WO2016080510A1 - 新規二重特異的抗体フォーマット - Google Patents
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Abstract
Description
[1]二重特異的抗体であって、該二重特異的抗体は、2つの重鎖、2つの第1の軽鎖、及び2つの第2の軽鎖を含み、
該重鎖は、それぞれアミノ末端側から順に、第1の重鎖可変領域、CH1領域、第1のリンカー、第2の重鎖可変領域、及び重鎖定常領域を含み、
該第1の軽鎖は、それぞれアミノ末端側から順に、第1の軽鎖可変領域及び第1の軽鎖定常領域を含み、
該第2の軽鎖は、それぞれアミノ末端側から順に、第2の軽鎖可変領域及び第2の軽鎖定常領域を含み、
該第1の重鎖可変領域と該第1の軽鎖可変領域は、第1の抗原結合部位を形成し、
該第2の重鎖可変領域と該第2の軽鎖可変領域は、第2の抗原結合部位を形成し、
該第1の抗原結合部位及び該第2の抗原結合部位は互いに異なる抗原を認識する、
二重特異的抗体。
[2]以下のa)~c):
a)[1]に記載の二重特異的抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該二重特異的抗体の第1の軽鎖及び第2の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;
b)[1]に記載の二重特異的抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該二重特異的抗体の第1の軽鎖及び第2の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;並びに
c)[1]に記載の二重特異的抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、並びに、該二重特異的抗体の第1の軽鎖及び第2の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞
から選択される、宿主細胞であって、
ここで、該二重特異的抗体の第1の軽鎖及び第2の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、該第1の軽鎖のカルボキシ末端に第2のリンカーを介して該第2の軽鎖のアミノ末端が連結されたポリペプチドをコードする塩基配列を含み、該第2のリンカーはプロテアーゼ認識配列を含むペプチドリンカーである、
宿主細胞。
[3]第2のリンカーが細胞内プロテアーゼ認識配列を含むペプチドリンカーである、[2]に記載の宿主細胞。
[4]二重特異的抗体を生産する方法であって、[2]に記載の宿主細胞を培養し、二重特異的抗体を発現させる工程を包含する、方法。
[5][4]に記載の方法によって生産できる二重特異的抗体。
[6]二重特異的抗体を生産する方法であって、[3]に記載の宿主細胞を培養し、二重特異的抗体を発現させる工程を包含する、方法。
[7]培養工程において宿主細胞内のプロテアーゼによって第2のリンカーが切断される、[6]に記載の方法。
[8][6]又は[7]に記載の方法によって生産できる二重特異的抗体。
[9][1]に記載の二重特異的抗体の抗原結合フラグメント。
[10]Fab、Fab’、又はF(ab’)2である[9]に記載の抗原結合フラグメント。
[11]二重特異的抗体であって、該二重特異的抗体は、2つの軽鎖、2つの第1の重鎖のフラグメント、及び2つの第2の重鎖を含み、
該軽鎖は、それぞれアミノ末端側から順に、第1の軽鎖可変領域、第1の軽鎖定常領域、第1のリンカー、第2の軽鎖可変領域、及び第2の軽鎖定常領域を含み、
該第1の重鎖のフラグメントは、それぞれアミノ末端側から順に、第1の重鎖可変領域及びCH1領域を含み、
該第2の重鎖は、それぞれアミノ末端側から順に、第2の重鎖可変領域及び重鎖定常領域を含み、
該第1の重鎖可変領域と該第1の軽鎖可変領域は、第1の抗原結合部位を形成し、
該第2の重鎖可変領域と該第2の軽鎖可変領域は、第2の抗原結合部位を形成し、
該第1の抗原結合部位及び該第2の抗原結合部位は互いに異なる抗原を認識する、
二重特異的抗体。
[12]以下のa)~c):
a)[11]に記載の二重特異的抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該二重特異的抗体の第1の重鎖のフラグメント及び第2の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;
