WO2016080399A1 - 哺乳動物の標的ゲノム領域にｄｎａをノックインする方法及び細胞 - Google Patents

哺乳動物の標的ゲノム領域にｄｎａをノックインする方法及び細胞 Download PDF

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    • C12N2800/10—Plasmid DNA

Definitions

  • the present invention relates to a method and a cell for knocking DNA into a target genomic region of a mammal.
  • a donor plasmid having a homologous sequence of about 500 ⁇ bp -1 kbp of the target genomic region at both ends of a knock-in sequence such as GFP is used.
  • the artificial nuclease By introducing a donor plasmid into a fertilized egg together with an artificial nuclease, the artificial nuclease introduces DSB into the target sequence, and using the homologous sequence of the donor plasmid, another DSB repair mechanism, homologous recombination (HR : Homologous recombination), a gene such as GFP is knocked into the target sequence (Non-Patent Documents 3 and 4).
  • single-stranded DNA ssODN: single-stranded oligodeoxynucleotides
  • ssODN single-stranded oligodeoxynucleotides
  • Single ssODN is a highly efficient DSB repair mechanism by artificially synthesizing ssODN containing homologous sequence of 40-60 bp at both ends across the base sequence to be introduced, and introducing it into fertilized eggs together with artificial nuclease It is possible to produce knock-in animals simply and efficiently using -strand annealing (SSA) (Non-patent Documents 5 and 6).
  • SSA -strand annealing
  • ssODN When ssODN is used, since it is knocked in using DSB repair mechanism SSA using single-stranded DNA different from HR, it has been reported that the efficiency is higher than in the case of donor plasmid (non-patent literature) 5, 6). However, since ssODN can only synthesize accurately up to about 200 bp, it is difficult to knock in long-chain gene sequences (several hundreds to several kilobps) such as GFP.
  • An object of the present invention is to provide a technique for efficiently performing DNA knock-in into a cell genome.
  • the present invention provides the following methods and cells.
  • Item 1 Introducing at least one artificial nuclease system G capable of cleaving one or two target sequences G of the cell genome, donor DNA and two kinds of single-stranded oligonucleotides (ssODN) into the cell, Cleaves one or two target sequences G on the cell genome to produce two double-stranded DNA break (DSB) sites on the cell genome, and the two types of ssODNs are generated by cleavage of the target sequence G in the cell genome.
  • ssODN single-stranded oligonucleotides
  • Up-ssODN complementary to one DSB site g1 and upstream introduction site D1 of donor DNA
  • Down-ssODN complementary to the other DSB site g2 of the cell genome and downstream introduction site D2 of donor DNA Yes, characterized in that donor DNA is knocked in between two DSB sites g1, g2 in one or two target sequences G of the cell genome by two types of ssODN (Up-ssODN and Down-ssODN), Methods for knocking donor DNA into the cell genome
  • Item 2. The method according to Item 1, wherein the donor DNA is a gene construct that can be expressed in a cell.
  • the donor DNA is a plasmid having 1 or 2 target sequences
  • the artificial nuclease system uses Cas9 nuclease and 1 or 2 guide RNA-G (gRNA-G) corresponding to 1 or 2 target sequences G of the cell genome.
  • gRNA-G guide RNA-G
  • the method according to Item 1 wherein an upstream introduction site D1 and a downstream introduction site D2 of donor DNA derived from a plasmid knocked in are generated.
  • Artificial nuclease system G that has one target sequence G on the cell genome and one target sequence D on the plasmid, and the artificial nuclease system contains Cas9 nuclease and guide RNA-G (gRNA-G) corresponding to the target sequence G And an artificial nuclease system D containing a Cas9 nuclease and a guide RNA-D (gRNA-D) corresponding to the target sequence D, gRNA-G contains the complementary strand of the target sequence G, and gRNA-D is the target sequence
  • the target sequence G is cleaved by the artificial nuclease system G containing the complementary strand of D to generate DSB sites g1 and g2 on the cell genome, and the target sequence D is cleaved by the artificial nuclease system D to remove the plasmid-derived donor DNA.
  • the upstream introduction site D1 and the downstream introduction site D2 are generated, and one DSB site g1 and the upstream DSB site D1 are combined with an upstream single-stranded oligonucleotide (Up-ssODN), and the other DSB site g2 is downstream Single-stranded oligo downstream of DSB site D2 Item 4.
  • gRNA-G1 Guide RNA-G1 (gRNA-G1), which has two target sequences G1, G2 on the cell genome and one target sequence D on the plasmid, and the artificial nuclease system corresponds to Cas9 nuclease and target sequences G1, G2, respectively.
  • gRNA-G2 includes artificial nuclease system G1, G2 containing guide RNA-G2 (gRNA-G2) and artificial nuclease system D containing Cas9 nuclease and guide RNA-D corresponding to target sequence D (gRNA-D)
  • gRNA-G1 and G2 contain the complementary strands of the target sequences G1 and G2, respectively
  • gRNA-D contains the complementary strand of the target sequence D
  • the target sequences G1 and G2 are cleaved by the artificial nuclease systems G1 and G2, and DSB is put on the cell genome Sites g1 and g2 are generated, and target sequence D is cleaved by artificial nuclease system D to generate upstream introduction site D1 and downstream introduction site D2 of plasmid-derived donor DNA.
  • One DSB site g1 and upstream DSB Link site D1 with upstream single-stranded oligonucleotide Up-ssODN
  • the other DSB sites g2 and downstream DSB sites D2 binds downstream single-stranded oligonucleotide (Down-ssODNs), Method according to claim 3.
  • Artificial nuclease system with one target sequence G on the cell genome and two target sequences D1 and D2 on the plasmid, and the artificial nuclease system contains Cas9 nuclease and guide RNA-G (gRNA-G) corresponding to the target sequence G, respectively Nuclease system G and Cas9 nuclease and artificial nuclease systems D1 and D2 containing guide RNA-D1 and D2 (gRNA-D1 and D2) corresponding to target sequences D1 and D2, including gRNA-G Artificial nuclease system that contains complementary strands, gRNA-D1 and D2 contain complementary strands of target sequences D1 and D2, and cleave target sequence G by artificial nuclease system G to generate DSB sites g1 and g2 on the cell genome The target sequences D1 and D2 are cleaved by D1 and D2 to generate the upstream introduction site D1 and the downstream introduction site D2 of the donor DNA derived
  • One DSB site g1 and one upstream DSB site D1 are upstream.
  • Stranded oligonucleotide (Up-ssODN) and the other DSB Position couples g2 and downstream DSB sites D2 downstream single-stranded oligonucleotide (Down-ssODN), Method according to claim 3.
  • Guide RNA-G1, G2 with two target sequences G1, G2 on the cell genome, two target sequences D1, D2 on the plasmid, and artificial nuclease system corresponding to Cas9 nuclease and target sequences G1, G2, respectively -G1, G2) including artificial nuclease systems G1, G2 and Cas9 nuclease and artificial RNA nuclei systems D1, D2 including guide RNA-D1, D2 (gRNA-D1, D2) corresponding to target sequences D1, D2 GRNA-G1 and G2 contain complementary strands of target sequences G1 and G2, respectively, gRNA-D1 and D2 contain complementary strands of target sequences D1 and D2, and target sequences G1 and G2 are converted by artificial nuclease systems G1 and G2.
  • DSB sites g1 and g2 Cleaves to generate DSB sites g1 and g2 on the cell genome, and cleaves target sequences D1 and D2 with artificial nuclease systems D1 and D2 to create upstream and downstream sites D1 and D2 of the plasmid-derived donor DNA.
  • Up-ssODN Attached at fault
  • Down-ssODN couples the other DSB sites g2 and downstream DSB sites D2 downstream single-stranded oligonucleotide
  • Item 8. The method according to any one of Items 1 to 7, wherein the cell is a fertilized egg.
  • Item 9. A cell in which all or part of a plasmid has been introduced into the genome.
  • Item 10. Item 10. The cell according to Item 9, wherein the plasmid is introduced into the genome at upstream and downstream DSB sites D1 and D2 generated by cleaving one or two target sequences D with Cas9.
  • Item 11. Item 11.
  • the cell according to Item 9 or 10 wherein the introduction position on the genome of the plasmid is between two DSB sites generated by cleaving one or two target sequences of the genome with Cas9.
  • Item 12. Item 12. The cell according to any one of Items 9 to 11, wherein the cell is a fertilized egg.
  • Item 13 A non-human mammal having a plasmid introduced into its genome, comprising the cell according to any one of Items 9 to 12. Item 14. Item 14. The non-human mammal according to Item 13, wherein a plasmid containing at least one gene derived from human is knocked in and humanized.
  • the present invention includes an artificial nuclease system, a donor DNA such as a donor plasmid vector that cannot homologous recombination because there is no homologous sequence of 18 bases or more continuous with the genome or one place, two types of ssODN together, a mouse, By microinjecting cells of mammals such as rats, particularly fertilized eggs, knock-in mammals can be produced with an efficiency several to several tens of times higher than that of conventional HR.
  • ssODN Up-ssODN
  • plasmid And Down-ssODN two types of ssODN (Up-ssODN) with homologous sequences of both the genome and the plasmid And Down-ssODN) can be used as “paste” to bond and repair the DSB sites of the genome and plasmid, respectively, so that the donor DNA can be knocked in accurately and efficiently onto a specific genome.
  • the method of the present invention is called 'SSA-mediated End Joining (SMEJ)'. It is also possible to replace a long gene sequence, gene cluster, or the like by cleaving a total of 3 or 4 sites, that is, 2 genomic sequences to be targeted and 1 or 2 plasmids.
  • Knock-in of any length of donor DNA (especially a plasmid vector) by targeting all DNA and promoter sequences on the mammalian genome with 'SMEJ' using an artificial nuclease system, donor DNA, and two types of ssODN simultaneously It becomes possible to do.
