WO2016092201A1 - Procédé de conservation de micro-organismes à température ambiante et composition - Google Patents

Procédé de conservation de micro-organismes à température ambiante et composition Download PDF

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WO2016092201A1
WO2016092201A1 PCT/FR2015/053373 FR2015053373W WO2016092201A1 WO 2016092201 A1 WO2016092201 A1 WO 2016092201A1 FR 2015053373 W FR2015053373 W FR 2015053373W WO 2016092201 A1 WO2016092201 A1 WO 2016092201A1
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WO
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composition
microorganisms
proportion
preservative
preservation
Prior art date
Application number
PCT/FR2015/053373
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English (en)
Inventor
Faouzi ATTIA
Zéphirin Mouloungui
Bernard Dumas
Original Assignee
Agronutrition
Institut National Polytechnique De Toulouse
Institut National De La Recherche Agronomique
Centre National De La Recherche Scientifique (C.N.R.S.)
Université Paul Sabatier Toulouse Iii
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Publication date
Application filed by Agronutrition, Institut National Polytechnique De Toulouse, Institut National De La Recherche Agronomique, Centre National De La Recherche Scientifique (C.N.R.S.), Université Paul Sabatier Toulouse Iii filed Critical Agronutrition
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    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/465—Streptomyces

Definitions

  • the invention relates to a method for the in vitro and at room temperature preservation of living microorganisms and a composition for the preservation of living microorganisms at ambient temperature for the implementation of such a method.
  • the invention is also directed to a method of treating plants in which a preservation composition comprising living microorganisms useful for plants is used.
  • Cell preservation methods are known in which glycerol and / or dimethyl sulfoxide (DMSO) are used as additive preserving the cells with respect to freezing / thawing during their storage at low temperature (-20 ° C.). ° C, -80 ° C or -176 ° C in liquid nitrogen). Such a method of preserving cells is complex in its implementation and requires the use of specific devices for storing cells at a temperature below 0 ° C., especially below -20 ° C.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • Such a composition must therefore be prepared extemporaneously by the farmer or made available to the farmer - by the distributor or the manufacturer - at the moment when its use is envisaged.
  • Another solution is to be able to keep the liquid composition comprising living microorganisms at a low temperature, at + 4 ° C. or at -20 ° C. or at -80 ° C. in a freezer or at -176 ° C. in the nitrogen. liquid.
  • Such conservation conditions can not in practice be implemented by the farmer.
  • the invention aims to overcome the disadvantages mentioned above by providing a method for the preservation of microorganisms at room temperature and a composition for conserving microorganisms that do not require storage of said microorganisms at low temperature.
  • the invention thus aims to propose a method for preserving microorganisms at ambient temperature, that is to say a process that does not require placing microorganisms in a specific cooling device.
  • the object of the invention is thus to propose a method for the preservation of microorganisms at ambient temperature that is applicable in any technical field in which it is necessary to conserve microorganisms.
  • the invention aims to provide such a method which is particularly applicable in the agricultural field in which microorganisms are likely to have to be applied to plants, in particular to stimulate their growth and / or their natural defenses (SDN).
  • SDN natural defenses
  • the invention further aims to provide a preservation method and composition that preserve the work habits of farmers, are easy to use, and imply for their implementation that little manipulation.
  • the invention also aims at providing a preservation method and composition in which compounds which can be obtained from renewable plant resources are used.
  • Another object of the invention is to provide such a method and such a preservation composition which respect the environment, especially when applying said composition for preserving microorganisms on plants.
  • the invention relates to a method for preserving microorganisms at room temperature, in which:
  • composition known as a preservation composition
  • a preservation composition comprising the microorganisms to be preserved and a medium for preserving said microorganisms
  • the preservation medium comprises at least one compound, said preservative compound, selected from the group consisting of compounds for which there is at least a predetermined inhibitory proportion of the preservative compound in the preservative composition which is:
  • said at least one preservative compound is in the preservative composition in a proportion greater than said predetermined inhibitory proportion and in a non-lethal proportion for said microorganisms;
  • the storage composition in which the storage composition is placed at room temperature, particularly at a temperature greater than or equal to + 4 ° C., for the purpose of preserving said microorganisms.
  • the term "conservation of microorganisms at room temperature” means the preservation of microorganisms which does not require any specific means for controlling and adjusting the temperature of the composition comprising the microorganisms.
  • the invention therefore consists in proposing a method for preserving microorganisms in vitro and at ambient temperature in which a preservation medium comprising at least one preservative compound admitting at least a predetermined proportion which is inhibiting growth of at least one less than one microorganism and not lethal to said at least one microorganism, said at least one preservative compound being in the preservation medium in a proportion greater than its predetermined inhibitory proportion.
  • the proportion of preservative compound in the preservation composition is chosen to be able to reversibly inhibit the growth of microorganisms, but without being lethal to said microorganisms.
  • the method according to the invention makes it possible, in a first conservation phase, to inhibit the growth of microorganisms at room temperature, but also, after appropriate dilution of the preservation composition, to allow the growth of microorganisms to be maintained. -organisms in a growth composition obtained by dilution of the preservation composition.
  • the preservation medium is chosen so as to maintain the culture of microorganisms in a stationary phase of growth-without degeneration of said culture-at ambient temperature, while preserving the potential of said culture of microorganisms to resume a phase later. exponential growth.
  • the microorganisms stored at room temperature in the preservation composition are therefore not in the decay phase.
  • the proportion of preservative compound greater than the predetermined inhibitory proportion in the preservation composition is therefore not lethal for the microorganisms.
  • the inventors have indeed found that it is possible to keep microorganisms at room temperature-that is to say, to maintain microorganisms in the lag phase (or dormancy) by inhibiting their growth while preserving their subsequent growth potential by placing these microorganisms in a suitable preservative composition comprising a preservative compound in a proportion selected to be growth inhibiting but non-lethal for these microorganisms.
  • a preservative compound according to the invention therefore has no antibiotic property-that is to say, it does not lead to the death of microorganisms-but only a reversible inhibitory property of the growth of microorganisms.
  • At least one preservative compound is selected from the group consisting of compounds admitting at least a proportion in the preservation medium which is inhibiting the growth of microorganisms, but not lethal for these microorganisms.
  • the predetermined inhibitory proportion of a preservative compound in the preservative composition is the value of the proportion of preservative compound in the preservative composition resulting in the complete cessation of growth of a microorganism without being lethal to the microorganisms .
  • a proportion of preservative compound greater than the predetermined inhibitory proportion is non-lethal by diluting the preservative composition-so that the proportion of preservative compound is less than the predetermined inhibitory proportion-and by noting the growth of the microorganisms. in the growth composition obtained by dilution of the preservation composition.
  • the minimum inhibitory proportion of a preservative compound is predetermined by methods for analyzing the growth of microorganisms known per se.
  • the preservative compound used in a process according to the invention in a proportion greater than the predetermined inhibitory proportion makes it possible to inhibit the growth of microorganisms for a period of at least 30 days, without being lethal to said micro-organisms. -organisms.
  • the dilution of the preservation medium - in particular in a culture medium suitable for the growth of the microorganisms- actually allows to lift inhibition of growth of microorganisms by the preservative compound.
  • the invention therefore relates to a process in which the preservation medium and the preservation composition comprise a preservative compound capable of inhibiting the growth of microorganisms for a proportion of preservative compound greater than a predetermined inhibitory proportion value, said proportion of compound however, the preservative is non-lethal for the microorganisms and capable of allowing the growth of the microorganisms for a proportion of preservative compound lower than said predetermined inhibitory proportion value.
  • At least one preservative compound is selected from the group consisting of undecylenic acid, esters of undecylenic acid and glycerol carbon esters.
  • glycol carbonic ester means any compound comprising at least one carboxylic ester chemical function formed between a group derived from carbonic acid and a group derived from glycerol;
  • At least one preservative compound is selected from the group consisting of glycerol carbonate (cyclic), glycerol carbonate (cyclic) esters and linear glycerol carbonyl esters.
  • glycerol carboxy esters in particular glycerol carbonate, glycerol carbonate (cyclic) esters and glycerol linear carbon esters, undecylenic acid and undecylenic acid esters are suitable for application to plants and meet the standards of protection and preservation of the environment. They do not in themselves have any toxicity for human or animal health. They are biodegradable and do not present a risk of accumulating in the soil and contaminating or damaging the environment, especially when applied to plants and / or when introduced into the soil. They do not pose a risk of contaminating the environment when applied in the open field and are likely to be carried away by runoff with rainwater or watering.
  • They can be "biobased”, that is to say obtained from natural resources - in particular plant resources - available and renewable.
  • At least one preservative compound is glycerol carbonate.
  • glycerol carbonate is meant the cyclic carbonate of glycerol five-membered (4- (hydroxymethyl) -1,3-dioxolan-2-one) of formula (I) below:
  • At least one preservative compound is an ester of glycerol carbonate (or acylated glycerol carbonate).
  • at least one preservative compound is a ⁇ - ⁇ -acylated 5-membered glycerol carbonate (cyclic) ester of formula (II) below:
  • R1 is a saturated, unsaturated, linear or branched aliphatic hydrocarbon group having from 1 to 30 carbon atoms.
  • the group RI may be chosen from the group formed by saturated aliphatic hydrocarbon groups.
  • the RI group may be a methyl (-CH 3 ), an ethyl (-CH 2 -CH 3 ), a n-propyl (-CH 2 -CH 2 -CH 3 ), a w-propyl (-CH (CH 3 ) 2), n-butyl (-CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 3), a ⁇ -butyl (-CH 2 -CH (CH 3) 2), a tem o-butyl (-C ( CH 3 ) 3 ), n-pentyl (- (CH 2 ) 4 -CH 3 ), n-hexyl (- (CH 2 ) 5 -CH 3 ), n-heptyl (- (CH 2 ) 6 - CH 3 ), n-octyl (- (CH 2 ) 7 -CH 3 ), n-nonyl (-
  • the group RI may be chosen from the group formed by unsaturated aliphatic hydrocarbon groups.
  • the RI group may be an aliphatic hydrocarbon group having at least one ethylenic double bond.
  • the RI group may be an aliphatic hydrocarbon group having 1, 2, 3, 4 or 5 ethylenic double bonds, conjugated or otherwise.
  • the group RI can also be chosen from the group formed:
  • At least one preservative compound is the (cyclic) carbonate ester of glycerol and oleic acid;
  • At least one preservative compound is the (cyclic) carbonate ester of glycerol and docosaenoic acid.
  • esters of the (cyclic) carbonate of glycerol and of a hydrocarbon acid with an even number of carbon atoms or even a hydrocarbon-based acid and
  • linear carbonic esters of glycerol and at least one hydrocarbon acid with an even number of carbon atoms or even hydrocarbon-based acid are examples of linear carbonic esters of glycerol and at least one hydrocarbon acid with an even number of carbon atoms or even hydrocarbon-based acid.
  • At least one preservative compound is selected from the group formed:
  • esters of the (cyclic) carbonate of glycerol and a hydrocarbon acid with an odd number of carbon atoms - or an odd hydrocarbon-acid and;
  • linear carbonic esters of glycerol and at least one hydrocarbon acid with an odd number of carbon atoms or an odd hydrocarbon-based acid are examples of linear carbonic esters of glycerol and at least one hydrocarbon acid with an odd number of carbon atoms or an odd hydrocarbon-based acid.
  • RI is a linear aliphatic hydrocarbon group -saturated or unsaturated- having an carbon chain with an even number of carbon atoms.
  • the acyl group (R1-CO-) of the cyclic carbonic ester of ⁇ / ⁇ '-acyl glycerol is therefore a group having an carbon chain with an odd number of carbon atoms.
  • At least one preservative compound can be: the ester of glycerol carbonate and heptanoic acid (ECG formula (III) below
  • At least one preservative compound may be a 6-membered cyclic glycerol carbonic ester.
  • At least one preservative compound is a linear carboxy ester of glycerol having at least one group of atoms of general formula (VI) below:
  • G 0 is selected from the group formed:
  • R 1 and R 2 are independently selected from the group consisting of unsaturated, linear or branched aliphatic hydrocarbon groups having from 1 to 30 carbon atoms.
  • the R2 group of a linear carboxy ester of glycerol may be chosen, independently of RI, from the group formed by saturated aliphatic hydrocarbon groups.
  • the R2 group may be a methyl (-CH 3 ), an ethyl (-CH 2 -CH 3 ), a n-propyl (-CH 2 -CH 2 -CH 3 ), a w-propyl (-CH (CH 3 ) 2), n-butyl (-CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 3), an iso-butyl (-CH 2 -CH (CH 3) 2), a tem o-butyl (-C ( CH 3 ) 3 ), n-pentyl (- (CH 2 ) 4 -CH 3 ), n-hexyl (- (CH 2 ) 5 -CH 3 ), n-heptyl (- (CH 2 ) 6 - CH 3 ), n-octyl (- (CH
  • the R2 group of a linear carbonic ester of glycerol can be chosen, independently of RI, in the group formed by unsaturated aliphatic hydrocarbon groups.
  • the R2 group may be an aliphatic hydrocarbon group having at least one ethylenic double bond.
