes and cytokines At least one protein selected from the group consisting of derived anticancer proteins, and even more preferably at least one protein selected from the group consisting of antibodies and amino acid degrading enzymes.
  • an amino acid degrading enzyme when included as an anticancer agent, it is preferable to include asparaginase as the amino acid degrading enzyme.
  • the antibody when the antibody is delivered as an anticancer agent, the antibody includes one or more antibodies selected from the group consisting of immunoglobulins, antibody fragments, and antibody analogs.
  • the antibody in the present invention is included without limitation so long as it is an immunoglobulin present in nature, preferably immunoglobulin G (IgG).
  • immunoglobulin G IgG
  • the term 'antibody fragment' in the present invention includes an antibody fragment having an amino acid sequence of a minimum unit capable of recognizing an antigen, and preferably Fab, Fab ', F (ab') 2 , F (ab ') At least one antibody fragment selected from the group consisting of F (ab), Fv and scFv.
  • the term 'antibody analog' in the present invention is an antibody having a lower protein molecular weight than an antibody fragment and capable of recognizing and binding an antigen (eg, an anticancer marker, an anticancer marker protein, etc.).
  • an antigen eg, an anticancer marker, an anticancer marker protein, etc.
  • the antibody analog when included as an antibody, the antibody analog may be present in or secreted out of the cells of Corynebacterium spp. And minicells derived therefrom, or expressed in the cell and bound to the cell surface to be delivered. Characterized in that it can.
  • Cell surface binding may be bound to the surface of the Corynebacterium bacteria and minicells derived therefrom using chemical binding or expression vectors. For example, they are transferred to and bound to the surface of bacteria and minicell membranes in Corynebacterium through co-expression with transport proteins.
  • the antibody analogs in the present invention are affibody, repeat body, affilin, DARPin, tetranectin, microbody, peptide aptamer And one or more antibody analogs selected from the group consisting of Avimers. More preferably, the antibody analog in the present invention is at least one antibody analogue selected from the group consisting of affibody, rebody, affilin and DARPin, even more preferably affibody ( one or more antibody analogs selected from the group consisting of affibody and repeat body.
  • the antibody analog when used in the present invention, it may further include antibody mimetics.
  • the antibody mimetics are apirin (affilins; Ebersbach H, et al. J. Mol. Biol. , 372: 172-185 (2007)), affimers (Johnson A, et al. Anal. Chem) ., 7; 84: 6553-6560 (2012)), Bahia tin (affitins; Krehenbrink M, et al, J. Mol Biol, 383:... 1058-1068 (2008)), anti-alkaline (anticalins; Skerra A , et al., FEBS J., 275: 2677-2683 (2008)), avimers; Silverman J, et al., Nat. Biotechnol.
  • the antibody mimetics can be constructed to target specific receptors or antigens, and panning methods are generally used in the preparation.
  • Antibody mimetic targets have a small size (molecular mass) and simple structure compared to the antibody has a relatively easy expression in bacteria, has the advantage of easy application by making a fusion protein form.
  • the nucleic acid when included as an anticancer agent as a drug, may include any nucleic acid capable of inhibiting the expression of an anticancer gene, and the method of inhibiting the expression may include, for example, a nucleic acid expressing a carcinogenic gene. Binding to or directly with oncogenic genes to inhibit expression.
  • nucleic acid may be present inside or outside the bacteria and minicells of Corynebacterium or operatively linked to the nucleic acid expression construct.
  • the nucleic acid as a delivery drug in the present invention comprises at least one nucleic acid selected from the group consisting of siRNA, shRNA, miRNA, antisense RNA, LincRNA, ribozyme and peptide nucleic acids (PNA), more preferably Comprises at least one nucleic acid selected from the group consisting of siRNA, shRNA, miRNA and antisense RNA, and even more preferably comprises at least one nucleic acid selected from the group consisting of siRNA and shRNA.
  • PNA peptide nucleic acids
  • the present invention includes a construct capable of expressing a protein, and in the case of including the construct, the drug protein may be expressed directly in the drug carrier or in the drug receptor (eg, cancer cell or cancer tissue). It includes a construct capable of expressing.
  • the term 'construct' refers to a minimal gene expression capable of protein expression in prokaryotic or eukaryotic cells, and particularly includes a construct capable of protein expression in mammalian cells.
  • the construct in the present invention is a construct contained in the bacteria of Corynebacterium or minicell derived therefrom is introduced into the animal cell due to receptor mediated endocytosis (receptor mediated endocytosis), the protein in the animal cell
  • a construct capable of expressing a protein a construct including a protein expression system capable of expressing a protein in a Corynebacteria genus bacterium or Corynebacteria genus minicells and secreting it out of the cell by a quorum sensing system.
  • the term 'quorum sensing' means that when a bacterium reaches a certain level of cell concentration, cells transmit signals between each other using chemical languages (metabolites) produced by them. It refers to a system that regulates the expression of a particular gene. This system has individual density-dependent quorum-sensing gene expression logic, which is composed of proteins that synthesize signal material and transcriptional regulator proteins that bind to and control the expression of genes.
  • a gene circuit consisting of a LuxI gene, a LuxR gene, and a LuxI promoter may be included in a protein expression construct.
  • the protein expression construct in the present invention is a construct capable of expressing one or more drug proteins from the group consisting of, for example, antibodies, antibody derivatives, antibody mimetics and cell conjugation molecules when the drug protein, particularly the drug protein as an anticancer agent, is expressed. It contains a net.
  • the present invention comprises a protein expression construct, more preferably encoding (1) anticancer protein, (2) anticancer protein and anticancer cell surface receptor, or (3) anticancer protein and anticancer cell surface antigen Protein expression constructs comprising a polynucleotide sequence.
  • the drug delivery composition of the present invention can express proteins (eg, antibodies, antibody analogs, receptors, cell surface antigens, etc.) capable of binding to anticancer targets in order to effectively deliver drugs having anticancer activity to anticancer cells or tissues. It is preferred to include a construct, wherein the protein capable of binding to the anticancer target is located on the outer surface of the bacteria of Corynebacterium and the minicell membrane derived therefrom.
  • proteins eg, antibodies, antibody analogs, receptors, cell surface antigens, etc.
  • the term 'anticancer cell surface receptor' refers to a receptor capable of binding to an anticancer cell surface
  • the term 'anticancer cell surface antigen' refers to a polypeptide or a protein capable of binding to an anticancer cell surface receptor
  • the drug can be delivered into the animal cell through endocytosis after binding to the animal cell surface.
  • internalin A is expressed on the surface of a minicell derived from a bacterium Corynebacterium or a bacterium Corynebacterium and then introduced into an anticancer cell by binding to an anticancer cell surface E-cadherin.
  • the anticancer cell surface antigen when the anticancer cell surface antigen is included, the anticancer cell surface antigen includes internalin A.
  • the present invention provides sorbase as a cell surface protein binding enzyme to bind proteins, antigenic cell receptors or antigenic cell antigens that can bind to anticancer targets to the surface of minicells derived from Corynebacterium bacteria and Corynebacterium bacteria. It is preferable to express a sortase, and for this purpose, a nucleotide sequence encoding asparaginase, together with a protein, an antigen cell receptor or an antigen cell surface antigen capable of binding to the anticancer target, is additionally added to the construct. It is preferable to include.
  • the invention comprises a protein expression construct comprising (1) an anticancer protein and anticancer cell surface receptor and (2) a polynucleotide sequence encoding an anticancer protein and anticancer cell surface antigen, More preferably it comprises a protein expression construct comprising a polynucleotide sequence encoding an anticancer protein and an anticancer cell surface antigen.
  • the drug when the anticancer protein and the anticancer cell surface receptor or the anticancer cell surface antigen are used, the drug can reach not only general cancer cells but also solid cancer tissues that are difficult to reach anticancer drugs.
  • flexible to enhance the structure maintenance and flexibility of the drug protein on the surface of minicells derived from bacteria of Corynebacterium or bacteria of Corynebacterium (flexible) linkers may be included in the protein expression construct.
  • the protein linker in the present invention includes all of the known protein linkers used in the art without limitation, and it is apparent to those skilled in the art that the polynucleotide sequence of the known protein linker may be constructed with reference to the codon sequence.
  • the protein linker in the present invention includes a linker capable of linking a protein to a protein or a substrate capable of chemically binding to the protein.
  • the term 'chemical bond' is used in the same sense as a chemical bond, and includes covalent bonds, ionic bonds, hydrogen bonds, and the like.
  • the protein expression construct in the present invention comprises a polynucleotide sequence encoding a protein linker.
  • the present invention includes a drug protein expression construct containing a polynucleotide encoding a ramp tag in the construct to increase drug protein expression when the drug protein expression construct is included. desirable.
  • the term 'lamp tag' is a tag capable of pre-recruiting these rare tRNAs in front of a gene in order to prevent a decrease in expression efficiency due to a translation delay effect caused by a rare codon in the middle of a gene translation process.
  • codon optimization since it does not change the original ORF sequence, there is no change in protein intrinsic activity, and it is an economical method in terms of cost since it does not require DNA artificial synthesis according to codon substitution.
  • the lamp tag is designed and utilized according to a specific logic with reference to the rare codon scheme of the host, and related theories and methods are described in detail in Korean Patent Publication No. 10-2014-0112888, which is referred to herein. Is inserted as.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for anticancer comprising the pharmaceutically effective amount of the drug carrier and the anticancer drug as an active ingredient.
  • the present invention is characterized in that it comprises a minicell drug carrier derived from Corynebacterium bacteria, Corynebacterium bacteria as a carrier (carrier) that can deliver anticancer drugs very effectively and effectively to cancer cells or cancer tissues.
  • composition in the present invention exhibits a very good anticancer effect in vitro as well as in vivo .
  • the anticancer effect of the present invention is due to the synergistic effect that the bacterium of Corynebacterium, which is a drug carrier, and minicells derived therefrom can simultaneously realize cancer cell and cancer tissue recognition and drug delivery by including anticancer drugs in the cells and on the cell surface. Exerted.
  • the term "pharmaceutically effective amount” means an amount sufficient to achieve the efficacy or activity (ie, inhibiting cancer cell growth or cancer cell death) of the anticancer drug described above.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Pharmaceutically acceptable carriers included in the pharmaceutical compositions of the present invention are those commonly used in the preparation, such as lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, Calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, and the like It doesn't happen.
  • Suitable dosages of the pharmaceutical compositions of the present invention may vary depending on factors such as the formulation method, mode of administration, age, weight, sex, morbidity, condition of food, time of administration, route of administration, rate of excretion and response to response of the patient.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered orally or parenterally, and when administered parenterally, it can be administered by bolus injection, intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, transdermal administration, and most particularly. In the form of a direct injection into the blood vessel (eg, bolus injection or intravenous injection).
  • arteries, veins, blood vessels including capillaries such as the aorta, carotid artery, subclavian artery, celiac artery, mesenteric arteries, renal artery, iliac artery, artery, capillaries, and vein.
  • Means to be administered into the blood vessel, and the method of administration can be appropriately selected according to the blood vessel site where the thrombus.
  • the route of administration is determined according to the type of disease to be applied and the decision of the prescription.
  • concentration of the active ingredient included in the composition of the present invention can be determined in consideration of the purpose of treatment, the condition of the patient, the period of time, etc., and is not limited to a specific range of concentration.
  • the daily dose of the pharmaceutical composition of the present invention is 0.001-1,000 mg / kg.
  • compositions of the present invention may be prepared in unit dosage form by formulating with a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to methods which can be easily carried out by those skilled in the art. Or may be prepared by incorporating into a multi-dose container.
  • the formulation may be in the form of a solution, suspension or emulsion in an oil or aqueous medium, or may be in the form of extracts, powders, granules, tablets or capsules, and may further include a dispersant or stabilizer.
  • Escherichia coli E. coli XL1-Blue [endA1 gyrA96 (nalR) thi-1 recA1 relA1 lacglnV44 F '[::: Tn10 proAB + lacI ⁇ (lacZ) M15] hsdR17 (rK-mK + in the experiment of the present invention )], JM110 [rpsL thr leu thi lacY galK galT ara tonA tsx dam dcm glnV44 ⁇ (lac-proAB) e14- [F 'traD36 proAB + lacIq lacZ ⁇ M15] hsdR17 (rK-mK +)] as host cell for gene cloning Corynebacterium glutamicum ( C.
  • glutamicum ATCC13032 (American Type Culture Collection) was used as a host cell for drug delivery.
  • the E. coli and C. glutamicum strains used in this experiment were incubated at 37 ° C and 32 ° C using Luria-Bertani (LB) medium (difco), respectively, and the appropriate amount of antibiotic (Kanamycin 20 ⁇ g / Ml, Chloramphenicol 10 ⁇ g / ml, Ampicillin 50 ⁇ g / ml) were used.
  • LB Luria-Bertani
  • Competent cells of E. coli XL1-Blue, JM110 were prepared as follows. First, the cells were cultured in LB plate medium and then pre-cultured by inoculating a single colony in a liquid medium, and subcultured at 22 ° C by passage in SOB medium to which 20 ml of MgCl 2 was added. When the OD 600 nm value was 0.5, it was recovered and prepared by treating Inoue transformation buffer. For prepared cells were stored and used at -80 °C. In the transformation method, each recombinant DNA was mixed with competent cells according to a general heat shock method, allowed to stand on ice for 30 minutes, heat shocked at 42 ° C. for 90 seconds, and left for 2 minutes on ice. It was performed by the method.
  • colony cracking colony cracking
  • Competent cells of Corynebacterium glutamicum were prepared as follows. First, cells were cultured in LB plate medium, and then single colonies were inoculated in LB liquid medium containing 2% glucose and pre-cultured, and the culture medium wasisonicotinic acid hydrazide (isoniazid; 4 ⁇ g / ml) and glycine ( 25 ⁇ g / ml), Tween 80 (0.1%)) containing 1-2% inoculated LB medium (called Epo medium) and incubated at 25 °C to recover when the OD 600 nm value is 0.6 to 10% glycerol Four washes prepared electrocompetent cells.
  • Corynebacterium glutamicum transformation method 100 ⁇ l of the prepared cells were dispensed and stored at ⁇ 80 ° C. and used.
  • a recombinant vector without a methylation pattern was recovered and used.
  • the transformation method of Corynebacterium glutamicum by electroporation was performed by adding 200-500 ng / ⁇ l of recombinant plasmid to 100 ⁇ l of electroporation cells, followed by 0.2 cm cuvette, 25 uF, 600 ohm, 2.5 kV.