  • Advantages of the present invention are as follows. 1) Since knock-in animals can be produced with a high efficiency of 10-30% of individuals born by microinjection, it is possible to reduce the number of experimental test animals, shorten the experiment time, and increase the efficiency. 2) When a plasmid is used as donor DNA, it can be used as it is without adding a homologous sequence to any existing plasmid, so that complicated plasmid preparation work is unnecessary.
  • guide RNA related to two or more knock-ins is introduced into cells together with Cas9 nuclease and two or more donor DNAs. By doing so, two or more knock-ins can be performed simultaneously.
  • Two hit two oligo (2H2O) method Vector knock-in via ssODNs-mediated end joining Three hit two oligo (3H2O) method for gene replacement
  • Three hit two oligo (4H2O) method for gene replacement CAG-GFP Knock-in at the Rosa26 locus in rats using the 2H2O method Generation of GFP knock-in rats with CRISPR / Cas9
  • gRNA target sequence blue; CAGGGTTATTGTCTCATGAG
  • PAM sequence green; CGG
  • upstream yellow underline
  • downstream red underline
  • TTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCAT 6 primers used for PCR analysis
  • CRISPR cut site red ⁇ .
  • CRISPR-mediated KO / KI mutations at rat Rosa26 loci GFP expression in each organ of GFP knock-in rat (# 11: right) and control rat (left).
  • a brain, b: heart, c: thymus, d: pancreas, e: spleen, f: liver, g: kidney, h: fat, i: testis, j: large intestine.
  • gRNA upstream and downstream of the rat Cyp2d gene cluster Three types of gRNA upstream and downstream of the rat Cyp2d gene cluster, cleave the human CYP2D6 gene (CAG) plasmid (top), and two types of ssODN (ssODN-1 and ssODN-2) induce binding of the cleaved end DSB (Bottom).
  • Up-ssODN a single-stranded oligonucleotide complementary to both the upstream DSB site g1 of the genome and the upstream DSB site
  • the genome editing technique used in the present invention includes ZFN, TALEN, and CRISPR / Cas, with CRISPR / Cas being preferred.
  • ZFN Zinc finger nuclease refers to an artificial nuclease containing a nucleic acid cleavage domain conjugated to a binding domain containing a zinc finger array.
  • the cleavage domain is the cleavage domain of the type II restriction enzyme FokI.
  • Zinc finger nucleases can be designed so that any target sequence in a given genome to be cleaved can be cleaved.
  • TALEN transcriptional activator-like element nuclease
  • TALEN transcriptional activator-like element nuclease
  • TALEN transcriptional activator-like element nuclease
  • CRISPR Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats
  • Cas Cas
  • RGN nuclease
  • gRNA guide RNA
  • examples of the nuclease (RGN) include type I, II, and III, type II is preferable, and Cas9 is particularly preferable.
  • the nuclease used for CRISPR may be described as “Cas9 nuclease”, but nucleases other than Cas9 may be used.
  • GRNA includes a chimera in which the complementary strand of the target sequence of genomic DNA or donor DNA (including plasmid) adjacent to PAM, crRNA (CRISPR RNA) and tract RNA (trans-activating crRNA) are linked by an appropriate connecting sequence.
  • a preferred artificial nuclease system is composed of Cas9 nuclease and guide RNA, and cleaves the target sequence with DSB.
  • Artificial nuclease system G is the case where the target sequence of the genome is one place, and is composed of Cas9 nuclease and guide RNA-G, and DSB cleaves target sequence G to generate DSB sites g1 and g2.
  • Guide RNA-G has a complementary strand of target sequence G adjacent to PAM.
  • Artificial nuclease system G1 and artificial nuclease system G2 are cases where there are two target sequences in the genome.
  • Artificial nuclease system G1 is composed of Cas9 nuclease and guide RNA-G1, and the target sequence G1 is cleaved with DSB to upstream DSB site. yields g1.
  • the artificial nuclease system G2 is composed of Cas9 nuclease and guide RNA-G2, and DSB cleaves the target sequence G2 to generate a downstream DSB site g2.
  • Guide RNA-G1 has a complementary strand of target sequence G1 adjacent to PAM
  • guide RNA-G2 has a complementary strand of target sequence G2 adjacent to PAM.
  • Artificial nuclease system D cleaves target sequence D of donor DNA by DSB.
  • the artificial nuclease system D is preferably composed of Cas9 nuclease and guide RNA-D.
  • Guide RNA-D has a complementary strand of target sequence D adjacent to PAM.
  • 2A, 2B, 3 show the case where the donor DNA is a plasmid.
  • the donor DNA is a circular DNA such as a plasmid
  • upstream introduction site d1 and downstream introduction site d2 are generated simultaneously by DSB cleavage of one target sequence D.
  • the donor DNA is a chain DNA, either the upstream introduction site d1 or the downstream introduction site d2 is generated by DSB cleavage of one target sequence D.
  • the donor DNA is a plasmid having two target sequences D1 and D2, one of the two divided plasmids is knocked into the cell genome as donor DNA.
  • Artificial nuclease system (i) Combination of artificial nuclease system G and artificial nuclease system D (2H2O, Fig. 1), (ii) Combination of artificial nuclease system G1, artificial nuclease system G2 and artificial nuclease system D (3H2O, Fig.2A ), (Iii) a combination of artificial nuclease system G and artificial nuclease system D1 and artificial nuclease system D2 (3H2O), or (iv) a combination of artificial nuclease system G1, artificial nuclease system G2, artificial nuclease system D1 and artificial nuclease system D2. (4H2O, FIG. 2B).
  • the components of the artificial nuclease system are Cas9 nuclease, guide RNA-G, and guide RNA-D, and in (ii), Cas9 nuclease, guide RNA-G1, guide RNA-G2, and guide RNA.
  • Cas9 nuclease, guide RNA-G, guide RNA-D1 and guide RNA-D2 and in the case of (iv), Cas9 nuclease, guide RNA-G1 and guide RNA-G2 Guide RNA-D1 and guide RNA-D2.
  • Cas9 nuclease and guide RNA can be introduced into cells using plasmids, viral vectors, and the like that express them.
  • the length of the target sequence on the cell genome is not particularly limited, but when CRISPR / Cas is used, it is 17-27, preferably 18-25, more preferably 19-22, still more preferably 19- It is composed of 20, especially 20 bases.
  • the target sequence (sense strand or antisense strand) on the cell genome is adjacent to the PAM (proto-spacer adaptor motif) sequence, and the target sequence on the cell genome is adjacent to the PAM sequence. Can be determined by position.
  • the PAM sequence is not particularly limited, and examples thereof include NGG (N is an arbitrary base).
  • the target sequence on the genome may be one or two.
  • a predetermined sequence can be cut out, and a part of the genomic DNA can be replaced by inserting donor DNA into the cut out target genomic region.
  • the genomic DNA can be replaced by the 3 hit 2 oligo method (Fig. 2A).
  • the donor DNA can be inserted into the target sequence on the genome by the 2 hit 2 oligo method ( Figure 1).
  • FIG. 3 shows the method and result of knocking CAG-GFP into the rat Rosa26 locus using the 2H2O method
  • FIG. 4 shows the method and result of obtaining a GFP knock-in rat using CRISPR / Cas9.
  • donor DNA of the present invention any DNA can be used, but a gene construct or plasmid that can be expressed in cells is preferred. Since donor DNA is introduced into the target site in a chain form, when a circular plasmid is used as the donor DNA, a chain plasmid is generated by cutting inside the cell, and the genome is cleaved by the artificial nuclease system as the donor DNA. It is introduced into the DSB site. An artificial nuclease system D can be used to cleave the target sequence D on the plasmid.
  • the target sequence D is determined by flanking the PAM sequence of the plasmid, and the target sequence is flanked by one or two PAM sequences of the genome (if the genome contains one target sequence, such as 2H2O, the target sequence G, When the genome contains two target sequences, such as 3H2O, by determining the target sequences G1 and G2), both the genomic and plasmid target sequences can be cleaved together by an artificial nuclease system.
  • the genomic target sequence and the plasmid target sequence may be the same or different.
  • an artificial nuclease system that can cleave two or three target sequences (eg, a combination of artificial nuclease systems G and D, artificial nuclease system G1 and A combination of G2 and D) can be used.
  • a DSB cleavage site (for example, “ ⁇ ” (2 places) in FIG. 5d, “ ⁇ ” in FIGS. 6 and 7) is generated inside the target sequence.
  • the length of the donor DNA is not particularly limited, but usually 10 bp or more, 20 bp or more, 40 bp or more, 80 bp or more, 200 bp or more, 400 bp or more, 800 bp or more, 1 kbp or more, 2 kbp or more, 3 kbp or more, 4 kbp or more, 8 kbp or more, 10 kbp or more 20 kbp or more, 40 kbp or more, 80 kbp or more, 100 kbp or more, or 200 kbp or more.
  • An advantage of the method of the present invention is that even a very long donor DNA of 200 kbp or more can be efficiently introduced.
  • the donor DNA may be derived from a host different from the host. For example, a donor DNA derived from a human can be knocked into a mammalian genome other than a human.
  • Donor DNA may be a single gene, and the gene cluster region can be knocked in as donor DNA.
  • SsODN used in the present invention has a complementary sequence at one DSB end site of the genomic cleavage site and one end of the donor DNA.
  • the donor DNA can be bound as a “glue” to the genomic cleavage site, which can greatly increase the efficiency of the knock-in.
  • the length of the ssODN sequence complementary to each end is 10 to 100 bases, preferably 12 to 80 bases, more preferably 15 to 60 bases, and even more preferably 20 to 40 bases.
  • the total length of ssODN having a typical sequence is 20 to 200 bases, preferably 24 to 160 bases, more preferably 30 to 120 bases, and further preferably 40 to 80 bases.
  • knock-in includes both insertion and replacement of donor DNA into the genome.
