WO2016104344A1 - 未分化細胞の分離方法及び未分化細胞分離用基板 - Google Patents

未分化細胞の分離方法及び未分化細胞分離用基板 Download PDF

Info

Publication number
WO2016104344A1
WO2016104344A1 PCT/JP2015/085443 JP2015085443W WO2016104344A1 WO 2016104344 A1 WO2016104344 A1 WO 2016104344A1 JP 2015085443 W JP2015085443 W JP 2015085443W WO 2016104344 A1 WO2016104344 A1 WO 2016104344A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
pillar
cells
undifferentiated
cell
dimension
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2015/085443
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
登山　伸人
仁美 草原
高橋　洋一
友一 稲月
洋美 三好
山形　豊
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Dai Nippon Printing Co Ltd
RIKEN
Original Assignee
Dai Nippon Printing Co Ltd
RIKEN
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dai Nippon Printing Co Ltd, RIKEN filed Critical Dai Nippon Printing Co Ltd
Priority to JP2016566184A priority Critical patent/JP6695810B2/ja
Publication of WO2016104344A1 publication Critical patent/WO2016104344A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M3/00—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus

Definitions

  • the present invention relates to a method for separating undifferentiated cells from a cell mixture containing undifferentiated cells and differentiated cells, and a substrate used for separating the undifferentiated cells.
  • Stem cells represented by somatic stem cells, iPS cells, ES cells and the like have the ability to differentiate into cells having various functions such as nerve cells, osteoblasts, vascular endothelial cells, cardiomyocytes and the like. Therefore, it is expected to be applied to the field of regenerative medicine that reconstructs living cells, tissues, organs, etc. using nerve cells, osteoblasts, vascular endothelial cells, cardiomyocytes, etc. obtained by inducing differentiation of stem cells. Yes.
  • undifferentiated stem cells are obtained from a cell mixture containing stem cells and differentiated cells (neural cells, osteoblasts, vascular endothelial cells, cardiomyocytes, etc.) that have been induced to differentiate from the stem cells. It may be desirable to separate and acquire.
  • differentiated cells neural cells, osteoblasts, vascular endothelial cells, cardiomyocytes, etc.
  • differentiation of undifferentiated cells is induced, if differentiation cells are mixed, the efficiency of differentiation induction of undifferentiated cells may decrease.
  • tissue formation failure may occur. Therefore, it is important to remove differentiated cells from the cell mixture and to separate and acquire undifferentiated cells.
  • Non-Patent Document 1 tissue formation using a cell mixture containing undifferentiated cells and differentiated cells is possible. In this case, it is important that the cell density of undifferentiated cells in the cell mixture is adjusted to an appropriate range.
  • a filter that can capture the target cell is focused on the difference in size between the target cell and other cells contained in the cell mixture.
  • a method of separating using a separation device provided see Patent Document 1), a method of adding an identification label or the like to a separation target cell, and detecting the identification label or the like (Patent Document 2, Patent Document 3) And non-patent document 2).
  • the separation method described in Patent Document 1 uses the filter capable of capturing target cells according to the size of target cells contained in the cell mixture and the size of other cells contained in the cell mixture.
  • a method for separating cells Therefore, when the size of a predetermined target cell contained in the cell mixture is different from the size of other cells contained in the cell mixture, the target cell can be separated.
  • the sizes of undifferentiated cells and differentiated cells are substantially the same, it is not possible to completely separate and obtain undifferentiated cells from the cell mixture using the above separation method, For example, it is difficult to improve the cell density of undifferentiated cells.
  • an identification label etc. are provided to the undifferentiated cell in a cell mixture.
  • the undifferentiated cells may be damaged by the operation of applying or removing the label or the like to the undifferentiated cells.
  • the operation of applying / removing such an identification label is complicated.
  • the present invention provides a method capable of selectively, easily and minimally separating undifferentiated cells from a cell mixture containing undifferentiated cells and differentiated cells, and the separation method.
  • An object is to provide a substrate for separating undifferentiated cells to be used.
  • the present invention provides a method for separating undifferentiated cells from a cell mixture containing undifferentiated cells and differentiated cells, wherein a plurality of pillar-like patterns are arranged with regularity.
  • a method for separating undifferentiated cells wherein either one is easily adhered to the pillar-shaped pattern and the other is difficult to adhere to the pillar-shaped pattern (Invention 1).
  • an undifferentiated cell can be selectively isolate
  • the interval between the pillar-shaped patterns means “the dimension of the pillar-shaped pattern from the linear length connecting the center of the plan view of one pillar-shaped pattern and the center of the plan view of another pillar-shaped pattern adjacent thereto.
  • the dimension of the pillar-shaped pattern means that if the pillar-shaped pattern has a substantially square shape in plan view, the length of one side of the square may be a pillar-shaped pattern having a substantially circular shape in plan view. Means the diameter of the circle.
  • “separation” means that any one cell (eg, undifferentiated cell) is completely separated and obtained from a cell mixture containing at least two types of cells (eg, undifferentiated cells and differentiated cells). It is not limited to this, and it also means increasing the cell density of any one cell (for example, undifferentiated cells) in the cell mixture.
  • the distance G and the dimension D of the pillar-shaped patterns are both in the range of 50 to 500 nm (Invention 2), and both are in the range of 100 to 250 nm. (Invention 3)
  • the distance G between the pillar-shaped patterns and the dimension D may have any of the following relationships (1-1) to (1-7) (Invention 4): ).
  • the interval G and the dimension D of the pillar pattern may have any of the following relations (2-1) to (2-7) (Invention 5): ).
  • the distance G between the pillar-shaped patterns and the dimension D may have any of the following relationships (3-1) to (3-7) (Invention 6). ).
  • the distance G between the pillar-shaped patterns and the dimension D may have any of the following relationships (4-1) to (4-7) (Invention 7). ).
  • the interval G and the dimension D of the pillar pattern may have any of the following relationships (5-1) to (5-4) (Invention 8). ).
  • the undifferentiated cells are preferably mesenchymal stem cells derived from a mouse, and the differentiated cells are preferably osteoblasts differentiated from the undifferentiated cells (Invention 9). ).
  • the undifferentiated cells are preferably mesenchymal stem cells derived from humans (Invention 10).
  • the plurality of pillar-shaped patterns in the concavo-convex structure, may be arranged on each lattice point of an equilateral triangular lattice (Invention 11), or the plurality of pillar-shaped patterns. May be arranged on each lattice point of the rectangular lattice (Invention 12).
  • the present invention is an undifferentiated cell separation substrate used for separating the undifferentiated cells from a cell mixture containing undifferentiated cells and differentiated cells, and faces the first surface and the first surface.
  • a substrate having a second surface; and a plurality of pillar-shaped nanopatterns arranged in a regular manner on the first surface of the substrate, and an interval G and a dimension D of the pillar-shaped nanopatterns Wherein either one of the undifferentiated cells and the differentiated cells is easy to adhere to the pillar-shaped nanopattern and the other is difficult to adhere to the pillar-shaped nanopattern.
  • a cell separation substrate is provided (Invention 13).
  • the distance G and the dimension D of the pillar-shaped nanopattern are both in the range of 50 to 500 nm (Invention 14). Are preferably in the range of 100 to 250 nm (Invention 15).
  • the interval G and the dimension D of the pillar pattern may have any of the following relations (1-1) to (1-7) (Invention 16): ).
  • the interval G and the dimension D of the pillar pattern may have any of the following relationships (2-1) to (2-7) (Invention 17). ).
  • the distance G between the pillar-shaped patterns and the dimension D may have any of the following relationships (3-1) to (3-7) (Invention 18). ).
  • the interval G and the dimension D of the pillar-shaped pattern may have any of the following relationships (4-1) to (4-7) (Invention 19). ). 100 nm ⁇ G ⁇ 112.5 nm; 100 nm ⁇ D ⁇ 250 nm (4-1) 112.5 nm ⁇ G ⁇ 137.5 nm; 112.5 nm ⁇ D ⁇ 250 nm (4-2) 137.5 nm ⁇ G ⁇ 162.5 nm; 112.5 nm ⁇ D ⁇ 250 nm (4-3) 162.5 nm ⁇ G ⁇ 187.5 nm; 112.5 nm ⁇ D ⁇ 250 nm (4-4) 187.5 nm ⁇ G ⁇ 212.5 nm; 100 nm ⁇ D ⁇ 187.5 nm or 212.5 nm ⁇ D ⁇ 250 nm (4-5) 212.5 nm ⁇ G ⁇ 237.5 nm; 100 nm ⁇ D ⁇ 137.5 nm; 100 nm ⁇ D ⁇ 13
  • the interval G and the dimension D of the pillar pattern may have any of the following relationships (5-1) to (5-4) (Invention 20). ). 112.5 nm ⁇ G ⁇ 137.5 nm; 187.5 nm ⁇ D ⁇ 212.5 nm (5-1) 137.5 nm ⁇ G ⁇ 162.5 nm; 112.5 nm ⁇ D ⁇ 137.5 nm (5-2) 162.5 nm ⁇ G ⁇ 187.5 nm; 112.5 nm ⁇ D ⁇ 212.5 nm (5-3) 237.5 nm ⁇ G ⁇ 250 nm; 237.5 nm ⁇ D ⁇ 250 nm (5-4)
  • the undifferentiated cells are preferably mesenchymal stem cells derived from a mouse, and the differentiated cells are preferably osteoblasts differentiated from the undifferentiated cells (Invention 21). ).
  • the undifferentiated cells are preferably mesenchymal stem cells derived from humans (Invention 22).
  • the plurality of pillar-like patterns may be arranged on each lattice point of an equilateral triangular lattice (Invention 23), or arranged on each lattice point of a square lattice. (Invention 24).
  • the method which can isolate
  • FIG. 1 is a cut end view showing a schematic configuration of an undifferentiated cell separation substrate according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a plan view schematically showing one aspect of an arrangement configuration of a plurality of pillar-like patterns of the undifferentiated cell separation substrate according to the embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 is a plan view schematically showing another aspect of the arrangement configuration of a plurality of pillar-like patterns on the undifferentiated cell separation substrate according to one embodiment of the present invention.
  • FIG. 4 is a process flow diagram showing the manufacturing process of the undifferentiated cell separation substrate according to the embodiment of the present invention in a cut end view.
  • FIG. 1 is a cut end view showing a schematic configuration of an undifferentiated cell separation substrate according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a plan view schematically showing one aspect of an arrangement configuration of a plurality of pillar-like patterns of the undifferentiated cell separation substrate according to the embodiment of the present invention.
  • FIG. 3
  • FIG. 5 is a plan view showing each region where a pillar-shaped pattern of the test undifferentiated cell separation substrate used in Test Examples 1 and 2 is formed.
  • 6 is a photomicrograph showing an image of mouse-derived mesenchymal stem cells in the vicinity of area PA 34 and a movement locus of mouse-derived mesenchymal stem cells imaged in the evaluation test of Test Example 1.
  • FIG. 7 is a photomicrograph showing an image of mouse-derived osteoblasts in the vicinity of area PA 34 and a movement locus of mouse-derived osteoblasts imaged in the evaluation test of Test Example 2.
  • FIG. 8 is a photomicrograph showing an image of human-derived mesenchymal stem cells in the vicinity of area PA 34 and a movement trajectory of human-derived mesenchymal stem cells imaged in the evaluation test of Test Example 3.
  • FIG. 9 is a photomicrograph showing an image of human-derived osteoblasts in the vicinity of area PA 34 and a movement locus of human-derived osteoblasts imaged in the evaluation test of Test Example 4.
  • FIG. 10 is a photomicrograph showing an image of human-derived adipose precursor cells in the vicinity of area PA 24 and a movement locus of human-derived adipose precursor cells imaged in the evaluation test of Test Example 5.
  • FIG. 11 is a photomicrograph showing an image of human-derived chondrocytes in the vicinity of area PA 24 and a movement trajectory of human-derived chondrocytes taken in the evaluation test of Test Example 6.
  • FIG. 1 is a cut end view showing a schematic configuration of an undifferentiated cell separation substrate according to the present embodiment
  • FIG. 2 is an arrangement configuration of a plurality of pillar-shaped patterns of the undifferentiated cell separation substrate according to the present embodiment
  • FIG. 3 is a plan view schematically showing another aspect of the arrangement configuration of a plurality of pillar-like patterns of the undifferentiated cell separation substrate according to the present embodiment. is there.
  • the undifferentiated cell separation substrate 1 is configured by a nano uneven structure having a base 2 and pillar-like patterns 3 formed on the main surface 21 of the base 2. It is used for separating undifferentiated cells from a cell mixture containing differentiated cells and undifferentiated cells.
  • the undifferentiated cells and differentiated cells contained in the cell mixture are not particularly limited as long as they are adhesive cells.
  • undifferentiated cells include somatic stem cells, iPS cells, ES cells and the like.
  • differentiated cells include neural cells, osteoblasts, vascular endothelial cells, cardiomyocytes, etc., induced to differentiate from the undifferentiated cells.
  • the undifferentiated cells are mesenchymal stem cells derived from a mouse and the differentiated cells are osteoblasts induced to differentiate from the undifferentiated cells, the undifferentiated cells are derived from humans.
  • Undifferentiated cells can be separated more efficiently.
  • Materials constituting the base 2 include quartz glass, synthetic quartz glass, soda glass, fluorite, calcium fluoride, magnesium fluoride, acrylic glass, borosilicate glass, etc .; polycarbonate, polypropylene, polyethylene, polystyrene, etc.
  • a transparent material such as a resin material such as polyolefin can be used.
  • “transparent” means that when light having a wavelength of 190 to 800 nm is irradiated from one side of an object (base 2 in the present embodiment), the light reaches the opposite side to the irradiated side. Means that. If a suitable standard is expressed by transmittance, it is 20% or more, preferably 50% or more, particularly preferably 80% or more.
  • the shape of the base 2 is not particularly limited, and examples thereof include a substantially rectangular shape in plan view and a substantially circular shape in plan view.
  • the size of the base 2 in plan view and the thickness of the base 2 are not particularly limited, and can be appropriately set according to the use of the undifferentiated cell separation substrate 1.
  • the size of the cell separation substrate 1 in plan view can be set to a size that can be accommodated in the dish.
  • the thickness of the undifferentiated cell separation substrate 1 is also set to a thickness that allows the pillar-shaped pattern 3 and the cell mixture to come into contact with each other when the undifferentiated cell separation substrate 1 is placed in the dish. obtain.
  • the pillar-shaped pattern 3 has a substantially circular shape or a substantially rectangular shape in plan view, and is arranged with a predetermined regularity in a predetermined area PA on the main surface 21 of the base portion 2 as a structure integrated with the base portion 2. It is formed as follows.
  • pillar-shaped patterns 3 having a substantially rectangular shape in plan view may be arranged on each lattice point of a regular triangular lattice Gr, or as shown in FIG. 3, It may be arranged on each lattice point of the square lattice Gr.
  • the predetermined area PA where the pillar-shaped pattern 3 is formed is such that the size of the area NPA where the pillar-shaped pattern 3 is not formed on the main surface 21 of the base 2 is as small as possible. It is preferably set on the main surface 21.
  • the pillar-shaped pattern 3 in the present embodiment has nano-level gaps G and dimensions D, in particular, they have a predetermined relationship, so that undifferentiated cells and differentiated cells in the cell mixture A difference in adhesion is expressed, and either one of the undifferentiated cells and the differentiated cells is relatively easy to adhere to the pillar-shaped pattern 3, and the other is relatively difficult to adhere to the pillar-shaped pattern 3.
  • both undifferentiated cells and differentiated cells adhere to the region NPA where the pillar-shaped pattern 3 is not formed. That is, if the region NPA where the pillar-shaped pattern 3 is not formed is large, there is a possibility that undifferentiated cells cannot be efficiently separated. Therefore, undifferentiated cells can be efficiently separated by making the region NPA where the pillar-shaped pattern 3 is not formed as small as possible.
  • the interval G and the dimension D of the pillar-shaped pattern 3 are both preferably in the range of 50 to 500 nm, more preferably in the range of 100 to 250 nm, which is the same size as the cell adhesion complex. preferable.
  • a combination of undifferentiated cells and differentiated cells contained in the cell mixture is mouse-derived mesenchymal stem cells and osteoblasts, human-derived mesenchymal stem cells and osteoblasts, human-derived mesenchymal stem cells and adipose precursor cells, or
  • the distance G and the dimension D preferably have any of the following relationships (1-1) to (1-7).
  • the gap G and the dimension D have any one of the following relationships (1-1 ′) to (1-7 ′).
  • the gap G and the dimension D have any one of the following relationships (1-1 ′′) to (1-7 ′′).
  • a combination of undifferentiated cells and differentiated cells contained in the cell mixture is mouse-derived mesenchymal stem cells and osteoblasts, human-derived mesenchymal stem cells and osteoblasts, human-derived mesenchymal stem cells and adipose precursor cells,
  • the gap G and the dimension D preferably have any one of the following relationships (2-1) to (2-7).
  • the gap G and the dimension D have any one of the following relationships (2-1 ′) to (2-7 ′).
  • the gap G and the dimension D have any one of the following relationships (2-1 ′′) to (2-7 ′′).
  • the interval G and dimension D are the following (3-1) to (3 -7) Any one of the relationships is satisfied.
  • the gap G and the dimension D have any one of the following relationships (3-1 ′) to (3-7 ′).
  • the gap G and the dimension D have any one of the following relationships (3-1 ′′) to (3-7 ′′).
  • the combination of undifferentiated cells and differentiated cells contained in the cell mixture is human-derived mesenchymal stem cells and osteoblasts, human-derived mesenchymal stem cells and adipose precursor cells, or human-derived mesenchymal stem cells and chondrocytes.
  • the gap G and the dimension D have any one of the following relationships (4-1) to (4-7).
  • the gap G and the dimension D have any one of the following relationships (4-1 ′) to (4-7 ′).
  • the gap G and the dimension D have any one of the following relationships (4-1 ′′) to (4-7 ′′).
  • the combination of undifferentiated cells and differentiated cells contained in the cell mixture is human-derived mesenchymal stem cells and osteoblasts, human-derived mesenchymal stem cells and adipose precursor cells, and human-derived mesenchymal stem cells and chondrocytes.
  • the gap G and the dimension D have any one of the following relationships (5-1) to (5-4).
  • the gap G and the dimension D have any one of the following relationships (5-1 ′) to (5-4 ′).
  • 115 nm ⁇ D ⁇ 210 nm (5-3 ′) 240 nm ⁇ G ⁇ 250 nm; 240 nm ⁇ D ⁇ 250 nm (5-4 ′)
  • the gap G and the dimension D have any one of the following relationships (5-1 ′′) to (5-4 ′′).
  • the distance G and the dimension D of the pillar pattern 3 are any one of the above relations (1-1) to (1-7), preferably any one of the relations (1-1 ′) to (1-7 ′). More preferably, any one of the cells (undifferentiated cells or differentiated cells) becomes the pillar-shaped pattern 3 by having any one of the above relationships (1-1 ′′) to (1-7 ′′). The other cell (differentiated cell or undifferentiated cell) becomes relatively difficult to adhere to the pillar-shaped pattern 3 relatively easily.
  • the distance G and dimension D of the pillar-shaped pattern 3 are any one of the above relations (2-1) to (2-7), preferably any one of the above relations (2-1 ′) to (2-7 ′). More preferably, by having any one of the above relationships (2-1 ′′) to (2-7 ′′), the undifferentiated cells and the differentiated cells contained in the cell mixture are derived from a mouse. Even if it is a human-derived one, any one cell (undifferentiated cell or differentiated cell) is relatively easy to adhere to the pillar-shaped pattern 3, and the other cell (differentiated cell or undifferentiated cell). Becomes relatively difficult to adhere to the pillar-shaped pattern 3, and versatility is enhanced.
  • the interval G and the dimension D of the pillar pattern 3 are related to any one of the above (3-1) to (3-7), Preferably, it has any one of the above relationships (3-1 ′) to (3-7 ′), and more preferably any one of the above relationships (3-1 ′′) to (3-7 ′′).
  • undifferentiated cells are relatively easy to adhere to the pillar-shaped pattern 3
  • differentiated cells are relatively difficult to adhere to the pillar-shaped pattern 3.
  • the interval G and the size of the pillar-shaped pattern 3 D is any one of the above relations (4-1) to (4-7), preferably any one of the above relations (4-1 ′) to (4-7 ′), more preferably the above (4-1 )) To (4-7 ''), so that any one cell (undifferentiated cell or differentiated cell) is relatively easy to adhere to the pillar-shaped pattern 3, and the other Cells (differentiated cells or undifferentiated cells) become relatively difficult to adhere to the pillar-shaped pattern 3.
