WO2016072798A1 - Pas1 변이 단백질을 포함하는 tods 변이 단백질 및 이의 용도 - Google Patents

Pas1 변이 단백질을 포함하는 tods 변이 단백질 및 이의 용도 Download PDF

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WO2016072798A1
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pas1
tods
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toluene
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김명희
고세리
황중원
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한국생명공학연구원
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Definitions

  • the present invention relates to a PAS1 mutant protein, a TodS mutant protein comprising the PAS1 mutant protein, a microorganism producing the mutant protein, an aromatic biosensor for detecting aromatic hydrocarbons using the mutant protein, and a microbial agent for decomposition of aromatic hydrocarbons.
  • the present invention also relates to PAS1 protein crystals, crystals of SeMet-PAS1 protein and toluene complex, crystals of PAS1 protein and 1,2,4-TMB (1,2,4-Trimethylbenzene) complex, and methods of preparing the crystals thereof. It is about application.
  • TodS which constitutes TodS / TodT two factor signaling, consists of two PAS domains, two histidine kinase (HK) domains, and one response regulator (RRR).
  • Toluene is bonded to the N- terminal part of TodS PAS1 domain induces autophosphorylation 2 (autophosphorylation) of histidine kinase in TodS, and by the phosphorylation signal promote the phosphorylation of transcription factors TodT tod operon transcription control region of todX Binding to box results in gene expression of tod operon (Proc. Natl. Acad. Sci., 2006, 103, 8191-8196).
  • autophosphorylation 2 autophosphorylation of histidine kinase in TodS
  • phosphorylation signal promote the phosphorylation of transcription factors TodT tod operon transcription control region of todX Binding to box results in gene expression of tod operon (Proc. Natl. Acad. Sci., 2006, 103, 8191-8196).
  • Recent protein enzymatic engineering studies have been conducted to identify the conformation and function of target proteins, and to design and develop efficient proteins through clear and efficient scientific protein engineering. These studies can enhance ligand specificity and efficacy. It can be used as a sensor development approach. In order to increase the sensitivity by designing the binding sites of selective and specific ligands, and to develop a sensor that expands ligand specificity, it is essential to secure a large amount of stable high purity protein and to identify the conformation of the protein through crystallization. However, the TodS or PAS1 protein is very difficult to crystallize by pure purification in a stable state, and despite its importance, no conformation has been revealed.
  • the present inventors have prepared Apo-PAS1 protein crystals, complex crystals of SeMet-PAS1 protein and toluene, and complex crystals of PAS1 protein with 1,2,4-TMB. Based on the tertiary structure obtained from this, the binding site of PAS1 protein and ligand was identified at high resolution atomic level. In addition, the present invention has been completed by confirming that a novel functional sensing sensor capable of transmitting a signal by combining with an aromatic chemical other than toluene using a ligand binding site was identified.
  • One object of the present invention to provide a TodS variant protein having one or more mutations selected from the group consisting of (a) to (w) in the TodS protein of SEQ ID NO: 1;
  • valine 59 (e) replacing valine 59 with alanine, aspartic acid or phenylalanine,
  • Another object of the present invention is a PAS1 protein having an amino acid sequence of Nos. 43 to 168 or Nos. 23 to 168 of TodS protein of SEQ ID NO: 1, based on the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, wherein (a) to (q) It is to provide a PAS1 mutant protein having one or more mutations selected from the group consisting of.
  • Another object of the present invention is a polynucleotide encoding the protein; An expression vector comprising the polynucleotide; And it is to provide a microorganism into which the expression vector is introduced.
  • Still another object of the present invention is to provide a microorganism producing the mutant protein.
  • Another object of the invention is (i) a combination of modules for sensors comprising the modules of (a) to (d) below; (ii) an expression cassette comprising a polynucleotide encoding said module combination; (iii) a vector comprising said expression cassette; Or to provide a biosensor for detecting aromatic hydrocarbons containing a microorganism comprising any of (i) to (iii):
  • Another object of the invention is (i) a combination of modules for sensors comprising the modules of (a) to (d) below; (ii) an expression cassette comprising a polynucleotide encoding said module combination; Or (iii) containing a microorganism comprising a vector comprising the expression cassette, to provide a microbial agent for degrading aromatic hydrocarbons:
  • Still another object of the present invention is to provide an aromatic hydrocarbon sensing composition comprising the biosensor.
  • Still another object of the present invention is to provide an aromatic hydrocarbon decomposition composition comprising the microbial agent.
  • Still another object of the present invention is to provide an aromatic hydrocarbon detection method comprising the step of exposing the biosensor to a sample.
  • Still another object of the present invention is to provide an aromatic hydrocarbon decomposition method comprising the step of degrading an aromatic hydrocarbon using the microbial agent.
  • Another object of the present invention is (a) atomic coordinates of the PAS1 protein shown in Table 3, atomic coordinates of the SeMet-PAS1 protein and toluene complex shown in Table 4, or PAS1 protein and 1,2,4-TMB shown in Table 5 Designing the tertiary structure of the PAS1 protein or a complex thereof using atomic coordinates of the (1,2,4-Trimethylbenzene) complex;
  • the present invention provides a method for screening a PAS1 mutant protein in which ligand binding activity is mutated to a wild type PAS1 protein.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for crystallizing a PAS1 protein, comprising crystallizing a PAS1 protein having a 43rd to 168th amino acid sequence from the TodS protein of SEQ ID NO: 1.
  • Another object of the present invention is to crystallize a mixture of toluene or 1,2,4-TMB (1,2,4-Trimethylbenzene) with PAS1 protein having amino acid sequence Nos. 43 to 168 of TodS protein of SEQ ID NO: 1.
  • To provide a method for crystallizing a complex of PAS1 protein and toluene or 1,2,4-TMB comprising.
  • the PAS1 protein having the 43rd to 168th amino acid sequences provides a crystal of the toluene complex and SeMet-PAS1 protein, in which methionine is selenomethionine.
  • Another object of the present invention is (a) atomic coordinates of the PAS1 protein shown in Table 3, atomic coordinates of the SeMet-PAS1 protein and toluene complex shown in Table 4 or PAS1 protein shown in Table 5 and 1,2,4-TMB ( Designing the tertiary structure of the PAS1 protein or its complex using atomic coordinates of 1,2,4-Trimethylbenzene) complex; (b) generating a candidate substance that binds to PAS1 using the designed tertiary structure; And (c) determining whether the candidate substance modulates the binding between the PAS1 protein or TodS protein comprising PAS1 and the ligand, wherein the substance modulates the binding between the PAS1 protein or TodS protein and ligand.
  • Table 3 atomic coordinates of the SeMet-PAS1 protein and toluene complex shown in Table 4 or PAS1 protein shown in Table 5 and 1,2,4-TMB ( Designing the tertiary structure of the PAS1 protein or its complex using atomic
  • Crystals of the PAS1 protein, PAS1 / 1,2,4-TMB complex protein crystals and SeMet-PAS1 / toluene protein complexes, crystallization methods and three-dimensional structural information provided by the present invention are various bacteria including the tod gene. It can be useful for the development of new sensor for the purpose of increasing the expression of pollutant degradation genes related to environmental pollution purification.
  • the PAS1 mutant protein provided herein or the TodS mutant protein including the same can be usefully used for aromatic hydrocarbon detection and degradation.
  • Figure 1a is a diagram showing the amino acid sequence used for the expression of PAS1 protein.
  • Figure 1b is a diagram confirming that the PAS1 protein is present in the dimer form in size exclusion chromatography.
  • Figure 1c is a diagram showing the benzene-based aromatic chemicals used for induction of crystals of SeMet-PAS1 / toluene complex, PAS1 / 1,2,4-TMB complex and in vivo signaling screening of TodS mutant proteins.
  • Figure 2a is a diagram analyzing the symmetric pairs in the dimer of PAS1 (43-168) protein (Apo-PAS1).
  • Figure 2b is a diagram showing the structure of Apo-PAS1 (43-168) with a ribbon.
  • the asymmetric unit has two PAS1 molecules (molecule A and molecule B).
  • 2C is a diagram analyzing the symmetric pairs in the dimer of SeMet-PAS1 (43-168) / toluene complex.
  • FIG. 2D is a diagram analyzing the dimer symmetric pairs of PAS1 (43-168) / 1,2,4-TMB complex.
  • Figure 3 is a structural analysis of the binding between SeMet-PAS1 (43-168) protein and toluene. Residues essential for the binding of PAS1 are shown with ligands.
  • Figure 5a is a diagram showing the structure of TodS PAS1 complexed with agonist toluene.
  • PAS1 complexed with agonist toluene.
  • PAS1 molecule that combines two toluenes in an asymmetric unit.
  • FIG. 5B shows toluene binding pockets.
  • the pockets are marked in black in the electrostatic surface representation.
  • the specific environment of toluene sensing by PAS1 was extended in molecules A and B. Toluene (red) is surrounded by hydrophobic PAS1 residues (green).
  • Figure 5c is a diagram showing the structure of PAS1 complexed with antagonists 1,2,4-TMB.
  • 1,2,4-TMB molecules are represented by red carbon atoms.
  • the unaligned C-terminal site of molecule B, corresponding to the unaligned site in molecule B of Apo-PAS1, is marked in red.
  • 5D shows 1,2,4-TMB binding pockets.
  • the pockets are marked in black in the electrostatic surface representation.
  • the specific environment of 1,2,4-TMB binding by PAS1 was extended in molecule A and molecule B.
  • 1,2,4-TMB (red) is surrounded by the same hydrophobic residue (green) as in the toluene binding pocket.