  • the cells used in the present invention are arbitrary cells, and include pluripotent stem cells such as somatic cells, ES cells, and iPS cells, fertilized eggs, etc., and fertilized eggs can easily be genetically modified mammals in which donor DNA is knocked in Therefore, it is preferable.
  • pluripotent stem cells such as somatic cells, ES cells, and iPS cells, fertilized eggs, etc.
  • fertilized eggs can easily be genetically modified mammals in which donor DNA is knocked in Therefore, it is preferable.
  • mammals in which all drug-metabolizing enzymes are humanized
  • human disease model animals into which at least one gene involved in human diseases has been introduced model mammals in which genes related to specific organs and tissues are all humanized, etc. It can be easily obtained by the method.
  • Up-ssODN contains sequences complementary to both the upstream (5 ′) d1 of the sense strand encoding the gene of the donor DNA and one DSB site g1 of the genome.
  • Down-ssODN is the donor Complementary sequences are included in both the downstream (3 ′) d2 of the sense strand encoding the gene of DNA and the other DSB site g2 of the genome (FIGS. 1 to 3).
  • the DSB site of the genome and the upstream or downstream introduction site of the donor DNA may be directly linked, and mutations such as insertion or deletion may occur between them. In either case, the gene in the donor DNA can function.
  • ssODNs act in the nucleus by microinjecting fertilized eggs and can increase the efficiency of knock-in. Microinjection in a fertilized egg can be performed efficiently in knocking of donor DNA regardless of whether it is performed in the cytoplasm or in the nucleus.
  • Mammals include humans, mice, rats, rabbits, goats, dogs, cats, cows, pigs, monkeys and the like.
  • the present invention further includes cells in which a plasmid is introduced into the genome, or 300 bp or more, 500 bp or more, 1 kbp or more, 2 kbp or more, 3 kbp or more, 5 kbp or more, 10 kbp or more, 20 kbp or more, 30 kbp or more, 50 kbp or more, 100 kbp or more, 200 kbp or more. It relates to cells into which long DNA (gene construct) has been inserted. Conventionally, there is no cell into which a plasmid or long donor DNA has been introduced, and a novel cell is provided by the present invention.
  • a particularly preferred embodiment of the present invention is a non-human mammal obtained by knocking in donor DNA into a fertilized egg.
  • the insertion of the plasmid or long donor DNA may be confirmed by sequencing, or the protein of the expression product may be confirmed by Western blotting or the like.
  • the artificial nuclease system performs double-strand breaks (DSB) on the target genomic sequence and donor DNA sequence as 'scissors', and two types of ssODN bind and repair the genome and donor DNA as 'paste', Donor DNA is knocked in accurately and efficiently on a specific genome.
  • DSB double-strand breaks
  • ssODN bind and repair the genome and donor DNA as 'paste'
  • Donor DNA is knocked in accurately and efficiently on a specific genome.
  • Long gene sequences, gene clusters, and the like can be replaced by cleaving the target genomic sequence at two sites and the plasmid at one or two sites.
  • Example 1 (1) Experimental method A Cas9 expression plasmid (hCas9: Addgene ID # 41815) and a gRNA expression plasmid (pDR274: Addgene ID # 42250) obtained from Addgene (www.addgene.org/CRISPR) were used in this experiment.
  • the Cas9 expression plasmid was improved by introducing a T7 promoter upstream of the Cas9 gene.
  • the pCAG plasmid was obtained from RIKEN BioResource Center, and the GFP gene and human CYP2D6 gene were introduced.
  • Target sequences were determined using CRISPR Design Tool (crispr.genome-engineering.org), and gRNA expression plasmids that recognize them were prepared (Table 1).
  • Cas9 mRNA was prepared by sequentially performing in vitro transcription, poly A addition reaction, and RNA purification using a Cas9 expression plasmid.
  • gRNA was prepared by in vitro transcription and RNA purification.
  • ssODN having a homologous sequence of the cleavage site on the genome and the plasmid cleavage site was designed and obtained (Table 2).
  • Sexually mature Wistar Jcl female rats were treated with superovulation and fertilized eggs were obtained by natural mating.
  • mice obtained fertilized eggs using females of the C57BL / 6JJcl line.
  • 100 ⁇ g / ml Cas9 mRNA, 50 ⁇ g / ml gRNA each, 50 ⁇ g / ml ssODN, 5 ⁇ g / ml plasmid mixed solution was prepared with RNase free water and microinjected into the male pronucleus of fertilized eggs.
  • the injected fertilized eggs were cultured overnight under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 , and then transplanted into ovipregnant female rats or mice. She delivered about 3 weeks after transplantation.
  • GFP-positive individuals were selected from the obtained litters using a GFP fluorescence confirmation light.
  • tissues were collected from offspring, DNA was extracted, and introduction of the plasmid into the genome target sequence was confirmed by PCR, electrophoresis, and sequence analysis using the primers shown in Table 3.
  • the details of the experimental method are described in the reference (Nat Commun. 2014 Jun 26; 5: 4240.). This reference is incorporated herein by reference.
  • (2) Experimental results uses CRIPSR / Cas9 scissors to simultaneously cleave the target sequence in the rat Rosa26 gene and the target sequence in the pCAG-GFP plasmid. Used to knock-in pCAG-GFP accurately and efficiently into rat Rosa26 (FIG. 5a).
  • a target sequence was designed between the first exon and the second exon of the rat Rosa26 gene and upstream of the CAG promoter of pCAG-GFP to prepare gRNA (Table 1, FIGS. 6 and 7).
  • ssODN was designed to bind upstream of the Rosa26 cleavage site and downstream of the pCAG plasmid cleavage site, and downstream of the Rosa26 cleavage site and upstream of the pCAG-GFP cleavage site (Table 2).
  • systemic GFP expression was observed in 4 out of the 17 offspring obtained (Table 4, FIG. 5b).
  • the 6th individual was found to have a deletion of 6 bases upstream, and the 7th individual was confirmed to have multiple bases inserted or deleted at both upstream and downstream ends.
  • knock-out mutations were confirmed in 15 animals (FIG. 8).
  • the plasmid knock-in mutation obtained in the 11th individual was stably transmitted to the offspring. Also, no off-target sequence mutation was observed. As a result of pathological analysis, it was confirmed that GFP was stably expressed in systemic organs in this knock-in strain (FIG. 9).
  • the target sequence was designed between the first and second exons of the Rosa26 gene in the same manner as in the rat, and gRNA and ssODN were prepared (FIG. 10, Tables 1 and 2).
  • gRNA and ssODN were prepared (FIG. 10, Tables 1 and 2).
  • gRNA and ssODN were prepared (FIG. 10, Tables 1 and 2).
  • pCAG-GFP As a result of introducing mouse Rosa26 target site-specific gRNA and ssODN together with pCAG-GFP, GFP expression in the whole body was observed in 3 out of 31 obtained offspring (Table 4) (FIG. 11a).
  • PCR As a result of PCR, amplification of GFP-specific sequence was observed in the 1st, 10th and 17th individuals.
  • mouse Rosa26 primer and pCAG-GFP primer it was confirmed that all three individuals were incorporated into the Rosa26 region (FIG. 11b).
  • rat Cyp2d gene cluster (Cyp2d1-5) was replaced with the human CYP2D6 gene for the CYP2D6 gene, a member of the cytochrome P450 (CYP) group that is the central enzyme of drug metabolism (FIG. 13a).
  • the target sequence was designed at a total of 3 sites, 2 sites upstream and downstream of the rat Cyp2d gene cluster, and 1 site upstream of the pCAG plasmid (pCYP2D6) incorporating the CYP2D6 gene, and gRNA was prepared (FIG. 14, Table 1). .
  • ssODN was designed to connect the upstream of the Cyp2d cluster cleavage site and the downstream of the plasmid cleavage site, and the downstream of the Cyp2d cluster cleavage site and the upstream of the plasmid cleavage site (Table 2). These were introduced into fertilized eggs together with pCYP2D6 (Table 4). As a result of PCR, amplification of CYP2D6 specific sequence was observed in the No. 1, 3, 8, and 18 individuals (FIG. 13b). In order to confirm the incorporation into the Cyp2d cluster region, a combination of rat Cyp2d primer and pCYP2D6 primer was examined. As a result, amplification was observed in the 18th individual.
  • the present invention not only knockout by the artificial nuclease ZFN / TALEN / CRISPR but also knock-in using various donor plasmids, that is, 'free genome editing' becomes possible. It is possible to introduce a reporter gene such as a GFP fluorescent protein into a stable expression staining region such as the Rosa26 locus, or to bind a reporter gene to the N-terminus or C-terminus of the target gene. Take your business forward.
  • the present invention it is possible to efficiently produce a so-called “genomic humanized animal” in which a mammalian gene is disrupted and a human gene is introduced. It becomes possible to produce disease model animals having genes of various human diseases, or humanized model animals having genes relating to the origin of civilization.
  • the newly developed genetically modified model animal is widely used not only for experimental animals but also for drug discovery, regenerative medicine research and the like.

