WO2016092136A1 - Método de obtención de datos útiles para el cribado de pacientes con cáncer de pulmón - Google Patents

Método de obtención de datos útiles para el cribado de pacientes con cáncer de pulmón Download PDF

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WO2016092136A1
WO2016092136A1 PCT/ES2015/070887 ES2015070887W WO2016092136A1 WO 2016092136 A1 WO2016092136 A1 WO 2016092136A1 ES 2015070887 W ES2015070887 W ES 2015070887W WO 2016092136 A1 WO2016092136 A1 WO 2016092136A1
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cytokeratin
lung cancer
cancer
group
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PCT/ES2015/070887
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French (fr)
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Bernabé JURADO GÁMEZ
Antonio RODRÍGUEZ ARIZA
Laura María LÓPEZ SÁNCHEZ
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Universidad de Cordoba
Servicio Andaluz de Salud
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Universidad de Cordoba
Servicio Andaluz de Salud
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Definitions

  • the present invention is within the field of Molecular Biology and Medicine. Specifically, it refers to a procedure for detecting and identifying proteins in exhaled air as a screening tool for lung cancer.
  • BACKGROUND OF THE INVENTION Lung cancer is one of the leading causes of death in industrialized countries, occupying second place only behind cardiovascular diseases. Despite its high incidence and mortality, it has a low prevalence because most cases are detected in late stages, so it would be very important to have screening tests capable of detecting the disease as soon as possible. Tobacco is the main risk factor, being the cause of 85-90% of all cases.
  • Screening is defined for the application of selection procedures (questionnaire, physical examination, test) to populations of apparently "healthy" individuals in order to identify, in the latency phase, those who may be ill or who present an increased risk of suffer from a certain disease because they have a certain risk factor. That is, it is about differentiating apparently healthy people who are likely to suffer from a disease or have a risk factor from apparently healthy people who probably do not suffer from the disease or do not present the risk factor. Screening is not a definitive diagnostic test.
  • the condensation analysis of exhaled breath air is a non-invasive test in which exhaled air enters a refrigeration system to condense.
  • This condensed air contains proteins, which may constitute markers of respiratory diseases, including lung cancer (Conrad et al., 2008. Gen. Intern. Med. 23 Suppl. 1, 78-84. Doi: 10.1007 / s1 1606-007 -0411-1).
  • a first aspect of the invention relates to a method of obtaining useful data for the classification, diagnosis and monitoring of cancer, hereinafter the first method of the invention, comprising: a) obtaining a biological sample isolated from the individual, b ) determine the total amount and / or concentration of proteins in the sample (a).
  • the method further comprises: c) include the individual of step (a) in the group of individuals with cancer if they have a number of different proteins greater than 6, preferably greater than 9, and more preferably greater than 12 different proteins.
  • the method further comprises: d) further determining the concentration of hemoglobin (beta subunit), cytokeratin 6A, cytokeratin 6B, cytokeratin 6C, cytokeratin 10 and / or histone 2A, in the biological sample of step (a).
  • the concentrations of hemoglobin (beta subunit), cytokeratin 6A, cytokeratin 6B, cytokeratin 6C, cytokeratin 10 and histone 2A are determined simultaneously.
  • the first method of the invention further comprises including the individual from group (a) in the group of individuals with cancer if they have a hemoglobin concentration greater than or equal to 0.07 ⁇ g / ml, preferably greater than or equal to 0.08 ⁇ g / ml, more preferably greater than or equal to 0.09 ⁇ g / ml, and even more preferably greater than or equal to 0.1 ⁇ g / ml.
  • the first method of the invention further comprises including the individual from group (a) in the group of individuals with cancer if he or she has a concentration of cytokeratin 6A greater than or equal to 0.35 ⁇ g / ml, preferably greater than or equal to at 0.37 ⁇ g / ml, more preferably greater than or equal to 0.4 ⁇ g / ml.
  • the first method of the invention further comprises including the individual from group (a) in the group of individuals with cancer if he or she has a concentration of cytokeratin 6B greater than or equal to 0.25 ⁇ g / ml, preferably greater than or equal to at 0.27 ⁇ g / ml, more preferably greater than or equal to 0.3 ⁇ g / ml.
  • the first method of the invention further comprises including the individual of group (a) in the group of individuals with cancer if it has a concentration of 6C cytokeratin greater than or equal to 0.15 ⁇ g / ml, preferably greater than or equal to at 0.17 ⁇ g / ml, more preferably greater than or equal to 0.2 ⁇ g / ml.
  • the first method of the invention further comprises including the individual from group (a) in the group of individuals with cancer if they have a 2A histone concentration greater than or equal to 0.15 ⁇ g / ml, preferably greater than or equal to 0.17 ⁇ g / ml, more preferably greater than or equal to 0.2 ⁇ g / ml.
  • the biological sample is a sample of exhaled air or brocoalveolar lavage, preferably it is exhaled air.
  • the cancer is lung cancer.
  • the determination of the proteins in the sample (a) is performed by liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC-MS / MS).
  • the invention in a second aspect relates to a method of classification of patients with lung cancer, hereafter referred to as the second method of the invention, comprising the steps steps (a) - (b) according to the first method of the invention , and also comprises determining the concentration of cytokeratin 10. In a preferred embodiment, it also includes including the individual of group (a) in the group of individuals with adenocarcinoma if it has a concentration of cytokeratin 10 less than 1.5 ⁇ g / ml, preferably lower at 1.2 ⁇ g / ml, and more preferably less than 1 ⁇ g / ml.
  • the biological sample is a sample of exhaled air or brocoalveolar lavage, preferably it is exhaled air.
  • the cancer is lung cancer.
  • the determination of the proteins in the sample (a) is performed by liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC-MS / MS).
  • a third aspect of the invention relates to a method for monitoring the progression of cancer and / or tumor growth, hereafter referred to as the third method of the invention, comprising steps (a) - (b) according to the first method. of the invention, and further comprises determining the variations of the isoforms of cytokeratin 6 in two stages, a time t1 and a time t2.
  • t1 is 0 (initial moment)
  • t2 goes from 1 day onwards.
  • t2 is 365 days.
  • the third method of the invention further comprises assigning the individual of step (a) to the group of individuals with a larger tumor size if the amount of cytokeratin 6 in t1 is less than in t2 .
  • the biological sample is a sample of exhaled air or brocoalveolar lavage, preferably it is exhaled air. More preferably, the cancer is lung cancer. Even more preferably, the determination of the proteins in the sample (a) is performed by liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC-MS / MS).
  • kit or device hereafter kit or device of the invention, comprising the necessary elements will carry out the method according to any of the methods of the invention.
  • the kit or device of the invention comprises the primers and probes obtained from the sequences of the genes of the invention, as also found in Table 1.
  • the kit may contain the probe (s) and primers. useful for quantifying the expression of the HBB, KRT6A, KRT6B, KRT6C, KRT10, and HIST2H2AC genes, of their corresponding proteins, or any combination thereof.
  • a fifth aspect of the invention relates to the use of the kit or device of the invention, for the classification, diagnosis and monitoring of cancer, and more preferably of lung cancer.
  • a sixth aspect of the invention relates to a computer-readable storage medium comprising program instructions capable of having a computer perform the steps of any of the methods of the invention.
  • the readable storage medium comprises at least one sequence comprised in any of the probes of the invention.
  • a seventh aspect of the invention relates to a transmissible signal comprising program instructions capable of having a computer perform the steps of any of the methods of the invention.
  • An eighth aspect of the invention relates to a computer program stored in the medium readable by a computer of the invention, comprising software code adapted to carry out the steps of any of the methods of the invention.
  • FIG. 1 In the proteomic analysis, a total of 384 proteins were identified in the four experimental groups. The number of peptides identified in each of them is shown from red (minor) to green (major).
  • Figure 2 The average number of proteins identified per patient is significantly higher in patients with lung cancer and the majority of proteins were identified in the lung cancer group.
  • Figure 5 The detected amount of several cytokeratin 6 isoforms was significantly higher in samples from patients with lung cancer.
  • Figure 6. There is a significant correlation between the number of identified peptides corresponding to some cytokeratin isoforms, and the size of the tumor lesion.
  • Figure 7 A significantly higher number of cytokeratin 10 peptides is detected in the case of epidermoid-like tumors, compared to adenocarcinomas.
  • the authors of the present invention have analyzed proteins in exhaled air samples from patients with lung cancer compared to other patients. healthy and with different risk factors. The results indicate that the proteins present in exhaled air can be used as markers of a lung cancer screening system.
  • a first aspect of the invention relates to a method of obtaining data useful for classification, diagnosis and monitoring of cancer, hereinafter the first method of the invention, comprising: a) obtaining a biological sample isolated from the individual, b) determining the total amount and / or concentration of proteins in the sample (a).
  • the method further comprises: c) including the individual of step (a) in the group of individuals with cancer if they have a number of different proteins greater than 6, preferably greater than 9, and more preferably greater than 12 different proteins.
  • the method further comprises: d) further determining the concentration of hemoglobin (beta subunit), cytokeratin 6A, cytokeratin 6B, cytokeratin 6C, cytokeratin 10 and / or histone 2A, in the biological sample of step (a). More preferably, the concentrations of hemoglobin (beta subunit), cytokeratin 6A, cytokeratin 6B, cytokeratin 6C, cytokeratin 10 and histone 2A are determined simultaneously.
  • the first method of the invention further comprises including the individual from group (a) in the group of individuals with cancer if they have a hemoglobin concentration greater than or equal to 0.07 ⁇ g / ml, preferably greater than or equal to 0.08 ⁇ g / ml, more preferably greater than or equal to 0.09 ⁇ g / ml, and even more preferably greater than or equal to 0, ⁇ g / ml.
  • the first method of the invention further comprises including the individual from group (a) in the group of individuals with cancer if they have a 6A cytokeratin concentration greater than or equal to 0.35 ⁇ g / ml, preferably greater than or equal to 0.37 ⁇ g / ml, more preferably greater than or equal to 0.4 ⁇ g / ml.