  • 5E shows the thermodynamic parameters of PAS1 (23-168) and its mutations that bind toluene. Obtained using two consecutive coupling models of ORIGIN software package (MicroCal Inc., USA). From the thermal data generated from the reaction of each protein variant with toluene, the thermal data generated by adding toluene to the reaction buffer was subtracted. Representative ITC profiles for the binding of wild type PAS1 (23-168) to toluene molecules are shown on the left.
  • FIG. 6 shows SeMet-PAS1-B monomers of PAS1 (43-168) protein (Apo-PAS1), PAS1 (43-168) / 1,2,4-TMB complex and SeMet-PAS1 (43-168) / toluene complex. Overlapping the structures, each ligand binding specific structural change of the PAS1-B protein is circled. In the case of SeMet-PAS1 / toluene complex, toluene bonds form a fixed ⁇ 5 helix by binding of E146 and R148 of SeMet-PAS1-B.
  • FIG. 7A confirms that TodS protein exists as a dimer having a long and flexible form having a tetramer in size exclusion chromatography.
  • Figure 7b is purely isolated from the TodS (43rd-978th amino acid sequence of SEQ ID NO: 1) protein having a His 6 tag at the C-terminal, the nickel-gold molecules were combined with histidine marker and negative staining observed by electron microscopy The results are shown. 6b confirmed that the two gold molecules were positioned side by side, and that the TodS protein was present as a dimer (indicated by arrow and circle).
  • FIG. 8A is a diagram confirming that TodS (43-978) protein alone (Apo-TodS) exists as a dimer.
  • FIG. 8B shows that TodS (43-978) / toluene complex protein is also present as a dimer, but shows a longer length than that of TodS protein alone.
  • FIG. 8C shows that TodS (43-978) / 1,2,4-TMB complex protein is also present as a dimer, but the majority of proteins show aggregation.
  • Figure 9a is a diagram showing the result of size exclusion chromatography analysis of purified TodS (SEQ ID NO: 1 23-978 amino acid sequence, TodS (23-978)) protein. TodS (23-978) was compared with the standard molecular weight markers ⁇ -amylase (200 kDa) and apoferritin (443 kDa).
  • 9B is an electron micrograph showing the molecular appearance of TodS (23-978) protein (Apo-TodS) and complexes thereof (Toluene-TodS, 1,2,4-TMB-TodS). Scale bar: 20 nm.
  • FIG. 10 is a variation TodS binding ligands of the protein specifically in vivo TodS / TodT 2 gae factor signal transduction capabilities to verify, 96-dip containing PAS1 domain was mutated ligand binding site-well plate-based screening system (in vivo It is a schematic diagram showing the principle of the ⁇ -galactosidase assay system.
  • FIG. 11A shows the dimer structure of PAS1 modeled under the structure of Azotobacter vinelandii NifL LOV domain (PDB ID: 2GJ3). Hydrophobic residues predicted to be involved in dimerization are indicated in molecules A and B in green and gray, respectively.
  • 11B evaluated residues involved in dimerization using an in vivo ⁇ -galactosidase assay system in a toluene environment. All results were obtained through three independent experiments.
  • FIG. 12A is a diagram illustrating a size exclusion chromatography analysis of purified PAS2.
  • Purified PAS2 was compared to carbonic anhydrase (29 kDa), a standard molecular weight marker, and analyzed as a dimer in solution.
  • FIG. 12B shows a PAS2 structure (magenta) modeled based on the dimer structure (green, cyan) of Azotobacter vinelandii NifL LOV domain (PDB ID: 2GJ3). FAD bound to each NifL PAS domain is shown. N-terminal alpha helix (Ser611-Ser622) of PAS2 predicted to be involved in dimerization is indicated.
  • 12C is a diagram showing Glu666 and Leu674 of PAS2 corresponding to Thr78 and Leu86, which are NifL FAD binding residues.
  • 12D is a diagram evaluating PAS2 residues predicted to be involved in various ligand binding using an in vivo ⁇ -galactosidase assay system.
  • 12E is a diagram overlapping the PAS1 structure with toluene and a modeled PAS2 structure.
  • FIG. 13 is a diagram showing a molecular model of the mechanism for signaling of TodS / TodT.
  • PAS1 dimer molecule A and molecule B are indicated in dark green and light green, respectively.
  • TodT dimers are indicated in light yellow and dark yellow. Toluene molecules are shown in red.
  • FIG. 14 shows Pseudomonas putida expressing TodS variant proteins when agonist toluene or antagonist 1,2,4-TMB ligand is supplied in gaseous form at a concentration of 100 ⁇ M.
  • FIG. Fig. Shows the results of beta galactosidase activity of KT2440-PXZ transformants in vivo.
  • TodS mutant proteins including the PAS1 domain, which were position-modified 10 amino acid residues identified based on the conformational structure of the PAS1 / toluene complex, were compared with wild type TodS, 100 ⁇ M of agonist toluene or antagonist 1,2,4-TMB Validation of the response to the ligand by the screening system confirmed that all 10 amino acid residues were important for TodS / TodT two factor signaling.
  • FIG. 15a compares signaling ability between TodS (WT) containing wild-type PAS1 and 10 TodS mutant proteins in which amino acid residues of the toluene binding site were substituted by a position-directed mutagenesis induction method by treating each ligand at a concentration of 10 ⁇ M.
  • Figure 1 shows the results.
  • 15B is a diagram comparing the results of in vivo beta galactosidase activity of wild-type TodS and 10 TodS mutant proteins depending on ligand concentration.
  • Figure 16 shows the results of ligand concentration dependent in vivo beta galactosidase activity of Pseudomonas putida KT2440-PXZ transformants expressing TodS mutant proteins modified with amino acids involved in dimerization of PAS1.
  • FIG. 17 shows ligand concentration-dependent in vivo beta galactosin of Pseudomonas putida KT2440-PXZ transformants expressing a TodS mutant protein mutated from amino acids at the ⁇ 5 helix forming site of PAS1-B that specifically undergoes a structural change in binding to toluene Figure showing the results of the sidase activity.
  • FIG. 18A shows in vivo beta galactosidase dependent of ligand concentration (10 ⁇ M, 50 ⁇ M, 100 ⁇ M) of Pseudomonas putida KT2440-PXZ transformants expressing TodS modified protein with altered biochemical properties of glutamic acid amino acid residue of PAS1 protein 61 Figure showing the activity results.
  • 18B is a diagram showing in vivo beta galactosidase activity of Pseudomonas putida KT2440-PXZ transformants expressing Q61R TodS and Q61A TodS mutant proteins when 10 ⁇ M of ligand was supplied in gaseous form.
  • One aspect of the invention provides TodS variant proteins.
  • the TodS variant protein of the present invention has a higher or lower sensitivity to various aromatic hydrocarbons than the wild type TodS protein, and thus may be usefully used for the detection and / or degradation of aromatic hydrocarbons.
  • TodS protein of SEQ ID NO: 1 it provides a TodS variant protein having one or more mutations selected from the group consisting of (a) to (w);
  • valine 59 (e) replacing valine 59 with alanine, aspartic acid or phenylalanine,
  • TodS protein refers to a protein that generates and transmits a phosphate signal by sensing an aromatic hydrocarbon, and includes two PAS domains and two histidine kinase (HK) domains and one reaction modulator (HK). response regulator, RRR).
  • the TodS protein may be derived from Pseudomoans genus microorganism, specifically Pseudomoans putida , but is not limited thereto.
  • the TodS protein is not particularly limited thereto, but its sequence can be easily obtained through a known database such as the NCBI gene bank, for example, a protein having GenBank ID: A5W4E3.1, and represented by SEQ ID NO: 1 It may have an amino acid sequence represented or a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the term "TodS variant protein” means a protein obtained by substituting, inserting, removing or modifying one or more amino acids in a PAS1 protein in a wild-type TodS gene.
  • the TodS variant protein may be sensitive to toluene.
  • a protein may be modified to increase or decrease, or may be modified to change sensitivity to a ligand other than toluene, but is not limited thereto.
  • the TodS mutant protein is specifically phenylalanine, 47 valine, 48 glycine, 49 leucine, 58 glutamic acid, 59 valine, 61 glutamine, 63 alanine, in the amino acid sequence of SEQ ID NO.
  • One or more of the group consisting of 620 glutamic acid, 666 glutamic acid, 674 leucine, 691 tyrosine and 703 alanine may be a mutated protein, such as a protein substituted with another amino acid. Further, among the above groups, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, Or a variant protein comprising 23 variants.
  • the TodS variant protein may be a protein lacking amino acids 617 to 623 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a protein lacking amino acids 617 to 623 additionally to the substituted TodS variant protein.
  • the TodS variant protein is a amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 of TodS protein, (a) 46 phenylalanine is substituted with alanine or serine, (b) 47 valine is substituted with alanine or leucine, (c) Leucine 49 replaces aspartic acid or alanine, (d) Glutamic acid 58 replaces alanine or serine, (e) Valine 59 replaces alanine, aspartic acid or phenylalanine, (f) Glutamine 61 leucine, egg Substituted or alanine, (g) alanine 63 replaced with valine or serine, (h) phenylalanine 79 replaced with tyrosine, glutamic acid or leucine, (i) tryptophan 84 replaced with valine, histidine or alginine, (j) Tryptophan 85 replaced with histidine, arginine, or leucine; (k) 114
  • the TodS variant protein is 70% or more of the TodS amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, including the mutation position, as long as the ability to bind an aromatic hydrocarbon as well as the variant protein as well as the wild type TodS protein is controlled. It is obvious that a protein comprising an amino acid sequence showing at least%, more specifically at least 95%, most specifically at least 97%, 98% or 99% similarity is included within the scope of the present invention.