  • genes from Corynebacterium glutamicum was performed by the typical method of inducing homologous recombination and screening for mutant strains using the pK19mobsacB vector.
  • the genes at the top and bottom of each gene were amplified to approximately 500 bp in length by PCR using the primers shown in Table 1 below, and these two homologous arms were Were linked via overlapping PCR into a template and cloned into the pK19mobsacB vector.
  • two screening procedures using antibiotics and 10% sucrose were used to select the mutants that appear to have deleted the gene.
  • colony PCR was performed using a check primer.
  • mutant strain from which the target gene was deleted was obtained.
  • Experimental results were the NCgl1366 gene parA and secure a mutant strain deleted, respectively, but the case of mrp performed three times or more was not obtained a mutant strain.
  • mutant strains do not appear to be produced because Mrp is an essential protein for the physiology of Corynebacterium glutamicum.
  • Table 1 below is a primer polynucleotide sequence used for the production of a mutant strain in the present invention.
  • minicells are minicells (FIG. 1).
  • the NCgl1366 mutant strain was observed not only minicells but also nucleated cells. According to the above results, both mutant strains can be used as minicell-producing strains.
  • minicell-producing strains are induced by causing perturbation of cell division process through deletion of other genes related to cell division or overexpression of proteins related to cell division. I can make it.
  • minicells from the parA mutant strain was performed by centrifugation and antibiotic treatment. Inoculate the mutant strain in 200 ml LB liquid medium and incubate at 30 °C, centrifuged for 10 minutes at 2000 g when the OD 600 nm value is 2.0 to remove feeder cells and centrifuged supernatant at 10000 g for 10 minutes Separated and recovered. Thereafter, the recovered minicell pellets were suspended in 50 ml of LB medium and incubated at 30 ° C. for 20 minutes, followed by addition of antibiotics (Streptomycin 50 ug / ml), followed by incubation for another hour to kill the remaining feeder cells.
  • antibiotics Streptomycin 50 ug / ml
  • minicells that went through the process were subjected to viable cell counting to determine the degree of contamination of the feeder cells. As a result, it was confirmed that the feeder cells of less than 100 cfu / ml were contaminated. When finally the first 200 ml culture minisel amount of separation was found to have about 3 ⁇ 10 10 cells.
  • Corynebacterium glutamicum is a Gram-positive strain that does not have Lipopolysacharide (LPS), which is a cell wall component, which is a major cause of endotoxin activity, but has arabinogalactan bound to a thick peptidoglycan layer.
  • LPS Lipopolysacharide
  • mycolic acid layer that acts as the outer membrane of Gram-negative bacteria, free polysaccharides, glycolipids, proteins (S-layer protein, pili, etc.) It is known to have a complex structure (A Burkovski et al. , ISRN Microbiol . 2013: 11 (2013)).
  • LAL chromogenic endotoxin quantification kit LAL chromogenic endotoxin quantification kit, Thermo scientific
  • affibody (HER2) and rebody (EGFR) were used as cancer cell targets.
  • Surface expression of affibody and rebody in Corynebacterium glutamicum can be achieved by (1) producing a fusion protein using membrane protein as an autotransporter, and (2) sotase. (sortase) dependently, two methods of anchoring the target protein to the cell wall peptidoglycan layer of Corynebacterium glutamicum were performed.
  • an example of surface expression of a target protein using a carrier protein in Corynebacterium glutamicum is ⁇ -amylase (W Yao et al. , Arch. Microbiol. , 191: 751-759 (2009)). In this embodiment, the experiment was performed with reference to the above example.
  • the primers prepared as shown in Table 2 are amplified, respectively, to amplify the surface expression target apibodi and rebodibody genes, and the NCgl1221 gene to be used as a transport protein is a genomic DNA of Corynebacterium glutamicum as a template. Amplification via PCR. At this time, 423 amino acids of N-terminal including signal sequence were translated to function as NCgl1221 transport protein, and designed to include linker sequence (SSSSGSSSSG) and tag sequence (Myc-tag, His-tag) The body and the repetitive body were placed at the C-terminus to be expressed as a fusion protein.
  • SSSSGSSSSG linker sequence
  • Myc-tag Myc-tag, His-tag
  • Table 2 below shows the surface expression protein preparation primer polynucleotide sequence using an auto-transporter in the present invention.
  • the enzymes of sortase derived from Listeria monocytogene KCTC13064 and the intenin A (inlA), which are well-known as the proteinase-dependent surface expression protein
  • the fusion protein was designed using the signal sequence and structure sequence (WD Schubert et al. , Cell 111: 825-836 (2002)).
  • the listeria was cultured and cultured in a Brain Heart Infusion solid medium to extract genomic DNA from the cultured strain, and the sortase and internalin genes were amplified using the primers of Table 3 as a template.
  • Table 3 shows the polynucleotide sequences of the primers used in the preparation of the sortase dependent surface expression protein in the present invention.
  • the vectors pCXS35 and pCXI40 equipped with Corynebacteria-derived constant expression promoters were used respectively (J Lee et al , J. Microbiol. Biotechnol. , 24: 70-79 (2014)).
  • the sortase gene was cloned into the Kpn I site by including a promoter and terminator sequence of the wild type strain, and internalin A was cloned after Bam HI and Pst I restriction enzyme treatment. That is, pCXS35 and pCXI40 recombinant vectors were constructed to include the constructs of srtA, inlA, and srtA-inlA.
  • the gene was designed to be expressed as a fusion protein by substituting affibodies and rebodies at sites binding to E-Cadherin of internalin A (internalin A), and recombination using the primers of Table 3 above.
  • Vectors were produced.
  • Gene constructs included the N-terminal signal sequence and the Cap sequence of internalin A, and the C-terminal and sotase dependent sequences, and the apibody and rebodibody genes between the Cap and structural sequences.
  • recombinant vectors were constructed in pCXS35 / srtA and pCXI40 / srtA to include the inlAss-affibody and inlAss-repebody constructs.
  • a construct was constructed to include a histidine tag (MH 6 ) in front of the LPXTG motif, a site for the recognition of the catase, for Western analysis (FIG. 3B).
  • NCgl1221-affibody, NCgl1221-repebody, srtA, inlA, srtA-inlA, inlAss-affibody, and inlAss-repebody constructs prepared in Example 5 were transformed into Corynebacterium by the method described in Example 2. Was produced.
  • the surface-expressing constructs NCgl1221-apibody and NCgl1221-repebody using carrier proteins were pre-incubated in 15 ml test tubes with single colonies of each recombinant strain cultured in LB solid medium containing chloramphenicol (Chloramphenicol 10 ⁇ g / ml).
  • the main culture was performed at 32 ° C. and 200 rpm. Thereafter, when the OD 600 nm value was 0.5, IPTG (Isopropyl ⁇ -D-1-thiogalactopyranoside) was added at a concentration of 1 mM to induce protein expression, and cultured for 3-6 hours to recover cells by time.
  • IPTG Isopropyl ⁇ -D-1-thiogalactopyranoside
  • the intAss-affibody and inlAss-repebody, the sotaze dependent surface expression constructs were cultured in a medium containing kanamycin (Kanamycin 20 ⁇ g / ml) .In the case of pCX series vectors, they are always expression vectors.
  • NCgl1221-affibody was well expressed in the surface expression construct using the carrier protein, and the expression band was well confirmed in the Western, but the expression band was not confirmed in the case of NCgl1221-repebody.
  • it is relatively difficult to express the surface because it is a larger protein than affibody.
  • electroporation cells were prepared in the same manner as in Example 2 using minicell-generated Corynebacterium glutamicum strain ( C. glutamicum ⁇ parA ).
  • PCXI40 / inlAss-affibody and pCXI40 / inlAss-repebody were used to transform the recombinant strains.
  • minicells in which the targets of the affibodies and the rebodies were expressed on the surface thereof were recovered in the same manner as in Example 3. Specificity of HER2 and EGFR was confirmed by an Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). Experimental method was put HER2 or EGFR in 96 well plate and coated overnight at 4 °C (overnight), the reaction was carried out at 25 °C for 2 hours using a blocking buffer (2% skim milk in PBS), wash buffer After washing three times with (0.1% Tween-20), and then put the apibody and the surface expression minicells of the reebodi body and reacted for 2 hours at 25 °C. At this time, minicells in which nothing was expressed were tested together as a control.
  • a blocking buffer 20% skim milk in PBS
  • wash buffer After washing three times with (0.1% Tween-20
  • the plate was washed three times using a wash buffer, and the first antibody ( ⁇ -affibody, ⁇ -repebody, Abcam) was added and reacted for about 1 hour, and then washed three times using the wash buffer again, HRP (horseradish) peroxidase) bound secondary antibody was added and reacted for about 1 hour and washed. Then, the absorbance was measured at 450 nm using a laser scanner (infinite M200: TECAN) in reaction with HRP substrate (tetramethybenzidine: BD OptEIA).
  • the cell uptake was compared by reacting with breast cancer cells using Corynebacterium glutamicum minicell prepared through the above procedure.
  • the human breast cancer cell lines used in this experiment were cultured in accordance with the group selected for the expression of HER2 and EGFR (K Subik et al, Breast Cancer, 4:. 35-41 (2010)).
  • SKBR-3 (HER2: +, EGFR: +), MDA-MB-453 (HER2:-, EGFR :-), MDA-MB-435 (HER2: +, EGFR :-) breast cancer cell lines were cultured at 37 ° C, DMEM (Dulbecco's modified Eagle medium; Hyclone, Thermal scientific) or Roswell (DMEM) containing 10% FBS (Fetal Bovine Serum; Gibco, Invitrogene) and 1% of antibiotics (Penicillin, streptomycin, Gibco, Invitrogene) under 5% carbon dioxide conditions Park Memorial Institute medium; Hyclone, Thermal scientific) medium.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle medium; Hyclone, Thermal scientific
  • FBS Fetal Bovine Serum
  • Gibco, Invitrogene Fetal Bovine Serum
  • antibiotics Penicillin, streptomycin, Gibco, Invitrogene
  • Experimental method was cultured SKBR-3, MDA-MB-453, MDA-MB-435 breast cancer cell line and put gelatin-coated coverslips in 12 well culture plate, about 1 x 10 7 per well Dog breast cancer cells were added and cultured. After incubation for about 12-16 hours, when the confluence was about 70%, the cells were reacted with minicells. The medium was changed to OPTIMEM medium for reaction with the minicell, the minicell was added, the reaction was carried out at 37 ° C. for about 4 hours, and washed three times with PBS to remove the remaining minicell.
  • the cells were reacted with 4% (w / v) PFA (paraformaldehyde) for 10 minutes to fix the cells, washed again, and then treated with 0.1% Triton x-100 for 10 minutes. After reacting with 1% BSA at room temperature for 1 hour, and reacted for 20 minutes using phallotoxin (staining). After washing with PBS and mounting the coverslip using a mountant (mountant, prolong Gold reagent DAPI) was observed at 1000 magnification using a fluorescence microscope (OLYMPUS BX43 U-RFL-T).
  • mountant mountant, prolong Gold reagent DAPI
  • Asparaginase drug gene (asparaginase), IL32 ⁇ , IL32 ⁇ is to produce a primer, as shown in the following Table 4 were prepared and amplified by PCR (polymerase chain reaction). Asparaginase, IL32 ⁇ and IL32 ⁇ genes were cloned into pXMJ19 vector using Hind III and Eco RI restriction enzymes. Finally, pXMJ19 / asparaginase, pXMJ19 / il32 ⁇ and pXMJ19 / il32 ⁇ recombinant vectors were prepared.
  • a recombinant strain was prepared by transforming Corynebacteria glutamicum in the same manner as described in Example 2.
  • Table 4 shows the polynucleotide sequences of primers used for the production of asparaginase, il32 ⁇ , and il32 ⁇ expression vectors.
  • each recombinant strain single colony cultured in LB solid medium containing chloramphenicol (Chloramphenicol 10 ⁇ g / ml) was preincubated in a 15 ml test tube. 1% of 100 ml of Erlenmeyer flasks was inoculated to carry out the culture at 32 ° C and 200 rpm. Then, when the OD 600 nm value is 0.5, IPTG 1 mM was added to induce protein expression, and cultured for 3-6 hours to recover cells by time. Thereafter, SDS-PAGE analysis was performed to confirm the expression of the drug protein.
  • Codon usage of C. glutamicum ATCC13032 strain was analyzed for the design of the lamp tag and rare codons were collected.
  • Rare codons here refer to codons that are collected in the process described below in addition to the commonly known rare codon concept.
  • the rate of translation is most influenced by how quickly the amino acid (aa) -tRNA is supplied when the codon is translated. Therefore, in codons in which the amount of the corresponding amino acid-tRNA is sufficiently present in the cell, the translation speed is fast, whereas the lack of amino acid-tRNA decreases the translation efficiency.
  • gene copy of tRNA can be used as the first measure to infer the concentration of the corresponding tRNA in the cell.
  • typical codon optimization methods reflect the codon frequency since it is known that the codon frequency is proportional to the corresponding tRNA copy number.
  • the codon frequency (100%) and tRNA gene copy corresponding to each amino acid were used in Corynebacterium glutamicum (http://gtrnadb.ucsc.edu/), and the conditions for collecting rare codons were See the method of patent (KR 1020130027549). Briefly, the codon pair frequency at each amino acid is 1.0% or less, and up to three codons for one amino acid are collected.
  • Table 5 shows the collected rare codons of Corynebacterium glutamicum strains.
  • the lamp tag was designed based on the codon frequencies in the table, and the cloning was performed to fuse to the N terminus of the gene of interest.
  • Table 6 below shows the lamptag applied IL32 gene primer sequences in Corynebacterium glutamicum strains.
  • recombinant drug proteins (IL32 ⁇ , IL32 ⁇ ) to which the Ramp tag was applied based on the above logic were expressed in Corynebacteria glutamicum and evaluated for overexpression.
  • Two ramp-IL32 ⁇ and ramp-IL32 ⁇ lamps were designed and cloned into the pXMJ19 vector.
  • Ramp tag applied IL32 ⁇ , IL32 ⁇ gene amplification was amplified by PCR using the primers of Table 6, cloning was carried out by a sequence ligation independent cloning (SLIC) method using homologous recombination (MZ Li et al. , Nat. Methods. , 4 (3): 251-6 (2007)).