b)[11]に記載の二重特異的抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該二重特異的抗体の第1の重鎖のフラグメント及び第2の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;並びに
c)[11]に記載の二重特異的抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、並びに、該二重特異的抗体の第1の重鎖のフラグメント及び第2の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞
から選択される、宿主細胞であって、
ここで、該二重特異的抗体の第1の重鎖のフラグメント及び第2の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、該第1の重鎖のフラグメントのカルボキシ末端に第2のリンカーを介して該第2の重鎖のアミノ末端が連結されたポリペプチドをコードする塩基配列を含み、該第2のリンカーはプロテアーゼ認識配列を含むペプチドリンカーである、
宿主細胞。
[13]第2のリンカーが細胞内プロテアーゼ認識配列を含むペプチドリンカーである、[12]に記載の宿主細胞。
[14]二重特異的抗体を生産する方法であって、[12]に記載の宿主細胞を培養し、二重特異的抗体を発現させる工程を包含する、方法。
[15][14]に記載の方法によって生産できる二重特異的抗体。
[16]二重特異的抗体を生産する方法であって、[13]に記載の宿主細胞を培養し、二重特異的抗体を発現させる工程を包含する、方法。
[17]培養工程において宿主細胞内のプロテアーゼによって第2のリンカーが切断される、[16]に記載の方法。
[18][16]又は[17]に記載の方法によって生産できる二重特異的抗体。
[19][11]に記載の二重特異的抗体の抗原結合フラグメント。
[20]Fab、Fab’、又はF(ab’)2である[19]に記載の抗原結合フラグメント。
本発明の二重特異的抗体には、以下の(1)及び(2)に記載の二重特異的抗体が含まれる:
(1)重鎖連結二重特異的抗体
二重特異的抗体であって、該二重特異的抗体は、2つの重鎖、2つの第1の軽鎖、及び2つの第2の軽鎖を含み、
該重鎖は、それぞれアミノ末端側から順に、第1の重鎖可変領域、CH1領域、第1のリンカー、第2の重鎖可変領域、及び重鎖定常領域を含み、
該第1の軽鎖は、それぞれアミノ末端側から順に、第1の軽鎖可変領域及び第1の軽鎖定常領域を含み、
該第2の軽鎖は、それぞれアミノ末端側から順に、第2の軽鎖可変領域及び第2の軽鎖定常領域を含み、
該第1の重鎖可変領域と該第1の軽鎖可変領域は、第1の抗原結合部位を形成し、
該第2の重鎖可変領域と該第2の軽鎖可変領域は、第2の抗原結合部位を形成し、
該第1の抗原結合部位及び該第2の抗原結合部位は互いに異なる抗原を認識する、
二重特異的抗体。
(2)軽鎖連結二重特異的抗体
二重特異的抗体であって、該二重特異的抗体は、2つの軽鎖、2つの第1の重鎖のフラグメント、及び2つの第2の重鎖を含み、
該軽鎖は、それぞれアミノ末端側から順に、第1の軽鎖可変領域、第1の軽鎖定常領域、第1のリンカー、第2の軽鎖可変領域、及び第2の軽鎖定常領域を含み、
該第1の重鎖のフラグメントは、それぞれアミノ末端側から順に、第1の重鎖可変領域及びCH1領域を含み、
該第2の重鎖は、それぞれアミノ末端側から順に、第2の重鎖可変領域及び重鎖定常領域を含み、
該第1の重鎖可変領域と該第1の軽鎖可変領域は、第1の抗原結合部位を形成し、
該第2の重鎖可変領域と該第2の軽鎖可変領域は、第2の抗原結合部位を形成し、
該第1の抗原結合部位及び該第2の抗原結合部位は互いに異なる抗原を認識する、
二重特異的抗体。
本発明の宿主細胞には、以下の特徴を有する宿主細胞が含まれる:
(1)重鎖連結二重特異的抗体を作製するための宿主細胞
以下のa)~c):
a)重鎖連結二重特異的抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該二重特異的抗体の第1の軽鎖及び第2の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;
b)重鎖連結二重特異的抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該二重特異的抗体の第1の軽鎖及び第2の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;並びに
c)重鎖連結二重特異的抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、並びに、該二重特異的抗体の第1の軽鎖及び第2の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞
から選択される、宿主細胞であって、
ここで、該二重特異的抗体の第1の軽鎖及び第2の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、該第1の軽鎖のカルボキシ末端に第2のリンカーを介して該第2の軽鎖のアミノ末端が連結されたポリペプチドをコードする塩基配列を含み、該第2のリンカーはプロテアーゼ認識配列を含むペプチドリンカーである、
宿主細胞。
(2)軽鎖連結二重特異的抗体を作製するための宿主細胞
以下のa)~c):
a)軽鎖連結二重特異的抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該二重特異的抗体の第1の重鎖のフラグメント及び第2の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;
b)軽鎖連結二重特異的抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該二重特異的抗体の第1の重鎖のフラグメント及び第2の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;並びに
c)軽鎖連結二重特異的抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、並びに、該二重特異的抗体の第1の重鎖のフラグメント及び第2の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞
から選択される、宿主細胞であって、
ここで、該二重特異的抗体の第1の重鎖のフラグメント及び第2の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、該第1の重鎖のフラグメントのカルボキシ末端に第2のリンカーを介して該第2の重鎖のアミノ末端が連結されたポリペプチドをコードする塩基配列を含み、該第2のリンカーはプロテアーゼ認識配列を含むペプチドリンカーである、
宿主細胞。
本発明の二重特異的抗体を生産する方法には、本発明の宿主細胞を培養し、二重特異的抗体を発現させる工程を包含する、二重特異的抗体を生産する方法が含まれる。
本実施例では、本発明の二重特異的抗体として以下の2種類の二重特異的抗体を作製した。
1)抗ヒトTLR4抗体の重鎖のN末端側に抗ヒトTLR2抗体の重鎖可変領域及びCH1領域をリンカーを介して連結した重鎖、抗ヒトTLR2抗体の軽鎖、及び抗ヒトTLR4抗体の軽鎖を含む二重特異的抗体(図1、タンデムフォームaと称する);並びに
2)タンデムフォームaの抗ヒトTLR2抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域と抗ヒトTLR4抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域をそれぞれ置き換えた二重特異的抗体(図1、タンデムフォームbと称する)
二重特異的抗体の重鎖をコードする遺伝子の5’側にシグナル配列(Protein.,Eng.,Vol.1,No.6,p.499,1987)をコードする遺伝子を繋げ、この重鎖遺伝子をGSベクターpEE6.4(Lonza社)に挿入した。この二重特異的抗体の重鎖の塩基配列を配列番号1に、それによりコードされるアミノ酸配列を配列番号2に示す。配列番号2のアミノ酸番号1から117までのアミノ酸配列からなる領域は、抗ヒトTLR2抗体の重鎖可変領域である。配列番号2のアミノ酸番号118から221までのアミノ酸配列からなる領域は、ヒトIgγ1のCH1領域である。配列番号2のアミノ酸番号222から236までのアミノ酸配列からなる領域は、リンカー配列である。配列番号2のアミノ酸番号237から355までのアミノ酸配列からなる領域は、抗ヒトTLR4抗体の重鎖可変領域である。配列番号2のアミノ酸番号356から685までのアミノ酸配列からなる領域は、ヒトIgγ1の重鎖定常領域である。
配列番号1に示される塩基配列において抗ヒトTLR2抗体の重鎖可変領域をコードする部分(配列番号1の塩基番号1から351まで)と抗ヒトTLR4抗体の重鎖可変領域(配列番号1の塩基番号709から1065まで)を置き換えた塩基配列を有する重鎖遺伝子を作製し、タンデムフォームaの重鎖ベクターと同様にして重鎖のGSベクターを作製した。配列番号3に示される塩基配列において抗ヒトTLR2抗体の軽鎖をコードする部分(配列番号3の塩基番号1から324まで)と抗ヒトTLR4抗体の軽鎖をコードする部分(配列番号3の塩基番号811から1134まで)を置き換えた塩基配列を有する軽鎖ポリペプチド遺伝子を作製し、タンデムフォームaの軽鎖ポリペプチドベクターと同様にして軽鎖ポリペプチドのGSベクターを作製した。両GSベクターを用いて、タンデムフォームaと同様の方法で二重特異的抗体を発現させ、タンデムフォームbの精製抗体を得た。