  • the R2 group may be an aliphatic hydrocarbon group having 1, 2, 3, 4 or 5 ethylenic double bonds, at least two of which may be conjugated or not.
  • the group R2 can also be chosen from the group formed:
  • a linear carboxy ester of glycerol having at least one group of atoms of formula (VI) may be chosen from the group consisting of linear carboxy esters of glycerol of general formula (VF):
  • G is chosen from the group formed:
  • Qi is selected from the group consisting of hydrogen (H) and organic groups formed by at least two atoms linked by covalent bonds and belonging to the group formed by carbon (C) and hydrogen (H); and optionally oxygen (O) -, and;
  • - Mi represents an organic group consisting of at least two atoms linked by covalent bonds and belonging to the group consisting of carbon (C) and hydrogen (H) and possibly oxygen (O) -.
  • the preservative compound is a linear carbyl ester of acylated glycerol of general formula (XI) below: (XI) in which;
  • x is an integer equal to 0 or 1 which can vary in (XI) according to each group of formula (XI-a):
  • n is an integer from 1 to 20, in particular from 1 to 10, inclusive;
  • Q 2 is selected from the group consisting of hydrogen (H) and organic groups consisting of at least two atoms linked by covalent bonds, said atoms belonging to the group consisting of carbon (C) and hydrogen ( H) and optionally oxygen (O) -, and;
  • M 2 represents an organic group formed by at least two atoms linked by covalent bonds, said atoms belonging to the group formed by carbon (C) and hydrogen (H) and optionally oxygen (O); , and;
  • G 2 represents a group of atoms chosen from the group formed:
  • At least one preservative compound is an acylated oligocarbonate / oligoglycerol of formula (XII) below:
  • M 3 is an organic group chosen from the group consisting of the following groups of formulas: ⁇ ,
  • R is a hydrocarbon group - especially a saturated hydrocarbon group, an unsaturated hydrocarbon group or a branched hydrocarbon group comprising from 1 to 21 carbon atoms, and;
  • - Gn is selected from the group consisting of hydroxylated propyl groups of general formulas (XIIE) and (II F ):
  • G 12 and G 13 are propyl ⁇ / ⁇ '-oxyacyl groups of general formula (VII) below:
  • Q 3 is selected from the group consisting of hydrogen and organic groups consisting of at least two atoms linked by covalent bonds and belonging to the group formed by carbon (C), hydrogen (H) and oxygen (O);
  • - m is a natural number less than 5 - in particular the interval
  • p is a natural number less than 4 - in particular the interval
  • the groups Gn of formula (XIIF), G 12 and G 13 of formula (VII) may be present in the oligomer according to one and / or both of their two possible directions of insertion into the oligomer.
  • the proportion of preservative compound in the preservation medium is chosen to be a volume proportion of between 0.01% and 100%. It is possible that the preservative compound is in the pure state in the preservation medium.
  • the proportion of preservative compound in the preservation medium is a volume proportion of between 0.01% and 10%, preferably between 0.01% and 1%, more preferably between 0.01%. % and 0.10%, in particular between 0.03% and 0.07%, in particular of the order of 0.05% -.
  • the process according to the invention is a method for preserving microorganisms in vitro.
  • the preservative compound and its proportion in the preservation composition are chosen to allow storage of microorganisms at room temperature for a shelf life of at least 30 days.
  • ambient temperature is meant a temperature, particularly a temperature of the preservation composition, which is achieved without requiring the use of heating and / or cooling means.
  • ambient temperature means a temperature greater than or equal to + 4 ° C, in particular between 15 ° C and 60 ° C, in particular between 20 ° C and 40 ° C.
  • the method for storing microorganisms at ambient temperature is therefore a method of preserving microorganisms at a temperature greater than or equal to + 4 ° C.
  • the preservation medium is an aqueous medium.
  • the microorganism preservation medium is an aqueous medium which does not in itself allow the growth and development of microorganisms.
  • the preservation medium is chosen from the group consisting of water and aqueous saline media.
  • the preservation medium is in the liquid state at room temperature. It may be an essentially aqueous preservation medium comprising at least one preservative compound. The microorganism is therefore stored in a liquid medium that can be further diluted in a dilution liquid, especially in water, or in any culture medium of the microorganism for its subsequent development.
  • the preservation medium may be in the solid state at room temperature. It may be a composition comprising a proportion of at least one gelling agent such as, for example, agar-agar.
  • the preservation medium is thus an agar-containing preservation medium comprising at least one preservative compound and which is in the solid state at room temperature.
  • the preservation medium comprises microorganisms chosen from the group consisting of bacteria, unicellular fungi, yeasts and protozoa.
  • the invention also relates to a method of treating plants in which a preservation medium according to the invention is used.
  • the invention also extends to a plant treatment method in which:
  • a preservation composition is prepared by a process according to the invention, and then:
  • the preservation composition is stored at ambient temperature and then:
  • said preservation composition is diluted so that the proportion of preservative compound in the diluted composition is lower than the predetermined inhibitory proportion and allows the growth of the microorganisms, and
  • said diluted composition is applied to plants.
  • the invention therefore also relates to a method of treating plants in which a microorganism preservation composition is prepared which enables the farmer to have a composition of preservation comprising concentrated and stable microorganisms, which is capable of being diluted-in particular in water-for the application of said diluted composition on plants.
  • the preservation composition is preserved for a period of at least 30 days.
  • the storage composition is stored at room temperature without significant variation in the number of live microorganisms in the preservation composition.
  • At least one microorganism is selected from the group consisting of microorganisms useful for the growth and development of plants.
  • At least one microorganism to be preserved is selected from the group consisting of Gram-positive bacteria, in particular of the genus Streptomyces.
  • At least one microorganism to be preserved is a bacterium of the genus Streptomyces conforming to the strain deposited and registered at the CNCM under the number 1-4667.
  • At least one microorganism is a Streptomyces bacterium conforming to the strain deposited and registered on April 7, 2011 under No. 1-4467 with the National Collection of Microorganism Cultures (CNCM) of the Pasteur Institute (of which address is 25, rue du Dondel Roux, 75724 Paris cedex 15) having the status of international depositary authority according to the Budapest Treaty.
  • CNCM National Collection of Microorganism Cultures
  • At least one microorganism is chosen from the group formed by micro-organisms capable of stimulating natural defenses of plants.
  • the diluted composition is adapted to stimulate the natural defenses of plants in culture.
  • the application of a diluted composition according to the invention has a stimulating activity of the natural defenses of plants, that is to say, it makes it possible to activate the expression in plants of defense genes - for example PR-1 with regard to plant pathogenic organisms.
  • the invention also extends to a composition comprising: at least one microorganism
  • said preservative compound selected from the group consisting of compounds for which there is a predetermined inhibitory proportion of the preservative compound in the preservation medium which is:
  • the preservative compound having in the composition a proportion greater than the predetermined inhibitory proportion
  • said preservation composition being adapted to retain said at least one microorganism at room temperature.
  • a preservation composition according to the invention means:
  • composition which comprises microorganisms in the latent state-that is to say in which the preservative compound has a proportion in the composition greater than the predetermined minimum inhibitory proportion and inhibits the growth of microorganisms and is non-lethal for said microorganisms, or
  • composition which comprises microorganisms in the growth phase that is to say in which the preserving compound has a proportion in the composition that is lower than the predetermined minimum inhibitory proportion and allows the growth of microorganisms to be .
  • the invention therefore relates in particular to a microorganism preservation composition which makes it possible to conserve living microorganisms, said preservation composition being capable of being diluted - in particular in water - with a view to the application of said composition diluted on plants.
  • At least one preservative compound is selected from the group consisting of undecylenic acid, esters of undecylenic acid and glycerol carbon esters.
  • At least one micro- organism is of the genus Streptomyces and conforms to the strain deposited and registered at the CNCM under the number 1-4667.
  • the invention also relates to a method for the preservation of microorganisms, a plant treatment method and a composition for the implementation of at least one of these processes characterized in combination by all or some of the characteristics mentioned above. above or below.
  • FIG. 1 is a graphical representation in histogram of the viability (PFU / ml) of the Streptomyces ⁇ -AA61 bacterium at the beginning (D + 0) of preservation (histogram full / grayed) and after 28 days of storage
  • FIG. 2 is a graphical representation of the viability (PFU / mL) of the bacterium Streptomyces ⁇ -AA61 at the beginning of conservation (histogram full / grayed) and after 28 days of preservation (histogram hatched) at room temperature in absence (H 2 O) or in the presence of preservative compound (ECG-C7, ECG-C9, ECG-C11: 1, OECG-C7, OECG-C9 and OECG-C1 1: 1) in a weight ratio of 1%,
  • FIG. 3 is a graphical representation of the viability (PFU / mL) of the bacterium Streptomyces ⁇ -AA61 at the beginning of conservation (open histogram) and after 28 days of storage (histogram hatched) at room temperature in the presence of glycerol , glycerol carbonate or undecylenic acid in a mass proportion of 0.05%,
  • FIG. 4 is a graphical representation of growth curves of the yeast Saccharomyces cerevisiae in the presence of ECG-C7 as a preservative compound according to the invention in a proportion of 0.01%; 0.05% and 0.10% in water
  • FIG. 5 is a graphical representation of growth curves of the yeast Saccharomyces cerevisiae in the presence of ECG-C9 as a preservative compound according to the invention in a proportion of 0.01%; 0.05% and 0.10% in water
  • FIG. 6 is a graphical representation of growth curves of the yeast Saccharomyces cerevisiae in the presence of ECG-Cl 1: 1 as a preservative compound according to the invention in a proportion of 0.01%; 0.05% and 0.10% in water,
  • FIG. 7 is a graphical representation of growth curves of the yeast Saccharomyces cerevisiae in the presence of OECG-C7 as preservative compound according to the invention in a proportion of 0.01%; 0.05% and 0.10% in water,
  • FIG. 8 is a graphical representation of growth curves of the yeast Saccharomyces cerevisiae in the presence of OECG-C9 as a preservative compound according to the invention in a proportion of 0.01%; 0.05% and 0.10% in water.
  • a preservation composition according to the invention comprises
  • a preservation medium for said microorganisms comprising at least one compound, said preservative compound, chosen for:
  • o be an inhibitor of the growth of at least one microorganism in vitro and at room temperature, and;
  • Such a preservation composition makes it possible to preserve microorganisms in vitro at room temperature.
  • Such a composition according to the invention when it is brought into contact with microorganisms, makes it possible to limit the growth of said microorganisms at room temperature, without significant losses of microorganism and without depleting the culture medium.
  • a preservation medium when placed in contact with microorganisms in a preservation composition, enables the microorganisms to resume their growth as soon as the proportion of preservative compound in the preservation composition becomes lower, for example by dilution of the preservative composition to the predetermined minimum inhibitory proportion of the preservative compound.
  • a composition according to the invention may comprise glycerol carbonate.
  • Glycerol carbonate is obtained by a process described in FR 2 778 1821 in which urea and glycerol are reacted in the presence of a solid catalyst in powder form and consisting of a metal salt or a mixture of metal salts. , containing Lewis acid sites.
  • a composition according to the invention may also comprise an ester of ⁇ / ⁇ '-acylated glycerol carbonate (5-membered) or a cyclic carbonic ester of ⁇ '-acylated glycerol (6-membered).
  • Such ⁇ / ⁇ '-acylated glycerol (cyclic) carboating esters are obtained by synthetic methods as described in Examples 1, 2 and 3 below.
  • the reaction medium is diluted in 150 ml of ethyl ether and the mixture obtained is placed in a 1 L separating funnel.
  • the mixture is washed successively with 4 volumes of saturated NaCl water until the aqueous phase is neutral.
  • the washed organic phase is dried over magnesium sulfate and is separated from the magnesium sulfate hydrate by filtration.
  • the ether of the organic phase is removed by evaporation under reduced pressure. A mass of dry product of 277 g is obtained.
  • the ester of the glycerol carbonate is separated from the excess fatty acids by thin-film distillation under reduced pressure at a temperature below the boiling point of the fatty acid under this reduced pressure and below 155 ° C.
  • the ester of glycerol carbonate is obtained whose purity evaluated by gas chromatography is between
  • RI is a methyl group
  • the excess acetic anhydride is removed by evaporation at a temperature of 60 ° C. and a reduced pressure of 55 hPa.
  • the ⁇ / ⁇ '-acetylated linear carbonic ester is purified by the thin film technique carried out in an evaporator / separator at a temperature of 170 ° C. and under a reduced pressure of 0.33 hPa.
  • ⁇ / ⁇ '-acetylated carbonic ester of glycerol is obtained whose purity evaluated by gas chromatography is between 98% and 99%.
  • a composition according to the invention may also comprise linear carbonic esters of glycerol.
  • Such linear glycerol carboxylic esters are obtained by condensation / oligomerization from cyclic carbonyl esters of glycerol, in particular of ⁇ / ⁇ '-acylated cyclic glycerol carbon esters, in the presence of an organic initiator - for example glycerol and a metal catalyst, for example zinc sulphate or zinc stearate, as described in Examples 4 and 5.
  • EXAMPLE 4 Oligomerization of cyclic glycerol carbonate ⁇ / ⁇ '-acetylated (ECG-C 2 ).