  • SLIC sequence ligation independent cloning
  • the recombinant vector was then transformed into Corynebacterium glutamicum as described in Example 2. Afterwards, the recombinant strain was cultured and SDS-PAGE was performed as in Example 8 to confirm the expression of the protein. Western blot analysis was also performed using His-tag antibody.
  • the autoinduction system by quorum sensing is operated in Corynebacterium glutamicum, and its availability as a system for expressing drug protein is confirmed.
  • the Gram-negative bacteria Vibrio fischeri- derived quorum sensing expression system can be utilized in Corynebacterium glutamicum, the conditions under which AHL can be generated by luxI were confirmed.
  • Corynebacterium glutamicum contains Cgl1603 (S-adenosyl methionine synthetase (EC: 2.5.1.6)), an enzyme that produces SAM (S-adenosylmethionine), which is used as a substrate for AHL production.
  • Cgl1603 S-adenosyl methionine synthetase (EC: 2.5.1.6)
  • SAM S-adenosylmethionine
  • AHL hydrolase Based on the amino acid sequence information of Bacillus- derived AHL hydrolase, NCBI's Blast P program was used. As a result, S-adenosyl-homocystein hydrolase (under 25% identities) was identified. However, no enzyme related to AHL hydrolase was identified. Therefore, the availability of the quorum sensing system in Corynebacteria was transplanted as it is without additional gene deletion or deletion in the existing system.
  • mCherry gene was used as a reporter protein, and asparaginase was expressed as a drug protein to confirm the expression level and activity.
  • Shuttle vector pCES208 was used for the construction of each construct. The cloning method was based on the recombinant vectors pBAD24 / luxR-luxI-mCherry and pBAD24 / luxR-luxI-asparaginase, which were produced through the previous studies. Genes amplified by PCR using the primers of Table 7 were performed using the Bam HI and Eco RV restriction sites of the pCES208 vector.
  • the pBAD24 / luxR-luxI-mCherry and pBAD24 / luxR-luxI-asparaginase recombinant vectors were produced using luxR and luxI, which are well known as quorum sensing genes derived from Vibrio fischeri , and luxR and A construct was constructed to include a luxRI promoter between luxIs and to place translational coupling of mcherry or asparaginae genes on the downstream side of the luxI gene and cloned into the pBAD24 vector.
  • Table 7 shows the polynucleotide sequences of the primers for mCherry and asparaginase quorum sensing expression systems.
  • the recombinant vector thus prepared was transformed into Corynebacterium glutamicum as described in Example 2, and selected from LB solid medium containing kanamycin (Kanamycin 20 ⁇ g / ml). Each recombinant strain single colony was preincubated in a 15 ml test tube, followed by 1% inoculation into a 100 ml Erlenmeyer flask to carry out the main culture at 32 ° C. and 200 rpm.
  • the recombinant Corynebacterium glutamicum loaded with asparaginase gene and animal cells were cultured together, it was confirmed that the drug protein was normally expressed in the animal cell culture environment.
  • the breast cancer cell line MDA-MB-453 was cultured and then trypsin EDTA treated and transferred to 48 well culture plates to about 10 4 cell numbers, and cultured for 20 hours, and the recombinant Corynebacteria were OD 600 nm.
  • the cells were harvested by centrifugation, suspended again in DMEM medium, and added to about 10 7-10 8 cells per well to incubate with animal cells.
  • the protein expression was confirmed by SDS-PAGE.
  • Corynebacterial glutamicum and breast cancer cell line MDA-MB-453 transformed with pCES208 / luxR-luxI-asparaginase were transformed into animal cell culture medium. Even when cultured together, Corynebacterium glutamicum grows well, and as a result of viable cell counting, it was confirmed that the cells were grown to 10 9 cells, which are sufficient to cause self-induction. In addition, the quorum sensing expression system works well, and as a result, it was confirmed that asparaginase is overexpressed, and thus, the construct was able to operate well in an in-vivo environment (FIG. 10). .
  • MTT assay was performed to measure cell activity. After culturing breast cancer cell lines SKBR-3, MDA-MB-453, and MDA-MB-435, put about 10 4 cells per well into a 96 well culture plate and overnight at 37 ° C and 5% carbon dioxide. And incubated. Then, after adding the pCES208 / lucR-luxI-asparaginase Corynebacterial recombinant strain expressing asparaginase by the quorum sensing, it was reacted for 4 hours, washed with PBS, and the medium was further changed for 24 hours and 48 hours. Incubated.
  • mice 6-8 weeks old Balb / c nude mice (Orient Bio Inc.) were used for the experiments to produce a cancer animal model. All animal breeding, experimentation, and euthanasia according to the protocol approved by the Animal Research Committee of Chonnam National University and the Guidelines for the Breeding and Use of Laboratory Animals published by the National Institute of Health (Representation 85-23, Rev. 1985). Was carried out. First, subcutaneous tumors in experimental animals were induced as follows. After harvesting by centrifugation of breast cancer cells MDA-MB-435 and SKBR-3 overexpressing HER2 and EGFR cultured in Example 10, the cells were suspended in 100 ⁇ l of PBS to give about 1 ⁇ 10 6 cells.
  • the thigh subcutaneous tissue was implanted and the size of the cancerous tissue was measured (horizontal ⁇ vertical ⁇ height / 2). About 10 days after transplantation, the experiment was performed by administering a Corynebacteria-derived drug carrier (a Corynebacteria glutamicum recombinant strain transformed with pCES208 / luxR-luxI-asparaginase).
  • a Corynebacteria-derived drug carrier a Corynebacteria glutamicum recombinant strain transformed with pCES208 / luxR-luxI-asparaginase.
  • Corynebacteria-derived drug carrier Corynebacteria glutamicum recombinant strain transformed with pCES208 / luxR-luxI-asparaginase
  • the method was carried out using a recombinant strain loaded with an asparaginase expression vector. It was administered to the produced cancer animal model and observed a change in the size of the cancer.
  • pCES208 / luxR-luxI-asparagniase recombinant strains were cultured and 5 ⁇ 10 7 cells were suspended in 100 ⁇ l of PBS and administered to 3 mouse tail vein sections of tumor-forming tumors in each experimental group using 1 ⁇ insulin syringe.
  • the recombinant strain transformed with (1) PBS and (2) pCES208 vector was dosed in the same amount. The volume change of cancer was then measured for 20 days.

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Abstract

본 발명은 코리네박테리움 속 박테리아 및 코리네박테리움 속 박테리아 유래 미니셀을 포함하는 것을 특징으로 하는 약물전달체 조성물에 관한 것으로, 다른 박테리아(예컨대, 대장균(E. coli), 살모넬라속 박테리아. 바실러스 속 박테리아 등) 또는 다른 박테리아 유래 약물전달체에 비해 상대적으로 인체에 사용하기에 더 안전한 장점을 갖는다. 본 발명은 항암용 약물단백질 발현 컨트스럭트(단백질 발현 재조합 벡터 등)를 포함하는 경우 항암용 약물단백질의 과발현, 생체내에서의 효과적인 단백질 발현 조절, 표적인자의 발현을 통한 표적화 기술을 제공한다. 또한, 본 발명은 생체내에서 안정적으로 약물을 전달할 수 있으므로, 항암 치료 효과를 극대화할 수 있다.

Description

코리네박테리움 속 박테리아 및 이로부터 유래된 미니셀 그리고 이의 용도
본 발명은 코리네박테리움 속 박테리아, 이로부터 유래된 미니셀 또는 이의 모두를 포함하는 약물전달체 조성물에 관한 것이다.
방사선과 항암제를 이용한 기존의 암치료 방법은 암세포뿐만 아니라 정상세포에도 광범위한 피해를 입히기 때문에 인체에 상당한 부담을 주며, 환자의 나이 또는 건강 상태에 따라 제한되게 사용되어 왔다. 또한 이와 같은 치료법은 치료방법상의 한계로 인해 남아있는 암세포의 완전한 사멸이 어려우며, 따라서 이를 해결하기 위해 최근 리포솜, 박테리아 유래 미니셀, 미셀, 폴리머 유래 나노파티클(nanoparticle), 박테리아 외막 비이클(bacterial outer membrane vehicles, OMVs) 등 다양한 약물전달체를 이용하여 암세포 특이적으로 약물을 전달하는 기술들이 연구되고 있다(Huang SL, Adv. Drug Deliv. Rev. 60:1167-1176(2008), Kim SH, et al., BBA-Biomembranes 1788:2150-2159(2009), Savic R, el al., Science 300:615-618(2003), Torchilin VP., Adv. Drug Deliv. Rev., 58:1532-1555(2006), MacDiarmid JA et al., Cancer Cell 11:431-445(2007)). 이 중, 미니셀은 박테리아 유래 물질로 다양한 종류의 약물을 탑재할 수 있으며(US 2003/0198996 A1), 높은 안정성과 생체 적합성을 갖는 특성 때문에 특히 주목받고 있다.
박테리아 미니셀은 약 100 ~ 400 ㎚ 의 크기의 염색체가 결여된 세포로 염색체가 전혀 없거나 조금 포함되어 있으며, RNAs과 단백질 세포벽 물질 등은 부모세포와 동일한 세포 구성성분을 갖는다. 미니셀 생산 균주의 제작은 일반적으로 세포 분열에 관련된 유전자를 유전적으로 불활성화 시키거나 과발현시킴으로써 세포분열 과정에 비균등 분열이 일어나도록 하여 제작할 수 있으며, 지금까지 대장균(Escherichia coli), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 시겔라 플레나리(Shigella flexnery), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 리스테리아 모노시토젠(Listeria monocytogenes) 등 다양한 균주에서 미니셀을 생산하는 균주가 제작되었다(MacDiarmid JA, et al., Cancer Cell, 11:431-445(2007)).
미니셀을 약물전달체로 이용하는 경우 세포벽 구성성분의 지질(lipid)과 다양한 채널(channel) 단백질들을 약물 탑재 또는 방출에 이용할 수 있다는 장점이 있다. 또한 항체(antibody)나 접합 분자(adhesion molecule)를 통해 세포벽 구성 물질에 변화를 줌으로써, 암세포 표적화 및 동물세포내로 엔도시토시스(endocytosis)를 촉진시킬 수 있다. 이와 관련된 연구로 대장균 유래 미니셀을 이중특이적 항체(bispecific antibody)로 코팅하여 암세포 지향성을 높이고 si/shRNA와 항암제를 각각 탑재하여 순차적으로 처리하였을 때, 항암제 저항성이 있는 암세포에 대해서 높은 성장억제 및 종양 억제(tumor regression) 효과가 확인된 바 있다.(MacDiarmid JA et al., Nat. Biotechnol., 27:643-697(2009)). 하지만 이 연구에서 사용된 미니셀 생산 균주인 살모넬라 티피뮤리움(S. typhimurium)은 세포벽 구성물질로 내독소(endotoxin)인 LPS(Lipopolysaccharide)를 가지며, 약물전달체로 인체에 사용될 때 미니셀로부터 유리된 LPS가 발열물질(pyrogen)로 작용하여 예기치 못한 면역반응(염증), 발열 등의 문제가 나타날 수 있다. 이러한 문제를 해결하기 위한 방법으로, 진화적으로 적응(adaptation) 되어온 인체의 다양한 균주(normal flora) 중 병원성이 없고 배양과 유전적인 조작이 가능한 균주를 선택하여 약물전달체로 개발하여 활용해 볼 수 있다.
코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)은 사람 몸에 존재하는 정상세균총(normal flora) 균주 중 하나로 우리 몸의 면역계에도 적응되어 있으며, GRAS (Generally recognized as safe) 스트레인(strain) 중 하나로 아미노산, 핵산 생산에 주로 이용되어 산업적으로 활용도가 높은 균주이다(Nakayama K et al., Adv. Exp. Med. Biol., 105:649-661(1978)). 그람 양성 균주로 세포벽에 LPS 층이 없고 포자(spore)를 형성하지 않으며, 다른 야생형 균주에 비해 배양과 유전적 조작이 쉬운 특징이 있다. 따라서 이를 약물전달체로 활용할 경우 그람 음성세균의 LPS 와 같은 약물전달체 자체가 갖는 독성문제를 피할 수 있으며, 지금까지 발굴된 다양한 유전적 툴과 자원을 이용한다면, 원하는 약물 단백질의 탑재 및 암세포 표적화 연구를 수행할 수 있다.
코리네박테리아의 유전자 조작에는 대표적으로 상동 재조합(homologous recombination) 방법을 이용한 sacB 스크린 시스템(screen system)(pK19mobsacB)이 쓰이며, 이를 통해 염색체에 원하는 유전자의 삽입 및 삭제가 가능하다(Schafer A, et al., Gene, 145:69-73(1994)). 또한 대장균과 코리네박테리아의 셔틀 벡터(shuttle vector; pCES208, pXMJ19 등)를 활용하여 외래 유전자의 도입 및 발현 실험을 수행할 수 있다. 실 예로 코리네박테리움 글루타미쿰에서 인간의 단백질을 과발현 시킨 연구결과가 있으며(Date M et al., Lett. Appl. Microbiol., 42:66-70(2006)), 이러한 결과로 미루어 볼 때 다양한 진핵세포 유래의 약물단백질의 생산에도 긍정적인 효과가 기대된다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로, 본 발명자들은 약물을 전달하는데 있어서 약물을 보다 안전하고 효과적으로 전달시킬 수 있을 뿐만 아니라 약물전달시 주위 환경(예컨대, 핵산, 단백질, 세포, 조직 등) 특히 인체내에서 거의 독성을 나타내지 않는 약물전달체를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 코리네박테리움 속 박테리아와 코리네 박테리움 속 유래 미니셀이 in vitro와 in vivo에서 약물을 효과적으로 전달하고 독성을 거의 나타내지 않는다는 사실을 규명함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 설명된다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (1) 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.) 박테리아, (2) 코리네박테리움 속 박테리아 유래 미니셀(minicell) 또는 (3) 이의 모두를 포함하는 약물전달체 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 (1) 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.) 박테리아, (2) 코리네박테리움 속 박테리아 유래 미니셀(minicell) 또는 (3) 이의 모두를 포함하는 약물전달체 및 약제학적 유효량의 항암용 약물을 포함하는 항암용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 코리네박테리움 속 박테리아 및 코리네박테리움 속 박테리아 유래 미니셀을 포함하는 것을 특징으로 하는 약물전달체에 관한 것으로, 다른 박테리아(예컨대, 대장균(E. coli), 살모넬라속 박테리아. 바실러스 속 박테리아 등) 또는 다른 박테리아 유래 약물전달체에 비해 상대적으로 인체에 사용하기에 더 안전한 장점을 갖는다.