  • the first method of the invention further comprises including the individual from group (a) in the group of individuals with cancer if he or she has a concentration of cytokeratin 6B greater than or equal to 0.25 ⁇ g / ml, preferably greater than or equal to at 0.27 ⁇ g / ml, more preferably greater than or equal to 0.3 ⁇ g / ml.
  • the first method of the invention further comprises including the individual of group (a) in the group of individuals with cancer if it has a concentration of 6C cytokeratin greater than or equal to 0.15 ⁇ g / ml, preferably greater than or equal to at 0.17 ⁇ g / ml, more preferably greater than or equal to 0.2 ⁇ g / ml.
  • the first method of the invention further comprises including the individual from group (a) in the group of individuals with cancer if they have a histone 2A concentration greater than or equal to 0.15 ⁇ g / ml, preferably greater than or equal to at 0.17 ⁇ g / ml, more preferably greater than or equal to 0.2 ⁇ g / ml.
  • the biological sample is a sample of exhaled air or brocoalveolar lavage, preferably it is exhaled air. More preferably, the cancer is lung cancer. Even more preferably, the determination of the proteins in the sample (a) is performed by liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC-MS / MS).
  • the levels of gene expression will give a certain gene expression profile.
  • level of expression also called “amount of gene product” or “amount of expression product” refers to the biochemical material, either RNA or protein, resulting from the expression of a gene. Sometimes a measure of the amount of gene product is used to infer how active a gene is.
  • Gene expression profile means the gene profile obtained after quantification of mRNA and / or protein produced by the genes of interest or biomarkers, that is, by the HBB, KRT6A, KRT6B, KRT6C, KRT10 and HIST2H2AC genes, in an isolated biological sample.
  • the expression profile of genes can be performed by determining the level of mRNA derived from its transcription, after extracting the total RNA present in the isolated biological sample, which can be performed by protocols known in the state of the art.
  • the measurement of the quantity or concentration of expression product of these genes preferably semi-quantitatively or quantitatively, can be carried out directly or indirectly.
  • Direct measurement refers to the measure of the quantity or concentration of the gene expression product, based on a signal that is obtained directly from the transcripts of said genes, or from proteins, and that is directly correlated with the number of RNA molecules or proteins produced by genes.
  • Said signal to which we can also refer to as an intensity signal can be obtained, for example, by measuring an intensity value of a chemical or physical property of said products.
  • the indirect measurement includes the measurement obtained from a secondary component or a biological measurement system (for example the measurement of cellular responses, ligands, "tag” or enzymatic reaction products).
  • quantity refers to, but is not limited to, the absolute or relative quantity of gene expression products or the amount of antibodies, as well as any other value or parameter related to them or that may be derived from them.
  • Said values or parameters comprise signal intensity values obtained from any of the physical or chemical properties of said expression products obtained by direct measurement. Additionally, said values or parameters include all those obtained by indirect measurement, for example, any of the measurement systems described elsewhere in this document.
  • Hb hemoglobin
  • Hb refers to either normal HbA or Hb, which is a blood heteroprotein, of molecular weight 64,000 Daltons (64 kD), of red color, which It carries oxygen from the respiratory organs to tissues, in vertebrates and some invertebrates, and which is formed by four polypeptide chains (globins) to each of which a heme group is attached, whose iron atom is able to bind in a way reversible to oxygen; as with any structural variant of Hb or chemically modified derivatives thereof.
  • hemoglobin or chemically modified derivatives thereof are, although not limited to, glycosylated Hb or HbA1, including all its variants, such as, but not limited to, HbA1 a, HbA1 or HbA1c; Fetal HbF or Hb, HbLAIc, Hb P3, Hb P4, Hb A0, Hb X, carboxyhemoglobin, carbaminohemoglobin, methemoglobin, oxyhemoglobin, Hb La Roche-sur-Yon, Hb Baylor, HbS, HbE, HbC, HbD, Hb D-Punjab, Hb O-Arab, Hb G-Philadelphia, Hb Hasharon, Hb Korle-Bu, Hb Lepore, Hb M or HbA2.
  • the beta subunit of hemoglobin is detected.
  • the alpha (HBA) and beta (HBB) subunit genes determine the structure of the 2 types of polypeptide chains in adult hemoglobin, Hb A.
  • the adult normal hemoglobin tetramer consists of two alpha and two beta chains. .
  • Mutant beta globin causes sickle cell anemia.
  • the absence of the beta chain causes beta-zero-thalassemia.
  • Reduced amounts of detectable beta globin cause beta-plus-thalassemia.
  • the order of the genes in the beta-globin group is 5'-epsilon-gamma-G-gamma-A-delta-beta-3 '.
  • cytokeratin refers to the fibrous proteins that form the intermediate filaments of the intracellular cytoskeleton in particular epithelial cells (including mucous membranes and glands), as well as in the nails, hair and feathers of animals. Cytokeratin monomers are linked to each other by phylagrin molecules. Its main function is the organization of the internal three-dimensional structure of the cell, they form a rigid barrier which prevents the entry of microorganisms. That same barrier fulfills the vital function of retaining water within the cells. They also participate in some intercellular junctions (desmosomes). Irregularities in the expression of cytokeratin proteins have been described as the root of atypical conditions, such as eczema, ichthyosis, psoriasis and certain types of metastatic cancer.
  • cytokeratins 6A, 6B and 6C are encoded by the genes KRT6A, KRT6B and KRT6C, respectively, which are part of the family of keratin genes.
  • Cytokeratins 6A, 6B and 6C are type II cytokeratins, basic or neutral proteins arranged in pairs of heterotypic keratin chains coexpressed during differentiation of simple and stratified epithelial tissues.
  • Six type II cytokeratin (KRT6) have been identified; The multiplicity of genes is attributed successive gene duplication events.
  • the genes are expressed together with members of the KRT16 and / or KRT17 family in the filiform papillae of the tongue, the stratified epithelial lining of the oral mucosa and esophagus, the outer sheath of the hair follicle root, and the glandular epithelium . Mutations in these genes have been associated with congenital pachionychia.
  • the peptides of the C-terminal region of the protein have antimicrobial activity against pathogens.
  • bacterial Type II cytokeratins are grouped in a region of chromosome 12q12-q13.
  • the cytokeratin 10 gene encodes a type I (acid) member of the cytokeratin family, which belong to the intermediate filament protein superfamily (I F). Keratins are heteropolymeric structural proteins that form the intermediate filaments. These filaments, together with actin microfilaments and microtubules, make up the cytoskeleton of epithelial cells. Mutations in this gene are associated with epidermolytic hyperkeratosis. This gene is found within a group of members of the keratin family on chromosome 17q21.
  • histone refers to basic proteins, of low molecular mass, very evolutionarily conserved among eukaryotes and in some prokaryotes. They form chromatin together with DNA, based on units known as nucleosomes. Chromatin solves the problem of restriction of DNA and nucleus growth, chromatin is made up of DNA and proteins, the main forming protein is histones. They are the most frequent cellular proteins and exhibit a high content, about 20%, of lysine and arginine (basic amino acids). With the positive charges of the side chains of these residues, histones (which are extremely basic) bind to phosphate groups in DNA (negatively charged); For this, the sequence of bases within the DNA is not relevant.
  • histones are modified by methylations, acetylations, phosphorylations or ADP-ribosylations.
  • the latter are also called nucleosomal histones and form an octamer with two histones of each; a strand of DNA is wrapped around this core twice.
  • This DNA-histone complex is called a nucleosome and is the primary component of the chromosome.
  • Histones can also be modified by methylation, ribosylation or phosphorylation; It is not yet known in detail what are the precise mechanisms with which these modifications influence the genetic regulation.
  • Table 1 Hemoglobin (beta subunit), cytokeratins 6A, 6B, 6C, 10 and histone 2A.
  • HIST2H2AC histone 2 H2ac 8338 SEQ ID N0: 13 SEQ ID N0: 14
  • the HBB, KRT6A, KRT6B, KRT6C, KRT10, and HIST2H2AC genes are also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence, which constitutes the coding sequence of the proteins collected respectively in SEQ IDs collected in the Table 1, and which would comprise various variants from: a) nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID listed in Table 1, b) nucleic acid molecules whose hybrid complementary chain with the sequence polynucleotide of a), c) nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code, d) nucleic acid molecules that encode a polypeptide comprising the amino acid sequence with an identity of at least 80%, 90%, 95%, 98% or 99% with the SEQ IDs listed in Table 1, respectively, and in which the polypeptide encoded by di
  • the nucleic acids have the activity
  • the methods for quantifying the total amount and / or concentration of proteins in the sample (a) are those known in the state of the art including, for example, but not limited to, ES-MS (Electrospray mass spectrometry) , IEF (Isoelectric focusing), electrophoresis or HPLC (High-Performance Liquid Chromatography), liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC-MS / MS), two-dimensional electrophoresis, fluorescence, MALDI-TOF-MS ionization technique, stable isotope labeling, ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay).
  • the quantification of steps (b) and (d) of the method of the invention is performed by LC-MS / MS.
  • the detection and quantification of the proteins in the sample (a) can be performed by any procedure known in the state of the art. For example, but not limited to, using conventional electrophoresis, SDS-PAGE, two-dimensional electrophoresis, fluorescence, arrays, mass spectrometry (MS), chromatography, liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC-MS / MS).
  • MS mass spectrometry
  • LC-MS / MS liquid chromatography coupled to mass spectrometry
  • Steps (b), (c) and / or (d) of the method described above can be fully or partially automated, for example, by means of a robotic sensor device for detecting the amount in steps (b) and ( d), and / or the computerized comparison in step (c).
  • an "isolated biological sample” includes, but is not limited to, cells, tissues and / or biological fluids of an organism, obtained by any method known to a person skilled in the art.