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Abstract

本発明は、細胞ゲノムの標的配列を切断可能な少なくとも１つの人工ヌクレアーゼシステム、ドナーDNA及び二種類の一本鎖オリゴヌクレオチド(ssODN)を細胞に導入する工程を含み、前記人工ヌクレアーゼシステムは細胞ゲノム上の標的配列を切断し、二種類のssODNは各々細胞ゲノムの標的配列の切断により生じた各端部とドナーDNAの各導入末端に相補性を有し、ドナーDNAは、二種類のssODNを介して切断部位にノックインされることを特徴とする、ドナーDNAを細胞ゲノムにノックインする方法を提供するものである。　

Description

哺乳動物の標的ゲノム領域にＤＮＡをノックインする方法及び細胞
　本発明は、哺乳動物の標的ゲノム領域にDNAをノックインする方法及び細胞に関する。
　近年、マウスやラット等の哺乳動物において、人工ヌクレアーゼZFN/TALEN/CRISPRを受精卵にマイクロインジェクションすることにより、簡単に遺伝子改変動物を作製することが可能になった。人工ヌクレアーゼは、標的遺伝子に二本鎖DNA切断（DSB: double strand break）を導入し、DSB修復機構の一つである非相同末端結合（NHEJ: non-homologous end joining）により挿入欠失変異が導入されることで、標的遺伝子が破壊されたノックアウト動物が作製される。従来のES細胞を用いた遺伝子改変技術よりも短期間、低費用かつ効率的にノックアウト動物を作製することが可能なことから、遺伝子改変動物の作製技術として広く利用されるようになっている（非特許文献１，２）。
　人工ヌクレアーゼを利用して、標的とするゲノム領域（あるいは遺伝子）にGFP等の遺伝子を導入するノックインの試みも行われている。GFP等のノックイン配列の両端に、標的とするゲノム領域の相同配列約500 bp － 1kbpを有するドナープラスミドを利用する。ドナープラスミドを人工ヌクレアーゼと一緒に受精卵に導入することで、人工ヌクレアーゼが標的配列にDSBを導入し、ドナープラスミドの相同配列を利用して、もう一つのDSB修復機構である相同組換え（HR: homologous recombination）により、GFP等の遺伝子が標的配列にノックインされる（非特許文献３，４）。
　また、ドナープラスミドを使わない方法として、一本鎖DNA（ssODN: single-stranded oligodeoxynucleotides）を用いることで、標的遺伝子の一塩基置換や、HisタグやLoxP等の数十bp以下の短いDNA配列を導入することができる。導入したい塩基配列を挟んで、両端に40-60 bpの相同配列を含むssODNを人工的に合成して、人工ヌクレアーゼと一緒に受精卵に導入することで、高効率なDSB修復機構であるSingle-strand annealing (SSA)を利用して 、簡単かつ効率的にノックイン動物を作製することが可能である（非特許文献５，６）。
　ドナープラスミドを利用してノックインを行う際には、ノックインしたい遺伝子を含むプラスミドに、標的とするゲノム領域の相同配列を付加する必要がある。従来、相同配列をPCR等で増幅して、ライゲーションおよび大腸菌でクローニングしてドナープラスミドを作製するため、時間と手間がかかる。また、通常、哺乳動物細胞や受精卵のDSB修復においては、HR効率がNHEJ効率より極端に低いことが報告されており、人工ヌクレアーゼと一緒にドナープラスミドをマイクロインジェクションしても、ノックアウト動物に比べてノックイン動物の作製効率は著しく低い（非特許文献３，７）。
　ssODNを利用した場合は、HRとは異なる一本鎖DNAを利用したDSB修復機構SSAを利用してノックインされるので、ドナープラスミドの場合よりも効率が高いことが報告されている（非特許文献５、６）。しかし、ssODNは200 bp程度までの長さしか正確に合成できないために、GFP等の長鎖遺伝子配列（数百から数キロbp）をノックインすることは困難である。
Hsu PD et al. Cell 2014 Mashimo T. Dev Growth Differ 2014 Cui X et al. Nat Biotechnol 2011 Yang H et al. Cell 2013 Wang H et al. Cell 2013 Yoshimi K et al. Nat Commun 2014 Ponce de Leon V et al. PLoS One 2014 Olsen PA et al. DNA Repair 2009 Radecke S et al. Mol Ther 2010
　本発明は細胞のゲノムへのDNAのノックインを効率的に行う技術を提供することを目的とする。
　本発明は、以下の方法及び細胞を提供するものである。
項１．　細胞ゲノムの1又は2の標的配列Gを切断可能な少なくとも１つの人工ヌクレアーゼシステムG、ドナーDNA及び二種類の一本鎖オリゴヌクレオチド(ssODN)を細胞に導入する工程を含み、前記人工ヌクレアーゼシステムGは細胞ゲノム上の１又は２の標的配列Gを切断して細胞ゲノム上に2つの二本鎖DNA切断(DSB)部位を生じさせ、二種類のssODNは細胞ゲノムの標的配列Gの切断により生じた一方のDSB部位g1とドナーDNAの上流側導入部位D1に相補性を有するUp-ssODN並びに細胞ゲノムの他方のDSB部位g2とドナーDNAの下流側導入部位D2に相補性を有するDown-ssODNであり、二種類のssODN（Up-ssODNとDown-ssODN）により細胞ゲノムの1つ又は2つの標的配列Gにおける2つのDSB部位g1,g2の間にドナーDNAがノックインされることを特徴とする、ドナーDNAを細胞ゲノムにノックインする方法。　
項２．　ドナーＤＮＡが細胞内で発現可能な遺伝子構築物である、項１に記載の方法。
項３．　ドナーＤＮＡが1又は2の標的配列を有するプラスミドであり、人工ヌクレアーゼシステムは、Cas9ヌクレアーゼと細胞ゲノムの1又は2の標的配列Gに対応する1又は2のガイドRNA-G(gRNA-G)を含む人工ヌクレアーゼシステムGと、Cas9ヌクレアーゼとドナーDNAの1又は2の標的配列Dに対応する1又は2のガイドRNA-D(gRNA-D)を含む人工ヌクレアーゼシステムDを包含し、人工ヌクレアーゼシステムGにより細胞ゲノムの1又は2の標的配列Gを切断して細胞ゲノム上にDSB部位g1,g2を生じさせ、人工ヌクレアーゼシステムDによりドナーDNAプラスミド上の1又は2の標的配列Dを切断してゲノムにノックインされるプラスミド由来のドナーＤＮＡの上流側導入部位D1と下流側導入部位D2を生じさせる、項１に記載の方法。
項４．　細胞ゲノム上に1つの標的配列G、プラスミド上に1つの標的配列Dを有し、人工ヌクレアーゼシステムがCas9ヌクレアーゼと標的配列Gに対応するガイドRNA-G(gRNA-G)を含む人工ヌクレアーゼシステムGと、Cas9ヌクレアーゼと標的配列Dに対応するガイドRNA-D(gRNA-D)を含む人工ヌクレアーゼシステムDとを包含し、gRNA-Gが標的配列Gの相補鎖を含み、gRNA-Dが標的配列Dの相補鎖を含み、人工ヌクレアーゼシステムGにより標的配列Gを切断して細胞ゲノム上にDSB部位g1,g2を生じさせ、人工ヌクレアーゼシステムDにより標的配列Dを切断してプラスミド由来のドナーＤＮＡの上流側導入部位D1と下流側導入部位D2を生じさせ、一方のDSB部位g1と上流側DSB部位D1を上流側一本鎖オリゴヌクレオチド（Up-ssODN）で結合し、他方のDSB部位g2と下流側DSB部位D2を下流側一本鎖オリゴヌクレオチド（Down-ssODN）で結合する、項３に記載の方法。
項５．　細胞ゲノム上に2つの標的配列G1、G2、プラスミド上に1つの標的配列Dを有し、人工ヌクレアーゼシステムがCas9ヌクレアーゼと標的配列G1,G2に各々対応するガイドRNA-G1(gRNA-G1) 、ガイドRNA-G2(gRNA-G2)を含む人工ヌクレアーゼシステムG1、G2と、Cas9ヌクレアーゼと標的配列Dに対応するガイドRNA-D(gRNA-D)を含む人工ヌクレアーゼシステムDとを包含し、gRNA-G1、G2が各々標的配列G1、G2の相補鎖を含み、gRNA-Dが標的配列Dの相補鎖を含み、人工ヌクレアーゼシステムG1、G2により標的配列G1,G2を切断して細胞ゲノム上にDSB部位g1,g2を生じさせ、人工ヌクレアーゼシステムDにより標的配列Dを切断してプラスミド由来のドナーＤＮＡの上流側導入部位D1と下流側導入部位D2を生じさせ、一方のDSB部位g1と上流側DSB部位D1を上流側一本鎖オリゴヌクレオチド（Up-ssODN）で結合し、他方のDSB部位g2と下流側DSB部位D2を下流側一本鎖オリゴヌクレオチド（Down-ssODN）で結合する、項３に記載の方法。
項6．　細胞ゲノム上に1つの標的配列G、プラスミド上に2つの標的配列D1、D2を有し、人工ヌクレアーゼシステムがCas9ヌクレアーゼと標的配列Gに各々対応するガイドRNA-G(gRNA-G)を含む人工ヌクレアーゼシステムGと、Cas9ヌクレアーゼと標的配列D1、D2に対応するガイドRNA-D1、D2(gRNA-D1、D2)を含む人工ヌクレアーゼシステムD1、D2とを包含し、gRNA-Gが標的配列Gの相補鎖を含み、gRNA-D1、D2が標的配列D1、D2の相補鎖を含み、人工ヌクレアーゼシステムGにより標的配列Gを切断して細胞ゲノム上にDSB部位g1,g2を生じさせ、人工ヌクレアーゼシステムD1、D2により標的配列D1、D2を切断してプラスミド由来のドナーＤＮＡの上流側導入部位D1と下流側導入部位D2を生じさせ、一方のDSB部位g1と上流側DSB部位D1を上流側一本鎖オリゴヌクレオチド（Up-ssODN）で結合し、他方のDSB部位g2と下流側DSB部位D2を下流側一本鎖オリゴヌクレオチド（Down-ssODN）で結合する、項３に記載の方法。