본 발명은 항암용 약물단백질 발현 컨트스럭트(단백질 발현 재조합 벡터 등)를 포함하는 경우 항암용 약물단백질의 과발현, 생체내에서의 효과적인 단백질 발현 조절, 표적인자의 발현을 통한 표적화 기술을 제공한다.
또한, 본 발명은 생체내에서 안정적으로 약물을 전달할 수 있으므로 항암 치료 효과를 극대화할 수 있다.
도 1은 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰과 돌연변이 균주(parA, NCgl1366)의 표현형을 현미경을 통해 관찰한 것이다. 돌연변이 균주에서는 비정상적인 분열을 통해 길이가 긴세포와 작은 구형의 미니셀이 함께 생성되는 것을 확인할 수 있으며, 각각의 균주를 SYTO9을 통해 염색체 DNA를 염색하여 확인한 결과, 돌연변이 균주에서 생성된 작은 구형의 세포가 미니셀임을 확인할 수 있다.
도 2는 LAL(Limulus amebocye lysate) assay를 통해 코리네박테리아 글루타미쿰과 대장균에서 엔도톡신(endotoxin) 활성을 확인한 결과로, 대장균에 비해 코리네박테리아 글루타미쿰의 경우 엔도톡신 활성이 거의 나타나지 않는 것을 확인할 수 있다.
도 3은 오토트랜스포터(autotransporter) 단백질을 이용한 표면발현 컨스트럭트와, 소타제(Sortase) 의존적인 표면발현 컨스트럭트의 구조를 보여준다. 표면발현을 위한 표적인자 단백질로는 아피바디(affibody)와 레피바디(repebody)가 예로 사용되었다.
도 4는 실시예 5에서 제작된 컨스트럭트가 형질전환된 코리네박테리아 글루타미쿰 재조합 균주를 배양하여 표적인자 단백질을 발현시키고 Western을 통해 재조합 단백질의 발현을 확인하였다.
도 5는 ELISA를 통해 코리네박테리아 글루타미쿰 재조합 균주의 표면발현 표적인자의 기능성을 확인하였다. ELISA 결과가 보여주듯이 코리네박테리아 글루타미쿰 표면의 아피바디와 레피바디(repebody) 모두 각각 HER2와 EGFR 에 대한 특이성을 확인할 수 있다.
도 6은 면역형광염색(immunofluorescence staining)을 통해 유방암세포에서 셀 업테이크(cell uptake) 활성을 비교한 것이다. 셀 업테이크 정도를 확인하기 위해 동물세포는 유방암세포 MDA-MB-435(HER2+), MDA-MB-453(HER2-)를 사용하였으며, inlAss-affibody가 표면발현된 미니셀과 대조군 미니셀을 분리하여 사용하였다.
도 7은 코리네박테리아 글루타미쿰에서 약물단백질의 발현을 확인하기 위해, pXMJ19/asparaginase, pXMJ19/IL32β, pXMJ19/IL32γ가 형질전환된 재조합 균주를 제작하여 발현 여부를 확인하였다.
도 8은 IL32β과 IL32γ에 램프 태그(ramp-tag)를 적용하여 코리네박테리아 글루타미쿰 재조합 균주를 제작한 뒤, 램프 태그가 적용되지 않은 코리네박테리아 글루타미쿰 재조합 균주와 발현양을 비교분석 하였다.
도 9는 pCES208/luxR-luxI-mCherry와 pCES208/luxR-luxI-asparaginase 가 형질전환된 코리네박테리아 글루타미쿰 재조합 균주로부터 쿼럼센싱 발현 시스템의 작동 여부를 확인하고, 약물단백질인 아스파라기나제(asparaginase) 발현에 쿼럼센싱 시스템을 적용하여 발현을 확인하였다.
도 10는 pCES208/luxR-luxI-asparaginase 가 형질전환된 코리네박테리아 글루타미쿰을 동물세포와 함께 동물세포 배양배지에서 함께 배양하였을 때, 재조합 균주의 성장과 쿼럼센싱 발현시스템의 작동여부를 확인하였다. 동물세포로 유방암세포 MDA-MB-453을 사용하였다.
도 11은 실시예 11에서와 같이 동물세포와 코리네박테리아 글루타미쿰 재조합 균주를 함께 배양하였을 때, 재조합 균주로부터 생성된 약물단백질 아스파라기나제에 의해 동물세포의 세포활성 변화를 MTT assay를 통해 확인하였다.
도 12는 pCES208/luxR-luxI-asparaginase가 형질전환된 코리네박테리아 글루타미쿰 재조합 균주를 배양하여, 유방암 세포주 MDA-MB-453과 SKBR-3이 이식된 마우스에 투여하여 실험하고, 종양의 크기를 확인한 그래프이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (1) 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.) 박테리아, (2) 코리네박테리움 속 박테리아 유래 미니셀(minicell) 또는 (3) 이의 모두를 포함하는 약물전달체 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 코리네박테리움 속 박테리아와 코리네 박테리움 속 유래 미니셀이 약물을 전달하는데 있어서 약물을 보다 안전하고 효과적으로 전달시킬 수 있을 뿐만 아니라 약물전달시 주위 환경(예컨대, 핵산, 단백질, 세포, 조직 등) 특히 인체내에서 거의 독성을 나타내지 않는다는 것을 기초로 본 발명를 완성하였다.
본 발명에서의 약물전달체인 코리네박테리움 속 박테리아는 그람 양성균주로 세포벽에 LPS 층이 없고 포자(spore)를 형성하지 않으며, 다른 야생형 균주에 비해 배양과 유전적 조작이 쉬운 특징을 가지고 있다. 이와 같은 코리네박테리움 속 박테리아의 특성으로 인하여 약물전달시 주위 환경에 독성을 나타내지 않으며, 약물도 효과적으로 전달하는 장점을 가진다.
바람직하게는, 본 발명에서는 약물전달체로서 코리네박테리움 속 박테리아는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 카세이(Corynebacterium casei) 및 코리네박테리움 에피시엔스(Corynebacterium efficiens)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 코리네박테리움 속 박테리아이며, 보다 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰 및 코리네박테리움 카세이로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 코리네박테리움 속 박테리아이고, 가장 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰이다.
본 발명에서의 약물전달체는 (1) 코리네박테리움 속 박테리아, (2) 이로부터 생성된 미니셀 또는 (3) 코리네박테리움 속 박테리아와 코리네박테리움 속 박테리아로부터 생성된 미니셀을 포함한다. 바람직하게는, 코리네박테리움 속 박테리아와 코리네박테리움 속 박테리아로부터 생성된 미니셀을 포함한다.
또한, 본 발명에서의 약물전달체 중의 하나인 미니셀은 코리네박테리움 속 박테리아으로부터 유래된 미니셀로서 코리네박테리움 속 박테리아의 세포분열에 관여하는 몇몇 유전자를 과발현 또는 불활성화시키는 방법으로 제작된다.
본 발명에서 코리네박테리리움 속 박테리아에서 세포 분열에 관련된 유전자의 탐색은 기 알려진 세포분열에 관련된 단백질들의 서열정보를 토대로 Blast P 프로그램을 이용한 상동성(homology) 검색을 수행하여 찾을 수 있으며, 이들 유전자의 삭제는 당업계에서 사용되는 도구로 실시되나, 대표적으로 SacB 스크리닝 시스템(pK19mobsacB)을 활용할 수 있다.
본 발명인 코리네박테리움 속 박테리아로부터 미니셀을 제조하는 방법은 본 명세서에서 일 실시예로 제시하였으며, 코리네박테리움 속 박테리아에 대한 구조적인 정보 및 미니셀 제작 배경은 하기와 같다.
코리네박테리움 속 박테리아는 다른 그람양성균과 마찬가지로 DivIVA를 갖지만, 격벽의 수축(constriction)에 관여하는 FtsA가 결여되어있으며, FtsZ 의 중합에 중요한 역할을 하는 ZipA, ZapA 와 FtsZ ring의 형성위치를 조정하는 MinC, MinD 또한 결여되어 있다(Michal et al., Antonie van Leeuwenhoek 94:99-109(2008)). 즉, 다른 그람양성균과는 다른 방법으로 세포분열이 일어나는 것으로 생각되며, 미니셀 생산 균주의 제작을 위해서는 DivIVA, 또는 상기한 것처럼 다른 격벽 형성에 관여하는 유전자들을 탐색하여 돌연변이를 제작하거나, 발현 수준을 변화시킴으로써 미니셀을 형성하도록 할 수 있다.
본 발명에서는 코리네박테리움 속 박테리아 유래 미니셀이 포함된 조성물을 제공하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 본 발명에서의 미니셀은 코리네박테리움 글루타미쿰, 코리네박테리움 암모니아게네스, 코리네박테리움 카세이 및 코리네박테리움 에피시엔스으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 코리네박테리움 속 박테리아로부터 유래된 미니셀이며, 보다 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰 및 코리네박테리움 카세이로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 코리네박테리움 속 박테리아로부터 유래된 미니셀이고, 가장 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 유래된 미니셀이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서의 약물전달체는 항암용 약물전달체이며, 다양한 암에 대하여 활성을 가지는 약물을 전달할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에서의 암은 유방암, 자궁경부암, 난소암, 자궁내막암, 흑색종, 방광암, 폐암, 췌장암, 결장암, 전립선암, 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, B-세포 림프종, 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 골수성 백혈병, 갑상선암, 갑상선 여포암, 신장암, 비장암, 방광암, 두경부암, 위암, 간암, 골암, 뇌암, 담관암, 소장암, 자궁암 및 고환암으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 암이며, 보다 바람직하게는 유방암, 자궁경부암, 난소암, 자궁내막암, 흑색종, 방광암, 폐암, 췌장암, 결장암, 전립선암, 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 갑상선암, 신장암, 방광암, 위암, 간암, 뇌암, 소장암, 자궁암 및 고환암 으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 암이고, 보다 더 바람직하게는 유방암, 자궁경부암 및 난소암이며, 가장 바람직하게는 유방암이다.
본 발명은 약물을 전달하는 탁월한 기능을 발휘하는 약물전달체를 포함하며, 특히 항암 활성을 가지는 약물을 매우 효과적으로 안전하게 전달하는 장점을 가진다.
본 발명에서의 용어 '항암제'는 항암 활성을 가지는 물질이라면 제한없이 모두를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서의 약물은 항암제를 의미하며, 보다 바람직하게는 화학적 제제, 단백질 및 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 약물을 포함한다.
본 발명에서 항암제로서 화학적 제제를 전달하는 약물전달체로 사용되는 경우, 화학적 제제는 독소루비신 (doxorubicin), 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 다우노루비신(daunorubicin), 에피루비신(epirubicin), 이다루비신(idarubicin), 발루비신(valubicin), 미토산트론(mitoxantrone), 커큐민(curcumin), 제피티닙(gefitinib), 에를로티닙(erlotinib), 이리노테칸(irinotecan), 토포테칸(topotecan), 빈블라스틴(vinblastine) 및 빈크리스틴(vincristine)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 화학적 제제를 포함하는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 독소루비신 (doxorubicin), 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 시스플라틴(cisplatin) 및 카르보플라틴(carboplatin)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 화학적 제제이며, 보다 더 바람직하게는 독소루비신 (doxorubicin), 파클리탁셀(paclitaxel) 및 도세탁셀(docetaxel)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 화학적 제제이다.
본 발명의 코리네박테리리움 속 박테리아 또는 이로부터 유래된 미니셀에 약물을 포함시키는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법으로 구현될 수 있는 방법을 모두를 포함한다.
본 발명에서 항암제로서 단백질을 전달하는 경우 단백질은 항체, 수송단백질, 구조 단백질, 조절단백질, 호르몬, 호르몬 유사체, 사이토카인 유래 항암단백질, 세포용해단백질, 아미노산 분해효소, 항혈관생성인자(antiangiogenic factor), 세포접합분자(cell adhesion molecule), 효소 저해제, 리셉터, 리셉터의 단편 및 면역독소(immunotoxin)로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질이 바람직하다. 보다 바람직하게는 단백질은 항체, 수송단백질, 구조 단백질, 조절단백질 및 사이토카인 유래 항암단백질로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질을 포함하며, 보다 더 바람직하게는 항체, 아미노산 분해효소 및 사이토카인 유래 항암단백질로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질을 포함하고, 보다 더욱 더 바람직하게는 항체 및 아미노산 분해효소로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질을 포함한다.
본 발명에서 항암제로서 아미노산 분해효소를 포함하는 경우, 아미노산 분해효소로 아스파라기나제(asparaginase)를 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 항암제로서 항체를 전달하는 경우 항체는 이뮤노글로블린(immunoglobulin), 항체 단편 및 항체 유사체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 항체를 포함한다.
본 발명에서의 항체는 자연계에 존재하는 이뮤노글로블린이라면 제한없이 포함되나, 바람직하게는 이뮤노글로블린 G(IgG)이다.
본 발명에서의 용어 '항체 단편'은 항원을 인식할 수 있는 최소한의 단위의 아미노산 서열을 가지는 항체 단편을 포함하며, 바람직하게는 Fab, Fab', F(ab')2, F(ab'), F(ab), Fv 및 scFv으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 항체 단편을 포함한다.
본 발명에서의 용어 '항체 유사체'는 항체 단편보다 단백질 분자량이 작은 항체로서 항원(예컨대, 항암 표지인자, 항암 마커 단백질 등)을 인식하여 결합할 수 있는 항체이다.
본 발명에서 항체로서 항체 유사체가 포함되는 경우 항체 유사체는 코리네박테리움 속 박테리아 및 이로부터 유래된 미니셀 세포내에 존재하거나 세포밖으로 분비될 수 있으며, 또는 세포네에서 발현되어 세포 표면에 결합되어 전달될 수 있는 것을 특징으로 한다. 세포표면 결합은 화학결합이나 발현 벡터를 이용하여 상기 코리네박테리움 속 박테리아 및 이로부터 유래된 미니셀 표면에 결합시킬 수 있다. 예컨대, 수송 단백질과의 동시 발현을 통하여 코리네박테리움 속 박테리아 및 미니셀 막 표면으로 이동되어 결합된다.