  • the isolated biological sample of an individual from step (a) is exhaled air.
  • the term “individual” is not intended to be limiting in any aspect, and may be of any age, sex and physical condition.
  • comparison refers to, but is not limited to, the comparison of the result of the amplification of the biological sample to be analyzed, also called the biological problem sample, with an amplification of one or more Desirable reference samples.
  • the reference sample can be analyzed, for example, simultaneously or consecutively, together with the problem biological sample.
  • the comparison described in section (e) of the method of the present invention can be performed manually or assisted by a computer.
  • the invention in a second aspect relates to a method of classification of patients with lung cancer, hereafter referred to as the second method of the invention, comprising the steps steps (a) - (b) according to the first method of the invention, and further comprises determining the concentration of cytokeratin 10.
  • it further comprises including the individual of group (a) in the group of individuals with adenocarcinoma if it has a cytokeratin concentration of less than 1.5 ⁇ g / ml, preferably less than 1.2 ⁇ g / ml, and more preferably less than 1 ⁇ g / ml.
  • the biological sample is a sample of exhaled air or brocoalveolar lavage, preferably it is exhaled air.
  • the cancer is lung cancer.
  • the determination of the proteins in the sample (a) is performed by liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC-MS / MS).
  • a third aspect of the invention relates to a method for monitoring the progression of cancer and / or tumor growth, hereafter referred to as the third method of the invention, comprising steps (a) - (b) according to the first method. of the invention, and further comprises determining the variations of the isoforms of cytokeratin 6 in two stages, a time t1 and a time t2.
  • t1 is 0 (initial moment)
  • t2 goes from 1 day onwards.
  • t2 is 182 days, more preferably t2 is 273 days and even more preferably 365 days.
  • the third method of the invention further comprises assigning the individual of step (a) to the group of individuals with a larger tumor size, if the amount of cytokeratin 6 in t1 is less than in t2.
  • the biological sample is a sample of exhaled air or brocoalveolar lavage, preferably it is exhaled air.
  • the cancer is lung cancer.
  • the determination of the proteins in the sample (a) is performed by liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC-MS / MS).
  • kit or device hereafter kit or device of the invention, comprising the necessary elements will carry out the method according to any of the methods of the invention.
  • the kit or device comprises: a device for collecting, storing and / or transporting gas samples, for example, but not limited to, such as that described in patent EP99948568.3, preferably adapted for exhaled air, containing the sensors necessary for quantitative and qualitative detection of proteins and / or that can be connected to a computer that contains the program instructions to perform the steps of the method of the invention.
  • the kit or device of the invention comprises the primers and probes obtained from the sequences of the genes of the invention, as also found in Table 1.
  • the kit may contain the probe (s) and primers.
  • kits of the invention may include positive and / or negative controls.
  • the kit may also contain, without any limitation, buffers, protein extraction solutions, agents to prevent contamination, inhibitors of protein degradation, etc.
  • the kit can include all the supports and containers necessary for commissioning and optimization.
  • the kit further comprises instructions for carrying out the methods of the invention.
  • kits or device of the invention for the classification, diagnosis and monitoring of cancer from a biological sample.
  • the kit is based on the power of diagnosis, classification and monitoring of the method of the present invention.
  • the reference indicator value for each particular gene / protein can be determined before carrying out the process of the present invention.
  • they can be provided with the reference indicator value for diagnosis, classification and monitoring.
  • the expression of each gene and / or number and / or concentration of proteins can be calculated, that is, with respect to the control samples exemplified above.
  • the control can thus also be included in the kit.
  • a fifth aspect of the invention relates to the use of the kit or device of the invention, for the classification, diagnosis and monitoring of cancer, and more preferably of lung cancer.
  • a sixth aspect of the invention relates to a computer-readable storage medium comprising program instructions capable of having a computer perform the steps of any of the methods of the invention.
  • the readable storage medium comprises at least one sequence comprised in any of the probes of the invention.
  • the readable storage medium comprising oligonucleotides or single channel microarrays designed from at least one known sequence or an mRNA comprising any of the probes of the invention.
  • oligonucleotide sequences can be constructed on the surface of a chip by sequential elongation of a growing chain with a single nucleotide using photolithography.
  • the oligonucleotides are anchored at the 3 'end by a method of selective activation of nucleotides, protected by a photolabile reagent, by the selective incidence of light through a photomask.
  • the photomask can be physical or virtual. Synthesis in situ on a solid support (for example, glass) could be done using ink-jet technology, which requires longer probes.
  • the supports could be, but not limited to, filters or membranes of NC or nylon (charged), silicon, or glass slides for microscopes covered with aminosilanes, polylysine, aldehydes or epoxy.
  • the probe is each of the chip samples.
  • the target is the sample to be analyzed: messenger RNA, total RNA, a PCR fragment, etc.
  • a seventh aspect of the invention relates to a transmissible signal comprising program instructions capable of having a computer perform the steps of any of the methods of the invention.
  • An eighth aspect of the invention relates to a computer program stored in the medium readable by a computer of the invention, comprising software code adapted to carry out the steps of any of the methods of the invention.
  • a nucleic acid or polynucleotide sequence may comprise the five bases that appear biologically (adenine, guanine, thymine, cytosine and uracil) and / or bases other than the five that appear biologically. These bases can serve different purposes, for example, to stabilize or destabilize hybridization; to stimulate or inhibit probe degradation; or as junction points for detectable debris or screening debris.
  • a polynucleotide of the invention may contain one or more modified, non-standard, derivatized base moieties, including, but not limited to, N 6 -methyl-adenine, N 6 -terc-butyl-benzyl-adenine, imidazole, Substituted imidazoles, 5-fluorouracil, 5-bromouracil, 5-chlorouracil, 5- iodouracil, hypoxanthine, xanthine, 4-acetylcytosine, 5- (carboxyhydroxymethyl) uracil, 5- carboxymethylaminomethyl-2-thiouridine, 5-carboxymethylaminoomethyl, beta-diylocylocylmethylomethyl, beta-diyloxymethylomethyl, beta-diyloxymethylomethyl, beta-dihydroxymethyl D-galactosylkeosine, inosine, N6-isopentenyladenine, 1- methylguanine, 1-methyli
  • nucleic acid or polynucleotide sequence may comprise one or more modified sugar moieties including, but not limited to, arabinose, 2-fluoroarabinous, xylulose, and a hexose.
  • polynucleotide and “nucleic acid” are used interchangeably herein, referring to polymeric forms of nucleotides of any length, both ribonucleotides (RNA or RNA) and deoxyribonucleotides (DNA or DNA).
  • amino acid sequence referring to polymeric forms of amino acids of any length, which may be coding or non-coding, Chemically or biochemically modified.
  • Control Group 49 healthy controls without risk factor
  • FR Group 49 healthy controls with risk factor (smoking)
  • COPD Group 46 diagnosed with chronic obstructive pulmonary disease
  • CP Group chronic obstructive pulmonary disease
  • EBC samples were obtained using EcoScreen II equipment (FILT GmbH, Germany). The patients breathed through the device normally for 15 minutes, and the sample corresponding to the distal (lower) airways was collected for study, being frozen at -80 ° C until its corresponding analysis.
  • the samples were analyzed by liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC-MS / MS) at the Proteomics Service of the University of Valencia.
  • the samples (400 ⁇ ) were dried by centrifugation and evaporation (SpeedVac, Thermo Scientific) and dissolved in 20 ⁇ of ABC buffer (anode buffer container, Applied Biosystems). Cysteine residues were reduced by incubation with 2 mM Dithiothreitol (DTT) at 60 ° C for 20 min. The resulting sulfhydryl groups were blocked by alkylation with 5 mM iodoacetamide (AMI), in a 30 min incubation at room temperature. The excess AMI was neutralized with an incubation with 10 mM DTT, for 30 min at room temperature.
  • DTT Dithiothreitol
  • AMI iodoacetamide
  • the sample was digested with 250 ng (100 ng / ⁇ ) of modified trypsin with quality for sequencing (Promega) in ABC buffer, overnight at 37 ° C. Digestion was stopped with trifluoroacetic acid (TFA) at 0.1% final concentration. The resulting peptide mixture was concentrated by centrifugation and vacuum (SpeedVac, Thermo Scientific) to a final volume of 6 ⁇ .
  • TFA trifluoroacetic acid
  • the peptides were analyzed on a nanoESI qQTOF mass spectrometer (6600TripleTOF, ABSCIEX).
  • the triple TOF was handled in the information-dependent acquisition mode, in which a TOF-MS sweep of 0.26 s and 350-1250 m / z was performed, followed by another sweep of 0.05 s and 100-1600 m / z of the 50 product ions charged (2-5) more intense.
  • the sensitivity of the system was monitored with 2 fmol of a standard mixture of 6 proteins (LC Packings).
  • the ProteinPilot v4.6 search engine (ABSciex) with the default parameters was used to generate the list of peaks directly from the wiff files of the 6600TripleTOF equipment.
  • the Paragon algorithm was used to perform the search in the Expasy protein database (616203 sequences, 181334896 residues) with the following parameters: trypsin specificity, Cys-alkylation, taxonomic restriction to Human and search effort set to through.

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Abstract

Método de obtención de datos útiles para la clasificación, diagnóstico y seguimiento del cáncer de pulmón, kit o dispositivo y sus usos.

Description

MÉTODO DE OBTENCIÓN DE DATOS ÚTILES PARA EL CRIBADO DE
PACIENTES CON CÁNCER DE PULMÓN.
CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se encuentra dentro del campo de la Biología Molecular y la Medicina. Específicamente, se refiere a un procedimiento de detección e identificación de proteínas en el aire exhalado como herramienta de cribado del cáncer de pulmón.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El cáncer de pulmón es una de las principales causas de muerte en los países industrializados, ocupando el segundo lugar solamente por detrás de las enfermedades cardiovasculares. A pesar de su alta incidencia y mortalidad, presenta una baja prevalencia debido a que la mayoría de los casos son detectados en estadios tardíos, por lo que sería muy importante disponer de pruebas de cribado capaces de detectar la enfermedad lo antes posible. El tabaco es el principal factor de riesgo, siendo el causante del 85-90% de todos los casos.