  • the distance G and the dimension D of the pillar-shaped pattern 3 are any one of the above relations (5-1) to (5-4), preferably any one of the above (5-1 ′) to (5-4 ′). More preferably, the undifferentiated cell contained in the cell mixture is a human-derived mesenchymal stem cell by satisfying any of the above relationships (5-1 ′′) to (5-4 ′′).
  • any one cell is relatively adhered to the pillar pattern 3
  • the other cell is relatively less likely to adhere to the pillar-shaped pattern 3, and versatility is enhanced.
  • the pillar-shaped pattern 3 can be obtained simply by bringing the cell mixture and the pillar-shaped pattern 3 into contact using the difference in adhesion between the undifferentiated cells and the differentiated cells contained in the cell mixture.
  • Cells that are relatively difficult to adhere to can be suspended in the culture medium.
  • the target cell is a cell that is relatively easy to adhere to the pillar-shaped pattern 3
  • the cell remaining on the pillar-shaped pattern 3 can be easily separated.
  • the target cell is a cell that is relatively difficult to adhere to the pillar pattern 3, the cell can be separated by collecting the culture solution.
  • the interval G between the pillar-shaped patterns 3 is “a straight line connecting the center C of the plan view of one pillar-shaped pattern 3 and the center of plan view C of the other pillar-shaped pattern 3 closest thereto. This means the length obtained by subtracting the dimension D of the pillar-shaped pattern from the length L.
  • the dimension D of the pillar-shaped pattern 3 is “the length of one side of the square if the pillar-shaped pattern 3 has a substantially square shape in plan view”. If the pillar-shaped pattern 3 has a substantially circular shape in plan view, it means the diameter of the circle ”.
  • the height (aspect ratio) of the pillar-shaped pattern 3 is not particularly limited, and can be appropriately set according to the dimension D of the pillar-shaped pattern 3. Usually, the height of the pillar-shaped pattern 3 can be set so that the aspect ratio of the pillar-shaped pattern 3 is about 0.5 to 5.
  • the predetermined area PA where the pillar-shaped pattern 3 is formed is set on substantially the entire main surface 21 of the base portion 2, but is not limited to such a mode.
  • the main surface 21 of the base portion 2 may be divided into first to Nth regions (N is an integer of 2 or more), and the pillar pattern 3 may be formed in each region.
  • the interval G and the dimension D of the pillar pattern 3 may be the same in each region or may be different.
  • undifferentiated cell separation substrate 1 having the above-described configuration, as will be apparent from Examples described later, when the cell mixture containing differentiated cells and undifferentiated cells is brought into contact with the pillar pattern 3, One of the undifferentiated cells and the differentiated cells is relatively easy to adhere to the pillar-shaped pattern 3, and the other is relatively difficult to adhere to the pillar-shaped pattern 3. Therefore, undifferentiated cells can be selectively and easily separated from the cell mixture.
  • undifferentiated cells remaining on the pillar-shaped pattern 3 can be obtained by using the undifferentiated cell separation substrate 1 having the pillar-shaped pattern 3 in which the undifferentiated cells are relatively easy to adhere in relation to the interval G and the dimension D. It can be selectively and easily separated.
  • the undifferentiated cell separation substrate 1 having the pillar-shaped pattern 3 in which the undifferentiated cells are relatively difficult to adhere in relation to the interval G and the dimension D the undifferentiated cells floating in the culture solution are selectively selected. And can be separated easily. Further, unlike the conventional method of separating the undifferentiated cells by detecting the identification labels or the like given to the undifferentiated cells, it is not necessary to give or remove the identification labels or the like. According to the undifferentiated cell separation substrate 1, undifferentiated cells can be separated from the cell mixture with minimal invasiveness.
  • mesenchymal stem cells that are undifferentiated cells In the field of regenerative medicine in which mesenchymal stem cells that are undifferentiated cells are administered to a patient, it may be desired to selectively culture only mesenchymal stem cells.
  • mesenchymal stem cell culturing step some cells may differentiate into osteoblasts and the like, and unnecessary cells (such as osteoblasts that are differentiated cells) may be mixed.
  • unnecessary cells such as osteoblasts which are differentiated cells
  • target mesenchymal stem cells are selected. Therefore, mesenchymal stem cells can be cultured at a high cell density because they can be easily separated.
  • chondrocytes obtained by differentiating mesenchymal stem cells which are undifferentiated cells
  • mesenchymal stem cell culturing step a part of the mesenchymal stem cell may differentiate into an osteoblast.
  • the undifferentiated cell separation substrate 1 according to the present embodiment is used, osteoblasts that have been unintentionally differentiated can be removed. Therefore, mesenchymal stem cells are cultured at a high cell density. It becomes possible to proliferate.
  • FIG. 4 is a process flow diagram showing the manufacturing process of the undifferentiated cell separation substrate 1 according to this embodiment in a cut end view.
  • a substrate 20 including a hard mask layer 30 is prepared, a resist film 40 is formed on the hard mask layer 30 of the substrate 20, and the resist is formed using an electron beam lithography apparatus or the like. A pattern latent image is formed on the film 40.
  • the constituent materials of the undifferentiated cell separation substrate 1 according to this embodiment for example, quartz glass, synthetic quartz glass, soda glass, fluorite, calcium fluoride, magnesium fluoride, acrylic glass, borosilicate glass
  • a substrate made of a glass material such as polycarbonate, polypropylene, polyethylene, polystyrene, and other transparent resin materials such as polyolefin
  • polycarbonate such as polypropylene, polyethylene, polystyrene, and other transparent resin materials such as polyolefin
  • the hard mask layer 30 is a layer for forming a hard mask pattern 31 that is used for etching the substrate 20 in a process described later (see FIG. 4D). Therefore, it is made of a material that takes into consideration the etching selectivity with the material constituting the substrate 20.
  • the hard mask layer 30 is preferably made of metal chromium or the like.
  • the resist material constituting the resist film 40 is not particularly limited, and a conventionally known energy beam sensitive resist material (for example, an electron beam sensitive resist material, an ultraviolet sensitive resist material, etc.) or the like may be used. it can.
  • a conventionally known energy beam sensitive resist material for example, an electron beam sensitive resist material, an ultraviolet sensitive resist material, etc.
  • the pattern latent image formed on the resist film 40 is formed with substantially the same spacing and dimension as the spacing G and dimension D of the pillar-shaped pattern 3 in the undifferentiated cell separation substrate 1.
  • the resist film 40 is developed to form a resist pattern 41.
  • the hard mask layer 30 is formed using the resist pattern 41 as a mask.
  • the hard mask pattern 31 is formed by etching.
  • the substrate 20 is etched using the hard mask pattern 31 as a mask to form pillar-like patterns 3 in a predetermined area PA of the main surface 21 of the substrate 20, and finally the hard mask By peeling the pattern 31, the undifferentiated cell separation substrate 1 having the base portion 2 and the pillar-like pattern 3 formed on the main surface 21 of the base portion 2 is manufactured as shown in FIG. Can do.
  • the undifferentiated cell separation substrate 1 having the above-described configuration, when the pillar pattern 3 is brought into contact with a cell mixture containing undifferentiated cells and differentiated cells, either one of the undifferentiated cells and the differentiated cells becomes a pillar shape. It is easy to adhere to the pattern 3 and the other is difficult to adhere to the pillar pattern 3.
  • the undifferentiated cell separation substrate 1 according to the present embodiment has an effect that the undifferentiated cells can be selectively separated easily and with minimal invasiveness. It can be suitably used in a method for separating differentiated cells.
  • the undifferentiated cell separation substrate 1 As a method of bringing the pillar-shaped pattern 3 of the undifferentiated cell separation substrate 1 into contact with the cell mixture, for example, the undifferentiated cell separation substrate 1 is placed in a dish, and the dish Examples thereof include a method of bringing the pillar pattern 3 into contact with the cell mixture by seeding the cell mixture therein.
  • the time for bringing the pillar-shaped pattern 3 into contact with the cell mixture selectively separates the undifferentiated cells. There is no particular limitation as long as the time is sufficient.
  • either one of the undifferentiated cells and the differentiated cells is a pillar-shaped pattern. It is easy to adhere to 3 and the other is difficult to adhere to the pillar-shaped pattern 3. Therefore, undifferentiated cells can be selectively and easily separated from the cell mixture containing undifferentiated cells and differentiated cells easily and with minimal invasiveness.
  • the undifferentiated cell separation substrate 1 having the pillar-like pattern 3 formed as an integral uneven structure on the main surface 21 of the base portion 2 has been described as an example. It is not limited to the embodiment.
  • the undifferentiated cell separation substrate 1 has a concavo-convex structure (for example, a sheet having the pillar-shaped pattern 3) having the pillar-shaped pattern 3 configured as a member separate from the base 2 on the main surface 21 of the base 2. A member etc. may be attached.
  • the pillar-shaped pattern 3 is formed by etching, and then the hard mask pattern 31 is peeled off to manufacture the undifferentiated cell separation substrate 1, but the present invention is limited to such an embodiment. It is not something.
  • the base 2 on which the pillar-shaped pattern 3 is formed may be thinned without changing the dimensions and height of the pillar-shaped pattern 3.
  • the undifferentiated cell separation substrate 1 may be manufactured by forming pillar-like patterns 3 in a plurality of regions on the base 2 and cutting (dividing into pieces) for each region.
  • a quartz glass substrate (152 mm ⁇ 152 mm, thickness: 6.35 mm) is prepared as a substrate 20 on which a hard mask layer 30 made of Cr having a thickness of 6 nm is provided on the main surface 21, and an electron beam sensitive resist (product) Name: SEBP-9902, manufactured by Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.) was applied onto the hard mask layer 30 to form a resist film 40.
  • a pillar-shaped resist pattern 41 was formed on the resist film 40 using an electron beam drawing apparatus. The pillar-shaped resist pattern 41 is formed so as to be positioned on each lattice point of the equilateral triangular lattice Gr as shown in FIG.
  • 49 divided areas PA 01 to PA 49 are set in a 14 mm ⁇ area PA on the main surface 21 of the quartz glass substrate 20. Then, pillar-shaped resist patterns 41 having different distances G and dimensions D were formed (see FIG. 5).
  • the hard mask layer 30 was dry-etched (etching gas: Cl 2 + O 2 ) using the resist pattern 41 as a mask, and the remaining resist pattern 41 was removed to form the hard mask pattern 31.
  • the quartz glass substrate 20 is etched using the hard mask pattern 31 formed as described above as a mask, and the pillar-shaped pattern 3 having a predetermined gap G and dimension D is formed in each region of the main surface 21 of the quartz glass substrate 20. Formed. Finally, the hard mask pattern 31 was peeled off to produce a test undifferentiated cell separation substrate (see FIG. 5).
  • the interval G and dimension D of the pillar-shaped pattern 3 formed in each of the regions PA 01 to PA 49 of the test undifferentiated cell separation substrate were measured using a scanning electron microscope (product name: LWM9000). The results were as shown in Table 1 below.
  • Test Example 1 Prepare a perforated dish (35 mm ⁇ ) with a 14 mm ⁇ hole formed on the bottom surface, and make sure that the areas PA 01 to PA 49 where the pillar-shaped pattern 3 is formed are exposed from the bottom hole.
  • the differentiated cell separation substrate was attached to the outside of the bottom surface of the perforated dish.
  • mouse-derived mesenchymal stem cells (RIKEN BRC, undifferentiated cells) are seeded in the perforated dish, and the undifferentiated cells are brought into contact with the pillar-shaped pattern 3 of the test undifferentiated cell separation substrate. It was. POWEREDBY10 (manufactured by Glyco Technica) was used as the culture solution.
  • An evaluation test was performed to evaluate the relationship between the spacing G and dimension D of the pillar-shaped pattern 3 and the state of cell adhesion based on an image obtained by imaging the vicinity of each region PA 01 to PA 49 36 hours after cell seeding.
  • the cell number ratio PMU was evaluated as an index of affinity with respect to the pillar-shaped pattern 3.
  • FIG. 6 shows an image of the mesenchymal stem cells in the vicinity of the area PA 34 imaged in the evaluation test and the movement trajectory of the mesenchymal stem cells.
  • the arrow line shown in FIG. 6 represents the movement trajectory of the mesenchymal stem cell.
  • Test Example 2 The cell number ratio P MD (in each region PA 01 to PA 49 ) was the same as in Test Example 1 except that osteoblasts (differentiated cells) obtained by inducing differentiation of mouse mesenchymal stem cells were seeded in the dish.
  • PMD N in / (N in + N out ), N in is “the number of cells existing in each region PA 01 to PA 49 (on the pillar pattern 3) and at the boundary between each region PA 01 to PA 49 ”.
  • N out is by calculating the.) representing "an area of the same area as each area PA 01 ⁇ PA 49, the number of cells present in the area surrounding the periphery of each region PA 01 ⁇ PA 49"
  • An evaluation test was performed to evaluate the relationship between the distance G and dimension D of the pillar-shaped pattern 3 and the state of cell adhesion. The evaluation results are shown in Table 2.
  • FIG. 7 shows an image of osteoblasts in the vicinity of the area PA 34 imaged in the evaluation test and a movement locus of the osteoblasts.
  • the arrow line shown in FIG. 7 represents the movement locus
  • N in is “the number of cells existing in each region PA 01 to PA 49 (on the pillar-shaped pattern 3) and the boundary between each region PA 01 to PA 49 ”, and N out is “each region a region of the same area as the PA 01 ⁇ PA 49, representing the number "of cells present in the area surrounding the periphery of each region PA 01 ⁇ PA 49.) by calculating the spacing of the pillar-shaped patterns 3
  • An evaluation test was performed to evaluate the relationship between G and dimension D and the state of cell adhesion. The evaluation results are shown in Table 2.
  • FIG. 8 shows an image of mesenchymal stem cells in the vicinity of the area PA 34 imaged in the evaluation test and a movement locus of the mesenchymal stem cells.
  • the arrow line shown in FIG. 8 represents the movement trajectory of the mesenchymal stem cell.
  • the cell number ratio P HO in each region PA 01 to PA 49 is the same as in Test Example 1 except that osteoblasts (differentiated cells) obtained by inducing differentiation of human-derived mesenchymal stem cells are seeded in the dish.
  • P HO N in / (N in + N out )
  • N in is “the number of cells existing in each region PA 01 to PA 49 (on the pillar pattern 3) and at the boundary between each region PA 01 to PA 49 ”.
  • N out is by calculating the.) representing "an area of the same area as each area PA 01 ⁇ PA 49, the number of cells present in the area surrounding the periphery of each region PA 01 ⁇ PA 49"
  • An evaluation test was performed to evaluate the relationship between the distance G and dimension D of the pillar-shaped pattern 3 and the state of cell adhesion. The evaluation results are shown in Table 2.
  • FIG. 9 shows an image of osteoblasts in the vicinity of the area PA 34 imaged in the evaluation test and the movement locus of the osteoblasts.
  • the arrow line shown in FIG. 9 represents the movement locus
  • Test Example 5 In the same manner as in Test Example 1, except that adipose precursor cells (differentiated cells) obtained by inducing differentiation of human mesenchymal stem cells were seeded in a dish, and Adipogenic Maintenance Medium (manufactured by Lonza) was used as a medium,
  • the evaluation test which evaluates the relationship between the space
  • Test Example 6 In the same manner as in Test Example 1 except that chondrocytes (differentiated cells) obtained by inducing differentiation of human-derived mesenchymal stem cells were seeded in a dish and Chondrocyte Growth Medium (manufactured by PromoCell) was used as a medium.
  • chondrocytes differentiated cells obtained by inducing differentiation of human-derived mesenchymal stem cells were seeded in a dish and Chondrocyte Growth Medium (manufactured by PromoCell) was used as a medium.
  • FIG. 11 shows an image of chondrocytes in the vicinity of the area PA 24 and the movement trajectory of the chondrocytes taken in the evaluation test.
  • the arrow line shown in FIG. 11 represents the movement locus
  • E HAU and selective evaluation A HAD of selective separability of adipose precursor cells estimated from the contact of the P-like pattern 3 with human-derived mesenchymal stem cells It shows together with Table 4.
  • the mesenchymal stem cell In the region having the pillar-like pattern 3 having a relatively high capture efficiency E MD and E HOD of the mesenchymal stem cell (the region where the overall evaluation shown in Table 4 is “ ⁇ ” or “ ⁇ ”), the mesenchymal stem cell Then, since the mesenchymal stem cells in the cell mixture containing osteoblasts induced to differentiate are relatively easily adhered to the pillar-shaped pattern 3, the cell mixture is simply brought into contact with the pillar-shaped pattern 3. It is considered that mesenchymal stem cells can be selectively and easily separated and obtained from the cells, or the cell density of mesenchymal stem cells can be increased.
  • the pillar-like pattern 3 having relatively high capture efficiency E MD , E HOD , E HAD , E HCD of differentiated cells (osteoblasts, adipose precursor cells, chondrocytes, etc.) induced to differentiate from mesenchymal stem cells
  • the differentiated cells in the cell mixture containing the mesenchymal stem cells and the differentiated cells differentiated therefrom are relative to the pillar pattern 3. Therefore, mesenchymal stem cells can be selectively and easily separated and obtained from the cell mixture only by contacting the cell mixture with the pillar-shaped pattern 3, or the mesenchymal system It is thought that the cell density of stem cells can be increased.
  • cell adhesion is achieved by using the undifferentiated cell separation substrate 1 on which the pillar-shaped pattern 3 having the distance G and the dimension D having the relationships shown in the following (1-1) to (1-7) is formed. Based on the difference in sex, undifferentiated cells can be selectively and easily separated and obtained from the cell mixture, or the cell density of undifferentiated cells can be increased.
  • the undifferentiated cell separation substrate 1 on which the pillar-shaped pattern 3 having the distance G and the dimension D having the relationships shown in the following (2-1) to (2-7) is formed Regardless of the type, it is possible to selectively and easily separate and acquire undifferentiated cells from a cell mixture or increase the cell density of undifferentiated cells based on the difference in cell adhesion.
  • the undifferentiated cells contained in the cell mixture are mouse-derived mesenchymal stem cells and the differentiated cells are osteoblasts induced to differentiate therefrom, preferably the following (3-1) to (3-7)
  • the undifferentiated cells are selectively selected from the cell mixture based on the difference in cell adhesion. And can be easily separated and obtained, or the cell density of undifferentiated cells can be increased.
  • the undifferentiated cells contained in the cell mixture are human-derived mesenchymal stem cells and the differentiated cells are osteoblasts, adipose precursor cells or chondrocytes induced to differentiate therefrom, preferably the following (4-1) to
  • the undifferentiated cell separation substrate 1 on which the pillar-shaped pattern 3 having the distance G and the dimension D having the relationship shown in (4-7) is formed it is possible to remove the cell mixture from the cell mixture.
  • Undifferentiated cells can be selectively and easily separated and obtained, or the cell density of undifferentiated cells can be increased.
  • the cell mixture is particularly preferably used by using the undifferentiated cell separation substrate 1 on which the pillar-shaped pattern 3 having the distance G and the dimension D having the relationships shown in the following (5-1) to (5-4) is formed.
  • the undifferentiated cells contained in the cells are human-derived mesenchymal stem cells and the differentiated cells are differentiated from osteoblasts, adipose precursor cells, and chondrocytes, the difference in cell adhesion Based on the above, it is possible to selectively and easily separate and acquire undifferentiated cells from the cell mixture, or to increase the cell density of undifferentiated cells.
  • the undifferentiated cells are selectively selected from the cell mixture, and It can be easily separated and obtained, or the cell density of undifferentiated cells can be increased.
  • the present invention is useful in technical fields related to regenerative medicine using undifferentiated cells or differentiated cells.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