  • the aromatic hydrocarbon may include without limitation an aromatic hydrocarbon capable of binding to the mutant protein of the present invention, benzene, ethylbenzene, propylbenzene, butylbenzene, nitrobenzene (nitrobenzene), chlorobenzene (chlorobenzene), benzene (fluorobenzene) fluoro, toluene (toluene), styrene (styrene), o - xylene (o -xylene), m - xylene (m -xylene), p - xylene alkylene (p -xylene), o - chlorotoluene (o -chlorotoluene), m - chlorotoluene (m -chlorotoluene), p - chlorotoluene (p -chlorotoluene), o - toluidine (o
  • the TodS protein having the 43rd-978th or 23rd-978th amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is mixed with TodS (43-978) or TodS (23-978), respectively.
  • Another embodiment of the present invention is based on the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the PAS1 protein having amino acid sequence 23-168, or 43-168 amino acid sequence of the TodS protein of SEQ ID NO: It provides a PAS1 variant protein having one or more mutations selected from the group consisting of a) to (q).
  • the PAS1 mutant protein of the present invention has a higher or lower sensitivity to various aromatic hydrocarbons than the wild type PAS1 protein, and thus may be usefully used for the detection and / or degradation of aromatic hydrocarbons.
  • PAS1 protein refers to a protein site located at the N-terminus of the TodS protein, which can detect and bind toluene as a ligand to exhibit sensor function for toluene.
  • the PAS1 protein may bind to toluene, and by the binding, the conformational change of the TodS protein may be activated by the structural change of the PAS1 protein, and the TodT phosphorylated by TodS may be activated. in combination with a transcription control region DNA of the tod operon may activate the tod genes.
  • PAS1 protein structure can be obtained from a database such as NCBI GenBank, for example, amino acids 43 to 168 of the TodS protein represented by SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 3), Or amino acid sequence 23 to amino acid sequence 168 (SEQ ID NO: 5).
  • the PAS1 protein is not only a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5, but also 80% or more, specifically 90% or more, more specifically 95% or more, even more specifically 97% And amino acid sequences having at least 98% or 99% homology.
  • sequence having such homology is an amino acid sequence having a biological activity substantially the same as or corresponding to that of the protein of SEQ ID NO or SEQ ID NO: 4, even if some sequences have an amino acid sequence deleted, modified, substituted or added, It is obvious that it is included in the category.
  • PAS1 mutant protein refers to a protein obtained by substituting, inserting, removing or modifying one or more amino acids in a wild-type PAS1 protein.
  • the PAS1 mutant protein may increase sensitivity to toluene ligand or It may mean, but is not limited to, a protein modified to lower or altered to change the sensitivity to ligands other than toluene.
  • the PAS1 mutant protein has one or more mutations selected from the group consisting of (a) to (q), as long as its ability to bind aromatic hydrocarbons is controlled as compared to wild-type PAS1 protein. At least 70%, specifically at least 80%, more specifically at least 95%, most specifically at least 97%, 98% or 99% similarity with the amino acid sequence from the 168th to 168th amino acids or from the 23rd to 168th amino acid sequences It is obvious that proteins comprising amino acid sequences are also included within the scope of the present invention.
  • the PAS1 protein having the 43rd-168th or 23rd-168th amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is mixed with PAS1 (43-168) or PAS1 (23-168), respectively.
  • phenylalanine No. 46 is alanine or serine
  • 59 valine is alanine
  • 63 alanine is valine or serine
  • tryptophan 84 histidine or arginine
  • tryptophan 85 histidine, marginine, or leucine
  • isofucin valine 114 phenylalanine, threonine Or Serine, valine 126 with alanine, serine, threonine, or leucine
  • 128 phenylalanine with glutamic acid, histidine, aspartic acid, serine or leucine, 145 alanine with serine or valine
  • TodS mutant protein in the TodS protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 619 tyrosine and 620 glutamic acid are substituted with alanine, 666 glutamic acid is substituted with alanine, 674 leucine is substituted with alanine, 691 TodS mutant protein was prepared by replacing tyrosine with isoleucine, alanine 703 with serine, or amino acids 617 to 623, to confirm the detection ability according to the ligand.
  • TodS mutant protein (I114V TodS, SEQ ID NO: 7) substituted with isoleucine 114 in the TodS protein of SEQ ID NO: 1 in the present invention
  • the PAS1 variant protein having an amino acid sequence of 43 to 168 or 23rd to 168th in the amino acid sequence of the TodS variant protein may be used as one or more aromatic hydrocarbon detection sensors selected from the group consisting of toluene and m -xylene. .
  • the I114V TodS can be used as toluene or / and m -xylene sensing sensor.
  • Toluene or / and / or the like for example, by introducing a system into a microorganism comprising a system comprising three components of a polynucleotide encoding I114V TodS, a polynucleotide encoding TodT, and a reporter gene operably linked to a promoter of a tod operon. It can be used as m -xylene detection sensor.
  • the TodS variant protein (Q61R TodS, SEQ ID NO: 8) in which glutamine amino acid No. 61 in the TodS protein of SEQ ID NO: 1 is substituted with arginine, or 43 to 168 th or 23rd in the amino acid sequence of the TodS variant protein
  • One or more PAS1 variant proteins having an amino acid sequence of the first to 168th amino acids are selected from the group consisting of toluene, styrene, m -xylene, o -xylene, and 1,2,4-TMB (1,2,4-Trimethylbenzene) It can be used as aromatic hydrocarbon detection sensor.
  • TodS / TodT signaling by toluene is about 2 to 4 times.
  • styrene, m -xylene and o -xylene also exhibited higher sensitivity than wild-type TodS (Experimental Example 10).
  • the Q61R TodS can thus be used as toluene, styrene, m -xylene, and / or o -xylene sensing sensors.
  • toluene, styrene, or the like may be introduced into a microorganism by introducing a system comprising three components of a polynucleotide encoding Q61R TodS, a polynucleotide encoding TodT, and a reporter gene operably linked to a promoter of a tod operon.
  • m -xylene, and / or o -xylene sensing sensors may be introduced into a microorganism by introducing a system comprising three components of a polynucleotide encoding Q61R TodS, a polynucleotide encoding TodT, and a reporter gene operably linked to a promoter of a tod operon.
  • the PAS1 variant protein is included in the TodS variant protein.
  • Another aspect of the invention provides a polynucleotide encoding a TodS variant protein or a PAS1 variant protein; An expression vector comprising said polynucleotide; And a transformant having the expression vector introduced therein.
  • the mutant protein is as described above.
  • Expression vectors comprising the polynucleotide encoding the TodS mutant protein or PAS1 mutant protein provided by the present invention is not particularly limited thereto, and include mammalian cells (eg, human, monkey, rabbit, rat, hamster, mouse cells, etc.). ), And may be a vector capable of replicating and / or expressing the polynucleotide in eukaryotic or prokaryotic cells, including plant cells, yeast cells, insect cells or bacterial cells (e.g., E. coli), preferably The vector may be a vector operably linked to an appropriate promoter for expression of the polynucleotide in a host cell and comprising at least one selection marker.
  • mammalian cells eg, human, monkey, rabbit, rat, hamster, mouse cells, etc.
  • the vector may be a vector operably linked to an appropriate promoter for expression of the polynucleotide in a host cell and comprising at least one selection marker.
  • the term "transformer” refers to a transformant capable of producing a large amount of the water-soluble, water-soluble, and crystalline TodS mutant protein or PAS1 mutant protein of the present invention as a host cell transformed with the vector.
  • the TodS mutant protein or PAS1 mutant protein may be introduced, but may include a transformant capable of screening a candidate for developing a sensor for detection of renal function through NMR or the like, but is not limited thereto.
  • the transformant may also be prepared as a microbial strain that degrades contaminants such as aromatic hydrocarbons.
  • the transformant introduced with the expression vector provided in the present invention is not particularly limited thereto, but bacteria cells such as Escherichia coli and Pseudomonas transformed by introducing the expression vector (eg, Pseudomonas putida); Yeast cells; Fungal cells such as Pchia pastoris; Or plant cells.
  • bacteria cells such as Escherichia coli and Pseudomonas transformed by introducing the expression vector (eg, Pseudomonas putida); Yeast cells; Fungal cells such as Pchia pastoris; Or plant cells.
  • introduction refers to a method of delivering an expression vector containing a polynucleotide encoding the PAS1 protein to a host cell.
  • introductions include calcium phosphate-DNA coprecipitation, DEAE-dextran-mediated transfection, polybrene-mediated transfection, electroshock, microinjection, liposome fusion, lipofectamine and protoplast fusion. It can be carried out by various methods known in the art.
  • transduction refers to the delivery of a target product into cells using viral particles by means of infection.
  • the vector can be introduced into the host cell by gene bombardment or the like. Introduction in the present invention can be used interchangeably with transformation.
  • Another embodiment of the present invention provides a microorganism producing the TodS variant protein or PAS1 variant protein.
  • the mutant protein is as described above.
  • Microorganisms producing the TodS variant protein or PAS1 variant protein include not only microorganisms which produce the variant protein as a wild type protein without mutation, but also microorganisms which have produced the variant protein by artificial and / or natural mutations.
  • the TodS mutant microorganism to produce a protein or PAS1 mutant protein may be a Pseudomonas (Pseudomonas) in microorganisms, more specifically, the footage Pseudomonas (Pseudomonas putida), but is not limited thereto.