Se define cribado a la aplicación de procedimientos de selección (cuestionario, examen físico, test) a poblaciones de individuos aparentemente «sanos» con objeto de identificar, en la fase de latencia, a aquellos que pueden estar enfermos o que presentan un riesgo incrementado de padecer una determinada enfermedad porque presentan un determinado factor de riesgo. Es decir, se trata de diferenciar a las personas aparentemente sanas que probablemente padecen una enfermedad o presentan un factor de riesgo de las aparentemente sanas que probablemente no padecen la enfermedad o no presentan el factor de riesgo. El cribado no es una prueba diagnóstica definitiva.
Se han propuesto diversas pruebas para el cribado de cáncer de pulmón. En función de su frecuencia de uso, las pruebas más usadas en el cribado de cáncer de pulmón son la radiografía de tórax, la tomografía computarizada y la citología de esputo (Detterbeck et al., 2013. American College of Chest Physicians evidence-based clinical practice guidelines 143(5 Suppl.):e78S-92S). Las dos primeras pruebas están basadas en imagen, dependen de la presencia de una lesión neoplásica ya detectable y además suponen la exposición a una fuente de radiación, con el potencial efecto nocivo asociado. Por otro lado, la citología de esputo es un método de diagnóstico sencillo y no invasivo, pero de resultados muy variables (D'Urso et al., 2013. J. Cell Physiol. 228(5), 945-951).
El análisis de condensación del aire exhalado en la respiración es una prueba no invasiva en la que el aire exhalado entra en un sistema de refrigeración para condensarse. Este aire condensado contiene proteínas, que pueden constituir marcadores de patologías respiratorias, incluyendo el cáncer de pulmón (Conrad et al., 2008. Gen. Intern. Med. 23 Suppl. 1 , 78-84. doi: 10.1007/s1 1606-007-0411-1).
Hay muy pocos estudios proteómicos en el condensado del aire exhalado, y en los existentes se han conseguido identificar un número relativamente bajo de proteínas (Gianazza et al., 2004. Am. J. Med. 117(1), 51-54; Fumagalli et al., 2008. Int. J. Mol. Sci. 13(11), 13894-13910; Kurova et al., 2009. Clin. Chem. Lab. Med. 47(6), 706-712; Bloemen et al., 2009. Proteomics Clin. Appl. 3(4), 498-504; Chang et al., 2010. Eur. Respir. J. 35(5), 1182-1215; Bloemen et al., 2010. Biomarkers 15(7), 583-93). Solamente en dos estudios más recientes (Fumagalli et al., 2012. Int. J. Mol. Sci. 13(11), 13894-13910.; Bredberg eí al., 2012. Clin. Chem. 58(2), 431-440) se han conseguido identificar 44 y 124 proteínas diferentes, respectivamente. Sin embargo, ambos estudios analizaron "pools" de muestras, y no pacientes individuales. La gran mayoría de los estudios realizados hasta la fecha están relacionados con asma o con otras enfermedades pulmonares, como la enfermedad pulmonar crónica obstructiva (EPOC), y únicamente el estudio de Chang analizó muestras de pacientes de cáncer de pulmón consiguiendo identificar sólo 20 proteínas distintas en todas las muestras analizadas (Chang et ai, 2010. Eur. Respir. J. 35(5), 1182-1215).
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Un primer aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de datos útiles para la clasificación, diagnóstico y seguimiento del cáncer, de ahora en adelante primer método de la invención, que comprende: a) obtener una muestra biológica aislada del individuo, b) determinar la cantidad total y/o concentración de proteínas en la muestra (a).
En una realización preferida de este aspecto de la invención, el método además comprende: c) incluir al individuo del paso (a) en el grupo de individuos con cáncer si presenta un número de proteínas distintas mayor de 6, preferiblemente mayor de 9, y más preferiblemente mayor de 12 proteínas distintas.
En otra realización preferida, el método además comprende: d) determinar adicionalmente la concentración de hemoglobina (subunidad beta), citoqueratina 6A, citoqueratina 6B, citoqueratina 6C, citoqueratina 10 y/o histona 2A, en la muestra biológica del paso (a).
Más preferiblemente, las concentraciones de hemoglobina (subunidad beta), citoqueratina 6A, citoqueratina 6B, citoqueratina 6C, citoqueratina 10 e histona 2A se determinan simultáneamente.
En otra realización preferida, el primer método de la invención además comprende incluir al individuo del grupo (a) en el grupo de individuos con cáncer si presenta una concentración de hemoglobina mayor o igual a 0,07 μg/ml, preferiblemente mayor o igual a 0,08 μg/ml, más preferiblemente mayor o igual a 0,09 μg/ml, y aún más preferiblemente mayor o igual a 0, 1 μg/ml.
En otra realización preferida, el primer método de la invención además comprende incluir al individuo del grupo (a) en el grupo de individuos con cáncer si presenta una concentración de citoqueratina 6A mayor o igual a 0,35 μg/ml, preferiblemente mayor o igual a 0,37 μg/ml, más preferiblemente mayor o igual a 0,4 μg/ml. En otra realización preferida, el primer método de la invención además comprende incluir al individuo del grupo (a) en el grupo de individuos con cáncer si presenta una concentración de citoqueratina 6B mayor o igual a 0,25 μg/ml, preferiblemente mayor o igual a 0,27 μg/ml, más preferiblemente mayor o igual a 0,3 μg/ml.
En otra realización preferida, el primer método de la invención además comprende incluir al individuo del grupo (a) en el grupo de individuos con cáncer si presenta una concentración de citoqueratina 6C mayor o igual a 0, 15 μg/ml, preferiblemente mayor o igual a 0, 17 μg/ml, más preferiblemente mayor o igual a 0,2 μg/ml.
En otra realización preferida, el primer método de la invención además comprende incluir al individuo del grupo (a) en el grupo de individuos con cáncer si presenta una concentración de histona 2A mayor o igual a 0, 15 μg/ml, preferiblemente mayor o igual a 0, 17 μg/ml, más preferiblemente mayor o igual a 0,2 μg/ml.
En otra realización más preferida de este aspecto de la invención, la muestra biológica es una muestra de aire exhalado o lavado brocoalveolar, preferiblemente es aire exhalado. Más preferiblemente, el cáncer es cáncer de pulmón. Aún más preferiblemente, la determinación de las proteínas de la muestra (a) se realiza por cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas (LC-MS/MS).
En un segundo aspecto la invención se refiere a un método de clasificación de pacientes con cáncer de pulmón, de ahora en adelante segundo método de la invención, que comprende los pasos los pasos (a)-(b) según el primer método de la invención, y además comprende determinar la concentración de citoqueratina 10. En una realización preferida además comprende incluir al individuo del grupo (a) en el grupo de individuos con adenocarcinoma si presenta una concentración de citoqueratina 10 menor a 1 ,5 μg/ml, preferiblemente menor a 1 ,2 μg/ml, y más preferiblemente menor a 1 μg/ml.
En otra realización más preferida de este aspecto de la invención, la muestra biológica es una muestra de aire exhalado o lavado brocoalveolar, preferiblemente es aire exhalado. Más preferiblemente, el cáncer es cáncer de pulmón. Aún más preferiblemente, la determinación de las proteínas de la muestra (a) se realiza por cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas (LC-MS/MS).
Un tercer aspecto de la invención se refiere método para el seguimiento de la progresión del cáncer y/o el crecimiento del tumor, de ahora en adelante tercer método de la invención, que comprende los pasos (a)-(b) según el primer método de la invención, y además comprende determinar las variaciones de las isoformas de la citoqueratina 6 en dos tiempos, un tiempo t1 y un tiempo t2. En una realización preferida de este aspecto de la invención, t1 es 0 (momento inicial), y t2 va desde 1 día en adelante. En otra realización preferida t2 es 365 días.
En otra realización más preferida de este aspecto de la invención, el tercer método de la invención además comprende asignar al individuo del paso (a) al grupo de individuos con un mayor tamaño tumoral si la cantidad de citoqueratina 6 en t1 es menor que en t2. En otra realización más preferida de este aspecto de la invención, la muestra biológica es una muestra de aire exhalado o lavado brocoalveolar, preferiblemente es aire exhalado. Más preferiblemente, el cáncer es cáncer de pulmón. Aún más preferiblemente, la determinación de las proteínas de la muestra (a) se realiza por cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas (LC-MS/MS).
Un cuarto aspecto de la invención se refiere a kit o dispositivo, de ahora en adelante kit o dispositivo de la invención, que comprende los elementos necesarios llevara a cabo el método según cualquiera de los métodos de la invención.
En otra realización preferida, el kit o dispositivo de la invención comprende los cebadores y sondas obtenidos de las secuencias de los genes de la invención, tal y como también se encuentran en la tabla 1. El kit puede contener la/s sonda/s y cebadores útiles para cuantificar la expresión de los genes HBB, KRT6A, KRT6B, KRT6C, KRT10, y HIST2H2AC, de sus correspondientes proteínas, o cualquiera de sus combinaciones. Un quinto aspecto de la invención se refiere al uso del kit o dispositivo de la invención, para la clasificación, diagnóstico y seguimiento del cáncer, y más preferiblemente del cáncer de pulmón.
Un sexto aspecto de la invención se refiere a un medio de almacenamiento legible por un ordenador que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos de cualquiera de los métodos de la invención.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, el medio de almacenamiento legible comprende al menos una secuencia comprendida en cualquiera de las sondas de la invención.
En otra realización preferida de este aspecto de la invención que comprende oligonucleótidos o microarreglos de canal único diseñados a partir de al menos una secuencia conocida o un ARNm comprendida cualquiera de las sondas de la invención.