配列番号4のアミノ酸配列からなる軽鎖ポリペプチドにおいてリンカー配列(配列番号4のアミノ酸番号215から270までのアミノ酸配列からなる)を((Gly)4Ser)3に置換した軽鎖ポリペプチドを用いることを除き、タンデムフォームaと同様の方法を用いて、参照の二重特異的抗体(タンデムフォームcと称する)を作製した。
タンデムフォームbの軽鎖ポリペプチドにおいてリンカー配列(配列番号9のアミノ酸配列からなる)を((Gly)4Ser)3に置換した軽鎖ポリペプチドを用いることを除き、タンデムフォームbと同様の方法を用いて、参照の二重特異的抗体(タンデムフォームdと称する)を作製した。
<DVD-Igフォームb>
参照抗体として、DVD-Ig型の二重特異的抗体(DVD-Igフォームbと称する)を作製した。該二重特異的抗体における抗ヒトTLR4抗体部分及び抗ヒトTLR2抗体部分の可変領域としては、タンデムフォームbで用いた各可変領域と同じ可変領域を用い、重鎖及び軽鎖の定常領域としては、それぞれヒトIgγ1定常領域及びヒトIgκ定常領域を用いた。培養及び精製方法としてはタンデムフォームbと同様の方法を用い、各精製抗体を得た。
参照抗体として、以下のIgG型の抗ヒトTLR2抗体(TLR2-IgGと称する)及び抗ヒトTLR4抗体(TLR4-IgGと称する)を作製した。
TLR2-IgG:タンデムフォームaで用いた抗ヒトTLR2抗体の重鎖可変領域及びヒトIgγ1定常領域を含む重鎖、並びにタンデムフォームaで用いた抗ヒトTLR2抗体の軽鎖可変領域及びヒトIgκ定常領域を含む軽鎖を含む、IgG抗体
TLR4-IgG:タンデムフォームaで用いた抗ヒトTLR4抗体の重鎖可変領域及びヒトIgγ1定常領域を含む重鎖、並びにタンデムフォームaで用いた抗ヒトTLR4抗体の軽鎖可変領域及びヒトIgκ定常領域を含む軽鎖を含む、IgG抗体
実施例1で作製したタンデムフォームa(外側に抗ヒトTLR2抗体部分を、内側に抗ヒトTLR4抗体部分を有する二重特異的抗体フォーマット)のヒトTLR4に対する結合活性を評価するために、細胞ELISAを実施した。参照抗体として、タンデムフォームc及びTLR4-IgGを用いた。ヒトTLR4/MD2発現HEK293細胞を、1×104cells/ウェルでBD BioCoat ポリD-リジン384ウェルプレート(ベクトンディッキンソン社)にα-MEM培地(ライフテクノロジーズ社)を用いて播種し、一晩培養した。翌日培地を捨てて、希釈液(1%ウシ血清由来アルブミン(BSA)及び10mM 2-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-エタンスルホン酸(HEPES)含有ハンクス緩衝塩溶液)で希釈した各精製抗体(タンデムフォームa、タンデムフォームc、又はTLR4-IgG)の希釈溶液(タンデムフォームa及びcは最終濃度100nMから0.00005nMの濃度域で、TLR4-IgGは最終濃度99nMから0.00005nMの濃度域で、それぞれ公比5倍の10段階希釈系列)を30μL添加した。37℃にて1時間培養した後、洗浄液(0.1%BSA及び10mM HEPES含有ハンクス緩衝塩溶液)にて洗浄し、洗浄液で5000倍に希釈したホースラディッシュぺルオキシダーゼ標識抗ヒトIgG抗体(DAKO社)を添加した。37℃にて1時間培養した後、洗浄液で洗浄し、呈色試薬であるTMB(MOSS社)25μLを加えた。20分後に1M硫酸25μLを添加して呈色反応を停止させ、その呈色強度をSafire II(テカン社)で測定することで、抗体の結合活性を評価した。得られた測定結果を用いて統計解析ソフトGraphPad Prism(GraphPad Software社)による4パラメータロジスティック曲線回帰から、各抗体の50%効果濃度(EC50)を算出した。
表1:ヒトTLR4に対する結合活性
