JPWO2020090860A1 - miRNAの抽出方法、および、miRNAの解析方法 - Google Patents
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Abstract
Description
サンプル液とデバイスとを接触させることで、サンプル液中の細胞外小胞をデバイスに捕捉する細胞外小胞捕捉工程、
細胞外小胞を捕捉したデバイスを細胞外小胞の破砕液と接触させることで、細胞外小胞を破砕し、細胞外小胞からmiRNAを破砕液中に抽出するmiRNA抽出工程、
を含む、miRNAの抽出方法。
(2)前記細胞外小胞捕捉工程と前記miRNA抽出工程との間に、細胞外小胞を捕捉したデバイスを洗浄するデバイス洗浄工程、
を含む、上記(1)に記載のmiRNAの抽出方法。
(3)前記デバイスが、破砕液に対して耐久性がある材料で形成されている、
上記(1)または(2)に記載のmiRNAの抽出方法。
(4)該デバイスは、セルロースファイバーで構成された不織布を含む、上記(1)〜(3)のいずれかに記載miRNAの抽出方法。
(5)セルロースファイバーが、セルロースナノファイバーである、上記(4)に記載のmiRNAの抽出方法。
(6)前記デバイスが、
ナノワイヤ、
セルロースファイバーを用いて作製した構造体、および、
セルロースナノファイバーを用いて作製した構造体、
から選択される何れか一つを含む、
上記(3)に記載のmiRNAの抽出方法。
(7)前記デバイスが、セルロースナノファイバーを用いて作製した構造体である、
上記(6)に記載のmiRNAの抽出方法。
(8)前記サンプル液が、非侵襲性の生体サンプル液である、
上記(1)〜(7)の何れか一つに記載のmiRNAの抽出方法。
(9)前記サンプル液が、唾液である、
上記(8)に記載のmiRNAの抽出方法。
(10)上記(1)〜(9)の何れか一つに記載のmiRNAの抽出方法で抽出した破砕液中に含まれるmiRNAを解析する解析工程を含む、
サンプル液中の細胞外小胞に含まれるmiRNAの解析方法。
図1を参照して、抽出方法の第1の実施形態について説明する。図1は、抽出方法の第1の実施形態のフローチャートである。抽出方法の第1の実施形態は、細胞外小胞(EVs)捕捉工程(ST1)、miRNA抽出工程(ST2)を含んでいる。細胞外小胞(EVs)捕捉工程(ST1)では、サンプル液とEVsを捕捉できるデバイスとを接触させることで、サンプル液中のEVsをデバイスに捕捉する。miRNA抽出工程(ST2)では、EVsを捕捉したデバイスをEVsの破砕液と接触させることでEVsを破砕し、EVsからmiRNAを破砕液中に抽出する。
抽出方法の第2の実施形態は、図1に示す細胞外小胞(EVs)捕捉工程(ST1)とmiRNA抽出工程(ST2)の間に、EVsを捕捉したデバイスを洗浄するデバイス洗浄工程を含む点で抽出方法の第1の実施形態と異なり、その他の点は抽出方法の第1の実施形態と同様である。生体から抽出した生体サンプル液、例えば、唾液、汗、鼻水等には、外部から侵入したウイルス等から生体を守るため、ウイルス等の異物のRNAを分解する酵素であるRNaseを含んでいる。そのため、唾液、汗、鼻水等のRNaseを含む生体サンプル液からmiRNAを抽出する場合、細胞外小胞捕捉工程の際に、デバイスにRNaseが吸着する恐れがある。そして、RNaseが吸着したデバイスでmiRNA抽出工程を実施すると、EVsから抽出したmiRNAがRNaseにより分解される恐れがある。
miRNAの解析方法の実施形態は、抽出方法の第1または第2の実施形態により抽出した破砕液中のmiRNAを解析する解析工程を含んでいる。miRNAの解析は、公知のmiRNA解析方法を用いればよい。例えば、(1)miRneasy Mini Kit(QIAGEN)を用いてmiRNAを含む全RNAを抽出し、3D−Gene(登録商標)miRNAチップを用いて約2500種のmiRNAの中から網羅的解析を行い、チップ画像を数値化し、発現比の算出、変動遺伝子解析、クラスター解析を行う、(2)miRNeasy Serum/Plasma kit (Qiagen)を用いて、破砕液中の全miRNAを単離し、miScript II RT Kit (Qiagen)を用いcDNAを合成し、次いで、定量的リアルタイムPCRで定量する、等の方法が挙げられる。