  • Another aspect of the invention provides a combination of (i) a module for sensors comprising the modules of (a) to (d) below; (ii) an expression cassette comprising a polynucleotide encoding said module combination; (iii) a vector comprising said expression cassette; Or a biosensor for detecting an aromatic hydrocarbon containing a microorganism comprising any of (i) to (iii):
  • the PAS1 mutant protein of the present invention specifically binds to an aromatic hydrocarbon to induce self-phosphorylation of the kinase protein to generate and transmit a phosphate signal
  • a transcriptional regulator is activated by the transmitted signal to bind to a promoter of a labeled protein.
  • the labeled protein since the label protein is expressed according to the type of aromatic hydrocarbon by the sensor module combination including the first module to the fourth module, the biosensor including the module combination may be used for aromatic hydrocarbon detection.
  • mutant protein, vector and aromatic hydrocarbon are as described above.
  • the signal of the second module means a signal generated when the PAS1 mutant protein specifically binds to a specific aromatic hydrocarbon.
  • the signal of the second module may be generated and / or delivered by autophosphorylation of the kinase protein by binding of the PAS1 mutant protein to a specific aromatic hydrocarbon, and more specifically, by autophosphorylation of the primary kinase protein (HK 1).
  • the generated phosphate signal may be delivered through one or more proteins selected from the group consisting of a response regulator (RRR), a PAS2 protein, and a secondary kinase protein (HK 2).
  • the kinase protein, the reaction modulator and the PAS2 protein are not particularly limited as long as they can generate and / or transmit a phosphate signal.
  • the kinase protein, the reaction modulator and the PAS2 protein may be derived from the genus Pseudomonas, more specifically Pseudomonas putida.
  • the second module may include a protein excluding the PAS1 mutant protein among the TodS mutant proteins of the present invention.
  • a protein excluding the PAS1 mutant protein among the TodS mutant proteins of the present invention examples include 70% or more, specifically 80% or more, amino acid sequence of a protein excluding PAS1 mutant protein of the TodS mutant protein of the present invention as long as it can generate and / or transmit a phosphate signal by autophosphorylation. May also comprise a protein having an amino acid sequence of at least 95%, most specifically 97%, 98% or 99%.
  • the third module includes a transcriptional regulator that is phosphorylated and activated by a phosphate signal transmitted from the second module.
  • the activating transcriptional regulator is not limited as long as it can express the labeling protein, but may be specifically TodT protein, more specifically derived from the genus Pseudomonas, more specifically Pseudomonas putida.
  • information such as the amino acid sequence and the nucleotide sequence of the TodT protein may be obtained from a database such as NCBI GenBank, and may be, for example, an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 or a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 10.
  • the TodT protein is not only a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 or the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10, but also 80% or more, specifically 90% or more, more specifically 95% or more, even more specifically May comprise an amino acid sequence or nucleotide sequence having at least 97%, 98% or 99% homology. If the sequence having such homology is a sequence having a biological activity substantially the same as or corresponding to that of the protein of SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 10, even if some of the sequences have a sequence deleted, modified, substituted or added, the scope of the present invention Inclusion in is self-evident.
  • the fourth module means a module expressing a label protein by the third module.
  • the expression of the protein may be achieved by binding to a promoter that phosphorylated and activated transcriptional regulator of the third module expresses the labeling protein.
  • the fourth module may include a promoter to which the phosphorylated transcriptional regulator of the third module binds and a gene encoding a label protein operably linked to the promoter, but is not limited thereto.
  • the promoter is not limited as long as the phosphorylated transcriptional regulator can bind to express a label protein, but may be specifically a todX promoter, more specifically, a microorganism of the genus Pseudomonas, and more specifically, Pseudomonas putida. .
  • information such as the base sequence of the todX promoter may be obtained from a database such as NCBI GenBank, for example, the base sequence represented by SEQ ID NO: 7.
  • the todX promoter is not only a promoter having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7, but also 80% or more, specifically 90% or more, more specifically 95% or more, even more specifically 97%, 98% or It may include a base sequence having more than 99% homology. If the sequence having such homology has a nucleotide sequence having a biological activity substantially the same as or corresponding to that of the promoter of SEQ ID NO: 7, the case where some sequences have a nucleotide sequence deleted, modified, substituted or added is also included in the scope of the present invention. Is self-explanatory.
  • the label protein is specifically a fluorescent protein and variant (GFP, YFP, RFP, CFP, etc.), alkaline phosphatase (firefly luciferase), bioluminescent microorganisms (Vibrio, Genor Xenorhabdus , Photorhabdus , and Photobacterium , etc.) and beta-galactosidase may be one or more selected, and more specifically, Beta-galactosidase, but is not limited thereto.
  • GFP fluorescent protein and variant
  • alkaline phosphatase firefly luciferase
  • bioluminescent microorganisms Vibrio, Genor Xenorhabdus , Photorhabdus , and Photobacterium , etc.
  • beta-galactosidase may be one or more selected, and more specifically, Beta-galactosidase, but is not limited thereto.
  • the microorganism that can be used as a biosensor for detecting aromatic hydrocarbons in the present invention is not limited as long as it can express a label protein specifically according to aromatic hydrocarbons, including a module combination of the first module to the fourth module. It may be a microorganism of the genus Monas, more specifically Pseudomonas putida.
  • the biosensor may further include a substance capable of measuring the expression of a labeled protein, but is not limited thereto.
  • a cassette consisting of TodT binding promoter P todX , ⁇ -galactosidase gene lac Z, and streptomycin resistance gene Sm R in the mex C gene of Pseudomonas putida KT2440 chromosome (P todX - lac Z) -Pseudomonas putida KT24400-PXZ reporter strain inserted with Sm R ) was prepared, and the TodS / TodT plasmid transformed with the TodS / TodT plasmid at the toluene-binding site in PAS1 was transformed into Pseudomonas transformants. Produced.
  • the Pseudomonas transformants were incubated in a 96-well deep plate, and agonists toluene, styrene, m -xylene or antagonists o -xylene and 1,2,4-TMB ligand, respectively.
  • 4-MUG 4-methylumbelliferyl ⁇ -galactopyranoside
  • Another aspect of the invention provides a combination of (i) a module for sensors comprising the modules of (a) to (d) below; (ii) an expression cassette comprising a polynucleotide encoding said module combination; Or (iii) containing a microorganism comprising a vector comprising said expression cassette, providing a microbial agent for degrading aromatic hydrocarbons:
  • the modular combination of the microbial agent for decomposing the aromatic hydrocarbon of the present invention is a form in which the label protein of the fourth module is replaced with the aromatic hydrocarbon decomposed protein in the module combination of the biosensor. That is, since the aromatic hydrocarbon degradation protein is expressed according to the type of aromatic hydrocarbon by the module combination including the first to fourth modules, the microbial agent including the module combination can be used to decompose the aromatic hydrocarbon.
  • the mutant protein, the vector, the aromatic hydrocarbon, the first module, the second module and the third module are as described above.
  • the aromatic hydrocarbon decomposed protein of the fourth module may be selected from various proteins known to decompose aromatic hydrocarbons, and may be two or more proteins required to decompose one aromatic hydrocarbon, or one capable of decomposing two or more aromatic hydrocarbons.
  • the protein may be, but is not limited thereto.
  • the aromatic hydrocarbon-degrading protein of the fourth module is toluene dioxygenase (todene C1C2), cis-toluene dihydrodiol dehydrogenase (todD) required to decompose toluene.
  • 30-methylcatechol 2,3, -dioxygase (todE) and 2-hydroxy-6-oxo-2,4-hexadienoate hydrolase ( 2-hydroxy-6-oxo-2,4-heptadienoate hydrolase, todF) may be one or more selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • the aromatic hydrocarbon-degraded protein of the fourth module is styrene monooxygenase (styAB ), styrene oxide isomerase (styC ), phenylacetaldehyde, which are required to decompose styrene.
  • styAB styrene monooxygenase
  • styC styrene oxide isomerase
  • phenylacetaldehyde which are required to decompose styrene.
  • One or more selected from the group consisting of penylacetaldehyde dehydrogenase ( styD ), and phenylacetyl coA ligase ( paaF2 ) but is not limited thereto.
  • the aromatic hydrocarbon-degrading protein of the fourth module is xylene monooxygenase, benzyl alcohol dehydrogenase, benzaldehyde di, which are required to decompose m -xylene.
  • Benzaldehyde dehydrogenase, toluate dioxygenase, and 1,2-dihydroxy-3-methylcyclohexa-3,5-dienecarboxylate dehydrogenase (1,2- dihydroxy-3-methylcyclohexa-3,5-dienecarboxylate dehydrogenase) may be one or more selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • the aromatic hydrocarbon-degrading protein of the fourth module is xylene monooxygenase, benzyl alcohol dehydrogenase, benzaldehyde di, which are required to decompose o -xylene.
  • Benzaldehyde dehydrogenase, toluate dioxygenase, 1,2-dihydroxy-6-methylcyclohexa-3,5-dienecarboxylate dehydrogenase (1,2-dihydroxy -6-methylcyclohexa-3,5-dienecarboxylate dehydrogenase ), o - xylene 3,4-dioxygenase dehydratase (o-xylene 3,4-dioxygenase) , catechol 2,3-dioxygenase dehydratase (catechol 2,3 dioxygenase), o -xylene 4,5-dioxygenase, and 4,5-dimethylcatechol 2,3-dioxygenase (4,5-dimethylcatechol 2,3- dioxygenase) may be one or more selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • the microorganism that can be used as a microbial agent for decomposing the aromatic hydrocarbon in the present invention is not limited as long as it can express the degraded protein specifically according to the aromatic hydrocarbon, including a modular combination of the first to fourth modules. It may be a microorganism of the genus Pseudomonas, even more specifically Pseudomonas putida.