　未分化細胞と分化細胞とを含む細胞混合物から未分化細胞を分離する方法は、複数のピラー状パターンが規則性を有して配列されてなるナノ凹凸構造体を用い、複数のピラー状パターンに細胞混合物を接触させる工程を含み、ピラー状パターンの間隔Ｇと寸法Ｄとが、未分化細胞及び分化細胞のうちのいずれか一方がピラー状パターンに接着し易く、他方がピラー状パターンに接着し難い関係を具備する。これにより、未分化細胞と分化細胞とを含む細胞混合物から分化細胞を選択的に、かつ容易に分離することができる。

Description

未分化細胞の分離方法及び未分化細胞分離用基板
　本発明は、未分化細胞と分化細胞とを含む細胞混合物から当該未分化細胞を分離する方法及び当該未分化細胞を分離するために用いられる基板に関する。
　体性幹細胞、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞等に代表される幹細胞は、神経細胞、骨芽細胞、血管内皮細胞、心筋細胞等の様々な機能を有する細胞への分化能を有する。そのため、幹細胞を分化誘導させることで得られる神経細胞、骨芽細胞、血管内皮細胞、心筋細胞等を用いて生体の細胞、組織、器官等を再構築する再生医療分野への応用が期待されている。
　幹細胞の再生医療分野への応用研究にあたり、幹細胞と、当該幹細胞から分化誘導した分化細胞（神経細胞、骨芽細胞、血管内皮細胞、心筋細胞等）とを含む細胞混合物から、未分化の幹細胞を分離・取得するのが望ましい場合がある。未分化細胞を分化誘導させる際に、分化細胞が混在していると、未分化細胞の分化誘導の効率が低下することがある。また、そのようにして分化誘導した細胞を、例えば組織形成に使用する場合、組織形成不全が起こるおそれがある。そのため、当該細胞混合物から分化細胞を除去し、未分化細胞を分離・取得することが重要となる。
　一方で、未分化細胞と分化細胞とを含む細胞混合物を使用した組織形成が可能であるとの報告もある（非特許文献１参照）。この場合において、細胞混合物中における未分化細胞の細胞密度が適切な範囲に調整されていることが重要となる。
　従来、所定の目的細胞を含む細胞混合物から当該目的細胞を分離する方法として、細胞混合物に含まれる目的細胞とその他の細胞との大きさの違いに着目し、当該目的細胞を捕捉可能なフィルタを備える分離装置を用いて分離する方法（特許文献１参照）、分離目的細胞に識別ラベル等を付加し、当該識別ラベル等を検出することにより目的細胞を分離する方法（特許文献２，特許文献３，非特許文献２参照）等が知られている。
特開２００３－２７４９２３号公報 特開２００５－２７５７９号公報 特開２０１１－８７４７５号公報
Takabe et al., "Vascularized and Complex Organ Buds from Diverse Tissues via Mesenchymal Cell-Driven Condensation", Cell Stem Cell, Vol. 16, pp. 556-565, 2015 Kuanyin K. Lin et al., "Detection of Hematopoietic Stem Cells by Flow Cytometry", METHODS IN CELLS BIOLOGY, Vol. 103, 2011
　特許文献１に記載の分離方法は、細胞混合物に含まれる目的細胞の大きさと、細胞混合物に含まれる他の細胞の大きさとに応じて、目的細胞を捕捉可能なフィルタを用いることにより、当該目的細胞を分離する方法である。したがって、細胞混合物に含まれる所定の目的細胞の大きさが、当該細胞混合物に含まれる他の細胞の大きさと異なる場合には、当該目的細胞を分離することができる。しかしながら、未分化細胞と分化細胞との大きさは実質的に同一であるため、上記分離方法を用いても、上記細胞混合物から未分化細胞を完全に分離・取得することができず、一方（例えば未分化細胞）の細胞密度を向上させることも困難であるという問題がある。
　また、特許文献２、特許文献３及び非特許文献２に記載の分離方法を用いて細胞混合物中の未分化細胞を分離するためには、細胞混合物中の未分化細胞に識別ラベル等を付与する必要があり、当該識別ラベル等の検出により未分化細胞を分離することが可能な方法ではある。しかし、分離された未分化細胞を分化誘導して得られる分化細胞を用いて組織形成を行うためには、分離後の未分化細胞から識別ラベル等を除去しなければならない場合があるが、識別ラベル等の未分化細胞への付与及び除去操作により、当該未分化細胞に損傷を与えてしまうおそれがある。また、かかる識別ラベル等の付与・除去作業が煩雑であるという問題もある。
　このような課題に鑑みて、本発明は、未分化細胞と分化細胞とを含む細胞混合物から未分化細胞を選択的に、容易に、かつ低侵襲で分離することのできる方法及び当該分離方法に用いられる未分化細胞分離用基板を提供することを目的とする。
　上記課題を解決するために、本発明は、未分化細胞と分化細胞とを含む細胞混合物から前記未分化細胞を分離する方法であって、複数のピラー状パターンが規則性を有して配列されてなるナノ凹凸構造体を用い、前記複数のピラー状パターンに前記細胞混合物を接触させる工程を含み、前記ピラー状パターンの間隔Ｇと寸法Ｄとが、前記未分化細胞及び前記分化細胞のうちのいずれか一方が前記ピラー状パターンに接着し易く、他方が前記ピラー状パターンに接着し難い関係を具備することを特徴とする未分化細胞の分離方法を提供する（発明１）。
　本発明者らの鋭意研究により、ナノ凹凸構造体に複数のピラー状パターンが規則性を有して配列されていることで、当該ナノ凹凸構造体の複数のピラー状パターンが配列されている領域において、未分化細胞と分化細胞とのピラー状パターンに対する接着性に違いが生じることが見出された。よって、上記発明（発明１）によれば、未分化細胞と分化細胞とを含む細胞混合物から未分化細胞を選択的に、容易に、かつ低侵襲で分離することができる。
　なお、本発明において、ピラー状パターンの間隔とは、「一のピラー状パターンの平面視中心と、それに隣接する他のピラー状パターンの平面視中心とを結ぶ直線長さからピラー状パターンの寸法を差し引いた長さ」を意味し、ピラー状パターンの寸法とは、「平面視略正方形状のピラー状パターンであれば当該正方形の一辺の長さ、平面視略円形状のピラー状パターンであれば当該円の直径」を意味する。また、本発明において「分離」とは、少なくとも２種の細胞（例えば、未分化細胞及び分化細胞）を含む細胞混合物から、いずれか一方の細胞（例えば、未分化細胞）を完全に分離・取得することに限らず、当該細胞混合物中におけるいずれか一方の細胞（例えば、未分化細胞）の細胞密度を高めることをも意味するものとする。
　上記発明（発明１）においては、前記ピラー状パターンの間隔Ｇと寸法Ｄとが、いずれも５０～５００ｎｍの範囲内であるのが好ましく（発明２）、いずれも１００～２５０ｎｍの範囲内であるのが好ましい（発明３）。
　上記発明（発明１～３）において、前記ピラー状パターンの間隔Ｇと寸法Ｄとが、下記（１－１）～（１－７）のいずれかの関係を有していてもよい（発明４）。
１００ｎｍ≦Ｇ＜１１２．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（１－１）
１１２．５ｎｍ≦Ｇ＜１３７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（１－２）
１３７．５ｎｍ≦Ｇ＜１６２．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（１－３）
１６２．５ｎｍ≦Ｇ＜１８７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（１－４）
１８７．５ｎｍ≦Ｇ＜２１２．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１８７．５ｎｍ又は２１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（１－５）
２１２．５ｎｍ≦Ｇ＜２３７．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１３７．５ｎｍ又は２１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（１－６）
２３７．５ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（１－７）
　上記発明（発明１～３）において、前記ピラー状パターンの間隔Ｇと寸法Ｄとが、下記（２－１）～（２－７）のいずれかの関係を有していてもよい（発明５）。
１００ｎｍ≦Ｇ＜１１２．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（２－１）
１１２．５ｎｍ≦Ｇ＜１３７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ＜１３７．５ｎｍ　…（２－２）
１３７．５ｎｍ≦Ｇ＜１６２．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ＜１６２．５ｎｍ又は１８７．５ｎｍ≦Ｄ＜２３７．５ｎｍ　…（２－３）
１６２．５ｎｍ≦Ｇ＜１８７．５ｎｍ；１６２．５ｎｍ≦Ｄ＜２１２．５ｎｍ又は２３７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（２－４）
１８７．５ｎｍ≦Ｇ＜２１２．５ｎｍ；２１２．５ｎｍ≦Ｄ＜２３７．５ｎｍ　…（２－５）
２１２．５ｎｍ≦Ｇ＜２３７．５ｎｍ；２３７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（２－６）
２３７．５ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；１６２．５ｎｍ≦Ｄ＜２３７．５ｎｍ　…（２－７）
　上記発明（発明１～３）において、前記ピラー状パターンの間隔Ｇと寸法Ｄとが、下記（３－１）～（３－７）のいずれかの関係を有していてもよい（発明６）。
１００ｎｍ≦Ｇ＜１１２．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（３－１）
１１２．５ｎｍ≦Ｇ＜１３７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ＜１３７．５ｎｍ　…（３－２）
１３７．５ｎｍ≦Ｇ＜１６２．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１６２．５ｎｍ又は１８７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（３－３）
１６２．５ｎｍ≦Ｇ＜１８７．５ｎｍ；１６２．５ｎｍ≦Ｄ＜２１２．５ｎｍ又は２３７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（３－４）
１８７．５ｎｍ≦Ｇ＜２１２．５ｎｍ；２１２．５ｎｍ≦Ｄ＜２３７．５ｎｍ　…（３－５）
２１２．５ｎｍ≦Ｇ＜２３７．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１１２．５ｎｍ又は２３７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（３－６）
２３７．５ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１３７．５ｎｍ又は１６２．５ｎｍ≦Ｄ＜２３７．５ｎｍ　…（３－７）
　上記発明（発明１～３）において、前記ピラー状パターンの間隔Ｇと寸法Ｄとが、下記（４－１）～（４－７）のいずれかの関係を有していてもよい（発明７）。
１００ｎｍ≦Ｇ＜１１２．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（４－１）
１１２．５ｎｍ≦Ｇ＜１３７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（４－２）
１３７．５ｎｍ≦Ｇ＜１６２．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（４－３）
１６２．５ｎｍ≦Ｇ＜１８７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（４－４）
１８７．５ｎｍ≦Ｇ＜２１２．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１８７．５ｎｍ又は２１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（４－５）
２１２．５ｎｍ≦Ｇ＜２３７．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１３７．５ｎｍ又は２１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（４－６）
２３７．５ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；１３７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（４－７）
　上記発明（発明１～３）において、前記ピラー状パターンの間隔Ｇと寸法Ｄとが、下記（５－１）～（５－４）のいずれかの関係を有していてもよい（発明８）。
１１２．５ｎｍ≦Ｇ＜１３７．５ｎｍ；１８７．５ｎｍ≦Ｄ＜２１２．５ｎｍ　…（５－１）
１３７．５ｎｍ≦Ｇ＜１６２．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ＜１３７．５ｎｍ　…（５－２）
１６２．５ｎｍ≦Ｇ＜１８７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ＜２１２．５ｎｍ　…（５－３）
２３７．５ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；２３７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（５－４）
　上記発明（発明１～６）において、前記未分化細胞が、マウスに由来する間葉系幹細胞であり、前記分化細胞が、前記未分化細胞から分化した骨芽細胞であるのが好ましい（発明９）。
　上記発明（発明１～５、７，８）において、前記未分化細胞が、ヒトに由来する間葉系幹細胞であるのが好ましい（発明１０）。
　上記発明（発明１～１０）において、前記凹凸構造体は、前記複数のピラー状パターンが正三角形格子の各格子点上に配列されていてもよいし（発明１１）、前記複数のピラー状パターンが方形格子の各格子点上に配列されていてもよい（発明１２）。
　また、本発明は、未分化細胞と分化細胞とを含む細胞混合物から前記未分化細胞を分離するために用いられる未分化細胞分離用基板であって、第１面及び前記第１面に対向する第２面を有する基材と、前記基材の前記第１面に規則性を有して配列形成されてなる複数のピラー状ナノパターンとを備え、前記ピラー状ナノパターンの間隔Ｇと寸法Ｄとが、前記未分化細胞及び前記分化細胞のうちのいずれか一方が前記ピラー状ナノパターンに接着し易く、他方が前記ピラー状ナノパターンに接着し難い関係を具備することを特徴とする未分化細胞分離用基板を提供する（発明１３）。
　上記発明（発明１３）において、前記ピラー状ナノパターンの間隔Ｇと寸法Ｄとが、いずれも５０～５００ｎｍの範囲内であるのが好ましく（発明１４）、前記ピラー状パターンの間隔Ｇと寸法Ｄとが、いずれも１００～２５０ｎｍの範囲内であるのが好ましい（発明１５）。
　上記発明（発明１３～１５）において、前記ピラー状パターンの間隔Ｇと寸法Ｄとが、下記（１－１）～（１－７）のいずれかの関係を有していてもよい（発明１６）。
１００ｎｍ≦Ｇ＜１１２．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（１－１）
１１２．５ｎｍ≦Ｇ＜１３７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（１－２）
１３７．５ｎｍ≦Ｇ＜１６２．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（１－３）
１６２．５ｎｍ≦Ｇ＜１８７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（１－４）
１８７．５ｎｍ≦Ｇ＜２１２．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１８７．５ｎｍ又は２１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（１－５）
２１２．５ｎｍ≦Ｇ＜２３７．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１３７．５ｎｍ又は２１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（１－６）
２３７．５ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（１－７）
　上記発明（発明１３～１５）において、前記ピラー状パターンの間隔Ｇと寸法Ｄとが、下記（２－１）～（２－７）のいずれかの関係を有していてもよい（発明１７）。
１００ｎｍ≦Ｇ＜１１２．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（２－１）
１１２．５ｎｍ≦Ｇ＜１３７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ＜１３７．５ｎｍ　…（２－２）
１３７．５ｎｍ≦Ｇ＜１６２．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ＜１６２．５ｎｍ又は１８７．５ｎｍ≦Ｄ＜２３７．５ｎｍ　…（２－３）
１６２．５ｎｍ≦Ｇ＜１８７．５ｎｍ；１６２．５ｎｍ≦Ｄ＜２１２．５ｎｍ又は２３７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（２－４）
１８７．５ｎｍ≦Ｇ＜２１２．５ｎｍ；２１２．５ｎｍ≦Ｄ＜２３７．５ｎｍ　…（２－５）
２１２．５ｎｍ≦Ｇ＜２３７．５ｎｍ；２３７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（２－６）
２３７．５ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；１６２．５ｎｍ≦Ｄ＜２３７．５ｎｍ　…（２－７）
　上記発明（発明１３～１５）において、前記ピラー状パターンの間隔Ｇと寸法Ｄとが、下記（３－１）～（３－７）のいずれかの関係を有していてもよい（発明１８）。
１００ｎｍ≦Ｇ＜１１２．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（３－１）
１１２．５ｎｍ≦Ｇ＜１３７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ＜１３７．５ｎｍ　…（３－２）
１３７．５ｎｍ≦Ｇ＜１６２．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１６２．５ｎｍ又は１８７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（３－３）
１６２．５ｎｍ≦Ｇ＜１８７．５ｎｍ；１６２．５ｎｍ≦Ｄ＜２１２．５ｎｍ又は２３７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（３－４）
１８７．５ｎｍ≦Ｇ＜２１２．５ｎｍ；２１２．５ｎｍ≦Ｄ＜２３７．５ｎｍ　…（３－５）
２１２．５ｎｍ≦Ｇ＜２３７．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１１２．５ｎｍ又は２３７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（３－６）
２３７．５ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１３７．５ｎｍ又は１６２．５ｎｍ≦Ｄ＜２３７．５ｎｍ　…（３－７）
　上記発明（発明１３～１５）において、前記ピラー状パターンの間隔Ｇと寸法Ｄとが、下記（４－１）～（４－７）のいずれかの関係を有していてもよい（発明１９）。
１００ｎｍ≦Ｇ＜１１２．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（４－１）
１１２．５ｎｍ≦Ｇ＜１３７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（４－２）
１３７．５ｎｍ≦Ｇ＜１６２．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（４－３）
１６２．５ｎｍ≦Ｇ＜１８７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（４－４）
１８７．５ｎｍ≦Ｇ＜２１２．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１８７．５ｎｍ又は２１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（４－５）
２１２．５ｎｍ≦Ｇ＜２３７．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１３７．５ｎｍ又は２１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（４－６）