実施例1で作製したタンデムフォームaのヒトTLR2への結合活性を評価するために、SPR解析を実施した。参照抗体として、タンデムフォームc及びTLR2-IgGを用いた。SPR解析においては、Biacore T200(GEヘルスケアジャパン社)を用いた。CM5センサーチップにHis Capture Kit(GEヘルスケアジャパン社、28-9950-56)とAmine Coupling Kit(GEヘルスケアジャパン社、BR-1000-50)を用いてAnti-His IgG(His Capture Kit付属)を固定した。流路No.1をリファレンスとし、この流路にはヒトTLR2蛋白質を結合させず、その他の流路(No.2)に、HBS-EP+ buffer(GEヘルスケアジャパン社、BR-1006-69)で0.66μg/mLに希釈したヒトTLR2蛋白質(R&D systems社、2616TR/CF)を流速5μL/分にて2分間添加し固相化させた。その後、各精製抗体(タンデムフォームa、タンデムフォームc、又はTLR2-IgG)をHBS-EP+ bufferで系列希釈した溶液(最終濃度100nMから0.781nMの濃度域で公比2倍の8段階希釈系列)を、流速50μL/分にて2分間添加し、精製抗体とTLR2の結合を測定した。次に、HBS-EP+ bufferを流速50μL/分にて5分間添加し、精製抗体とヒトTLR2の解離を測定した。Bivalent analyte model、RmaxをFit localで解析し、結合速度定数(ka)及び解離速度定数(kd)を算出し、kdをkaで割ることによって結合解離定数(KD)を算出した。
表2:ヒトTLR2に対する結合活性
実施例1のタンデムフォームaの作製において、Expi293細胞に代えてCHO-K1SV細胞で発現させることにより、タンデムフォームaを作製した。具体的には、CD-CHO medium(ライフテクノロジーズ社)で約1×107cells/mLに培養されたCHO-K1SV細胞(Lonza社)に対して、実施例1に記載のタンデムフォームaの重鎖及び軽鎖の両発現ベクターをエレクトロポレーション法を用いてトランスフェクトし、7日間培養した。培養上清をプロテインA又はプロテインGカラム(GEヘルスケアジャパン社)を用いて精製し、精製抗体を得た。
実施例4で作製したタンデムフォームaのヒトTLR4に対する中和活性を評価するために、ヒトTLR4/MD2を内在的に発現するヒト単球系細胞であるU937細胞を用いて、TLR4リガンドであるリポポリサッカライド(LPS)誘発IL-6産生阻害アッセイを実施した。参照抗体として、タンデムフォームc及びTLR4-IgGを用いた。
表4:ヒトTLR4に対する中和活性
実施例4で作製したタンデムフォームaのヒトTLR2に対する中和活性を評価するために、ヒトTLR2を内在的に発現するヒト単球系細胞であるU937細胞を用いて、TLR2リガンドであるPam2CSK4誘発IL-6産生阻害アッセイを実施した。参照抗体として、タンデムフォームc及びTLR2-IgGを用いた。
実施例1及び実施例4のタンデムフォームaの作製において、軽鎖ポリペプチドのリンカー中のプロテアーゼ認識配列(配列番号5)を各種細胞内プロテアーゼ認識配列(配列番号6、配列番号7、又は配列番号8)に置き換えた3種類のリンカー(それぞれ、配列番号10、配列番号11、又は配列番号12)を用いて、タンデムフォームaを作製した。本実施例で作製したタンデムフォームaについて、SDS-PAGEを実施した。さらに実施例2に記載の方法を用いてヒトTLR4に対する結合活性を評価した。但し、各精製抗体の希釈系列は、42nMから0.00002nMの濃度域で評価した。
表6:ヒトTLR4に対する結合活性
実施例1で作製したタンデムフォームb(外側に抗ヒトTLR4抗体部分を、内側に抗ヒトTLR2抗体部分を有する二重特異的抗体フォーマット)のヒトTLR4に対する中和活性を評価するために、実施例5で用いたLPS誘発IL-6産生阻害アッセイを実施した。被験抗体として、実施例1のタンデムフォームbの作製において、軽鎖ポリペプチドのリンカー中のプロテアーゼ認識配列(配列番号5)を各種細胞内プロテアーゼ認識配列(配列番号6、配列番号7、又は配列番号8)に置き換えた3種類のリンカー(それぞれ、配列番号10、配列番号11、又は配列番号12)を用いて、CHO-K1SV細胞で作製したタンデムフォームbを使用した。参照抗体として、タンデムフォームd及びTLR4-IgGを用いた。被験抗体の最終濃度に関して、最終濃度20nMから0.00001nMの濃度域でそれぞれ実施した。
表7:ヒトTLR4に対する中和活性
実施例8で作製したタンデムフォームbのヒトTLR2に対する中和活性を評価するために、実施例6で用いたPam2CSK4誘発IL-6産生阻害アッセイを実施した。参照抗体として、タンデムフォームd及びTLR2-IgGを用いた。被験抗体の最終濃度に関して、タンデムフォームb及びタンデムフォームdは最終濃度20nMから0.00001nMの濃度域で、TLR2-IgGは最終濃度19nMから0.00001nMの濃度域でそれぞれ実施した。
