WO2016104580A1 - カチオン性脂質 - Google Patents

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WO2016104580A1
WO2016104580A1 PCT/JP2015/085969 JP2015085969W WO2016104580A1 WO 2016104580 A1 WO2016104580 A1 WO 2016104580A1 JP 2015085969 W JP2015085969 W JP 2015085969W WO 2016104580 A1 WO2016104580 A1 WO 2016104580A1
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裕太 鈴木
健治 兵頭
陽平 田中
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エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社
相互薬工株式会社
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    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.

Definitions

  • the present invention relates to a novel cationic lipid.
  • This application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2014-266548 filed in Japan on December 26, 2014, the contents of which are incorporated herein by reference.
  • Nucleic acids such as siRNA (small interfering RNA), miRNA (micro RNA), shRNA (short hairpin RNA, or small hairpin RNA) expression vectors, antisense oligonucleotides, and the like induce sequence-specific gene expression suppression in vivo. It is a nucleic acid and is known as a nucleic acid medicine.
  • siRNA is particularly attracting attention.
  • siRNA is a double-stranded RNA consisting of 19 to 23 base pairs, and induces sequence-specific gene expression suppression called RNA interference (RNAi).
  • RNAi RNA interference
  • siRNA is chemically stable, it has problems for therapeutic use in that it is easily degraded by RNase (ribonuclease) in plasma and it is difficult to permeate the cell membrane alone.
  • RNase ribonuclease
  • encapsulating siRNA in microparticles containing cationic lipids protects the encapsulated siRNA from degradation in plasma and allows permeation to a fat-soluble cell membrane.
  • encapsulating siRNA in microparticles containing cationic lipids protects the encapsulated siRNA from degradation in plasma and allows permeation to a fat-soluble cell membrane.
  • Patent Documents 2 to 4 describe cationic lipids that are used for delivery of nucleic acid drugs such as siRNA and have improved biodegradability.
  • fine particles containing cationic lipids have a problem of stability that they tend to aggregate during storage, and a method of suppressing aggregation by containing polyethylene glycol-modified lipid (PEG lipid) in the fine particles is known. ing. Furthermore, a method for improving aggregation efficiency and nucleic acid delivery efficiency by using PEG-DPG, which is a specific PEG lipid, as a constituent of microparticles or a preparation comprising the microparticles and a deionized solvent, It is described in Patent Document 5.
  • the present invention relates to the following [1] to [8].
  • [1] A compound selected from the group consisting of compounds represented by the following formulas (1) to (11) or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the compound represented by the above formula (8) is a cationic lipid.
  • composition comprising at least one lipid and (III) a nucleic acid.
  • the cationic lipid of the present invention nucleic acid can be efficiently released into the cytoplasm. Therefore, the cationic lipid of the present invention has applicability as a lipid for nucleic acid delivery to the cytoplasm.
  • the present invention is a compound represented by any one of the above formulas (1) to (11) or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and can be used as a cationic lipid.
  • the cationic lipid may be a hydrate of the salt or a solvate of the salt.
  • a cationic lipid is an amphiphilic molecule having a lipophilic region containing one or more hydrocarbon groups and a hydrophilic region containing a polar group that is protonated at physiological pH. That is, the cationic lipid of the present invention can be protonated to form a cation.
  • the anion that can be contained in the cationic lipid of the present embodiment in combination with the cation is not particularly limited as long as it is pharmaceutically acceptable.
  • R 3 represents an alkylene group having 4 to 12 carbon atoms
  • R 4 represents an alkyl group having 7 to 12 carbon atoms
  • R 8 represents a structure represented by the following formula (13).
  • R 9 represents a structure represented by the following formula (14).
  • R 1 is an alkyl group having 4 to 10 carbon atoms which may have one or more cyclopropane or cyclobutane formed by condensation of a part of the carbon chain, or 4 to 10 carbon atoms.
  • R 2 represents a hydrogen atom or an alkyl group having 2 to 8 carbon atoms, and m represents an integer of 0 to 5.
  • R 5 , R 6 and R 7 each independently represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms, and n represents an integer of 0 to 5.
  • R 5 and R 6 may be combined to form a monocyclic heterocycle, and R 6 and R 7 may be combined to form a monocyclic heterocycle.
  • the cationic lipid (1-7) can be synthesized as follows.
  • a dialkyl dicarboxylate represented by the formula (1-1) is hydrolyzed to obtain a monoester represented by the formula (1-2).
  • Formula (1-1) shows an example in which the alkyl group of the dialkyl dicarboxylate is a methyl group, but the alkyl group of the dialkyl dicarboxylate is not limited to a methyl group, and an appropriate alkyl group should be selected. Can do.
  • the compound represented by the formula (1-2) is acid chlorided to obtain the compound represented by the formula (1-3).
  • the compound represented by the formula (1-4) is obtained by reacting the compound represented by the formula (1-3) with a Grignard reagent.
  • a compound represented by formula (1-5) is obtained by transesterification, and a compound represented by formula (1-6) is obtained by reduction.
  • the cationic lipid (1-7) can be synthesized by condensing the compound represented by the formula (1-6) with a carboxylic acid.
  • the present invention provides a lipid complex containing (I) the above-described cationic lipid and (II) at least one lipid selected from the group consisting of a neutral lipid, a polyethylene glycol-modified lipid, and a sterol.
  • the lipid complex includes (I) the above-described cationic lipid, and (II) at least one lipid selected from the group consisting of neutral lipid, polyethylene glycol-modified lipid, and sterol, III) a nucleic acid.
  • the lipid complex of this embodiment enables nucleic acid to be efficiently released into the cytoplasm.
  • the lipid complex of the present embodiment contains, for example, 10 to 100 mol%, such as 20 to 90 mol%, such as 40 to 70 mol%, of the above-described cationic lipid based on the total lipid contained in the lipid complex.
  • Cationic lipids can be used singly or in combination of two or more.
  • nucleic acid examples include siRNA, miRNA, shRNA expression vector, antisense oligonucleotide, ribozyme and the like.
  • the nucleic acid may be siRNA or miRNA.
  • the lipid complex of this embodiment contains, for example, 0.01 to 50% by weight of nucleic acid, for example, 0.1 to 30% by weight, for example, 1 to 10% by weight.
  • the lipid complex of the present embodiment comprises, as a lipid component, (I) the above-described cationic lipid, and (II) at least one lipid selected from the group consisting of a neutral lipid, a polyethylene glycol-modified lipid, and a sterol. contains.
  • Neutral lipids include dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE), palmitoyl oleoylphosphatidylcholine (POPC), egg phosphatidylcholine (EPC), dimyristoylphosphatidylcholine (DMPC), dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC), distearoylphosphatidylcholine (DSPC) , Diarachidoylphosphatidylcholine (DAPC), dibehenoylphosphatidylcholine (DBPC), dilignocelloylphosphatidylcholine (DLPC), dioleoylphosphatidylcholine (DOPC), sphingomyelin, ceramide, dioleoylphosphatidylglycerol (DOPG), dipalmitoyl Phosphatidylglycerol (DPPG), phosphatidylethanolamine POPE), dioleoyl - phosphatid
  • the lipid complex of the present embodiment may contain neutral lipid, for example, 0 to 50 mol%, for example 0 to 40 mol%, for example 0 to 30 mol%, based on the total lipid contained in the lipid complex. Good.
  • polyethylene glycol-modified lipid examples include PEG2000-DMG (PEG2000-dimyristylglycerol, PEG2000-DPG (PEG2000-dipalmitoylglycerol), PEG2000-DSG (PEG2000-distearoylglycerol), PEG5000-DMG (PEG5000-dimyristylglycerol, PEG5000).
  • -DPG PEG5000-dipalmitoylglycerol
  • PEG5000-DSG PEG5000-distearoylglycerol
  • PEG-cDMA N-[(methoxypoly (ethyleneglycol) 2000) carbamyl] -1,2-dimyristyloxylpropyl-3- Amine
  • PEG-C-DOMG R-3-[( ⁇ -methoxy-poly (ethylene glycol) 2 00) carbamoyl)]-1,2-dimyristyloxylpropyl-3-amine
  • PEG polyethylene glycol
  • PEG -diacylglycerol
  • DAA PEG-dialkyloxypropyl
  • PEG-phospholipid PEG-ceramide
  • PEG-dialkyloxypropyl examples include PEG-dilauryloxypropyl, PEG-dimyristyloxypropyl, PEG-dipalmityloxypropyl, PEG-distearyloxypropyl, and the like.
  • Polyethylene glycol-modified lipids can be used alone or in combination of two or more.
  • the lipid complex of the present embodiment contains, for example, 0 to 30 mol%, such as 0 to 20 mol%, such as 0 to 10 mol%, of polyethylene glycol-modified lipid, based on the total lipid contained in the lipid complex. Also good.
  • sterols examples include cholesterol, dihydrocholesterol, lanosterol, ⁇ -sitosterol, campesterol, stigmasterol, brassicasterol, ergocasterol, fucosterol, and 3 ⁇ - [N- (N ′, N′-dimethylaminoethyl) carbamoyl].
  • examples include cholesterol (DC-Chol).
  • a sterol can be used individually by 1 type or in mixture of 2 or more types.
  • the lipid complex of this embodiment may contain, for example, 0 to 90 mol%, such as 10 to 80 mol%, such as 20 to 50 mol%, of sterol based on the total lipid contained in the lipid complex.
  • the combination of lipid components in the lipid complex of the present embodiment is not particularly limited.
  • the combination of the above-described cationic lipid, neutral lipid and sterol, the above-described cationic lipid, neutral lipid, polyethylene glycol-modified lipid, and Examples include sterol combinations.
  • the present invention provides (I) a cationic lipid as described above, (II) at least one lipid selected from the group consisting of a neutral lipid, a polyethylene glycol-modified lipid, and a sterol, and (III) a nucleic acid.
  • the composition containing this is provided.
  • the composition of this embodiment makes it possible to efficiently release nucleic acids into the cytoplasm.
  • the composition of this embodiment may contain the lipid complex described above, a pharmaceutically acceptable medium, and optionally other additives. Pharmaceutically acceptable media and other additives will be described later.
  • composition of the present embodiment contains, for example, 10 to 100 mol%, such as 20 to 90 mol%, such as 40 to 70 mol%, of the above-described cationic lipid based on the total lipid contained in the composition.
  • Cationic lipids can be used singly or in combination of two or more.
  • Nucleic acids include those similar to those described above.
  • the composition of this embodiment contains, for example, 0.01 to 50% by weight, for example, 0.1 to 30% by weight, for example 1 to 10% by weight, of nucleic acid.
  • composition of this embodiment contains, as a lipid component, (I) the cationic lipid described above, and (II) at least one lipid selected from the group consisting of neutral lipids, polyethylene glycol-modified lipids, and sterols. To do.
  • composition of the present embodiment may contain, for example, 0 to 50 mol%, such as 0 to 40 mol%, such as 0 to 30 mol%, based on the total lipid contained in the composition.
  • the composition of the present embodiment may contain, for example, 0 to 30 mol%, such as 0 to 20 mol%, such as 0 to 10 mol%, of polyethylene glycol-modified lipid, based on the total lipid contained in the composition. .
  • composition of the present embodiment may contain, for example, 0 to 90 mol%, such as 10 to 80 mol%, such as 20 to 50 mol%, based on the total lipid contained in the composition.
  • the combination of lipid components in the composition of the present embodiment is not particularly limited.
  • composition of the present embodiment includes, as other additives, sugars such as sucrose, glucose, sorbitol, and lactose; amino acids such as glutamine, glutamic acid, sodium glutamate, and histidine; citric acid, phosphorus Acid salts such as acid, acetic acid, lactic acid, carbonic acid and tartaric acid may be contained.
  • sugars such as sucrose, glucose, sorbitol, and lactose
  • amino acids such as glutamine, glutamic acid, sodium glutamate, and histidine
  • citric acid citric acid
  • phosphorus Acid salts such as acid, acetic acid, lactic acid, carbonic acid and tartaric acid may be contained.
  • composition of the present embodiment may be formulated as a pharmaceutical composition.
  • dosage form of the pharmaceutical composition include injections.
  • the composition of the present embodiment may be in a powder state from which the solvent has been removed by freeze drying or the like, or in a liquid state.
  • the composition When the composition is in a powder state, it can be suspended or dissolved in a pharmaceutically acceptable medium before use and used as an injection.
  • the composition When the composition is in a liquid state, it can be used as an injection as it is or suspended or dissolved in a pharmaceutically acceptable medium.
  • compositions of the present embodiment may further contain additives such as solubilizing agents such as ethanol, propylene glycol, polyethylene glycol and the like, stabilizers, antioxidants, preservatives and the like.
  • Administration of the composition to a patient can be performed, for example, by intraarterial injection, intravenous injection, subcutaneous injection, or the like.
  • the dose of the composition varies depending on the administration subject, target organ, symptom, and administration method.
  • the composition of the present embodiment forms a lipid complex in which a nucleic acid is encapsulated in fine particles composed of a lipid containing a cationic lipid.
  • the “average particle diameter” of the lipid complex can be calculated by any one of volume average, number average, and Z-average.
  • the average particle size (Z-average) of the lipid complex may be, for example, 10 to 1000 nm, such as 30 to 500 nm, such as 30 to 200 nm.
  • the composition of the present embodiment preferably has almost no surface charge in an environment of about pH 7.4, such as in blood, from the viewpoint of suppressing non-specific adsorption and immune reaction.
  • an environment of about pH 7.4 such as in blood
  • the present invention provides a polar organic solvent comprising (I) the above-described cationic lipid and (II) at least one lipid selected from the group consisting of a neutral lipid, a polyethylene glycol-modified lipid, and a sterol.
  • a composition comprising: a step (a) of obtaining a mixed solution by mixing an aqueous solution containing (III) an aqueous solution containing a nucleic acid; and a step (b) for reducing the content of a polar organic solvent in the mixed solution.
  • a manufacturing method is provided. According to the production method of the present embodiment, a composition capable of efficiently releasing nucleic acid into the cytoplasm can be produced.
  • a lipid complex in which nucleic acid is encapsulated in fine particles composed of lipid can be formed by electrostatic interaction between water-soluble nucleic acid and the above-mentioned cationic lipid and hydrophobic interaction between lipids.
  • a lipid complex can be formed by changing.
  • the polar organic solvent include alcohols such as ethanol.
  • step (a) a polar organic in which (I) the above-described cationic lipid and (II) at least one lipid selected from the group consisting of a neutral lipid, a polyethylene glycol-modified lipid, and a sterol are dissolved.
  • a solvent-containing aqueous solution and (III) an aqueous solution containing a nucleic acid are mixed to obtain a mixed solution.
  • the concentration of the polar organic solvent in the polar organic solvent-containing aqueous solution is not particularly limited as long as it satisfies the conditions for dissolving lipid molecules even after mixing with the nucleic acid aqueous solution.
  • the content of the polar organic solvent is reduced by adding water or the like to the above mixed solution.
  • a lipid complex can be formed.
  • lipid complex in which nucleic acids are efficiently encapsulated inside fine particles can be obtained.
  • the composition can be used as a pharmaceutical composition.
  • the chemical shift of the proton nuclear magnetic resonance spectrum is recorded in ⁇ units (ppm) relative to tetramethylsilane.
  • the abbreviations of the patterns are as follows. s: singlet, d: doublet, t: triplet, q: quartet, dd: double doublet, ddd: double doublet, dt: double triplet, tt: triple triplet, m: multiplet.
  • the reaction was confirmed by TLC and quenched with water with the disappearance of the starting material as the end point.
  • the precipitated solid was filtered off, and the filtrate was extracted with ethyl acetate, washed with water and brine, and then dried over anhydrous magnesium sulfate.
  • the desiccant was removed by filtration, and the filtrate was concentrated under reduced pressure.
  • the product was purified by silica gel column chromatography to obtain the fourth step product (1.2 g, 2.7 mmol, 99%).
  • Example 2 ((Z) -1- (Non-2-en-1-yloxy) -1-oxononadecan-10-yl-1-methylpiperidine-4-carboxylate (hereinafter sometimes referred to as “YS-101”) Synthesis)
  • YS-101 represented by the following formula (16) was synthesized in the same manner as in Example 1 except that the fifth step was not performed.
  • Example 3 Synthesis of 1-oxo-1- (undecan-5-yloxy) nonadecan-10-yl-1-methylpiperidine-4-carboxylate (hereinafter sometimes referred to as “YS-103”))
  • YS-103 2-butyloctane-1-ol is reacted instead of 2-nonenol, and the fifth step is not performed, and is represented by the following formula (2) in the same manner as in Example 1.
  • YS-103 was synthesized.
  • Example 5 Synthesis of 1-oxo-1- (undecan-5-yloxy) pentadecan-6-yl-1-methylpiperidine 4-carboxylate (hereinafter sometimes referred to as “YS-111”)) Similar to Example 4 except that dimethyl adipate was reacted in place of dimethyl sebacate in the first step and undecan-5-ol was reacted in place of 2-butyloctane-1-ol in the fourth step. Thus, YS-111 represented by the following formula (17) was synthesized.
  • Example 6 Synthesis of 1-oxo-1- (undecan-5-yloxy) heptadecan-8-yl-1-methylpiperidine 4-carboxylate (hereinafter sometimes referred to as “YS-112”)) Same as Example 4 except that dimethyl suberate was reacted in place of dimethyl sebacate in the first step and undecan-5-ol was reacted in place of 2-butyloctane-1-ol in the fourth step. Thus, YS-112 represented by the following formula (4) was synthesized.
  • Example 7 Synthesis of 21-oxo-21- (undecan-5-yloxy) henicosane-10-yl-1-methylpiperidine 4-carboxylate (hereinafter sometimes referred to as “YS-113”))
  • Example 4 except that dimethyl dodecanedioate was reacted instead of dimethyl sebacate in the first step, and undecan-5-ol was reacted instead of 2-butyloctane-1-ol in the fourth step.