２３７．５ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；１３７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（４－７）
　上記発明（発明１３～１５）において、前記ピラー状パターンの間隔Ｇと寸法Ｄとが、下記（５－１）～（５－４）のいずれかの関係を有していてもよい（発明２０）。
１１２．５ｎｍ≦Ｇ＜１３７．５ｎｍ；１８７．５ｎｍ≦Ｄ＜２１２．５ｎｍ　…（５－１）
１３７．５ｎｍ≦Ｇ＜１６２．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ＜１３７．５ｎｍ　…（５－２）
１６２．５ｎｍ≦Ｇ＜１８７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ＜２１２．５ｎｍ　…（５－３）
２３７．５ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；２３７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（５－４）
　上記発明（発明１３～１８）において、前記未分化細胞が、マウスに由来する間葉系幹細胞であり、前記分化細胞が、前記未分化細胞から分化した骨芽細胞であるのが好ましい（発明２１）。
　上記発明（発明１３～１７，１９，２０）において、前記未分化細胞が、ヒトに由来する間葉系幹細胞であるのが好ましい（発明２２）。
　上記発明（発明１３～２２）において、前記複数のピラー状パターンは、正三角形格子の各格子点上に配列されていてもよいし（発明２３）、方形格子の各格子点上に配列されていてもよい（発明２４）。
　本発明によれば、未分化細胞と分化細胞とを含む細胞混合物から分化細胞を選択的に、容易に、かつ低侵襲で分離することのできる方法及び当該分離方法に用いられる未分化細胞分離用基板を提供することができる。
図１は、本発明の一実施形態に係る未分化細胞分離用基板の概略構成を示す切断端面図である。 図２は、本発明の一実施形態に係る未分化細胞分離用基板の複数のピラー状パターンの配列構成の一の態様を概略的に示す平面図である。 図３は、本発明の一実施形態に係る未分化細胞分離用基板の複数のピラー状パターンの配列構成の他の態様を概略的に示す平面図である。 図４は、本発明の一実施形態に係る未分化細胞分離用基板の製造工程を切断端面図にて示す工程フロー図である。 図５は、試験例１及び２において用いた試験用未分化細胞分離用基板のピラー状パターンが形成された各領域を示す平面図である。 図６は、試験例１の評価試験において撮像した領域ＰＡ34近傍のマウス由来間葉系幹細胞の画像及びマウス由来間葉系幹細胞の移動軌跡を示す顕微鏡写真である。 図７は、試験例２の評価試験において撮像した領域ＰＡ34近傍のマウス由来骨芽細胞の画像及びマウス由来骨芽細胞の移動軌跡を示す顕微鏡写真である。 図８は、試験例３の評価試験において撮像した領域ＰＡ34近傍のヒト由来間葉系幹細胞の画像及びヒト由来間葉系幹細胞の移動軌跡を示す顕微鏡写真である。 図９は、試験例４の評価試験において撮像した領域ＰＡ34近傍のヒト由来骨芽細胞の画像及びヒト由来骨芽細胞の移動軌跡を示す顕微鏡写真である。 図１０は、試験例５の評価試験において撮像した領域ＰＡ24近傍のヒト由来脂肪前駆細胞の画像及びヒト由来脂肪前駆細胞の移動軌跡を示す顕微鏡写真である。 図１１は、試験例６の評価試験において撮像した領域ＰＡ24近傍のヒト由来軟骨細胞の画像及びヒト由来軟骨細胞の移動軌跡を示す顕微鏡写真である。
　本発明の実施の形態について、図面を参照しながら説明する。
　図１は、本実施形態に係る未分化細胞分離用基板の概略構成を示す切断端面図であり、図２は、本実施形態に係る未分化細胞分離用基板の複数のピラー状パターンの配列構成の一の態様を概略的に示す平面図であり、図３は、本実施形態に係る未分化細胞分離用基板の複数のピラー状パターンの配列構成の他の態様を概略的に示す平面図である。
　図１に示すように、本実施形態に係る未分化細胞分離用基板１は、基部２と、基部２の主面２１に形成されてなるピラー状パターン３とを有するナノ凹凸構造体により構成され、分化細胞と未分化細胞とを含む細胞混合物から、未分化細胞を分離するために用いられる。
　細胞混合物に含まれる未分化細胞及び分化細胞は、接着性を有する細胞であれば特に限定されるものではなく、例えば、未分化細胞として体性幹細胞、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞等を挙げることができ、分化細胞として上記未分化細胞から分化誘導した神経細胞、骨芽細胞、血管内皮細胞、心筋細胞等を挙げることができる。これらのうち、特に、未分化細胞がマウスに由来する間葉系幹細胞であって、分化細胞が当該未分化細胞から分化誘導させた骨芽細胞である場合、未分化細胞がヒトに由来する間葉系幹細胞であって、分化細胞が当該未分化細胞から分化誘導させた骨芽細胞、脂肪前駆細胞又は軟骨細胞である場合、本実施形態に係る未分化細胞分離用基板１を用いることで、より効率的に未分化細胞を分離することができる。
　基部２を構成する材料としては、石英ガラス、合成石英ガラス、ソーダガラス、蛍石、フッ化カルシウム、フッ化マグネシウム、アクリルガラス、ホウケイ酸ガラス等のガラス材料；ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン、その他ポリオレフィン等の樹脂材料等の透明材料等を用いることができる。特に、基部２を構成する材料として上記透明材料を用いると、未分化細胞のピラー状パターン３への接着状態を顕微鏡などで観察しながら未分化細胞の分離操作を行うことができるため好ましい。
　なお、本実施形態において「透明」とは、波長１９０～８００ｎｍの光を対象物（本実施形態においては基部２）の片側から照射した際、照射された側とは反対側へ光が到達することを意味する。好適な基準を透過率で示すならば２０％以上、好ましくは５０％以上、特に好ましくは８０％以上である。
　基部２の形状は、特に限定されるものではなく、例えば、平面視略矩形状、平面視略円形状等を挙げることができる。また、平面視における基部２の大きさや、基部２の厚さも特に限定されるものではなく、未分化細胞分離用基板１の用途等に応じて適宜設定され得る。例えば、細胞混合物から未分化細胞を分離するために、ディッシュ等に未分化細胞分離用基板１を収容し、当該ディッシュ内で未分化細胞分離用基板１と細胞混合物とを接触させる場合、未分化細胞分離用基板１の平面視における大きさは、当該ディッシュ内に収容可能な大きさに設定され得る。同様に、未分化細胞分離用基板１の厚さも、上記ディッシュ内に未分化細胞分離用基板１を載置したときに、そのピラー状パターン３と細胞混合物とが接触可能な厚さに設定され得る。
　ピラー状パターン３は、平面視略円形又は略矩形であり、基部２と一体的な構造物として、基部２の主面２１上の所定の領域ＰＡ内に所定の規則性を有して配列するように形成されている。
　具体的には、図２に示すように、平面視略矩形のピラー状パターン３が、正三角形状の格子Ｇｒの各格子点上に配列されていてもよいし、図３に示すように、方形状の格子Ｇｒの各格子点上に配列されていてもよい。
　本実施形態において、上記ピラー状パターン３が形成される所定の領域ＰＡは、基部２の主面２１上における上記ピラー状パターン３が形成されない領域ＮＰＡの大きさが可能な限り小さくなるように、当該主面２１上に設定されているのが好ましい。後述するように、本実施形態におけるピラー状パターン３がナノレベルの間隔Ｇ及び寸法Ｄを有すること、特にそれらが所定の関係を具備することで、細胞混合物中の未分化細胞と分化細胞との接着性の違いが発現され、未分化細胞及び分化細胞のうちのいずれか一方は当該ピラー状パターン３に相対的に接着し易く、他方は当該ピラー状パターン３に相対的に接着し難い。一方、ピラー状パターン３が形成されない領域ＮＰＡには、未分化細胞及び分化細胞がともに接着する。すなわち、ピラー状パターン３が形成されない領域ＮＰＡが大きいと、未分化細胞を効率的に分離することができないおそれがある。したがって、ピラー状パターン３が形成されない領域ＮＰＡを可能な限り小さくすることで、未分化細胞を効率的に分離することができる。
　本実施形態において、ピラー状パターン３の間隔Ｇ及び寸法Ｄは、いずれも細胞接着複合体と同等サイズの５０～５００ｎｍの範囲内であるのが好ましく、１００～２５０ｎｍの範囲内であるのがより好ましい。
　細胞混合物に含まれる未分化細胞と分化細胞との組み合わせが、マウス由来間葉系幹細胞及び骨芽細胞、ヒト由来間葉系幹細胞及び骨芽細胞、ヒト由来間葉系幹細胞及び脂肪前駆細胞、又はヒト由来間葉系幹細胞及び軟骨細胞である場合、好ましくは、上記間隔Ｇ及び寸法Ｄは、下記（１－１）～（１－７）のいずれかの関係を具備する。
　１００ｎｍ≦Ｇ＜１１２．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（１－１）
　１１２．５ｎｍ≦Ｇ＜１３７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（１－２）
　１３７．５ｎｍ≦Ｇ＜１６２．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（１－３）
　１６２．５ｎｍ≦Ｇ＜１８７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（１－４）
　１８７．５ｎｍ≦Ｇ＜２１２．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１８７．５ｎｍ又は２１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（１－５）
　２１２．５ｎｍ≦Ｇ＜２３７．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１３７．５ｎｍ又は２１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（１－６）
　２３７．５ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（１－７）
　より好ましくは、上記間隔Ｇ及び寸法Ｄは、下記（１－１’）～（１－７’）のいずれかの関係を具備する。
　１００ｎｍ≦Ｇ≦１１０ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（１－１’）
　１１５ｎｍ≦Ｇ≦１３５ｎｍ；１１５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（１－２’）
　１４０ｎｍ≦Ｇ≦１６０ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（１－３’）
　１６５ｎｍ≦Ｇ≦１８５ｎｍ；１１５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（１－４’）
　１９０ｎｍ≦Ｇ≦２１０ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦１８５ｎｍ又は２１５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（１－５’）
　２１５ｎｍ≦Ｇ＜２３５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦１３５ｎｍ又は２１５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（１－６’）
　２４０ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（１－７’）
　さらに好ましくは、上記間隔Ｇ及び寸法Ｄは、下記（１－１’’）～（１－７’’）のいずれかの関係を具備する。
　１００ｎｍ≦Ｇ≦１０５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（１－１’’）
　１２０ｎｍ≦Ｇ≦１３０ｎｍ；１２０ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（１－２’’）
　１４５ｎｍ≦Ｇ≦１５５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（１－３’’）
　１７０ｎｍ≦Ｇ≦１８０ｎｍ；１２０ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（１－４’’）
　１９５ｎｍ≦Ｇ≦２０５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦１８０ｎｍ又は２２０ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（１－５’’）
　２２０ｎｍ≦Ｇ≦２３０ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦１３０ｎｍ又は２２０ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（１－６’’）
　２４５ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（１－７’’）
　細胞混合物に含まれる未分化細胞と分化細胞との組み合わせが、マウス由来間葉系幹細胞及び骨芽細胞、並びにヒト由来間葉系幹細胞及び骨芽細胞、ヒト由来間葉系幹細胞及び脂肪前駆細胞、又はヒト由来間葉系幹細胞及び軟骨細胞である場合、好ましくは、上記間隔Ｇ及び寸法Ｄは、下記（２－１）～（２－７）のいずれかの関係を具備する。
　１００ｎｍ≦Ｇ＜１１２．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（２－１）
　１１２．５ｎｍ≦Ｇ＜１３７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ＜１３７．５ｎｍ　…（２－２）
　１３７．５ｎｍ≦Ｇ＜１６２．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ＜１６２．５ｎｍ又は１８７．５ｎｍ≦Ｄ＜２３７．５ｎｍ　…（２－３）
　１６２．５ｎｍ≦Ｇ＜１８７．５ｎｍ；１６２．５ｎｍ≦Ｄ＜２１２．５ｎｍ又は２３７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（２－４）
　１８７．５ｎｍ≦Ｇ＜２１２．５ｎｍ；２１２．５ｎｍ≦Ｄ＜２３７．５ｎｍ　…（２－５）
　２１２．５ｎｍ≦Ｇ＜２３７．５ｎｍ；２３７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（２－６）
　２３７．５ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；１６２．５ｎｍ≦Ｄ＜２３７．５ｎｍ　…（２－７）
　より好ましくは、上記間隔Ｇ及び寸法Ｄは、下記（２－１’）～（２－７’）のいずれかの関係を具備する。
　１００ｎｍ≦Ｇ≦１１０ｎｍ；１１５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（２－１’）
　１１５ｎｍ≦Ｇ≦１３５ｎｍ；１１５ｎｍ≦Ｄ≦１３５ｎｍ　…（２－２’）
　１４０ｎｍ≦Ｇ≦１６０ｎｍ；１１５ｎｍ≦Ｄ≦１６０ｎｍ又は１９０ｎｍ≦Ｄ＜２３５ｎｍ　…（２－３’）
　１６５ｎｍ≦Ｇ≦１８５ｎｍ；１６５ｎｍ≦Ｄ≦２１０ｎｍ又は２４０ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（２－４’）
　１９０ｎｍ≦Ｇ≦２１０ｎｍ；２１５ｎｍ≦Ｄ≦２３５ｎｍ　…（２－５’）
　２１５ｎｍ≦Ｇ≦２３５ｎｍ；２４０ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（２－６’）
　２４０ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；１６５ｎｍ≦Ｄ≦２３５ｎｍ　…（２－７’）
　さらに好ましくは、上記間隔Ｇ及び寸法Ｄは、下記（２－１’’）～（２－７’’）のいずれかの関係を具備する。
　１００ｎｍ≦Ｇ≦１０５ｎｍ；１２０ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（２－１’’）
　１２０ｎｍ≦Ｇ≦１３０ｎｍ；１２０ｎｍ≦Ｄ≦１３０ｎｍ　…（２－２’’）
　１４５ｎｍ≦Ｇ≦１５５ｎｍ；１２０ｎｍ≦Ｄ≦１５５ｎｍ又は１９５ｎｍ≦Ｄ≦２３０ｎｍ　…（２－３’’）
　１７０ｎｍ≦Ｇ≦１８０ｎｍ；１７０ｎｍ≦Ｄ≦２０５ｎｍ又は２４５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（２－４’’）
　１９５ｎｍ≦Ｇ≦２０５ｎｍ；２２０ｎｍ≦Ｄ≦２３０ｎｍ　…（２－５’’）
　２２０ｎｍ≦Ｇ≦２３０ｎｍ；２４５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（２－６’’）
　２４５ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；１７０ｎｍ≦Ｄ≦２３０ｎｍ　…（２－７’’）
　細胞混合物に含まれる未分化細胞と分化細胞との組み合わせが、マウス由来間葉系幹細胞及び骨芽細胞である場合、好ましくは、上記間隔Ｇ及び寸法Ｄは、下記（３－１）～（３－７）のいずれかの関係を具備する。
　１００ｎｍ≦Ｇ＜１１２．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（３－１）
　１１２．５ｎｍ≦Ｇ＜１３７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ＜１３７．５ｎｍ　…（３－２）
　１３７．５ｎｍ≦Ｇ＜１６２．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１６２．５ｎｍ又は１８７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（３－３）
　１６２．５ｎｍ≦Ｇ＜１８７．５ｎｍ；１６２．５ｎｍ≦Ｄ＜２１２．５ｎｍ又は２３７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（３－４）
　１８７．５ｎｍ≦Ｇ＜２１２．５ｎｍ；２１２．５ｎｍ≦Ｄ＜２３７．５ｎｍ　…（３－５）
　２１２．５ｎｍ≦Ｇ＜２３７．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１１２．５ｎｍ又は２３７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（３－６）
　２３７．５ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１３７．５ｎｍ又は１６２．５ｎｍ≦Ｄ＜２３７．５ｎｍ　…（３－７）
　より好ましくは、上記間隔Ｇ及び寸法Ｄは、下記（３－１’）～（３－７’）のいずれかの関係を具備する。
　１００ｎｍ≦Ｇ≦１１０ｎｍ；１１５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（３－１’）
　１１５ｎｍ≦Ｇ≦１３５ｎｍ；１１５ｎｍ≦Ｄ≦１３５ｎｍ　…（３－２’）
　１４０ｎｍ≦Ｇ≦１６０ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦１６０ｎｍ又は１９０ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（３－３’）
　１６５ｎｍ≦Ｇ≦１８５ｎｍ；１６５ｎｍ≦Ｄ≦２１０ｎｍ又は２４０ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（３－４’）
　１９０ｎｍ≦Ｇ≦２１０ｎｍ；２１５ｎｍ≦Ｄ≦２３５ｎｍ　…（３－５’）
　２１５ｎｍ≦Ｇ≦２３５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦１１０ｎｍ又は２４０ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（３－６’）
　２４０ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦１３５ｎｍ又は１６５ｎｍ≦Ｄ≦２３５ｎｍ　…（３－７’）
　さらに好ましくは、上記間隔Ｇ及び寸法Ｄは、下記（３－１’’）～（３－７’’）のいずれかの関係を具備する。
　１００ｎｍ≦Ｇ≦１０５ｎｍ；１２０ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（３－１’’）
　１２０ｎｍ≦Ｇ≦１３０ｎｍ；１２０ｎｍ≦Ｄ≦１３０ｎｍ　…（３－２’’）
　１４５ｎｍ≦Ｇ≦１５５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦１５５ｎｍ又は１９５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（３－３’’）
　１７０ｎｍ≦Ｇ≦１８０ｎｍ；１７０ｎｍ≦Ｄ≦２０５ｎｍ又は２４５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（３－４’’）