項7．　細胞ゲノム上に2つの標的配列G1、G2、プラスミド上に2つの標的配列D1、D2を有し、人工ヌクレアーゼシステムがCas9ヌクレアーゼと標的配列G1,G2に各々対応するガイドRNA-G1,G2(gRNA-G1,G2) を含む人工ヌクレアーゼシステムG1、G2と、Cas9ヌクレアーゼと標的配列D1、D2に対応するガイドRNA-D1、D2(gRNA-D1、D2)を含む人工ヌクレアーゼシステムD1、D2とを包含し、gRNA-G1、G2が各々標的配列G1、G2の相補鎖を含み、gRNA-D1、D2が標的配列D1、D2の相補鎖を含み、人工ヌクレアーゼシステムG1、G2により標的配列G1,G2を切断して細胞ゲノム上にDSB部位g1,g2を生じさせ、人工ヌクレアーゼシステムD1、D2により標的配列D1、D2を切断してプラスミド由来のドナーＤＮＡの上流側導入部位D1と下流側導入部位D2を生じさせ、一方のDSB部位g1と上流側DSB部位D1を上流側一本鎖オリゴヌクレオチド（Up-ssODN）で結合し、他方のDSB部位g2と下流側DSB部位D2を下流側一本鎖オリゴヌクレオチド（Down-ssODN）で結合する、項３に記載の方法。
項8．　前記細胞が受精卵である、項１～7のいずれか１項に記載の方法。
項9．　プラスミドの全部または一部がゲノムに導入された細胞。
項10．　前記プラスミドは1又は2の標的配列DをCas9により切断することにより生じた上流側及び下流側DSB部位D1,D2でゲノムに導入されてなる、項9に記載の細胞。
項11．　プラスミドのゲノム上の導入位置は、ゲノムの１又は２の標的配列をCas9により切断することにより生じた2つのDSB部位の間である、項9又は10に記載の細胞。
項12．　細胞が受精卵である、項9～11のいずれかに記載の細胞。
項13．　項9～12のいずれか１項に記載の細胞を含む、プラスミドがゲノムに導入された非ヒト哺乳動物。
項14．　ヒト由来の少なくとも１つの遺伝子を含むプラスミドがノックインされてヒト化された項13に記載の非ヒト哺乳動物。
　本発明は、人工ヌクレアーゼシステム、ゲノムと連続する18塩基以上の相同配列が無いか1か所であるため相同組換えができないドナープラスミドベクターなどのドナーDNA、二種類のssODNを一緒に、マウス、ラットなどの哺乳動物の細胞、特に受精卵にマイクロインジェクションすることで、従来のHRよりも数倍から数十倍の効率でノックイン哺乳動物を作製することが可能となる。人工ヌクレアーゼシステムによる「はさみ(ヌクレアーゼ)」）が、ゲノム標的配列と必要な場合にはさらにプラスミド配列においてDSBを誘導して、ゲノムとプラスミドの両方の相同配列を持つ二種類のssODN（Up-ssODNとDown-ssODN）が‘のり’としてゲノムとプラスミドのDSB部位同士をそれぞれ結合修復することで、ドナーDNAを特定のゲノム上に正確かつ効率的にノックインすることが可能となる。DSB修復機構SSAを利用して、ゲノム配列上DSB末端とドナーDNA配列DSB末端とを結合することから本発明の方法を‘SSA-mediated End Joining (SMEJ)’と呼ぶ。また、標的とするゲノム配列を2箇所、プラスミドを1箇所又は2箇所の合計3箇所又は4箇所を切断することで、長い遺伝子配列や遺伝子クラスター等を置換することも可能である。
　人工ヌクレアーゼシステム、ドナーDNA、二種類のssODNを同時に利用した‘SMEJ’により、哺乳動物ゲノム上のあらゆる遺伝子やプロモーター等のDNA配列を標的として、あらゆる長さのドナーDNA(特にプラスミドベクター)をノックインすることが可能となる。本発明のメリットは、１）マイクロインジェクションにより産まれてきた個体の10-30％の高効率でノックイン動物を作製できることから、実験供試動物の削減、実験時間の短縮、効率化が期待できる。２）ドナーDNAとしてプラスミドを使用する場合、あらゆる既存プラスミドに相同配列を付加することなくそのまま利用することできるため、煩雑なプラスミド準備作業が不要である。３）人工ヌクレアーゼCRISPRを利用する場合、Cas９ヌクレアーゼとgRNAの準備に数日から1週間、ssODNの合成に数日かかるだけで、実験計画から短期間でインジェクションを実施できる。４）これまでのES細胞等による遺伝子改変技術では困難であった200kb以上の長いBAC(bacterial artificial chromosome)プラスミドを用いたノックイン、遺伝子クラスター領域の置換も可能である。５）マウス、ラットだけでなく、受精卵が利用できるあらゆる実験動物（ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）に利用可能である。
　本発明は、ゲノム上の1か所にドナーDNAをノックインする方法として明細書中で説明されているが、2以上のノックインに関わるガイドRNAをCas9ヌクレアーゼ、2以上のドナーDNAとともに細胞内に導入することで、2以上のノックインを同時に行うことができる。
Two hit two oligo (2H2O) method: Vector knock-in via ssODNs-mediated end joining Three hit two oligo (3H2O) method for gene replacement Four hit two oligo (4H2O) method for gene replacement 2H2O法を用いたラットのRosa26遺伝子座でのCAG-GFP Knock-in Generation of GFP knock-in rats with CRISPR/Cas9 (a) SMEJ法のノックインの模式図。2種類のgRNAがラットRosa26遺伝子のイントロン１とpCAG-GFPプラスミドを切断して（上）、2種類のssODN(ssODN-1 and ssODN-2)が切断末端DSBの結合を誘導する（下）。(b) GFPが導入されたラット。(c) 14匹のラット産仔のPCR解析。(d) GFP陽性個体（#6, 7, 8, 11）のシークエンス解析。 ラットRosa26遺伝子のDNA配列。gRNAの標的配列（青; CGTGATCTGCAACTGGAGTC）およびPAM配列（緑; CCT）、ssODNの上流（黄下線; CCCTGGGCCTGGAAGATTCCCTTCCCCCTTCTTC）および下流（赤下線; GATCTGCAACTGGAGTCTTTCTGGAAGATAGGCGGGAGTC）、PCR解析用に使われたプライマー（ボックス）。CRISPRによる切断部位（赤色▼）。 pCAG-GFPプラスミドのDNA配列。gRNAの標的配列（青; CAGGGTTATTGTCTCATGAG）およびPAM配列（緑;CGG）、ssODNの上流（黄下線; GAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAA）および下流（赤下線; TTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCAT）、PCR解析用に使われたプライマー（6つのボックス）。CRISPRによる切断部位（赤色▼）。 マイクロインジェクションにより得られたラット産仔17匹におけるラットRosa26遺伝子のシークエンス解析。さまざまなノックアウト、ノックイン変異が確認された。CRISPR-mediated KO/KI mutations at rat Rosa26 loci. GFPノックインラット（#11：右）および対照ラット（左）の各臓器におけるGFP発現。a：脳、b：心臓、c：胸腺、d：膵臓、e：脾臓、f：肝臓、g：腎臓、h：脂肪、i：精巣、j：大腸。 マウスRosa26遺伝子のDNA配列。gRNAの標的配列（青; CGTGATCTGCAACTCCAGTC）およびPAM配列（緑; CCT）、ssODNの上流（黄下線; GCCCTGGGCCTGGGAGAATCCCTTCCCCCTCTTCCCTCGT）および下流（赤下線; GATCTGCAACTCCAGTCTTTCTAGAAGATGGGCGGGAGTC）、PCR解析用に使われたプライマー（4つのボックス）。CRISPRによる切断部位（赤色▼）。 (a) SMEJ法によりマウスRosa26遺伝子内にpCAG-GFPプラスミドが導入されたラット。(b) 6匹のラット産仔のPCR解析。(c) GFP陽性個体（#1,10, 17）のシークエンス解析。 マイクロインジェクションにより得られたマウス産仔6匹におけるマウスRosa26遺伝子のシークエンス解析。さまざまなノックアウト、ノックイン変異が確認された。CRISPR-mediated KO/KI mutations at rat Rosa26 loci. (a) SMEJ法による遺伝子置換の模式図。3種類のgRNAがラットCyp2d遺伝子クラスタの上流と下流、ヒトCYP2D6遺伝子（CAG）プラスミドを切断して（上）、2種類のssODN(ssODN-1 and ssODN-2)が切断末端DSBの結合を誘導する（下）。(b) 23匹のラット産仔のPCR解析。(c)ヒトCYP2D6に置換された個体（#18）、ラットCyp2dクラスタ欠失個体（#2）のシークエンス解析。 ラットCyp2d遺伝子クラスタのDNA配列。gRNAの標的配列（青;CCGTCTCTTCAGGGTAACTG）およびPAM配列（緑; TGG）、ssODN配列（青下線; CTAGTGACAGGGCCTGGTGCCCAGGAGTCAGGCAAAACACCTACCGTCTCTTCAGGGTAA）、PCR解析用に使われたプライマー（8つのボックス）、CRISPRによる切断部位（赤色▼）を示している。 マイクロインジェクションにより得られたラット産仔23匹におけるラットCyp2d遺伝子クラスタの上流および下流のシークエンス解析。さまざまなノックアウト、ノックイン変異が確認された。