Un séptimo aspecto de la invención se refiere a una señal transmisible que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos de cualquiera de los métodos de la invención.
Un octavo aspecto de la invención se refiere a un programa de ordenador almacenado en el medio legible por un ordenador de la invención, que comprende código de software adaptado para llevar a cabo los pasos de cualquiera de los métodos de la invención.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. En el análisis proteómico se identificaron un total de 384 proteínas en los cuatro grupos experimentales. De rojo (menor) a verde (mayor) se muestra el número de péptidos identificados en cada una de ellas.
Figura 2. El número medio de proteínas identificado por paciente es significativamente más alto en pacientes con cáncer de pulmón y la mayoría de proteínas se identificó en el grupo de cáncer de pulmón.
Figura 3. El número total de proteínas identificadas por paciente posee valor diagnóstico
Figura 4. Algunas proteínas, como la hemoglobina (subunidadp) o la histona 2A, se identifican mucho más a menudo en pacientes con cáncer de pulmón en comparación con los demás grupos control.
Figura 5. La cantidad detectada de varias isoformas de citoqueratina 6 fue significativamente mayor en las muestras procedentes de pacientes con cáncer de pulmón. Figura 6. Existe una correlación significativa entre el número de péptidos identificados correspondientes a algunas isoformas de citoqueratinas, y el tamaño de la lesión tumoral
Figura 7. Se detecta un número significativamente mayor de péptidos de la citoqueratina 10 en el caso de tumores del tipo epidermoide, en comparación con adenocarcinomas.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Los autores de la presente invención han analizado las proteínas en muestras de aire exhalado de pacientes con cáncer de pulmón en comparación con otros pacientes sanos y con diferentes factores de riesgo. Los resultados indican que las proteínas presentes en el aire exhalado pueden ser usadas como marcadores de un sistema de cribado de cáncer de pulmón.
La presente invención se refiere, por tanto, a un método de obtención de datos útiles para la clasificación, diagnóstico y seguimiento del cáncer- Así pues, un primer aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de datos útiles para la clasificación, diagnóstico y seguimiento del cáncer, de ahora en adelante primer método de la invención, que comprende: a) obtener una muestra biológica aislada del individuo, b) determinar la cantidad total y/o concentración de proteínas en la muestra (a).
En una realización preferida de este aspecto de la invención, el método además comprende: c) incluir al individuo del paso (a) en el grupo de individuos con cáncer si presenta un número de proteínas distintas mayor de 6, preferiblemente mayor de 9, y más preferiblemente mayor de 12 proteínas distintas.
En otra realización preferida, el método además comprende: d) determinar adicionalmente la concentración de hemoglobina (subunidad beta), citoqueratina 6A, citoqueratina 6B, citoqueratina 6C, citoqueratina 10 y/o histona 2A, en la muestra biológica del paso (a). Más preferiblemente, las concentraciones de hemoglobina (subunidad beta), citoqueratina 6A, citoqueratina 6B, citoqueratina 6C, citoqueratina 10 e histona 2A se determinan simultáneamente.
En otra realización preferida, el primer método de la invención además comprende incluir al individuo del grupo (a) en el grupo de individuos con cáncer si presenta una concentración de hemoglobina mayor o igual a 0,07 μg/ml, preferiblemente mayor o igual a 0,08 μg/ml, más preferiblemente mayor o igual a 0,09 μg/ml, y aún más preferiblemente mayor o igual a 0, ^g/ml.
En otra realización preferida, el primer método de la invención además comprende incluir al individuo del grupo (a) en el grupo de individuos con cáncer si presenta una concentración de citoqueratina 6A mayor o igual a 0,35 μg/ml, preferiblemente mayor o igual a 0,37 μg/ml, más preferiblemente mayor o igual a 0,4 μg/ml.
En otra realización preferida, el primer método de la invención además comprende incluir al individuo del grupo (a) en el grupo de individuos con cáncer si presenta una concentración de citoqueratina 6B mayor o igual a 0,25 μg/ml, preferiblemente mayor o igual a 0,27 μg/ml, más preferiblemente mayor o igual a 0,3 μg/ml.
En otra realización preferida, el primer método de la invención además comprende incluir al individuo del grupo (a) en el grupo de individuos con cáncer si presenta una concentración de citoqueratina 6C mayor o igual a 0, 15 μg/ml, preferiblemente mayor o igual a 0, 17 μg/ml, más preferiblemente mayor o igual a 0,2 μg/ml.
En otra realización preferida, el primer método de la invención además comprende incluir al individuo del grupo (a) en el grupo de individuos con cáncer si presenta una concentración de histona 2A mayor o igual a 0, 15 μg/ml, preferiblemente mayor o igual a 0, 17 μg/ml, más preferiblemente mayor o igual a 0,2 μg/ml. En otra realización más preferida de este aspecto de la invención, la muestra biológica es una muestra de aire exhalado o lavado brocoalveolar, preferiblemente es aire exhalado. Más preferiblemente, el cáncer es cáncer de pulmón. Aún más preferiblemente, la determinación de las proteínas de la muestra (a) se realiza por cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas (LC-MS/MS). Los niveles de expresión de los genes van a dar un determinado perfil de expresión génica. El término "nivel de expresión", también denominado "cantidad producto génico" o "cantidad de producto de expresión" se refiere al material bioquímico, ya sea ARN o proteína, resultado de la expresión de un gen. Algunas veces se usa una medida de la cantidad de producto génico para inferir qué tan activo es un gen. Se entiende por "perfil de expresión génica" el perfil génico obtenido tras la cuantificación del ARNm y/o de proteína producida por los genes de interés o biomarcadores, es decir, por los genes HBB, KRT6A, KRT6B, KRT6C, KRT10 y HIST2H2AC, en una muestra biológica aislada. El perfil de expresión de los genes, por ejemplo, puede realizarse determinando el nivel de ARNm derivado de su transcripción, previa extracción del ARN total presente en la muestra biológica aislada, lo cual puede realizarse mediante protocolos conocidos en el estado de la técnica. La medida de la cantidad o la concentración de producto de expresión de estos genes, preferiblemente de manera semi-cuantitativa o cuantitativa, puede ser llevada a cabo de manera directa o indirecta. La medida directa se refiere a la medida de la cantidad o la concentración del producto de expresión de los genes, basada en una señal que se obtiene directamente de los transcritos de dichos genes, o de las proteínas, y que está correlacionada directamente con el número de moléculas de ARN o de proteínas producidas por los genes. Dicha señal a la que también podemos referirnos como señal de intensidad puede obtenerse, por ejemplo, midiendo un valor de intensidad de una propiedad química o física de dichos productos. La medida indirecta incluye la medida obtenida de un componente secundario o un sistema de medida biológica (por ejemplo la medida de respuestas celulares, ligandos, "etiqueta" o productos de reacción enzimática).
El término "cantidad", tal y como se utiliza en la descripción, se refiere pero no se limita, a la cantidad absoluta o relativa de los productos de expresión de los genes o a la cantidad de los anticuerpos, así como a cualquier otro valor o parámetro relacionado con los mismos o que pueda derivarse de éstos. Dichos valores o parámetros comprenden valores de intensidad de la señal obtenidos a partir de cualquiera de las propiedades físicas o químicas de dichos productos de expresión obtenidos mediante medida directa. Adicionalmente, dichos valores o parámetros incluyen todos aquellos obtenidos mediante medida indirecta, por ejemplo, cualquiera de los sistemas de medida descritos en otra parte del presente documento.
En el contexto de la presente invención el término "hemoglobina" o "Hb" se refiere tanto a la HbA o Hb normal, la cual es una heteroproteína de la sangre, de peso molecular 64.000 Daltons (64 kD), de color rojo, que transporta el oxígeno desde los órganos respiratorios hasta los tejidos, en vertebrados y algunos invertebrados, y que está formada por cuatro cadenas polipeptídicas (globinas) a cada una de las cuales se une un grupo hemo, cuyo átomo de hierro es capaz de unirse de forma reversible al oxígeno; como a cualquier variante estructural de la Hb o derivados de la misma modificados químicamente. Ejemplos de variantes estructurales de la hemoglobina o derivados de la misma modificados químicamente son, aunque sin limitarse, la Hb glicosilada o HbA1 , incluyéndose dentro de ella todas sus variantes, como por ejemplo, aunque sin limitarnos, la HbA1 a, HbA1 b o HbA1c; la HbF o Hb fetal, HbLAIc, Hb P3, Hb P4, Hb A0, Hb X, la carboxihemoglobina, carbaminohemoglobina, metahemoglobina, oxihemoglobina, Hb La Roche-sur-Yon, Hb Baylor, HbS, HbE, HbC, HbD, Hb D-Punjab, Hb O-Arab, Hb G-Philadelphia, Hb Hasharon, Hb Korle-Bu, Hb Lepore, Hb M o HbA2. En una realización preferida de este aspecto de la invención, se detecta la subunidad beta de la hemoglobina.
Los genes de la subunidad alfa (HBA) y beta (HBB) determinan la estructura de los 2 tipos de cadenas de polipéptidos en la hemoglobina adulta, Hb A. El tetrámero de hemoglobina normal del adulto se compone de dos cadenas alfa y dos cadenas beta. La Globina beta muíante produce anemia de células falciformes. La ausencia de la cadena beta provoca beta-cero-talasemia. Las cantidades reducidas de globina beta detectable causan beta-plus-talasemia. El orden de los genes en el grupo beta-globina es 5'-epsilon-gamma-G-gamma-A-delta-beta-3'.