  • Example 3 The ⁇ - ⁇ -acetylated glycerol carbonic acid ester (ECG-C 2 ) obtained in Example 3 is oligomerized in the presence of a metal catalyst, of glycerol as an organic initiator, and in the presence of conditions described in Table 2 below.
  • the TC (%) value indicates the conversion rate of the ⁇ / ⁇ '-acetylated carbonic acid carbonic ester.
  • the molar mass values of the number of products of the reaction are obtained by analysis of the reaction medium in gel permeation chromatography on a PL-Gel TM 3 ⁇ MIX-E column.
  • the linear carbon esters of ⁇ / ⁇ '-acetylated glycerol are detected at the column outlet by refractometry and the molecular masses are determined by comparison with polystyrene standards.
  • the mass spectrum produced on a reaction medium obtained by implementing an oligomerization process of the ⁇ / ⁇ '-acetylated glycerol carbonate ester (ECG-C 2 ) as described in the present example comprises signals corresponding to molecular ions and fragments with m / z values of between 180.9 and 761.4 and corresponding to oligomers of formulas (A), (B) and (C) as follows:
  • c can be 1, 2 or 4 and d can be 1, 2, 3 or 4
  • b can be 1, 2, or 3;
  • a is 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 or 8, and
  • g can be 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10.
  • EXAMPLE 5 Synthesis of linear carbon esters of ⁇ / ⁇ '-acylated glycerol (OECG-C 2 , OECG-C 7 , OECG-C 9 and OECG-Cn : 1) from esters of glycerol carbonate (cyclic ) ⁇ / ⁇ '-acylated (ECG-C 2 , ECG-C 7 ,
  • the TC (%) value indicates the degree of conversion of the ester of the starting glycerol carbonate.
  • the apparent molecular weight values are obtained by analysis of the reaction medium by gel permeation chromatography. Oligomers of apparent molecular weight up to 7600 Da are obtained.
  • Streptomyces 1-4467 The Streptomyces strain, called Streptomyces 1-4467, which is the subject of this example, was filed and registered on April 7, 2011 under the number 1-4467 with the National Collection of Microorganism Cultures (CNCM) of the Institut Pasteur (of which the address is 25, rue du Dondel Roux, 75724 Paris cedex 15) having the status of international depositary authority according to the Budapest Treaty.
  • the strain of Streptomyces 1-4467 has a DNA sequence, called r 16S DNA, coding for the 16S ribosomal RNA which has SEQ ID_NO1.
  • sequence SEQ ID_NO1 is described below:
  • sequence SEQ ID_NOl designates, according to the IUPAC ("International Union ofPure and Applied Chemistry"), any one of the four nucleotides a, t, c or g.
  • nucleotide n at position 1036 is selected from the group consisting of nucleotide "a”, nucleotide “t”, nucleotide “g” and nucleotide “c”, and nucleotide n at position 1049 is selected independently of nucleotide at position 1036 in the group consisting of nucleotide "a”, nucleotide "t”, nucleotide "g” and nucleotide "c”.
  • Strain Streptomyces 1-4467 is a gram-positive bacterium.
  • the strain Streptomyces -AA61 can be used for the protection of plants and the stimulation of their vitality by natural means and processes (biocontrol), aiming in particular at controlling the balance between the plants and the populations of aggressors rather than at to eradicate these populations of aggressors.
  • biocontrol natural means and processes
  • the strain Streptomyces -AA61 is able to:
  • the strain Streptomyces -AA61 makes it possible to promote the dissolution -in the rhizosphere of plants- of solid fertilization products that can not be assimilated by said plants and to improve the nutrition of plants;
  • a liquid composition according to the invention comprising between 1 and 2 g (mass of wet bacteria) of bacteria of the Streptomyces strain -AA61 per liter of film, is laminated onto sunflower seeds and maize seeds.
  • composition Seeds of sunflower and maize treated with the liquid composition according to the invention are sown and as controls untreated sunflower seeds and maize. Stimulation of initial growth of sunflower and maize plants compared to untreated sunflower and corn plants is observed;
  • Botrytis cinerea o certain phyto-pathogenic target microorganisms such as Botrytis cinerea, Streptomyces scabies, Botrytis cinerae, Fusarium culmorum, Pythium ultimum, Phaeomoniella chlamydospora, Phaeomoniella aelophilum, Eutypa lata, Fomitiporia mediterranea and Botryosphaeria obtusa;
  • a treatment composition according to the invention has a stimulating activity of the natural defenses of the plants, that is to say that it makes it possible to activate the expression in plants of defense genes - for example PR-1 - with respect to plant pathogenic organisms.
  • the strain Streptomyces -AA61 can be cultured in an aqueous liquid culture medium, in particular in a medium selected from the group consisting of complete media and rich media comprising all the mineral elements and organic precursors necessary for the growth of bacteria according to US Pat. invention, in particular a carbon source, a nitrogen source, a source of phosphorus, vitamins and trace elements.
  • a complete medium may comprise D-glucose, a yeast extract, dibasic potassium phosphate (K 2 HPO 4 ), ammonium sulphate ((NH 4 ) 2 SO 4 ), potassium chloride (KCt) and glycerol at pH 2.
  • the Streptomyces strain -AA61 when grown on ISP-2 medium or solid Bennett medium, forms bacterial clusters or "colonies" having:
  • a mycelium said substrate mycelium, branched developing in the thickness of the solid medium of varying color from yellow-brown to gray-brown depending on the composition of the solid medium, and
  • Streptomyces -AA61 is between 12 ° C and 37 ° C. It is preferably between 28 ° C and 30 ° C.
  • the optimum storage temperature of the Streptomyces strain -AA61 in its culture medium is + 4 ° C.
  • a suspension of Streptomyces-AA61 bacterium comprising 800 CFU (Colony Forming Unit) per ml of water is prepared.
  • ECG-C 7 , ECG-C 9 , ECG-C 11: 1 glycerol carbonate esters
  • OECG-C 7 , OECG-C 9 , and OECG-C n i
  • a suspension of bacterium Streptomyces 1-4467 comprising 800 CFU per ml of culture medium is prepared and 0.05% water is added.
  • the viability of the bacteria in each of the preservation compositions by spreading of 200 ⁇ l of the composition or of serial dilutions of the composition on a solid Bennet culture medium (10 g of glucose) is evaluated.
  • strain Streptomyces 1-4467 In comparison with control (H 2 O), the growth of strain Streptomyces 1-4467 is strongly limited or even prevented by conservative compounds ECG-C 9 , ECG-C 11: 1 , OECG-C 7 and OECG-C 11 : 1 and, to a lesser extent, ECG-C 7 and OECG-C 9 .
  • Preservative compounds can maintain Streptomyces 1-4467 bacteria for 28 days by inhibiting their growth while maintaining their subsequent growth potential. They make it possible to preserve the Streptomyces 1-4467 bacteria for 28 days without requiring dilution and regular transplanting of the strain Streptomyces 1-4467 and without depleting the culture medium.
  • ECG-C 7 , ECG-C 9 , ECG-C 1 : 1, OECG-C 7 , OECG-C 9 and OECG-C 1 : 1 exhibit a bactericidal behavior.
  • EXAMPLE 8 Storage of Streptomyces strain 1-4467 at room temperature (28 ° C.)
  • Example 7 The procedure is as in Example 7 using glycerol carbonate and undecylenic acid as preservative compounds.
  • a suspension of Streptomyces 1-4467 bacterium comprising about 400 CFU (Colony Forming Unit) per ml of water is prepared.
  • 0.05% (v / v) of preservative compound selected from glycerol carbonate or undecylenic acid is added.
  • the preservation composition thus obtained is placed at a temperature of 28 ° C for 28 days.
  • a suspension of Streptomyces 1-4467 bacterium comprising 400 CFU per ml of culture medium is prepared and 0.05% glycerol is added.
  • the viability of the bacteria in each of the preservation compositions by spreading of 200 ⁇ l of the composition or of a serial dilution of the composition on a solid Bennet culture medium (10 g) is evaluated. of glucose, 1 g of yeast extract, 1 g of meat extract, 2 g of bactopeptone, 18 g of agar-agar in 1 L of osmosis water), incubation of the dishes at 28 ° C. and enumeration of bacterial colonies formed after 7 days.
  • the growth of the strain Streptomyces 1-4467 is strongly limited by the glycerol carbonate and undecylenic acid preservative compounds. These preservative compounds maintain Streptomyces 1-4467 bacteria for 28 days by inhibiting their growth while maintaining their subsequent growth potential. They make it possible to preserve the Streptomyces 1-4467 bacteria for 28 days without requiring dilution and regular transplanting of the strain Streptomyces 1-4467 and without depleting the culture medium.
  • EXAMPLE 9 Growth curve of the yeast Saccharomyces cerevisiae in a liquid medium at room temperature (28 ° C.) in the presence of ester of glycerol carbonate and heptanoic acid (ECG-C 7 )
  • a preculture of pure Saccharomyces cerevisiae yeast is carried out in 3 ml of YPD medium (comprising 2% of bactopeptone, 1% of yeast extract, 2% glucose and osmosis water qs) with stirring (220 rpm). at 28 ° C for 12 hours.
  • the optical density (OD at 600 nm) of the preculture is of the order of 0.4 to 0.5.
  • EXAMPLE 10 Growth Curve of the Saccharomyces cerevisiae Yeast in a Liquid Medium at Room Temperature (28 ° C.) in the Presence of Glycerol Carbonate and Nonanoic Acid Ester (ECG-C 9 )
  • Example 9 The procedure is identical to Example 9. 100 ⁇ l of preculture are introduced into tubes containing 5 ml of fresh medium and a volume proportion of 0.01, 0.05 and 0.1% of carbonate ester. glycerol ECG-C 9 . The tubes are placed at 28 ° C. and the evolution of the optical density of the culture is measured over time. The results are shown in FIG. 5. An inhibition of the growth of the yeast Saccharomyces cerevisiae is observed from 0.1% of ECG-C 9 .
  • EXAMPLE 11 Growth curve of the yeast Saccharomyces cerevisiae in a liquid medium at ambient temperature (28 ° C.) in the presence of ester of glycerol carbonate and of undecylenic acid (ECG-C 11: 1 )
  • Example 9 The procedure is identical to Example 9. 100 ⁇ l of preculture are introduced into tubes containing 5 ml of fresh medium and a volume proportion of 0.01, 0.05 and 0.1% of carbonate ester. of glycerol ECG-C 11: 1 . The tubes are placed at 28 ° C. and the evolution of the optical density of the culture is measured over time. The results are shown in Figure 6. On observed an inhibition of the growth of the yeast Saccharomyces cerevisiae from 0.05% of ECG-Cn : i.
  • EXAMPLE 12 Growth curve of the yeast Saccharomyces cerevisiae in a liquid medium at room temperature (28 ° C.) in the presence of linear carbonic ester of glycerol and of nonanoic acid (OECG-C9).
  • Example 9 The procedure is identical to Example 9. 100 ⁇ L of pre-culture are introduced into tubes containing 5 mL of fresh medium and a proportion by volume of 0.01, 0.05 and 0.1% of OECG. C 9 . The tubes are placed at 28 ° C. and the evolution of the optical density of the culture is measured over time. The results are shown in FIG. 7. An inhibition of the growth of the yeast Saccharomyces cerevisiae is observed from 0.05% of OECG-C 9 .
  • EXAMPLE XIII Growth curve of the yeast Saccharomyces cerevisiae in a liquid medium at room temperature (28 ° C.) in the presence of linear carbonic ester of glycerol and heptanoic acid (OECG-C 7 )
  • Example 9 The procedure is identical to Example 9. 100 ⁇ L of pre-culture are introduced into tubes containing 5 mL of fresh medium and a proportion by volume of 0.01, 0.05 and 0.1% of OECG. C 7 . The tubes are placed at 28 ° C. and the evolution of the optical density of the culture is measured over time. The results are shown in FIG. 8. An inhibition of the growth of the yeast Saccharomyces cerevisiae is observed starting from 0.05% of OECG-C 7 .
  • a composition, a microorganism preservation method and a plant treatment method in which such a composition is used are subject to an infinity of variants both in the formulation of the composition and in the modes of implementation. processes.

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Abstract

L'invention concerne un procédé de conservation de micro-organismes à température ambiante, dans lequel: - on prépare une composition, dite composition de conservation, comprenant les micro-organismes à conserver et un milieu de conservation desdits micro-organismes, caractérisé en ce que: le milieu de conservation comprend au moins un composé, dit composé conservateur, choisi dans le groupe formé des composés pour lesquels il existe au moins une proportion inhibitrice prédéterminée du composé conservateur dans la composition de conservation qui est : inhibitrice de la croissance desdits micro-organismes dans la composition de conservation à température ambiante, et; non létale pour lesdits micro-organismes, et en ce que; ledit composé conservateur est dans la composition de conservation en proportion supérieure à ladite proportion inhibitrice prédéterminée et en proportion non létale pour lesdits micro-organismes; -et dans lequel on place la composition de conservation à température ambiante aux fins de conserver lesdits micro-organismes. L'invention vise en particulier, un tel procédé dans lequel le composé conservateur est un ester carbonique de glycérol.