　図面において、以下の略号を使用する。
(g1)：標的配列G又はG1が人工ヌクレアーゼシステムG又はG1により切断されたときに上流側DSB部位g1を生じる潜在的g1、
(g2)：標的配列G又はG2が人工ヌクレアーゼシステムG又はG2により切断されたときに下流側DSB部位g2を生じる潜在的g2、
(d1)：標的配列D又はD1が人工ヌクレアーゼシステムD又はD1により切断されたときに上流側DSB部位d1を生じる潜在的d1、
(d2)：標的配列D又はD2が人工ヌクレアーゼシステムD又はD2により切断されたときに下流側DSB部位d2を生じる潜在的d1、
Up-ssODN：ゲノムの上流側DSB部位g1とドナーDNAの上流側DSB部位d1の双方に相補的な一本鎖オリゴヌクレオチド、
Down-ssODN：ゲノムの下流側DSB部位g2とドナーDNAの下流側DSB部位d2の双方に相補的な一本鎖オリゴヌクレオチド。
　本発明に使用するゲノム編集技術としては、ZFN、TALEN、CRISPR/Casが挙げられ、CRISPR/Casが好ましい。
　ZFN（ジンクフィンガーヌクレアーゼ）は、ジンクフィンガーアレイを含む結合ドメインにコンジュゲートした核酸切断ドメインを含む人工ヌクレアーゼを指す。１つの実施形態では、切断ドメインは、II型制限酵素FokIの切断ドメインである。切断する所与のゲノム中の任意の標的配列を切断できるように、ジンクフィンガーヌクレアーゼを設計することができる。
　TALEN（転写活性化因子様エレメントヌクレアーゼ）は、DNA切断ドメイン、例えばＦｏｋＩドメインに加えて転写活性化因子様(TAL)エフェクターのDNA結合ドメインを含む人工ヌクレアーゼを指す。操作されたＴＡＬＥ構築物を作製するためのいくつかのモジュール構築スキームが報告されている（例えばZhang, Feng et. al. (2011) Nature Biotechnology 29 (2)；この論文は、本明細書に参考として援用される）。
　CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）／Cas（CRISPR-associated）は、ヌクレアーゼ（RGN；RNA-guided nuclease）とガイドRNA(gRNA)を使用する。ヌクレアーゼ(RGN)としてはtype I、II、IIIが挙げられ、type II が好ましく、Cas9が特に好ましい。以下において、CRISPRに使用するヌクレアーゼを「Cas9ヌクレアーゼ」と記載することがあるが、Cas9以外のヌクレアーゼを使用してもよい。
　gRNAは、PAMに隣接するゲノム又はドナーDNA(プラスミドを含む)の標的配列の相補鎖、crRNA（CRISPR RNA）とtractRNA (trans-activating crRNA)を適当な接続配列で連結したキメラを含む。
　CRISPR/Casの場合、好ましい人工ヌクレアーゼシステムはCas9ヌクレアーゼとガイドRNAから構成され、標的配列をDSB切断する。
　人工ヌクレアーゼシステムGはゲノムの標的配列が１箇所の場合であり、Cas9ヌクレアーゼとガイドRNA-Gから構成され、標的配列GをDSB切断してDSB部位g1,g2を生じる。ガイドRNA-GはPAMに隣接する標的配列Gの相補鎖を有する。
　人工ヌクレアーゼシステムG1と人工ヌクレアーゼシステムG2はゲノムの標的配列が２箇所の場合であり、人工ヌクレアーゼシステムG1 はCas9ヌクレアーゼとガイドRNA-G1から構成され、標的配列G1をDSB切断して上流側DSB部位g1を生じる。人工ヌクレアーゼシステムG2 はCas9ヌクレアーゼとガイドRNA-G2から構成され、標的配列G2をDSB切断して下流側DSB部位g2を生じる。ガイドRNA-G1はPAMに隣接する標的配列G1の相補鎖を有し、ガイドRNA-G2はPAMに隣接する標的配列G2の相補鎖を有する。
　人工ヌクレアーゼシステムDはドナーDNAが有する標的配列DをDSB切断する。人工ヌクレアーゼシステムDは、好ましくはCas9ヌクレアーゼとガイドRNA-Dから構成される。ガイドRNA-DはPAMに隣接する標的配列Dの相補鎖を有する。図2A、2B、3は、ドナーDNAがプラスミドの場合を示す。ドナーDNAがプラスミドのような環状DNAの場合、1つの標的配列DのDSB切断で、上流側導入部位d1と下流側導入部位d2が同時に生成する。ドナーDNAが鎖状のDNAの場合、1つの標的配列DのDSB切断で、上流側導入部位d1又は下流側導入部位d2のいずれかが生成する。ドナーDNAが2つの標的配列D1,D2を有するプラスミドの場合、2つに分かれたプラスミドの一方がドナーDNAとして細胞ゲノムにノックインされる。
　人工ヌクレアーゼシステムとして、(i)人工ヌクレアーゼシステムGと人工ヌクレアーゼシステムDの組み合わせ(2H2O、図1)、(ii)人工ヌクレアーゼシステムG1と人工ヌクレアーゼシステムG2と人工ヌクレアーゼシステムDの組み合わせ(3H2O、図2A)、(iii)人工ヌクレアーゼシステムGと人工ヌクレアーゼシステムD1と人工ヌクレアーゼシステムD2の組み合わせ(3H2O)、或いは(iv) 人工ヌクレアーゼシステムG1と人工ヌクレアーゼシステムG2と人工ヌクレアーゼシステムD1と人工ヌクレアーゼシステムD2の組み合わせ(4H2O、図2B )が挙げられる。
　人工ヌクレアーゼシステムの構成要素は、(i)の場合、Cas9ヌクレアーゼとガイドRNA-GとガイドRNA-Dであり、(ii)の場合、Cas9ヌクレアーゼとガイドRNA-G1とガイドRNA-G2とガイドRNA-Dであり、(iii)の場合、Cas9ヌクレアーゼとガイドRNA-GとガイドRNA-D1とガイドRNA-D2であり、(iv)の場合、Cas9ヌクレアーゼとガイドRNA-G1とガイドRNA-G2とガイドRNA-D1とガイドRNA-D2である。Cas9ヌクレアーゼとガイドRNAは、これらを発現するプラスミド、ウイルスベクターなどを用いて細胞内に導入することができる。
　細胞ゲノム上の標的配列の長さは、特に限定されないが、CRISPR/Casを用いる場合には、17-27個、好ましくは18-25個、より好ましくは19-22個、さらに好ましくは19-20個、特に20個の塩基で構成される。CRISPR/Casシステムを用いる場合、細胞ゲノム上の標的配列(センス鎖又はアンチセンス鎖)はPAM（proto-spacer adaptor motif）配列に隣接しており、細胞ゲノム上の標的配列はPAM配列に隣接する位置で決定することができる。PAM配列は特に限定されないが、例えばNGG（Nは任意の塩基）が挙げられる。
　ゲノム上の標的配列は、1つであってもよく、２つであってもよい。例えばゲノム上の２つの標的配列で切断すると、所定の配列を切り出すことができ、この切り出された標的ゲノム領域にドナーDNAを挿入することで、ゲノムDNAの一部を置換することができる。ゲノムDNAの置換は、3 hit 2 oligo法により行うことができる（図2A）。ゲノム上の標的配列へのドナーDNAの挿入は2 hit 2 oligo法により行うことができる（図1）。図３は2H2O法を用いてラットのRosa26遺伝子座にCAG-GFPをノックインする方法及び結果を示し、図４は、CRISPR/Cas9を用いてGFPノックインラットを得る方法及び結果を示す。
　本発明のドナーDNAとしては、任意のDNAが使用できるが、細胞内で発現可能な遺伝子構築物、プラスミドが好ましい。ドナーDNAは鎖状で標的部位に導入されるので、環状のプラスミドをドナーDNAとした場合には、細胞内で切断して鎖状プラスミドを生成させ、ドナーDNAとして人工ヌクレアーゼシステムにより切断されたゲノムのDSB部位に導入される。プラスミド上の標的配列Dの切断には、人工ヌクレアーゼシステムDを利用することができる。すなわち、プラスミドのPAM配列に隣接させて標的配列Dを決定し、ゲノムの１又は２のPAM配列に隣接させて標的配列(2H2Oのようにゲノムが1つの標的配列を含む場合、標的配列G、3H2Oのようにゲノムが2つの標的配列を含む場合、標的配列G1及びG2)を決定することで、人工ヌクレアーゼシステムによりゲノムとプラスミドの両方の標的配列をともに切断することができる。ゲノムの標的配列とプラスミドの標的配列は同一であっても異なっていてもよい。ゲノムの標的配列（１つ又は２つ）とプラスミドの標的配列が異なる場合、2つ又は３つ標的配列を切断可能な人工ヌクレアーゼシステム(例えば人工ヌクレアーゼシステムGとDの組み合わせ、人工ヌクレアーゼシステムG1とG2とDの組み合わせ)を使用することができる。本発明によるノックインでは、相同組換法と異なりドナーDNAにホモロジーアームは必要ない。本発明では、標的配列の内部にDSB切断部位(例えば、図5dの「▼」(2箇所)、図6及び図7の「▼」)が生じる。ssODNによりゲノムとドナーDNAの2つのDSBが結合される場合、変異の導入無しに連結されることもあり(例えば図5dの#11)、変異が導入されることもある(例えば図5dの#6,7,8)。
　ドナーDNAの長さは特に限定されないが、通常10bp以上、20bp以上、40bp以上、80bp以上、200bp以上、400bp以上、800bp以上、1kbp以上、2kbp以上、3kbp以上、4kbp以上、8kbp以上、10kbp以上、20kbp以上、40kbp以上、80kbp以上、100kbp以上、200kbp以上のいずれであってもよい。本発明の方法の利点は、200kbp以上の非常に長いドナーDNAでも効率よく導入できることである。ドナーDNAは、宿主と異なる由来であってもよく、例えばヒト由来のドナーDNAをヒト以外の哺乳動物ゲノムにノックインすることができる。
　ドナーDNAは、1つの遺伝子であってもよく、遺伝子クラスタ領域をドナーDNAとしてノックインすることも可能である。