　１９５ｎｍ≦Ｇ≦２０５ｎｍ；２２０ｎｍ≦Ｄ≦２３０ｎｍ　…（３－５’’）
　２２０ｎｍ≦Ｇ≦２３０ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦１０５ｎｍ又は２４５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（３－６’’）
　２４５ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦１３０ｎｍ又は１７０ｎｍ≦Ｄ≦２３０ｎｍ　…（３－７’’）
　細胞混合物に含まれる未分化細胞と分化細胞との組み合わせが、ヒト由来間葉系幹細胞及び骨芽細胞、ヒト由来間葉系幹細胞及び脂肪前駆細胞、又はヒト由来間葉系幹細胞及び軟骨細胞である場合、好ましくは、上記間隔Ｇ及び寸法Ｄは、下記（４－１）～（４－７）のいずれかの関係を具備する。
　１００ｎｍ≦Ｇ＜１１２．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（４－１）
　１１２．５ｎｍ≦Ｇ＜１３７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（４－２）
　１３７．５ｎｍ≦Ｇ＜１６２．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（４－３）
　１６２．５ｎｍ≦Ｇ＜１８７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（４－４）
　１８７．５ｎｍ≦Ｇ＜２１２．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１８７．５ｎｍ又は２１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（４－５）
　２１２．５ｎｍ≦Ｇ＜２３７．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１３７．５ｎｍ又は２１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（４－６）
　２３７．５ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；１３７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（４－７）
　より好ましくは、上記間隔Ｇ及び寸法Ｄは、下記（４－１’）～（４－７’）のいずれかの関係を具備する。
　１００ｎｍ≦Ｇ≦１１０ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（４－１’）
　１１５ｎｍ≦Ｇ≦１３５ｎｍ；１１５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（４－２’）
　１４０ｎｍ≦Ｇ≦１６０ｎｍ；１１５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（４－３’）
　１６５ｎｍ≦Ｇ≦１８５ｎｍ；１１５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（４－４’）
　１９０ｎｍ≦Ｇ≦２１０ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦１８５ｎｍ又は２１５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（４－５’）
　２１５ｎｍ≦Ｇ≦２３５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦１３５ｎｍ又は２１５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（４－６’）
　２４０ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；１４０ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（４－７’）
　さらに好ましくは、上記間隔Ｇ及び寸法Ｄは、下記（４－１’’）～（４－７’’）のいずれかの関係を具備する。
　１００ｎｍ≦Ｇ≦１０５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（４－１’’）
　１２０ｎｍ≦Ｇ≦１３０ｎｍ；１２０ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（４－２’’）
　１４５ｎｍ≦Ｇ≦１５５ｎｍ；１２０ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（４－３’’）
　１７０ｎｍ≦Ｇ≦１８０ｎｍ；１２０ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（４－４’’）
　１９５ｎｍ≦Ｇ≦２０５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦１８０ｎｍ又は２２０ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（４－５’’）
　２２０ｎｍ≦Ｇ≦２３０ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦１３０ｎｍ又は２２０ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（４－６’’）
　２４５ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；１４５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（４－７’’）
　細胞混合物に含まれる未分化細胞と分化細胞との組み合わせが、ヒト由来間葉系幹細胞及び骨芽細胞、ヒト由来間葉系幹細胞及び脂肪前駆細胞、並びにヒト由来間葉系幹細胞及び軟骨細胞である場合、好ましくは、上記間隔Ｇ及び寸法Ｄは、下記（５－１）～（５－４）のいずれかの関係を具備する。
　１１２．５ｎｍ≦Ｇ＜１３７．５ｎｍ；１８７．５ｎｍ≦Ｄ＜２１２．５ｎｍ　…（５－１）
　１３７．５ｎｍ≦Ｇ＜１６２．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ＜１３７．５ｎｍ　…（５－２）
　１６２．５ｎｍ≦Ｇ＜１８７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ＜２１２．５ｎｍ　…（５－３）
　２３７．５ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；２３７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（５－４）
　より好ましくは、上記間隔Ｇ及び寸法Ｄは、下記（５－１’）～（５－４’）のいずれかの関係を具備する。
　１１５ｎｍ≦Ｇ≦１３５ｎｍ；１９０ｎｍ≦Ｄ≦２１０ｎｍ　…（５－１’）
　１４０ｎｍ≦Ｇ≦１６０ｎｍ；１１５ｎｍ≦Ｄ≦１３５ｎｍ　…（５－２’）
　１６５ｎｍ≦Ｇ≦１８５ｎｍ；１１５ｎｍ≦Ｄ≦２１０ｎｍ　…（５－３’）
　２４０ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；２４０ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（５－４’）
　さらに好ましくは、上記間隔Ｇ及び寸法Ｄは、下記（５－１’’）～（５－４’’）のいずれかの関係を具備する。
　１２０ｎｍ≦Ｇ≦１３０ｎｍ；１９５ｎｍ≦Ｄ≦２０５ｎｍ　…（５－１’’）
　１４５ｎｍ≦Ｇ≦１５５ｎｍ；１２０ｎｍ≦Ｄ≦１３０ｎｍ　…（５－２’’）
　１７０ｎｍ≦Ｇ≦１８０ｎｍ；１２０ｎｍ≦Ｄ≦２０５ｎｍ　…（５－３’’）
　２４５ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；２４５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（５－４’’）
　ピラー状パターン３の間隔Ｇ及び寸法Ｄが上記（１－１）～（１－７）のいずれかの関係、好ましくは上記（１－１’）～（１－７’）のいずれかの関係、より好ましくは上記（１－１’’）～（１－７’’）のいずれかの関係を具備することで、いずれか一方の細胞（未分化細胞又は分化細胞）がピラー状パターン３に相対的に接着し易く、他方の細胞（分化細胞又は未分化細胞）はピラー状パターン３に相対的に接着し難くなる。
　ピラー状パターン３の間隔Ｇ及び寸法Ｄが上記（２－１）～（２－７）のいずれかの関係、好ましくは上記（２－１’）～（２－７’）のいずれかの関係、より好ましくは上記（２－１’’）～（２－７’’）のいずれかの関係を具備することで、細胞混合物に含まれる未分化細胞と分化細胞とが、マウス由来のものであっても、ヒト由来のものであっても、いずれか一方の細胞（未分化細胞又は分化細胞）がピラー状パターン３に相対的に接着し易く、他方の細胞（分化細胞又は未分化細胞）はピラー状パターン３に相対的に接着し難くなり、汎用性が高くなる。
　細胞混合物に含まれる未分化細胞と分化細胞とがマウス由来のものである場合、ピラー状パターン３の間隔Ｇ及び寸法Ｄが上記（３－１）～（３－７）のいずれかの関係、好ましくは上記（３－１’）～（３－７’）のいずれかの関係、より好ましくは上記（３－１’’）～（３－７’’）のいずれかの関係を具備することで、未分化細胞がピラー状パターン３に相対的に接着し易く、分化細胞がピラー状パターン３に相対的に接着し難くなる。
　細胞混合物に含まれる未分化細胞がヒト由来間葉系幹細胞であって、分化細胞がそれから分化誘導された骨芽細胞、脂肪前駆細胞又は軟骨細胞である場合、ピラー状パターン３の間隔Ｇ及び寸法Ｄが上記（４－１）～（４－７）のいずれかの関係、好ましくは上記（４－１’）～（４－７’）のいずれかの関係、より好ましくは上記（４－１’’）～（４－７’’）のいずれかの関係を具備することで、いずれか一方の細胞（未分化細胞又は分化細胞）がピラー状パターン３に相対的に接着し易く、他方の細胞（分化細胞又は未分化細胞）がピラー状パターン３に相対的に接着し難くなる。
　特に、ピラー状パターン３の間隔Ｇ及び寸法Ｄが上記（５－１）～（５－４）のいずれかの関係、好ましくは上記（５－１’）～（５－４’）のいずれかの関係、より好ましくは上記（５－１’’）～（５－４’’）のいずれかの関係を具備することで、細胞混合物に含まれる未分化細胞がヒト由来間葉系幹細胞であって、分化細胞がそれから分化誘導された骨芽細胞、脂肪前駆細胞及び軟骨細胞のいずれであっても、いずれか一方の細胞（未分化細胞又は分化細胞）がピラー状パターン３に相対的に接着し易く、他方の細胞（分化細胞又は未分化細胞）がピラー状パターン３に相対的に接着し難くなり、汎用性が高くなる。
　このように、細胞混合物に含まれる未分化細胞と分化細胞とのピラー状パターン３に対する接着性の違いを利用して、細胞混合物とピラー状パターン３とを接触させるだけで、当該ピラー状パターン３に相対的に接着し難い細胞を、培養液中に浮遊させることができる。目的とする細胞がピラー状パターン３に相対的に接着し易い細胞である場合、ピラー状パターン３上に残存する当該細胞を容易に分離することができる。一方、目的とする細胞がピラー状パターン３に相対的に接着し難い細胞である場合、培養液を回収することで当該細胞を分離することができる。
　なお、本実施形態において、ピラー状パターン３の間隔Ｇとは、「一のピラー状パターン３の平面視中心Ｃと、それに最近接の他のピラー状パターン３の平面視中心Ｃとを結ぶ直線長さＬからピラー状パターンの寸法Ｄを差し引いた長さ」を意味し、ピラー状パターン３の寸法Ｄとは、「平面視略正方形状のピラー状パターン３であれば当該正方形の一辺の長さ、平面視略円形状のピラー状パターン３であれば当該円の直径」を意味する。
　ピラー状パターン３の高さ（アスペクト比）は、特に限定されるものではなく、ピラー状パターン３の寸法Ｄに応じて、適宜設定され得る。通常、ピラー状パターン３のアスペクト比が０．５～５程度になるように、ピラー状パターン３の高さが設定され得る。
　本実施形態において、ピラー状パターン３が形成される所定の領域ＰＡは、基部２の主面２１の略全面に設定されているが、このような態様に限定されるものではない。例えば、基部２の主面２１を第１～第Ｎの領域（Ｎは２以上の整数である。）に区分し、各領域にピラー状パターン３が形成されていてもよい。この場合、ピラー状パターン３の間隔Ｇ及び寸法Ｄは各領域で同一であってもよいし、異なっていてもよい。
　上述したような構成を有する未分化細胞分離用基板１によれば、後述する実施例から明らかなように、分化細胞と未分化細胞とを含む細胞混合物とピラー状パターン３とを接触させると、未分化細胞及び分化細胞のうちのいずれか一方はピラー状パターン３に相対的に接着し易く、他方はピラー状パターン３に相対的に接着し難い。そのため、細胞混合物から未分化細胞を選択的に、かつ容易に分離することができる。例えば、間隔Ｇ及び寸法Ｄの関係において未分化細胞が相対的に接着し易いピラー状パターン３を有する未分化細胞分離用基板１を用いることで、ピラー状パターン３上に残存する未分化細胞を選択的に、かつ容易に分離することができる。一方、間隔Ｇ及び寸法Ｄの関係において未分化細胞が相対的に接着し難いピラー状パターン３を有する未分化細胞分離用基板１を用いることで、培養液中に浮遊する未分化細胞を選択的に、かつ容易に分離することができる。また、従来の未分化細胞に付与された識別ラベル等を検出することにより当該未分化細胞を分離する方法のように、識別ラベル等の付与・除去操作を必要としないため、本実施形態に係る未分化細胞分離用基板１によれば、細胞混合物から未分化細胞を低侵襲で分離することができる。
　未分化細胞である間葉系幹細胞を患者に投与する再生医療の分野において、間葉系幹細胞のみを選択的に培養することが望まれる場合がある。その間葉系幹細胞の培養工程において、一部が骨芽細胞等に分化し、不要な細胞（分化細胞である骨芽細胞等）が混在してしまうおそれがある。しかしながら、本実施形態に係る未分化細胞分離用基板１を用いれば、そのようにして混在する不要な細胞（分化細胞である骨芽細胞等）を除去し、目的とする間葉系幹細胞を選択的に、かつ容易に分離することができるため、間葉系幹細胞を高い細胞密度で培養することが可能となる。
　また、未分化細胞である間葉系幹細胞を分化させた軟骨細胞を患者に移植する再生医療の分野において、軟骨細胞に分化させるにあたって間葉系幹細胞を選択的に培養し、増殖させることが望ましい場合がある。その間葉系幹細胞の培養工程において、当該間葉系幹細胞の一部が骨芽細胞に分化してしまうことがある。しかしながら、本実施形態に係る未分化細胞分離用基板１を用いれば、意図せずして分化してしまった骨芽細胞を除去することができるため、間葉系幹細胞を高い細胞密度で培養し、増殖させることが可能となる。
　上述したような構成を有する未分化細胞分離用基板１は、例えば、下記のようにして製造することができる。図４は、本実施形態に係る未分化細胞分離用基板１の製造工程を切断端面図にて示す工程フロー図である。
　図４（ａ）に示すように、まず、ハードマスク層３０を備える基板２０を準備し、当該基板２０のハードマスク層３０上にレジスト膜４０を形成し、電子線描画装置等を用いてレジスト膜４０にパターン潜像を形成する。
　基板２０としては、本実施形態に係る未分化細胞分離用基板１の構成材料（例えば、石英ガラス、合成石英ガラス、ソーダガラス、蛍石、フッ化カルシウム、フッ化マグネシウム、アクリルガラス、ホウケイ酸ガラス等のガラス材料；ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン、その他ポリオレフィン等の樹脂材料等の透明材料）からなる基板等を用いることができる。
　ハードマスク層３０を構成する材料としては、例えば、金属クロム、酸化クロム、窒化クロム、酸窒化クロム等を用いることができる。ハードマスク層３０は、後述する工程（図４（ｄ）参照）により基板２０をエッチングするために用いられるハードマスクパターン３１を形成するための層である。そのため、基板２０を構成する材料とのエッチング選択比を考慮した材料により構成される。例えば、基板２０が石英ガラスにより構成される場合、ハードマスク層３０は金属クロム等により構成されるのが望ましい。
　レジスト膜４０を構成するレジスト材料としては、特に限定されるものではなく、従来公知のエネルギー線感応型レジスト材料（例えば、電子線感応型レジスト材料、紫外線感応型レジスト材料等）等を用いることができる。
　レジスト膜４０に形成されるパターン潜像は、未分化細胞分離用基板１におけるピラー状パターン３の間隔Ｇ及び寸法Ｄと実質的に同一の間隔及び寸法で形成される。
　次に、図４（ｂ）に示すように、レジスト膜４０に現像処理を施し、レジストパターン４１を形成し、図４（ｃ）に示すように、レジストパターン４１をマスクとしてハードマスク層３０をエッチングし、ハードマスクパターン３１を形成する。
　その後、図４（ｄ）に示すように、ハードマスクパターン３１をマスクとして基板２０をエッチングして、基板２０の主面２１の所定の領域ＰＡにピラー状パターン３を形成し、最後にハードマスクパターン３１を剥離することで、図４（ｅ）に示すように、基部２と、基部２の主面２１に形成されたピラー状パターン３とを有する未分化細胞分離用基板１を製造することができる。
　上述した構成を有する未分化細胞分離用基板１においては、未分化細胞及び分化細胞を含む細胞混合物にピラー状パターン３を接触させると、未分化細胞及び分化細胞のうちのいずれか一方はピラー状パターン３に接着し易く、他方はピラー状パターン３に接着し難い。この接着性の違いを利用することで、本実施形態に係る未分化細胞分離用基板１は、未分化細胞を選択的に、容易に、かつ低侵襲で分離可能との効果を奏するため、未分化細胞を分離する方法に好適に用いることができる。
　かかる未分化細胞分離方法において、未分化細胞分離用基板１のピラー状パターン３と細胞混合物とを接触させる方法としては、例えば、ディッシュ内に未分化細胞分離用基板１を載置し、当該ディッシュ内に細胞混合物を播種することによりピラー状パターン３と細胞混合物とを接触させる方法等が挙げられる。
　ディッシュ内にて未分化細胞分離用基板１のピラー状パターン３と細胞混合物とを接触させる方法において、当該ピラー状パターン３と細胞混合物とを接触させる時間は、未分化細胞を選択的に分離するのに十分な時間である限り、特に制限されるものではない。
　上述したように、本実施形態によれば、未分化細胞分離用基板１のピラー状パターン３と細胞混合物とを接触させることで、未分化細胞及び分化細胞のうちのいずれか一方はピラー状パターン３に接着し易く、他方はピラー状パターン３に接着し難い。よって、未分化細胞と分化細胞とを含む細胞混合物から、未分化細胞を選択的に、容易に、かつ低侵襲で分離することができる。
　以上説明した実施形態は、本発明の理解を容易にするために記載されたものであって、本発明を限定するために記載されたものではない。したがって、上記実施形態に開示された各要素は、本発明の技術的範囲に属する全ての設計変更や均等物をも含む趣旨である。
　上記実施形態においては、基部２の主面２１に一体的な凹凸構造として形成されたピラー状パターン３を有する未分化細胞分離用基板１を例に挙げて説明したが、本発明はこのような態様に限定されるものではない。例えば、未分化細胞分離用基板１は、基部２の主面２１に、基部２とは別個の部材として構成されるピラー状パターン３を有する凹凸構造体（例えば、ピラー状パターン３を有するシート状部材等）を取り付けてなるものであってもよい。
　上記実施形態においては、エッチングによりピラー状パターン３を形成し、その後ハードマスクパターン３１を剥離することで未分化細胞分離用基板１を製造しているが、本発明はこのような態様に限定されるものではない。例えば、ピラー状パターン３が形成された基部２を、当該ピラー状パターン３の寸法及び高さを変動させることなく薄板化してもよい。また、基部２上の複数の領域にピラー状パターン３を形成し、領域ごとに切断（個片化）することで、未分化細胞分離用基板１を製造してもよい。
　以下、実施例等を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は下記の実施例等により何ら限定されるものではない。
〔試験用未分化細胞分離用基板の製造例１〕
　厚さ６ｎｍのＣｒからなるハードマスク層３０が主面２１に設けられている基板２０としての石英ガラス基板（１５２ｍｍ×１５２ｍｍ，厚さ：６．３５ｍｍ）を用意し、電子線感応型レジスト（製品名：ＳＥＢＰ－９０１２，信越化学工業社製）をハードマスク層３０上に塗布してレジスト膜４０を形成した。当該レジスト膜４０上に電子線描画装置を用いてピラー状のレジストパターン４１を形成した。なお、ピラー状のレジストパターン４１は、図２に示すように、正三角形状の格子Ｇｒの各格子点上に位置するように形成された。また、石英ガラス基板２０の主面２１上の１４ｍｍφの領域ＰＡ内に４９個の区分領域ＰＡ01～ＰＡ49（各領域ＰＡ01～ＰＡ49の大きさ：４５０μｍ×４５０μｍ）を設定し、各領域に間隔Ｇ及び寸法Ｄの異なるピラー状のレジストパターン４１が形成された（図５参照）。
　次に、レジストパターン４１をマスクとして用いてハードマスク層３０をドライエッチング（エッチングガス：Ｃｌ2＋Ｏ2）し、残存するレジストパターン４１を除去して、ハードマスクパターン３１を形成した。