바람직하게는, 본 발명에서의 항체 유사체는 아피바디(affibody), 레피바디(repebody), 아피린(affilin), DARPin, 테트라넥틴(tetranectin), 마이크로바디(microbody), 펩타이드 압타머(peptide aptamer) 및 아비머(Avimer)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 항체 유사체를 포함한다. 보다 바람직하게는, 본 발명에서의 항체 유사체는 아피바디(affibody), 레피바디(repebody), 아피린(affilin) 및 DARPin로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 항체 유사체이며, 보다 더 바람직하게는 아피바디(affibody) 및 레피바디(repebody)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 항체 유사체이다.
또한, 본 발명에서 항체 유사체를 사용하는 경우 항체 모방체(antibody mimetics)를 추가적으로 포함할 수 있다.
바람직하게는, 항체 모방체는 아피린(affilins; Ebersbach H, et al. J. Mol. Biol., 372:172-185(2007)), 아피머(affimers; Johnson A, et al. Anal. Chem., 7;84:6553-6560(2012)), 아피틴(affitins; Krehenbrink M, et al., J. Mol. Biol., 383:1058-1068(2008)), 안티칼린(anticalins; Skerra A, et al., FEBS J., 275:2677-2683(2008)), 아비머(avimers; Silverman J, et al., Nat. Biotechnol., 23:1556-1561(2005)), 모노바디(monobodies; Koide A, et al., Methods Mol. Biol., 352:95-109(2007))를 포함한다. 상기 항체 모방체는 특정 수용체 또는 항원를 표적으로 하도록 제작할 수 있으며, 제작에는 일반적으로 패닝(panning) 방법이 사용된다. 항체 모방 표적인자는 항체에 비해 작은 크기(molecular mass)를 가지며 구조가 단순하기 때문에 박테리아에서 발현이 비교적 쉽고, 융합단백질 형태로 제작하여 응용이 쉽다는 장점을 가진다.
본 발명의 약물전달체에서 약물로서 항암제로 핵산을 포함하는 경우 핵산은 항암 유발 유전자의 발현을 억제시킬 수 있는 핵산이라면 제한없이 모두를 포함하며, 발현을 억제시키는 방식은 예컨대 발암 유전자를 발현하는 핵산과 결합하거나 발암 유전자와 직접 결합하여 발현을 억제시키는 방식을 포함할 수 있다.
또한, 상기 핵산은 코리네박테리움 속 박테리아 및 미니셀 세포내·외에 존재하거나 또는 핵산 발현 콘스트럭트와 작동적으로 연결(operatively linked)되어 존재할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에서 전달 약물로서 핵산은 siRNA, shRNA, miRNA, 안티센스 RNA, LincRNA, 리보자임(ribozyme) 및 PNA(peptide nucleic acids)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵산을 포함하며, 보다 바람직하게는 siRNA, shRNA, miRNA 및 안티센스 RNA로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵산을 포함하고, 보다 더 바람직하게는 siRNA 및 shRNA로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵산을 포함한다.
본 발명은 단백질을 발현할 수 있는 컨스트럭트를 포함하는 것이 바람직하며, 컨스트럭트를 포함하는 경우 약물전달체 안에서 직접 약물단백질을 발현시키거나 약물수용체(예컨대, 암세포 또는 암조직)내에서 약물단백질을 발현시킬 수 있는 컨스트럭트를 포함한다.
본 발명의 명세서에서 용어 '컨스트럭트(construct)'는 원핵세포 또는 진핵세포에서 단백질 발현이 가능한 최소한의 유전자 발현체를 의미하며, 특히 포유동물 세포에서 단백질 발현이 가능한 컨스트럭트를 포함한다.
예컨대, 본 발명에서의 컨스트럭트는 코리네박테리움 속 박테리아 또는 이로부터 유래된 미니셀에 포함된 컨스트럭트가 리셉터 매개 엔도사이토시스(receptor mediated endocytosis)로 인하여 동물세포내로 유입되어 동물세포내에서 단백질을 발현시킬 수 있는 컨스트럭트, 쿼럼센싱 시스템에 의하여 코리네박테리아 속 박테리아 또는 코리네박테리아 속 미니셀내에서 단백질이 발현되어 세포밖으로 분비될 수 있는 단백질 발현 시스템이 포함된 컨스트럭트 등을 포함한다.
본 발명의 명세서에서 용어 '쿼럼센싱(quorum sensing)'은 세균은 일정 수준의 세포농도에 도달하면, 자신이 생산하는 화학적 언어(대사물)을 이용하여 세포들 서로 간에 신호를 전달하고, 이를 통해 특정 유전자의 발현을 조절하는 시스템을 의미한다. 이 시스템은 개체 밀도 의존적 쿼럼센싱 유전자 발현 논리를 갖는데, 신호물질을 합성하는 단백질과 신호물질과 결합하여 유전자의 발현을 조절하는 전사조절 단백질에 의해 이루어진다.
본 발명은 퀀럼센싱에 이용되는 경우 LuxI 유전자와 LuxR 유전자, LuxI 프로모터로 구성된 유전자 회로를 단백질 발현 컨스트럭트에 포함시킬 수 있다.
본 발명에서의 단백질 발현 컨스트럭트는 약물단백질, 특히 항암제로서 약물단백질을 발현시키는 경우 예컨대, 항체, 항체유도체, 항체모방체 및 세포 접합 분자로 이루어진 군으로부터 하나 이상의 약물단백질을 발현시킬 수 있는 컨스트럭트를 포함한다.
바람직하게는, 본 발명은 단백질 발현 컨스트럭트를 포함하며, 보다 바람직하게는 (1) 항암단백질, (2) 항암단백질 및 항암세포 표면리셉터, 또는 (3) 항암단백질 및 항암세포 표면 항원을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단백질 발현 컨스트럭트를 포함한다.
본 발명의 약물전달체 조성물은 항암 활성을 가지는 약물을 항암 세포 또는 조직에 효과적으로 전달하기 위하여 항암 표적인자와 결합할 수 있는 단백질(예컨대, 항체, 항체 유사체, 리셉터, 세포표면항원 등)을 발현시킬 수 있는 컨스트럭트를 포함하는 것이 바람직하며, 상기 항암표적인자와 결합할 수 있는 단백질은 코리네박테리움 속 박테리아 및 이로부터 유래한 미니셀 막 외부 표면에 위치한다.
본 발명에서 용어 '항암세포 표면 리셉터'는 항암세포 표면과 결합할 수 있는 리셉터를 의미하며, 용어 '항암세포 표면 항원'은 항암세포 표면리셉터에 결합될 수 있는 폴리펩타이드 또는 단백질을 의미한다.
본 발명은 항암표적인자와 결합할 수 있는 항암세포 표면항원으로서 인터날린 A(internalin A)을 컨스트럭트에 포함시킴으로써 동물세포 표면과 결합 후 엔도사이토시스를 통하여 동물세포내로 약물을 전달시킬 수 있다. 예컨대, 인터날린 A를 코리네박테리움 속 박테리아 또는 코리네박테리움 속 박테리아 유래 미니셀 표면에 발현시킨 후 항암세포 표면 E-카드헤린(E-cadherin)과 결합하여 항암세포 안으로 유입된다. 본 발명에서 항암세포 표면항원을 포함하는 경우 항암세포 표면항원은 인터날린 A(internalin A)을 포함한다.
본 발명은 항암 표적인자와 결합할 수 있는 단백질, 항원세포 리셉터 또는 항원세포 표면항원을 코리네박테리움 속 박테리아와 코리네박테리움 속 박테리아 유래 미니셀 표면에 결합시키기 위하여 세포표면 단백질 결합효소로서 소르타제(sortase)를 발현시키는 것이 바람직하며, 이를 위하여 상기 항암 표적인자와 결합할 수 있는 단백질, 항원세포 리셉터 또는 항원세포 표면항원과 함께 아스파라기나제를 코딩하는 뉴클레이오타이드 서열을 추가적으로 컨스트럭트에 포함시키는 것이 바람직하다.
보다 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 (1) 항암단백질 및 항암세포 표면 리셉터 및 (2) 항암단백질 및 항암세포 표면 항원을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단백질 발현 컨스트럭트를 포함하며, 보다 더 바람직하게는 항암단백질 및 항암세포 표면항원을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단백질 발현 컨스트럭트를 포함한다.
본 발명은 상기 항암단백질과 항암세포 표면리셉터 또는 항암세포 표면 항원을 이용하는 경우 일반 암세포 뿐만 아니라 항암 약물이 도달하기 어려운 고형암 조직 안까지 약물을 도달시킬 수 있는 효과를 발휘한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명에서 약물로서 단백질을 발현시키는 경우 코리네박테리움 속 박테리아 또는 코로네박테리움 속 박테리아 유래 미니셀 표면에서 상기 약물단백질의 구조 유지 및 유연성을 강화시키기 위해 플렉셔블(flexible) 링커를 단백질 발현 컨스트럭트에 포함시킬 수 있다.
본 발명에서의 단백질 링커는 당업계에서 사용되는 공지된 단백질 링커라면 제한없이 모두를 포함하며, 공지된 단백질 링커의 폴리뉴클레오타이드 서열은 코돈 서열을 참조로하여 구성될 수 있음은 당업자에게 있어서 자명하다.
본 발명에서의 단백질 링커는 단백질과 단백질을 연결하거나, 단백질과 화학적 결합이 가능한 기질과 연결시킬 수 있는 링커를 포함한다. 본 발명에서 용어 '화학적 결합'은 화학 결합과 동일한 의미로 사용되며, 공유결합, 이온결합, 수소결합 등을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서의 단백질 발현 컨스트럭트는 단백질 링커를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
또한, 본 발명은 약물단백질 발현 컨스트럭트를 포함하는 경우 약물단백질 발현을 증가시키기 위하여 컨스트럭트에 램프 태그(ramp tag)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 포함된 약물단백질 발현 컨스트럭트를 포함시키는 것이 바람직하다.
본 발명에서 용어 '램프 태그'는 유전자의 번역과정 중간에 희귀코돈에 의해 발생하는 번역 지연효과에 따른 발현효율의 감소를 막기 위해, 유전자의 앞에 이들 희귀 tRNA를 미리 유도(recruit) 할 수 있는 태그를 부착하는 것으로, 코돈 최적화와 달리 본래의 ORF 서열을 바꾸지 않기 때문에 단백질 고유활성에 변화가 없으며 코돈 치환에 따른 DNA 인공합성을 필요로 하지 않아 비용면에서도 경제적인 방법이다. 램프 태그는 숙주의 희귀코돈 구성표를 참조하여 특정 논리에 따라 설계하여 활용하는 것으로, 관련된 이론과 방법은 한국특허공개 제10-2014-0112888호에 상세히 기재되어 있으며, 이 특허문헌은 본 명세서의 참조로서 삽입된다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 약물전달체 및 항암 약물의 약제학적 유효량을 유효성분으로 포함하는 항암용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 항암 약물을 매우 효과적으로 우수하게 암세포 또는 암조직에 전달할 수 있는 운반체(carrier)로서 코리네박테리움 속 박테리아, 코리네박테리움 속 박테리아 유래 미니셀 약물전달체를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서의 조성물은 인 비트로(in vitro) 뿐만 아니라 인 비보(in vivo)에서 매우 우수한 항암 효과를 발휘한다.
본 발명의 항암 효과는 약물전달체인 코리네박테리움 속 박테리아와 이로부터 유래된 미니셀이 항암 약물을 세포내 및 세포 표면에 포함시킴으로써 암세포 및 암조직 인식과 약물 전달을 동시에 구현할 수 있다는 시너지 효과에 의해 발휘된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "약제학적 유효량"은 상술한 항암 약물의 효능 또는 활성(즉, 암세포 성장 억제 또는 암세포 사멸능)을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다. 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구로 투여되는 경우, 볼루스 주입, 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있으며, 가장 구체적으로는 혈관 내로 직접 주입되는 방식(예컨대, 볼루스 주입 또는 정맥내 주입)으로 투여될 수 있다. 혈관 내로 직접 투입되는 방식이란 동맥, 정맥, 모세혈관을 포함하는 혈관, 예컨대 대동맥, 경동맥, 쇄골하동맥, 복강동맥, 장간막동맥(mesenteric arteries), 신동맥, 장골동맥, 소동맥, 모세혈관, 소정맥을 포함하는 혈관 내로 투여되는 것을 의미하며 혈전이 생긴 혈관 부위에 따라 적절하게 그 투여방법을 선택할 수 있다.
또한, 본 발명의 약제학적 조성물은 적용되는 질환의 종류 및 처방의의 결정에 따라, 투여 경로가 결정되는 것이 바람직하다. 예를 들어, 본 발명의 조성물에 포함되는 유효성분의 농도는 치료 목적, 환자의 상태, 필요기간 등을 고려하여 결정할 수 있으며 특정 범위의 농도로 한정되지 않는다. 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.001-1,000 mg/kg이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때, 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1 : 박테리아 균주, 배지 및 배양조건
본 발명의 실험에서 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli : E. coli) XL1-Blue [endA1 gyrA96 (nalR) thi-1 recA1 relA1 lacglnV44 F'[::Tn10 proAB+ lacIΔ(lacZ)M15] hsdR17(rK- mK+)], JM110 [rpsL thr leu thi lacY galK galT ara tonA tsx dam dcm glnV44 Δ(lac-proAB) e14- [F' traD36 proAB+ lacIq lacZΔM15] hsdR17(rK-mK+)]을 유전자 클로닝을 위한 숙주세포로 사용하였고, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum: C. glutamicum) ATCC13032(American Type Culture Collection)를 약물전달체 제작을 위한 숙주세포로 사용하였다. 본 실험에서 사용한 E. coli 와 C. glutamicum 균주는 Luria-Bertani(LB) 배지(difco사)를 사용하여 37℃와 32℃에서 각각 배양하였으며, 배양시 필요에 따라 적정량의 항생제(Kanamycin 20 ㎍/㎖, Chloramphenicol 10 ㎍/㎖, Ampicillin 50 ㎍/㎖)를 첨가하여 사용하였다.
실시예 2 : 컴피턴트 세포(competent cell)의 제조 및 형질전환
대장균(E. coli XL1-Blue, JM110)의 컴피턴트 세포(competent cell) 을 다음과 같이 제작하였다. 우선, 세포를 LB 플레이트 배지에서 배양한 후 단일 콜로니를 액체배지에 접종하여 전배양하고, MgCl2 20 ㎖ 이 첨가된 SOB 배지에 계대하여 22℃에서 본배양하였다. OD 600 ㎚ 값이 0.5 일 때 회수하여 이노우에 형질전환 버퍼(Inoue transformation buffer)를 처리하여 제조하였다. 제조된 세포의 경우 -80℃에 보관하고 사용하였다. 형질전환 방법은 일반적인 열 충격(heat shock) 방법에 따라 각각의 재조합 DNA를 컴피턴트 세포와 혼합한 후 얼음에 30분간 정치한 후, 42℃에서 90초 동안 열 충격하고, 얼음에서 2분간 방치하는 방법으로 수행하였다. 이후 37℃에서 배양한 후, 적절한 항생제가 포함된 LB 고체배지에 도말하여 15-20 시간 내외로 성장을 유도한 후 콜로니 크랙킹(colony cracking)과 콜로니 PCR을 통해 원하는 유전자가 삽입된 클론을 확보하였다.