  • YS-113 represented by the following formula (5) was synthesized.
  • Example 8 Synthesis of 23-oxo-23- (undecan-5-yloxy) tricosan-10-yl-1-methylpiperidine 4-carboxylate (hereinafter sometimes referred to as “YS-114”))
  • Example 4 except that dimethyltetradecandioate was reacted in place of dimethyl sebacate in the first step, and undecan-5-ol was reacted in place of 2-butyloctane-1-ol in the fourth step.
  • YS-114 represented by the following formula (18) was synthesized.
  • Example 9 Synthesis of 1-((2-butyloctyl) oxy) -1-oxoheptadecan-8-yl-1-methylpiperidine-4-carboxylate (hereinafter sometimes referred to as “YS-115”)) YS-115 represented by the following formula (19) was synthesized in the same manner as in Example 4 except that dimethyl suberate was reacted instead of dimethyl sebacate in the first step.
  • Example 10 Synthesis of 21-((2-butyloctyl) oxy) -21-oxohenicosan-10-yl-1-methylpiperidine-4-carboxylate (hereinafter sometimes referred to as “YS-116”)) YS-116 represented by the following formula (20) was synthesized in the same manner as in Example 4 except that dimethyl suberate was reacted instead of dimethyl sebacate in the first step.
  • Example 11 Synthesis of 1- (octane-3-yloxy) -1-oxoheptadecan-8-yl-1-methylpiperidine-4-carboxylate (hereinafter sometimes referred to as “YS-117”)) Similar to Example 4 except that dimethyl suberate was reacted in place of dimethyl sebacate in the first step and octane-3-ol was reacted in place of 2-butyloctane-1-ol in the fourth step. Thus, YS-117 represented by the following formula (21) was synthesized.
  • Example 12 Synthesis of 1-((S) octane-3-yloxy) -1-oxoheptadecan-8-yl-1-methylpiperidine-4-carboxylate (hereinafter sometimes referred to as “YS-117S”)) Performed except that dimethyl suberate was reacted in place of dimethyl sebacate in the first step, and (S) -octane-3-ol was reacted in place of 2-butyloctane-1-ol in the fourth step.
  • YS-117S represented by the following formula (22) was synthesized.
  • Example 13 Synthesis of 21- (octane-3-yloxy) -21-oxohenicosan-10-yl-1-methylpiperidine-4-carboxylate (hereinafter sometimes referred to as “YS-118”))
  • Example 4 except that dimethyl dodecanedioate was reacted instead of dimethyl sebacate in the first step and octane-3-ol was reacted instead of 2-butyloctane-1-ol in the fourth step.
  • YS-118 represented by the following formula (3) was synthesized.
  • Example 14 (21-((S) -octane-3-yloxy) -21-oxohenicosan-10-yl-1-methylpiperidine-4-carboxylate (hereinafter sometimes referred to as “YS-118S”). Synthesis) In the first step, dimethyl dodecanedioate was reacted in place of dimethyl sebacate, and (S) -octane-3-ol was reacted in place of 2-butyloctane-1-ol in the fourth step. In the same manner as in Example 4, YS-118S represented by the following formula (23) was synthesized.
  • Example 15 Synthesis of 1-((2-butyloctyl) oxy) -1-oxoicosane-10-yl-1-methylpiperidine-4-carboxylate (hereinafter sometimes referred to as “YS-120”)) YS-120 represented by the following formula (6) was synthesized in the same manner as in Example 4 except that decanylmagnesium bromide was reacted instead of nonylmagnesium bromide in the third step.
  • the sixth step product (37.2 g, 68.4 mmol), palladium / carbon (4.9 mL) was suspended in ethyl acetate (136.8 mL) and stirred overnight under a hydrogen atmosphere. The reaction solution was filtered off and concentrated after removing paradim / carbon. The product was purified by silica gel chromatography to obtain a seventh step product (26.8 g, 59.1 mmol).
  • Example 17 (1-((2Z, 5Z) -deca-2,5-dien-1-yloxy) -1-oxoicosane-10-yl-1-methylpiperidine-4-carboxylate (hereinafter referred to as “YS-121”)
  • YS-121 (1-((2Z, 5Z) -deca-2,5-dien-1-yloxy) -1-oxoicosane-10-yl-1-methylpiperidine-4-carboxylate
  • Example 18 ((Z) -1-((2-Butylnon-3-en-1-yl) oxy) -1-oxoicosane-10-yl-1-methylpiperidine-4-carboxylate (hereinafter referred to as “YS-122”) May be a combination of))
  • YS-122 ((Z) -1-((2-Butylnon-3-en-1-yl) oxy) -1-oxoicosane-10-yl-1-methylpiperidine-4-carboxylate (hereinafter referred to as “YS-122”) May be a combination of))
  • Example 19 ((Z) -1-oxo-1-((5-propylnon-2-en-1-yl) oxy) icosane-10-yl-1-methylpiperidine-4-carboxylate (hereinafter referred to as “YS-123 )))))
  • YS-123 icosane-10-yl-1-methylpiperidine-4-carboxylate
  • the eighth step in the same manner as in Example 16 except that (Z) -5-propylnon-2-en-1-ol was reacted instead of 2-butyloctane-1-ol, the following formula (26 ) was synthesized.
  • Example 20 Synthesis of 1-oxo-1-((3-pentyloctyl) oxy) icosane-10-yl-1-methylpiperidine-4-carboxylate (hereinafter sometimes referred to as “YS-124”))
  • YS-124 represented by the following formula (27) was obtained in the same manner as in Example 16 except that 3-pentyloctane-1-ol was reacted instead of 2-butyloctane-1-ol. was synthesized.
  • Example 21 Synthesis of 1-((2,4-dipropylheptyl) oxy) -1-oxoicosane-10-yl-1-methylpiperidine-4-carboxylate (hereinafter sometimes referred to as “YS-125”))
  • YS-125 Synthesis of 1-((2,4-dipropylheptyl) oxy) -1-oxoicosane-10-yl-1-methylpiperidine-4-carboxylate (hereinafter sometimes referred to as “YS-125”))
  • YS-125 was synthesized.
  • Example 22 Synthesis of 1-((3,4-dipropylheptyl) oxy) -1-oxoicosane-10-yl-1-methylpiperidine-4-carboxylate (hereinafter sometimes referred to as “YS-126”))
  • YS-126 Synthesis of 1-((3,4-dipropylheptyl) oxy) -1-oxoicosane-10-yl-1-methylpiperidine-4-carboxylate (hereinafter sometimes referred to as “YS-126”))
  • YS-126 was synthesized.
  • Example 23 (1- (4- (hexyldisulfanyl) -3-((hexyldisulfanyl) methyl) butoxy) -1-oxoicosane-10-yl-1-methylpiperidine-4-carboxylate (hereinafter “YS-127”)
  • YS-127 (1- (4- (hexyldisulfanyl) -3-((hexyldisulfanyl) methyl) butoxy) -1-oxoicosane-10-yl-1-methylpiperidine-4-carboxylate
  • Example 24 (1-((6- (butyldisulfanyl) -3- (3- (butyldisulfanyl) propyl) hexyl) oxy) -1-oxoicosane-10-yl-1-methylpiperidine-4-carboxylate Sometimes referred to as “YS-128”))
  • Example 16 except that in the eighth step, 6- (butyldisulfanyl) -3- (3- (butyldisulfanyl) propyl) hexane-1-ol was reacted instead of 2-butyloctane-1-ol.
  • YS-128 represented by the following formula (31) was synthesized.
  • Example 25 Synthesis of 1-((2-butyloctyl) oxy) -1-oxoicosane-10-yl-1-methylpyrrolidine-3-carboxylate (hereinafter sometimes referred to as “YS-129”))
  • YS-129 Synthesis of 1-((2-butyloctyl) oxy) -1-oxoicosane-10-yl-1-methylpyrrolidine-3-carboxylate (hereinafter sometimes referred to as “YS-129”))
  • YS-129 was synthesized.
  • Example 26 (Synthesis of 1-((2-butyloctyl) oxy) -1-oxoicosane-10-yl-1-methylazetidine-3-carboxylate (hereinafter sometimes referred to as “YS-131”))
  • YS-131 is represented by the following formula (33) in the same manner as in Example 16 except that 1-methylazatidine-3-carboxylic acid was reacted instead of 1-methylpiperidine-4-carboxylic acid.
  • YS-131 was synthesized.
  • Example 27 (Synthesis of 1-((2-butyloctyl) oxy) -1-oxoicosane-10-yl-1-ethylpiperidine-4-carboxylate (hereinafter sometimes referred to as “YS-132”))
  • the sixth step is represented by the following formula (34) in the same manner as in Example 16 except that 1-ethylpiperidine-4-carboxylic acid is reacted instead of 1-methylpiperidine-4-carboxylic acid.
  • YS-132 was synthesized.
  • Example 28 Synthesis of 2-butyloctyl-10-((4- (dimethylamino) butanoyl) oxy) icosanoate (hereinafter sometimes referred to as “YS-133”))
  • YS represented by the following formula (35) was obtained in the same manner as in Example 16 except that 4- (dimethylamino) butanoic acid was reacted instead of 1-methylpiperidine-4-carboxylic acid.
  • -133 was synthesized.
  • composition (1) [Example 29] (YS-102) A composition was prepared using the cationic lipid of Example 1 (YS-102).
  • cationic lipid YS-102
  • DSPC Nippon Seika Co., Ltd.
  • Cholesterol Nippon Seika Co., Ltd.
  • MPEG2000-DMG Nippon Oil Co., Ltd.
  • Example 29 By mixing siRNA dilution and lipid solution at a flow rate of 2.4 mL / min and 1.29 mL / min, respectively, and further mixing 25 mM sodium acetate (pH 4.0) at a flow rate of 9.25 mL / min, A lipid complex aqueous solution was obtained.
  • the obtained lipid complex aqueous solution is subjected to dialysis using a dialysis membrane (trade name “Float-A-Lyser G2,” SPECTRUM, 50K MWCO), and the external solution is phosphate buffer (PBS, pH 7.5). Replaced with After dialysis, concentration and filter sterilization were performed to obtain the composition of Example 29.
  • a dialysis membrane trade name “Float-A-Lyser G2,” SPECTRUM, 50K MWCO
  • PBS phosphate buffer
  • Example 30 A composition of Example 30 was obtained in the same manner as in Example 29 except that the cationic lipid (YS-101) of Example 2 was used instead of YS-102 as the cationic lipid.
  • Example 31 (YS-103) A composition of Example 31 was obtained in the same manner as in Example 29 except that the cationic lipid (YS-103) of Example 3 was used instead of YS-102 as the cationic lipid.
  • Reference Example 1 As a cationic lipid, 1- (2-octylcyclopropyl) heptadecan-8-yl-1-methylpiperidine-4-carboxylate (hereinafter referred to as “YS-”) represented by the following formula (36) instead of YS-102:
  • YS- 1- (2-octylcyclopropyl) heptadecan-8-yl-1-methylpiperidine-4-carboxylate
  • composition (1) ⁇ Analysis of composition (1)>
  • the encapsulation rate of siRNA in the lipid complex was measured.
  • the composition was diluted with RNase Free Water, and the siRNA concentration (A) measured using Quant-iT RiboGreen RNA Reagent (Invitrogen) was defined as siRNA present in the lipid complex external solution.
  • the nucleic acid encapsulation rate was calculated by the following formula (F1).
  • Encapsulation rate (%) 100 ⁇ (A / B) ⁇ 100 (F1)
  • the average particle size of the lipid complex was measured with a particle size measuring device (trade name “Zetasizer Nano ZS”, manufactured by Malvern).
  • Table 1 shows the siRNA encapsulation rate and the average particle size (Z-average) of the lipid complex.
  • composition (2) A composition was prepared using the cationic lipid of Example 5 (YS-111). As the nucleic acid, the same Factor VII siRNA as that used in the composition of Example 29 was used.
  • RNA diluted solution was prepared by cationic lipid (YS-111), DSPC (Nippon Seika Co., Ltd.), Cholesterol (Nippon Seika Co., Ltd.), MPEG2000-DMG (Nippon Oil Co., Ltd.) can be added to 60 / 8.5 / 30 / 1.5.
  • a lipid solution was prepared by dissolving in ethanol so that the total lipid concentration was 10 mM at a molar ratio.
  • Example 32 By mixing the siRNA dilution and the lipid solution at a flow rate of 2.4 mL / min and 1.29 mL / min, respectively, and further mixing 25 mM sodium acetate (pH 4.0) at a flow rate of 5.0 mL / min, A lipid complex aqueous solution was obtained.
  • the obtained lipid complex aqueous solution is subjected to dialysis using a dialysis membrane (trade name “Float-A-Lyser G2,” SPECTRUM, 50K MWCO), and the external solution is phosphate buffer (PBS, pH 7.5). Replaced with After dialysis, concentration and filter sterilization were performed to obtain the composition of Example 32.
  • a dialysis membrane trade name “Float-A-Lyser G2,” SPECTRUM, 50K MWCO
  • PBS phosphate buffer
  • Example 33 (YS-112) A composition of Example 33 was obtained in the same manner as in Example 32 except that the cationic lipid (YS-112) of Example 6 was used instead of YS-111 as the cationic lipid.
  • Example 34 (YS-113) A composition of Example 34 was obtained in the same manner as in Example 32 except that the cationic lipid (YS-113) of Example 7 was used instead of YS-111 as the cationic lipid.
  • Example 35 (YS-114) A composition of Example 35 was obtained in the same manner as in Example 32 except that the cationic lipid (YS-114) of Example 8 was used instead of YS-111 as the cationic lipid.
  • Example 36 (YS-115) A composition of Example 36 was obtained in the same manner as in Example 32 except that the cationic lipid (YS-115) of Example 9 was used instead of YS-111 as the cationic lipid.
  • Example 37 (YS-116) A composition of Example 36 was obtained in the same manner as in Example 32 except that the cationic lipid (YS-116) of Example 10 was used instead of YS-111 as the cationic lipid.
  • composition (3) was prepared using the cationic lipid of Example 11 (YS-117).
  • the same Factor VII siRNA as that used in the composition of Example 29 was used.
  • cationic lipid YS-111
  • DSPC Nippon Seika Co., Ltd.
  • Cholesterol Nippon Seika Co., Ltd.
  • MPEG2000-DMG Nippon Oil Co., Ltd.
  • lipid complex aqueous solution was obtained.
  • the obtained lipid complex aqueous solution is subjected to dialysis using a dialysis membrane (trade name “Float-A-Lyser G2,” SPECTRUM, 50K MWCO), and the external solution is phosphate buffer (PBS, pH 7.5). Replaced with After dialysis, concentration and filter sterilization were performed to obtain the composition of Example 38.
  • Example 39 (YS-117S) A composition of Example 39 was obtained in the same manner as in Example 38 except that the cationic lipid (YS-117S) of Example 12 was used instead of YS-117 as the cationic lipid.
  • Example 40 (YS-118) A composition of Example 40 was obtained in the same manner as Example 38, except that the cationic lipid (YS-118) of Example 13 was used instead of YS-117 as the cationic lipid.
  • Example 41 (YS-118S) A composition of Example 41 was obtained in the same manner as Example 38 except that the cationic lipid (YS-118S) of Example 14 was used instead of YS-117 as the cationic lipid.
  • Example 42 (YS-119) A composition of Example 42 was obtained in the same manner as Example 38 except that the cationic lipid (YS-119) of Example 4 was used instead of YS-117 as the cationic lipid.
  • composition (3) ⁇ Analysis of composition (3)> In the same manner as the composition of Example 29, the encapsulation rate of siRNA in the lipid complex and the average particle size of the lipid complex were measured for the compositions of Examples 38 to 42. Table 3 shows the siRNA encapsulation rate and the average particle size (Z-average) of the lipid complexes.
  • composition (4) was prepared using the cationic lipid of Example 4 (YS-119).
  • the same Factor VII siRNA as that used in the composition of Example 29 was used.
  • cationic lipid (YS-119), DSPC (Nippon Seika Co., Ltd.), Cholesterol (Nippon Seika Co., Ltd.), MPEG2000-DMG (Nippon Oil Co., Ltd.) can be added to 60 / 8.5 / 30 / 1.5. (Molar ratio) was dissolved in ethanol so that the total lipid concentration was 6 mM to obtain a lipid solution.
  • Example 43 By mixing the siRNA diluted solution and the lipid solution at flow rates of 1.80 mL / min and 0.97 mL / min, respectively, and further mixing 25 mM sodium acetate (pH 4.0) at a flow rate of 6.94 mL / min, A lipid complex aqueous solution was obtained.
  • the obtained lipid complex aqueous solution is subjected to dialysis using a dialysis membrane (trade name “Float-A-Lyser G2,” SPECTRUM, 50K MWCO), and the external solution is phosphate buffer (PBS, pH 7.5). Replaced with After dialysis, concentration and filter sterilization were performed to obtain the composition of Example 43.
  • a dialysis membrane trade name “Float-A-Lyser G2,” SPECTRUM, 50K MWCO
  • PBS phosphate buffer
  • Comparative Example 2 (ALN-319) A composition of Comparative Example 2 was obtained in the same manner as in Example 43 except that ALN-319 was used instead of YS-119 as the cationic lipid.
  • composition (5) A composition was prepared using the cationic lipid of Example 4 (YS-119). As the nucleic acid, the same Factor VII siRNA as that used in the composition of Example 29 was used.
  • RNA diluted solution 216 ⁇ g / mL with 25 mM sodium acetate (pH 4.0) to prepare a siRNA diluted solution. Further, cationic lipid (YS-119), Cholesterol (Nippon Seika Co., Ltd.) and MPEG2000-DPG (Nippon Oil Co., Ltd.) were added at a ratio of 60 / 38.5 / 1.5 (molar ratio) to a total lipid concentration of 6 mM. Then, it was dissolved in ethanol to obtain a lipid solution.