本発明の二重特異的抗体の可変領域における構造安定性を評価するために、示差走査熱量測定(Differential Scanning Calorimetry(DSC))による熱変性中間温度(Tm値)の評価を行った。タンデムフォームb及びDVD-Igフォームbの精製抗体を、20mM クエン酸及び120mM NaCl(pH6.0)の溶液で濃縮カセットVivapore5(Sartorius AG社)を用いてバッファー置換を行った。得られた各抗体溶液について、MicroCal VP-Capillary DSC(GEヘルスケアジャパン社)を用いて、約0.12mg/mLの蛋白質で、25℃から100℃まで1℃/分の昇温速度でDSC測定を行った。得られたDSCの変性曲線より、各抗体の可変領域のTm値を解析ソフトOrigin7(OriginLab社)を用いて算出した。
表8:DSC試験の結果
Claims (10)
- 二重特異的抗体であって、該二重特異的抗体は、2つの重鎖、2つの第1の軽鎖、及び2つの第2の軽鎖を含み、
該重鎖は、それぞれアミノ末端側から順に、第1の重鎖可変領域、CH1領域、第1のリンカー、第2の重鎖可変領域、及び重鎖定常領域を含み、
該第1の軽鎖は、それぞれアミノ末端側から順に、第1の軽鎖可変領域及び第1の軽鎖定常領域を含み、
該第2の軽鎖は、それぞれアミノ末端側から順に、第2の軽鎖可変領域及び第2の軽鎖定常領域を含み、
該第1の重鎖可変領域と該第1の軽鎖可変領域は、第1の抗原結合部位を形成し、
該第2の重鎖可変領域と該第2の軽鎖可変領域は、第2の抗原結合部位を形成し、
該第1の抗原結合部位及び該第2の抗原結合部位は互いに異なる抗原を認識する、
二重特異的抗体。 - 以下のa)~c):
a)請求項1に記載の二重特異的抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該二重特異的抗体の第1の軽鎖及び第2の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;
b)請求項1に記載の二重特異的抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該二重特異的抗体の第1の軽鎖及び第2の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞;並びに
c)請求項1に記載の二重特異的抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、並びに、該二重特異的抗体の第1の軽鎖及び第2の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞
から選択される、宿主細胞であって、
ここで、該二重特異的抗体の第1の軽鎖及び第2の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、該第1の軽鎖のカルボキシ末端に第2のリンカーを介して該第2の軽鎖のアミノ末端が連結されたポリペプチドをコードする塩基配列を含み、該第2のリンカーはプロテアーゼ認識配列を含むペプチドリンカーである、
宿主細胞。 - 第2のリンカーが細胞内プロテアーゼ認識配列を含むペプチドリンカーである、請求項2に記載の宿主細胞。
- 二重特異的抗体を生産する方法であって、請求項2に記載の宿主細胞を培養し、二重特異的抗体を発現させる工程を包含する、方法。
- 請求項4に記載の方法によって生産できる二重特異的抗体。
- 二重特異的抗体を生産する方法であって、請求項3に記載の宿主細胞を培養し、二重特異的抗体を発現させる工程を包含する、方法。
- 培養工程において宿主細胞内のプロテアーゼによって第2のペプチドリンカーが切断される、請求項6に記載の方法。
- 請求項6又は7に記載の方法によって生産できる二重特異的抗体。
- 請求項1に記載の二重特異的抗体の抗原結合フラグメント。
- Fab、Fab’、又はF(ab’)2である請求項9に記載の抗原結合フラグメント。
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Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2003531588A (ja) * | 2000-04-11 | 2003-10-28 | ジェネンテック・インコーポレーテッド | 多価抗体とその用途 |
JP2008538926A (ja) * | 2005-04-26 | 2008-11-13 | グライコフィ, インコーポレイテッド | 切断可能なリンカーを有する一本鎖抗体 |
JP2012510821A (ja) * | 2008-12-04 | 2012-05-17 | アボット・ラボラトリーズ | 二重可変ドメイン免疫グロブリンおよびその使用 |