El término "citoqueratina" se refiere a las proteínas fibrosas que forman los filamentos intermedios del citoesqueleto intracelular en particular de células epiteliales (incluyendo mucosas y glándulas), así como en las uñas, pelo y en las plumas de los animales. Los monómeros de citoqueratina están ligados una a la otra por moléculas de filagrina. Su función principal es la organización de la estructura tridimensional interna de la célula, forman una barrera rígida la cual evita la entrada de microorganismos. Esa misma barrera cumple la vital función de retener agua dentro de las células. También participan en algunas uniones intercelulares (desmosomas). Se han descrito irregularidades en la expresión de las proteínas de citoqueratina forman la raíz de condiciones atípicas, tales como eccema, ictiosis, soriasis y ciertos tipos de cáncer metastático.
Concretamente, las citoqueratinas 6A, 6B y 6C están codificadas por los genes KRT6A, KRT6B y KRT6C, respectivamente, que forman parte de la familia de genes de queratinas. Las citoqueratinas 6A, 6B y 6C son citoqueratinas de tipo II, proteínas básicas o neutras dispuestas en pares de cadenas de queratina heterotípicas coexpresadas durante la diferenciación de los tejidos epiteliales simples y estratificados. Se han identificado seis citoqueratina de tipo II (KRT6); la multiplicidad de los genes se atribuye eventos sucesivos de duplicación de genes. Los genes se expresan junto a miembros de la familia KRT16 y/o KRT17 en las papilas filiformes de la lengua, el revestimiento epitelial estratificado de la mucosa oral y el esófago, la vaina externa de la raíz de los folículos pilosos, y el epitelio glandular. Las mutaciones en estos genes se han asociado con paquioniquia congénita. Además, los péptidos de la región C-terminal de la proteína tienen actividad antimicrobiana contra patógenos bacterianos. Las citoqueratinas tipo II se agrupan en una región del cromosoma 12q12-q13.
Por otro lado, el gen de la citoqueratina 10 codifica un miembro tipo I (ácido) de la familia de las citoqueratina, que pertenecen a la superfamilia de proteínas de los filamentos intermedios (I F). Las queratinas son proteínas estructurales heteropoliméricas que forman los filamentos intermedios. Estos filamentos, junto con los microfilamentos de actina y los microtúbulos, componen el citoesqueleto de las células epiteliales. Las mutaciones en este gen están asociadas con hiperqueratosis epidermolítica. Este gen se encuentra dentro de un grupo de miembros de la familia de queratina en el cromosoma 17q21 .
El término "histona" se refiere a proteínas básicas, de baja masa molecular, muy conservadas evolutivamente entre los eucariotas y en algunos procariotas. Forman la cromatina junto con el ADN, sobre la base de unas unidades conocidas como nucleosomas. La cromatina resuelve el problema de restricción de crecimiento de ADN y núcleo, la cromatina está formada por ADN y proteínas, la principal proteína formadora son las histonas. Son las proteínas celulares más frecuentes y exhiben un alto contenido, cerca de 20%, de lisina y arginina (aminoácidos básicos). Con las cargas positivas de las cadenas laterales de estos restos, las histonas (que son extremadamente básicas) se unen a los grupos fosfato del ADN (cargados negativamente); para ello no es relevante la secuencia de bases dentro del ADN. A menudo, las histonas son modificadas por metilaciones, acetilaciones, fosforilaciones o ADP-ribosilaciones. En los seres humanos hay cinco tipos principales: la histona H 1 y las histonas H2A, H2B, H3 y H4. Estas últimas se denominan también histonas nucleosomales y forman un octámero con dos histonas de cada; alrededor de este núcleo se enrolla dos veces un hilo de ADN. Este complejo ADN-histona recibe el nombre de nucleosoma y constituye el componente primario del cromosoma. Las histonas también pueden modificarse por metilación, ribosilación o fosforilación; aún no se conoce en detalles cuáles son los mecanismos precisos con los que están modificaciones influyen en la regulación genética. Tabla 1. Hemoglobina (subunidad beta), citoqueratinas 6A, 6B, 6C, 10 e histona 2A.
Nombre
Gene Secuencias Secuencias
Descripción
ID nucleotídicas aminoacídicas del Gen HBB hemoglobin, beta 3043 SEQ ID N0:1 SEQ ID N0:2
KRT6A keratin 6A 3853 SEQ ID N0:3 SEQ ID N0:4
KRT6B keratin 6B 3854 SEQ ID N0:5 SEQ ID N0:6
KRT6C keratin 6C 286887 SEQ ID N0:7 SEQ ID N0:8
SEQ ID N0:9 y SEQ ID N0: 1 1 y
KRT10 keratin 10 3858
SEQ ID NO: 10 SEQ ID N0: 12
HIST2H2AC histone 2, H2ac 8338 SEQ ID N0:13 SEQ ID N0: 14
En el contexto de la presente invención, los genes HBB, KRT6A, KRT6B, KRT6C, KRT10, y HIST2H2AC se definen también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante de las proteínas recogidas respectivamente en las SEQ ID recogidas en la tabla 1 , y que comprendería a diversas variantes procedentes de: a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID recogidas en la tabla 1 , b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con las SEQ ID recogidas en la tabla 1 , respectivamente, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de las proteínas HBB, KRT6A, KRT6B, KRT6C, KRT10 y HIST2H2AC. Entre dichas moléculas de ácido nucleico se encuentra la recogida en las SEQ ID indicada en la tablal . Los métodos para cuantificar la cantidad total y/o concentración de proteínas en la muestra (a) son los conocidos en el estado de la técnica incluyendo, por ejemplo, aunque sin limitarnos, ES-MS (de sus siglas en inglés Electrospray mass spectrometry), IEF (de sus siglas en inglés Isoelectric focusing), electroforesis o HPLC (de sus siglas en inglés High-Performance Liquid Chromatography), la cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas (LC-MS/MS), electroforesis en dos dimensiones, fluorescencia, técnica de ionización MALDI-TOF-MS, etiquetado de isótopos estables, ELISA (de sus siglas en inglés Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay). En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la cuantificación de los pasos (b) y (d) del método de la invención se realiza por LC-MS/MS.
La detección y cuantificación de las proteínas en la muestra (a) se puede realizar por cualquier procedimiento de los conocidos en el estado del arte. Por ejemplo, aunque sin limitarnos, usando una electroforesis convencional, SDS-PAGE, electroforesis en dos dimensiones, fluorescencia, arrays, espectrometría de masas (MS), cromatografía, cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas (LC-MS/MS).
Los pasos (b), (c) y/o (d) del método descrito anteriormente pueden ser total o parcialmente automatizados, por ejemplo, por medio de un equipo robótico sensor para la detección de la cantidad en los pasos (b) y (d), y/o la comparación computerizada en el paso (c).
Una "muestra biológica aislada" incluye, pero sin limitarnos a, células, tejidos y/o fluidos biológicos de un organismo, obtenidos mediante cualquier método conocido por un experto en la materia. Preferiblemente, la muestra biológica aislada de un individuo del paso (a) es aire exhalado.
El término "individuo", tal y como se utiliza en la descripción, se refiere a animales, preferiblemente mamíferos, y más preferiblemente, humanos. El término "individuo" no pretende ser limitativo en ningún aspecto, pudiendo ser éste de cualquier edad, sexo y condición física.
El término "comparación", tal y como se utiliza en la descripción, se refiere pero no se limita, a la comparación del resultado de la amplificación de la muestra biológica a analizar, también llamada muestra biológica problema, con una amplificación de una o varias muestras de referencia deseable. La muestra de referencia puede ser analizada, por ejemplo, simultánea o consecutivamente, junto con la muestra biológica problema. La comparación descrita en el apartado (e) del método de la presente invención puede ser realizada manualmente o asistida por ordenador.
En un segundo aspecto la invención se refiere a un método de clasificación de pacientes con cáncer de pulmón, de ahora en adelante segundo método de la invención, que comprende los pasos los pasos (a)-(b) según el primer método de la invención, y además comprende determinar la concentración de citoqueratina 10. En una realización preferida además comprende incluir al individuo del grupo (a) en el grupo de individuos con adenocarcinoma si presenta una concentración de citoqueratina 10 menor a 1 ,5 μg/ml, preferiblemente menor a 1 ,2 μg/ml, y más preferiblemente menor a 1 μg/ml.
En otra realización más preferida de este aspecto de la invención, la muestra biológica es una muestra de aire exhalado o lavado brocoalveolar, preferiblemente es aire exhalado. Más preferiblemente, el cáncer es cáncer de pulmón. Aún más preferiblemente, la determinación de las proteínas de la muestra (a) se realiza por cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas (LC-MS/MS).
Un tercer aspecto de la invención se refiere método para el seguimiento de la progresión del cáncer y/o el crecimiento del tumor, de ahora en adelante tercer método de la invención, que comprende los pasos (a)-(b) según el primer método de la invención, y además comprende determinar las variaciones de las isoformas de la citoqueratina 6 en dos tiempos, un tiempo t1 y un tiempo t2. En una realización preferida de este aspecto de la invención, t1 es 0 (momento inicial), y t2 va desde 1 día en adelante. En otra realización preferida t2 es 182 días, más preferiblemente t2 es 273 días y aún más preferiblemente 365 días.
En otra realización preferida se realizan múltiples análisis (tn) a partir del t1=0, realizando un seguimiento de la progresión del cáncer y/o el crecimiento del tumor periódico del individuo.
En otra realización más preferida de este aspecto de la invención, el tercer método de la invención además comprende asignar al individuo del paso (a) al grupo de individuos con un mayor tamaño tumoral, si la cantidad de citoqueratina 6 en t1 es menor que en t2.
En otra realización más preferida de este aspecto de la invención, la muestra biológica es una muestra de aire exhalado o lavado brocoalveolar, preferiblemente es aire exhalado. Más preferiblemente, el cáncer es cáncer de pulmón. Aún más preferiblemente, la determinación de las proteínas de la muestra (a) se realiza por cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas (LC-MS/MS).
KIT O DISPOSITIVO DE LA INVENCIÓN Un cuarto aspecto de la invención se refiere a kit o dispositivo, de ahora en adelante kit o dispositivo de la invención, que comprende los elementos necesarios llevara a cabo el método según cualquiera de los métodos de la invención.