デバイスの第1の実施形態は、セルロースナノファイバーを用いて作製したフィルムをナノ構造体として用いる。セルロースナノファイバーを得るためには、先ず、木材チップから木材繊維(セルロースファイバー)を取り出してパルプ化する。このセルロースファイバーは、無数のセルロースナノファイバーが束になって構成されている。次に、このセルロースファイバーを、TEMPO触媒の存在下で、溶媒中で高圧で繊維同士を衝突させ、束になっているセルロースファイバーを解すことでセルロースナノファイバーを得ることができる。なお、前記のセルロースナノファイバーの作製方法は単なる例示で、その他の方法であってもよい。第1の実施形態に係るデバイスは、得られたセルロースナノファイバーを含む溶媒を吸引濾過することで、セルロースナノファイバー同士が表面張力により凝集・フィルム化することで作製できる。セルロースナノファイバーを分散する溶媒としては、水等が挙げられる。
デバイスの第2の実施形態は、セルロースナノファイバーに代え、セルロースファイバー(パルプ)を用いて作製したフィルムをナノ構造体として用いている点で、第1の実施形態と異なる。第2の実施形態に係るデバイスは、セルロースナノファイバーに代え、セルロースファイバー(パルプ)を溶媒に分散する以外は、デバイスの第1の実施形態と同様の手順で作製すればよい。セルロースファイバー同士の隙間、および、セルロースファイバー表面に存在するセルロースナノファイバー同士の隙間も、第1の実施形態と同様の手順で作製およびサイズの調整ができる。なお、セルロースナノファイバーの幅は約3nm〜100nmであることから、約1nm〜200nm程度のサイズのナノポアが形成される。一方、セルロースファイバーの幅は約20μm〜40μmである。したがって、隙間のサイズは、第1の実施形態と異なり、nm〜μmオーダーで、約1nm〜200nm、および、約1μm〜100μmのマルチスケールである。
デバイスの第3の実施形態は、ナノワイヤをデバイスとして用いている。図2A乃至図2Dは、第3の実施形態に係るデバイス1の一例を示す図である。図2Aはデバイス1aの上面図、図2Bは図2AのX−X’断面図、図2Cは図2AのY−Y’断面である。また、図2Dは図2Cに示す実施形態の変形例の断面図である。デバイス1aは、基板2、ナノワイヤ3、カバー部材4を少なくとも含み、図2B乃至図2D(以下、図2に共通する説明は、単に「図2」と記載することがある。以下の段落においても同様である。)に示すデバイス1aでは、ナノワイヤ3を形成するための触媒層5を含んでいる。デバイス1aは、基板2上にナノワイヤ3を形成するための触媒層5が形成され、触媒層5の上にナノワイヤ3が形成されている。なお、本明細書において「第1面」とは、基板2のナノワイヤ3が形成されている側の面の最表面を意味する。したがって、後述するとおり、基板2の「第1面」とカバー部材の「第2面」が液密に密着と記載した場合、「第1面」の部材は、製法により、基板2、触媒層5または被覆層になる。さらに、カバー部材の「第2面」と密着する「第1面」にナノワイヤが成長している場合もあるが、その場合はナノワイヤの根元にある平坦部を「第1面」とする。また、本明細書においてナノワイヤの「先端」とは、ナノワイヤの両方の端部の内、基板2の第1面から離れた方のナノワイヤの端部を意味し、基板2の第1面側のナノワイヤの端部は、本明細書ではそのまま「端部」と記載する。
(2)基板2上に、ナノワイヤ3作製用の粒子をECR(Electron Cyclotron Resonance)スパッタリング、又は触媒をECRスパッタリング、EB(Electron Beam)蒸着、PLD(Pulsed Laser Deposition)、ALD(Atomic Layer Deposition)、することで触媒層5を形成する。なお、本明細書において「触媒層」と記載した場合、ナノワイヤ作製用の「粒子」又は「触媒」の「層」を意味する。
(3a、3b)フォトリソグラフィ用のレジスト6を塗布し、ナノワイヤ3を成長させる場所をフォトリソグラフィでパターニングする。フォトリソグラフィのパターニングは、ナノワイヤ3を成長させたいパターンで形成すればよい。例えば、ナノワイヤ3をランダムに成長させたい場合は、基板2上のナノワイヤ3を形成する領域の触媒層5が全て露出するようにパターニングすればよい(3a参照)。また、所定間隔でナノワイヤ3を成長させる場合は、所定間隔のドット状に触媒層5が露出するようにパターニングあるいは、フォトリソグラフィによる描画をすればよい(3b参照)。フォトリソグラフィでパターニング、あるいは描画した後は、パターニングあるいは描画した部分のレジスト6を現像・除去する。