　上述のようにして形成されたハードマスクパターン３１をマスクとして用いて石英ガラス基板２０をエッチングし、石英ガラス基板２０の主面２１の各領域に、所定の間隔Ｇ及び寸法Ｄのピラー状パターン３を形成した。最後に、ハードマスクパターン３１を剥離して、試験用未分化細胞分離用基板を製造した（図５参照）。なお、試験用未分化細胞分離用基板の各領域ＰＡ01～ＰＡ49に形成されたピラー状パターン３の間隔Ｇ及び寸法Ｄを、走査型電子顕微鏡（Ｖｉｓｔｅｃ社製，製品名：ＬＷＭ９０００）を用いて測定したところ、下記表１に示されるとおりであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
〔試験例１〕
　底面に１４ｍｍφの穴が形成されている穴あきディッシュ（３５ｍｍφ）を準備し、ピラー状パターン３が形成されている各領域ＰＡ01～ＰＡ49が当該底面の穴から露出するように、試験用未分化細胞分離用基板を穴あきディッシュの底面の外側に取り付けた。
　次に、マウス由来の間葉系幹細胞（理研ＢＲＣ，未分化細胞）を上記穴あきディッシュ内に播種し、当該未分化細胞と試験用未分化細胞分離用基板のピラー状パターン３とを接触させた。培養液として、ＰＯＷＥＲＥＤＢＹ１０（グライコテクニカ社製）を用いた。
　細胞播種から３６時間後に各領域ＰＡ01～ＰＡ49近傍を撮像した画像に基づき、ピラー状パターン３の間隔Ｇ及び寸法Ｄと、細胞接着の状態との関係を評価する評価試験を行った。
　なお、当該評価試験においては、各領域ＰＡ01～ＰＡ49における細胞数比ＰMU（ＰMU＝Ｎin／(Ｎin＋Ｎout)，Ｎinは「各領域ＰＡ01～ＰＡ49内（ピラー状パターン３上）及び各領域ＰＡ01～ＰＡ49の境界に存在する細胞の数」を、Ｎoutは「各領域ＰＡ01～ＰＡ49と同一面積の領域であって、各領域ＰＡ01～ＰＡ49の外周を取り囲む領域内に存在する細胞の数」を表す。）を算出し、当該細胞数比ＰMUをピラー状パターン３に対する親和性の指標として評価した。
　上記細胞数比ＰMUの数値が大きいほどピラー状パターン３に対して接着しやすい（親和性が高い）と評価することができ、小さいほどピラー状パターン３に対して接着し難い（親和性が低い）と評価することができる。
　評価結果を表２に示す。また、上記評価試験において撮像した領域ＰＡ34近傍の間葉系幹細胞の画像及び間葉系幹細胞の移動軌跡を図６に示す。なお、図６に示す矢印線は、間葉系幹細胞の移動軌跡を表すものである。
〔試験例２〕
　マウス由来の間葉系幹細胞を分化誘導させた骨芽細胞（分化細胞）をディッシュ内に播種した以外は、試験例１と同様にして、各領域ＰＡ01～ＰＡ49における細胞数比ＰMD（ＰMD＝Ｎin／(Ｎin＋Ｎout)，Ｎinは「各領域ＰＡ01～ＰＡ49内（ピラー状パターン３上）及び各領域ＰＡ01～ＰＡ49の境界に存在する細胞の数」を、Ｎoutは「各領域ＰＡ01～ＰＡ49と同一面積の領域であって、各領域ＰＡ01～ＰＡ49の外周を取り囲む領域内に存在する細胞の数」を表す。）を算出することで、ピラー状パターン３の間隔Ｇ及び寸法Ｄと、細胞接着の状態との関係を評価する評価試験を行った。評価結果を表２にあわせて示す。また、評価試験において撮像した領域ＰＡ34近傍の骨芽細胞の画像及び骨芽細胞の移動軌跡を図７に示す。なお、図７に示す矢印線は、骨芽細胞の移動軌跡を表すものである。
〔試験例３〕
　ヒト由来の間葉系幹細胞（未分化細胞）をディッシュ内に播種した以外は、試験例１と同様にして、各領域ＰＡ01～ＰＡ49における細胞数比ＰHU（ＰHU＝Ｎin／(Ｎin＋Ｎout)，Ｎinは「各領域ＰＡ01～ＰＡ49内（ピラー状パターン３上）及び各領域ＰＡ01～ＰＡ49の境界に存在する細胞の数」を、Ｎoutは「各領域ＰＡ01～ＰＡ49と同一面積の領域であって、各領域ＰＡ01～ＰＡ49の外周を取り囲む領域内に存在する細胞の数」を表す。）を算出することで、ピラー状パターン３の間隔Ｇ及び寸法Ｄと、細胞接着の状態との関係を評価する評価試験を行った。評価結果を表２にあわせて示す。また、評価試験において撮像した領域ＰＡ34近傍の間葉系幹細胞の画像及び間葉系幹細胞の移動軌跡を図８に示す。なお、図８に示す矢印線は、間葉系幹細胞の移動軌跡を表すものである。
〔試験例４〕
　ヒト由来の間葉系幹細胞を分化誘導させた骨芽細胞（分化細胞）をディッシュ内に播種した以外は、試験例１と同様にして、各領域ＰＡ01～ＰＡ49における細胞数比ＰHO（ＰHO＝Ｎin／(Ｎin＋Ｎout)，Ｎinは「各領域ＰＡ01～ＰＡ49内（ピラー状パターン３上）及び各領域ＰＡ01～ＰＡ49の境界に存在する細胞の数」を、Ｎoutは「各領域ＰＡ01～ＰＡ49と同一面積の領域であって、各領域ＰＡ01～ＰＡ49の外周を取り囲む領域内に存在する細胞の数」を表す。）を算出することで、ピラー状パターン３の間隔Ｇ及び寸法Ｄと、細胞接着の状態との関係を評価する評価試験を行った。評価結果を表２にあわせて示す。また、評価試験において撮像した領域ＰＡ34近傍の骨芽細胞の画像及び骨芽細胞の移動軌跡を図９に示す。なお、図９に示す矢印線は、骨芽細胞の移動軌跡を表すものである。
〔試験例５〕
　ヒト由来の間葉系幹細胞を分化誘導させた脂肪前駆細胞（分化細胞）をディッシュ内に播種し、培地としてAdipogenic Maintenance Medium（Lonza社製）を使用した以外は、試験例１と同様にして、各領域ＰＡ01～ＰＡ49における細胞数比ＰHA（ＰHA＝Ｎin／(Ｎin＋Ｎout)，Ｎinは「各領域ＰＡ01～ＰＡ49内（ピラー状パターン３上）及び各領域ＰＡ01～ＰＡ49の境界に存在する細胞の数」を、Ｎoutは「各領域ＰＡ01～ＰＡ49と同一面積の領域であって、各領域ＰＡ01～ＰＡ49の外周を取り囲む領域内に存在する細胞の数」を表す。）を算出することで、ピラー状パターン３の間隔Ｇ及び寸法Ｄと、細胞接着の状態との関係を評価する評価試験を行った。評価結果を表２にあわせて示す。また、評価試験において撮像した領域ＰＡ24近傍の脂肪前駆細胞の画像及び脂肪前駆細胞の移動軌跡を図１０に示す。なお、図１０に示す矢印線は、脂肪前駆細胞の移動軌跡を表すものである。
〔試験例６〕
　ヒト由来の間葉系幹細胞を分化誘導させた軟骨細胞（分化細胞）をディッシュ内に播種し、培地としてChondrocyte Growth Medium（PromoCell社製）を使用した以外は、試験例１と同様にして、各領域ＰＡ01～ＰＡ49における細胞数比ＰHC（ＰHC＝Ｎin／(Ｎin＋Ｎout)，Ｎinは「各領域ＰＡ01～ＰＡ49内（ピラー状パターン３上）及び各領域ＰＡ01～ＰＡ49の境界に存在する細胞の数」を、Ｎoutは「各領域ＰＡ01～ＰＡ49と同一面積の領域であって、各領域ＰＡ01～ＰＡ49の外周を取り囲む領域内に存在する細胞の数」を表す。）を算出することで、ピラー状パターン３の間隔Ｇ及び寸法Ｄと、細胞接着の状態との関係を評価する評価試験を行った。評価結果を表２にあわせて示す。また、評価試験において撮像した領域ＰＡ24近傍の軟骨細胞の画像及び軟骨細胞の移動軌跡を図１１に示す。なお、図１１に示す矢印線は、軟骨細胞の移動軌跡を表すものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　試験例１及び試験例２の評価結果から、各領域ＰＡ01～ＰＡ49における未分化細胞捕捉効率ＥMU及び分化細胞捕捉効率ＥMDを下記式により算出した。結果を表３に示す。
　ＥMU＝ＰMU／(ＰMU＋ＰMD)
　ＥMD＝ＰMD／(ＰMU＋ＰMD)
　試験例３及び試験例４の評価結果から、各領域ＰＡ01～ＰＡ49における未分化細胞捕捉効率ＥHOU及び分化細胞捕捉効率ＥHODを下記式により算出した。結果を表３にあわせて示す。
　ＥHOU＝ＰHU／(ＰHU＋ＰHO)
　ＥHOD＝ＰHO／(ＰHU＋ＰHO)
　試験例３及び試験例５の評価結果から、各領域ＰＡ01～ＰＡ49における未分化細胞捕捉効率ＥHAU及び分化細胞捕捉効率ＥHADを下記式により算出した。結果を表３にあわせて示す。
　ＥHAU＝ＰHU／(ＰHU＋ＰHA)
　ＥHAD＝ＰHA／(ＰHU＋ＰHA)
　試験例３及び試験例６の評価結果から、各領域ＰＡ01～ＰＡ49における未分化細胞捕捉効率ＥHCU及び分化細胞捕捉効率ＥHCDを下記式により算出した。結果を表３にあわせて示す。
　ＥHCU＝ＰHU／(ＰHU＋ＰHC)
　ＥHCD＝ＰHC／(ＰHU＋ＰHC)
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３に示す未分化細胞捕捉効率ＥMUの算出結果及び分化細胞捕捉効率ＥMDの算出結果から、マウス由来間葉系幹細胞（未分化細胞）と骨芽細胞（分化細胞）とを含む細胞混合物をピラー状パターン３に接触させた場合に推定される、マウス由来間葉系幹細胞の選択的分離可能性についての総合評価Ａmu及び骨芽細胞の選択的分離可能性ＡMDについての総合評価を表４に示す。
　表３に示す未分化細胞捕捉効率ＥHOUの算出結果及び分化細胞捕捉効率ＥHODの算出結果から、ヒト由来間葉系幹細胞（未分化細胞）と骨芽細胞（分化細胞）とを含む細胞混合物をピラー状パターン３に接触させた場合に推定される、ヒト由来間葉系幹細胞の選択的分離可能性についての総合評価ＡHOU及び骨芽細胞の選択的分離可能性についての総合評価ＡHODを表４にあわせて示す。
　表３に示す未分化細胞捕捉効率ＥHAUの算出結果及び分化細胞捕捉効率ＥHADの算出結果から、ヒト由来間葉系幹細胞（未分化細胞）と脂肪前駆細胞（分化細胞）とを含む細胞混合物をピラー状パターン３に接触させた場合に推定される、ヒト由来間葉系幹細胞の選択的分離可能性についての総合評価ＡHAU及び脂肪前駆細胞の選択的分離可能性についての総合評価ＡHADを表４にあわせて示す。
　表３に示す未分化細胞捕捉効率ＥHCUの算出結果及び分化細胞捕捉効率ＥHCDの算出結果から、ヒト由来間葉系幹細胞（未分化細胞）と軟骨細胞（分化細胞）とを含む細胞混合物をピラー状パターン３に接触させた場合に推定される、ヒト由来間葉系幹細胞の選択的分離可能性についての総合評価ＡHCU及び軟骨細胞の選択的分離可能性についての総合評価ＡHCDを表４にあわせて示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表４において、総合評価の「◎」、「○」、「△」及び「×」は、下記指標に基づくものである。
　◎：ＥMU，ＥHOU，ＥHAU，ＥHCU＞０．８；ＥMD，ＥHOD，ＥHAD，ＥHCD＞０．８
　○：０．６＜ＥMU，ＥHOU，ＥHAU，ＥHCU≦０．８；０．６＜ＥMD，ＥHOD，ＥHAD，ＥHCD≦０．８
　△：０．５＜ＥMU，ＥHOU，ＥHAU，ＥHCU≦０．６；０．５＜ＥMD，ＥHOD，ＥHAD，ＥHCD≦０．６
　×：ＥMU，ＥHOU，ＥHAU，ＥHCU≦０．５；ＥMD，ＥHOD，ＥHAD，ＥHCD≦０．５
　表２～４に示す結果、並びに図６～１１から、ナノ凹凸構造体、特に間隔Ｇ及び寸法Ｄが、いずれも１００～２５０ｎｍの範囲内であるピラー状パターン３であれば、細胞の接着性を変化させ得る傾向が見出された。さらに、その接着性の変化は、細胞の分化状態によって異なることが明らかとなった。間葉系幹細胞の捕捉効率ＥMD，ＥHODが相対的に高いピラー状パターン３を有する領域（表４に示す総合評価が「◎」又は「○」の領域）においては、間葉系幹細胞とそれから分化誘導させた骨芽細胞とを含む細胞混合物中の間葉系幹細胞がピラー状パターン３に相対的に接着し易くなるため、当該細胞混合物を当該ピラー状パターン３に接触させるだけで、当該細胞混合物から間葉系幹細胞を選択的に、かつ容易に分離・取得することができる、又は間葉系幹細胞の細胞密度を高めることができると考えられる。一方、間葉系幹細胞から分化誘導させた分化細胞（骨芽細胞、脂肪前駆細胞、軟骨細胞等）の捕捉効率ＥMD，ＥHOD，ＥHAD，ＥHCDが相対的に高いピラー状パターン３を有する領域（表４に示す総合評価が「◎」又は「○」の領域）においては、間葉系幹細胞とそれから分化した分化細胞とを含む細胞混合物中の分化細胞がピラー状パターン３に相対的に接着し易くなるため、当該細胞混合物を当該ピラー状パターン３に接触させるだけで、当該細胞混合物から間葉系幹細胞を選択的に、かつ容易に分離・取得することができる、又は間葉系幹細胞の細胞密度を高めることができると考えられる。
　上記試験例の結果から明らかなように、寸法Ｄ（Ｄ＝１００～２５０ｎｍ）の複数のピラー状パターン３を間隔Ｇ（Ｇ＝１００～２５０ｎｍ）で規則性を有して配列されたナノ凹凸構造体を用いると、未分化細胞及び分化細胞を含む細胞混合物と、ピラー状パターン３とを接触させるだけで、細胞の接着性の違いに基づき、当該細胞混合物から、未分化細胞を選択的に、かつ容易に分離し、取得することができると考えられる。
　好ましくは下記（１－１）～（１－７）に示す関係を具備する間隔Ｇ及び寸法Ｄを有するピラー状パターン３が形成された未分化細胞分離用基板１を用いることで、細胞の接着性の違いに基づき、細胞混合物から未分化細胞を選択的に、かつ容易に分離・取得する、又は未分化細胞の細胞密度を高めることができる。
　１００ｎｍ≦Ｇ＜１１２．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（１－１）
　１１２．５ｎｍ≦Ｇ＜１３７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（１－２）
　１３７．５ｎｍ≦Ｇ＜１６２．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（１－３）
　１６２．５ｎｍ≦Ｇ＜１８７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（１－４）
　１８７．５ｎｍ≦Ｇ＜２１２．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１８７．５ｎｍ又は２１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（１－５）
　２１２．５ｎｍ≦Ｇ＜２３７．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１３７．５ｎｍ又は２１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（１－６）
　２３７．５ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（１－７）
　特に好ましくは下記（２－１）～（２－７）に示す関係を具備する間隔Ｇ及び寸法Ｄを有するピラー状パターン３が形成された未分化細胞分離用基板１を用いることで、細胞の種類に依存することなく、細胞の接着性の違いに基づき、細胞混合物から未分化細胞を選択的に、かつ容易に分離・取得する、又は未分化細胞の細胞密度を高めることができる。
　１００ｎｍ≦Ｇ＜１１２．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（２－１）
　１１２．５ｎｍ≦Ｇ＜１３７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ＜１３７．５ｎｍ　…（２－２）
　１３７．５ｎｍ≦Ｇ＜１６２．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ＜１６２．５ｎｍ又は１８７．５ｎｍ≦Ｄ＜２３７．５ｎｍ　…（２－３）
　１６２．５ｎｍ≦Ｇ＜１８７．５ｎｍ；１６２．５ｎｍ≦Ｄ＜２１２．５ｎｍ又は２３７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（２－４）
　１８７．５ｎｍ≦Ｇ＜２１２．５ｎｍ；２１２．５ｎｍ≦Ｄ＜２３７．５ｎｍ　…（２－５）
　２１２．５ｎｍ≦Ｇ＜２３７．５ｎｍ；２３７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（２－６）
　２３７．５ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；１６２．５ｎｍ≦Ｄ＜２３７．５ｎｍ　…（２－７）
　細胞混合物に含まれる未分化細胞がマウス由来間葉系幹細胞であって、分化細胞がそれから分化誘導させた骨芽細胞である場合、好ましくは下記（３－１）～（３－７）に示す関係を具備する間隔Ｇ及び寸法Ｄを有するピラー状パターン３が形成された未分化細胞分離用基板１を用いることで、細胞の接着性の違いに基づき、細胞混合物から未分化細胞を選択的に、かつ容易に分離・取得する、又は未分化細胞の細胞密度を高めることができる。
　１００ｎｍ≦Ｇ＜１１２．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（３－１）
　１１２．５ｎｍ≦Ｇ＜１３７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ＜１３７．５ｎｍ　…（３－２）
　１３７．５ｎｍ≦Ｇ＜１６２．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１６２．５ｎｍ又は１８７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（３－３）
　１６２．５ｎｍ≦Ｇ＜１８７．５ｎｍ；１６２．５ｎｍ≦Ｄ＜２１２．５ｎｍ又は２３７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（３－４）
　１８７．５ｎｍ≦Ｇ＜２１２．５ｎｍ；２１２．５ｎｍ≦Ｄ＜２３７．５ｎｍ　…（３－５）
　２１２．５ｎｍ≦Ｇ＜２３７．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１１２．５ｎｍ又は２３７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（３－６）
　２３７．５ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１３７．５ｎｍ又は１６２．５ｎｍ≦Ｄ＜２３７．５ｎｍ　…（３－７）
　細胞混合物に含まれる未分化細胞がヒト由来間葉系幹細胞であって、分化細胞がそれから分化誘導させた骨芽細胞、脂肪前駆細胞又は軟骨細胞である場合、好ましくは下記（４－１）～（４－７）に示す関係を具備する間隔Ｇ及び寸法Ｄを有するピラー状パターン３が形成された未分化細胞分離用基板１を用いることで、細胞の接着性の違いに基づき、細胞混合物から未分化細胞を選択的に、かつ容易に分離・取得する、又は未分化細胞の細胞密度を高めることができる。
　１００ｎｍ≦Ｇ＜１１２．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（４－１）
　１１２．５ｎｍ≦Ｇ＜１３７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（４－２）
　１３７．５ｎｍ≦Ｇ＜１６２．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（４－３）
　１６２．５ｎｍ≦Ｇ＜１８７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（４－４）
　１８７．５ｎｍ≦Ｇ＜２１２．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１８７．５ｎｍ又は２１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（４－５）
　２１２．５ｎｍ≦Ｇ＜２３７．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１３７．５ｎｍ又は２１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（４－６）
　２３７．５ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；１３７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（４－７）
　特に好ましくは下記（５－１）～（５－４）に示す関係を具備する間隔Ｇ及び寸法Ｄを有するピラー状パターン３が形成された未分化細胞分離用基板１を用いることで、細胞混合物に含まれる未分化細胞がヒト由来間葉系幹細胞であって、分化細胞がそれから分化誘導させた骨芽細胞、脂肪前駆細胞及び軟骨細胞のいずれの場合であっても、細胞の接着性の違いに基づき、細胞混合物から未分化細胞を選択的に、かつ容易に分離・取得する、又は未分化細胞の細胞密度を高めることができる。
　１１２．５ｎｍ≦Ｇ＜１３７．５ｎｍ；１８７．５ｎｍ≦Ｄ＜２１２．５ｎｍ　…（５－１）
　１３７．５ｎｍ≦Ｇ＜１６２．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ＜１３７．５ｎｍ　…（５－２）
　１６２．５ｎｍ≦Ｇ＜１８７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ＜２１２．５ｎｍ　…（５－３）
　２３７．５ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；２３７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（５－４）
　以上のように、当該未分化細胞分離用基板１のピラー状パターン３と、未分化細胞及び分化細胞を含む細胞混合物とを接触させるだけで、当該細胞混合物から未分化細胞を選択的に、かつ容易に分離・取得する、又は未分化細胞の細胞密度を高めることができる。
　本発明は、未分化細胞や分化細胞を用いた再生医療に関する技術分野等において有用である。
１…未分化細胞分離用基板
２…基部（基材）
　２１…主面（第１面）
３…ピラー状パターン