코리네박테리아 글루타미쿰(C. glutamicum)의 컴피턴트 세포는 다음과 같이 제작하였다. 우선 세포를 LB 플레이트 배지에서 배양한 후 단일 콜로니를 2% 글루코스가 포함된 LB 액체 배지에 접종하여 전배양하고, 배양액을 이소니코틴산 히드라지드(isonicotinic acid hydrazide(isoniazid; 4 ㎍/㎖), glycine(25 ㎍/㎖), Tween 80(0.1%))가 포함된 LB 배지(called Epo medium)에 1-2% 접종한 뒤 25℃에서 배양하여 OD 600 ㎚ 값이 0.6 일 때 회수하여 10% 글리세롤로 4회 세척하여 전기 천공능세포(electrocompetent cell)를 준비하였다. 제작된 세포 100 ㎕ 씩 분주하여 -80℃에 보관하고 사용하였다. 코리네박테리아 글루타미쿰 형질전환 방법의 수율을 높이기 위하여 JM110에 형질전환한 뒤 메틸레이션 패턴(methylation pattern)이 없는 재조합 벡터를 회수하여 사용하였다. 코리네박테리아 글루타미쿰의 전기천공법에 의한 형질전환방법은 전기천공능세포 100 ㎕에 재조합 플라스미드를 200-500 ng/㎕를 첨가하고 0.2 ㎝ 큐벳(cuvette), 25 uF, 600 ohm, 2.5 kV, 10-12 ms의 조건으로 전기천공장치(Bio-Rad, USA)에서 전류를 가한 후, 바로 46℃에서 6분 동안 열 충격을 가하여 수행하였다(van der Rest ME, et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 52:541-545(1999)). 이후 1 ㎖의 SOC 배지를 첨가하여 32℃에서 1.5시간 동안 배양하고, 적절한 항생제가 포함된 LB 고체배지에 도말하여 재조합 균주를 선별하였다.
실시예 3 : 코리네박테리아로부터 미니셀 생산 균주 제작 및 미니셀 분리
코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum) 으로부터 미니셀 생산 균주 제작은 격벽형성위치 조절에 관여하는 단백질을 탐색하여 불활성화 시키는 방법으로 수행하였다.
관련유전자의 탐색은 대장균의 minCDE의 아미노산 서열을 바탕으로 Blast P 검색을 통해 확인하였으며, 그 결과 대장균의 MinD와 코리네박테리아의 ParA, NCgl1366, Mrp가 각각 22%, 24%, 18%의 상동성(identities)을 갖는 것을 확인하였다. minD와 낮은 상동성을 갖음에도 불구하고, 위 단백질 모두 세포 분열에 관련된 단백질임을 알 수 있었으며(description; putative cell division protein, chromosome partitioning ATPase), 따라서 상기 유전자(parA, NCgl1366, mrp)들의 삭제 돌연변이 균주를 제작하는 실험을 수행하였다.
코리네박테리아 글루타미쿰에서의 유전자의 삭제는 pK19mobsacB 벡터를 이용하여 상동성 재조합(homologous recombination) 유도 및 돌연변이 균주를 선별하는 전형적인 방법으로 수행하였다. 상동성 암(homologous arm) 제작을 위해 각각의 유전자의 위쪽과 아래쪽의 유전자를 아래 표 1 에 나타낸 프라이머를 이용하여 PCR을 통해 약 500 bp 길이가 되도록 증폭하고, 이 두 상동성 암(homologous arm)을 주형으로 오버랩핑(overlapping) PCR을 통해 연결시킨 뒤 pK19mobsacB 벡터에 클로닝하였다. 이후 코리네박테리아 글루타미쿰에 형질전환 한 뒤 항생제와 10% 수크로스(sucrose)를 이용한 두 번의 선별과정을 거쳐 유전자가 삭제된 것으로 보이는 돌연변이를 선별하고, 마지막으로 체크 프라이머를 이용하여 콜로니 PCR을 통해 목표 유전자가 삭제된 돌연변이 균주를 확보하였다. 실험결과, parA와 NCgl1366 유전자가 각각 삭제된 돌연변이 균주를 확보하였으며, mrp의 경우 3회 이상 실시하였으나 돌연변이 균주를 확보하지 못하였다. 설명할 수 있는 이유로, Mrp 의 경우 코리네박테리아 글루타미쿰의 생리에 필수 단백질이기 때문에 돌연변이 균주가 생성되지 않는 것으로 보인다. 하기 표 1은 본 발명에서 돌연변이 균주 제작을 위하여 사용한 프라이머 폴리뉴클레오타이드 서열이다.
표 1
Figure PCTKR2015011154-appb-T000001
상기 두 돌연변이 균주(parA, NCgl1366)를 현미경을 통해 관찰한 결과 두 균주 모두 정상 균주와는 다르게 세포분열시 비균등 분열이 일어나는 것을 확인할 수 있었으며, 그 결과 길이가 긴 세포와 작은 구형의 미니셀처럼 보이는 세포가 관찰되었다. 미니셀 크기로 생성된 세포가 정말 미니셀인지 확인을 위해 SYTO9를 이용하여 염색체(chromosomal) DNA를 염색하여 형광현미경(OLYMPUS BX43 U-RFL-T)을 통해 관찰한 결과, 작은 구형의 세포에서는 형광이 적거나 없는 것을 확인하였다.
따라서, 생성된 작은 구형의 세포가 미니셀임을 확인하였다(도 1). 또한, NCgl1366 돌연변이 균주의 경우 미니셀 뿐만 아니라 무핵(anucleate) 세포도 함께 관찰되는 것을 확인하였다. 상기 결과에 따르면 두 돌연변이 균주 모두 미니셀 생성균주로 사용될 수 있으며, 이 외에도 세포분열에 관련된 다른 유전자의 삭제 또는 세포분열에 관련된 단백질의 과발현을 통해 세포분열 과정의 동요(perturbation)를 유발하여 미니셀 생성 균주를 제작할 수 있다.
parA 돌연변이 균주로부터 미니셀의 분리는 원심분리와 항생제를 처리하는 방법을 통해 수행하였다. 200 ㎖의 LB 액체배지에 돌연변이 균주를 접종하고 30℃에서 배양하여, OD 600 ㎚ 값이 2.0 일 때 2000 g에서 10분 동안 원심분리하여 영양세포를 제거하고 다시 상등액을 10000 g에서 10분 동안 원심분리하여 회수하였다. 이후 50 ㎖의 LB 배지에 회수된 미니셀 펠렛을 부유시키고 30℃에서 20분 동안 배양한 뒤, 항생제(Streptomycin 50ug/ml)을 첨가하여 다시 1시간 동안 배양하여 남아있는 영양세포를 죽였다. 이후 400 g에서 5분간 원심분리하여 세포 잔해(cell debris)를 제거하고 다시 상등액을 10000 g에서 10분 동안 원심분리하여 미니셀을 회수하였다. 상기 과정을 거친 미니셀은 영양세포의 오염정도를 확인하기 위해 생존세포 카운팅(viable cell counting)을 수행하였으며, 그 결과 100 cfu/㎖ 미만의 영양세포가 오염되어있음을 확인할 수 있었다. 최종적으로 분리된 미니셀의 양은 최초 200 ㎖ 배양 시 약 3 × 1010개 세포가 확인되었다.
실시예 4 : 코리네박테리아 유래 약물전달체의 내독성(endotoxin activity) 평가
코리네박테리아 글루타미쿰은 그람 양성 균주로 세포벽 구성 물질로 내독성 활성의 주요 원인 물질이 되는 LPS(Lipopolysacharide)를 갖지 않으나, 두터운 펩티도글리칸 층과 여기 결합된 아라비노칼락탄(arabinogalactan)을 갖으며, 이외에도 그람 음성균의 외막 역할을 하는 마이콜릭산(mycolic acid) 층과 세포벽 표면의 프리 폴리사카라이드(free polysaccharides), 글리코리피드(glycolipids), 단백질(S-layer protein, pili 등) 등의 복잡한 구조를 갖는 것으로 알려져 있다(A Burkovski et al., ISRN Microbiol. 2013:11(2013)). 아직까지 이들 구성 물질에 의한 내독성 유발 여부는 알려져 있지 않으며, 이를 확인하기 위해 LAL 크로모제닉 내독소 정량 키트(LAL chromogenic endotoxin quantification kit, Thermo scientific)를 사용하여 대장균과 비교하여 실험하였다. 실험을 위해 야생형 코리네박테리아 글루타미쿰(C. glutamicum)과 parA 돌연변이균주로부터 분리된 미니셀을 각각 사용하였으며, 소니케이션(sonication)을 통한 라이시스(lysis) 전과 후를 나누어 비교하였다. 그 결과 코리네박테리아 글루타미쿰과 미니셀의 경우 대장균에 비해 현저히 낮은 수준의 내독성 활성을 확인할 수 있었다(도 2).
실시예 5 : 암세포 표적인자의 표면발현을 위한 재조합 벡터 제작
본 발명에서는 암세포 표적인자로 아피바디(affibody)(HER2)와 레피바디(repebody)(EGFR)를 이용하였다. 코리네박테리아 글루타미쿰에서 아피바디와 레피바디의 표면발현은 (1) 막(membrane) 단백질을 운반단백질(autotransporter)로 활용하여 융합단백질(fusion protein) 제작을 통한 방법과, (2) 소타제(sortase) 의존적으로 코리네박테리아 글루타미쿰의 세포벽 펩티도글리칸 층에 표적인자 단백질을 앵커링(anchoring) 시키는 방법의 두 가지 방법을 각각 실시하였다. 먼저 코리네박테리아 글루타미쿰에서 운반단백질을 이용하여 목적단백질을 표면발현 시킨 예로 α-아밀라아제(α-amylase)가 있으며(W Yao et al., Arch. Microbiol., 191:751-759(2009)), 본 실시예에서도 위 사례를 참고하여 실험을 수행하였다.
이를 위해 다음 표 2와 같은 프라이머를 제작하여 표면발현 목적단백질인 아피바디와 레피바디 유전자를 각각 증폭하고, 운반단백질로 사용할 NCgl1221 유전자를 코리네박테리아 글루타미쿰의 게노믹(genomic) DNA를 주형으로 PCR을 통해 증폭하였다. 이때, NCgl1221 운반단백질로 기능하도록 신호서열을 포함한 N-말단(terminal)의 423개 아미노산이 번역되도록 하였으며, 링커서열(SSSSGSSSSG)과 태그 서열(Myc-tag, His-tag)을 포함하도록 설계하고 아피바디와 레피바디를 C-말단에 위치시켜 융합단백질로 발현되도록 제작하였다. NCgl1221 유전자는 HindⅢ 와 KpnI으로 절단하고, 링커서열과 태그서열이 포함된 아피바디와 레피바디는 KpnI 과 SacI으로 절단하여 pXMJ19 벡터에 클로닝하였으며, 최종적으로 NCgl1221-affibody, NCgl1221-repebody 두 컨스트럭트를 포함하는 pXMJ19 재조합 벡터를 제작하였다(도 3A). 하기 표 2에는 본 발명에서 오토-트랜스포터(auto-transporter)를 이용한 표면발현 단백질 제작 프라이머 폴리뉴클레오타이드 서열을 나타내었다.
표 2
Figure PCTKR2015011154-appb-T000002
두 번째로 소타제(Sortase) 의존적인 표면발현을 위해 리스테리아균 (Listeria monocytogene KCTC13064) 유래의 소타제(Sortase, srtA)와 소타제 의존적 표면발현 단백질로 잘 알려진 인테날린 A(internalin A : inlA)의 신호서열 및 구조서열을 활용하여 융합단백질을 설계하였다(WD Schubert et al., Cell 111:825-836(2002)). 유전자원 확보를 위해 리스테리아 균을 분양받아 Brain Heart Infusion 고체배지에서 배양하여 배양된 균주로부터 게노믹(genomic) DNA를 추출하고 이를 주형으로 다음 표 3의 프라이머를 이용하여 sortase와 internalin 유전자를 증폭하였다. 하기 표 3에는 본 발명에서 소타제(sortase) 의존적인 표면발현 단백질 제작에 이용한 프라이머의 폴리뉴클레오타이드 서열을 나타내었다.
표 3
Figure PCTKR2015011154-appb-T000003
클로닝에는 코리네박테리아 유래 항시발현 프로모터(Psod, PilvC)가 장착된 벡터인 pCXS35와 pCXI40을 각각 사용하였다(J Lee et al, J. Microbiol. Biotechnol., 24:70-79(2014)). Sortase 유전자는 야생형 균주의 프로모터와 터미네이터(terminator sequence)를 포함하도록 하여 KpnI 자리에 클로닝하였고, internalin A는 BamHI 과 PstI 제한효소 처리 후 클로닝하였다. 즉 srtA, inlA, srtA-inlA의 컨스트럭트를 포함하도록 pCXS35와 pCXI40 재조합 벡터를 제작하였다. 이후, 인터날린 A(internalin A)의 E-카드헤린(E-Cadherin)에 결합하는 부위를 아피바디와 레피바디를 대체하여 융합단백질로 발현되도록 유전자를 설계하고 상기 표 3의 프라이머를 이용하여 재조합 벡터를 제작하였다. 유전자 구성은 internalin A 의 N-말단의 신호서열과 Cap 서열을 포함하고, C-말단의 구조서열과 소타제 의존적인 서열을 포함하도록 하였으며, Cap 서열과 구조서열 사이에 아피바디와 레피바디 유전자를 삽입하여 결과적으로 inlAss-affibody, inlAss-repebody 컨스트럭트를 포함하도록 pCXS35/srtA, pCXI40/srtA에 재조합 벡터를 제작하였다. 또한 Western 분석을 위해 소타제 인식 부위인 LPXTG motif 앞에 히스티딘 태그(MH6)를 포함하도록 컨스트럭트를 제작하였다(도 3B).