Description

PROCÉDÉ DE CONSERVATION DE MICRO-ORGANISMES À
TEMPÉRATURE AMBIANTE ET COMPOSITION
L'invention concerne un procédé de conservation in vitro et à température ambiante de micro-organismes vivants et une composition permettant la conservation de micro-organismes vivants à température ambiante pour la mise en œuvre d'un tel procédé. L'invention vise aussi un procédé de traitement de plantes dans lequel on utilise une composition de conservation comprenant des micro-organismes vivants utiles pour des plantes.
On connaît des procédés de conservation de cellules dans lequel on utilise du glycérol et/ou du diméthyl suif oxyde (DMSO) à titre d'additif préservant les cellules vis à vis de la congélation/décongélation lors de leur conservation à basse température (-20°C, -80°C ou -176°C dans l'azote liquide). Un tel procédé de conservation de cellules est complexe dans sa mise en œuvre et nécessite d'utiliser des dispositifs spécifiques de conservation des cellules à température inférieure à 0°C -notamment inférieure à -20°C-.
On connaît aussi un procédé de conservation de microorganismes à l'état au moins partiellement déshydraté. Une telle déshydratation est en général réalisée par congélation des cellules à basse température puis sublimation de l'eau à basse pression par lyophilisation. D'une part, de nombreux types cellulaires ne peuvent pas être conservés par lyophilisation, cette déshydratation par lyophilisation n'étant pas compatible avec le maintien de l'intégrité des cellules. D'autre part, un tel procédé nécessite d'utiliser, pour la lyophilisation, un dispositif spécifique de congélation qui peut être un congélateur ou un bain d'azote liquide. La maintenance d'un tel dispositif spécifique de congélation est complexe et coûteuse.
L'utilisation de micro-organismes vivants pour combattre des champignons et des bactéries pathogènes des plantes et des maladies provoquées par ces champignons et ces bactéries pathogènes est connue, par exemple de WO 2012/016140, de WO 2009/156688 ou de WO 2009/156687. Ces documents ne traitent pas de la conservation de micro-organismes en vue de leur utilisation en agriculture pour le traitement de plantes. En effet, une telle utilisation nécessite pour un agriculteur de disposer d'une composition -par exemple, une composition liquide- comprenant de tels micro-organismes vivants prête à être appliquée sur des plantes. Une telle composition liquide comprenant des micro-organismes vivants en phase de croissance ne peut être conservée durablement par l'agriculteur. En effet, une telle composition comprenant des bactéries en phase exponentielle de croissance est susceptible d'entrer rapidement en phase stationnaire puis en phase de décroissance conduisant à la perte de la culture bactérienne. Une telle composition doit donc être préparée de façon extemporanée par l'agriculteur ou mise à disposition de l'agriculteur -par le distributeur ou le fabriquant- au moment où son utilisation est envisagée. Une autre solution est de pouvoir conserver la composition liquide comprenant des micro-organismes vivants à basse température, à +4°C ou à -20°C ou à -80°C dans un congélateur ou à -176°C dans l'azote liquide. De telles conditions de conservation ne peuvent pas en pratique être mises en œuvre par l'agriculteur.
L'invention vise à pallier les inconvénients précédemment évoqués en fournissant un procédé de conservation de micro-organismes à température ambiante et une composition pour conserver des micro-organismes qui ne nécessitent pas un stockage desdits micro-organismes à basse température.
L'invention vise ainsi à proposer un procédé de conservation de micro-organismes à température ambiante, c'est-à-dire un procédé qui ne nécessite pas de placer des micro-organismes dans un dispositif spécifique de refroidissement.
L'invention vise ainsi à proposer un procédé de conservation de micro-organismes à température ambiante qui soit applicable dans tout domaine technique dans lequel il est nécessaire de conserver des micro-organismes.
L'invention vise à proposer un tel procédé qui soit en particulier applicable dans le domaine agricole dans lequel des micro-organismes sont susceptibles de devoir être appliqués sur des plantes, en particulier pour stimuler leur croissance et/ou leurs défenses naturelles (SDN). L'invention vise de surcroît à proposer un procédé et une composition de conservation qui préservent les habitudes de travail des agriculteurs, soient faciles à utiliser, et n'impliquent pour leur mise en œuvre que peu de manipulations.
L'invention vise également à proposer un procédé et une composition de conservation dans lesquels sont utilisés des composés susceptibles d'être obtenus à partir de ressources végétales renouvelables.
Un autre objectif de l'invention est de proposer un tel procédé et une telle composition de conservation qui respectent l'environnement, notamment lors de l'application de ladite composition de conservation de microorganismes sur des plantes.
Pour ce faire, l'invention concerne un procédé de conservation de micro-organismes à température ambiante, dans lequel :
- on prépare une composition, dite composition de conservation, comprenant les micro-organismes à conserver et un milieu de conservation desdits micro-organismes,
caractérisé en ce que :
o le milieu de conservation comprend au moins un composé, dit composé conservateur, choisi dans le groupe formé des composés pour lesquels il existe au moins une proportion inhibitrice prédéterminée du composé conservateur dans la composition de conservation qui est :
■ inhibitrice de la croissance desdits micro-organismes dans la composition de conservation à température ambiante, et ;
■ non létale pour lesdits micro-organismes, et en ce que ;
o ledit au moins un composé conservateur est dans la composition de conservation en proportion supérieure à ladite proportion inhibitrice prédéterminée et en proportion non létale pour lesdits micro-organismes ;
- et dans lequel on place la composition de conservation à température ambiante -notamment à une température supérieure ou égale à +4°C- aux fins de conserver lesdits micro-organismes. Dans toute la suite, on entend par "conservation de micro-organismes à température ambiante", la conservation de micro-organismes qui ne nécessite aucun moyen spécifique de contrôle et d'ajustement de la température de la composition comprenant les micro-organismes.
L'invention consiste donc à proposer un procédé de conservation de micro-organismes in vitro et à température ambiante dans lequel on utilise un milieu de conservation comprenant au moins un composé conservateur admettant au moins une proportion prédéterminée qui est inhibitrice de la croissance d'au moins un micro-organisme et non létale pour ledit au moins un micro-organisme, ledit au moins un composé conservateur étant dans le milieu de conservation en proportion supérieure à sa proportion inhibitrice prédéterminée. La proportion de composé conservateur dans la composition de conservation est choisie pour pouvoir inhiber de façon réversible la croissance de micro-organismes, mais sans être létale pour lesdits micro-organismes. En particulier, le procédé selon l'invention permet, dans une première phase de conservation, d'inhiber la croissance de micro-organismes à température ambiante, mais permet aussi, après dilution appropriée de la composition de conservation, de permettre la croissance des micro-organismes dans une composition de croissance obtenue par dilution de la composition de conservation.
Le milieu de conservation est choisi pour permettre de maintenir la culture de micro-organismes dans une phase stationnaire de croissance -sans dégénérescence de ladite culture- à température ambiante, tout en préservant le potentiel de ladite culture de micro-organismes à reprendre ultérieurement une phase exponentielle de croissance. Les micro-organismes conservés à température ambiante dans la composition de conservation ne sont donc pas en phase de décroissance. La proportion de composé conservateur supérieure à la proportion inhibitrice prédéterminée dans la composition de conservation n'est donc pas létale pour les micro-organismes.
Les inventeurs ont en effet constaté qu'il est possible de conserver des micro-organismes à température ambiante -c'est-à-dire de maintenir des micro-organismes en phase de latence (ou dormance) en inhibant leur croissance tout en préservant leur potentiel de croissance ultérieure- en plaçant ces micro-organismes dans une composition de conservation appropriée comprenant un composé conservateur dans une proportion choisie pour être inhibitrice de la croissance mais non létale pour ces micro-organismes. Un composé conservateur selon l'invention ne présente donc pas de propriété antibiotique -c'est-à-dire qu'il ne conduit pas à la mort de micro-organismes- mais uniquement une propriété inhibitrice réversible de la croissance de micro-organismes.
Dans un procédé selon l'invention, on choisit au moins un composé conservateur dans le groupe formé des composés admettant au moins une proportion dans le milieu de conservation qui est inhibitrice de la croissance de micro-organismes, mais non létale pour ces micro-organismes. La proportion inhibitrice prédéterminée d'un composé conservateur dans la composition de conservation est la valeur de la proportion de composé conservateur dans la composition de conservation entraînant l'arrêt total de la croissance d'un micro- organisme sans être létale pour les micro-organismes.
On détermine qu'une proportion de composé conservateur supérieure à la proportion inhibitrice prédéterminée est non létale en diluant la composition de conservation -de façon que la proportion de composé conservateur soit inférieure à la proportion inhibitrice prédéterminée- et en constatant la croissance des micro-organismes dans la composition de croissance obtenue par dilution de la composition de conservation.
On prédétermine la proportion minimale inhibitrice d'un composé conservateur par des méthodes d'analyse de la croissance de micro-organismes connues en elles-mêmes.
Avantageusement, le composé conservateur mis en œuvre dans un procédé selon l'invention dans une proportion supérieure à la proportion inhibitrice prédéterminée permet d'inhiber la croissance de micro-organismes pendant une durée d'au moins 30 jours, sans être létale pour lesdits micro-organismes. Dans un procédé selon l'invention, la dilution du milieu de conservation -notamment dans un milieu de culture adapté pour la croissance des micro-organismes- permet en fait de lever l'inhibition de la croissance des micro-organismes par le composé conservateur.
L'invention vise donc un procédé dans lequel le milieu de conservation et la composition de conservation comprennent un composé conservateur apte à inhiber la croissance de micro-organismes pour une proportion de composé conservateur supérieure à une valeur de proportion inhibitrice prédéterminée, ladite proportion de composé conservateur étant cependant non létale pour les micro-organismes et apte à permettre la croissance des micro-organismes pour une proportion de composé conservateur inférieure à ladite valeur de proportion inhibitrice prédéterminée.
Avantageusement et selon l'invention, on choisit au moins un composé conservateur dans le groupe formé de l'acide undécylénique, des esters de l'acide undécylénique et des esters carboniques de glycérol.
Dans tout le texte, on entend par :
- "ester carbonique de glycérol", tout composé comprenant au moins une fonction chimique ester carboxylique formée entre un groupement dérivé de l'acide carbonique et un groupement dérivé du glycérol ;
- groupement "dérivé de l'acide carbonique", tout groupement de formule suivante :
O
o— c— o—
dans laquelle les atomes d'hydrogène de l'acide carbonique sont substitués par un groupement organique qui est donc distinct de l'hydrogène, et par ;
- groupement "dérivé de glycérol" tout groupement de formule suivante :
Figure imgf000007_0001
dans laquelle au moins un atome d'hydrogène des groupements hydroxyles du glycérol est substitué par un groupement organique distinct de l'hydrogène. Avantageusement et selon l'invention, on choisit au moins un composé conservateur dans le groupe formé du carbonate de glycérol (cyclique), des esters du carbonate (cyclique) de glycérol et des esters carboniques linéaires de glycérol.
Les esters carboniques de glycérol -notamment le carbonate de glycérol, les esters du carbonate (cyclique) de glycérol et les esters carboniques linéaires de glycérol-, l'acide undécylénique et les esters de l'acide undécylénique sont adaptés pour pouvoir être appliqués sur des plantes et satisfont les normes de protection et de préservation de l'environnement. Ils ne présentent pas en eux- mêmes de toxicité pour la santé humaine ou animale. Ils sont biodégradables et ne présentent pas de risque de s'accumuler dans les sols et de contaminer ou de détériorer l'environnement, notamment lors de leur application sur des végétaux et/ou lors de leur introduction dans le sol. Ils ne présentent pas de risque de contaminer l'environnement lorsqu'ils sont appliqués en plein champ et qu'ils sont susceptibles d'être entraînés par ruissellement avec les eaux de pluie ou d'arrosage.
Ils peuvent être "biosourcés", c'est-à-dire obtenus à partir de ressources naturelles -notamment de ressources végétales- disponibles et renouvelables.
Dans une variante d'un procédé selon l'invention, au moins un composé conservateur est du carbonate de glycérol. Par carbonate de glycérol, on entend le carbonate cyclique de glycérol à cinq chaînons (4-(hydroxyméthyl)- l,3-dioxolan-2-one) de formule (I) suivante :
Figure imgf000008_0001
(I), référencé sous le numéro CAS 931-40-8 et dont un procédé de synthèse est décrit par exemple dans FR 2 778 182.
Dans une autre variante d'un procédé selon l'invention, au moins un composé conservateur est un ester du carbonate de glycérol (ou carbonate de glycérol acylé). Dans cette variante, au moins un composé conservateur est un ester du carbonate (cyclique) de glycérol α/α'-acylé à 5-chaînons de formule (II) ci- après :
Figure imgf000009_0001
(II), dans laquelle RI est un groupement hydrocarboné aliphatique -saturé, insaturé, linéaire ou ramifié- comprenant entre 1 et 30 atomes de carbone.