En una realización preferida el kit o dispositivo comprende: un dispositivo de recogida, almacenado y/o transporte de muestras de gases, por ejemplo, pero sin limitarnos, como el descrito en la patente EP99948568.3, preferiblemente adaptado para aire exhalado, que contiene los sensores necesarios para detección cuantitativa y cualitativa de proteínas y/o que puede conectarse a un ordenador que contiene las instrucciones de programa para realizar los pasos del método de la invención. En otra realización preferida, el kit o dispositivo de la invención comprende los cebadores y sondas obtenidos de las secuencias de los genes de la invención, tal y como también se encuentran en la tabla 1. El kit puede contener la/s sonda/s y cebadores útiles para cuantificar la expresión de los genes HBB, KRT6A, KRT6B, KRT6C, KRT10, y HIST2H2AC, o cualquiera de las combinaciones de los genes. El kit de la invención puede incluir controles positivos y/o negativos. El kit además puede contener, sin ningún tipo de limitación, tampones, soluciones de extracción de proteínas, agentes para prevenir la contaminación, inhibidores de la degradación de las proteínas, etc.
Por otro lado el kit puede incluir todos los soportes y recipientes necesarios para su puesta en marcha y optimización. Preferiblemente, el kit comprende además las instrucciones para llevar a cabo los métodos de la invención.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso del kit o dispositivo de la invención para la clasificación, diagnóstico y seguimiento del cáncer a partir de una muestra biológica.
El kit se basa en el poder de diagnóstico, clasificación y seguimiento del método de la presente invención. Tal como se ha mencionado anteriormente, el valor indicador de referencia para cada gen/proteína concreto se puede determinar antes de llevar a cabo el procedimiento de la presente invención. En el caso particular del kit, se pueden proporcionar con el valor indicador de referencia para el diagnóstico, clasificación y seguimiento. Con la ayuda del kit, se puede calcular la expresión de cada gen y/o número y/o concentración de proteínas, es decir, con respecto a las muestras de control ejemplificadas anteriormente. El control puede de esta manera estar comprendido también en el kit. Un quinto aspecto de la invención se refiere al uso del kit o dispositivo de la invención, para la clasificación, diagnóstico y seguimiento del cáncer, y más preferiblemente del cáncer de pulmón.
Un sexto aspecto de la invención se refiere a un medio de almacenamiento legible por un ordenador que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos de cualquiera de los métodos de la invención.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, el medio de almacenamiento legible comprende al menos una secuencia comprendida en cualquiera de las sondas de la invención. En otra realización preferida de este aspecto de la invención que comprende oligonucleótidos o microarreglos de canal único diseñados a partir de al menos una secuencia conocida o un ARNm comprendida cualquiera de las sondas de la invención.
Así, por ejemplo, las secuencias de oligonucleótidos pueden ser construidas en la superficie un chip mediante el elongamiento secuencial de una cadena en crecimiento con un sólo nucleótido utilizando fotolitografía. Así, los oligonucleótidos son anclados por el extremo 3' mediante un método de activación selectiva de nucleótidos, protegidos por un reactivo fotolábil, mediante la incidencia selectiva de luz a través de una fotomáscara. La fotomáscara puede ser física o virtual. La síntesis in situ sobre un soporte sólido (por ejemplo, vidrio), podría hacerse mediante tecnología chorro de tinta (ink-jet), lo que requiere sondas más largas. Los soportes podrían ser, pero sin limitarse, filtros o membranas de NC o nylon (cargadas), silicio, o Portas de vidrio para microscopios cubiertos con aminosilanos, polilisina, aldehidos o epoxy. La sonda es cada una de las muestras del chip. El target es la muestra a analizar: RNA mensajero, RNA total, un fragmento de PCR, etc.
Un séptimo aspecto de la invención se refiere a una señal transmisible que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos de cualquiera de los métodos de la invención.
Un octavo aspecto de la invención se refiere a un programa de ordenador almacenado en el medio legible por un ordenador de la invención, que comprende código de software adaptado para llevar a cabo los pasos de cualquiera de los métodos de la invención. Una secuencia de ácido nucleico o polinucleótido puede comprender las cinco bases que aparecen biológicamente (adenina, guanina, timina, citosina y uracilo) y/o bases distintas de las cinco que aparecen biológicamente. Estas bases pueden servir para distintos propósitos, por ejemplo, para estabilizar o desestabilizar la hibridación; para estimular o inhibir la degradación de la sonda; o como puntos de unión para restos detectables o restos de apantallamiento. Por ejemplo, un polinucleótido de la invención puede contener uno o más restos de base modificados, no estándar, derivatizados, incluyendo, pero sin limitarse a, N6-metil-adenina, N6-terc-butil-bencil-adenina, imidazol, imidazoles sustituidos, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5- yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroximetil) uracilo, 5- carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo,beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1- metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3- metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-metiladenina, 7-metilguanina, 5- metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'- metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxi uracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético, wybutoxosina, pesudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2- tiouracilo, 2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo (es decir, timina), éster metílico del ácido uracil-5-oxiacético, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil)uracilo, (acp3)w, 2,6-diaminopurina, y 5-propinil pirimidina. Otros ejemplos de restos de bases modificados, no estándar, o derivatizados pueden encontrarse en las Patentes de EEUU Nos. 6.001.61 1 ; 5.955.589; 5.844.106; 5.789.562; 5.750.343; 5.728.525; y 5.679.785. Además, una secuencia de ácido nucleico o polinucleótido puede comprender uno o más restos de azúcares modificados incluyendo, pero sin limitarse a, arabinosa, 2-fluoroarabinosa, xilulosa, y una hexosa.
Los términos "polinucleótido" y "ácido nucleico" se usan aquí de manera intercambiable, refiriéndose a formas poliméricas de nucleótidos de cualquier longitud, tanto ribonucleótidos (ARN ó RNA) como desoxiribonucleótidos (ADN ó DNA). Los términos "secuencia aminoacídica", "péptido", "oligopéptido", "polipéptido" y "proteína" se usan aquí de manera intercambiable, y se refieren a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, que pueden ser codificantes o no codificantes, química o bioquímicamente modificados.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. EJEMPLOS DE LA INVENCIÓN
Pacientes
Se incluyeron en el estudio un total de 193 pacientes: 49 controles sanos sin factor de riesgo (Grupo Control), 49 controles sanos con factor de riesgo (tabaquismo) (Grupo FR), 46 con diagnóstico de enfermedad pulmonar obstructiva crónica (Grupo EPOC), y 48 con diagnóstico de cáncer de pulmón (Grupo CP).
Obtención de las muestras
Las muestras de condensado de aire exhalado (EBC) se obtuvieron usando un equipo EcoScreen II (FILT GmbH, Alemania). Los pacientes respiraron a través del dispositivo de manera normal durante 15 minutos, y se recogió para el estudio la muestra correspondiente a las vías aéreas distales (inferiores), siendo congelada a -80°C hasta su correspondiente análisis.
Análisis proteómico
Las muestras fueron analizadas mediante cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas (LC-MS/MS) en el Servicio de Proteómica de la Universidad de Valencia.
Preparación de las muestras
Las muestras (400 μΙ) se desecaron mediante centrifugación y evaporación (SpeedVac, Thermo Scientific) y se disolvieron en 20 μΙ de tampón ABC (anode buffer container, Applied Biosystems). Los residuos de cisteína se redujeron mediante incubación con 2 mM Dithiothreitol (DTT) a 60°C durante 20 min. Los grupos sulfhidrilo resultantes se bloquearon mediante alquilación con yodoacetamida (IAM) 5 mM, en una incubación de 30 min a temperatura ambiente. El exceso de IAM se neutralizó con una incubación con 10 mM DTT, durante 30 min a temperatura ambiente.
La muestra se sometió a digestión con 250 ng (100 ng/ μΙ) de tripsina modificada con calidad para secuenciación (Promega) en tampón ABC, durante toda la noche a 37 °C. La digestión se detuvo con ácido trifluoroacético (TFA) al 0.1 % de concentración final. La mezcla de péptidos resultante se concentró mediante centrifugación y vacío (SpeedVac, Thermo Scientific) hasta un volumen final de 6μΙ.
Cromatografía líquida y espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) De cada muestra se inyectaron 5 μΙ en una columna trampa (NanoLC Column, 3μ C18-CL, 350umx0.5mm; Eksigen) y se desaló con TFA 0.1 % a 3μΙ/Γηϊη durante 5 min. Los péptidos se cargaron entonces en una columna analítica (LC Column, 3 μ C18-CL, 75umx12cm, Nikkyo) equilibrada en acetonitrilo al 5% y ácido fórmico (FA) al 0.1 %. La elución se realizó con un gradiente linear 5-35% B en A durante 30 min. (A: 0.1 % FA; B: ACN, 0.1 % FA) a un flujo de 300nl/min.
Los péptidos se analizaron en un espectrómetro de masas nanoESI qQTOF (6600TripleTOF, ABSCIEX). El triple TOF se manejó en el modo de adquisición información-dependiente, en el que se realizó un barrido TOF-MS de 0.26 s y 350- 1250 m/z, seguido de otro barrido de 0.05 s y 100-1600 m/z de los 50 iones producto cargados (2-5) más intensos. La sensibilidad del sistema se monitorizó con 2 fmol de una mezcla patrón de 6 proteínas (LC Packings).
Se utilizó el motor de búsqueda ProteinPilot v4.6 (ABSciex) con los parámetros por defecto para generar la lista de picos directamente de los ficheros wiff del equipo 6600TripleTOF. El algoritmo Paragón se utilizó para realizar la búsqueda en la base de datos de proteínas Expasy (616203 secuencias, 181334896 residuos) con los siguientes parámetros: trypsin specificity, Cys-alkylation, restricción taxonómica a Human y search effort ajustado en through.