  • cationic lipid YS-119
  • Cholesterol Cholesterol
  • MPEG2000-DPG Natural Oil Co., Ltd.
  • Example 44 By mixing the siRNA dilution and the lipid solution at flow rates of 3.36 mL / min and 1.81 mL / min, respectively, and further mixing 25 mM sodium acetate (pH 4.0) at a flow rate of 12.95 mL / min, A lipid complex aqueous solution was obtained.
  • the obtained lipid complex aqueous solution is subjected to dialysis using a dialysis membrane (trade name “Float-A-Lyser G2,” SPECTRUM, 50K MWCO), and the external solution is phosphate buffer (PBS, pH 7.5). Replaced with After dialysis, concentration and filter sterilization were performed to obtain the composition of Example 44.
  • a dialysis membrane trade name “Float-A-Lyser G2,” SPECTRUM, 50K MWCO
  • PBS phosphate buffer
  • Example 45 (YS-120) A composition of Example 45 was obtained in the same manner as in Example 44 except that the cationic lipid (YS-120) of Example 15 was used instead of YS-119 as the cationic lipid.
  • composition (6) A composition was prepared using the cationic lipid of Example 16 (YS-120). As the nucleic acid, the same Factor VII siRNA as that used in the composition of Example 29 was used.
  • RNA diluted solution was diluted in 450 ⁇ g / mL with 25 mM sodium acetate (pH 4.0) to prepare a siRNA diluted solution.
  • cationic lipid YS-120
  • DSPC Nippon Seika Co., Ltd.
  • Cholesterol Nippon Seika Co., Ltd.
  • MPEG2000-DMG Nippon Oil Co., Ltd.
  • a lipid solution was prepared by dissolving in ethanol so that the total lipid concentration was 40 mM at a molar ratio.
  • the ratio of lipid to siRNA was 0.06, and the siRNA dilution and lipid solution were mixed at a flow rate of 4.0 mL / min and 1.3 mL / min, respectively, to obtain a lipid complex aqueous solution.
  • the obtained lipid complex aqueous solution is subjected to dialysis using a dialysis membrane (trade name “Float-A-Lyzer G2,” SPECTRUM, 50K MWCO), and the external solution is phosphate buffer (PBS, pH 7.4).
  • concentration and filter sterilization were performed to obtain the composition of Example 46.
  • Example 47 (YS-121) A composition of Example 47 was obtained in the same manner as in Example 46 except that the cationic lipid (YS-121) of Example 17 was used instead of YS-120 as the cationic lipid.
  • Example 48 (YS-122) A composition of Example 48 was obtained in the same manner as in Example 46 except that the cationic lipid (YS-122) of Example 18 was used instead of YS-120 as the cationic lipid.
  • Example 49 (YS-123) A composition of Example 49 was obtained in the same manner as in Example 46 except that the cationic lipid (YS-123) of Example 19 was used instead of YS-120 as the cationic lipid.
  • Example 50 A composition of Example 50 was obtained in the same manner as in Example 46 except that the cationic lipid (YS-124) of Example 20 was used instead of YS-120 as the cationic lipid.
  • Example 51 (YS-125) A composition of Example 51 was obtained in the same manner as in Example 46 except that the cationic lipid (YS-125) of Example 21 was used instead of YS-120 as the cationic lipid.
  • Example 52 (YS-126) A composition of Example 52 was obtained in the same manner as in Example 46 except that the cationic lipid (YS-126) of Example 22 was used instead of YS-120 as the cationic lipid.
  • compositions of Examples 46 to 52 were stored in sealed vials at 4 ° C., and the particle sizes (Z-average and polydispersity index) before storage, 3 months after storage, and 6 months were measured as Example 29. The measurement was performed in the same manner as the composition of
  • Table 7 shows the change over time in the average particle diameter of the compositions of Examples 46 to 52, the sixth month of storage, and the change in particle diameter before storage (d).
  • Compositions containing cationic lipids other than YS-121 were shown to inhibit the increase in particle size of the lipid complex during storage.
  • Example 54 A composition of Example 54 was obtained in the same manner as in Example 53 except that the cationic lipid (YS-127) of Example 23 was used instead of YS-120 as the cationic lipid.
  • Comparative Example 3 (ALN-319) A composition of Comparative Example 3 was obtained in the same manner as in Example 53 except that ALN-319 was used instead of YS-120 as the cationic lipid.
  • composition (9) ⁇ Analysis of composition (9)>
  • the lipid complex was dialyzed against PBS, Measure the particle size (Z-average and polydispersity index) at 2 ° C and 6th month after storage at 4 ° C in a sealed vial with a particle size measuring device (trade name “Zetasizer Nano ZS”, manufactured by Malvern) did.
  • Table 9 shows the change over time in the average particle size of the compositions of Examples 53 and 54 and Comparative Example 3, and the particle size change (d) immediately after mixing at the sixth month of storage. Compared with the composition of Comparative Example 3, the composition containing YS-120 or YS-124 cationic lipid was shown to suppress the increase in the particle size of the lipid complex during the storage period.
  • Example 56 A composition of Example 56 was obtained in the same manner as in Example 55 except that the cationic lipid (YS-127) of Example 23 was used instead of YS-120 as the cationic lipid.
  • Example 57 A composition of Example 57 was obtained in the same manner as in Example 55 except that the cationic lipid (YS-128) of Example 24 was used instead of YS-120 as the cationic lipid.
  • Example 58 (YS-129) The composition of Example 58 was obtained in the same manner as in Example 55 except that the cationic lipid (YS-129) of Example 25 was used instead of YS-120 as the cationic lipid.
  • composition (10) ⁇ Analysis of composition (10)>
  • the encapsulation rate of siRNA in the lipid complex and the average particle diameter (Z-average) of the lipid complex were measured for the compositions of Examples 55 to 58.
  • Table 10 shows the siRNA encapsulation rate and the average particle size of the lipid complex.
  • Example 60 (YS-131) A composition of Example 60 was obtained in the same manner as in Example 59 except that the cationic lipid (YS-131) of Example 26 was used instead of YS-101 as the cationic lipid.
  • Example 61 (YS-132) A composition of Example 61 was obtained in the same manner as in Example 59 except that the cationic lipid (YS-132) of Example 27 was used instead of YS-101 as the cationic lipid.
  • Example 62 (YS-133) A composition of Example 62 was obtained in the same manner as in Example 59 except that the cationic lipid (YS-133) of Example 28 was used instead of YS-101 as the cationic lipid.
  • Example 63 (YS-120) A composition of Example 63 was obtained in the same manner as in Example 59 except that the cationic lipid (YS-120) of Example 16 was used instead of YS-101 as the cationic lipid.
  • Comparative Example 4 (ALN-319) A composition of Comparative Example 4 was obtained in the same manner as in Example 59 except that ALN-319 was used instead of YS-101 as the cationic lipid.
  • composition (11) ⁇ Analysis of composition (11)>
  • the siRNA encapsulation rate in the lipid complex and the average particle size (Z-average) of the lipid complex were determined. It was measured.
  • Table 11 shows the siRNA encapsulation rate and the average particle size of the lipid complex.
  • the Factor VII protein concentration in the PBS administration group was taken as 100%, and the Factor VII protein concentration in the composition administration group was calculated as a relative value.
  • the liver was homogenized, and lipids constituting the composition were extracted with methanol, and then the cationic lipid was quantified by LC-MS.
  • the amount of cationic lipid administered was 100%, and the amount of cationic lipid remaining in the liver was calculated as a relative value. The results are shown in Table 12.
  • Example 43 and Comparative Example 2 were diluted with PBS so that the concentration of Factor VII siRNA encapsulated in the lipid complex was 1 ⁇ g / mL or 5 ⁇ g / mL.
  • Each composition was administered to C57 / BL6 mice (5 weeks old, male) via the tail vein at a dose volume of 10 mL / kg, and blood collection and liver collection were performed under anesthesia 24 hours after administration. Plasma was separated from the blood by centrifugation, and Factor VII protein concentration in the plasma was quantified with a commercially available kit (trade name “BIOPHEN FVII”, HYPHEN BioMed). As a negative control, the group treated with PBS was treated in the same manner.
  • the Factor VII protein concentration in the PBS administration group was taken as 100%, and the Factor VII protein concentration in the composition administration group was calculated as a relative value.
  • the results are shown in Table 15 and FIG.
  • the composition of Example 43 was shown to have a higher Factor VII protein expression inhibitory effect than the composition of Comparative Example 2.
  • compositions of Examples 44 and 45 were diluted with PBS so that the concentration of Factor VII siRNA encapsulated in the lipid complex was 1 ⁇ g / mL or 5 ⁇ g / mL.
  • Each composition was administered to C57 / BL6 mice (5 weeks old, male) via the tail vein at a dose volume of 10 mL / kg, and blood collection and liver collection were performed under anesthesia 24 hours after administration. Plasma was separated from the blood by centrifugation, and Factor VII protein concentration in the plasma was quantified with a commercially available kit (trade name “BIOPHEN FVII”, HYPHEN BioMed). As a negative control, the group treated with PBS was treated in the same manner.