Le groupement RI peut être choisi dans le groupe formé des groupements hydrocarbonés aliphatiques saturés. Le groupement RI peut être un méthyle (-CH3), un éthyle (-CH2-CH3), un n-propyle (-CH2-CH2-CH3), un wo-propyle (-CH(CH3)2), un n-butyle (-CH2-CH2-CH2-CH3), un ΪΛΌ-butyle (-CH2-CH(CH3)2), un tem'o-butyle (-C(CH3)3), un n-pentyle (-(CH2)4-CH3), un n-hexyle (-(CH2)5-CH3), un n-heptyle (-(CH2)6-CH3), un n-octyle (-(CH2)7-CH3), un n-nonyle (-(CH2)8-CH3), un n-décyle (-(CH2)9-CH3), un n-undécyle (-(CH2)10-CH3), un n-dodécyle (-(CH2)n-CH3), un n-tridécyle (-(CH2)12-CH3), un n-tétradécyle (-(CH2)13-CH3), un n-pentadécyle (-(CH2)14-CH3), un n-hexadécyle (-(CH2)15-CH3), un n-heptadécyle (-(CH2)16-CH3), un n-octadécyle (-(CH2)17-CH3), un n-nonadécyle (-(CH2)18-CH3), un n-dodécadécyle (-(CH2)19-CH3).
Le groupement RI peut être choisi dans le groupe formé des groupements hydrocarbonés aliphatiques insaturés. Le groupement RI peut être un groupement hydrocarboné aliphatique présentant au moins une double liaison éthylénique. Le groupement RI peut être un groupement hydrocarboné aliphatique présentant 1, 2, 3, 4 ou 5 doubles liaisons éthyléniques, conjuguées ou non.
Avantageusement, le groupement RI peut aussi être choisi dans le groupe formé :
- du 9-ène-decyle de formule CH2=CH-(CH2)7-CH2-. Au moins un composé conservateur est l'ester du carbonate (cyclique) de glycérol et de l'acide undécylénique ; - du 8-ène-pentadecyle CH3-(CH2)5-CH=CH-(CH2)7-. Au moins un composé conservateur est l'ester du carbonate (cyclique) de glycérol et de l'acide palmitique ;
- du 8-ène-heptadecyle CH3-(CH2)7-CH=CH-(CH2)7-. Au moins un composé conservateur est l'ester du carbonate (cyclique) de glycérol et de l'acide oléique ;
- du groupement 12-ène-hénéicosyle CH3-(CH2)7-CH=CH-(CH2)n-. Au moins un composé conservateur est l'ester du carbonate (cyclique) de glycérol et de l'acide docosaénoïque.
Dans un mode de réalisation particulier, il est possible de choisir au moins un composé conservateur dans le groupe formé :
- des esters du carbonate (cyclique) de glycérol et d'un acide hydrocarboné à nombre pair d'atomes de carbone -ou acide hydrocarboné pair-, et ;
- des esters carboniques linéaires de glycérol et d'au moins un acide hydrocarboné à nombre pair d'atomes de carbone -ou acide hydrocarboné pair-.
Dans un autre mode de réalisation, avantageusement et selon l'invention, on choisit au moins un composé conservateur dans le groupe formé :
- des esters du carbonate (cyclique) de glycérol et d'un acide hydrocarboné à nombre impair d'atomes de carbone -ou acide hydrocarboné impair-, et ;
- des esters carboniques linéaires de glycérol et d'au moins un acide hydrocarboné à nombre impair d'atomes de carbone -ou acide hydrocarboné impair-.
Avantageusement et selon l'invention, RI est un groupement hydrocarboné aliphatique linéaire -saturé ou insaturé- présentant une chaîne principale carbonée à nombre pair d'atomes de carbone. Le groupement acyle (R1-CO-) de l'ester carbonique cyclique de glycérol α/α'-acylé est donc un groupement présentant une chaîne principale carbonée à nombre impair d'atomes de carbone. En particulier, RI est choisi dans le groupe formé du n-hexyle (-(CH2)5-CH3), du n-octyle (-(CH2)7-CH3) et d'un 9-ène-decyle (-(CH2)8-CH=CH2). Au moins un composé conservateur peut être : - l'ester du carbonate de glycérol et de l'acide heptanoïque (ECG formule (III) suivante
Figure imgf000011_0001
l'ester du carbonate de glycérol et de l'acide nonanoïque (ECG-C9) de formule (IV) suivante
Figure imgf000011_0002
l'ester du carbonate de glycérol et de l'acide undécylénique (ECG-
C11:1) de formule (V) suivante
Figure imgf000011_0003
Dans une autre variante d'un procédé selon l'invention, au moins un composé conservateur peut être un ester carbonique de glycérol cyclique à 6-chaînons.
Dans une autre variante d'un procédé selon l'invention, au moins un composé conservateur est un ester carbonique linéaire de glycérol présentant au moins un groupement d'atomes de formule (VI) générale suivante :
O— C— O— G;— O
0 (VI)
dans laquelle G0 est choisi dans le groupe formé :
- des groupements propyles α/α'-oxyacylés de formule (VII) générale suivante :
O
H — O— C— R1
-CH— CH—
(VII) des groupements propyles β-oxyacylés de formule (VIII) générale suivante :
O
O— C— R2
CH CH-CH—
(VIII)
du groupement propyle α/α'-hydroxylé de formule (IX) suivante :
H2C— OH
CH CH—
(IX)
du groupement propyle β-hydroxylé de formule (X) suivante :
OH
CH2 CH CH2
(X)
dans lesquelles RI et R2 sont choisis indépendamment l'un de l'autre dans le groupe formé des groupements hydrocarbonés aliphatiques -saturés, insaturés, linéaires ou ramifiés- comprenant entre 1 et 30 atomes de carbone.
Le groupement R2 d'un ester carbonique linéaire de glycérol peut être choisi, indépendamment de RI, dans le groupe formé des groupements hydrocarbonés aliphatiques saturés. Le groupement R2 peut être un méthyle (-CH3), un éthyle (-CH2-CH3), un n-propyle (-CH2-CH2-CH3), un wo-propyle (-CH(CH3)2), un n-butyle (-CH2-CH2-CH2-CH3), un wo-butyle (-CH2-CH(CH3)2), un tem'o-butyle (-C(CH3)3), un n-pentyle (-(CH2)4-CH3), un n-hexyle (-(CH2)5-CH3), un n-heptyle (-(CH2)6-CH3), un n-octyle (-(CH2)7-CH3), un n-nonyle (-(CH2)8-CH3), un n-décyle (-(CH2)9-CH3), un n-undécyle (-(CH2)10-CH3), un n-dodécyle (-(CH2)„-CH3), un n-tridécyle (-(CH2)12-CH3), un n-tétradécyle (-(CH2)13-CH3), un n-pentadécyle (-(CH2)14-CH3), un n-hexadécyle (-(CH2)15-CH3), un n-heptadécyle (-(CH2)16-CH3), un n-octadécyle (-(CH2)17-CH3), un n-nonadécyle (-(CH2)18-CH3), un n-dodécadécyle (-(CH2)19-CH3).
Le groupement R2 d'un ester carbonique linéaire de glycérol peut être choisi, indépendamment de RI, dans le groupe formé des groupements hydrocarbonés aliphatiques insaturés. Le groupement R2 peut être un groupement hydrocarboné aliphatique présentant au moins une double liaison éthylénique. Le groupement R2 peut être un groupement hydrocarboné aliphatique présentant 1, 2, 3, 4 ou 5 doubles liaisons éthyléniques, au moins deux d'entre elles pouvant être conjuguées ou non. Avantageusement, le groupement R2 peut aussi être choisi dans le groupe formé :
- du 9-ène-decyle de formule CH2=CH-(CH2)8- ;
- du 8-ène-pentadecyle CH3-(CH2)5-CH=CH-(CH2)7- ;
- du 8-ène-heptadecyle CH3-(CH2)7-CH=CH-(CH2)7-, et ;
- du 12-ène-hénéicosyle CH3-(CH2)7-CH=CH-(CH2)i .
Un ester carbonique linéaire de glycérol présentant au moins un groupement d'atomes de formule (VI) peut être choisi dans le groupe formé des esters carboniques linéaires de glycérol de formule (VF) générale suivante :
M1 O— C— O— G— O— Q1
0 (VF)
dans laquelle :
- G est choisi dans le groupe formé :
■ des groupements propyles α/α'-oxyacylés de formule (VII) ;
■ des groupements propyles β-oxyacylés de formule (VIII) ;
■ du groupement propyle α/α'-hydroxylé de formule (IX) ;
■ du groupement propyle β-hydroxylé de formule (X) ;
- Qi est choisi dans le groupe formé de l'hydrogène (H) et des groupements organiques formés d'au moins deux atomes liés par des liaisons covalentes et appartenant au groupe formé du carbone (C) et de l'hydrogène (H) -et éventuellement de l'oxygène (O)-, et ;
- Mi représente un groupement organique formé d'au moins deux atomes liés par des liaisons covalentes et appartenant au groupe formé du carbone (C) et de l'hydrogène (H) -et éventuellement de l'oxygène (O)-.
Dans cette variante d'un procédé selon l'invention, le composé conservateur est un ester carbonique linéaire de glycérol acylé de formule (XI) générale suivante :
Figure imgf000014_0001
(XI) dans laquelle ;
- x est un nombre entier égal à 0 ou à 1 pouvant varier dans (XI) selon chaque groupement de formule (XI- a) :
Figure imgf000014_0002
x n'étant pas toujours nul ;
- n est un nombre entier compris entre 1 et 20 -notamment compris entre 1 et 10-, bornes incluses ;
- Q2 est choisi dans le groupe formé de l'hydrogène (H) et des groupements organiques formés d'au moins deux atomes liés par des liaisons covalentes, lesdits atomes appartenant au groupe formé du carbone (C) et de l'hydrogène (H) -et éventuellement de l'oxygène (O)-, et ;
- M2 représente un groupement organique formé d'au moins deux atomes liés par des liaisons covalentes, lesdits atomes appartenant au groupe formé du carbone (C) et de l'hydrogène (H) -et éventuellement de l'oxygène (O)-, et ;
- G2 représente un groupement d'atomes choisi dans le groupe formé :
■ des groupements propyles α/α'-oxyacylés de formule (VII) générale, et ;
■ des groupements propyles β-oxyacylés de formule (VIII) générale.
Avantageusement et selon l'invention, au moins un composé conservateur est un oligocarbonate/oligoglycérol acylé de formule (XII) suivante :
Figure imgf000014_0003
(XII), dans laquelle :
- M3 est un groupement organique choisi dans le groupe formé des groupements de formules suivantes :
Figure imgf000014_0004
νγγ ,
Figure imgf000015_0001
2OH
O— CHg ? CH
(XIIc), et ;
O
R C O CH„CH CH„ VTT \
( AiiDj ;
dans lesquels R est un groupement hydrocarboné -notamment un groupement hydrocarboné saturé, un groupement hydrocarboné insaturé ou un groupement hydrocarboné ramifié- comprenant de 1 à 21 atomes de carbone, et ;
- Gn est choisi dans le groupe formé des groupements propyles hydroxylés de formules générales (XIIE) et (IIF) suivantes :
?H
CH CH-CH2 (χ¾) et .
Figure imgf000015_0002
- G12 et G13 sont des groupements propyles α/α'-oxyacylés de formule générale (VII) suivante :
Figure imgf000015_0003
- Q3 est choisi dans le groupe formé de l'hydrogène et des groupements organiques formés d'au moins deux atomes liés par des liaisons covalentes et appartenant au groupe formé du carbone (C), de l'hydrogène (H) et de l'oxygène (O) ;
- n est un nombre entier naturel inférieur à 9 -c'est-à-dire de l'intervalle [0 ; 8]- tel que si n = 0 et m≠ 0, alors Mi est choisi dans le groupe formé de IC et ID, et ;
- m est un nombre entier naturel inférieur à 5 -notamment de l'intervalle
[0 ; 4], et ;
- p est un nombre entier naturel inférieur à 4 -notamment de l'intervalle
[0 ; 3]-.
Dans toute la suite, les groupements Gn de formule (XIIF), G12 et G13 de formule (VII) peuvent être présents dans l'oligomère selon l'un et/ou l'autre de leurs deux sens d'insertion possible dans l'oligomère.
Avantageusement et selon l'invention, la proportion de composé conservateur dans le milieu de conservation est choisie pour être une proportion volumique comprise entre 0,01 % et 100 %. Il est possible que le composé conservateur soit à l'état pur dans le milieu de conservation.
Avantageusement et selon l'invention, la proportion de composé conservateur dans le milieu de conservation est une proportion volumique comprise entre 0,01 % et 10 % -de préférence comprise entre 0,01 % et 1 %, plus préférentiellement comprise entre 0,01 % et 0,10 %, en particulier comprise entre 0,03 % et 0,07 %, notamment de l'ordre de 0,05 %-.
Avantageusement, le procédé selon l'invention est un procédé de conservation de micro-organismes in-vitro.
Avantageusement et selon l'invention, le composé conservateur et sa proportion dans la composition de conservation sont choisis pour permettre une conservation de micro-organismes à température ambiante pendant une durée de conservation au moins égale à 30 jours.