Claims (24)

  1. 　未分化細胞と分化細胞とを含む細胞混合物から前記未分化細胞を分離する方法であって、
    　複数のピラー状パターンが規則性を有して配列されてなるナノ凹凸構造体を用い、前記複数のピラー状パターンに前記細胞混合物を接触させる工程を含み、
    　前記ピラー状パターンの間隔Ｇと寸法Ｄとが、前記未分化細胞及び前記分化細胞のうちのいずれか一方が前記ピラー状パターンに接着し易く、他方が前記ピラー状パターンに接着し難い関係を有することを特徴とする未分化細胞の分離方法。
  2. 　前記ピラー状パターンの間隔Ｇと寸法Ｄとが、いずれも５０～５００ｎｍの範囲内であることを特徴とする請求項１に記載の未分化細胞の分離方法。
  3. 　前記ピラー状パターンの間隔Ｇと寸法Ｄとが、いずれも１００～２５０ｎｍの範囲内であることを特徴とする請求項１又は２に記載の未分化細胞の分離方法。
  4. 　前記ピラー状パターンの間隔Ｇと寸法Ｄとが、下記（１－１）～（１－７）のいずれかの関係を有することを特徴とする請求項１～３のいずれかに記載の未分化細胞の分離方法。
    １００ｎｍ≦Ｇ＜１１２．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（１－１）
    １１２．５ｎｍ≦Ｇ＜１３７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（１－２）
    １３７．５ｎｍ≦Ｇ＜１６２．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（１－３）
    １６２．５ｎｍ≦Ｇ＜１８７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（１－４）
    １８７．５ｎｍ≦Ｇ＜２１２．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１８７．５ｎｍ又は２１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（１－５）
    ２１２．５ｎｍ≦Ｇ＜２３７．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１３７．５ｎｍ又は２１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（１－６）
    ２３７．５ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（１－７）
  5. 　前記ピラー状パターンの間隔Ｇと寸法Ｄとが、下記（２－１）～（２－７）のいずれかの関係を有することを特徴とする請求項１～３のいずれかに記載の未分化細胞の分離方法。
    １００ｎｍ≦Ｇ＜１１２．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（２－１）
    １１２．５ｎｍ≦Ｇ＜１３７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ＜１３７．５ｎｍ　…（２－２）
    １３７．５ｎｍ≦Ｇ＜１６２．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ＜１６２．５ｎｍ又は１８７．５ｎｍ≦Ｄ＜２３７．５ｎｍ　…（２－３）
    １６２．５ｎｍ≦Ｇ＜１８７．５ｎｍ；１６２．５ｎｍ≦Ｄ＜２１２．５ｎｍ又は２３７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（２－４）
    １８７．５ｎｍ≦Ｇ＜２１２．５ｎｍ；２１２．５ｎｍ≦Ｄ＜２３７．５ｎｍ　…（２－５）
    ２１２．５ｎｍ≦Ｇ＜２３７．５ｎｍ；２３７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（２－６）
    ２３７．５ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；１６２．５ｎｍ≦Ｄ＜２３７．５ｎｍ　…（２－７）
  6. 　前記ピラー状パターンの間隔Ｇと寸法Ｄとが、下記（３－１）～（３－７）のいずれかの関係を有することを特徴とする請求項１～３のいずれかに記載の未分化細胞の分離方法。
    １００ｎｍ≦Ｇ＜１１２．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（３－１）
    １１２．５ｎｍ≦Ｇ＜１３７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ＜１３７．５ｎｍ　…（３－２）
    １３７．５ｎｍ≦Ｇ＜１６２．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１６２．５ｎｍ又は１８７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（３－３）
    １６２．５ｎｍ≦Ｇ＜１８７．５ｎｍ；１６２．５ｎｍ≦Ｄ＜２１２．５ｎｍ又は２３７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（３－４）
    １８７．５ｎｍ≦Ｇ＜２１２．５ｎｍ；２１２．５ｎｍ≦Ｄ＜２３７．５ｎｍ　…（３－５）
    ２１２．５ｎｍ≦Ｇ＜２３７．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１１２．５ｎｍ又は２３７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（３－６）
    ２３７．５ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１３７．５ｎｍ又は１６２．５ｎｍ≦Ｄ＜２３７．５ｎｍ　…（３－７）
  7. 　前記ピラー状パターンの間隔Ｇと寸法Ｄとが、下記（４－１）～（４－７）のいずれかの関係を有することを特徴とする請求項１～３のいずれかに記載の未分化細胞の分離方法。
    １００ｎｍ≦Ｇ＜１１２．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（４－１）
    １１２．５ｎｍ≦Ｇ＜１３７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（４－２）
    １３７．５ｎｍ≦Ｇ＜１６２．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（４－３）
    １６２．５ｎｍ≦Ｇ＜１８７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（４－４）
    １８７．５ｎｍ≦Ｇ＜２１２．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１８７．５ｎｍ又は２１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（４－５）
    ２１２．５ｎｍ≦Ｇ＜２３７．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１３７．５ｎｍ又は２１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（４－６）
    ２３７．５ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；１３７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（４－７）
  8. 　前記ピラー状パターンの間隔Ｇと寸法Ｄとが、下記（５－１）～（５－４）のいずれかの関係を有することを特徴とする請求項１～３のいずれかに記載の未分化細胞の分離方法。
    １１２．５ｎｍ≦Ｇ＜１３７．５ｎｍ；１８７．５ｎｍ≦Ｄ＜２１２．５ｎｍ　…（５－１）
    １３７．５ｎｍ≦Ｇ＜１６２．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ＜１３７．５ｎｍ　…（５－２）
    １６２．５ｎｍ≦Ｇ＜１８７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ＜２１２．５ｎｍ　…（５－３）
    ２３７．５ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；２３７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（５－４）
  9. 　前記未分化細胞が、マウスに由来する間葉系幹細胞であり、
    　前記分化細胞が、前記未分化細胞から分化した骨芽細胞であることを特徴とする請求項１～６のいずれかに記載の未分化細胞の分離方法。
  10. 　前記未分化細胞が、ヒトに由来する間葉系幹細胞であることを特徴とする請求項１～５、並びに請求項７及び請求項８のいずれかに記載の未分化細胞の分離方法。
  11. 　前記凹凸構造体は、前記複数のピラー状パターンが正三角形格子の各格子点上に配列されてなることを特徴とする請求項１～１０のいずれかに記載の未分化細胞の分離方法。
  12. 　前記凹凸構造体は、前記複数のピラー状パターンが方形格子の各格子点上に配列されてなることを特徴とする請求項１～１０のいずれかに記載の未分化細胞の分離方法。
  13. 　未分化細胞と分化細胞とを含む細胞混合物から前記未分化細胞を分離するために用いられる未分化細胞分離用基板であって、
    　第１面及び前記第１面に対向する第２面を有する基材と、
    　前記基材の前記第１面に規則性を有して配列形成されてなる複数のピラー状ナノパターンと
    を備え、
    　前記ピラー状ナノパターンの間隔Ｇと寸法Ｄとが、前記未分化細胞及び前記分化細胞のうちのいずれか一方が前記ピラー状ナノパターンに接着し易く、他方が前記ピラー状ナノパターンに接着し難い関係を有することを特徴とする未分化細胞分離用基板。
  14. 　前記ピラー状ナノパターンの間隔Ｇと寸法Ｄとが、いずれも５０～５００ｎｍの範囲内であることを特徴とする請求項１３に記載の未分化細胞分離用基板。
  15. 　前記ピラー状ナノパターンの間隔Ｇと寸法Ｄとが、いずれも１００～２５０ｎｍの範囲内であることを特徴とする請求項１３又は１４に記載の未分化細胞分離用基板。
  16. 　前記ピラー状パターンの間隔Ｇと寸法Ｄとが、下記（１－１）～（１－７）のいずれかの関係を有することを特徴とする請求項１３～１５のいずれかに記載の未分化細胞分離用基板。
    １００ｎｍ≦Ｇ＜１１２．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（１－１）
    １１２．５ｎｍ≦Ｇ＜１３７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（１－２）
    １３７．５ｎｍ≦Ｇ＜１６２．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（１－３）
    １６２．５ｎｍ≦Ｇ＜１８７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（１－４）
    １８７．５ｎｍ≦Ｇ＜２１２．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１８７．５ｎｍ又は２１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（１－５）
    ２１２．５ｎｍ≦Ｇ＜２３７．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１３７．５ｎｍ又は２１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（１－６）
    ２３７．５ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（１－７）
  17. 　前記ピラー状パターンの間隔Ｇと寸法Ｄとが、下記（２－１）～（２－７）のいずれかの関係を有することを特徴とする請求項１３～１５のいずれかに記載の未分化細胞分離用基板。
    １００ｎｍ≦Ｇ＜１１２．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（２－１）
    １１２．５ｎｍ≦Ｇ＜１３７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ＜１３７．５ｎｍ　…（２－２）
    １３７．５ｎｍ≦Ｇ＜１６２．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ＜１６２．５ｎｍ又は１８７．５ｎｍ≦Ｄ＜２３７．５ｎｍ　…（２－３）
    １６２．５ｎｍ≦Ｇ＜１８７．５ｎｍ；１６２．５ｎｍ≦Ｄ＜２１２．５ｎｍ又は２３７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（２－４）
    １８７．５ｎｍ≦Ｇ＜２１２．５ｎｍ；２１２．５ｎｍ≦Ｄ＜２３７．５ｎｍ　…（２－５）
    ２１２．５ｎｍ≦Ｇ＜２３７．５ｎｍ；２３７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（２－６）
    ２３７．５ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；１６２．５ｎｍ≦Ｄ＜２３７．５ｎｍ　…（２－７）
  18. 　前記ピラー状パターンの間隔Ｇと寸法Ｄとが、下記（３－１）～（３－７）のいずれかの関係を有することを特徴とする請求項１３～１５のいずれかに記載の未分化細胞分離用基板。
    １００ｎｍ≦Ｇ＜１１２．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（３－１）
    １１２．５ｎｍ≦Ｇ＜１３７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ＜１３７．５ｎｍ　…（３－２）
    １３７．５ｎｍ≦Ｇ＜１６２．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１６２．５ｎｍ又は１８７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（３－３）
    １６２．５ｎｍ≦Ｇ＜１８７．５ｎｍ；１６２．５ｎｍ≦Ｄ＜２１２．５ｎｍ又は２３７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（３－４）
    １８７．５ｎｍ≦Ｇ＜２１２．５ｎｍ；２１２．５ｎｍ≦Ｄ＜２３７．５ｎｍ　…（３－５）
    ２１２．５ｎｍ≦Ｇ＜２３７．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１１２．５ｎｍ又は２３７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（３－６）
    ２３７．５ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１３７．５ｎｍ又は１６２．５ｎｍ≦Ｄ＜２３７．５ｎｍ　…（３－７）
  19. 　前記ピラー状パターンの間隔Ｇと寸法Ｄとが、下記（４－１）～（４－７）のいずれかの関係を有することを特徴とする請求項１３～１５のいずれかに記載の未分化細胞分離用基板。
    １００ｎｍ≦Ｇ＜１１２．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（４－１）
    １１２．５ｎｍ≦Ｇ＜１３７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（４－２）
    １３７．５ｎｍ≦Ｇ＜１６２．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（４－３）
    １６２．５ｎｍ≦Ｇ＜１８７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（４－４）
    １８７．５ｎｍ≦Ｇ＜２１２．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１８７．５ｎｍ又は２１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（４－５）
    ２１２．５ｎｍ≦Ｇ＜２３７．５ｎｍ；１００ｎｍ≦Ｄ＜１３７．５ｎｍ又は２１２．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（４－６）
    ２３７．５ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；１３７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（４－７）
  20. 　前記ピラー状パターンの間隔Ｇと寸法Ｄとが、下記（５－１）～（５－４）のいずれかの関係を有することを特徴とする請求項１３～１５のいずれかに記載の未分化細胞分離用基板。
    １１２．５ｎｍ≦Ｇ＜１３７．５ｎｍ；１８７．５ｎｍ≦Ｄ＜２１２．５ｎｍ　…（５－１）
    １３７．５ｎｍ≦Ｇ＜１６２．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ＜１３７．５ｎｍ　…（５－２）
    １６２．５ｎｍ≦Ｇ＜１８７．５ｎｍ；１１２．５ｎｍ≦Ｄ＜２１２．５ｎｍ　…（５－３）
    ２３７．５ｎｍ≦Ｇ≦２５０ｎｍ；２３７．５ｎｍ≦Ｄ≦２５０ｎｍ　…（５－４）
  21. 　前記未分化細胞が、マウスに由来する間葉系幹細胞であり、
    　前記分化細胞が、前記未分化細胞から分化した骨芽細胞であることを特徴とする請求項１３～１８のいずれかに記載の未分化細胞分離用基板。
  22. 　前記未分化細胞が、ヒトに由来する間葉系幹細胞であることを特徴とする請求項１３～１７、並びに請求項１９及び２０のいずれかに記載の未分化細胞分離用基板。
  23. 　前記複数のピラー状パターンは、正三角形格子の各格子点上に配列されていることを特徴とする請求項１３～２２のいずれかに記載の未分化細胞分離用基板。
  24. 　前記複数のピラー状パターンは、方形格子の各格子点上に配列されていることを特徴とする請求項１３～２２のいずれかに記載の未分化細胞分離用基板。
PCT/JP2015/085443 2014-12-22 2015-12-18 未分化細胞の分離方法及び未分化細胞分離用基板 Ceased WO2016104344A1 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2016566184A JP6695810B2 (ja) 2014-12-22 2015-12-18 未分化細胞の分離方法及び未分化細胞分離用基板