(4a、4b)レジストが除去され、触媒層5が露出した場所からナノワイヤ3を成長させる。
(5a、5b)残りのレジストを除去することで、第1面に形成した触媒層5上にナノワイヤ3を形成した基板2を作製できる。
(a)SiO2、Li2O、MgO、Al2O3、CaO、TiO2、Mn2O3、Fe2O3、CoO、NiO、CuO、ZnO、Ga2O3、SrO、In2O3、SnO2、Sm2O3、EuO等の材料を用い、パルスレーザーデポジション、VLS(Vapor−Liquid−Solid)法等の物理蒸着法でコアナノワイヤを形成する。
(b)SiO2、TiO2等を用い、スパッタリング、EB(Electron Beam)蒸着、PVD(Physical Vapor Deposition)、ALD(Atomic Layer Deposition)等の一般的な蒸着法により、コアナノワイヤの周囲に被覆層を形成する。なお、上記(b)の被覆層は必須ではなく、必要に応じて実施すればよい。
第4の実施形態に係るデバイス1bは、ナノワイヤ3の端部が基板2aの第1面に埋め込まれている点、および、基板2aを作製する材料が第3の実施形態に係るデバイス1aと違う点、で異なり、その他の点では、第3の実施形態に係るデバイス1aと同じである。
(5)第3の実施形態に係るデバイス1aで作製した、第1面にナノワイヤ3を形成した基板2を鋳型として準備する。
(6)基板2aを形成する材料を、鋳型に塗布する。
(7)基板2aを鋳型から剥離することで、第1面にナノワイヤ3の一部が埋め込まれた基板2aを形成する。
(8)基板2aの第1面に埋め込まれたナノワイヤ3を更に成長させることで、ナノワイヤ3の端部が第1面に埋め込まれた基板2aを作製する。ナノワイヤ3の成長は第1の実施形態と同様の手順で行うことができる。
そして、図示は省略するが、第3の実施形態と同様の手順で作製したカバー部材4を基板2aに被せることで、デバイス1bを作製できる。
以下の手順により、セルロースナノファイバーから、ナノポアを有するフィルム状のデバイスを作製した。
(1)針葉樹漂白クラフトパルプをスギノマシン社製の湿式微粒化装置(スターバースト HJP−25005E)で処理して得られた幅15〜100nmのナノセルロース400mgを200mLの水に投入し、ナノセルロース水分散液を得た。
(2)上記のナノセルロース水分散液を、濾過装置(KG−90、アドバンテック東洋濾紙株式会社)と吸引装置(アスピレーター AS−01、アズワン株式会社)を用い、親水性ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)メンブレンフィルター(H020A090C、アドバンテック東洋濾紙株式会社)を介して、濾過脱水を行った。
(3)続いて、脱水処理したナノセルロース集合体上にターシャリーブチルアルコール(tBuOH、06104−25、ナカライテスク株式会社)を200mL滴下して濾過する溶媒置換工程を行った。
(4)得られた湿潤状態のナノセルロース集合体を110℃、1MPa、15minの条件でホットプレス乾燥処理(AYSR−5、神藤金属工業所株式会社)した後、PTFEメンブレンフィルターから剥離することでフィルムを得た。
(5)作製したフィルムを、1辺が1cmの正方形にカットすることで、デバイス1を作製した。図6Aは、作製したデバイス1のSEM写真である。作製したフィルムのナノポアのサイズは、約数nm〜100nmであった。
デバイス1のtBuOHによる置換工程を実施しなかった以外は、デバイス1と同様の手順で、セルロースナノファイバーから、フィルム状のデバイスを作製した。図6Bは、作製したデバイス2のSEM写真である。写真から明らかなように、デバイス2は、セルロースナノファイバー同士の間にナノポアが形成されなかった。
以下の手順により、パルプ(セルロースファイバー)から、マイクロサイズのポアを有するフィルム状のデバイスを作製した。
(1)針葉樹漂白クラフトパルプ400mgを水200mLに投入し、パルプ水分散液を得た。
(2)上記のパルプ水分散液を、濾過装置(KG−90、アドバンテック東洋濾紙株式会社)と吸引装置(アスピレーター AS−01、アズワン株式会社)を用い、ステンレスメッシュフィルター(SUS304、300メッシュ、株式会社くればぁ)を介して、濾過脱水を行った。