JP2012530088A (ja) * | 2009-06-16 | 2012-11-29 | エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト | 二重特異性抗原結合タンパク質 |
WO2013006544A1 (en) * | 2011-07-06 | 2013-01-10 | Medimmune, Llc | Methods for making multimeric polypeptides |
WO2013119966A2 (en) * | 2012-02-10 | 2013-08-15 | Genentech, Inc. | Single-chain antibodies and other heteromultimers |
JP2013538204A (ja) * | 2010-08-24 | 2013-10-10 | ロシュ グリクアート アーゲー | 活性化可能な二重特異性抗体 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4816567A (en) * | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
US7612181B2 (en) | 2005-08-19 | 2009-11-03 | Abbott Laboratories | Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof |
EP2050764A1 (en) * | 2007-10-15 | 2009-04-22 | sanofi-aventis | Novel polyvalent bispecific antibody format and uses thereof |
WO2012123949A1 (en) | 2011-03-17 | 2012-09-20 | Ramot At Tel-Aviv University Ltd. | Bi- and monospecific, asymmetric antibodies and methods of generating the same |
-
2015
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Patent Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2003531588A (ja) * | 2000-04-11 | 2003-10-28 | ジェネンテック・インコーポレーテッド | 多価抗体とその用途 |
JP2008538926A (ja) * | 2005-04-26 | 2008-11-13 | グライコフィ, インコーポレイテッド | 切断可能なリンカーを有する一本鎖抗体 |
JP2012510821A (ja) * | 2008-12-04 | 2012-05-17 | アボット・ラボラトリーズ | 二重可変ドメイン免疫グロブリンおよびその使用 |
JP2012530088A (ja) * | 2009-06-16 | 2012-11-29 | エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト | 二重特異性抗原結合タンパク質 |
JP2013538204A (ja) * | 2010-08-24 | 2013-10-10 | ロシュ グリクアート アーゲー | 活性化可能な二重特異性抗体 |
WO2013006544A1 (en) * | 2011-07-06 | 2013-01-10 | Medimmune, Llc | Methods for making multimeric polypeptides |
WO2013119966A2 (en) * | 2012-02-10 | 2013-08-15 | Genentech, Inc. | Single-chain antibodies and other heteromultimers |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
MILLER K ET AL.: "Design, construction, and in vitro analyses of multivalent antibodies", J. IMMUNOL., vol. 170, no. 9, 2003, pages 4854 - 4861, XP002508787, ISSN: 1550-6606 * |
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