On entend par "température ambiante", une température -notamment une température de la composition de conservation- qui est atteinte sans nécessiter l'utilisation de moyens de chauffage et/ou de refroidissement. On entend en particulier par "température ambiante", une température supérieure ou égale à +4°C -notamment comprise entre 15°C et 60°C, en particulier entre 20°C et 40°C-. Le procédé de conservation de micro-organismes à température ambiante est donc un procédé de conservation de micro-organismes à une température supérieure ou égale à +4°C.
Avantageusement et selon l'invention, le milieu de conservation est un milieu aqueux. Avantageusement, le milieu de conservation de micro-organismes est un milieu aqueux qui ne permet pas en lui-même la croissance et le développement de micro-organismes. Avantageusement et selon l'invention, le milieu de conservation est choisi dans le groupe formé de l'eau et des milieux aqueux salins. Avantageusement et selon une variante de l'invention, le milieu de conservation est à l'état liquide à température ambiante. Il peut s'agir d'un milieu de conservation essentiellement aqueux comprenant au moins un composé conservateur. Le micro-organisme est donc conservé dans un milieu liquide susceptible de pouvoir être dilué ultérieurement dans un liquide de dilution, notamment dans de l'eau, ou dans tout milieu de culture du micro-organisme permettant son développement ultérieur.
Cependant, selon une autre variante de l'invention, le milieu de conservation peut être à l'état solide à température ambiante. Il peut s'agir d'une composition comprenant une proportion d'au moins un gélifiant tel que par exemple de l'agar-agar. Le milieu de conservation est donc un milieu de conservation gélosée comprenant au moins un composé conservateur et qui est à l'état solide à température ambiante.
Avantageusement et selon l'invention, le milieu de conservation comprend des micro-organismes choisis dans le groupe formé des bactéries, des champignons unicellulaires, des levures et des protozoaires.
L'invention concerne aussi un procédé de traitement de plantes dans lequel on utilise un milieu de conservation selon l'invention.
L'invention s'étend aussi à un procédé de traitement de plantes dans lequel :
- on prépare une composition de conservation par un procédé selon l'invention, puis :
- on conserve à température ambiante ladite composition de conservation, puis :
- on dilue ladite composition de conservation de façon que la proportion de composé conservateur dans la composition diluée soit inférieure à la proportion inhibitrice prédéterminée et permette la croissance des micro-organismes, et
- on applique ladite composition diluée sur des plantes.
L'invention concerne donc aussi un procédé de traitement de plantes dans lequel on prépare une composition de conservation de micro-organismes qui permette à l'agriculteur de disposer d'une composition de conservation comprenant des micro-organismes concentrée et stable, qui est susceptible de pouvoir être diluée -notamment dans de l'eau- en vue de l'application de ladite composition diluée sur des plantes.
Avantageusement et selon l'invention, on conserve la composition de conservation pendant une durée au moins égale à 30 jours. On conserve la composition de conservation à température ambiante sans variation significative du nombre de micro-organismes vivants dans la composition de conservation.
Avantageusement et selon l'invention, au moins un micro- organisme est choisi dans le groupe formé des micro-organismes utiles pour la croissance et le développement de plantes.
Avantageusement et selon l'invention, au moins un microorganisme à conserver est choisi dans le groupe formé des bactéries à Gram positif, en particulier du genre Streptomyces.
En particulier, avantageusement et selon l'invention, au moins un micro-organisme à conserver est une bactérie du genre Streptomyces conforme à la souche déposée et enregistrée à la CNCM sous le numéro 1-4667. Au moins un micro-organisme est une bactérie Streptomyces conforme à la souche déposée et enregistrée en date du 7 avril 2011 sous le n° 1-4467 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) de l'Institut Pasteur (dont l'adresse est 25, rue du Docteur Roux, 75724 Paris cedex 15) ayant le statut d'autorité de dépôt internationale selon le traité de Budapest.
Avantageusement et selon l'invention, au moins un microorganisme est choisi dans le groupe formé des micro-organismes aptes à stimuler de défenses naturelles de plantes. La composition diluée est adaptée pour stimuler les défenses naturelles de plantes en culture. En particulier, l'application d'une composition diluée selon l'invention présente une activité stimulatrice des défenses naturelles des plantes, c'est-à-dire qu'elle permet d'activer l'expression chez des plantes de gènes de défense -par exemple PR-1- vis-à-vis d'organismes pathogènes des plantes.
L'invention s'étend aussi à une composition comprenant : - au moins un micro-organisme ;
- un milieu de conservation d'au moins un micro-organisme, et
- au moins un composé, dit composé conservateur, choisi dans le groupe formé des composés pour lesquels il existe une proportion inhibitrice prédéterminée du composé conservateur dans le milieu de conservation qui est :
o inhibitrice de la croissance d'au moins un micro-organisme dans le milieu de conservation à température ambiante, et ;
o non létale pour ledit au moins un micro-organisme,
le composé conservateur présentant dans la composition une proportion supérieure à la proportion inhibitrice prédéterminée,
ladite composition de conservation étant adaptée pour conserver ledit au moins un micro-organisme à température ambiante.
Une composition de conservation selon l'invention s'entend :
- d'une composition qui comprend des micro-organismes à l'état latent -c'est-à-dire dans laquelle le composé conservateur présente dans la composition une proportion supérieure à la proportion minimale inhibitrice prédéterminée et inhibe la croissance de micro-organismes et est non létal pour lesdits micro-organismes-, ou
- d'une composition qui comprend des micro-organismes en phase de croissance -c'est-à-dire dans laquelle le composé conservateur présente dans la composition une proportion inférieure à la proportion minimale inhibitrice prédéterminée et permet la croissance de micro-organismes-.
L'invention concerne donc en particulier une composition de conservation de micro-organismes qui permette de conserver des micro-organismes vivants, ladite composition de conservation étant susceptible de pouvoir être diluée -notamment dans de l'eau- en vue de l'application de ladite composition diluée sur des plantes.
Avantageusement et selon l'invention, au moins un composé conservateur est choisi dans le groupe formé de l'acide undécylénique, des esters de l'acide undécylénique et des esters carboniques de glycérol.
Avantageusement et selon l'invention, au moins un micro- organisme est du genre Streptomyces et conforme à la souche déposée et enregistrée à la CNCM sous le numéro 1-4667.
L'invention concerne également un procédé de conservation de micro-organismes, un procédé de traitement de plantes et une composition pour la mise en œuvre d'au moins l'un de ces procédés caractérisés en combinaison par tout ou partie des caractéristiques mentionnées ci-dessus ou ci-après.
D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture de la description et des exemples non limitatifs suivants qui se réfèrent aux figures annexées, et dans lesquelles :
- la figure 1 est une représentation graphique en histogramme de la viabilité (PFU/mL) de la bactérie Streptomyces \-AA61 en début (J+0) de conservation (histogramme plein/grisé) et après 28 jours de conservation
(histogramme hachuré) à température ambiante en absence (H2O) ou en présence de composé conservateur (ECG-C7, ECG-C9, ECG-C11: 1, OECG-C7, OECG-C9 et OECG-C11 : 1) en proportion massique de 0,05 % selon l'invention,
- la figure 2 est une représentation graphique en histogramme de la viabilité (PFU/mL) de la bactérie Streptomyces \-AA61 en début de conservation (histogramme plein/grisé) et après 28 jours de conservation (histogramme hachuré) à température ambiante en absence (H2O) ou en présence de composé conservateur (ECG-C7, ECG-C9, ECG-C11: 1, OECG-C7, OECG-C9 et OECG-Cl l: l) en proportion massique de 1 %,
- la figure 3 est une représentation graphique en histogramme de la viabilité (PFU/mL) de la bactérie Streptomyces \-AA61 en début de conservation (histogramme ouvert) et après 28 jours de conservation (histogramme hachuré) à température ambiante en présence de glycérol, de carbonate de glycérol ou d'acide undécylénique en proportion massique de 0,05 %,
- la figure 4 est une représentation graphique de courbes de croissance de la levure Saccharomyces cerevisiae en présence d'ECG-C7 à titre de composé conservateur selon l'invention en proportion de 0,01 % ; 0,05 % et 0,10 % dans l'eau, - la figure 5 est une représentation graphique de courbes de croissance de la levure Saccharomyces cerevisiae en présence d'ECG-C9 à titre de composé conservateur selon l'invention en proportion de 0,01 % ; 0,05 % et 0,10 % dans l'eau,
- la figure 6 est une représentation graphique de courbes de croissance de la levure Saccharomyces cerevisiae en présence d'ECG-Cl l: l à titre de composé conservateur selon l'invention en proportion de 0,01 % ; 0,05 % et 0,10 % dans l'eau,
- la figure 7 est une représentation graphique de courbes de croissance de la levure Saccharomyces cerevisiae en présence d'OECG-C7 à titre de composé conservateur selon l'invention en proportion de 0,01 % ; 0,05 % et 0,10 % dans l'eau,
- la figure 8 est une représentation graphique de courbes de croissance de la levure Saccharomyces cerevisiae en présence d'OECG-C9 à titre de composé conservateur selon l'invention en proportion de 0,01 % ; 0,05 % et 0,10 % dans l'eau.
Une composition de conservation selon l'invention, comprend
- des micro-organismes ;
- un milieu de conservation desdits micro-organismes comprenant au moins un composé, dit composé conservateur, choisi pour :
o être inhibiteur de la croissance d'au moins un micro-organisme in-vitro et à température ambiante, et ;
o être non létal pour ledit au moins un micro-organisme, dans une proportion du composé conservateur dans la composition supérieure à une proportion minimale inhibitrice prédéterminée, et pour permettre la croissance d'au moins un micro-organisme, dans une proportion du composé conservateur dans la composition inférieure à ladite proportion minimale inhibitrice prédéterminée.
Une telle composition de conservation permet de conserver des micro-organismes in vitro à température ambiante. Une telle composition selon l'invention, lorsqu'elle est mise en contact avec des micro-organismes, permet de limiter la croissance desdits micro-organismes à température ambiante, sans pertes significatives de micro-organisme et sans épuiser le milieu de culture.
Un milieu de conservation permet, lorsqu'il est mis en contact avec des micro-organismes dans une composition de conservation permet aux micro-organismes de reprendre leur croissance dès lors que la proportion de composé conservateur dans la composition de conservation devient inférieure -par exemple par dilution de la composition de conservation- à la valeur de proportion minimale inhibitrice prédéterminée du composé conservateur.
Une composition selon l'invention peut comprendre du carbonate de glycérol. On obtient du carbonate de glycérol par un procédé décrit dans FR 2 778 1821 dans lequel on fait réagir de l'urée et du glycérol en présence d'un catalyseur solide sous forme de poudre et constitué par un sel métallique ou un mélange de sels métalliques, contenant des sites acides de Lewis.
Une composition selon l'invention peut aussi comprendre un ester du carbonate de glycérol α/α'-acylé (5-chaînons) ou un ester carbonique cyclique de glycérol β'-acylé (6 chaînons). On obtient de tels esters du carboante (cyclique) de glycérol α/α'-acylés par des procédés de synthèse tels que décrits aux exemples 1, 2 et 3 ci-après.
EXEMPLE 1 - Synthèse d'esters du carbonate de glycérol (carbonate de glycérol α/α'-acylé)
On réalise la synthèse d'esters du carbonate de glycérol choisis dans le groupe formé :
- de l'ester du carbonate de glycérol et de l'acide heptanoïque (ECG-
C7), et ;
- de l'ester du carbonate de glycérol et de l'acide nonanoïque (ECG-C9), et ;
- de l'ester du carbonate de glycérol et de l'acide undécylénique (ECG-
C11:1), et ;
- de l'ester carbonique cyclique de glycérol et de l'acide oléique (ECG- par estérification du carbonate de glycérol (cyclique α/α'-hydroxylé) par l'acide gras correspondant.
Dans un réacteur de 500 mL équipé d'un dispositif d'agitation mécanique, d'un dispositif de mise sous pression réduite et d'un dispositif "Dean-Stark" d'élimination de l'eau formée, on place 1,64 moles d'acide gras et 0,0078 moles d'acide 4-méthylbenzènesulfonique (CAS n° 6192-52-5, acide para- toluène- sulfonique, ApTs). On porte la température du mélange à la température de 110°C sous une pression de 800 hPa pendant une durée de 15 min. On ajoute ensuite goutte à goutte dans le réacteur 0,84 moles de carbonate de glycérol sous agitation mécanique à 800 rotations par minutes (rpm) pendant 15 min. On place le réacteur dans un bain d'huile porté à la température de 110°C et sous agitation mécanique (800 rpm) pendant 3 heures.
EXEMPLE 2 - Purification des esters du carbonate de glycérol.
On dilue le milieu réactionnel dans 150 mL d'éther éthylique et on place le mélange obtenu dans une ampoule à décanter de 1 L. On lave le mélange successivement avec 4 volumes d'eau saturée en NaCl jusqu'à neutralité de la phase aqueuse. La phase organique lavée est séchée sur du sulfate de magnésium, puis est séparée du sulfate de magnésium hydraté par filtration. L'éther de la phase organique est éliminé par évaporation sous pression réduite. On obtient une masse de produit sec de 277g. L'ester du carbonate de glycérol est séparé des acides gras en excès par distillation en film mince sous pression réduite à une température inférieure à la température d'ébullition de l'acide gras sous cette pression réduite et inférieure à 155°C. On obtient l'ester du carbonate de glycérol dont la pureté évaluée par chromatographie en phase gazeuse est comprise entre
85 % et 95 %.