　本発明で使用するssODNは、ゲノムの切断部位の一方のDSB末端部位とドナーDNAの一方の末端に各々相補的な配列を有する。2つのssODNを使用することで、ゲノムの切断部位にドナーDNAを「のり」として結合することができ、これによりノックインの効率を大幅に高めることができる。各端部と相補的なssODN配列の長さは10～100塩基、好ましくは12～80塩基、より好ましくは15～60塩基、さらに好ましくは20～40塩基であり、2つの端部に各々相補的な配列を有するssODNの全体の長さは、20～200塩基、好ましくは24～160塩基、より好ましくは30～120塩基、さらに好ましくは40～80塩基である。
　本明細書において「ノックイン」とは、ドナーDNAのゲノムへの挿入と置換の両方を含む。
　本発明で使用する細胞は、任意の細胞であり、体細胞、ES細胞、iPS細胞などの多能性幹細胞、受精卵などが挙げられ、受精卵がドナーDNAをノックインした遺伝子改変哺乳動物を容易に得られるので好ましい。例えば薬物代謝酵素を全てヒト化した哺乳動物、ヒトの疾患に関与する少なくとも1つの遺伝子を導入したヒト疾患モデル動物、特定の臓器、組織に関する遺伝子を全てヒト化したモデル哺乳動物などは本発明の方法により容易に得ることができる。
　本発明では二種類のssODN（Up-ssODNとDown-ssODN）を使用する。Up-ssODNは、ドナーDNAの遺伝子をコードするセンス鎖の上流側(5’側)d1とゲノムの一方のDSB部位g1の両方に相補性の配列を含むものであり、Down-ssODNは、ドナーDNAの遺伝子をコードするセンス鎖の下流側(3’側)d2とゲノムの他方のDSB部位g2の両方に相補性の配列を含むものである(図1～3)。
　ゲノムのDSB部位とドナーDNAの上流側もしくは下流側導入部位は直接連結されることもあり、これらの間に挿入又は欠失などの変異が生じることもある。いずれの場合にも、ドナーDNA中の遺伝子は機能することができる。
　これらのssODNは受精卵にマイクロインジェクションすることで核内において作用し、ノックインの効率を高めることができる。受精卵におけるマイクロインジェクションは、細胞質、核内のいずれに行ってもドナーDNAのノックインは効率よく行うことができる。
　哺乳動物としては、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、サルなどが挙げられる。
　本発明はさらにプラスミドがゲノムに導入された細胞、或いは300bp以上、500bp以上、1kbp以上、2kbp以上、3kbp以上、5kbp以上、10kbp以上、20kbp以上、30kbp以上、50kbp以上、100kbp以上、200kbp以上の長いDNA(遺伝子構築物)が挿入された細胞に関する。従来、プラスミド或いは長いドナーDNAを導入した細胞はなく、本発明により新規な細胞が提供される。
　本発明の特に好ましい実施形態は、ドナーDNAを受精卵にノックインして得られる非ヒト哺乳動物である。非ヒト哺乳動物にヒトの遺伝子を導入することでヒト化する試みが行われているが、大きなDNAを導入することは従来法では難しく限界があった。本発明では200kbp以上の長い配列であっても効率的に導入できるので、非ヒト哺乳動物の遺伝子クラスタをヒトの対応する遺伝子クラスタに容易に改変でき、ドナーDNAのノックインを繰り返すことで大多数のDNAをヒト化することも可能になった。
　プラスミド或いは長いドナーDNAが挿入されたことは、シーケンスにより確認してもよく、発現産物のタンパク質をウェスタンブロッティングなどにより確認してもよい。
　本発明において、人工ヌクレアーゼシステムは‘はさみ’として標的ゲノム配列とドナーDNA配列を二本鎖切断（DSB）して、二種類のssODNが‘のり’としてゲノムとドナーDNAを結合修復することで、ドナーDNAを特定のゲノム上に正確かつ効率的にノックインされる。標的とするゲノム配列を2箇所、プラスミドを1箇所あるいは2箇所切断することで、長い遺伝子配列や遺伝子クラスタ等を置換することができる。
　本発明は、人工ヌクレアーゼシステムとssODNを準備するだけで、哺乳動物ゲノム上のあらゆる遺伝子やプロモーター等のDNA配列を標的として、あらゆる既存プラスミド使って、そのままノックインすることができる。さらに、これまでES細胞が存在しなかったマウス以外の哺乳動物において、ノックアウトだけでなく、効率的なノックインが可能となる。
　以下、本発明を実施例を用いてより詳細に説明するが、本発明がこれら実施例に限定されないことはいうまでもない。
実施例1
（１）実験方法
　本実験には、Addgene（www.addgene.org/CRISPR）から入手したCas9発現プラスミド（hCas9: Addgene ID# 41815）およびgRNA発現プラスミド（pDR274: Addgene ID# 42250）を用いた。Cas9発現プラスミドはCas9遺伝子の上流にT7プロモーターを導入するなどの改良を加えた。pCAGプラスミドは理化学研究所バイオリソースセンターから入手し、GFP遺伝子およびヒトCYP2D6遺伝子を導入した。
　CRISPR Design Tool（crispr.genome-engineering.org）を用いて標的配列を決定し、これらを認識するgRNA発現プラスミドを作製した（表1）。Cas9発現プラスミドを用いて、in vitro転写、ポリA付加反応、RNA精製を順に行い、Cas9 mRNAを準備した。gRNAも同様にin vitro転写、RNA精製により準備した。またゲノム上の切断部位およびプラスミド切断部位の相同配列を持つssODNを設計し、入手した（表2）。性成熟したWistar:Jcl系統の雌ラットに対して過排卵処理を行い、自然交配により受精卵を得た。マウスはC57BL/6JJcl系統の雌を用いて受精卵を得た。100 μg/ml Cas9 mRNA、各50 μg/ml gRNA、各50 μg/ml ssODN、5 μg/ml プラスミド混合溶液をRNase free waterで調製し、受精卵の雄性前核へ顕微注入した。注入した受精卵を37℃、5% CO2条件下で一晩培養後、偽妊娠した雌ラットまたはマウスに卵管移植した。移植後、約3週間で分娩した。
　得られた産子に対して、GFP蛍光確認用ライトを用いてGFP陽性個体を選抜した。また産子から組織を採取し、DNAを抽出し、表3のプライマーを利用して、PCR、電気泳動、シークエンス解析によりプラスミドのゲノム標的配列への導入を確認した。実験方法の詳細は参考文献（Nat Commun. 2014 Jun 26;5:4240.）に記載されている。この参考文献は本明細書に参考として援用される。
（２）実験結果
　本実験は、CRIPSR/Cas9という‘はさみ’を用いて、ラットRosa26遺伝子内の標的配列とpCAG-GFPプラスミド内の標的配列を同時に切断し、二種類のssODNという‘のり’を用いて、pCAG-GFPをラットRosa26内に正確かつ効率的にノックインするものである（図５ａ）。ラットRosa26遺伝子の第1エクソンと第2エクソンの間、およびpCAG-GFPのCAGプロモーター上流に標的配列を設計し、gRNAを作製した（表1、図６，７）。また、Rosa26切断部位の上流とpCAGプラスミド切断部位の下流、Rosa26切断部位の下流とpCAG-GFP切断部位の上流を結合するためのssODNを設計した（表２）。これらをpCAG-GFPとともに受精卵に導入した結果、得られた17匹の産子のうち、4匹に全身でのGFP発現が観察された（表４、図５ｂ）。PCRの結果、6、7、8、11番個体でGFP特異配列の増幅が見られた（図５ｃ）。Rosa26領域に組み込まれていることを確認するため、ラットRosa26のプライマーとpCAG-GFPのプライマーを組み合わせて検討した結果、6、7、11番個体で増幅が見られ、Rosa26領域に組み込まれていることが確認できた（図５ｃ）。8番個体はpCAG-GFPの切断部位がゲノム上に存在することが確認された。シークエンス解析の結果、11番個体は上流、下流ともにssODNで設計した通りの配列でpCAG-GFPが導入されていることが確認された（図５ｄ）。6番個体は上流で6塩基の欠損、7番個体は上流下流の両端で複数塩基の挿入または欠失が確認された。これらノックイン変異の他に、15匹でノックアウト変異が確認された（図８）。11番個体で得られたプラスミドノックイン変異は安定的に子孫に伝達された。また、オフターゲット配列の変異は観察されなかった。病理学的解析の結果、このノックイン系統は全身臓器でGFPが安定して発現していることが確認された（図９）。
　マウスについても、ラットと同様にRosa26遺伝子の第1エクソンと第2エクソンの間に標的配列を設計し、gRNAおよびssODNを作製した（図１０、表１，２）。pCAG-GFPと一緒にマウスRosa26標的部位特異的gRNA、ssODNを導入した結果、得られた31匹の産子のうち（表４）、3匹に全身でのGFP発現が観察された（図１１ａ）。PCRの結果、1、10、17番個体でGFP特異配列の増幅が見られた。マウスRosa26プライマーとpCAG-GFPプライマーを組み合わせることで、3個体ともにRosa26領域に組み込まれていることが確認できた（図１１ｂ）。1番個体はpCAG-GFPの上流、下流ともにssODNで設計した通りの配列でpCAG-GFPが導入されていることが確認された（図１１ｃ）。10番個体は下流に8塩基の欠失が、17番個体は上流に18塩基の挿入が確認された。また、得られた産仔全てでノックアウト変異が確認された（図１２）。