  • Pseudomonas genus microorganism requires styABCD operon for catabolism of styrene in addition to toluene, styABCD operon is regulated by the styS / styR two factor signaling system.
  • styrene phosphorylates styR to upregulate sty operon expression, but styS also inhibits sty operon expression in the presence of glucose in preference to styrene.
  • StyS like TodS, also functions as a sensor kinase, and styrene binding is assumed to occur in the PAS domain.
  • the PAS1 mutant protein which was redesigned based on the conformational information of the PAS1 protein that binds toluene, was introduced into StyS that specifically reacted by styrene binding to decompose styrene contaminants in soil. It can be made possible.
  • Another aspect of the invention provides an aromatic hydrocarbon sensing composition comprising the biosensor.
  • Yet another aspect of the present invention provides a composition for decomposing aromatic hydrocarbon, comprising the microbial agent.
  • Another aspect of the invention provides an aromatic hydrocarbon detection method comprising the step of exposing the biosensor to a sample.
  • the biosensor of the present invention can detect a specific aromatic hydrocarbon by measuring the expressed labeled protein.
  • the aromatic hydrocarbon detection method of the present invention may further comprise the step of measuring the expression level of the labeled protein of the biosensor and comparing it with the control.
  • the aromatic hydrocarbon detection method of the present invention may further include determining that the aromatic hydrocarbon is present in the sample when the expression level of the labeled protein is increased compared to the control.
  • Yet another aspect of the present invention provides a method for decomposing an aromatic hydrocarbon, comprising decomposing an aromatic hydrocarbon using the microbial agent.
  • the microbial agent of the present invention expresses an aromatic hydrocarbon decomposing protein according to the type of aromatic hydrocarbon, it is possible to decompose specific aromatic hydrocarbons.
  • Another aspect of the invention provides a method of crystallizing a PAS1 protein comprising crystallizing a PAS1 protein having a 43rd to 168th amino acid sequence from a TodS protein of SEQ ID NO: 1, and from the TodS protein of SEQ ID NO: Crystallizing a mixture of PAS1 protein with toluene or 1,2,4-TMB (1,2,4-Trimethylbenzene) having the 43rd to 168th amino acid sequence, and the PAS1 protein with toluene or 1,2,4 Provided are methods for crystallizing complexes of -TMB.
  • Toluene and 1,2,4-TMB (1,2,4-Trimethylbenzene), which are ligands that bind to the crystals of the PAS1 protein alone (named 'Apo-PAS1'), and to the PAS1 protein site of TodS, respectively, and the PAS1 protein
  • Specific details of the present invention for the preparation of crystals of the complex is as follows.
  • PAS1 refers to a crystal formed by the PAS1 protein alone.
  • the PAS1 protein exists as a dimer of two molecules even in the absence of a ligand, but the structure between amino acids 150 and 168 has a high flexibility.
  • SeMet-PAS1 protein refers to a protein in which methionine of PAS1 is substituted with selenomethionine (SeMet).
  • the selenium methionine refers to an amino acid obtained by replacing sulfur ( 32 S) constituting methionine with selenium ( 75 Se) which is a cognate element.
  • Selenomethionine has similar kinetics and chemical properties to the original methionine, and is used to solve the phase problem to obtain three-dimensional crystal structure in the absence of similarly shaped stereostructures as found in X-ray crystallography.
  • selenomethionine In order to analyze the structure of these proteins, a method of crystallizing methionine with selenomethionine may be referred to as selenomethionine.
  • SeMet-PAS1 in which methionine constituting the protein is substituted with selenomethionine was prepared and crystallized by mixing with toluene.
  • the methionine nutrient E the methionine nutrient E.
  • SeMet-substituted PAS1 protein was purified and obtained by adding 5 mM methionine to all buffers.
  • toluene refers to a colorless volatile, flammable liquid, methylbenzene in which one hydrogen of benzene is substituted with a methyl group as aromatic hydrocarbon.
  • the toluene which is mostly produced from petroleum by a catalyst reforming method, but is partially produced by gasoline pyrolysis in ethylene and propylene manufacturing.
  • the toluene may have a chemical formula of C 6 H 5 CH 3 .
  • the term "complex of SeMet-PAS1 protein and toluene” means a complex formed by the interaction between SeMet-PAS1 protein and toluene. Specifically, phenylalanine No. 46, glycine No. 48, valine No. 59, alanine No. 63, alanine No. 79, phenylalanine No. 84, tryptophan No.
  • Tryptophan 85 isoleucine 114, 126 valine, 128 phenylalanine, 145 alanine, glycine and toluene 147 may refer to a complex formed by a hydrogen bond or a water molecule-mediated hydrogen bond. May be, but is not limited thereto.
  • the binding structure between SeMet-PAS1 protein and toluene was confirmed by analyzing the crystal structure produced in the present invention. Specifically, it was confirmed that toluene binds to the PAS1 hydrophobic ligand binding site. Intimate binding between the two SeMet-PAS1 monomers occurred through each SeMet-PAS1 monomer 47 valine, 49 leucine and 131 leucine. In addition, the structural changes of phenylalanine No. 46, glutamic acid No. 146 and arginine No. 148, which occurred when ligand binding to PAS1 protein, were very important for morphological changes of TodS protein dimers and signal transmission to tod operon genes.
  • the benzene ring of the toluene ligand is located in the space formed by phenylalanine no. 46, phenylalanine no. 79, tryptophan no. 84, tryptophan no. 85, phenylalanine no. 63, alanine no. 63, isoleucine no. 114, valine no. 147, 147 Glycine also played an important role in binding to toluene. It was also confirmed that the methyl group of toluene was surrounded by amino acid residues of glycine 48, valine 59 and alanine 145.
  • 1,2,4-TMB (1,2,4-trimethylbenzene)
  • the 1,2,4-TMB is mostly produced from petroleum or coal.
  • the 1,2,4-TMB may have a chemical formula of C 9 H 12 .
  • 1,2,4-TMB can bind to PAS1 protein, and the conformational change of TodS protein caused by the structural change of PAS1 protein by the binding inactivates the autophosphorylation of TodS protein. But may not be limited thereto.
  • the term "complex of PAS1 protein and 1,2,4-TMB” refers to a complex formed by the interaction between PAS1 protein and 1,2,4-TMB.
  • the 1,2,4-TMB ligand is also a phenylalanine, 48 glycine, 59 valine, 63 alanine, 79 phenylalanine, 84 tryptophan, 85 tryptophan, 114 Hydrogen bonds or water molecule-mediated hydrogen bonds with isoleucine, 126 valine, 128 phenylalanine, 145 alanine, and / or glycine 147 to form the complex, but are not limited thereto. .
  • crystal growth or “crystallinity” means the introduction of mutations into a protein molecule to bring the protein into a suitable state for X-ray protein tertiary structure analysis, and the like. It refers to the formation of solid particles having a uniform shape and size from a uniform liquid phase, or to a more stable crystal state of proteins. The three-dimensional structure of proteins is very important for understanding their in vivo functions and for elucidating molecular mechanisms.
  • the crystallization method in this step may use a variety of known crystallization method, specifically, it may be carried out by the vapor diffusion method (vapor diffusion method).
  • the vapor diffusion method includes a sitting drop vapo-diffusion method or a hanging-drop vapor diffusion method, and more specifically, may be performed by a sitting drop vapor diffusion method, but is not limited thereto. Do not.
  • sheeting drop vapor diffusion refers to the migration of water or other volatiles between small droplets of mother liquor and a much larger reservoir solution in a confined space. It is a supersaturated state in the solution condition of the protein, and the crystallization method using the precipitated protein in accordance with the change of the precipitant in the thermodynamic metastable state. As the protein precipitates, it slows down to a stable crystallization state, known as a precipitant, to reduce the solubility of the concentrated protein solution, and to reduce the relative adsorption layer around the protein molecule. They gather together and form a crystal.
  • the reservoir solution is a mixture of such precipitants, buffers, salts, surfactants (detergent) in different concentrations
  • the protein solution and the reservoir solution of these various conditions is usually mixed in a ratio of 1: 1 to form droplets
  • the drops thus obtained are placed on a microbrige and sealed. At this time, the concentration of the protein in the droplet is different from the concentration of the reservoir solution initially, so that the protein does not exist in the crystalline state. When left in this sealed state, equilibrium is gradually achieved, and crystals can be formed under specific conditions by the above-described principle.
  • the term "Hanging-drop vapor diffusion method” is one of the crystallization methods of proteins, a method of providing a crystal of sufficient size to analyze the protein structure.
  • Droplet mixed vapor diffusion attaches a reagent containing a sample and a pure reagent in liquid form to the top of the vessel in vapor equilibrium. In order for the sample with less reagent to reach equilibrium, the water contained in the sample falls into the container, so that the water contained in the sample is removed until the concentration is the same as the reagent in the liquid state. The protein crystals reached can be obtained.
  • crystals of PAS1 protein (Apo-PAS1), SeMet-PAS1 protein and toluene complexes, and PAS1 protein and 1,2,4-TMB complexes were obtained using sheeting drop vapor diffusion. .
  • the present invention provides an optimized method by which PAS1 protein alone or toluene or 1,2,4-TMB complexes thereof can be prepared.
  • the method can be carried out via a seating drop vapor diffusion method.
  • PAS1 protein and toluene or 1,2,4-TMB are 1: 2 to 1:20 (PAS1 protein: toluene or 1,2,4-TMB), more specifically, in a molar ratio of 1: 2. It may be a mixture.