EXEMPLE 3 - Synthèse du carbonate de glycérol
-acétylé (ECG-C2).
On réalise la synthèse du carbonate de glycérol α/α'-acetylé de formule ci-après :
Figure imgf000024_0001
dans laquelle RI est un groupement méthyle.
Dans un ballon tricol en verre de 2 L équipé d'un agitateur mécanique et d'un dispositif "Dean-Stark" d'élimination de l'eau formée comprenant un réfrigérant et placé dans un bain d'huile, on introduit 472 g de carbonate de glycérol cyclique (4-(hydroxyméthyle)-l,3-dioxolan-2-one, CAS 931-40-8) et 4 g de résine Lewatit K2431. On ajoute 6 moles d'anhydride acétique goutte à goutte dans le réacteur de façon à contrôler et maintenir la température du réacteur à 150°C sous agitation mécanique de 800 rpm pendant 4 heures.
On élimine l'excès d'anhydride acétique par évaporation à la température de 60° C et sous pression réduite de 55 hPa. On purifie l'ester carbonique linéaire de glycérol α/α'-acétylé par la technique du film mince conduite dans un évaporateur/séparateur à la température de 170°C et sous pression réduite de 0,33 hPa. On obtient l'ester carbonique de glycérol α/α'-acétylé dont la pureté évaluée par chromatographie en phase gazeuse est comprise entre 98 % et 99 %.
Le taux de pureté des esters du carbonate de glycérol obtenus aux exemples 1, 2 et 3 et l'ion moléculaire (m/z) analysé par spectrométrie de masse sont donnés au tableau 1 ci-après.
Figure imgf000024_0002
Tableau 1
Une composition selon l'invention peut aussi comprendre des esters carboniques linéaires de glycérol. On obtient de tels esters carboniques linéaires de glycérol par condensation/oligomérisation à partir d'esters carboniques cycliques de glycérol, notamment d'esters carboniques cycliques de glycérol α/α'-acylés, en présence d'un amorceur organique -par exemple du glycérol- et d'un catalyseur métallique, par exemple du sulfate de zinc ou du stéarate de zinc comme décrits aux exemples 4 et 5.
EXEMPLE 4 - Oligomérisation du carbonate de glycérol cyclique α/α'-acétylé (ECG-C2).
On réalise Γ oligomérisation de l'ester du carbonique de glycérol α/α'-acétylé (ECG-C2) obtenu à l'exemple 3 en présence d'un catalyseur métallique, de glycérol à titre d' amorceur organique, et dans les conditions décrites au tableau 2 ci-après.
Figure imgf000025_0001
Tableau 2
La valeur TC ( %) indique le taux de conversion de l'ester du carbonique de glycérol α/α'-acétylé de départ. Les valeurs de masse molaire en nombre de produits de la réaction sont obtenues par analyse du milieu de réaction en chromatographie par perméation de gel sur colonne PL-Gel™ 3 μπι MIX-E. Les esters carboniques linéaires de glycérol α/α'-acétylés sont détectés en sortie de colonne par réfractométrie et les masses moléculaires sont déterminées par comparaison avec des standards de polystyrène. Le spectre de masse réalisé sur un milieu de réaction obtenu par mise en œuvre d'un procédé d'oligomérisation de l'ester du carbonate de glycérol α/α'-acétylé (ECG-C2) tel que décrit dans le présent exemple comporte des signaux correspondant à des ions moléculaires et fragments de valeurs m/z comprises entre 180,9 et 761,4 et correspondant à des oligomères de formules (A), (B) et (C) suivantes :
Figure imgf000026_0001
(A) ;
dans laquelle c peut prendre la valeur 1, 2 ou 4 et d peut prendre la valeur 1, 2, 3 ou 4
Figure imgf000026_0002
dans laquelle b peut prendre la valeur 1, 2, ou 3;
Figure imgf000026_0003
dans laquelle a est 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8, et ;
Figure imgf000026_0004
dans laquelle g peut prendre la valeur 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10.
EXEMPLE 5 - Synthèse d'esters carboniques linéaires de glycérol α/α'-acylés (OECG-C2, OECG-C7, OECG-C9 et OECG-Cn:i) à partir d'esters du carbonate de glycérol (cyclique) α/α'-acylés (ECG-C2, ECG-C7,
Figure imgf000026_0005
On réalise une oligomérisation d'esters du carbonate de glycérol (cycliques α/α'-acylés) selon l'invention dans les conditions décrites au tableau 3 ci- après. Catalyseur métallique Amorceur Masses
ECG,
Nature Masse, Glycérol, Conditions TC, % molaires masse
mg g en nombre
714, 335,
ECG-C2, Zn(C18H35O2) 160°C, Patm,
125 3,75 98 206, 139, 21,25 g 2 2h
92
ECG-C7, 200°C, Patm, 639, 420,
ZnSO4 113 2,42 64 20 g 2h 252, 96
ECG-C9, 180°C, Patm, 992, 541,
ZnSO4 110 2,15 88 20 g 2h 303, 90
ECG- 7632,
190 C, Patm,
c11:1, ZnSO4 86 1,3 98 2113,1084
2h
10 g , 750, 486
Tableau 3
La valeur TC ( %) indique le taux de conversion de l'ester du carbonate de glycérol de départ. Les valeurs de masse molaire apparente sont obtenues par analyse du milieu de réaction par chromatographie par perméation de gel. On obtient des oligomères de masse molaire apparente atteignant 7600 Da.
EXEMPLE 6 - Souche Streptomyces 1-4467
La souche Streptomyces, dite Streptomyces 1-4467, objet du présent exemple a été déposée et enregistrée en date du 7 avril 2011 sous le numéro 1-4467 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) de l'Institut Pasteur (dont l'adresse est 25, rue du Docteur Roux, 75724 Paris cedex 15) ayant le statut d'autorité de dépôt internationale selon le traité de Budapest. La souche de Streptomyces 1-4467 présente une séquence d'ADN, dit ADNr 16S, codant pour l'ARN ribosomal 16S qui présente la SEQ ID_NOl.
La séquence SEQ ID_NOl est décrite ci-après :
tagtggcgaa cgggtgagta acacgtgggc aatctgccct gcactctggg acaagccctg 60 gaaacggggt ctaataccgg atatgacacg ctcccgcatg ggatgcgtgt ggaaagctcc 120 ggcggtgcag gatgagcccg cggcctatca gcttgttggt ggggtgatgg cctaccaagg 180 cgacgacggg tagccggcct gagagggcga ccggccacac tgggactgag acacggccca 240 gactcctacg ggaggcagca gtggggaata ttgcacaatg ggcgaaagcc tgatgcagcg 300 acgccgcgtg agggatgacg gccttcgggt tgtaaacctc tttcagcagg gaagaagcga 360 gagtgacggt acctgcagaa gaagcgccgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac 420 gtagggcgca agcgttgtcc ggaattattg ggcgtaaaga gctcgtaggc ggcttgtcgc 480 gtcggatgtg aaagcccggg gcttaacccc gggtctgcat tcgatacggg caggctagag 540 ttcggtaggg gagatcggaa ttcctggtgt agcggtgaaa tgcgcagata tcaggaggaa 600 caccggtggc gaaggcggat ctctgggccg atactgacgc tgaggagcga aagcgtgggg 660 agcgaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa cgttgggaac taggtgtggg 720 cgacattcca cgtcgtccgc gccgcagcta acgcattaag ttccccgcct ggggagtacg 780 gccgcaaggc taaaactcaa aggaattgac ggggggcccg cacaagcggc ggagcatgtg 840 gcttaattcg acgcaacgcg aagaacctta ccaaggcttg acatacaccc ggaaacctct 900 ggagacaggg gccccccttg tggtcggtgt acaggtggtg catggcttgt cgtcagctcg 960 tgtcgtgaga tgttgggtta agtccccgca acgagcgcaa cccttgttct gtgttgccag 1020 catgcctttc gggggntgat ggggacttnc acaggagact gccggggtca actcggagga 1080 aggtggggac gacgtcaagt catcatgccc cttatgtctt gggctgcaca cgtgctacaa 1140 tggccggtac aatgagctgc gaagccgtga ggtggagcga atctcaaaaa gccggtctca 1200 gttcggattg gggtctgcaa ctcgacccca tgaagtcgga gtcgctagta atcgcagatc 1260 agcattgctg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca cgtcacgaaa 1320 gtcggtaaca cctgaa 1336.
Dans la séquence SEQ ID_NOl ci-dessus, le symbole "n" en positions 1036 et 1049 de la séquence SEQ ID_NOl désigne, selon l'IUPAC ("International Union ofPure and Applied Chemistry"), l'un quelconque des quatre nucléotides a, t, c ou g. Ainsi, le nucléotide n en position 1036 est choisi dans le groupe formé du nucléotide "a", du nucléotide "t", du nucléotide "g" et du nucléotide "c", et le nucléotide n en position 1049 est choisi, indépendamment du nucléotide en position 1036, dans le groupe formé du nucléotide "a", du nucléotide "t", du nucléotide "g" et du nucléotide "c".
La souche Streptomyces 1-4467 est une bactérie à Gram positif. La souche Streptomyces \-AA61 peut être utilisée pour la protection de plantes et la stimulation de leur vitalité par des moyens et procédés naturels (biocontrôle), visant notamment à contrôler l'équilibre entre les plantes et les populations d'agresseurs plutôt qu'à éradiquer ces populations d'agresseurs. En particulier, la souche Streptomyces \-AA61 est apte à :
- promouvoir la solubilisation d'éléments nutritionnels solides -notamment du phosphore- et sa mise à disposition de plantes. La souche Streptomyces \-AA61 permet de favoriser la dissolution -dans la rhizosphère de végétaux- de produits de fertilisation solide inassimilable par lesdits végétaux et d'améliorer la nutrition de végétaux ;
- stimuler la croissance de plantes -en particulier la croissance des parties aériennes de plantes- par exemple telles que le tournesol et le maïs. Pour ce faire, on applique par pelliculage sur des graines de tournesol et sur des graines de maïs une composition liquide selon l'invention comprenant entre 1 et 2 g (masse de bactéries humides) de bactéries de la souche Streptomyces \-AA61 par litre de composition. On sème des graines de tournesol et de maïs traitées avec la composition liquide selon l'invention et à titre de contrôles des graines de tournesol et de maïs non traitées. On observe une stimulation de la croissance initiale des plants de tournesol et de plants de maïs par rapport aux plants de tournesol et de maïs non traités ;
- ralentir la croissance :
o de certaines bactéries telles que Micrococcus luteus et Bacillus subtilis ;
o de certains micro-organismes cible phyto-pathogènes tels que Botrytis cinerea, Streptomyces scabies, Botrytis cinerae, Fusarium culmorum, Pythium ultimum, Phaeomoniella chlamydospora, Phaeomoniella aelophilum, Eutypa lata, Fomitiporia mediterranea et Botryosphaeria obtusa ;
- stimuler les défenses naturelles de plantes en culture. L'application d'une composition de traitement selon l'invention présente une activité stimulatrice des défenses naturelles des plantes, c'est-à-dire qu'elle permet d'activer l'expression chez des plantes de gènes de défense -par exemple PR-1- vis-à-vis d'organismes pathogènes des plantes.
La souche Streptomyces \-AA61 peut être cultivée dans un milieu de culture liquide aqueux, notamment dans un milieu choisi dans le groupe formé des milieux complets et des milieux riches comprenant tous les éléments minéraux et des précurseurs organiques nécessaires à la croissance des bactéries selon l'invention, en particulier une source de carbone, une source d'azote, une source de phosphore, des vitamines et des oligoéléments. Un tel milieu complet peut comprendre du D-glucose, un extrait de levure, du phosphate de potassium dibasique (K2HPO4), du sulfate d'ammonium ((NH4)2SO4), du chlorure de potassium (KCt) et du glycérol à pH 2.
La souche Streptomyces \-AA61, lorsqu'elle est cultivée sur milieu ISP-2 ou sur milieu Bennett solide, forme des amas ou "colonies" bactériennes présentant :
- un mycélium, dit mycélium de substrat, ramifié se développant dans l'épaisseur du milieu solide de couleur variant du jaune-brun au gris-brun selon la composition du milieu solide, et
- un mycélium aérien se développant à l'interface air/solide qui est de couleur blanche.
La température optimale de croissance de la souche
Streptomyces \-AA61 est comprise entre 12°C et 37°C. Elle est de préférence comprise entre 28°C et 30°C. La température optimale de conservation de la souche Streptomyces \-AA61 dans son milieu de culture est de +4°C.