실시예 6 : 코리네박테리아에서 암세포 표적인자의 표면발현 확인
상기 실시예 5에서 제작된 NCgl1221-affibody, NCgl1221-repebody, srtA, inlA, srtA-inlA, inlAss-affibody, inlAss-repebody 컨스트럭트는 실시예 2에서 설명된 방법으로 코리네박테리아에 형질전환하여 재조합 균주를 제작하였다. 운반단백질을 이용한 표면발현 컨스트럭트인 NCgl1221-아피바디, NCgl1221-레피바디는 클로람페니콜(Chloramphenicol 10 ㎍/㎖)이 포함된 LB 고체배지에서 배양된 각각의 재조합 균주 단일 콜로니를 15 ㎖ 시험관에 전배양한 후 100 ㎖의 삼각플라스크에 1% 접종하여 32℃, 200 rpm 조건에서 본 배양을 수행하였다. 이후 OD 600 ㎚ 값이 0.5 일 때 1 mM 농도로 IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 첨가하여 단백질 발현을 유도하고, 3-6 시간 동안 배양하여 시간별로 세포를 회수하였다. 소타제 의존적인 표면발현 컨스트럭트인 inlAss-affibody, inlAss-repebody는 카나마이신(Kanamycin 20 ㎍/㎖) 이 포함된 배지에서 배양하였으며, pCX 시리즈 벡터의 경우 항시 발현 벡터이므로 따로 발현 유도물질은 첨가하지 않고 배양 후 시간별로 샘플을 회수하였다. 각각의 재조합 단백질의 발현 확인을 위해 SDS-PAGE와 Western 블롯 분석을 수행하였다. 그 결과 운반단백질을 이용한 표면발현 컨스트럭트에서 NCgl1221-affibody 의 경우에는 잘 발현되어 Western 상에서 발현 밴드가 잘 확인되나, NCgl1221-repebody 의 경우에는 발현밴드를 확인할 수 없었다. 설명할 수 있는 이유로 아피바디에 비해 레피바디가 크기가 큰 단백질이기 때문에 상대적으로 표면발현이 어려울 수 있다. 두 번째로 소타제 의존적인 표면발현 컨스트럭트인 inlAss-affibody 와 inlAss-repebody 의 경우도 SDS-PAGE 와 Western 블롯 분석을 수행하였으며, 두 융합단백질 모두 코리네박테리아에서 발현되는 것을 확인하였다(도 4).
실시예 7 : 코리네박테리아 약물전달체의 HER2, EGFR 과발현 암세포에 대한 특이성 확인
아피바디와 레피바디의 HER2와 EGFR에 대한 특이성을 확인하기 위해, 미니셀 생성 코리네박테리아 글루타미쿰 균주(C. glutamicum △parA)를 이용하여 실시예 2와 동일한 방법으로 전기천공능세포를 제작하고, 이를 이용하여 pCXI40/inlAss-affibody와 pCXI40/inlAss-repebody를 각각 형질전환하여 재조합 균주를 제작하였다.
이후 실시예 3과 동일한 방법으로 아피바디와 레피바디 각각의 표적인자가 표면 발현된 미니셀을 회수하였다. HER2와 EGFR에 대한 특이성 확인은 ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay)를 통해 수행하였다. 실험 방법은 96 웰 플레이트에 HER2 또는 EGFR을 각각 넣고 4℃에서 오버나이트(overnight)하여 코팅하고, 블로킹 버퍼(2% skim milk in PBS)를 이용하여 두 시간 동안 25℃에서 반응시킨 뒤, 워시 버퍼(0.1% Tween-20)로 3회 세척하고, 이후 아피바디와 레피바디 표면 발현 미니셀을 넣어 25℃에서 2시간 동안 반응 시켰다. 이때 아무것도 발현되지 않은 미니셀을 대조군으로 함께 실험하였다. 이후 플레이트를 워시 버퍼를 이용하여 3회 세척하고, 1차 항체(α-affibody, α-repebody, Abcam)를 넣어 약 1시간 동안 반응시킨 뒤 다시 워시 버퍼를 이용하여 3회 세척하고, HRP(horseradish peroxidase)가 결합된 2차 항체를 넣고 약 1시간동안 반응시킨 뒤 세척하였다. 이후 HRP 기질(tetramethybenzidine: BD OptEIA)과 반응하여 레이져 스캐너(laser scanner, infinite M200: TECAN)를 이용하여 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
실험결과 아피바디와 레피바디가 표면 발현된 미니셀에서 HER2와 EGFR 각각에 대한 특이성을 확인할 수 있었으며, 아무것도 발현하지 않는 미니셀의 경우 특이성이 나타나지 않는 것으로 확인되었다(도 5).
암세포에 대한 특이성을 확인하기 위해 상기 과정을 통해 제작된 코리네박테리아 글루타미쿰 미니셀을 이용하여 유방암세포와 반응시켜 세포 업테이크(cell uptake) 정도를 비교하였다. 실험에 사용된 인간 유방암 세포주는 HER2와 EGFR의 발현 정도에 따라 실험군으로 선정하여 배양하였다(K Subik et al., Breast Cancer, 4:35-41(2010)). SKBR-3(HER2:+, EGFR:+), MDA-MB-453(HER2:-, EGFR:-), MDA-MB-435 (HER2:+, EGFR:-) 유방암 세포주의 배양은 37℃, 5% 이산화탄소 조건하에서 10% FBS(Fetal Bovine Serum; Gibco, Invitrogene) 및 1% 의 항생제(Penicillin, streptomycin, Gibco, Invitrogene)가 포함된 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle medium; Hyclone, Thermal scientific) 또는 RPMI(Roswell Park Memorial Institute medium; Hyclone, Thermal scientific) 배지에서 배양하였다. 실험방법은 SKBR-3, MDA-MB-453, MDA-MB-435 유방암 세포주를 배양하여 12 웰 컬쳐 플레이트에 젤라틴-코팅 커버슬립(gelatin-coated coverslips)을 넣고, 각 웰 당 약 1 x 107개의 유방암세포를 넣은 뒤 배양하였다. 약 12 - 16시간 배양하여 콘플루언스(confluence)가 70% 정도일 때, 미니셀과 반응시켰다. 미니셀과 반응을 위해 OPTIMEM medium으로 배지를 갈아주고, 미니셀을 넣은 뒤 약 4시간동안 37℃에서 반응시키고 PBS를 이용하여 3회 세척하여 남아 있는 미니셀을 제거하였다. 세척 후 4%(w/v) PFA(paraformaldehyde)를 이용하여 10분 동안 반응시켜 세포를 고정하고 다시 세척한 뒤, 0.1% Triton x-100을 10분 동안 처리하였다. 이후 1% BSA 와 1시간 동안 상온에서 반응시키고 팔로톡신(phallotoxin)을 이용하여 20분 동안 반응하여 염색(staining) 하였다. 다시 PBS를 이용하여 세척하고 마운탄트(mountant, prolong Gold reagent DAPI)를 사용하여 커버슬립을 마운팅 한 후에 형광현미경(OLYMPUS BX43 U-RFL-T)을 이용하여 1000 배율에서 관찰하였다.
실험결과, 아피바디와 레피바디가 각각 표면 발현된 코리네박테리아 유래 미니셀이 HER2 또는 EGFR이 과발현된 암세포주에 업테이크 되는 것을 확인하였으며, 반대로 MDA-MB-435 암세포주에서는 상대적으로 덜 업테이크되는 것으로 관찰되었다. 대조군으로 사용한 미니셀의 경우 모든 경우에서 업테이크 되지 않는 것으로 확인되었다(도 6).
실시예 8 : 약물 단백질 발현을 위한 재조합 벡터 제작 및 코리네박테리아에서 발현 확인
약물단백질 유전자로 아스파라기나제(asparaginase), IL32β, IL32γ는 다음 표 4와 같이 프라이머를 제작하여 PCR(polymerase chain reaction)로 증폭하여 준비하였다. 아스파라기나제, IL32β, IL32γ 유전자는 HindⅢ와 EcoRI 제한효소를 이용하여 pXMJ19 벡터에 클로닝 하였으며, 최종적으로 pXMJ19/asparaginase, pXMJ19/il32β, pXMJ19/il32γ 재조합 벡터를 제작하였다. 상기 방법으로 클로닝된 유전자로부터 약물단백질이 잘 발현되는지를 확인하기 위해, 실시예 2에 설명한 방법과 동일한 방법으로 코리네박테리아 글루타미쿰에 형질전환시켜 재조합 균주를 제작하였다. 하기 표 4에는 본 발명에서 아스파라기나제(asparaginase), il32β, il32γ 발현 벡터 제작에 이용한 프라이머의 폴리뉴클레오타이드 서열이다.
표 4
Figure PCTKR2015011154-appb-T000004
코리네박테리아 글루타미쿰 재조합 균주에서 약물단백질의 발현을 확인하기 위해 클로람페니콜(Chloramphenicol 10 ㎍/㎖)이 포함된 LB 고체배지에서 배양된 각각의 재조합 균주 단일 콜로니를 15 ㎖ 시험관에 전배양한 후, 100 ㎖의 삼각플라스크에 1% 접종하여 32℃, 200 rpm 조건에서 본 배양을 수행하였다. 이후 OD 600 ㎚ 값이 0.5 일 때 IPTG 1mM을 첨가하여 단백질 발현을 유도하고, 3-6 시간 동안 배양하여 시간별로 세포를 회수하였다. 이후 약물단백질의 발현 확인을 위해 SDS-PAGE 분석을 수행하였다.
실험결과, 아스파라기나제 단백질의 경우 SDS-PAGE상에서 밴드를 확인할 수 있었으며, 대장균과 마찬가지로 코리네박테리아에서도 과발현 되는 것을 확인하였다(도 7). 반면에 IL32β와 IL32γ의 경우 SDS-PAGE 상에서 발현을 확인할 수 없어 His-tag을 부착하여 Western 블롯 분석을 통해 확인하였다. 그 결과 IL-32β 의 경우 발현을 확인하였으나, IL-32γ의 경우 발현 밴드를 확인하지 못하였다(도 7).
실시예 9 : 코리네박테리아에서 램프태그(ramp-tag)를 적용한 약물단백질의 과발현 확인
램프태그의 설계를 위해 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum ATCC13032) 균주의 코돈 이용(codon usage)을 분석하고 희귀코돈을 수집하였다. 여기서 말하는 희귀 코돈은 일반적으로 알려진 희귀 코돈의 개념에 더해 하위에서 설명하는 과정에서 수집되는 코돈들을 지칭한다. 번역의 속도는 코돈을 해독할 때, 아미노산이 결합된 상태인 아미노산(aa)-tRNA가 얼마나 신속하게 공급되느냐에 따라 가장 크게 영향을 받는다. 따라서 해당 아미노산-tRNA의 양이 세포 내에 충분히 존재하는 코돈에서 번역속도는 빠르고 반대로 아미노산-tRNA의 부족은 번역효율을 떨어뜨린다.
따라서 tRNA의 유전자 카피(gene copy)는 세포 내 해당 tRNA의 농도를 유추할 수 있는 첫 번째 척도로 사용할 수 있다. 알려진 바와 같이, 전형적인 코돈 최적화 방법은 코돈 빈도수(codon frequency)를 반영하는데, 이는 코돈 빈도수와 해당 tRNA 카피수가 비례한다고 알려졌기 때문이다. 본 실험에서는 코리네박테리움 글루타미쿰에서 각 아미노산에 해당하는 코돈 빈도수(100% 기준)와 tRNA 유전자 카피를 이용하였으며(http://gtrnadb.ucsc.edu/), 희귀 코돈을 수집하는 조건은 특허(KR 1020130027549)의 방법을 참조하였다. 간략히 설명하면, 각 아미노산에서 코돈쌍 빈도수가 1.0% 이하 인 것이며, 한 아미노산에 대해 최대 3개 코돈까지 수집하였다. 여기에는 각 코돈 빈도수를 고려하는 방법과 이소억셉터(isoacceptor) tRNA의 유전자 카피 수를 고려하는 방법을 혼용하였다(표 5). 하기 표 5에서는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주의 수집된 희귀 코돈을 나타내었다.
표 5
Figure PCTKR2015011154-appb-T000005
상기 표의 코돈 빈도수를 토대로 램프태그를 설계하여 목적 유전자의 N 말단에 융합되도록 클로닝을 수행하였다. 하기 표 6에는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에서 램프태그 적용 IL32 유전자 프라이머 서열을 나타내었다.
표 6
Figure PCTKR2015011154-appb-T000006
본 실시예에서는 상기 논리를 토대로 제작된 램프태그가 적용된 재조합 약물단백질(IL32β, IL32γ)을 코리네박테리아 글루타미쿰에서 발현시키고 과발현 가능 여부를 평가하였다. 램프태그가 적용된 ramp-IL32β, ramp-IL32γ를 각각 2개씩 설계하여 pXMJ19 벡터에 클로닝하였다. 램프태그가 적용된 IL32β, IL32γ 유전자 증폭은 상기 표 6의 프라이머를 사용하여 PCR을 통해 증폭하였으며, 클로닝은 상동성 재조합(homologous recombination)을 이용한 SLIC(sequence ligation independent cloning) 방법으로 수행하였다(MZ Li et al., Nat. Methods., 4(3):251-6(2007)). 이후 재조합 벡터를 실시예 2에서 설명된 바와 같이 코리네박테리아 글루타미쿰에 형질전환 하였다. 이후 단백질 발현 여부를 확인하기 위해 실시예 8에서와 같이 재조합 균주를 배양하고 SDS-PAGE 수행하였다. 또한 His-tag 항체를 이용하여 Western 블롯 분석을 수행하였다.
결과적으로 코리네박테리아 글루타미쿰 재조합 균주에서 IL32β의 경우, 대조군에 비해 램프 태그가 융합된 IL-32β(R1-IL32β, R2-IL32β)의 총 단백질 양이 4.2 - 6.3 배 이상 증가함을 확인할 수 있었으며, IL32γ를 발현시켰을 때 대조군은 전혀 발현되지 않으나 램프태그가 적용된 경우 과발현되는 것을 확인하였다(도 8).
실시예 10 : 코리네박테리아에서 쿼럼센싱(Quorum sensing) 발현 모듈이 적용된 약물단백질의 자가 유도 발현 확인
본 실시예에서는 코리네박테리아 글루타미쿰에서 쿼럼센싱에 의한 자가유도 시스템이 작동되는지를 확인하고 이를 통해 약물단백질을 발현시키는 시스템으로 그 가용성을 확인하였다. 그람 음성균인 비브리오 피스체리(Vibrio fischeri) 유래 쿼럼센싱 발현 시스템을 코리네박테리아 글루타미쿰에서 활용이 가능한지를 알아보기 위해 luxI 에 의해 AHL 이 생성될 수 있는 조건을 확인하였다.