  • the Factor VII protein concentration in the PBS administration group was taken as 100%, and the Factor VII protein concentration in the composition administration group was calculated as a relative value.
  • the results are shown in Table 16 and FIG.
  • compositions of Examples 53 and 54 and Comparative Example 3 were diluted with PBS so that the concentration of Factor VII siRNA encapsulated in the lipid complex was 2 ⁇ g / mL or 10 ⁇ g / mL.
  • Each composition was administered to ICR mice (6 weeks old, female) via the tail vein at a dose volume of 10 mL / kg, and blood collection and liver collection were performed under anesthesia 24 hours after administration. Plasma was separated from the blood by centrifugation, and Factor VII protein concentration in the plasma was quantified with a commercially available kit (trade name “BIOPHEN FVII”, HYPHEN BioMed). As a negative control, the group treated with PBS was treated in the same manner.
  • the Factor VII protein concentration in the PBS administration group was taken as 100%, and the Factor VII protein concentration in the composition administration group was calculated as a relative value.
  • the results are shown in Table 18.
  • the compositions of Examples 53 and 54 showed a higher expression inhibitory effect on Factor VII protein than the composition of Comparative Example 3.
  • a cationic lipid capable of efficiently releasing nucleic acid into the cytoplasm can be provided.

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Abstract

　本発明は、細胞質への核酸送達に利用可能なカチオン性脂質を提供する。本発明のカチオン性脂質は、例えば、下記式（１）で表される化合物又はその薬剤学的に許容される塩である。

Description

カチオン性脂質
　本発明は、新規なカチオン性脂質に関する。本願は、２０１４年１２月２６日に、日本に出願された特願２０１４－２６６５４８号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ　ＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏ　ＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ　ｈａｉｒｐｉｎ　ＲＮＡ、または、ｓｍａｌｌ　ｈａｉｒｐｉｎ　ＲＮＡ）発現ベクター、アンチセンスオリゴヌクレオチド等の核酸は、生体内で配列特異的な遺伝子発現抑制を誘導する核酸であり、核酸医薬として知られている。
　これらの核酸医薬の中でも、特にｓｉＲＮＡが注目を集めている。ｓｉＲＮＡは、１９～２３塩基対からなる二本鎖ＲＮＡであり、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ、ＲＮＡｉ）と呼ばれる配列特異的な遺伝子発現抑制を誘導する。
　ｓｉＲＮＡは化学的には安定であるが、血しょう中のＲＮａｓｅ（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ）により分解されやすい点、及び、単独では細胞膜を透過しにくいという点等において、治療用用途としての問題点を有している（例えば、特許文献１参照。）。
　上記の問題点に対して、カチオン性脂質を含有する微粒子内にｓｉＲＮＡを封入することにより、封入されたｓｉＲＮＡを血しょう中での分解から保護し、かつ脂溶性の細胞膜への透過を可能とすることが知られている（例えば、特許文献１参照。）。
　また、特許文献２～４には、ｓｉＲＮＡ等の核酸医薬の送達に用いられるカチオン性脂質であって、生分解能を向上させたカチオン性脂質が記載されている。
　また、カチオン性脂質を含有する微粒子は、保管期間中に凝集しやすいという安定性の問題点があり、ポリエチレングリコール修飾脂質（ＰＥＧ脂質）を該微粒子に含有させて凝集を抑制する方法が知られている。さらに、特定のＰＥＧ脂質であるＰＥＧ－ＤＰＧを微粒子の構成成分とすることや該微粒子と脱イオン化された溶媒とからなる製剤とすることで、凝集抑制と核酸の送達効率を改善する方法が、特許文献５に記載されている。
特表２０１２－５３００５９号公報 国際公開第２０１１／１５３４９３号パンフレット 国際公開第２０１３／０８６３５４号パンフレット 国際公開第２０１３／１５８５７９号パンフレット 国際公開第２０１４／０８９２３９号パンフレット
　しかしながら、最近の進展にもかかわらず、細胞質への核酸送達に利用できるカチオン性脂質が依然として求められている。
　本発明は、以下の[１]から[８]に関する。
［１］下記式（１）～（１１）で表される化合物からなる群より選択される化合物又はその薬学的に許容される塩。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
［２］下記式（１）及び（６）～（９）で表される化合物からなる群より選択される、［１］に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
［３］下記式（１）で表される、［１］又は［２］に記載の化合物又はその薬剤学的に許容される塩。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
 　上記式（１）で表される化合物はカチオン性脂質である。
［４］下記式（６）で表される、［１］又は［２］に記載の化合物又はその薬剤学的に許容される塩。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
 　上記式（６）で表される化合物はカチオン性脂質である。
［５］下記式（８）で表される、［１］又は［２］に記載の化合物又はその薬剤学的に許容される塩。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
 　上記式（８）で表される化合物はカチオン性脂質である。
［６］（Ｉ）［１］～［５］のいずれかに記載の化合物又はその薬学的に許容される塩と、（ＩＩ）中性脂質、ポリエチレングリコール修飾脂質及びステロールからなる群より選択される少なくとも一種の脂質と、を含有する脂質複合体。
［７］（Ｉ）［１］～［５］のいずれかに記載の化合物又はその薬学的に許容される塩と、（ＩＩ）中性脂質、ポリエチレングリコール修飾脂質及びステロールからなる群より選択される少なくとも一種の脂質と、（ＩＩＩ）核酸と、を含有する組成物。
［８］（Ｉ）［１］～［５］のいずれかに記載の化合物又はその薬学的に許容される塩と、（ＩＩ）中性脂質、ポリエチレングリコール修飾脂質及びステロールからなる群より選択される少なくとも一種の脂質とを含有する極性有機溶媒含有水溶液と、（ＩＩＩ）核酸を含有する水溶液とを混合して混合液を得る工程と、混合液中の極性有機溶媒の含有量を減少させる工程と、を備える組成物の製造方法。
　本発明のカチオン性脂質によれば、核酸を細胞質に効率よく放出することを可能とする。したがって、本発明のカチオン性脂質は、細胞質への核酸送達用の脂質としての利用可能性を有している。
動物実験（４）の結果を示すグラフである。 動物実験（５）の結果を示すグラフである。
＜カチオン性脂質＞
　一実施形態において、本発明は、上記式（１）～（１１）のいずれかで表される化合物又はその薬剤学的に許容される塩であり、カチオン性脂質として用いることができる。カチオン性脂質は、前記塩の水和物又は前記塩の溶媒和物であってもよい。本明細書において、カチオン性脂質とは、一つ以上の炭化水素基を含む脂質親和性領域と、生理的ｐＨでプロトン化する極性基を含む親水性領域を有する両親媒性分子である。即ち、本発明のカチオン性脂質は、プロトン化し、陽イオンを形成し得る。上記陽イオンと対になって、本実施形態のカチオン性脂質が含有し得る陰イオンとしては、薬剤学的に許容されるものであれば特に限定されず、例えば、塩化物イオン、臭化物イオン、硝酸イオン、硫酸イオン、リン酸イオン等の無機イオン；酢酸イオン、シュウ酸イオン、マレイン酸イオン、フマル酸イオン、クエン酸イオン、安息香酸イオン、メタンスルホン酸イオン等の有機酸イオン等が挙げられる。
＜カチオン性脂質の製造方法＞
　本発明のカチオン性脂質の製造方法について説明する。下記式（１２）に、カチオン性脂質の合成スキームの一実施形態を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
　上記式（１２）中、Ｒ３は炭素数４～１２のアルキレン基を表し、Ｒ４は炭素数７～１２のアルキル基を表し、Ｒ８は下記式（１３）で表される構造を表し、Ｒ９は下記式（１４）で表される構造を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000040
 ［式（１３）中、Ｒ１は炭素鎖の一部が縮合して形成されたシクロプロパン若しくはシクロブタンを１以上有していてもよい炭素数４～１０のアルキル基、又は炭素数４～１０のアルケニル基を表し、Ｒ２は水素原子又は炭素数２～８のアルキル基を表し、ｍは０～５の整数を表す。］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000041
 ［式（１４）中、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７はそれぞれ独立に水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基を表し、ｎは０～５の整数を表す。Ｒ５及びＲ６は一緒になって単環式複素環を形成してもよく、Ｒ６及びＲ７は一緒になって単環式複素環を形成してもよい。］
　本実施形態の合成スキームにおいて、カチオン性脂質（１－７）は、次のようにして合成することができる。
　まず、例えば式（１－１）で表されるジカルボン酸ジアルキルを加水分解して、式（１－２）で表されるモノエステル体を得る。ここで、式（１－１）ではジカルボン酸ジアルキルのアルキル基がメチル基である例を示しているが、ジカルボン酸ジアルキルのアルキル基はメチル基に限定されず、適宜のアルキル基を選択することができる。
　続いて、式（１－２）で表される化合物を酸クロライド化し、式（１－３）で表される化合物を得る。続いて、式（１－３）で表される化合物にグリニャール試薬を反応させることにより、式（１－４）で表される化合物が得られる。続いて、エステル交換反応により、式（１－５）で表される化合物を得、還元することにより、式（１－６）で表される化合物が得られる。続いて、式（１－６）で表される化合物をカルボン酸と縮合することにより、カチオン性脂質（１－７）を合成することができる。
＜脂質複合体＞
　本発明は、（Ｉ）上述したカチオン性脂質と、（ＩＩ）中性脂質、ポリエチレングリコール修飾脂質及びステロールからなる群より選択される少なくとも一種の脂質と、を含有する脂質複合体を提供する。本発明の一実施形態として、脂質複合体は、（Ｉ）上述したカチオン性脂質と、（ＩＩ）中性脂質、ポリエチレングリコール修飾脂質及びステロールからなる群より選択される少なくとも一種の脂質と、（ＩＩＩ）核酸と、を含有する。本実施形態の脂質複合体は、核酸を細胞質に効率よく放出することを可能とする。
　本実施形態の脂質複合体は、脂質複合体が含有する全脂質を基準として、上述したカチオン性脂質を、例えば１０～１００モル％、例えば２０～９０モル％、例えば４０～７０モル％含有する。カチオン性脂質は、１種を単独で、又は２種以上を混合して用いることができる。
　核酸としては、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ発現ベクター、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム等が挙げられる。核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡであってもよい。
　本実施形態の脂質複合体は、核酸を例えば０．０１～５０重量％、例えば０．１～３０重量％、例えば１～１０重量％含有する。
　本実施形態の脂質複合体は、脂質成分として、（Ｉ）上述したカチオン性脂質と、（ＩＩ）中性脂質、ポリエチレングリコール修飾脂質、及びステロールからなる群より選択される少なくとも一種の脂質とを含有する。
　中性脂質としては、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジアラキドイルホスファチジルコリン（ＤＡＰＣ）、ジベヘノイルホスファチジルコリン（ＤＢＰＣ）、ジリグノセロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、スフィンゴミエリン、セラミド、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）等が挙げられる。中性脂質は、１種を単独で、又は２種以上を混合して用いることができる。
　本実施形態の脂質複合体は、脂質複合体が含有する全脂質を基準として、中性脂質を、例えば０～５０モル％、例えば０～４０モル％、例えば０～３０モル％含有してもよい。
　ポリエチレングリコール修飾脂質としては、ＰＥＧ２０００－ＤＭＧ（ＰＥＧ２０００－ジミリスチルグリセロール、ＰＥＧ２０００－ＤＰＧ（ＰＥＧ２０００－ジパルミトイルグリセロール）、ＰＥＧ２０００－ＤＳＧ（ＰＥＧ２０００－ジステアロイルグリセロール）、ＰＥＧ５０００－ＤＭＧ（ＰＥＧ５０００－ジミリスチルグリセロール、ＰＥＧ５０００－ＤＰＧ（ＰＥＧ５０００－ジパルミトイルグリセロール）、ＰＥＧ５０００－ＤＳＧ（ＰＥＧ５０００－ジステアロイルグリセロール）、ＰＥＧ－ｃＤＭＡ（Ｎ－［（メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）カルバミル］－１，２－ジミリスチルオキシルプロピル－３－アミン）、ＰＥＧ－Ｃ－ＤＯＭＧ（Ｒ－３－［（ω－メトキシ－ポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル）］－１，２－ジミリスチルオキシルプロピル－３－アミン）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、ＰＥＧ－ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ－リン脂質、ＰＥＧ－セラミド（Ｃｅｒ）等が挙げられる。
　ＰＥＧ－ジアルキルオキシプロピルとしては、ＰＥＧ－ジラウリルオキシプロピル、ＰＥＧ－ジミリスチルオキシプロピル、ＰＥＧ－ジパルミチルオキシプロピル、ＰＥＧ－ジステアリルオキシプロピル等が挙げられる。ポリエチレングリコール修飾脂質は、１種を単独で、又は２種以上を混合して用いることができる。
　本実施形態の脂質複合体は、脂質複合体が含有する全脂質を基準として、ポリエチレングリコール修飾脂質を、例えば０～３０モル％、例えば０～２０モル％、例えば０～１０モル％含有してもよい。
　ステロールとしては、コレステロール、ジヒドロコレステロール、ラノステロール、β－シトステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、エルゴカステロール、フコステロール、３β－［Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエチル）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）等が挙げられる。ステロールは、１種を単独で、又は２種以上を混合して用いることができる。
　本実施形態の脂質複合体は、脂質複合体が含有する全脂質を基準として、ステロールを、例えば０～９０モル％、例えば１０～８０モル％、例えば２０～５０モル％含有してもよい。
　本実施形態の脂質複合体における脂質成分の組み合わせは、特に限定されず、例えば、上述したカチオン性脂質、中性脂質及びステロールの組み合わせ、上述したカチオン性脂質、中性脂質、ポリエチレングリコール修飾脂質及びステロールの組み合わせ等が挙げられる。
＜組成物＞
　一実施形態において、本発明は、（Ｉ）上述したカチオン性脂質と、（ＩＩ）中性脂質、ポリエチレングリコール修飾脂質及びステロールからなる群より選択される少なくとも一種の脂質と、（ＩＩＩ）核酸と、を含有する組成物を提供する。本実施形態の組成物は、核酸を細胞質に効率よく放出することを可能とする。本実施形態の組成物は、上述した脂質複合体、薬学的に許容される媒体、及び場合によりその他の添加剤を含有するものであってもよい。薬学的に許容される媒体、その他の添加剤については後述する。
　本実施形態の組成物は、組成物が含有する全脂質を基準として、上述したカチオン性脂質を、例えば１０～１００モル％、例えば２０～９０モル％、例えば４０～７０モル％含有する。カチオン性脂質は、１種を単独で、又は２種以上を混合して用いることができる。
　核酸としては、上述したものと同様のものが挙げられる。本実施形態の組成物は、核酸を例えば０．０１～５０重量％、例えば０．１～３０重量％、例えば１～１０重量％含有する。
　本実施形態の組成物は、脂質成分として、（Ｉ）上述したカチオン性脂質と、（ＩＩ）中性脂質、ポリエチレングリコール修飾脂質、及びステロールからなる群より選択される少なくとも一種の脂質とを含有する。
　中性脂質としては、上述したものと同様のものが挙げられる。本実施形態の組成物は、組成物が含有する全脂質を基準として、中性脂質を、例えば０～５０モル％、例えば０～４０モル％、例えば０～３０モル％含有してもよい。
　ポリエチレングリコール修飾脂質としては、上述したものと同様のものが挙げられる。本実施形態の組成物は、組成物が含有する全脂質を基準として、ポリエチレングリコール修飾脂質を、例えば０～３０モル％、例えば０～２０モル％、例えば０～１０モル％含有してもよい。
　ステロールとしては、上述したものと同様のものが挙げられる。本実施形態の組成物は、組成物が含有する全脂質を基準として、ステロールを、例えば０～９０モル％、例えば１０～８０モル％、例えば２０～５０モル％含有してもよい。
　本実施形態の組成物における脂質成分の組み合わせは、特に限定されず、例えば、上述したカチオン性脂質、中性脂質及びステロールの組み合わせ、上述したカチオン性脂質、中性脂質、ポリエチレングリコール修飾脂質及びステロールの組み合わせ等が挙げられる。
　本実施形態の組成物は、上述した成分の他にも、その他の添加剤として、ショ糖、ブドウ糖、ソルビトール、乳糖等の糖；グルタミン、グルタミン酸、グルタミン酸ナトリウム、ヒスチジン等のアミノ酸；クエン酸、リン酸、酢酸、乳酸、炭酸、酒石酸等の酸の塩等を含有してもよい。
　本実施形態の組成物は、医薬組成物として製剤化されていてもよい。医薬組成物の剤型としては、例えば注射剤が挙げられる。
　本実施形態の組成物は、例えば、凍結乾燥等により溶媒を除去した粉末状態であってもよく、液体状態であってもよい。組成物が粉末状態である場合には、使用前に薬学的に許容される媒体に懸濁又は溶解させて注射剤として用いることができる。組成物が液体状態である場合には、そのままで又は薬学的に許容される媒体に懸濁又は溶解させて注射剤として用いることができる。