EXEMPLE 7 - Conservation de la souche Streptomyces 1-4467 à température ambiante (28°C)
On prépare une suspension de bactérie Streptomyces \-AA61 comprenant 800 UFC (Unité Formant Colonie) par mL d'eau. On ajoute 0,05 % (v/v) d'un composé conservateur choisi dans le groupe formé des esters du carbonate de glycérol (ECG-C7, d'ECG-C9, d'ECG-C11:1) et des esters carboniques linéaires de glycérol (OECG-C7, d'OECG-C9, et d'OECG-Cn:i). On place la composition de conservation ainsi obtenue à la température de 28°C pendant 28 jours. À titre de contrôle, on prépare une suspension de bactérie Streptomyces 1-4467 comprenant 800 UFC par mL de milieu de culture et on ajoute 0,05 % d'eau. À l'issue de la période de 28 jours, on évalue la viabilité des bactéries dans chacune des compositions de conservation par étalement de 200 μΐ de la composition ou de dilutions sériées de la composition sur un milieu de culture Bennet solide (10 g de glucose, 1 g d'extrait de levure, 1 g d'extrait de viande, 2 g de bactopeptone, 18 g d'agar-agar dans 1 L d'eau osmosée), incubation à 28°C et dénombrement des colonies bactériennes formées après 7 jours.
Les résultats sont représentés en figure 1 dans laquelle les histogrammes pleins (grisés) représentent le nombre de bactéries (UFC/mL) ensemencées à J+0 et les histogrammes hachurés représentent le nombre de bactéries (UFC/mL) mesuré à J+28.
En comparaison avec le contrôle (H2O), la croissance de la souche Streptomyces 1-4467 est fortement limitée voire empêchée par les composés conservateurs ECG-C9, ECG-C11:1, OECG-C7 et OECG-C11:1 et, dans une moindre mesure avec les composés conservateurs ECG-C7 et OECG-C9. Les composés conservateurs permettent de conserver les bactéries Streptomyces 1-4467 pendant 28 jours en inhibant leur croissance tout en conservant leur potentiel ultérieur de croissance. Ils permettent de conserver les bactéries Streptomyces 1-4467 pendant 28 jours sans nécessiter de dilution et de repiquages réguliers de la souche Streptomyces 1-4467 et sans épuiser le milieu de culture.
À titre de contrôle, un essai similaire est réalisé avec une proportion des mêmes composés conservateurs de l'ordre de 1 % (v/v) et des suspensions de bactérie Streptomyces 1-4467 comprenant 400 UFC par mL de milieu de culture. Les résultats sont représentés en figure 2 dans laquelle les histogrammes pleins (grisés) représentent le nombre de bactéries (UFC/mL) ensemencées à J0 et les histogrammes hachurés représentent le nombre de bactéries (UFC/mL) mesuré à J+28.
Dans une proportion de 1 % dans le milieu, les composés conservateurs ECG-C7, ECG-C9, ECG-Cn:i, OECG-C7, OECG-C9 et OECG-Cn:i présentent un comportement bactéricide. EXEMPLE 8 - Conservation de la souche Streptomyces 1-4467 à température ambiante (28°C)
On procède comme à l'exemple 7 en utilisant du carbonate de glycérol et de l'acide undécylénique à titre de composés conservateurs. On prépare une suspension de bactérie Streptomyces 1-4467 comprenant de l'ordre de 400 UFC (Unité Formant Colonie) par mL d'eau. On ajoute 0,05 % (v/v) de composé conservateur choisi parmi le carbonate de glycérol ou l'acide undécylénique. On place la composition de conservation ainsi obtenue à la température de 28°C pendant 28 jours. A titre de contrôle, on prépare une suspension de bactérie Streptomyces 1-4467 comprenant 400 UFC par mL de milieu de culture et on ajoute 0,05 % de glycérol. A l'issue de la période de 28 jours, on évalue la viabilité des bactéries dans chacune des compositions de conservation par étalement de 200 μΐ de la composition ou d'une dilution sériée de la composition sur un milieu de culture Bennet solide (10 g de glucose, 1 g d'extrait de levure, 1 g d'extrait de viande, 2 g de bactopeptone, 18 g d'agar-agar dans 1 L d'eau osmosée), incubation des boites à 28°C et dénombrement des colonies bactériennes formées après 7 jours.
Les résultats sont représentés en figure 3 dans laquelle les histogrammes pleins (grisés) représentent le nombre de bactéries (UFC/mL) ensemencées à J+0 et les histogrammes hachurés représentent le nombre de bactéries (UFC/mL) mesuré à J+28.
En comparaison avec le contrôle (glycérol), la croissance de la souche Streptomyces 1-4467 est fortement limitée par les composés conservateurs carbonate de glycérol et acide undécylénique. Ces composés conservateurs permettent de conserver les bactéries Streptomyces 1-4467 pendant 28 jours en inhibant leur croissance tout en conservant leur potentiel ultérieur de croissance. Ils permettent de conserver les bactéries Streptomyces 1-4467 pendant 28 jours sans nécessiter de dilution et de repiquages réguliers de la souche Streptomyces 1-4467 et sans épuiser le milieu de culture
EXEMPLE 9 - Courbe de croissance de la levure Saccharomyces cerevisiae en milieu liquide à température ambiante (28°C) en présence d'ester du carbonate de glycérol et de l'acide heptanoïque (ECG-C7) On réalise une pré-culture de levure Saccharomyces cerevisiae pure dans 3 mL de milieu YPD (comprenant 2 % de bactopeptone, 1 % d'extrait de levure, 2 % de glucose et de l'eau osmosée qsp) sous agitation (220 rpm) à 28°C pendant 12 heures. La densité optique (DO à 600 nm) de la pré-culture est de l'ordre de 0,4 à 0,5. On prélève 100
Figure imgf000033_0001
de cette pré-culture que l'on introduit dans un tube contenant 5 mL de milieu frais à titre de contrôle. On introduit aussi 100
Figure imgf000033_0002
de cette pré-culture dans des tubes contenant 5 mL de milieu frais et une proportion volumique de 0,01 , 0,05 et 0,1 % d'ester carbonique cyclique de glycérol ECG-C7. On place les tubes à 28°C et on mesure l'évolution de la densité optique à 595 nm de la culture au cours du temps. Les résultats sont représentés en figure 4. On observe à partir de 0,1 % d'ECG-C7 une inhibition de la croissance de la levure Saccharomyces cerevisiae.
EXEMPLE 10 - Courbe de croissance de la levure Saccharomyces cerevisiae en milieu liquide à température ambiante (28°C) en présence d'ester du carbonate de glycérol et de l'acide nonanoïque (ECG-C9)
On procède de façon identique à l'exemple 9. On introduit 100 xL de pré-culture dans des tubes contenant 5 mL de milieu frais et une proportion volumique de 0,01, 0,05 et 0,1 % d'ester du carbonate de glycérol ECG-C9. On place les tubes à 28°C et on mesure l'évolution de la densité optique de la culture au cours du temps. Les résultats sont représentés en figure 5. On observe à partir de 0,1 % d'ECG-C9 une inhibition de la croissance de la levure Saccharomyces cerevisiae.
EXEMPLE 11 - Courbe de croissance de la levure Saccharomyces cerevisiae en milieu liquide à température ambiante (28°C) en présence d'ester du carbonate de glycérol et de l'acide undécylénique (ECG-C11:1)
On procède de façon identique à l'exemple 9. On introduit 100 xL de pré-culture dans des tubes contenant 5 mL de milieu frais et une proportion volumique de 0,01, 0,05 et 0,1 % d'ester du carbonate de glycérol ECG-C11:1. On place les tubes à 28°C et on mesure l'évolution de la densité optique de la culture au cours du temps. Les résultats sont représentés en figure 6. On observe une inhibition de la croissance de la levure Saccharomyces cerevisiae à partir de 0,05 % d'ECG-Cn:i.
EXEMPLE 12 - Courbe de croissance de la levure Saccharomyces cerevisiae en milieu liquide à température ambiante (28°C) en présence d'ester carbonique linéaire de glycérol et de l'acide nonanoïque (OECG-C9).
On procède de façon identique à l'exemple 9. On introduit 100 μL· de pré-culture dans des tubes contenant 5 mL de milieu frais et une proportion volumique de 0,01, 0,05 et 0,1 % d'OECG-C9. On place les tubes à 28°C et on mesure l'évolution de la densité optique de la culture au cours du temps. Les résultats sont représentés en figure 7. On observe à partir de 0,05 % d'OECG-C9 une inhibition de la croissance de la levure Saccharomyces cerevisiae.
EXEMPLE XIII - Courbe de croissance de la levure Saccharomyces cerevisiae en milieu liquide à température ambiante (28°C) en présence d'ester carbonique linéaire de glycérol et de l'acide heptanoïque (OECG-C7)
On procède de façon identique à l'exemple 9. On introduit 100 μL· de pré-culture dans des tubes contenant 5 mL de milieu frais et une proportion volumique de 0,01, 0,05 et 0,1 % d'OECG-C7. On place les tubes à 28°C et on mesure l'évolution de la densité optique de la culture au cours du temps. Les résultats sont représentés en figure 8. On observe à partir de 0,05 % d'OECG-C7 une inhibition de la croissance de la levure Saccharomyces cerevisiae.
Il va de soi que l'invention peut faire l'objet de nombreuses variantes de réalisation et applications. En particulier, une composition, un procédé de conservation de micro-organisme et un procédé de traitement de plantes dans lequel on utilise une telle composition sont sujets à une infinité de variantes tant dans la formulation de la composition que dans les modes de mise en œuvre des procédés.

Claims

REVENDICATIONS
1/ Procédé de conservation de micro-organismes à température ambiante, dans lequel :
- on prépare une composition, dite composition de conservation, comprenant les micro-organismes à conserver et un milieu de conservation desdits micro-organismes,
caractérisé en ce que :
o le milieu de conservation comprend au moins un composé, dit composé conservateur, choisi dans le groupe formé des composés pour lesquels il existe au moins une proportion inhibitrice prédéterminée du composé conservateur dans la composition de conservation qui est :
■ inhibitrice de la croissance desdits micro-organismes dans la composition de conservation à température ambiante, et ;
■ non létale pour lesdits micro-organismes, et en ce que ;
o ledit au moins un composé conservateur est dans la composition de conservation en proportion supérieure à ladite proportion inhibitrice prédéterminée et en proportion non létale pour lesdits micro-organismes ;
- et dans lequel on place la composition de conservation à température ambiante aux fins de conserver lesdits micro-organismes.
21 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on choisit au moins un composé conservateur dans le groupe formé de l'acide undécylénique, des esters de l'acide undécylénique et des esters carboniques de glycérol.
3/ Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'on choisit au moins un composé conservateur dans le groupe formé du carbonate de glycérol, des esters du carbonate de glycérol et des esters carboniques linéaires de glycérol.
4/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'on choisit au moins un composé conservateur dans le groupe formé : - des esters du carbonate de glycérol et d'un acide hydrocarboné à nombre impair d'atomes de carbone, et ;
- des esters carboniques linéaires de glycérol et d'au moins un acide hydrocarboné à nombre impair d'atomes de carbone.
5/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la proportion de composé conservateur dans la composition de conservation est choisie pour être une proportion volumique comprise entre 0,01 % et 100 %.
6/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le composé conservateur et sa proportion dans la composition de conservation sont choisis pour permettre une conservation de micro-organismes à température ambiante pendant une durée de conservation au moins égale à 30 jours.
Il Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le milieu de conservation est un milieu aqueux.
8/ Procédé de traitement de plantes dans lequel :
- on prépare une composition de conservation par un procédé selon l'une des revendications 1 à 7, puis :
- on conserve à température ambiante ladite composition de conservation, puis :
- on dilue ladite composition de façon que la proportion de composé conservateur dans la composition diluée soit inférieure à la proportion inhibitrice prédéterminée et permette la croissance des micro-organismes, et
- on applique ladite composition diluée sur des plantes.
91 Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'au moins un micro-organisme est choisi dans le groupe formé des micro-organismes aptes à stimuler de défenses naturelles de plantes.
10/ Procédé selon l'une des revendications 8 ou 9, caractérisé en ce qu'au moins un micro-organisme à conserver est choisi dans le groupe formé des bactéries à Gram positif.
11/ Procédé selon l'une des revendications 8 à 10, caractérisé en ce qu'au moins un micro-organisme à conserver est une bactérie de genre Streptomyces conforme à la souche déposée et enregistrée à la CNCM sous le numéro 1-4667.
12/ Composition comprenant :
- au moins un micro-organisme ;
- un milieu de conservation d'au moins un micro-organisme, et ;
- au moins un composé, dit composé conservateur, choisi dans le groupe formé des composés pour lesquels il existe une proportion inhibitrice prédéterminée du composé conservateur dans la composition de conservation qui est :
o inhibitrice de la croissance d'au moins un micro-organisme dans la composition de conservation à température ambiante, et ;
o non létale pour ledit au moins un micro-organisme,
le composé conservateur présentant dans la composition une proportion supérieure à la proportion inhibitrice prédéterminée,
ladite composition de conservation étant adaptée pour conserver ledit au moins un micro-organisme à température ambiante.
13/ Composition selon la revendication 12, caractérisée en ce qu'au moins un composé conservateur est choisi dans le groupe formé de l'acide undécylénique, des esters de l'acide undécylénique et des esters carboniques de glycérol.
14/ Composition selon l'une des revendications 12 ou 13, caractérisée en ce qu'au moins un micro-organisme est du genre Streptomyces et conforme à la souche déposée et enregistrée à la CNCM sous le numéro 1-4667.
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