확인 결과, 코리네박테리아 글루타미쿰에는 AHL 생산의 기질로 활용되는 SAM(S-adenosylmethionine)을 생성하는 효소인 Cgl1603(S-adenosyl methionine synthetase(EC:2.5.1.6))이 있는 것을 확인하였다. 반대로 AHL 분해 활성으로 인한 쿼럼퀀칭(Quorum quenching) 가능 여부를 확인하기 위해 AHL 하이드로라제(hydrolase)의 유무를 확인하였다. Bacillus 유래의 AHL 하이드로라제의 아미노산 서열정보를 바탕으로 NCBI의 Blast P 프로그램을 통해 검색을 수행하였으며, 그 결과 S-아데노실-호모시스테인 하이드로라제(S-adenosyl-homocystein hydrolase, under 25% identities)는 확인되나, AHL 하이드로라제에 관련된 효소는 없는 것으로 확인되었다. 따라서, 코리네박테리아에서 쿼럼센싱 시스템 확인에 기존 시스템에서 별다른 유전자의 추가 또는 삭제 없이 그대로 이식하여 가용성 여부를 확인하였다.
쿼럼센싱 시스템의 가용성 확인은 mCherry 유전자를 리포터 단백질로 활용하였으며, 약물단백질로 아스파라기나제(asparaginase)를 발현시켜 발현 정도와 활성을 확인하였다. 각각의 컨스트럭트의 제작을 위해 셔틀벡터인 pCES208을 사용하였으며, 클로닝 방법은 선행연구를 통해 제작된 재조합 벡터인 pBAD24/luxR-luxI-mCherry와 pBAD24/luxR-luxI-asparaginase를 주형으로 하여, 아래 표 7의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭된 유전자를 pCES208 벡터의 BamHI과 EcoRV 제한효소 자리를 이용하여 수행하였다. 상기 pBAD24/luxR-luxI-mCherry와 pBAD24/luxR-luxI-asparaginase 재조합 벡터는 비브리오 피스체리 (Vibrio fischeri) 유래의 쿼럼센싱 유전자로 잘 알려진 luxR과 luxI를 이용하여 제작되었으며, overlapping PCR 기법을 통해 luxR과 luxI 사이에 luxRI 프로모터를 포함하고 luxI 유전자의 downstream 쪽에 mcherry 또는 asparaginae 유전자를 위치시켜 translational coupling 되어 발현되도록 컨스트럭트를 제작한 뒤 pBAD24 벡터에 클로닝하였다.
하기 표 7에는 mCherry과 아스파라기나제 쿼럼센싱 발현 시스템을 위한 프라이머의 폴리뉴클레오타이드 서열을 나타내었다.
표 7
Figure PCTKR2015011154-appb-T000007
제작된 재조합 벡터는 실시예 2에서 설명된 바와 같이 코리네박테리아 글루타미쿰에 형질전환하고, 카나마이신(Kanamycin 20 ㎍/㎖)이 포함된 LB 고체배지에서 선별하였다. 각각의 재조합 균주 단일 콜로니를 15 ㎖ 시험관에 전배양한 후, 100 ㎖의 삼각플라스크에 1% 접종하여 32℃, 200 rpm 조건에서 본 배양을 수행하였다. luxR-luxI-mCherry 컨스트럭트가 형질전환된 코리네박테리아 재조합 균주의 경우, 본 배양 과정 중 유도물질 없이 쿼럼센싱 기작에 의해 mCherry 단백질이 발현되는 것을 확인하였으며, 따라서 코리네박테리아에서 쿼럼센싱에 의한 발현 시스템이 작동함을 알 수 있었다. 시간별로 샘플을 회수하여 SDS-PAGE를 수행한 결과, 배양한지 약 10 시간 이후부터 쿼럼센싱에 의한 mCherry 단백질의 발현을 확인할 수 있었다(도 9A).
약물단백질을 탑재한 luxR-luxI-asparaginase 컨스트럭트를 이용하여 상기 방법과 동일하게 실험을 수행한 결과, 아스파라기나제 또한 쿼럼센싱 발현 시스템에 의해 과발현 되는 것으로 확인되었다(도 9B). 이후, luxR-luxI-asparaginase가 형질전환된 대장균과 코리네박테리아 글루타미쿰 각각의 재조합 균주를 배양한 후 쿼럼센싱에 의한 발현 유도 이후에 세포를 회수하고, 소니케이션(sonication)을 통해 세포를 파쇄하여 크루드(crude) 상태에서 각각의 아스파라기나제의 활성을 비교하였다.
그 결과 두 균주에서 아스파라기나제에 의한 활성을 확인할 수 있었으며, 대장균에서 발현시킨 경우와 코리네박테리아 글루타미쿰에서 발현시킨 경우의 아스파라기나제의 활성 차이는 미미한 것으로 나타났다.
실시예 11 : 동물세포와 재조합 코리네박테리아를 동시 배양한 후 약물단백질의 발현 확인
본 실시예에서는 아스파라기나제 유전자가 탑재된 재조합 코리네박테리아 글루타미쿰과 동물세포를 함께 배양하였을 때, 동물세포 배양액 환경에서 약물단백질이 정상적으로 발현되는지를 확인하였다. 실험을 위해 유방암 세포주 MDA-MB-453을 배양한 뒤 트립신(trypsin) EDTA 처리하여 48 웰 컬쳐 플레이트에 약 104개 세포수가 되도록 옮겨 20시간 동안 배양하고, 재조합 코리네박테리아를 OD 600 ㎚ 값이 0.5 일 때 원심분리를 통해 세포를 수확하고 다시 DMEM 배지에 부유시켜 각 웰 당 약 107~108개 정도의 세포수가 되도록 첨가하여 동물세포와 함께 배양하였다. 배양을 유도하면서 시간별로 샘플링하고 SDS-PAGE를 통해 단백질 발현을 확인한 결과, pCES208/luxR-luxI-asparaginase가 형질전환된 코리네박테리아 글루타미쿰과 유방암 세포주 MDA-MB-453을 동물세포 배양 배지에서 함께 배양한 경우에도 코리네박테리아 글루타미쿰이 잘 자라며, 생존세포 카운팅(viable cell counting)을 통해 확인한 결과 자가 유도를 일으키기 충분한 세포수인 109개 까지 증식함을 확인하였다. 또한, 쿼럼센싱 발현 시스템이 잘 작동하며 그 결과 아스파라기나제가 과발현되는 것을 확인하였으며, 따라서 상기 컨스트럭트가 생체 내(in-vivo) 환경에서도 잘 작동될 수 있음을 알 수 있었다(도 10).
이후 세포 활성 측정을 위해 MTT assay를 수행하였다. 유방암 세포주 SKBR-3, MDA-MB-453, MDA-MB-435를 각각 배양한 뒤 96 웰 배양 플레이트에 각 웰 당 약 104 개의 세포를 넣고 37℃, 5% 이산화탄소 조건에서 오버나이트(overnight)하여 배양 하였다. 이후 상기 쿼럼센싱에 의해 아스파라기나제를 발현하는 pCES208/lucR-luxI-asparaginase 코리네박테리아 재조합 균주를 넣은 뒤 4시간 동안 반응시키고 PBS를 이용하여 세척한 뒤 배지를 갈아 추가로 24시간, 48시간 동안 배양하였다. 이후 PBS를 이용하여 세척하고, 100 ㎕의 MTT 시약을 넣어 37℃에서 4시간 동안 반응시킨 뒤, DMSO 200 ㎕를 넣고 570nm에서 흡광값을 측정하였다. 실험 결과 아스파라기나제 발현 재조합 벡터가 장착된 코리네박테리아를 처리하여 대조군과 비교하였을 때 약물단백질에 의한 암세포의 세포 활성이 저해되는 것을 확인하였다(도 11).
실시예 12 : 암 모델 동물에서 코리네박테리아 유래 약물전달체를 이용한 항암 효과 확인
암 동물 모델 제작을 위해 6-8 주령의 Balb/c 누드 마우스(Orient Bio Inc.)를 실험에 사용하였다. 전남대학교 동물연구회(Animal Research Committee)에서 승인된 프로토콜 및 NIH(National Institute of Health)에서 발표한 실험동물 사육 및 이용에 대한 가이드(발표 85-23, 개정 1985)에 따라 모든 동물 사육, 실험 및 안락사를 실시하였다. 먼저 실험동물에서 피하 종양은 다음과 같이 유도하였다. 상기 실시예 10에서 배양한 HER2과 EGFR을 과발현하는 유방암세포 MDA-MB-435, SKBR-3를 원심분리하여 수확한 후, 약 1 × 106개 세포가 되도록 100 ㎕의 PBS에 현탁하여 마우스의 허벅지 피하 조직에 이식하였으며, 암 조직의 크기를 측정하였다(가로 × 세로 × 높이/2). 이식 후 약 10일 후에 코리네박테리아 유래 약물전달체(pCES208/luxR-luxI-asparaginase가 형질전환된 코리네박테리아 글루타미쿰 재조합 균주)를 투여하여 실험을 수행하였다.
코리네박테리아 유래 약물전달체(pCES208/luxR-luxI-asparaginase가 형질전환된 코리네박테리아 글루타미쿰 재조합 균주)의 항암효과 확인을 위해 아스파라기나제 발현 벡터가 탑재된 재조합 균주를 이용하여, 상기 방법을 통해 제작된 암 동물 모델에 투여하고 암의 크기 변화를 관찰하였다. pCES208/luxR-luxI-asparagniase 재조합 균주를 배양하여 5 × 107개 세포를 100 ㎕의 PBS에 현탁하고 1 ㏄의 인슐린 실린지를 이용하여 각 실험군 별로 종양이 형성된 3 마리의 마우스 꼬리 정맥 부분에 투여하였으며, 대조군으로 (1) PBS 와 (2) pCES208 벡터가 형질전환된 재조합 균주를 동량 투여하였다. 이후 20일 동안 암의 부피변화를 측정하였다.
그 결과 아스파라기나제를 탑재한 재조합 균주에서 대조군에 비해 암의 부피가 감소하는 경향을 확인하였다. 따라서 코리네박테리아 유래 약물전달체(pCES208/luxR-luxI-asparaginase가 형질전환된 코리네박테리아 글루타미쿰 재조합 균주)로부터 발현된 항암단백질이 암세포를 치료할 수 있음을 확인하였다(도 12).

Claims (17)

  1. (1) 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.) 박테리아, (2) 코리네박테리움 속 박테리아 유래 미니셀(minicell) 또는 (3) 이의 모두를 포함하는 약물전달체 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 코리네박테리움 속 박테리아는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 카세이(Corynebacterium casei) 및 코리네박테리움 에피시엔스(Corynebacterium efficiens)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 코리네박테리움 속 박테리아인 것을 특징으로 하는 약물전달체 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 약물전달체는 항암용 약물전달체인 것을 특징으로 하는 약물전달체 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 암은 유방암, 자궁경부암, 난소암, 자궁내막암, 흑색종, 방광암, 폐암, 췌장암, 결장암, 전립선암, 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, B-세포 림프종, 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 골수성 백혈병, 갑상선암, 갑상선 여포암, 신장암, 비장암, 방광암, 두경부암, 위암, 간암, 골암, 뇌암, 담관암, 소장암, 자궁암 및 고환암으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 암인 것을 특징으로 하는 약물전달체 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 약물은 항암제인 것을 특징으로 하는 약물전달체 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 항암제는 화학적 제제, 단백질 및 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 항암제인 것을 특징으로 하는 약물전달체 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 화학적 제제는 독소루비신 (doxorubicin), 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 다우노루비신(daunorubicin), 에피루비신(epirubicin), 이다루비신(idarubicin), 발루비신(valubicin), 미토산트론(mitoxantrone), 커큐민(curcumin), 제피티닙(gefitinib), 에를로티닙(erlotinib), 이리노테칸(irinotecan), 토포테칸(topotecan), 빈블라스틴(vinblastine) 및 빈크리스틴(vincristine)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 화학적 제제인 것을 특징으로 하는 약물전달체 조성물.
  8. 제6항에 있어서, 상기 단백질은 항체, 수송단백질, 구조 단백질, 조절단백질, 호르몬, 호르몬 유사체, 사이토카인 유래 항암단백질, 세포용해단백질, 아미노산 분해효소, 항혈관생성인자(antiangiogenic factor), 세포접합분자(cell adhesion molecule), 효소 저해제, 리셉터, 리셉터의 단편 및 면역독소(immunotoxin)로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질인 것을 특징으로 하는 약물전달체 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 항체는 이뮤노글로블린(immunoglobulin), 항체 단편 및 항체 유사체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 항체인 특징으로 하는 약물전달체 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 항체 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, F(ab'), F(ab), Fv 및 scFv으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 항체 단편인 것을 특징으로 하는 약물전달체 조성물.
  11. 제9항에 있어서, 상기 항체 유사체는 아피바디(affibody), 레피바디(repebody), 아피린(affilin), DARPin, 테트라넥틴(tetranectin), 마이크로바디(microbody), 펩타이드 압타머(peptide aptamer) 및 아비머(avimer)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 항체 유사체인 것을 특징으로 하는 약물전달체 조성물.
  12. 제6항에 있어서, 상기 핵산은 siRNA, shRNA, miRNA, 안티센스 RNA, lincRNA, 리보자임(ribozyme) 및 PNA(peptide nucleic acids)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵산인 것을 특징으로 하는 약물전달체 조성물.
  13. 제1항에 있어서, 상기 약물전달체는 단백질 발현 컨스트럭트(construct)를 포함하는 것을 특징으로 하는 약물전달체 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 단백질은 (1) 항암단백질, (2) 항암단백질 및 항암세포 표면리셉터, 또는 (3) 항암단백질 및 항암세포 표면 항원인 것을 특징으로 하는 약물전달체 조성물.
  15. 제13항에 있어서, 상기 컨스트럭트는 단백질 링커를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 약물전달체 조성물.
  16. 제13항에 있어서, 상기 컨스트럭트는 램프 태그(ramp tag)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 약물전달체 조성물.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 약물전달체 및 항암 약물의 약제학적 유효량을 유효성분으로 포함하는 항암용 약제학적 조성물.
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