  • the PAS1 protein used in the method of the present invention may be a protein obtained by separately expressing or purifying a protein present in nature, and the purification may be a purification method well known in the art. Therefore, prior to performing the step of crystallization in the method, may include the step of purifying the PAS1 protein, the purification of the protein may be performed by a known purification method such as affinity chromatography. Examples include immunoaffinity chromatography, receptor affinity chromatography, hydrophobic action chromatography, lectin affinity chromatography, size exclusion chromatography, cation or anion exchange chromatography, high performance liquid chromatography (HPLC), reverse phase HPLC, and the like.
  • the host cells can be separated from the medium in which the host cells are grown by conventional chromatography methods.
  • Purified protein can be cleaved into the desired protein portion or left on its own. Cleavage of the fusion protein may result in the desired protein form with additional amino acids in the cleavage process.
  • the crystallization may be made under a reservoir solution condition containing ammonium phosphate and tris hydrochloride.
  • the crystallization is a solution containing 2.8 to 3.0M ammonium phosphate (eg ammonium phosphate dibasic, trihydrate) and 0.01 to 0.1M, specifically 0.1M Tris-Hydrochloride (pH 8.0 to 8.5) It may be made under the conditions.
  • ammonium phosphate eg ammonium phosphate dibasic, trihydrate
  • Tris-Hydrochloride pH 8.0 to 8.5
  • a protein solution further comprising a PAS1 protein or a ligand thereof may be added, mixed, and equilibrated to prepare crystals.
  • the protein solution including the PAS1 protein may include PAS1 protein at a concentration of 5 to 10 mg / ml, but is not limited thereto.
  • the protein solution may be a solution containing the PAS1 protein at a concentration of 10 mg / ml.
  • the reservoir solution and the protein solution are preferably mixed in a ratio of 1: 1, but are not limited thereto.
  • the mixed solution can be attached to the top of the reservoir under a closed cover slip or to the top of the container so that the crystals become larger.
  • the crystallization may be performed by standing on ice for 1 to 24 hours, for example, 1 to 2 hours.
  • it was possible to obtain a complex by mixing purified PAS1 and toluene in a 1: 2 molar ratio using a sheet drop steam diffusion method at 21 ° C. and standing on ice for 1 hour. Crystallization of the protein was optimally formed under 0.1M Tris-Hydrochloride conditions at 3.0 M ammonium phosphate dibasic (trihydrate), pH 8.0.
  • Another aspect of the invention provides PAS1 protein crystals, crystals of SeMet-PAS1 protein and toluene complex, and crystals of PAS1 protein and 1,2,4-TMB complex.
  • PAS1, SeMet-PAS1, toluene, 1,2,4-TMB, complexes and crystals are as described above.
  • methionine may be a crystal of SeMet-PAS1 protein and toluene complex, which is selenomethionine.
  • space group refers to the symmetry of a unit cell of a crystal, and when the symmetric elements are combined, a group is formed. The space is mixed with a space group.
  • unit-cell dimension is also referred to as the lattice coefficient
  • the unit cell is the most easily interpreted minimum repeating unit (repeating unit) constituting the space group, is defined by three crystallographic axes , The length ( a , b , c ) for these three vectors and the angles ( ⁇ , ⁇ , ⁇ ) they form.
  • a , b , and c may be represented by A, B, and C , respectively.
  • the phase information may be obtained through multiple isomorphous replacement, multiwavelength anomalous dispersion, and molecular replacement.
  • the heavy metal substitution method is to replace various crystals with heavy metals, collect data, analyze the information, and obtain phase information.
  • multi-wavelength analysis is one of the techniques widely used to obtain phase information after collecting data by using anomalies of atoms at various wavelengths by using specific metals or atoms in the crystal instead of heavy metals.
  • the amino acid methionine can be replaced with selenium methionine (Se-Met) using molecular biological method from one crystal without the hassle of collecting data from multiple crystals. There is a disadvantage that must be obtained only in the radiation.
  • the structure substitution method solves the topology problem from similar structures already known.
  • the dispersion data for the crystals of the present invention, Apo-PAS1 protein was measured at a resolution of 1.5 Hz.
  • Single wavelength abnormal diffraction data for the crystalline crystals of the SeMet-PAS1 / toluene complex were collected with PAS1 / 1,2,4-TMB composite crystals at 1.65 Hz resolution. All data was analyzed with the HKL2000 software package.
  • the structure of the SeMet-PAS1 / toluene complex was determined by analyzing the SOLVE program for abnormal signals from Se atoms. Density control and sequential automated model building procedures were performed with the RESOLVE program.
  • the complex crystal structure was revealed at 1.65 ⁇ s resolution through molecular substitution using the MOLREP program using a partial improvement model of SeMet crystals. Complex crystal structure was calibrated with COOT program and improved using REFMAC5.
  • the atomic coordinates and structure factor amplitudes for PAS1 alone protein (Apo-PAS1), SeMet-PAS1 protein and toluene complexes, and PAS1 and 1,2,4-TMB complexes obtained in this way are the PDB (Protein Data Bank).
  • Each accession code is 3X18 for PAS1 protein alone (Apo-PAS1), 3X19 for SeMet-PAS1 / toluene conjugates, and 3x19 for PAS1 / 1,2,4-TMB. Is 3X1A. Crystal information about this is shown in Table 3, and atomic coordinates are shown in Tables 4 to 6, respectively.
  • Another embodiment of the present invention is (a) atomic coordinates of the PAS1 protein shown in Table 4, atomic coordinates of the SeMet-PAS1 protein and toluene complex shown in Table 5 or PAS1 protein shown in Table 6 and 1,2,4- Designing a tertiary structure of the PAS1 protein or a complex thereof using atomic coordinates of the TMB (1,2,4-Trimethylbenzene) complex; (b) generating a candidate substance that binds to PAS1 using the designed tertiary structure; And (c) determining whether the candidate substance modulates the binding between the PAS1 protein or TodS protein comprising PAS1 and the ligand, wherein the substance modulates the binding between the PAS1 protein or TodS protein and ligand.
  • Table 4 atomic coordinates of the SeMet-PAS1 protein and toluene complex shown in Table 5 or PAS1 protein shown in Table 6 and 1,2,4- Designing a tertiary structure of the PAS1 protein or a complex
  • PAS1 protein complex, toluene, 1,2,4-TMB and the like are as described above.
  • the atomic coordinates for the PAS1 protein or complexes thereof can be stored in a medium for continuous use with a computing device such as a computer.
  • the coordinates may be stored in a medium useful for storing large amounts of data, such as magnetic or optical media (ie, floppy disks, hard disks, compact disks, magneto-optical media or electronic media, etc.).
  • magnetic or optical media ie, floppy disks, hard disks, compact disks, magneto-optical media or electronic media, etc.
  • the selection of computers, storage media, networking and other devices or technologies in this regard will be familiar to those skilled in the art of structure / computation chemistry.
  • Step (a) of the screening method comprises the steps of inputting data on atomic coordinates, etc., for the tertiary structure for the complex, together with a suitable software program on a computer; And representing a three-dimensional protein structure capable of visualization and further computer manipulation.
  • Step (b) of the screening method is a step of generating a candidate substance that binds to PAS1 using the designed tertiary structure.
  • a computer-readable medium containing data on atomic coordinates and / or three-dimensional structure representations may be used for various protein sites including interaction sites. Information may be provided. Through this process, it is possible to predict the reaction pattern without carrying out actual experiments on a number of new drug candidates, and increase the economics of drug development by conducting experiments on selected substances according to the results.
  • the term “candidate material” includes, without limitation, aromatic compounds as long as it is a substance capable of binding to PAS1. That is, based on the tertiary structure of the analyzed PAS1 protein or a complex thereof, a substance synthesized, manufactured or modified to have a structure capable of binding to or predicting a structure capable of binding to a corresponding PAS1 site may be included without limitation. can do. For example, it may be an aromatic hydrocarbon bonded to PAS1, and more specifically, may be an aromatic hydrocarbon described below, but is not limited thereto.
  • the step (c) is a step of confirming whether the candidate substance modulates the binding between the PAS1 protein or the TodS protein including PAS1 and the ligand.
  • whether the candidate substance modulates the binding between the protein and the ligand is determined by measuring the level of the labeled protein expressed by the candidate substance using a biosensor containing PAS1 protein or TodS protein comprising PAS1 protein. You can check it.
  • step (c) comprises (i) a combination module for sensors comprising the modules of (a ') to (d') below; (ii) an expression cassette comprising a polynucleotide encoding said module combination; (iii) a vector comprising said expression cassette; Or by measuring the level of the labeled protein expressed by the candidate using a biosensor containing a microorganism comprising any of (i)-(iii):
  • a transcriptional regulator is activated by the transmitted signal to bind to a promoter of a labeled protein to bind a label protein.
  • Expression That is, since the labeled protein is expressed according to the candidate substance by the sensor module combination including the first to fourth modules, a substance for controlling the binding between the PAS1 protein or the TodS protein and the ligand by measuring the expression level of the labeled protein. Can be screened.
  • beta-galactosidase protein was used as a label protein.
  • the agonist of TodS may be further included, and reducing the expression of the labeled protein as compared to the control group may further include determining the antagonist of TodS.
  • Another embodiment of the present invention is (a) atomic coordinates of the PAS1 protein shown in Table 4, atomic coordinates of the SeMet-PAS1 protein and toluene complex shown in Table 5 or PAS1 protein shown in Table 6 and 1,2,4- Designing the tertiary structure of the PAS1 protein or complex thereof using the atomic coordinates of the TMB complex; (b) generating a PAS1 variant protein using the designed tertiary structure; And (c) measuring the binding activity between the generated PAS1 mutant protein and a given ligand.