(3)続いて、脱水処理したパルプ集合体上にターシャリーブチルアルコール(tBuOH、06104−25、ナカライテスク株式会社)を200mL滴下して濾過する溶媒置換工程を行った。
(4)得られた湿潤状態のパルプ集合体を110℃、1MPa、15minの条件でホットプレス乾燥処理(AYSR−5、神藤金属工業所株式会社)した後、ステンレスメッシュフィルターから剥離することでフィルムを得た。
(5)作製したフィルムを、1辺が1cmの正方形にカットすることで、デバイス3を作製した。図6Cは、作製したデバイス3の写真である。作製したフィルムのポアのサイズは、約数nm〜100nm、および、約1μm〜100μmのマルチスケールであった。
デバイス3のtBuOHによる置換工程を実施しなかった以外は、デバイス3と同様の手順で、パルプ(セルロースファイバー)から、フィルム状のデバイスを作製した。図6Dは、作製したデバイス4の写真である。作製したフィルムのポアのサイズは、約1μm〜100μmであった。
以下の手順により、ナノワイヤを基板に形成した流路に埋め込んだデバイスを作製した。
(1)先ず、Si(100)基板(Advantech Co.,Ltd.)にPDMS埋め込み型ナノワイヤデバイスの流路パターニングを行った。Si基板表面にポジティブレジスト(OFPR−8600 LB,Tokyo Ohka Kogyo Co. Ltd.)を500rpm(5sec)、3000rpm(120sec)の条件でスピンコーター(MS−A100、ミカサ株式会社)によって回転塗布した後、ホットプレート上にて90℃、12min加熱することで溶媒を蒸発させてレジストを基板上に固定させた。加熱後の基板上にガラスマスクをのせ、露光機で600mJ/cm2のi線を照射することによってレジストの軟化を行った。最後にこの基板を現像液(NMD−3、Tokyo Ohka Kogyo Co.,Ltd.)に10秒ほど浸漬することで軟化したレジストのはく離を行い、現像液から基板を取り出し流水洗浄を行った。次いで、ホットプレートにて90℃、5min加熱することでパターニングを完了した。
(6)最後に、上記(4)で作製したナノワイヤを有する基板上に、上記(5)作製したカバー部材を被せた。また、投入孔および回収孔にPEEKチューブを挿入し、接着剤で固定することで、デバイス5を作製した。図6Eは、作製したデバイス5のナノワイヤの拡大写真である。
<実施例1>
サンプル液として唾液を用い、デバイスにはデバイス1乃至4を用い、以下の手順で、唾液中に含まれるEVsからmiRNAの抽出および解析を行った。
(1)サンプル液の調整
被検者から唾液を収集した。実施例1では唾液をそのまま用いたが、唾液中の不純物を取り除くため、必要に応じて唾液を遠沈管に入れ、遠心分離により不純物を取り除いてもよい。なお、この遠心分離は、あくまでも不純物を取り除くためで、EVsを分画・回収するための超遠心分離とは異なる。
唾液サンプル10μlを、デバイス1乃至4に滴下して、約10秒間放置することで、唾液サンプル中のEVsをデバイスに捕捉した。次に、デバイスをピンセットで摘み、PBSに約10秒間浸漬することで、RNase等の洗浄を行った。
破砕液として、細胞溶解バッファーM(038−21141,Wako)を用いた。遠沈管に破砕液1mlを入れ、次いで、上記(2)でEVsを捕捉したデバイスを遠沈管に投入し、ボルテックスで約3秒攪拌した後、5分間静置することで、EVsを捕捉したデバイスから直接EVsを溶解し、miRNAの抽出を行った。図7Aはデバイス1を用いた際の写真で、(a)miRNA抽出後にデバイス1を遠沈管から取り出した後の遠沈管の写真、(b)遠沈管から取り出したデバイス1の写真である。図7Bはデバイス2を用いた際の写真で、(a)miRNA抽出後にデバイス2を遠沈管から取り出した後の遠沈管の写真、(b)遠沈管から取り出したデバイス2の写真である。図8Aはデバイス3を用いた際の写真で、(a)miRNA抽出工程終了直後の遠沈管の写真、(b)miRNA抽出後にデバイス3を遠沈管から取り出した後の遠沈管の写真、(c)遠沈管から取り出したデバイス3の写真である。図8Bはデバイス4を用いた際の写真で、(a)miRNA抽出工程終了直後の遠沈管の写真、(b)miRNA抽出後にデバイス4を遠沈管から取り出した後の遠沈管の写真、(c)遠沈管から取り出したデバイス4の写真である。図7A及び図7Bに示すように、セルロースナノファイバーから作製したデバイス1及びデバイス2を用いた場合は、破砕液でEVsを破砕した後でも、遠沈管内にデバイス由来の繊維等は見られず、また、取り出したデバイスは元の形状を維持していた。そのため、miRNAの抽出後は、ピンセットでデバイスを取り除くだけで、miRNA抽出液を作製できた。