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2014-258564 2014-12-22
JP2014258564 2014-12-22

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2016104344A1 true WO2016104344A1 (ja) 2016-06-30

Family

ID=56150364

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2015/085443 Ceased WO2016104344A1 (ja) 2014-12-22 2015-12-18 未分化細胞の分離方法及び未分化細胞分離用基板

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JP6695810B2 (ja)
WO (1) WO2016104344A1 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2019041719A (ja) * 2017-09-06 2019-03-22 大日本印刷株式会社 細胞培養用構造体、細胞培養容器及び細胞培養用構造体の製造方法
JP2020156443A (ja) * 2019-03-28 2020-10-01 東京都公立大学法人 細胞培養用基板および間葉系幹細胞の分化制御方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0276570A (ja) * 1988-09-13 1990-03-15 Dainippon Printing Co Ltd 細胞培養基板
JP2015142526A (ja) * 2014-01-31 2015-08-06 大日本印刷株式会社 被分離体の分離方法、及び被分離体分離用基板

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0276570A (ja) * 1988-09-13 1990-03-15 Dainippon Printing Co Ltd 細胞培養基板
JP2015142526A (ja) * 2014-01-31 2015-08-06 大日本印刷株式会社 被分離体の分離方法、及び被分離体分離用基板

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HUANG LR ET AL.: "Continuous particle separation through deterministic lateral displacement.", SCIENCE, vol. 304, no. 5673, 14 May 2004 (2004-05-14), pages 987 - 990 *
MASUMI YAMADA ET AL.: "Saibo no Bunri · Senbatsu no Tameno Micro Ryutai Device", JOURNAL OF THE SOCIETY FOR BIOSCIENCE AND BIOENGINEERING, vol. 92, no. 4, 25 April 2014 (2014-04-25), pages 153 - 156 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2019041719A (ja) * 2017-09-06 2019-03-22 大日本印刷株式会社 細胞培養用構造体、細胞培養容器及び細胞培養用構造体の製造方法
JP2020156443A (ja) * 2019-03-28 2020-10-01 東京都公立大学法人 細胞培養用基板および間葉系幹細胞の分化制御方法
JP7320827B2 (ja) 2019-03-28 2023-08-04 東京都公立大学法人 細胞培養用基板および間葉系幹細胞の分化制御方法

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2016104344A1 (ja) 2017-11-30
JP6695810B2 (ja) 2020-05-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7390751B2 (ja) 細胞培養基材、がん細胞集合体及び該基材を用いたその製造方法、並びに該がん細胞集合体を用いた薬剤のスクリーニング方法
JP5497011B2 (ja) 哺乳類の幹細胞の成長および分化のための生体適合性材料
EP1874367B1 (en) Biocompatible material for surgical implants and cell guiding tissue culture surfaces
Girard et al. Isolating nasal olfactory stem cells from rodents or humans
JP2020036621A (ja) 細胞培養支持体、細胞培養装置、細胞培養キット、及び細胞シート
WO2016104344A1 (ja) 未分化細胞の分離方法及び未分化細胞分離用基板
JPWO2020090860A1 (ja) ｍｉＲＮＡの抽出方法、および、ｍｉＲＮＡの解析方法
WO2020090859A1 (ja) 細胞外小胞を捕捉するために用いられるデバイス、細胞外小胞の保存方法および移送方法
Bérces et al. Effect of nanostructures on anchoring stem cell-derived neural tissue to artificial surfaces
JP2017205021A (ja) 初代癌細胞のスフェロイド作製方法、スフェロイド、スクリーニング方法、及び、診断方法
JPWO2011052281A1 (ja) 神経スフェロイドネットワークの構築方法
Chen et al. Regulation of stem cell functions by micro-patterned structures
JP7813435B2 (ja) 細胞塊形成部材、培養容器、培養細胞の生産方法、細胞塊形成部材付き培養細胞
JP2014138605A (ja) 哺乳類の幹細胞の成長および分化のための生体適合性材料
JP2019041719A (ja) 細胞培養用構造体、細胞培養容器及び細胞培養用構造体の製造方法
JP7053065B1 (ja) 細胞シート製造用細胞培養器材、回収用支持体、及び細胞シート製造用キット
JP6597118B2 (ja) 細胞挙動評価用基板、細胞挙動評価用容器及び細胞挙動評価方法
TWI920175B (zh) 細胞層片製造用細胞培養器材、細胞層片製造用套組及細胞層片製造方法
JP7802784B2 (ja) 組織工学におけるフラクタル
Sgro et al. A high-throughput method for generating uniform microislands for autaptic neuronal cultures
JP2010068766A (ja) 三次元細胞構造体の作製方法
Liu et al. Schwann Cells Migration on Patterned PDMS Microgrooved Surface
GR1009056B (el) Νανοδομημενα με ηλεκτρικες εκκενωσεις πλασματος υποστρωματα για επιλεκτικο εμπλουτισμο καρκινικων κυτταρων
Özçelik Interaction between micro and nano patterned polymeric surfaces and different cell types
WO2020204106A1 (ja) 三次元培養皮膚シート、その製造に使用するための細胞培養容器及びその製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 15872913

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2016566184

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 15872913

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1