  • the method provides a method for screening a PAS1 mutant protein, wherein ligand binding activity is mutated to the wild-type PAS1 protein.
  • PAS1 protein, complex, toluene, 1,2,4-TMB, step (a) and the like are as described above.
  • Step (b) is a step of generating a PAS1 mutant protein using the designed tertiary structure
  • step (c) is a step of measuring the binding activity between the generated PAS1 mutant protein and a given ligand.
  • the binding activity measurement between the mutant protein and a given ligand can be performed by measuring the level of the labeled protein expressed by the binding of the produced PAS1 mutant protein and the ligand using a biosensor.
  • step (c) comprises (i) a combination module for sensors comprising the modules of (a ') to (d') below; (ii) an expression cassette comprising a polynucleotide encoding said module combination; (iii) a vector comprising said expression cassette; Or by measuring the level of a labeled protein expressed by binding between the resulting PAS1 mutant protein and a given ligand using a biosensor containing a microorganism comprising any of (i) to (iii). .
  • a transcriptional regulator is activated by the transmitted signal to bind to a promoter of a labeled protein to label it.
  • the aromatic hydrocarbon binding activity is mutated to the wild-type PAS1 protein by measuring the expression level of the labeled protein. Can be screened for PAS1 variant proteins.
  • beta-galactosidase protein was used as a label protein.
  • the method of the present invention may further comprise the step of (d) determining the PAS1 variant protein, wherein the ligand binding activity is altered for the wild type PAS1 protein, when the measured ligand binding activity is changed relative to the value of the wild type PAS1 protein. Can be.
  • the binding of the PAS1 protein was increased, resulting in tod operon transcription.
  • Whether or not it functions as an activity signal can be compared by quantifying the sensitivity of the redesigned binding site with fluorescent material that is degraded by beta galactosidase expression. Through this screening, it can be judged that the redesign of the binding site is a sensor for detecting a new aromatic chemical compared with the degree of maintaining or enhancing the function of the wild type PAS1.
  • the ligand binding site of PAS1 can be redesigned to prevent or bind to PAS1 to deliver a signal such as toluene.
  • the redesign of the ligand binding site of PAS1 increases the binding affinity for a specific chemical and designes a new sensor design that induces a change to a signal transmissible structure and introduces it to microorganisms to continuously monitor petroleum pollutants in soil.
  • microbial reporter strains can be produced that detect and decompose specific contaminants. That is, it can be used for biological purification.
  • biological purification refers to a method of purifying environmental pollutants using microorganisms by detecting and detoxifying various hardly decomposable pollutants accumulated in the environment (soil, air, river, sea) using microorganisms.
  • Bioremediation is one of the promising technologies utilized as an environmental pollution purification and recovery method in an economical and environmentally friendly way. Therefore, PAS1 sensors designed and manufactured based on the three-dimensional structure information of the present invention are introduced into microbial strains containing genes utilizing benzene-based aromatic volatile environmental pollutants as nutrients to increase the sensitivity of pollutant detection and promote degradation. You can expect the effect.
  • the degradation effect of toluene was revealed in a beta galactosidase reporter expressing strain derived from Pseudomonas putida KT2440, in particular, todS / todT gene, but the expression of tod operon is increased by the structural change of PAS1 protein.
  • a beta galactosidase reporter expressing strain derived from Pseudomonas putida KT2440 in particular, todS / todT gene, but the expression of tod operon is increased by the structural change of PAS1 protein.
  • it is not limited to this strain.
  • Substrate or ligand that can be applied to the method of the present invention may be an aromatic hydrocarbon, for example benzene, ethylbenzene, propylbenzene, butylbenzene, nitrobenzene, chlorobenzene (chlorobenzene), benzene (fluorobenzene) fluoro, toluene (toluene), styrene (styrene), o - xylene (o -xylene), m - xylene (m -xylene), p - xylene (p - xylene), o - chlorotoluene (o -chlorotoluene), m - chlorotoluene (m -chlorotoluene), p - chlorotoluene (p -chlorotoluene), o - toluidine (o -toluidine),
  • the bacterial strains used in the present invention and the prepared plasmids are summarized in Table 1 below.
  • the todS gene which encodes the TodS (TodS (43-978), TodS (23-978)) protein having the 43rd-978th amino acid sequence or the 23rd-978th amino acid sequence of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, is derived from Pseudomonas putida ( Pseudomonas Putida ) F1 genomic DNA as a template was amplified by PCR.
  • the amplified TodS protein (SEQ ID NO: 43-978 amino acid of SEQ ID NO: 1) through the Nco I and Xho I sites of the expression vector pET28b (+) (Novagene, USA) of the protein to which 6 histidine tags are bound to the C-terminus. Gene of the sequence) was inserted.
  • the gene of the TodS protein (SEQ ID NO: 23-978 amino acid sequence) through the Bam HI and Xho I site of the protein expression vector pGST-Parallell (Sheffield et al., 1999) in which GST is bound to the N-terminus was inserted.
  • PAS1 (SEQ ID NO: 3, PAS1 (43-168), Fig. 1A) protein having the 43rd-168th amino acid sequence of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or PAS1 having the 23rd-168th amino acid sequence (SEQ ID NO: 5, PAS1 a pas 2 gene, encoding the PAS2 protein of 729 amino acid sequence - (23 - 168)) encoding the protein, pas 1 genes (respectively SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 6) and SEQ ID NO: 1 amino acid sequence of 611 of the After amplification by PCR using the TodS expression vector, NcoI and XhoI of the pHis-Parallell vector (Sheffield et al., 1999) having six histidine tags and an rTEV protease cleavage site at the N-terminus Inserted at site.
  • pHis-Parallell vector Sheffield et al., 1999
  • the tod ST promoter and the tod ST gene of Pseudomonas putida F1 were amplified by PCR using TodSTpp-u and TodSTpp-m primers and TodST-F and TodST-R primers, respectively.
  • TodSTpp-u and TodSTpp-m primers and TodST-F and TodST-R primers were amplified by PCR using TodSTpp-u and TodSTpp-m primers and TodST-F and TodST-R primers, respectively.
  • pBBR-P todST- TodST was generated by inserting tod ST into the Sac I and Hind III sites of pBBR-P todST to express tod ST under the wild-type tod ST promoter.
  • the expression plasmid did not contain a green fluorescent protein gene.
  • Mutants were also made via site-directed mutations using the QuicKChange Site-Directed Mutagenesis kit (Stratagene, USA). L71M mutations were induced in PAS1 (43-168) for substitution with selenomethionine (SeMet) to determine the crystal structure. All mutants were confirmed by DNA sequencing (Macrogene, Korea). The primers used to make the plasmids and the various mutants are shown in Table 2 below.
  • E. coli and Pseudomonas putida strains were cultured in 37 ° C. Luria-Bertani (LB) medium and 30 ° C. LB medium, respectively, in which antibiotics were added at the following concentrations.
  • LB Luria-Bertani
  • Toluene was purchased from Sigma Aldrich, USA.
  • the first letter refers to the original amino acid, the number to the position of the mutation, and the last letter to the amino acid replaced by the mutation.
  • E. coli BL21 Star (DE3) system (Invitrogen, USA) was incubated overnight at 18 ° C with 0.5 mM IPTG (isopropyl ⁇ -D-thiogalactopyranoside), and PAS1 with His 6 tag at the N-terminus (43-168). ) And PAS2 protein. All purification steps were performed using buffer A (containing 50 mM Tris-HCl pH 8.0 and 300 mM NaCl). Cultured cells were harvested, resuspended in Buffer A, and triturated by ultrasound. The milled liquor at 16,000 x g for 1 hour at 4 ° C Centrifuged.
  • Lysates of cells were then loaded onto a Ni-NTA (Qiagen, USA) affinity column to elute six histidine bound proteins with 200 mM imidazole. Eluted protein was treated with rTEV protease; Size-exclusion chromatography using Superdex G75 columns (GE Healthcare, USA); And further Ni-NTA affinity chromatography to remove proteins with His 6 tags and uncut His 6 tags (FIG. 1B). Purified protein present in Buffer A was concentrated to a concentration of 15 mg / ml for later use and stored at -80 ° C.
  • PAS1 (23-168) having a His 6 tag at its N-terminus and its mutant protein were expressed using the E. coli C41 (DE3) system (Lucigen, USA) as described above, followed by ITC (isothermal). For use in titration calorimetry analysis, it was purified by Ni-NTA affinity chromatography using Buffer A with 5% glycerol and 2 mM DTT.
  • SeMet-substituted PAS1 (L71M) was expressed in minimal medium containing 50 mg / ml of SeMet using E. coli B834 (DE3) (Novagen), a methionine nutrient.
  • the purification procedure of SeMet-PAS1 (L71M) was the same as the purification procedure of wild type protein except adding 5 mM methionine to the buffer.
  • TodS (43-978) protein with His 6 tag at the C-terminus was expressed in an E. coli BL21 Star (DE3) system (Invitrogen, USA), Ni-NTA affinity chromatography and Superdex G200 columns (GE Healthcare). , US), and purified by the method described above using size exclusion chromatography.
  • TodS (23-978) protein with GST fused to N-terminus was expressed in E. coli BL21-CodonPlus (DE3) -RIPL system (Agilent, USA) as described above.
  • the cultured cells were harvested and then resuspended in a buffer containing PBS (pH 7.3, LPS solution, Korea), 5% glycerol, 2 mM DTT, and protease inhibitor cocktail (GenDEPOT, USA) and ground by ultrasound.
  • the grinding liquid was centrifuged at 16,000 x g for 1 hour at 4 ° C.