次に、miRNA抽出液に含まれるmiRNAの種類を、3D−Gene(登録商標)(東レ株式会社製)ヒトmiRNAチップを用い、以下の手順で解析を行った。
(a)miRNA抽出液を、キット製造者の取扱説明書に従い、SeraMi Exosome RNA精製カラムキット(System Biosciences Inc.)を用いて精製した。
(b)精製したmiRNA抽出液15μlを、マイクロアレイおよび3D−GeneHuman miRNA Oligoチップver.21(Toray Industries)を使用してmiRNAプロファイリングを分析した。3D−Geneは、2565ヒトmiRNAプローブを含んでおり、miRNA抽出液から、最大2565種類のmiRNAの発現を解析できる。
(c)miRNA抽出液中の各miRNAの発現レベルは、各マイクロアレイ中のすべてのmiRNAのバックグラウンドを差し引いたシグナル強度を計算し、その後にグローバルノーマライゼイションすることで解析した。
サンプル液として尿を用い、デバイスにはデバイス5を用い、以下の手順で、尿中に含まれるEVsからmiRNAの抽出および解析を行った。
(1)サンプルの調整
市販の尿(Proteogenex、BioreclamationIVT、EW Biopharma)1mLを、1.5mL遠沈管に分注し、この遠沈管を冷却遠心機にセットし、3000×g、15min、4℃の条件で遠心分離することによって不純物を沈殿させた。以下では、この不純物を除いた上澄み部分のことを尿サンプルと記載する。
上記尿サンプル1mLを、シリンジポンプによって流量50μL/minの条件で、デバイス5に導入し、ナノワイヤに尿サンプル中のEVsを捕捉させた。
(3)miRNAの抽出
破砕液として、実施例1と同様の細胞溶解バッファーMを用い、破砕液1mLをデバイスに導入することで捕捉したEVsを溶解し、miRNA抽出液を作製した。
(4)miRNAの解析
実施例1と同様の手順で解析を行った。
Claims (10)
- 細胞外小胞を捕捉できるデバイスを用いたサンプル液中の細胞外小胞からのmiRNAの抽出方法であって、該miRNAの抽出方法は、
サンプル液とデバイスとを接触させることで、サンプル液中の細胞外小胞をデバイスに捕捉する細胞外小胞捕捉工程、
細胞外小胞を捕捉したデバイスを細胞外小胞の破砕液と接触させることで、細胞外小胞を破砕し、細胞外小胞からmiRNAを破砕液中に抽出するmiRNA抽出工程、
を含む、miRNAの抽出方法。 - 前記細胞外小胞捕捉工程と前記miRNA抽出工程との間に、細胞外小胞を捕捉したデバイスを洗浄するデバイス洗浄工程、
を含む、請求項1に記載のmiRNAの抽出方法。 - 前記デバイスが、破砕液に対して耐久性がある材料で形成されている、
請求項1または2に記載のmiRNAの抽出方法。 - 該デバイスは、セルロースファイバーで構成された不織布を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載miRNAの抽出方法。
- セルロースファイバーが、セルロースナノファイバーである、請求項4に記載のmiRNAの抽出方法。
- 前記デバイスが、
ナノワイヤ、
セルロースファイバーを用いて作製した構造体、および、
セルロースナノファイバーを用いて作製した構造体、
から選択される何れか一つを含む、
請求項3に記載のmiRNAの抽出方法。 - 前記デバイスが、セルロースナノファイバーを用いて作製した構造体である、
請求項6に記載のmiRNAの抽出方法。 - 前記サンプル液が、非侵襲性の生体サンプル液である、
請求項1〜7の何れか一項に記載のmiRNAの抽出方法。 - 前記サンプル液が、唾液である、
請求項8に記載のmiRNAの抽出方法。 - 請求項1〜9の何れか一項に記載のmiRNAの抽出方法で抽出した破砕液中に含まれるmiRNAを解析する解析工程を含む、
サンプル液中の細胞外小胞に含まれるmiRNAの解析方法。
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