　薬学的に許容される媒体としては、滅菌水；生理食塩水；ブドウ糖、Ｄ－ソルビトール、Ｄ－マンノース、Ｄ－マンニトール、塩化ナトリウム等の補助薬を含む等張液等が挙げられる。本実施形態の組成物は、更に、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等のアルコール等の溶解補助剤、安定剤、酸化防止剤、防腐剤等の添加剤を含有していてもよい。
　組成物の患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射等により行うことができる。組成物の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法によっても異なる。
　本実施形態の組成物は、カチオン性脂質を含有する脂質で構成された微粒子内に核酸が封入された脂質複合体を形成している。脂質複合体の「平均粒子径」は、体積平均、数平均、Ｚ－平均のいずれかの方法で算出することができる。本実施形態の組成物において、脂質複合体の平均粒子径（Ｚ－平均）は、例えば１０～１０００ｎｍ、例えば３０～５００ｎｍ、例えば３０～２００ｎｍであってよい。
　本実施形態の組成物は、非特異的な吸着や免疫反応を抑制する観点から、例えば血液中等の約ｐＨ７．４の環境下において、表面の荷電がほとんどないことが好ましい。また、エンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれる際、エンドソーム膜との融合効率を向上させる観点から、低ｐＨ環境下で正に帯電することが好ましい。
＜組成物の製造方法＞
　一実施形態において、本発明は、（Ｉ）上述したカチオン性脂質と、（ＩＩ）中性脂質、ポリエチレングリコール修飾脂質及びステロールからなる群より選択される少なくとも一種の脂質とを含有する極性有機溶媒含有水溶液と、（ＩＩＩ）核酸を含有する水溶液とを混合して混合液を得る工程（ａ）と、混合液中の極性有機溶媒の含有量を減少させる工程（ｂ）とを備える、組成物の製造方法を提供する。本実施形態の製造方法によれば、核酸を細胞質に効率よく放出することが可能な組成物を製造することができる。
　水溶性の核酸と上述したカチオン性脂質との静電的相互作用、及び脂質間の疎水的相互作用により、脂質で構成された微粒子内に核酸が封入された脂質複合体を形成することができる。例えば、（Ｉ）上述したカチオン性脂質と、（ＩＩ）中性脂質、ポリエチレングリコール修飾脂質及びステロールからなる群より選択される少なくとも一種の脂質とを含む脂質成分の、極性有機溶媒含有水溶液に対する溶解度を変化させることにより、脂質複合体を形成させることができる。極性有機溶媒としては、エタノール等のアルコールが挙げられる。
　まず、工程（ａ）において、（Ｉ）上述したカチオン性脂質と、（ＩＩ）中性脂質、ポリエチレングリコール修飾脂質及びステロールからなる群より選択される少なくとも一種の脂質とを溶解させた、極性有機溶媒含有水溶液と、（ＩＩＩ）核酸を含有する水溶液とを混合して混合液を得る。極性有機溶媒含有水溶液中の極性有機溶媒の濃度は、核酸の水溶液と混合後も、脂質分子が溶解する条件を満たしていれば特に限定されない。
　続いて、工程（ｂ）において、上記の混合液に水等を添加することにより、極性有機溶媒の含有量を減少させる。これにより、脂質複合体を形成させることができる。脂質複合体を効率よく形成させるためには、極性有機溶媒の含有量を急激に低下させることが好ましい。
　本実施形態の組成物の製造方法によれば、核酸が効率よく微粒子内部に封入された脂質複合体を得ることができる。
　組成物に封入される核酸が核酸医薬である場合には、組成物を医薬組成物として利用することができる。
　以下に実施例を挙げて本発明を更に詳述するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。また、実施例中の化合物名は、ソフトウエア（商品名「ＣｈｅｍＤｒａｗ　Ｕｌｔｒａ　ｖｅｒ．１２．０」、パーキンエルマー社製）を用いて命名した。
　実施例において使用される略語は当業者に周知の慣用的な略語である。いくつかの略語を以下に示す。
　ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド
　ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
　ＷＳＣ：１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩
　ＤＭＡＰ：Ｎ，Ｎ－ジメチル－４－アミノピリジン
　ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
　ＬＣ－ＭＳ：液体クロマトグラフィー－マススペクトルメトリー
　ＥＳＩ－ＭＳ：エレクトロスプレーイオン化質量分析
　プロトン核磁気共鳴スペクトルの化学シフトは、テトラメチルシランに対するδ単位（ｐｐｍ）で記録されている。パターンの略語は、次の通りである。
　ｓ：シングレット、ｄ：ダブレット、ｔ：トリプレット、ｑ：カルテット、ｄｄ：ダブルダブレット、ｄｄｄ：ダブルダブルダブレット、ｄｔ：ダブルトリプレット、ｔｔ：トリプルトリプレット、ｍ：マルチプレット。
＜カチオン性脂質の合成＞
［実施例１］
（１－（（２－ヘキシルシクロプロピル）メトキシ）－１－オキソノナデカン－１０－イル－１－メチルピペリジン－４－カルボキシレート（以下、「ＹＳ－１０２」という場合がある。）の合成）
　以下に、ＹＳ－１０２の合成スキームを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000042
（第１工程：加水分解）
　セバシン酸ジメチル（２００ｇ、８６８．４ｍｍｏｌ）をエタノール（８６８ｍＬ）に溶かした溶液を０℃まで冷却した。その溶液に水酸化カリウム（４８．７３ｇ、８６８．４ｍｍｏｌ）のエタノール（３００ｍＬ）溶液を滴下し、滴下後０℃で１２時間撹拌した。反応終了後、酢酸エチルと水を加え、未反応物を有機層に抽出することで除去した。水層を塩酸にて酸性にし、酢酸エチルを加えて目的物を抽出した。有機層を水、食塩水で洗浄し、濃縮した。第１工程品モノエステル体（１５０．３ｇ、６５２．６ｍｍｏｌ、７５％）は精製を行わずに次のステップへ用いた。
（第２工程：酸クロライド化）
　第１工程品モノエステル体（５０．０ｇ、２３１．２ｍｍｏｌ）と触媒量のＤＭＦ（２３ｍＬ）との懸濁液に、塩化チオニル（４１．３ｇ、３４６．８ｍｍｏｌ）を滴下した。反応終了後、塩化チオニルを減圧下留去した後、蒸留精製し、第２工程品（２５．８ｇ、１０９．９ｍｍｏｌ、４８％）を得た。
（第３工程：グリニャール試薬との反応）
　塩化亜鉛（２．７ｇ、２０．１ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（６１ｍＬ）に溶解させ、－７８℃まで冷却した。この溶液に１Ｍのノニルマグネシウムブロミド（４０．２ｍＬ、４０．２ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下－７８℃で滴下した。滴下後０℃まで昇温し、０℃で３０分撹拌した後、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０．５８ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）を投下し、次いで第２工程品（５．０ｇ、２０．１ｍｍｏｌ）を滴下した。０℃で更に１時間撹拌した後に１Ｍ塩酸水溶液を加えてクエンチした。反応溶液より析出物をろ別し、ろ液を酢酸エチルで抽出し有機層を水、食塩水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥剤をろ過で除き、ろ液を減圧下濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、第３工程品（５．０ｇ、１４．７ｍｍｏｌ、７３％）を得た。
（第４工程：エステル交換）
　第３工程品（２．０ｇ、５．９ｍｍｏｌ）、２－ノネノール（４．２ｇ、２９．４ｍｍｏｌ）、チタニウムテトラプロポキシド（０．２ｇ、０．６ｍｍｏｌ）の混合液を撹拌しながら、外浴を１１０℃まで昇温した。出てくる留出液を除きながら撹拌を続け、留出が見えなくなった時点を反応終点として冷却後水を加えてクエンチした。反応液を酢酸エチルで抽出し水、食塩水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥剤をろ過で除き、ろ液を減圧下濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、第４工程品（２．６ｇ、５．８ｍｍｏｌ、９９％）を得た。
（第５工程：シクロプロパン化）
　ジエチル亜鉛（８．３ｍＬ、８．３ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１５ｍＬ）に溶解させ、０℃まで冷却した。そこへトリフルオロメタンスルホン酸（０．９ｇ、８．３ｍｍｏｌ）を滴下し、次いでジヨードメタン（２．２ｇ、８．３ｍｍｏｌ）を滴下後、０℃で１時間撹拌した。この溶液に第４工程品（１．２ｇ、２．８ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（５ｍＬ）溶液を滴下し、室温まで昇温した。反応をＴＬＣで確認し、原料の消失を終点として水でクエンチした。析出した固体をろ別し、ろ液を酢酸エチルで抽出、水、食塩水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥剤をろ過で除き、ろ液を減圧下濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、第４工程品（１．２ｇ、２．７ｍｍｏｌ、９９％）を得た。
（第６工程：還元）
　第５工程品（１．０ｇ、２．２ｍｍｏｌ）をエタノール（２２ｍＬ）に溶かした溶液中に、水素化ホウ素ナトリウム（０．０８ｇ、２．２ｍｍｏｌ）を添加し、１０分間反応させた。反応終了後１Ｎ塩酸でクエンチした。酢酸エチルで抽出し、水、食塩水で洗浄後、有機層を減圧下濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、第６工程品（０．３ｇ、０．７ｍｍｏｌ、３０％）を得た。
（第７工程：縮合）
　第６工程品（０．８ｇ、１．８ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（７ｍＬ）に溶かした溶液中に、ＷＳＣ（０．７ｇ、３．７ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノピリジン（０．０４ｇ、０．４ｍｍｏｌ）、１－メチルピペリジン－４－カルボン酸（０．５ｇ、３．７ｍｍｏｌ）を添加した。室温で翌日まで撹拌した後、水を加え、有機層を分液した。有機層を水で５回洗浄後、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液で１度洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥剤をろ過で除き、ろ液を減圧下濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、下記式（１５）で表されるＹＳ－１０２（０．１２ｇ、０．２ｍｍｏｌ、１２％）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000043
　得られた化合物を以下の条件でＨＰＬＣ－ＬＣ／ＭＳにより確認した。カラム：ＹＭＣ－ＴｒｉａｒｔＣ１８、１５０－４．６ｍｍ、５μｍ、溶離液：ＭｅＯＨ（均一溶媒）、流速：１．０ｍＬ／分、ランタイム：１５分、カラム温度：４５℃、検出：ＵＶ（２１５ｎｍ）、エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）。
　ＨＰＬＣ－ＬＣ／ＭＳ、Ｒｔ　６．２４分、ＥＳＩ－ＭＳ　（Ｍ＋Ｈ）　ｃａｃｌｄ　５７７．５、ｆｏｕｎｄ　５７８．６、１Ｈ　ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ４．８７（１Ｈ，ｑ）、２．８２（２Ｈ，ｄ）、２．２７（４Ｈ，ｍ）、２．０４（１Ｈ，ｍ）、１．９１（１Ｈ，ｍ）、１．８２（２Ｈ，ｍ）、１．６１（２Ｈ，ｍ）、１．５０（４Ｈ，ｍ）、１．３６（５Ｈ，ｍ）、１．２５（２４Ｈ，ｍ）、０．８８（６Ｈ，ｍ）
［実施例２］
（（Ｚ）－１－（ノン－２－エン－１－イルオキシ）－１－オキソノナデカン－１０－イル－１－メチルピペリジン－４－カルボキシレート（以下、「ＹＳ－１０１」という場合がある。）の合成）
　第５工程を行わなかった点以外は実施例１と同様にして、下記式（１６）で表されるＹＳ－１０１を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000044
　ＨＰＬＣ－ＬＣ／ＭＳ、Ｒｔ　５．５１分、ＥＳＩ－ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）　ｃａｃｌｄ　５６３．５、ｆｏｕｎｄ　５６４．５、１Ｈ　ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ５．３２（２Ｈ，ｍ）、４．８７（１Ｈ，ｑ）、４．１１（１Ｈ，ｄｄ）、４．０５（２Ｈ，ｔ）、２．８２（２Ｈ，ｄ）、２．２７（７Ｈ，ｍ）、２．０４（８Ｈ，ｍ）、１．８９（２Ｈ，ｍ）、１．７９（２Ｈ，ｍ）、１．６１（４Ｈ，ｍ）、１．４９（４Ｈ，ｍ）、１．３６（５Ｈ，ｍ）、１．２５（３０Ｈ，ｍ）、０．９５（３Ｈ，ｍ）、０．８８（３Ｈ，ｍ）
［実施例３］
（１－オキソ－１－（ウンデカン－５－イルオキシ）ノナデカン－１０－イル－１－メチルピペリジン－４－カルボキシレート（以下、「ＹＳ－１０３」という場合がある。）の合成）
　第４工程において、２－ノネノールの代わりに２－ブチルオクタン－１－オールを反応させ、第５工程を行わなかった点以外は実施例１と同様にして、下記式（２）で表されるＹＳ－１０３を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000045
　ＨＰＬＣ－ＬＣ／ＭＳ、Ｒｔ　７．５２分、ＥＳＩ－ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）　ｃａｃｌｄ　５９３．５、ｆｏｕｎｄ　５９４．６、１Ｈ　ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ４．８６（１Ｈ，ｑ）、４．０６（２Ｈ，ｔ）、２．８２（２Ｈ，ｄ）、２．２７（７Ｈ，ｍ）、１．９９（２Ｈ，ｍ）、１．８８（２Ｈ，ｍ）、１．７９（２Ｈ，ｍ）、１．６０（４Ｈ，ｍ）、１．４９（４Ｈ，ｍ）、１．３８（７Ｈ，ｍ）、１．２５（３０Ｈ，ｍ）、０．９７（３Ｈ，ｍ）、０．８８（３Ｈ，ｍ）、０．６４（２Ｈ，ｍ）、０．５９（１Ｈ，ｍ）、－０．３３（１Ｈ，ｄｄ）
［実施例４］
（１－（（２－ブチルオクチル）オキシ）－１－オキソノナデカン－１０－イル－１－メチルピペリジン－４－カルボキシレート（以下、「ＹＳ－１１９」という場合がある。）の合成）
　以下に、ＹＳ－１１９の合成スキームを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000046
（第１工程から第３工程）
　第１工程から第３工程は上述したＹＳ－１０２の合成と同様に行った。
（第４工程：エステル交換）
　第３工程品（４．１ｇ、１２．０ｍｍｏｌ）、２－ブチルオクタン－１－オール（６．７３ｇ、３６．１２ｍｍｏｌ）、チタニウムテトラプロポキシド（０．３４ｇ、１．２ｍｍｏｌ）の混合液を撹拌しながら、外浴を１１０℃まで昇温した。出てくる留出液を除きながら撹拌を続け、留出が見えなくなった時点を反応終点として冷却後水を加えてクエンチした。反応液を酢酸エチルで抽出し、水、食塩水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥剤をろ過で除き、ろ液を減圧下濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、第４工程品（４．５ｇ、９．４ｍｍｏｌ、７８％）を得た。
（第５工程：還元）
　第４工程品（４．５ｇ、９．４ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１８．７ｍＬ）、メタノール（１８．７ｍＬ）に溶かした溶液中に、水素化ホウ素ナトリウム（１．８ｇ、４６．８ｍｍｏｌ）を添加し、一時間反応させた。反応終了後１Ｎ塩酸でクエンチした。酢酸エチルで抽出し、水、食塩水で洗浄後、有機層を減圧下濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、第５工程品（３．１ｇ、６．４２ｍｍｏｌ、６９％）を得た。
（第６工程：縮合）
　第５工程品（２．０ｇ、４．１４ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（８．２８ｍＬ）に溶かした溶液中に、ＷＳＣ（１．５９ｇ、８．２８ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノピリジン（０．０４ｇ、０．４ｍｍｏｌ）、１－メチルピペリジン－４－カルボン酸（１．１９ｇ、８．２８ｍｍｏｌ）を添加した。室温で翌日まで撹拌した後、水を加え、有機層を分液した。有機層を水で５回洗浄後、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液で１度洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥剤をろ過で除き、ろ液を減圧下濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、式（１）で表されるＹＳ－１１９（１．９ｇ、３．１ｍｍｏｌ、７４％）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000047
　ＨＰＬＣ－ＬＣ／ＭＳ、Ｒｔ　８．０１分、ＥＳＩ－ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）　ｃａｃｌｄ　６０７．６、ｆｏｕｎｄ　６０８．６、１Ｈ　ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ４．８７（１Ｈ，ｑ）、３．９６（２Ｈ，ｄ）、２．８１（２Ｈ，ｄ）、２．２７（６Ｈ，ｍ）、１．９８（２Ｈ，ｍ）、１．９１（２Ｈ，ｍ）、１．８２（２Ｈ，ｍ）、１．６１（４Ｈ，ｍ）、１．４９（４Ｈ，ｍ）、１．２０（４６Ｈ，ｍ）、０．８６（９Ｈ，ｍ）
［実施例５］
（１－オキソ－１－（ウンデカン－５－イルオキシ）ペンタデカン－６－イル－１－メチルピペリジン４－カルボキシレート（以下、「ＹＳ－１１１」という場合がある。）の合成）
　第１工程において、セバシン酸ジメチルの代わりにアジピン酸ジメチルを反応させ、第４工程において、２－ブチルオクタン－１－オールの代わりにウンデカン－５－オールを反応させた以外は実施例４と同様にして、下記式（１７）で表されるＹＳ－１１１を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000048
　ＨＰＬＣ－ＬＣ／ＭＳ、Ｒｔ　５．３５分、ＥＳＩ－ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）　ｃａｃｌｄ　５３７．５、ｆｏｕｎｄ　５３８．５、１Ｈ　ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ４．８７（２Ｈ，ｑ）、２．８１（２Ｈ，ｄ）、２．２７（６Ｈ，ｍ）、１．９８（２Ｈ，ｍ）、１．９１（２Ｈ，ｍ）、１．８２（２Ｈ，ｍ）、１．６２－１．５０（１０Ｈ，ｍ）、１．２４（２８Ｈ，ｍ）、０．８７（９Ｈ，ｍ）
［実施例６］
（１－オキソ－１－（ウンデカン－５－イルオキシ）ヘプタデカン－８－イル－１－メチルピペリジン４－カルボキシレート（以下、「ＹＳ－１１２」という場合がある。）の合成）
　第１工程において、セバシン酸ジメチルの代わりにスベリン酸ジメチルを反応させ、第４工程において、２－ブチルオクタン－１－オールの代わりにウンデカン－５－オールを反応させた以外は実施例４と同様にして、下記式（４）で表されるＹＳ－１１２を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000049
　ＨＰＬＣ－ＬＣ／ＭＳ、Ｒｔ　６．０５分、ＥＳＩ－ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）　ｃａｃｌｄ　５６５．５、ｆｏｕｎｄ　５６６．５、１Ｈ　ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ４．８７（２Ｈ，ｑ）、２．８１（２Ｈ，ｄ）、２．２７（６Ｈ，ｍ）、１．９８（２Ｈ，ｍ）、１．９１（２Ｈ，ｍ）、１．８２（２Ｈ，ｍ）、１．６２－１．５０（１０Ｈ，ｍ）、１．２４（３２Ｈ，ｍ）、０．８７（９Ｈ，ｍ）
［実施例７］
（２１－オキソ－２１－（ウンデカン－５－イルオキシ）ヘンイコサン－１０－イル－１－メチルピペリジン４－カルボキシレート（以下、「ＹＳ－１１３」という場合がある。）の合成）
　第１工程において、セバシン酸ジメチルの代わりにドデカン二酸ジメチルを反応させ、第４工程において、２－ブチルオクタン－１－オールの代わりにウンデカン－５－オールを反応させた以外は実施例４と同様にして、下記式（５）で表されるＹＳ－１１３を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000050