Análisis estadístico
El análisis estadístico para comparar los resultados obtenidos en cada uno de los grupos clínicos se realizó utilizando los programas SPSS 15.0 (IBM) y GraphPad Prism 6.0.
RESULTADOS
Los autores de la presente invención han analizado la presencia de proteínas en muestras de aire exhalado de pacientes con cáncer de pulmón, en comparación con donantes sanos, con o sin factor de riesgo (tabaquismo), y también en comparación con otra patología pulmonar no neoplásica (EPOC). Se presentan resultados que demuestran que las proteínas presentes en el aire exhalado pueden ser usadas como marcadores para un sistema de cribado del cáncer de pulmón.
En total se identificaron 348 proteínas, que en la Figura 1 se representan mediante el número de péptidos identificados de cada una de ellas. El número de péptidos identificados para cada proteína se muestra con una gradación de color, aumentando desde el rojo-naranja hasta el amarillo-verde. Aunque se observó variabilidad entre las distintas muestras, el análisis de los resultados como a continuación se detalla, permite concluir que las proteínas presentes en el aire exhalado pueden ser usadas como marcadores para un sistema de cribado del cáncer de pulmón. 1.- En pacientes con cáncer de pulmón se identifica un número significativamente mayor de proteínas en el aire exhalado.
Como se puede observar en la Figura 2, en aquellas muestras correspondientes al grupo CP se identificó un mayor número de proteínas. De hecho, al analizar el número de proteínas identificado en cada grupo, no solo el número medio de proteínas identificado por pacientes fue significativamente más elevado, sino que un 42% de las 384 proteínas identificadas en total se encuentran únicamente en el grupo de pacientes con CP. Para examinar el potencial valor diagnóstico que proporcionaría el número total de péptidos o proteínas identificado en cada paciente se realizó un análisis mediante curvas ROC ("receiver operating characteristic curve") que se muestra en la Figura 3. Los resultados muestran que el parámetro AUC (área bajo la curva) para el total de péptidos es 0.6, y para el total de proteínas es de 0.8, indicando que el número total de proteínas identificadas en una muestra de aire exhalado posee valor diagnóstico. Si establecemos un punto de corte de >12 proteínas, podremos identificar a aquellos pacientes con cáncer de pulmón con un 70% de sensibilidad y un 67% de especificidad.
2.- Algunas proteínas se identifican mucho más a menudo en pacientes con cáncer de pulmón en comparación con los demás grupos control.
Se ha observado una mayor presencia de algunas proteínas en pacientes con cáncer de pulmón (Figura 4). Es el caso de la hemoglobina, una proteína que se sabe que se expresa en las células epiteliales del alveolo pulmonar. Otras proteínas detectadas también con más frecuencia en pacientes de cáncer de pulmón fueron varias isoformas de histonas, concretamente la isoforma 2A, cuyos elevados niveles extracelulares se ha relacionado con varias patologías pulmonares. Por tanto, la presencia de algunas proteínas concretas en el aire exhalado puede constituir un marcador de cáncer de pulmón.
3.- En muestras de aire exhalado de pacientes con cáncer de pulmón se detectan más péptidos correspondientes a algunas isoformas de citoqueratinas. Debido a que el mayor número de péptidos y proteínas correspondían a distintas isoformas de citoqueratinas se realizó un análisis más detallado de las mismas. Para ello, se realizó una estimación de la cantidad de proteína, basándose en el número de péptidos detectados en cada caso. Como muestra la Figura 5 en los pacientes con cáncer de pulmón se detectó una cantidad significativamente mayor de algunas isoformas de citoqueratinas. Concretamente, la cantidad de varias isoformas de citoqueratinas 6 fue significativamente mayor en las muestras procedentes de pacientes con cáncer de pulmón. Se sabe que algunos cambios específicos en la expresión de citoqueratinas de las células epiteliales del tracto respiratorio se correlacionan con la progresión desde lesiones pre-neoplásicas a neoplásicas. Además, se ha descrito que el gen que codifica para la citoqueratina 6A (KRT6A) se sobreexpresa unas 10 veces en cáncer de pulmón del tipo epidermoide. En nuestro estudio, se halló además una correlación entre el número de péptidos identificados correspondientes a algunas isoformas de citoqueratinas, y el tamaño de la lesión tumoral (Figura 6).

Claims

REIVINDICACIONES
1. - Un método de obtención de datos útiles para la clasificación, diagnóstico y seguimiento del cáncer de pulmón, que comprende: a) obtener una muestra biológica aislada del individuo, b) determinar la cantidad total y/o concentración de proteínas en la muestra (a).
2. - El método según la reivindicación anterior, que además comprende: c) incluir al individuo del paso (a) en el grupo de individuos con cáncer de pulmón si presenta un número de proteínas distintas mayor de 6, preferiblemente mayor de 9, más preferiblemente mayor de 12 proteínas distintas.
3. - El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, que además comprende: d) determinar adicionalmente la concentración de hemoglobina (subunidad beta), citoqueratina 6A, citoqueratina 6B, citoqueratina 6C, e histona 2A, en la muestra biológica del paso (a).
4.- El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que además comprende incluir al individuo del grupo (a) en el grupo de individuos con cáncer de pulmón si presenta una concentración de hemoglobina mayor o igual a 0,07 μg/ml, preferiblemente mayor o igual a 0,08 μg/ml, más preferiblemente mayor o igual a 0,09 μg/ml, aún más preferiblemente mayor o igual a 0,^g/ml.
5.- El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que además comprende incluir al individuo del paso (a) en el grupo de individuos con cáncer de pulmón si presenta una concentración de citoqueratina 6A mayor o igual a 0,35 μg/ml, preferiblemente mayor o igual a 0,37 μg/ml, más preferiblemente mayor o igual a 0,4 μg/ml.
6.- El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que además comprende incluir al individuo del paso (a) en el grupo de individuos con cáncer de pulmón si presenta una concentración de citoqueratina 6B mayor o igual a 0,25 μg/ml, preferiblemente mayor o igual a 0,27 μg/ml, más preferiblemente mayor o igual a 0,3 μg/ml.
7. - El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que además comprende incluir al individuo del paso (a) en el grupo de individuos con cáncer de pulmón si presenta una concentración de citoqueratina 6C mayor o igual a 0, 15 μg/ml, preferiblemente mayor o igual a 0, 17 μg/ml, más preferiblemente mayor o igual a 0,2 μg/ml.
8. - El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que además comprende incluir al individuo del paso (a) en el grupo de individuos con cáncer de pulmón si presenta una concentración de histona 2A mayor o igual a 0, 15 μg/ml, preferiblemente mayor o igual a 0, 17 μg/ml, más preferiblemente mayor o igual a 0,2 μg/ml.
9.- El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde la muestra biológica es una muestra de aire exhalado o lavado brocoalveolar, preferiblemente es aire exhalado.
10. - El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, donde la determinación de las proteínas de la muestra (a) se realiza por cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas (LC-MS/MS).
1 1. - Un método de clasificación de pacientes con cáncer de pulmón, que comprende los pasos según cualquiera de las reivindicaciones 1-10 y además comprende determinar la concentración de citoqueratina 10.
12. - El método de clasificación de pacientes según la reivindicación anterior, que además comprende incluir al individuo del grupo (a) en el grupo de individuos con adenocarcinoma si presenta una concentración de citoqueratina 10 menor a 1 ,5 μg/ml, preferiblemente menor a 1 ,2 μg/ml, y más preferiblemente menor a 1 μg/ml.
13. - El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 1-12, donde la muestra biológica es una muestra de aire exhalado o lavado brocoalveolar, preferiblemente es aire exhalado.
14. - El método según cualquiera de las reivindicaciones 11-13, donde el cáncer es cáncer de pulmón.
15. - El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 1-14, donde la determinación de las proteínas de la muestra (a) se realiza por cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas (LC-MS/MS).
16.- Un método para el seguimiento de la progresión del cáncer y/o el crecimiento del tumor que comprende los pasos (a)-(b) según cualquiera de las reivindicaciones 1-10, y además comprende determinar las variaciones de las isoformas de la citoqueratina 6 en dos tiempos, un tiempo t1 y un tiempo t2.
17.- El método para el seguimiento de la progresión del cáncer y/o el crecimiento del tumor según la reivindicación anterior, t1 es 0 (momento inicial), y t2 va desde 1 día en adelante.
18.- El método para el seguimiento de la progresión del cáncer y/o el crecimiento del tumor según cualquiera de las reivindicaciones 16-17, donde t2 es 365 días.
19.- El método para el seguimiento de la progresión del cáncer y/o el crecimiento del tumor según cualquiera de las reivindicaciones 16-18, que además comprende asignar al individuo del paso (a) un mayor tamaño tumoral si la cantidad de citoqueratina 6 en t1 es menor que en t2.
20. - El método para el seguimiento de la progresión del cáncer y/o el crecimiento del tumor según cualquiera de las reivindicaciones 16-19, donde la muestra biológica es una muestra de aire exhalado o lavado brocoalveolar, preferiblemente es aire exhalado.
21. - El método según cualquiera de las reivindicaciones 16-20, donde el cáncer es cáncer de pulmón.
22.- El método según cualquiera de las reivindicaciones 16-21 , donde la determinación de las proteínas de la muestra (a) se realiza por cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas (LC-MS/MS).
23. - Un kit o dispositivo que comprende los elementos necesarios llevara a cabo el método según cualquiera de las reivindicaciones 1-22, y preferiblemente comprende cebadores y sondas obtenidas de las secuencias de la Tabla 1 , útiles para cuantificar la expresión de los genes HBB, KRT6A, KRT6B, KRT6C, KRT10, y HIST2H2AC, o cualquiera de sus combinaciones.
24. - El uso del kit o dispositivo según la reivindicación anterior, para la clasificación, diagnóstico y seguimiento del cáncer, preferiblemente del cáncer de pulmón.
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