　最後に、薬剤代謝の中心的酵素であるシトクロムP450（CYP）群の1種、CYP2D6遺伝子を対象に、ラットのCyp2d遺伝子クラスタ（Cyp2d1-5）をヒトCYP2D6遺伝子に置換した（図１３ａ）。ラットのCyp2d遺伝子クラスタの上流と下流それぞれ2箇所、およびCYP2D6遺伝子を組み込んだpCAGプラスミド（pCYP2D6）の上流1箇所、合計3箇所に標的配列を設計し、gRNAを作製した（図１４、表１）。また、Cyp2dクラスタ切断部位の上流とプラスミド切断部位の下流、Cyp2dクラスタ切断部位の下流とプラスミド切断部位の上流をつなぐためのssODNを設計した（表２）。これらをpCYP2D6とともに受精卵に導入した（表４）。PCRの結果、1、3、8、18番個体でCYP2D6特異配列の増幅が見られた（図１３ｂ）。Cyp2dクラスタ領域に組み込まれていることを確認するため、ラットCyp2dプライマーとpCYP2D6プライマーを組み合わせて検討した結果、18番個体で増幅が見られた。さらにシークエンス解析の結果、18番個体は上流、下流ともにssODNで設計した通りの配列でpCYP2D6が導入されていることが確認された（図１３ｃ）。2番個体はCyp2d 上流と下流のプライマーでPCR増幅が見られ、ラットCyp2d遺伝子クラスタの大規模欠失が確認された。同時にCyp2d遺伝子標的配列にも多数の変異が確認された（図１５）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
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　本発明により、人工ヌクレアーゼZFN/TALEN/CRISPRによるノックアウトだけでなく、様々なドナープラスミドを利用したノックイン、すなわち‘自由なゲノム編集’が可能となる。GFP蛍光蛋白等のレポーター遺伝子をRosa26遺伝子座等の安定発現染色領域に導入したり、標的遺伝子のN末端、C末端にレポーター遺伝子を結合させることも可能であり、遺伝子改変動物のノックイン動物受託作製ビジネスを大きく前進させる。
　また、本発明により、哺乳動物の遺伝子を破壊してヒト遺伝子を導入したいわゆる‘ゲノムヒト化動物’を効率的に作製することが可能である。様々なヒト疾患の遺伝子を有する疾患モデル動物、あるいは人類の起源に関する遺伝子などを有するヒト化モデル動物などを作製することが可能となる。このようにして新しく開発された遺伝子改変モデル動物は、実験動物だけでなく創薬、再生医療研究等においても広く利用される。
　既に本技術により、非常に効率的にGFPノックインマウスやラットの作製、ラット相同遺伝子をヒト遺伝子へ置換したゲノムヒト化動物の作製に成功していることから、今後、実用化技術として広く利用されると予測される。

Claims (14)

  1. 細胞ゲノムの1又は2の標的配列Gを切断可能な少なくとも１つの人工ヌクレアーゼシステムG、ドナーDNA及び二種類の一本鎖オリゴヌクレオチド(ssODN)を細胞に導入する工程を含み、前記人工ヌクレアーゼシステムGは細胞ゲノム上の１又は２の標的配列Gを切断して細胞ゲノム上に2つの二本鎖DNA切断(DSB)部位を生じさせ、二種類のssODNは細胞ゲノムの標的配列Gの切断により生じた一方のDSB部位g1とドナーDNAの上流側導入部位D1に相補性を有するUp-ssODN並びに細胞ゲノムの他方のDSB部位g2とドナーDNAの下流側導入部位D2に相補性を有するDown-ssODNであり、二種類のssODN（Up-ssODNとDown-ssODN）により細胞ゲノムの1つ又は2つの標的配列Gにおける2つのDSB部位g1,g2の間にドナーDNAがノックインされることを特徴とする、ドナーDNAを細胞ゲノムにノックインする方法。　
  2. ドナーＤＮＡが細胞内で発現可能な遺伝子構築物である、請求項１に記載の方法。
  3. ドナーＤＮＡが1又は2の標的配列を有するプラスミドであり、人工ヌクレアーゼシステムは、Cas9ヌクレアーゼと細胞ゲノムの1又は2の標的配列Gに対応する1又は2のガイドRNA-G(gRNA-G)を含む人工ヌクレアーゼシステムGと、Cas9ヌクレアーゼとドナーDNAの1又は2の標的配列Dに対応する1又は2のガイドRNA-D(gRNA-D)を含む人工ヌクレアーゼシステムDを包含し、人工ヌクレアーゼシステムGにより細胞ゲノムの1又は2の標的配列Gを切断して細胞ゲノム上にDSB部位g1,g2を生じさせ、人工ヌクレアーゼシステムDによりドナーDNAプラスミド上の1又は2の標的配列Dを切断してゲノムにノックインされるプラスミド由来のドナーＤＮＡの上流側導入部位D1と下流側導入部位D2を生じさせる、請求項１に記載の方法。
  4. 細胞ゲノム上に1つの標的配列G、プラスミド上に1つの標的配列Dを有し、人工ヌクレアーゼシステムがCas9ヌクレアーゼと標的配列Gに対応するガイドRNA-G(gRNA-G)を含む人工ヌクレアーゼシステムGと、Cas9ヌクレアーゼと標的配列Dに対応するガイドRNA-D(gRNA-D)を含む人工ヌクレアーゼシステムDとを包含し、gRNA-Gが標的配列Gの相補鎖を含み、gRNA-Dが標的配列Dの相補鎖を含み、人工ヌクレアーゼシステムGにより標的配列Gを切断して細胞ゲノム上にDSB部位g1,g2を生じさせ、人工ヌクレアーゼシステムDにより標的配列Dを切断してプラスミド由来のドナーＤＮＡの上流側導入部位D1と下流側導入部位D2を生じさせ、一方のDSB部位g1と上流側DSB部位D1を上流側一本鎖オリゴヌクレオチド（Up-ssODN）で結合し、他方のDSB部位g2と下流側DSB部位D2を下流側一本鎖オリゴヌクレオチド（Down-ssODN）で結合する、請求項３に記載の方法。
  5. 細胞ゲノム上に2つの標的配列G1、G2、プラスミド上に1つの標的配列Dを有し、人工ヌクレアーゼシステムがCas9ヌクレアーゼと標的配列G1,G2に各々対応するガイドRNA-G1(gRNA-G1) 、ガイドRNA-G2(gRNA-G2)を含む人工ヌクレアーゼシステムG1、G2と、Cas9ヌクレアーゼと標的配列Dに対応するガイドRNA-D(gRNA-D)を含む人工ヌクレアーゼシステムDとを包含し、gRNA-G1、G2が各々標的配列G1、G2の相補鎖を含み、gRNA-Dが標的配列Dの相補鎖を含み、人工ヌクレアーゼシステムG1、G2により標的配列G1,G2を切断して細胞ゲノム上にDSB部位g1,g2を生じさせ、人工ヌクレアーゼシステムDにより標的配列Dを切断してプラスミド由来のドナーＤＮＡの上流側導入部位D1と下流側導入部位D2を生じさせ、一方のDSB部位g1と上流側DSB部位D1を上流側一本鎖オリゴヌクレオチド（Up-ssODN）で結合し、他方のDSB部位g2と下流側DSB部位D2を下流側一本鎖オリゴヌクレオチド（Down-ssODN）で結合する、請求項３に記載の方法。
  6. 細胞ゲノム上に1つの標的配列G、プラスミド上に2つの標的配列D1、D2を有し、人工ヌクレアーゼシステムがCas9ヌクレアーゼと標的配列Gに各々対応するガイドRNA-G(gRNA-G)を含む人工ヌクレアーゼシステムGと、Cas9ヌクレアーゼと標的配列D1、D2に対応するガイドRNA-D1、D2(gRNA-D1、D2)を含む人工ヌクレアーゼシステムD1、D2とを包含し、gRNA-Gが標的配列Gの相補鎖を含み、gRNA-D1、D2が標的配列D1、D2の相補鎖を含み、人工ヌクレアーゼシステムGにより標的配列Gを切断して細胞ゲノム上にDSB部位g1,g2を生じさせ、人工ヌクレアーゼシステムD1、D2により標的配列D1、D2を切断してプラスミド由来のドナーＤＮＡの上流側導入部位D1と下流側導入部位D2を生じさせ、一方のDSB部位g1と上流側DSB部位D1を上流側一本鎖オリゴヌクレオチド（Up-ssODN）で結合し、他方のDSB部位g2と下流側DSB部位D2を下流側一本鎖オリゴヌクレオチド（Down-ssODN）で結合する、請求項３に記載の方法。
  7. 細胞ゲノム上に2つの標的配列G1、G2、プラスミド上に2つの標的配列D1、D2を有し、人工ヌクレアーゼシステムがCas9ヌクレアーゼと標的配列G1,G2に各々対応するガイドRNA-G1,G2(gRNA-G1,G2) を含む人工ヌクレアーゼシステムG1、G2と、Cas9ヌクレアーゼと標的配列D1、D2に対応するガイドRNA-D1、D2(gRNA-D1、D2)を含む人工ヌクレアーゼシステムD1、D2とを包含し、gRNA-G1、G2が各々標的配列G1、G2の相補鎖を含み、gRNA-D1、D2が標的配列D1、D2の相補鎖を含み、人工ヌクレアーゼシステムG1、G2により標的配列G1,G2を切断して細胞ゲノム上にDSB部位g1,g2を生じさせ、人工ヌクレアーゼシステムD1、D2により標的配列D1、D2を切断してプラスミド由来のドナーＤＮＡの上流側導入部位D1と下流側導入部位D2を生じさせ、一方のDSB部位g1と上流側DSB部位D1を上流側一本鎖オリゴヌクレオチド（Up-ssODN）で結合し、他方のDSB部位g2と下流側DSB部位D2を下流側一本鎖オリゴヌクレオチド（Down-ssODN）で結合する、請求項３に記載の方法。
  8. 前記細胞が受精卵である、請求項１～7のいずれか１項に記載の方法。
  9. プラスミドの全部または一部がゲノムに導入された細胞。
  10. 前記プラスミドは1又は2の標的配列DをCas9により切断することにより生じた上流側及び下流側DSB部位D1,D2でゲノムに導入されてなる、請求項9に記載の細胞。
  11. プラスミドのゲノム上の導入位置は、ゲノムの１又は２の標的配列をCas9により切断することにより生じた2つのDSB部位の間である、請求項9又は10に記載の細胞。
  12. 細胞が受精卵である、請求項9～11のいずれかに記載の細胞。
  13. 請求項9～12のいずれか１項に記載の細胞を含む、プラスミドがゲノムに導入された非ヒト哺乳動物。
  14. ヒト由来の少なくとも１つの遺伝子を含むプラスミドがノックインされてヒト化された請求項13に記載の非ヒト哺乳動物。
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