　ＨＰＬＣ－ＬＣ／ＭＳ、Ｒｔ　８．９５分、ＥＳＩ－ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）　ｃａｃｌｄ　６２１．６、ｆｏｕｎｄ　６２２．６、１Ｈ　ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ４．８７（２Ｈ，ｑ）、２．８１（２Ｈ，ｄ）、２．２７（６Ｈ，ｍ）、１．９８（２Ｈ，ｍ）、１．９１（２Ｈ，ｍ）、１．８２（２Ｈ，ｍ）、１．６２－１．５０（１０Ｈ，ｍ）、１．２４（４０Ｈ，ｍ）、０．８７（９Ｈ，ｍ）
［実施例８］
（２３－オキソ－２３－（ウンデカン－５－イルオキシ）トリコサン－１０－イル－１－メチルピペリジン４－カルボキシレート（以下、「ＹＳ－１１４」という場合がある。）の合成）
　第１工程において、セバシン酸ジメチルの代わりにテトラデカン二酸ジメチルを反応させ、第４工程において、２－ブチルオクタン－１－オールの代わりにウンデカン－５－オールを反応させた以外は実施例４と同様にして、下記式（１８）で表されるＹＳ－１１４を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000051
　ＨＰＬＣ－ＬＣ／ＭＳ、Ｒｔ　１１．１分、ＥＳＩ－ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）　ｃａｃｌｄ　６４９．６、ｆｏｕｎｄ　６５０．６、１Ｈ　ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ４．８７（２Ｈ，ｑ）、２．８１（２Ｈ，ｄ）、２．２７（６Ｈ，ｍ）、１．９８（２Ｈ，ｍ）、１．９１（２Ｈ，ｍ）、１．８２（２Ｈ，ｍ）、１．６２－１．５０（１０Ｈ，ｍ）、１．２４（４４Ｈ，ｍ）、０．８７（９Ｈ，ｍ）
［実施例９］
（１－（（２－ブチルオクチル）オキシ）－１－オキソヘプタデカン－８－イル－１－メチルピペリジン－４－カルボキシレート（以下、「ＹＳ－１１５」という場合がある。）の合成）
　第１工程において、セバシン酸ジメチルの代わりにスベリン酸ジメチルを反応させた以外は実施例４と同様にして、下記式（１９）で表されるＹＳ－１１５を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000052
　ＨＰＬＣ－ＬＣ／ＭＳ、Ｒｔ　６．７２分、ＥＳＩ－ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）　ｃａｃｌｄ　５７９．５、ｆｏｕｎｄ　５８０．７、１Ｈ　ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ４．８７（２Ｈ，ｑ）、３．９６（２Ｈ，ｄ）、２．８１（２Ｈ，ｄ）、２．２７（６Ｈ，ｍ）、１．９８（２Ｈ，ｍ）、１．９１（２Ｈ，ｍ）、１．８２（２Ｈ，ｍ）、１．６２－１．５０（１０Ｈ，ｍ）、１．２４（３２Ｈ，ｍ）、０．８７（９Ｈ，ｍ）
［実施例１０］
（２１－（（２－ブチルオクチル）オキシ）－２１－オキソヘンイコサン－１０－イル－１－メチルピペリジン－４－カルボキシレート（以下、「ＹＳ－１１６」という場合がある。）の合成）
　第１工程において、セバシン酸ジメチルの代わりにスベリン酸ジメチルを反応させた以外は実施例４と同様にして、下記式（２０）で表されるＹＳ－１１６を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000053
　ＨＰＬＣ－ＬＣ／ＭＳ、Ｒｔ　１０．０分、ＥＳＩ－ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）　ｃａｃｌｄ　６３５．６、ｆｏｕｎｄ　６３６．７、１Ｈ　ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ４．８７（２Ｈ，ｑ）、３．９６（２Ｈ，ｄ）、２．８１（２Ｈ，ｄ）、２．２７（６Ｈ，ｍ）、１．９８（２Ｈ，ｍ）、１．９１（２Ｈ，ｍ）、１．８２（２Ｈ，ｍ）、１．６２－１．５０（１０Ｈ，ｍ）、１．２４（４０Ｈ，ｍ）、０．８７（９Ｈ，ｍ）
［実施例１１］
（１－（オクタン－３－イルオキシ）－１－オキソヘプタデカン－８－イル－１－メチルピペリジン－４－カルボキシレート（以下、「ＹＳ－１１７」という場合がある。）の合成）
　第１工程において、セバシン酸ジメチルの代わりにスベリン酸ジメチルを反応させ、第４工程において、２－ブチルオクタン－１－オールの代わりにオクタン－３－オールを反応させた以外は実施例４と同様にして、下記式（２１）で表されるＹＳ－１１７を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000054
　ＨＰＬＣ－ＬＣ／ＭＳ、Ｒｔ　４．７１分、ＥＳＩ－ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）　ｃａｃｌｄ　５２３．５、ｆｏｕｎｄ　５２４．６、１Ｈ　ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ４．８７（１Ｈ，ｑ）、４．８０（１Ｈ，ｑ）、２．８２（２Ｈ，ｄ）、２．２７（６Ｈ，ｍ）、１．９８（２Ｈ，ｍ）、１．９１（２Ｈ，ｍ）、１．８２（２Ｈ，ｍ）、１．６２－１．２９（１０Ｈ，ｍ）、１．２４（２６Ｈ，ｍ）、０．８７（９Ｈ，ｍ）
［実施例１２］
（１－（（Ｓ）オクタン－３－イルオキシ）－１－オキソヘプタデカン－８－イル－１－メチルピペリジン－４－カルボキシレート（以下、「ＹＳ－１１７Ｓ」という場合がある。）の合成）
　第１工程において、セバシン酸ジメチルの代わりにスベリン酸ジメチルを反応させ、第４工程において、２－ブチルオクタン－１－オールの代わりに（Ｓ）－オクタン－３－オールを反応させた以外は実施例４と同様にして、下記式（２２）で表されるＹＳ－１１７Ｓを合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000055
　ＨＰＬＣ－ＬＣ／ＭＳ、Ｒｔ　４．７０分、ＥＳＩ－ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）　ｃａｃｌｄ　５２３．５、ｆｏｕｎｄ　５２４．６、１Ｈ　ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ４．８７（１Ｈ，ｑ）、４．８０（１Ｈ，ｑ）、２．８２（２Ｈ，ｄ）、２．２７（６Ｈ，ｍ）、１．９８（２Ｈ，ｍ）、１．９１（２Ｈ，ｍ）、１．８２（２Ｈ，ｍ）、１．６２－１．２９（１０Ｈ，ｍ）、１．２４（２６Ｈ，ｍ）、０．８６（９Ｈ，ｍ）
［実施例１３］
（２１－（オクタン－３－イルオキシ）－２１－オキソヘンイコサン－１０－イル－１－メチルピペリジン－４－カルボキシレート（以下、「ＹＳ－１１８」という場合がある。）の合成）
　第１工程において、セバシン酸ジメチルの代わりにドデカン二酸ジメチルを反応させ、第４工程において、２－ブチルオクタン－１－オールの代わりにオクタン－３－オールを反応させた以外は実施例４と同様にして、下記式（３）で表されるＹＳ－１１８を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000056
　ＨＰＬＣ－ＬＣ／ＭＳ、Ｒｔ　６．５５分、ＥＳＩ－ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）　ｃａｃｌｄ　５７９．５、ｆｏｕｎｄ　５８０．６、１Ｈ　ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ４．８７（１Ｈ，ｑ）、４．８０（１Ｈ，ｑ）、２．８２（２Ｈ，ｄ）、２．２７（６Ｈ，ｍ）、１．９８（２Ｈ，ｍ）、１．９１（２Ｈ，ｍ）、１．８２（２Ｈ，ｍ）、１．６２－１．２９（１０Ｈ，ｍ）、１．２４（３０Ｈ，ｍ）、０．８６（９Ｈ，ｍ）
［実施例１４］
（２１－（（Ｓ）－オクタン－３－イルオキシ）－２１－オキソヘンイコサン－１０－イル－１－メチルピペリジン－４－カルボキシレート（以下、「ＹＳ－１１８Ｓ」という場合がある。）の合成）
　第１工程において、セバシン酸ジメチルの代わりにドデカン二酸ジメチルを反応させ、第４工程において、２－ブチルオクタン－１－オールの代わりに（Ｓ）－オクタン－３－オールを反応させた以外は実施例４と同様にして、下記式（２３）で表されるＹＳ－１１８Ｓを合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000057
　ＨＰＬＣ－ＬＣ／ＭＳ、Ｒｔ　６．５４分、ＥＳＩ－ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）　ｃａｃｌｄ　５７９．５、ｆｏｕｎｄ　５８０．６、１Ｈ　ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ４．８７（１Ｈ，ｑ）、４．８０（１Ｈ，ｑ）、２．８２（２Ｈ，ｄ）、２．２７（６Ｈ，ｍ）、１．９８（２Ｈ，ｍ）、１．９１（２Ｈ，ｍ）、１．８２（２Ｈ，ｍ）、１．６２－１．２９（１０Ｈ，ｍ）、１．２４（３０Ｈ，ｍ）、０．８６（９Ｈ，ｍ）
［実施例１５］
（１－（（２－ブチルオクチル）オキシ）－１－オキソイコサン－１０－イル－１－メチルピペリジン－４－カルボキシレート（以下、「ＹＳ－１２０」という場合がある。）の合成）
　第３工程において、ノニルマグネシウムブロミドの代わりにデカニルマグネシウムブロミドを反応させた以外は実施例４と同様にして、下記式（６）で表されるＹＳ－１２０を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000058
　ＨＰＬＣ－ＬＣ／ＭＳ、Ｒｔ　８．７０分、ＥＳＩ－ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）　ｃａｃｌｄ　６２１．６、ｆｏｕｎｄ　６２２．７、１Ｈ　ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ４．８６（１Ｈ，ｄｄｄ）、３．９６（２Ｈ，ｄ）、２．８１（２Ｈ，ｄ）、２．２７（６Ｈ，ｍ）、２．０３（２Ｈ，ｍ）、１．９８（１Ｈ，ｄ）、１．９０（１Ｈ，ｍ）、１．７８（４Ｈ，ｍ）、１．６１（４Ｈ，ｍ）、１．４９（４Ｈ，ｍ）、１．２７－１．２１（４１Ｈ，ｍ）、０．８７（９Ｈ，ｍ）
　後述するように、上記式（６）で表される化合物で脂質複合体を形成すると、一定期間保管した場合の脂質複合体の粒子径の増大が抑制されており、安定性が高い。
［実施例１６］
（１－（（２－ブチルオクチル）オキシ）－１－オキソイコサン－１０－イル－１－メチルピペリジン－４－カルボキシレート（「ＹＳ－１２０」）の合成）
　以下に、ＹＳ－１２０の別の合成スキームを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000059
（第１工程から第３工程）
　第１工程から第３工程は上述したＹＳ－１０２の合成と同様に行った。
（第４工程：エステル交換）
　第３工程品（１５０．０ｇ、４４０．５ｍｍｏｌ）、ベンジルアルコール（１４２．９ｇ、１３２１．４ｍｍｏｌ）、チタニウムテトラプロポキシド（１２．５ｇ、４４．５ｍｍｏｌ）の混合液を撹拌しながら、外浴を１３０℃まで昇温した。出てくる留出液を除きながら撹拌を続け、留出が見えなくなった時点を反応終点として冷却後水を加えてクエンチした。反応液を酢酸エチルで抽出し、水、食塩水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥剤をろ過で除き、ろ液を減圧下濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、第４工程品（１４６．２ｇ、３５０．９ｍｍｏｌ）を得た。
（第５工程：還元）
　第４工程品（１００．０ｇ、２４０．０ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（４８０．０ｍＬ）、メタノール（４８０．０ｍＬ）に溶かした溶液中に、水素化ホウ素ナトリウム（１０．９ｇ、２８８．０ｍｍｏｌ）を添加し、１０分間反応させた。反応終了後１Ｎ塩酸でクエンチした。酢酸エチルで抽出し、水、食塩水で洗浄後、有機層を減圧下濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、第５工程品（７０．０ｇ、１６７．２ｍｍｏｌ）を得た。
（第６工程：縮合）
　第５工程品（５０．０ｇ、１１９．４ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（４８０．０ｍＬ）に溶かした溶液中に、ＷＳＣ（４５．８ｇ、２３８．９ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノピリジン（２．９２ｇ、２３．９ｍｍｏｌ）、１－メチルピペリジン－４－カルボン酸（３４．２ｇ、２３８．９ｍｍｏｌ）を添加した。室温で翌日まで撹拌した後、水を加え、有機層を分液した。有機層を水で５回洗浄後、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液で１度洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥剤をろ過で除き、ろ液を減圧下濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、第６工程品（３７．２ｇ、６８．４ｍｍｏｌ）を得た。
（第７工程：接触還元）
　第６工程品（３７．２ｇ、６８．４ｍｍｏｌ）、パラジウム／炭素（４．９ｍＬ）を酢酸エチル（１３６．８ｍＬ）に懸濁させ、水素雰囲気下一晩攪拌した。反応液をろ別し、パラジム／炭素を除いて濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィーにて精製し、第７工程品（２６．８ｇ、５９．１ｍｍｏｌ）を得た。
（第８工程：縮合）
　第７工程品（２０．０ｇ、４４．１ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（２２０．０ｍＬ）に溶かした溶液中に、ＷＳＣ（８．９ｇ、４６．３ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノピリジン（１．０８ｇ、０．４ｍｍｏｌ）、２－ブチルオクタン－１－オール（１６．４ｇ、８８．２ｍｍｏｌ）を添加した。室温で翌日まで撹拌した後、水を加え、有機層を分液した。有機層を水で５回洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥剤をろ過で除き、ろ液を減圧下濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、式（６）で表されるＹＳ－１２０（２２．０ｇ、３５．４ｍｍｏｌ）を得た。
［実施例１７］
（１－（（２Ｚ，５Ｚ）－デカ－２，５－ジエン－１－イルオキシ）－１－オキソイコサン－１０－イル－１－メチルピペリジン－４－カルボキシレート（以下、「ＹＳ－１２１」という場合がある。）の合成）
　第８工程において、２－ブチルオクタン－１－オールの代わりに（２Ｚ，５Ｚ）－デカ－２，５－ジエン－１－オールを反応させた以外は実施例１６と同様にして、下記式（２４）で表されるＹＳ－１２１を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000060
　ＥＳＩ－ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）　ｃａｃｌｄ　５８９．５、ｆｏｕｎｄ　５９０．７、１Ｈ　ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ５．６０（１Ｈ，ｍ）、５．３６（１Ｈ，ｍ）、４．８７（１Ｈ，ｔｔ）、４．６４（１Ｈ，ｄ）、２．８６（２Ｈ，ｍ）、２．３６(３Ｈ，ｓ)２．３２（２Ｈ，ｔ）、２．２２（１Ｈ，ｍ）、２．０２（２Ｈ，ｍ）、１．９７（２Ｈ，ｍ）、１．６１（２Ｈ，ｍ）、１．５０（３Ｈ，ｍ）、１．２７（４０Ｈ，ｍ）、０．８８（６Ｈ，ｍ）
［実施例１８］
（（Ｚ）－１－（（２－ブチルノン－３－エン－１－イル）オキシ）－１－オキソイコサン－１０－イル－１－メチルピペリジン－４－カルボキシレート（以下、「ＹＳ－１２２」という場合がある。）の合成）
　第８工程において、２－ブチルオクタン－１－オールの代わりに（Ｚ）－２－ブチルノン－３－エン－１－オールを反応させた以外は実施例１６と同様にして、下記式（２５）で表されるＹＳ－１２２を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000061
　ＥＳＩ－ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）　ｃａｃｌｄ　６３３．６、ｆｏｕｎｄ　６３４．７、１Ｈ　ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ５．６０（１Ｈ，ｍ）、５．３６（１Ｈ，ｍ）、４．８７（１Ｈ，ｔｔ）、４．６４（１Ｈ，ｄ）、２．８６（２Ｈ，ｍ）、２．３６（３Ｈ,ｓ）、２．３２（２Ｈ，ｔ）、２．２２（１Ｈ，ｍ）、２．０２（２Ｈ，ｍ）、１．９７（２Ｈ，ｍ）、１．６１（２Ｈ，ｍ）、１．５０（３Ｈ，ｍ）、１．２７（４８Ｈ，ｍ）、０．８８（６Ｈ，ｍ）
　後述するように、上記式（２５）で表される化合物で脂質複合体を形成すると、一定期間保管した場合の脂質複合体の粒子径の増大が抑制されており、安定性が高い。
［実施例１９］
（（Ｚ）－１－オキソ－１－（（５－プロピルノン－２－エン－１－イル）オキシ）イコサン－１０－イル－１－メチルピペリジン－４－カルボキシレート（以下、「ＹＳ－１２３」という場合がある。）の合成）
　第８工程において、２－ブチルオクタン－１－オールの代わりに（Ｚ）－５－プロピルノン－２－エン－１－オールを反応させた以外は実施例１６と同様にして、下記式（２６）で表されるＹＳ－１２３を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000062
　ＥＳＩ－ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）　ｃａｃｌｄ　６１９．６、ｆｏｕｎｄ　６２０．７、１Ｈ　ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ５．６０（２Ｈ，ｍ）、４．８７（１Ｈ，ｔｔ）、４．６１（２Ｈ，ｄ）、２．９３（２Ｈ，ｄ）、２．４２（３Ｈ，ｓ）、２．３１（２Ｈ，ｔ）、２．２９（２Ｈ，ｔ）、２．０５（４Ｈ，ｔ）、１．９３（２Ｈ，ｍ）、１．６１（２Ｈ，ｍ）、１．５０（４Ｈ，ｍ）、１．２７（４３Ｈ，ｍ）、０．８８（６Ｈ，ｍ）
　後述するように、上記式（２６）で表される化合物で脂質複合体を形成すると、一定期間保管した場合の脂質複合体の粒子径の増大が抑制されており、安定性が高い。
［実施例２０］
（１－オキソ－１－（（３－ペンチルオクチル）オキシ）イコサン－１０－イル－１－メチルピペリジン－４－カルボキシレート（以下、「ＹＳ－１２４」という場合がある。）の合成）
　第８工程において、２－ブチルオクタン－１－オールの代わりに３－ペンチルオクタン－１－オールを反応させた以外は実施例１６と同様にして、下記式（２７）で表されるＹＳ－１２４を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000063
　ＥＳＩ－ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）　ｃａｃｌｄ　６３５．６、ｆｏｕｎｄ　６３６．７、１Ｈ　ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ４．８７（１Ｈ，ｔｔ）、４．０６（２Ｈ，ｍ）、２．８１（２Ｈ，ｄ）、２．２７（６Ｈ，ｍ）、２．０２（２Ｈ，ｍ）、１．９７（２Ｈ，ｍ）、１．７７（４Ｈ，ｍ）、１．６１（２Ｈ，ｍ）、１．５０（３Ｈ，ｍ）、１．４３（１Ｈ，ｍ）、１．２７（４３Ｈ，ｍ）、０．８８（９Ｈ，ｍ）
　後述するように、上記式（２７）で表される化合物で脂質複合体を形成すると、一定期間保管した場合の脂質複合体の粒子径の増大が抑制されており、安定性が高い。
［実施例２１］
（１－（（２，４－ジプロピルヘプチル）オキシ）－１－オキソイコサン－１０－イル－１－メチルピペリジン－４－カルボキシレート（以下、「ＹＳ－１２５」という場合がある。）の合成）
　第８工程において、２－ブチルオクタン－１－オールの代わりに２，４－ジプロピルヘプタン－１－オールを反応させた以外は実施例１６と同様にして、下記式（２８）で表されるＹＳ－１２５を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000064
　ＥＳＩ－ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）　ｃａｃｌｄ　６３５．６、ｆｏｕｎｄ　６３６．７、１Ｈ　ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ４．８７（１Ｈ，ｔｔ）、３．９５（１Ｈ，ｄ）、３．５５（２Ｈ，ｔ）、２．９６（２Ｈ，ｍ）、２．４５（３Ｈ，ｓ）、２．３２（２Ｈ，ｔ）、２．２２（１Ｈ，ｍ）、２．０２（２Ｈ，ｍ）、１．９７（２Ｈ，ｍ）、１．６１（２Ｈ，ｍ）、１．５０（３Ｈ，ｍ）、１．２７（４９Ｈ，ｍ）、０．８８（１２Ｈ，ｍ）
　後述するように、上記式（２８）で表される化合物で脂質複合体を形成すると、一定期間保管した場合の脂質複合体の粒子径の増大が抑制されており、安定性が高い。
［実施例２２］
（１－（（３，４－ジプロピルヘプチル）オキシ）－１－オキソイコサン－１０－イル－１－メチルピペリジン－４－カルボキシレート（以下、「ＹＳ－１２６」という場合がある。）の合成）
　第８工程において、２－ブチルオクタン－１－オールの代わりに３，４－ジプロピルヘプタン－１－オールを反応させた以外は実施例１６と同様にして、下記式（２９）で表されるＹＳ－１２６を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000065
　ＥＳＩ－ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）　ｃａｃｌｄ　６３５．６、ｆｏｕｎｄ　６３６．７、１Ｈ　ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ４．８７（１Ｈ，ｔｔ）、４．０６（２Ｈ，ｍ）、３．００（２Ｈ，ｍ）、２．４５（５Ｈ，ｍ）、２．２７（２Ｈ，ｔ）、２．０２（２Ｈ，ｍ）、１．９７（２Ｈ，ｍ）、１．６１（２Ｈ，ｍ）、１．５０（３Ｈ，ｍ）、１．４３（２Ｈ，ｍ）、１．２７（４２Ｈ，ｍ）、０．８８（１２Ｈ，ｍ）
　後述するように、上記式（２９）で表される化合物で脂質複合体を形成すると、一定期間保管した場合の脂質複合体の粒子径の増大が抑制されており、安定性が高い。
［実施例２３］
（１－（４－（ヘキシルジスルファニル）－３－（（ヘキシルジスルファニル）メチル）ブトキシ）－１－オキソイコサン－１０－イル－１－メチルピペリジン－４－カルボキシレート（以下、「ＹＳ－１２７」という場合がある。）の合成）
　第８工程において、２－ブチルオクタン－１－オールの代わりに４－（ヘキシルジスルファニル）－３－（（ヘキシルジスルファニル）メチル）ブタン－１－オールを反応させた以外は実施例１６と同様にして、下記式（３０）で表されるＹＳ－１２７を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000066
　ＥＳＩ－ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）　ｃａｃｌｄ　８１９．５、ｆｏｕｎｄ　８２０．６、１Ｈ　ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ４．８６（１Ｈ，ｔｔ）、４．１３（２Ｈ，ｔ）、２．８１（６Ｈ，ｄ）、２．６７（２Ｈ，ｔ）、２．２９（３Ｈ，ｔ）、２．２７（３Ｈ，ｓ）、１．９９（２Ｈ，ｍ）、１．９０（２Ｈ，ｄｄ）、１．７９（２Ｈ，ｄｔ）、１．６８（１２Ｈ，ｍ）、１．５０（６Ｈ，ｍ）、１．４２（６Ｈ，ｍ）、１．２４（２９Ｈ，ｍ）、０．８８（９Ｈ，ｍ）
［実施例２４］
（１－（（６－（ブチルジスルファニル）－３－（３－（ブチルジスルファニル）プロピル）ヘキシル）オキシ）－１－オキソイコサン－１０－イル－１－メチルピペリジン－４－カルボキシレート（以下、「ＹＳ－１２８」という場合がある。）の合成）
　第８工程において、２－ブチルオクタン－１－オールの代わりに６－（ブチルジスルファニル）－３－（３－（ブチルジスルファニル）プロピル）ヘキサン－１－オールを反応させた以外は実施例１６と同様にして、下記式（３１）で表されるＹＳ－１２８を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000067
　ＥＳＩ－ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）　ｃａｃｌｄ　８１９．５、ｆｏｕｎｄ　８２１．０、１Ｈ　ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ４．８６（１Ｈ，ｔｔ）、４．０８（２Ｈ，ｔ）、２．８１（２Ｈ，ｄ）、２．６７（８Ｈ，ｄｄ）、２．２９（３Ｈ，ｔ）、２．２７（３Ｈ，ｓ）、１．９９（２Ｈ，ｍ）、１．９０（２Ｈ，ｄｄ）、１．７９（２Ｈ，ｄｔ）、１．６８（１２Ｈ，ｍ）、１．５０（６Ｈ，ｍ）、１．４２（６Ｈ，ｍ）、１．２４（３７Ｈ，ｍ）、０．９２－０．８８（９Ｈ，ｍ）
［実施例２５］
（１－（（２－ブチルオクチル）オキシ）－１－オキソイコサン－１０－イル－１－メチルピロリジン－３－カルボキシレート（以下、「ＹＳ－１２９」という場合がある。）の合成）
　第６工程において、１－メチルピぺリジン－４－カルボン酸の代わりに１－メチルピロリジン－３－カルボン酸を反応させた以外は実施例１６と同様にして、下記式（３２）で表されるＹＳ－１２９を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000068
　ＥＳＩ－ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）　ｃａｃｌｄ　６０７．６、ｆｏｕｎｄ　６０８．８、１Ｈ　ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ４．８６（１Ｈ，ｔｔ）、３．９８（２Ｈ，ｄ）、３．０５（１Ｈ，ｔｔ）、２．８６（１Ｈ，ｔｔ）、２．６７（２Ｈ，ｍ）、２．４９（１Ｈ，ｔｔ）、２．３５（３Ｈ，ｓ）、２．２９（２Ｈ，ｔ）、２．１７（２Ｈ，ｍ）、１．７２（２Ｈ，ｓ）、１．６０（３Ｈ，ｍ）、１．５０（４Ｈ，ｍ）、１．２４（４４Ｈ，ｍ）、０．９２－０．８８（９Ｈ，ｍ）
［実施例２６］
（１－（（２－ブチルオクチル）オキシ）－１－オキソイコサン－１０－イル－１－メチルアゼチジン－３－カルボキシレート（以下、「ＹＳ－１３１」という場合がある。）の合成）
　第６工程において、１－メチルピぺリジン－４－カルボン酸の代わりに１－メチルアザチジン－３－カルボン酸を反応させた以外は実施例１６と同様にして、下記式（３３）で表されるＹＳ－１３１を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000069
　ＥＳＩ－ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）　ｃａｃｌｄ　５９３．４、ｆｏｕｎｄ　５９４．７、１Ｈ　ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ４．８７（１Ｈ，ｔｔ）、３．９６（２Ｈ，ｄ）、３．５７（２Ｈ，ｄ）、３．２５（２Ｈ，ｄ）、３．２３（１Ｈ，ｔｔ）、２．３２（３Ｈ，ｓ）、２．２９（２Ｈ，ｔ）、２．０３（２Ｈ，ｍ）、１．６１（４Ｈ，ｍ）、１．４９（４Ｈ，ｍ）、１．２７－１．２１（４１Ｈ，ｍ）、０．８７（９Ｈ，ｍ）
［実施例２７］
（１－（（２－ブチルオクチル）オキシ）－１－オキソイコサン－１０－イル－１－エチルピペリジン－４－カルボキシレート（以下、「ＹＳ－１３２」という場合がある。）の合成）
　第６工程において、１－メチルピぺリジン－４－カルボン酸の代わりに１－エチルピペリジン－４－カルボン酸を反応させた以外は実施例１６と同様にして、下記式（３４）で表されるＹＳ－１３２を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000070
　ＥＳＩ－ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）　ｃａｃｌｄ　６３６．０、ｆｏｕｎｄ　６３６．７、１Ｈ　ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ４．８７（１Ｈ，ｄｄｄ）、３．９６（２Ｈ，ｄ）、２．９１（２Ｈ，ｄ）、２．４０（２Ｈ，ｄｄ）、２．２９（４Ｈ，ｍ）、２．０３－１．９３（４Ｈ，ｍ）、１．８０（２Ｈ，ｍ）、１．６１（４Ｈ，ｍ）、１．４９（４Ｈ，ｍ）、１．２７－１．２１（４１Ｈ，ｍ）、１．０８（４Ｈ，ｔ）、０．８７（９Ｈ，ｍ）
［実施例２８］
（２－ブチルオクチル－１０－（（４－（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）イコサノエート（以下、「ＹＳ－１３３」という場合がある。）の合成）
　第６工程において、１－メチルピぺリジン－４－カルボン酸の代わりに４－（ジメチルアミノ）ブタン酸を反応させた以外は実施例１６と同様にして、下記式（３５）で表されるＹＳ－１３３を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000071
　ＥＳＩ－ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）　ｃａｃｌｄ　６０９．６、ｆｏｕｎｄ　６１０．７、１Ｈ　ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ４．８６（１Ｈ，ｔｔ）、３．９６（２Ｈ，ｄ）、２．３３－２．２６（６Ｈ，ｍ）、２．２１（６Ｈ，ｓ）、２．０３（２Ｈ，ｍ）、１．８０（２Ｈ，ｍ）、１．６１（４Ｈ，ｍ）、１．４９（４Ｈ，ｍ）、１．２７－１．２１（４１Ｈ，ｍ）、０．８７（９Ｈ，ｍ）
＜組成物の調製（１）＞
［実施例２９］
（ＹＳ－１０２）
　実施例１のカチオン性脂質（ＹＳ－１０２）を用いて組成物を調製した。核酸としては、センス鎖５’－ＧＧＡｆＵｆＣＡｆＵｆＣｆＵｆＣＡＡＧｆＵｆＣｆＵｆＵＡｆＣＴ＊Ｔ－３’（配列番号１、Ｔ：ＤＮＡ、ｆＵ，ｆＣ＝２’－Ｆｌｕｏｒｏ　ＲＮＡ、＊＝Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ　ｌｉｎｋａｇｅ）、アンチセンス鎖５’－ＧｆＵＡＡＧＡｆＣｆＵｆＵＧＡＧＡｆＵＧＡｆＵｆＣｆＣＴ＊Ｔ－３’（配列番号２、Ｔ：ＤＮＡ、ｆＵ，ｆＣ＝２’－Ｆｌｕｏｒｏ　ＲＮＡ、＊＝Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ　ｌｉｎｋａｇｅ）の塩基配列からなる、Ｆａｃｔｏｒ　ＶＩＩ（血液凝固第ＶＩＩ因子）遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡであり、アニーリング済みのもの（株式会社ジーンデザイン、以下「Ｆａｃｔｏｒ　ＶＩＩ　ｓｉＲＮＡ」という場合がある。）を使用した。
　Ｆａｃｔｏｒ　ＶＩＩ　ｓｉＲＮＡを２５ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）で２１６μｇ／ｍＬに溶解し、ｓｉＲＮＡ希釈液とした。また、カチオン性脂質（ＹＳ－１０２）、ＤＳＰＣ（日本精化株式会社）、Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ（日本精化株式会社）、ＭＰＥＧ２０００－ＤＭＧ（日油株式会社）を６０／８．５／３０／１．５（モル比）の割合で総脂質濃度１５ｍＭとなるようにエタノールに溶解し、脂質溶液とした。ｓｉＲＮＡ希釈液と脂質溶液とを、それぞれ２．４ｍＬ／分、１．２９ｍＬ／分の流速で混合し、更に２５ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）を９．２５ｍＬ／分の流速で混合することにより、脂質複合体水溶液を得た。得られた脂質複合体水溶液を、透析膜（商品名「Ｆｌｏａｔ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ　Ｇ２」、ＳＰＥＣＴＲＵＭ社、５０Ｋ　ＭＷＣＯ）を用いた透析に供し、外液をリン酸緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．５）に置換した。透析後、濃縮及び濾過滅菌を行い、実施例２９の組成物を得た。
［実施例３０］
（ＹＳ－１０１）
　カチオン性脂質として、ＹＳ－１０２の代わりに実施例２のカチオン性脂質（ＹＳ－１０１）を用いた以外は実施例２９と同様にして、実施例３０の組成物を得た。
［実施例３１］
（ＹＳ－１０３）
　カチオン性脂質として、ＹＳ－１０２の代わりに実施例３のカチオン性脂質（ＹＳ－１０３）を用いた以外は実施例２９と同様にして、実施例３１の組成物を得た。
［参考例１］
（ＹＳ－０２１）
　カチオン性脂質として、ＹＳ－１０２の代わりに下記式（３６）で表される１－（２－オクチルシクロプロピル）ヘプタデカン－８－イル－１－メチルピペリジン－４－カルボキシレート（以下、「ＹＳ－０２１」という場合がある。）を用いた以外は実施例２９と同様にして、参考例１の組成物を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000072
＜組成物の解析（１）＞
　実施例２９～３１及び参考例１の組成物について、脂質複合体へのｓｉＲＮＡの封入率を測定した。
　具体的には、組成物をＲＮａｓｅ　Ｆｒｅｅ　Ｗａｔｅｒで希釈し、Ｑｕａｎｔ－ｉＴ　ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ　ＲＮＡ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用して測定したｓｉＲＮＡ濃度（Ａ）を、脂質複合体外液に存在するｓｉＲＮＡとした。また、組成物を１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００で希釈して測定したｓｉＲＮＡ濃度（Ｂ）を組成物中の全ｓｉＲＮＡ濃度とした。続いて、次式（Ｆ１）により、核酸の封入率を算出した。
　封入率（％）＝１００－（Ａ／Ｂ）×１００　（Ｆ１）
　また、粒子径測定装置（商品名「Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ　Ｎａｎｏ　ＺＳ」、Ｍａｌｖｅｒｎ社製）で脂質複合体の平均粒子径を測定した。
　表１に、ｓｉＲＮＡの封入率及び脂質複合体の平均粒子径（Ｚ－平均）を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000073
＜組成物の調製（２）＞
［実施例３２］
（ＹＳ－１１１）
　実施例５のカチオン性脂質（ＹＳ－１１１）を用いて組成物を調製した。核酸としては、実施例２９の組成物で用いたものと同じＦａｃｔｏｒ　ＶＩＩ　ｓｉＲＮＡを使用した。
　Ｆａｃｔｏｒ　ＶＩＩ　ｓｉＲＮＡを２５ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）で１８１μｇ／ｍＬに溶解し、ｓｉＲＮＡ希釈液とした。また、カチオン性脂質（ＹＳ－１１１）、ＤＳＰＣ（日本精化株式会社）、Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ（日本精化株式会社）、ＭＰＥＧ２０００－ＤＭＧ（日油株式会社）を６０／８．５／３０／１．５（モル比）の割合で総脂質濃度１０ｍＭとなるようにエタノールに溶解し、脂質溶液とした。ｓｉＲＮＡ希釈液と脂質溶液とを、それぞれ２．４ｍＬ／分、１．２９ｍＬ／分の流速で混合し、更に２５ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）を５．０ｍＬ／分の流速で混合することにより、脂質複合体水溶液を得た。得られた脂質複合体水溶液を、透析膜（商品名「Ｆｌｏａｔ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ　Ｇ２」、ＳＰＥＣＴＲＵＭ社、５０Ｋ　ＭＷＣＯ）を用いた透析に供し、外液をリン酸緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．５）に置換した。透析後、濃縮及び濾過滅菌を行い、実施例３２の組成物を得た。
［実施例３３］
（ＹＳ－１１２）
　カチオン性脂質として、ＹＳ－１１１の代わりに実施例６のカチオン性脂質（ＹＳ－１１２）を用いた以外は実施例３２と同様にして、実施例３３の組成物を得た。
［実施例３４］
（ＹＳ－１１３）
　カチオン性脂質として、ＹＳ－１１１の代わりに実施例７のカチオン性脂質（ＹＳ－１１３）を用いた以外は実施例３２と同様にして、実施例３４の組成物を得た。
［実施例３５］
（ＹＳ－１１４）
　カチオン性脂質として、ＹＳ－１１１の代わりに実施例８のカチオン性脂質（ＹＳ－１１４）を用いた以外は実施例３２と同様にして、実施例３５の組成物を得た。
［実施例３６］
（ＹＳ－１１５）
　カチオン性脂質として、ＹＳ－１１１の代わりに実施例９のカチオン性脂質（ＹＳ－１１５）を用いた以外は実施例３２と同様にして、実施例３６の組成物を得た。
［実施例３７］
（ＹＳ－１１６）
　カチオン性脂質として、ＹＳ－１１１の代わりに実施例１０のカチオン性脂質（ＹＳ－１１６）を用いた以外は実施例３２と同様にして、実施例３６の組成物を得た。
［比較例１］
（ＡＬＮ－３１９）
　カチオン性脂質として、ＹＳ－１１１の代わりに、特許文献１に記載された下記式（３２）で表されるジ（（Ｚ）－ノン－２－エン－１－イル）９－（（４－（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（以下、「ＡＬＮ－３１９」という場合がある。）を、特許文献１に記載された方法にしたがって合成して用いた以外は実施例３２と同様にして、比較例１の組成物を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000074
＜組成物の解析（２）＞
　実施例２９の組成物と同様にして、実施例３２～３７及び比較例１の組成物について、脂質複合体へのｓｉＲＮＡの封入率、及び脂質複合体の平均粒子径を測定した。表２に、ｓｉＲＮＡの封入率及び脂質複合体の平均粒子径（Ｚ－平均）を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000075
＜組成物の調製（３）＞
［実施例３８］
（ＹＳ－１１７）
　実施例１１のカチオン性脂質（ＹＳ－１１７）を用いて組成物を調製した。核酸としては、実施例２９の組成物で用いたものと同じＦａｃｔｏｒ　ＶＩＩ　ｓｉＲＮＡを使用した。
　Ｆａｃｔｏｒ　ＶＩＩ　ｓｉＲＮＡを２５ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）で１０８μｇ／ｍＬに溶解し、ｓｉＲＮＡ希釈液とした。また、カチオン性脂質（ＹＳ－１１１）、ＤＳＰＣ（日本精化株式会社）、Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ（日本精化株式会社）、ＭＰＥＧ２０００－ＤＭＧ（日油株式会社）を６０／８．５／３０／１．５（モル比）の割合で総脂質濃度６ｍＭとなるようにエタノールに溶解し、脂質溶液とした。ｓｉＲＮＡ希釈液と脂質溶液とを、それぞれ２．４ｍＬ／分、１．２９ｍＬ／分の流速で混合し、更に２５ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）を９．２５ｍＬ／分の流速で混合することにより、脂質複合体水溶液を得た。得られた脂質複合体水溶液を、透析膜（商品名「Ｆｌｏａｔ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ　Ｇ２」、ＳＰＥＣＴＲＵＭ社、５０Ｋ　ＭＷＣＯ）を用いた透析に供し、外液をリン酸緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．５）に置換した。透析後、濃縮及び濾過滅菌を行い、実施例３８の組成物を得た。
［実施例３９］
（ＹＳ－１１７Ｓ）
　カチオン性脂質として、ＹＳ－１１７の代わりに実施例１２のカチオン性脂質（ＹＳ－１１７Ｓ）を用いた以外は実施例３８と同様にして、実施例３９の組成物を得た。
［実施例４０］
（ＹＳ－１１８）
　カチオン性脂質として、ＹＳ－１１７の代わりに実施例１３のカチオン性脂質（ＹＳ－１１８）を用いた以外は実施例３８と同様にして、実施例４０の組成物を得た。
［実施例４１］
（ＹＳ－１１８Ｓ）
　カチオン性脂質として、ＹＳ－１１７の代わりに実施例１４のカチオン性脂質（ＹＳ－１１８Ｓ）を用いた以外は実施例３８と同様にして、実施例４１の組成物を得た。
［実施例４２］
（ＹＳ－１１９）
　カチオン性脂質として、ＹＳ－１１７の代わりに実施例４のカチオン性脂質（ＹＳ－１１９）を用いた以外は実施例３８と同様にして、実施例４２の組成物を得た。
＜組成物の解析（３）＞
　　実施例２９の組成物と同様にして、実施例３８～４２の組成物について、脂質複合体へのｓｉＲＮＡの封入率、及び脂質複合体の平均粒子径を測定した。表３に、ｓｉＲＮＡの封入率及び脂質複合体の平均粒子径（Ｚ－平均）を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000076
＜組成物の調製（４）＞
［実施例４３］
（ＹＳ－１１９）
　実施例４のカチオン性脂質（ＹＳ－１１９）を用いて組成物を調製した。核酸としては、実施例２９の組成物で用いたものと同じＦａｃｔｏｒ　ＶＩＩ　ｓｉＲＮＡを使用した。
　Ｆａｃｔｏｒ　ＶＩＩ　ｓｉＲＮＡを２５ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）で１０８μｇ／ｍＬに溶解し、ｓｉＲＮＡ希釈液とした。また、カチオン性脂質（ＹＳ－１１９）、ＤＳＰＣ（日本精化株式会社）、Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ（日本精化株式会社）、ＭＰＥＧ２０００－ＤＭＧ（日油株式会社）を６０／８．５／３０／１．５（モル比）の割合で総脂質濃度６ｍＭとなるようにエタノールに溶解し、脂質溶液とした。ｓｉＲＮＡ希釈液と脂質溶液とを、それぞれ１．８０ｍＬ／分、０．９７ｍＬ／分の流速で混合し、更に２５ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）を６．９４ｍＬ／分の流速で混合することにより、脂質複合体水溶液を得た。得られた脂質複合体水溶液を、透析膜（商品名「Ｆｌｏａｔ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ　Ｇ２」、ＳＰＥＣＴＲＵＭ社、５０Ｋ　ＭＷＣＯ）を用いた透析に供し、外液をリン酸緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．５）に置換した。透析後、濃縮及び濾過滅菌を行い、実施例４３の組成物を得た。
［比較例２］
（ＡＬＮ－３１９）
　カチオン性脂質として、ＹＳ－１１９の代わりに、上述したＡＬＮ－３１９を用いた以外は実施例４３と同様にして、比較例２の組成物を得た。
＜組成物の解析（４）＞
　実施例２９の組成物と同様にして、実施例４３及び比較例２の組成物について、脂質複合体へのｓｉＲＮＡの封入率、及び脂質複合体の平均粒子径（Ｚ－平均）を測定した。表４に、ｓｉＲＮＡの封入率及び脂質複合体の平均粒子径を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000077
＜組成物の調製（５）＞
［実施例４４］
（ＹＳ－１１９）
　実施例４のカチオン性脂質（ＹＳ－１１９）を用いて組成物を調製した。核酸としては、実施例２９の組成物で用いたものと同じＦａｃｔｏｒ　ＶＩＩ　ｓｉＲＮＡを使用した。
　Ｆａｃｔｏｒ　ＶＩＩ　ｓｉＲＮＡを２５ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）で２１６μｇ／ｍＬに溶解し、ｓｉＲＮＡ希釈液とした。また、カチオン性脂質（ＹＳ－１１９）、Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ（日本精化株式会社）、ＭＰＥＧ２０００－ＤＰＧ（日油株式会社）を６０／３８．５／１．５（モル比）の割合で総脂質濃度６ｍＭとなるようにエタノールに溶解し、脂質溶液とした。ｓｉＲＮＡ希釈液と脂質溶液とを、それぞれ３．３６ｍＬ／分、１．８１ｍＬ／分の流速で混合し、更に２５ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）を１２．９５ｍＬ／分の流速で混合することにより、脂質複合体水溶液を得た。得られた脂質複合体水溶液を、透析膜（商品名「Ｆｌｏａｔ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ　Ｇ２」、ＳＰＥＣＴＲＵＭ社、５０Ｋ　ＭＷＣＯ）を用いた透析に供し、外液をリン酸緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．５）に置換した。透析後、濃縮及び濾過滅菌を行い、実施例４４の組成物を得た。
［実施例４５］
（ＹＳ－１２０）
　カチオン性脂質として、ＹＳ－１１９の代わりに、実施例１５のカチオン性脂質（ＹＳ－１２０）を用いた以外は実施例４４と同様にして、実施例４５の組成物を得た。
＜組成物の解析（５）＞
　実施例２９の組成物と同様にして、実施例４４及び４５の組成物について、脂質複合体へのｓｉＲＮＡの封入率、及び脂質複合体の平均粒子径（Ｚ－平均）を測定した。表５に、ｓｉＲＮＡの封入率及び脂質複合体の平均粒子径を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000078
＜組成物の調製（６）＞
［実施例４６］
（ＹＳ－１２０）
　実施例１６のカチオン性脂質（ＹＳ－１２０）を用いて組成物を調製した。核酸としては、実施例２９の組成物で用いたものと同じＦａｃｔｏｒ　ＶＩＩ　ｓｉＲＮＡを使用した。
　Ｆａｃｔｏｒ　ＶＩＩ　ｓｉＲＮＡを２５ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）で４５０μｇ／ｍＬに溶解し、ｓｉＲＮＡ希釈液とした。また、カチオン性脂質（ＹＳ－１２０）、ＤＳＰＣ（日本精化株式会社）、Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ（日本精化株式会社）、ＭＰＥＧ２０００－ＤＭＧ（日油株式会社）を６０／８．５／３０／１．５（モル比）の割合で総脂質濃度４０ｍＭとなるようにエタノールに溶解し、脂質溶液とした。ｓｉＲＮＡに対する脂質の比を質量比０．０６とし、ｓｉＲＮＡ希釈液と脂質溶液とを、それぞれ４．０ｍＬ／分、１．３ｍＬ／分の流速で混合することにより、脂質複合体水溶液を得た。得られた脂質複合体水溶液を、透析膜（商品名「Ｆｌｏａｔ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ　Ｇ２」、ＳＰＥＣＴＲＵＭ社、５０Ｋ　ＭＷＣＯ）を用いた透析に供し、外液をリン酸緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）に置換した。透析後、濃縮及び濾過滅菌を行い、実施例４６の組成物を得た。
［実施例４７］
（ＹＳ－１２１）
　カチオン性脂質として、ＹＳ－１２０の代わりに、実施例１７のカチオン性脂質（ＹＳ－１２１）を用いた以外は実施例４６と同様にして、実施例４７の組成物を得た。
［実施例４８］
（ＹＳ－１２２）
　カチオン性脂質として、ＹＳ－１２０の代わりに、実施例１８のカチオン性脂質（ＹＳ－１２２）を用いた以外は実施例４６と同様にして、実施例４８の組成物を得た。
［実施例４９］
（ＹＳ－１２３）
　カチオン性脂質として、ＹＳ－１２０の代わりに、実施例１９のカチオン性脂質（ＹＳ－１２３）を用いた以外は実施例４６と同様にして、実施例４９の組成物を得た。
［実施例５０］
（ＹＳ－１２４）
　カチオン性脂質として、ＹＳ－１２０の代わりに、実施例２０のカチオン性脂質（ＹＳ－１２４）を用いた以外は実施例４６と同様にして、実施例５０の組成物を得た。
［実施例５１］
（ＹＳ－１２５）
　カチオン性脂質として、ＹＳ－１２０の代わりに、実施例２１のカチオン性脂質（ＹＳ－１２５）を用いた以外は実施例４６と同様にして、実施例５１の組成物を得た。
［実施例５２］
（ＹＳ－１２６）
　カチオン性脂質として、ＹＳ－１２０の代わりに、実施例２２のカチオン性脂質（ＹＳ－１２６）を用いた以外は実施例４６と同様にして、実施例５２の組成物を得た。
＜組成物の解析（６）＞
　実施例２９の組成物と同様にして、実施例４６～５２の組成物について、脂質複合体へのｓｉＲＮＡの封入率、及び脂質複合体の平均粒子径（Ｚ－平均）を測定した。表６に、ｓｉＲＮＡの封入率及び脂質複合体の平均粒子径を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000079
＜組成物の解析（７）＞
　実施例４６～５２の組成物について、密閉したバイアルにて４℃で保管し、保管前、保管後３ヶ月目、及び６ヶ月目の粒子径（Ｚ－平均及び多分散指数）を実施例２９の組成物と同様にして測定した。
　表７に、実施例４６～５２の組成物の平均粒子径の経時変化及び保管６ヶ月目と保管前の粒子径変化(d)を示す。ＹＳ－１２１以外のカチオン性脂質を含む組成物は、保管期間中、脂質複合体の粒子径の増大が抑制されることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000080
＜組成物の調製（７）＞
［実施例５３］
（ＹＳ－１２０）
　「組成物の調製（６）」と同様にして、実施例１６のカチオン性脂質（ＹＳ－１２０）を用いて組成物を調製した。
［実施例５４］
（ＹＳ－１２４）
　カチオン性脂質として、ＹＳ－１２０の代わりに、実施例２３のカチオン性脂質（ＹＳ－１２７）を用いた以外は実施例５３と同様にして、実施例５４の組成物を得た。
［比較例３］
（ＡＬＮ－３１９）
　カチオン性脂質として、ＹＳ－１２０の代わりに、上述したＡＬＮ－３１９を用いた以外は実施例５３と同様にして、比較例３の組成物を得た。
＜組成物の解析（８）＞
　実施例２９の組成物と同様にして、実施例５３、５４、及び比較例３の組成物について、脂質複合体へのｓｉＲＮＡの封入率、及び脂質複合体の平均粒子径（Ｚ－平均）を測定した。表８に、ｓｉＲＮＡの封入率及び脂質複合体の平均粒子径を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000081
＜組成物の解析（９）＞
　実施例５３、５４、及び比較例３の組成物について、各組成物の調製においてｓｉＲＮＡ希釈液と脂質溶液との混合により脂質複合体が生じた直後、該脂質複合体をＰＢＳに透析した後、密閉したバイアルにて４℃で保管後２ヶ月目、及び６ヶ月目の粒子径（Ｚ－平均及び多分散指数）を粒子径測定装置（商品名「Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ　Ｎａｎｏ　ＺＳ」、Ｍａｌｖｅｒｎ社製）により測定した。
　表９に、実施例５３、５４、及び比較例３の組成物の平均粒子径の経時変化及び保管６ヶ月目と混合直後の粒子径変化（ｄ）を示す。ＹＳ－１２０またはＹＳ－１２４のカチオン性脂質を含む組成物は、比較例３の組成物に比べて、保管期間中、脂質複合体の粒子径の増大が抑制されることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000082
＜組成物の調製（８）＞
［実施例５５］
（ＹＳ－１２０）
　「組成物の調製（６）」と同様にして、実施例１６のカチオン性脂質（ＹＳ－１２０）を用いて組成物を調製した。
［実施例５６］
（ＹＳ－１２７）
　カチオン性脂質として、ＹＳ－１２０の代わりに、実施例２３のカチオン性脂質（ＹＳ－１２７）を用いた以外は実施例５５と同様にして、実施例５６の組成物を得た。
［実施例５７］
（ＹＳ－１２８）
　カチオン性脂質として、ＹＳ－１２０の代わりに、実施例２４のカチオン性脂質（ＹＳ－１２８）を用いた以外は実施例５５と同様にして、実施例５７の組成物を得た。
［実施例５８］
（ＹＳ－１２９）
　カチオン性脂質として、ＹＳ－１２０の代わりに、実施例２５のカチオン性脂質（ＹＳ－１２９）を用いた以外は実施例５５と同様にして、実施例５８の組成物を得た。
＜組成物の解析（１０）＞
　実施例２９の組成物と同様にして、実施例５５～５８の組成物について、脂質複合体へのｓｉＲＮＡの封入率、及び脂質複合体の平均粒子径（Ｚ－平均）を測定した。表１０に、ｓｉＲＮＡの封入率及び脂質複合体の平均粒子径を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000083
＜組成物の調製（９）＞
［実施例５９］
（ＹＳ－１０１）
　「組成物の調製（６）」と同様にして、実施例２のカチオン性脂質（ＹＳ－１０１）を用いて組成物を調製した。
［実施例６０］
（ＹＳ－１３１）
　カチオン性脂質として、ＹＳ－１０１の代わりに、実施例２６のカチオン性脂質（ＹＳ－１３１）を用いた以外は実施例５９と同様にして、実施例６０の組成物を得た。
［実施例６１］
（ＹＳ－１３２）
　カチオン性脂質として、ＹＳ－１０１の代わりに、実施例２７のカチオン性脂質（ＹＳ－１３２）を用いた以外は実施例５９と同様にして、実施例６１の組成物を得た。
［実施例６２］
（ＹＳ－１３３）
　カチオン性脂質として、ＹＳ－１０１の代わりに、実施例２８のカチオン性脂質（ＹＳ－１３３）を用いた以外は実施例５９と同様にして、実施例６２の組成物を得た。
［実施例６３］
（ＹＳ－１２０）
　カチオン性脂質として、ＹＳ－１０１の代わりに、実施例１６のカチオン性脂質（ＹＳ－１２０）を用いた以外は実施例５９と同様にして、実施例６３の組成物を得た。
［比較例４］
（ＡＬＮ－３１９）
　カチオン性脂質として、ＹＳ－１０１の代わりに、上述したＡＬＮ－３１９を用いた以外は実施例５９と同様にして、比較例４の組成物を得た。
＜組成物の解析（１１）＞
　実施例２９の組成物と同様にして、実施例５９～６３、及び比較例４の組成物について、脂質複合体へのｓｉＲＮＡの封入率、及び脂質複合体の平均粒子径（Ｚ－平均）を測定した。表１１に、ｓｉＲＮＡの封入率及び脂質複合体の平均粒子径を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000084
＜動物実験（１）＞
　実施例２９～３１及び参考例１の組成物を、脂質複合体に封入されたＦａｃｔｏｒ　ＶＩＩ　ｓｉＲＮＡ濃度が１０μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳで希釈した。各組成物を、Ｃ５７／ＢＬ６マウス（５週齢、オス）に１０ｍＬ／ｋｇの投与容量で尾静脈内投与し、投与から２４時間後に麻酔下で採血及び肝臓の採取を実施した。遠心により血液から血漿を分離し、血漿中のＦａｃｔｏｒ　ＶＩＩタンパク質濃度を市販のキット（商品名「ＢＩＯＰＨＥＮ　ＦＶＩＩ」、ＨＹＰＨＥＮ　ＢｉｏＭｅｄ社）により定量した。陰性対照として、ＰＢＳを投与した群に同様の処理を行った。
　ＰＢＳ投与群のＦａｃｔｏｒ　ＶＩＩタンパク質濃度を１００％とし、組成物投与群のＦａｃｔｏｒ　ＶＩＩタンパク質濃度を相対値として算出した。また、肝臓をホモジナイズし、メタノールで組成物構成脂質を抽出後、ＬＣ－ＭＳによりカチオン性脂質を定量した。投与したカチオン性脂質の量を１００％とし、肝臓に残存していたカチオン性脂質の量を相対値として算出した。結果を表１２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000085
＜動物実験（２）＞
　実施例３２～３７及び比較例１の組成物を「動物実験（１）」と同様にしてＣ５７／ＢＬ６マウス（５週齢、オス）に投与し、投与から２４時間後の血漿中のＦａｃｔｏｒ　ＶＩＩタンパク質濃度の相対値及び肝臓に残存していたカチオン性脂質量の相対値を算出した。結果を表１３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000086
＜動物実験（３）＞
　実施例３８～４２の組成物を「動物実験（１）」と同様にしてＣ５７／ＢＬ６マウス（５週齢、オス）に投与し、投与から２４時間後の血漿中のＦａｃｔｏｒ　ＶＩＩタンパク質濃度の相対値及び肝臓に残存していたカチオン性脂質量の相対値を算出した。結果を表１４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000087
＜動物実験（４）＞
　実施例４３及び比較例２の組成物を、脂質複合体に封入されたＦａｃｔｏｒ　ＶＩＩ　ｓｉＲＮＡ濃度が１μｇ／ｍＬ又は５μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳで希釈した。各組成物を、Ｃ５７／ＢＬ６マウス（５週齢、オス）に１０ｍＬ／ｋｇの投与容量で尾静脈内投与し、投与から２４時間後に麻酔下で採血及び肝臓の採取を実施した。遠心により血液から血漿を分離し、血漿中のＦａｃｔｏｒ　ＶＩＩタンパク質濃度を市販のキット（商品名「ＢＩＯＰＨＥＮ　ＦＶＩＩ」、ＨＹＰＨＥＮ　ＢｉｏＭｅｄ社）により定量した。陰性対照として、ＰＢＳを投与した群に同様の処理を行った。
　ＰＢＳ投与群のＦａｃｔｏｒ　ＶＩＩタンパク質濃度を１００％とし、組成物投与群のＦａｃｔｏｒ　ＶＩＩタンパク質濃度を相対値として算出した。結果を表１５及び図１に示す。実施例４３の組成物は、比較例２の組成物よりもＦａｃｔｏｒ　ＶＩＩタンパク質の発現抑制効果が高いことが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000088
＜動物実験（５）＞
　実施例４４及び４５の組成物を、脂質複合体に封入されたＦａｃｔｏｒ　ＶＩＩ　ｓｉＲＮＡ濃度が１μｇ／ｍＬ又は５μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳで希釈した。各組成物を、Ｃ５７／ＢＬ６マウス（５週齢、オス）に１０ｍＬ／ｋｇの投与容量で尾静脈内投与し、投与から２４時間後に麻酔下で採血及び肝臓の採取を実施した。遠心により血液から血漿を分離し、血漿中のＦａｃｔｏｒ　ＶＩＩタンパク質濃度を市販のキット（商品名「ＢＩＯＰＨＥＮ　ＦＶＩＩ」、ＨＹＰＨＥＮ　ＢｉｏＭｅｄ社）により定量した。陰性対照として、ＰＢＳを投与した群に同様の処理を行った。
　ＰＢＳ投与群のＦａｃｔｏｒ　ＶＩＩタンパク質濃度を１００％とし、組成物投与群のＦａｃｔｏｒ　ＶＩＩタンパク質濃度を相対値として算出した。結果を表１６及び図２に示す。実施例４４及び４５の組成物は、いずれも、Ｆａｃｔｏｒ　ＶＩＩタンパク質の高い発現抑制効果を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000089
＜動物実験（６）＞
　実施例４６～５２の組成物を「動物実験（５）」と同様にしてＣ５７／ＢＬ６マウス（５週齢、オス）に投与し、投与から２４時間後の血漿中のＦａｃｔｏｒ　ＶＩＩタンパク質濃度の相対値を算出した。結果を表１７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000090
＜動物実験（７）＞
　実施例５３、５４、及び比較例３の組成物を、脂質複合体に封入されたＦａｃｔｏｒ　ＶＩＩ　ｓｉＲＮＡ濃度が２μｇ／ｍＬ又は１０μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳで希釈した。各組成物を、ＩＣＲマウス（６週齢、メス）に１０ｍＬ／ｋｇの投与容量で尾静脈内投与し、投与から２４時間後に麻酔下で採血及び肝臓の採取を実施した。遠心により血液から血漿を分離し、血漿中のＦａｃｔｏｒ　ＶＩＩタンパク質濃度を市販のキット（商品名「ＢＩＯＰＨＥＮ　ＦＶＩＩ」、ＨＹＰＨＥＮ　ＢｉｏＭｅｄ社）により定量した。陰性対照として、ＰＢＳを投与した群に同様の処理を行った。
　ＰＢＳ投与群のＦａｃｔｏｒ　ＶＩＩタンパク質濃度を１００％とし、組成物投与群のＦａｃｔｏｒ　ＶＩＩタンパク質濃度を相対値として算出した。結果を表１８に示す。実施例５３及び５４の組成物は、比較例３の組成物に比べて、Ｆａｃｔｏｒ　ＶＩＩタンパク質の高い発現抑制効果を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000091
＜動物実験（８）＞
　実施例５５～５８の組成物を「動物実験（７）」と同様にしてＩＣＲマウス（６週齢、メス）に投与し、投与から２４時間後の血漿中のＦａｃｔｏｒ　ＶＩＩタンパク質濃度の相対値を算出した。結果を表１９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000092
＜動物実験（９）＞
　実施例５９～６３、及び比較例４の組成物を「動物実験（７）」と同様にしてＩＣＲマウス（５週齢、メス）に投与し、投与から２４時間後の血漿中のＦａｃｔｏｒ　ＶＩＩタンパク質濃度の相対値を算出した。結果を表２０に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000093
　本発明によれば、核酸を細胞質に効率よく放出することが可能なカチオン性脂質を提供することができる。

Claims (8)

  1. 　下記式（１）～（１１）で表される化合物からなる群より選択される化合物又はその薬学的に許容される塩。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
  2. 　下記式（１）及び（６）～（９）で表される化合物からなる群より選択される、請求項１に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
  3. 下記式（１）で表される、請求項１又は２に記載の化合物又はその薬剤学的に許容される塩。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
  4. 　下記式（６）で表される、請求項１又は２に記載の化合物又はその薬剤学的に許容される塩。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
  5. 　下記式（８）で表される、請求項１又は２に記載の化合物又はその薬剤学的に許容される塩。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
  6. 　（Ｉ）請求項１～５のいずれか一項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩と、（ＩＩ）中性脂質、ポリエチレングリコール修飾脂質、及びステロールからなる群から選ばれる少なくとも一種の脂質と、を含有する脂質複合体。
  7. 　（Ｉ）請求項１～５のいずれか一項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩と、（ＩＩ）中性脂質、ポリエチレングリコール修飾脂質、及びステロールからなる群から選ばれる少なくとも一種の脂質と、（ＩＩＩ）核酸と、を含有する組成物。
  8. 　（Ｉ）請求項１～５のいずれか一項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩と、（ＩＩ）中性脂質、ポリエチレングリコール修飾脂質、及びステロールからなる群から選ばれる少なくとも一種の脂質とを含有する極性有機溶媒含有水溶液と、（ＩＩＩ）核酸を含有する水溶液とを混合して混合液を得る工程と、混合液中の極性有機溶媒の含有量を減少させる工程と、を含む組成物の製造方法。
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