  • the cell lysates were then loaded onto a Glutathione Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare, Sweden) affinity column, followed by 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 300 mM NaCl, 5% glycerol, 2 mM DTT, and a protease inhibitor cocktail.
  • the column was washed using a buffer.
  • GST fusion protein was eluted with 10 mM reduced glutathione.
  • rTEV protease treatment Size exclusion chromatography with Superdex G200 column; And the eluted protein was further purified using GST affinity chromatography to remove GST and GST fusion proteins that were not truncated.
  • Purified TodS (23-978) protein was used for transmission electron microscopy (TEM) analysis.
  • the complex was prepared by incorporating purified PAS1 (43-168) protein alone or by mixing SeMet-PAS1 and toluene (FIG. 1C) in a 1: 2 molar ratio at 21 ° C. at 21 ° C. for 1 hour.
  • SeMet-PAS1 and toluene FIG. 1C
  • PAS1 and 1,2,4-TMB FIG. 1C
  • Apo-PAS1 and PAS1 / 1,2,4-TMB complexes comprise solution conditions comprising 2.8-3.0M ammonium phosphate dibasic (trihydrate), 0.1M Tris-Hydrochloride at pH 8.0-8.5
  • the SeMet-PAS / toluene complex obtained crystals of the complex under solution conditions containing 3.0 M ammonium phosphate, pH 8.0, 0.1 M tris hardochloride.
  • the grown crystals optimally formed the crystals of the complex under solution conditions including 3.0 M ammonium phosphate dibasic (trihydrate), 0.1 M tris hard chloride of pH 8.0.
  • Dispersion data for Apo-PAS1 protein crystals were measured at 1.5 Hz resolution (FIG. 2A).
  • SeMet-substituted PAS1 / toluene complex protein crystals were crystallized in the same manner as described above.
  • Single wavelength abnormal diffraction data for SeMet-substituted crystals were collected at 1.65 Hz resolution (FIG. 2B).
  • PAS1 / 1,2,4-TMB complex protein crystals were crystallized in the same manner as described above and single wavelength abnormal diffraction data was collected at 2.0 kHz resolution (FIG. 2C). All data was analyzed with the HKL2000 software package.
  • the structure of the PAS1 / toluene complex was determined by analyzing the SOLVE program for abnormal signals from Se atoms. Density control and sequential automated model building procedures were performed with the RESOLVE program. The complex crystal structure was revealed at 1.65 ⁇ s resolution through molecular substitution using the MOLREP program using a partial improvement model of SeMet crystals. Complex crystal structure was calibrated with COOT program and improved using REFMAC5. The improvement included a translation-liberation-screw (TLS) process. The final improved model showed R free and R cryst values of 0.23 and 0.18, respectively.
  • TLS translation-liberation-screw
  • PAS1 protein crystals In the PAS1 protein crystals, the Glu168 region of Asn164 of PAS1-A and PAS1-B showed no electron density. However, SeMet-substituted PAS1 / toluene complex protein crystals showed no electron density in the Glu168 region of Glu166 of SeMet-PAS1-A and Glu168 of SeMet-PAS1-B alone (FIGS. 3 to 5).
  • PAS1 / 1,2,4-TMB complex protein crystals did not show electron density only in the Glu168 region of Glu166 of PAS1-A, but PAS1-B showed no electron density from Ala155 to Glu168. It could be assumed that it is a high part. Therefore, residues that do not exhibit the electron density were not included in the model.
  • a calorimetric assay was performed using VP-ITC (MicroCal Inc., USA). The stirling speed was 300 revolutions per minute and the thermal power was recorded every 10 seconds. 2-6 mM toluene dissolved in 0.2% ethanol was titrated against 50 ⁇ M protein (calculated as dimer) in the reaction cell ( ⁇ 1.6 mL). Thermogram analysis of the titration was performed using the Origin package (version 7) provided with the test apparatus.
  • TodS (43-978) protein (Table 1) with His 6 tag at the C-terminus was overexpressed in E. coli, subjected to mass separation and purification by the above method, followed by electron microscopy and single particle analysis (FIGS. 7A to 8C). .
  • the network was identified on a Technai G2 Spirit Twin transmission electron microscope (FEI, Hillsboro, OR, USA) and images were stored with a 4K ⁇ 4K Ultrascan 895 CCD (Gatan, Pleasanton, CA, USA) at 0.36 nm / pixel magnification.
  • TodS (23-978) protein fused with GST at the N-terminus was overexpressed in E. coli, subjected to mass separation and purification by the above method, followed by electron microscopy and single particle analysis (FIGS. 9A to 9B).
  • Purified Apo-TodS protein, TodS / toluene complex and TodS / 1,2,4-TMB complex proteins were each finalized using a buffer containing PBS (pH 7.3), 5% glycerol, 2 mM DTT, and a protease inhibitor cocktail, respectively. Dilute to concentration ⁇ 100-200 nM. Electron microscopy and single particle analysis were performed in the same manner as in Example 5-1 using 5 ⁇ l of each final solution. A total of 482 apo-TodS particles, 411 TodS / toluene particles, 411 particles, and 459 odS / 1,2,4-TMB particles were used for the analysis.
  • Example 6 In vivo ⁇ -galactosidase assay system ( in vivo ⁇ -galactosidase assay system
  • Pseudomonas putida KT24400-PXZ reporter strain was constructed.
  • the strain contained the TodT binding promoter P todX (SEQ ID NO: 11), the gene lac Z (SEQ ID NO: 13), and streptomycin resistance to the mex C gene of Pseudomonas putida KT2440 chromosome.
  • a cassette consisting of the gene Sm R (P todX - lac Z- Sm R ) is inserted. Multiple gene replication steps were performed for reporter strain construction.
  • the 539 bp and 509 bp fragments of the Pseudomonas putida KT2440 mex C gene and the pEXT21 plasmid Sm R gene were identified as mexCn-u and mexCn-d, mexCc-u and mexCc-d, and Sm-N and Sm-C, respectively.
  • the three PCR products were digested using Eco RI and Bam HI, Bam HI and Sph I, and Bam HI, respectively.
  • the cleaved product was then inserted into the Eco RI and Sph I sites of pBR322 (New England Biolabs, Inc., USA) to obtain pSYK123.
  • Pseudomonas putida KT2440 was then transformed with pSYK135 via electroporation.
  • Pseudomonas putida transformants sensitive to Km R and sucrose were selected in LB medium supplemented with 50 ⁇ g / ml kanamycin and 10% sucrose. Single-crossover events in the selected transformants were further confirmed by PCR.
  • Reporter strain with P todX - lac Z- Sm R cassette inserted into the chromosome, formed by second crossover, Pseudomonas putida KT2440-PXZ was screened in LB plates added with 100 ⁇ g / ml streptomycin It was.
  • Transformants to Pseudomonas including PAS1-dependent-TodS / TodT plasmids, to measure changes in in vivo phosphorylation signaling capacity of TodS proteins that caused site-directed mutations in the toluene binding site in PAS1 compared to wild-type TodS, respectively
  • Incubated in a 96-well deep plate containing 200 ⁇ l of LB medium containing antibiotics and agonists toluene, styrene, m -xylene or antagonist o -xylene, 1,2,4- TMB ligands were respectively supplied in a gaseous form at a concentration of 2.5 to 400 ⁇ M and incubated for 4-5 hours at 30 ° C. and 500 rpm to induce ⁇ -galactosidase protein production in vivo.
  • the PAS1-dependent TodS protein expressed in the Pseudomonas transformant binds to a specific ligand and the PAS1-B monomer structure is changed to change the morphology for activation of TodS.
  • TodT phosphorylated by TodS binds to P todX and upregulates the transcriptional activity of ⁇ -galactosidase enzyme linked to tod operon instead of tod operon, resulting in fluorescence decomposed by ⁇ -galactosidase enzyme in vivo.
  • the principle is to quantitatively measure the amount of material at 365nm / 465nm.
  • the screening method using 96-Deepwell plate was constructed so that Pseudomonas transformants expressing a number of PAS1-dependent TodS mutant proteins at the same time can be tested in three iterations with a wild type, in response to a specific ligand supplied in gaseous form. It was.
  • PAS1 (43-168) protein was crystallized alone by the above crystallization method to secure the conformation of Apo-PAS1 (FIG. 2A), and the conformation including two molecules of asymmetric units (PAS1-A and PAS1-B). It was also confirmed by size exclusion chromatography that the structure constitutes a dimer structure of two molecules regardless of the presence or absence of ligand (FIG. 1B).
  • the two molecules analyzed in the PAS1 protein conformation showed asymmetry in the amino acid 150-163 region of the C-terminal region, respectively, where the amino acid 150-163 region, which forms a helix structure in PAS1-A, was found in the loops in PAS1-B.
  • the Glu168 region of Asn164 showed no electron density, and the flexibility of this region could be inferred.
  • each PAS1 domain was very similar to that of the other PAS domain, consisting of five strands of antiparallel beta sheets and three alpha helices, corresponding to the 45th-149th amino acid sequences (FIG. 2B).
  • An additional alpha helix ( ⁇ 4, amino acid residues 150-163) was located just outside the basic PAS fold in molecule A. Specifically, the C-terminal portion of molecule B, the region corresponding to ⁇ 4, was completely out of alignment.
  • PAS1 is a central green algae photoreceptor (photoreceptor) of the LOV domain (Chlamydomonas reinhardtii): a blue light receptor of the (PDB ID 1N9L, 11% sequence homology, RMSD (82 1.52 ⁇ ) for the alpha-carbon pairs) and Arabidopsis (Arabidopsis) Most similar to the backbone of the LOV1 domain (PDB ID: 2Z6D, 11% sequence homology, RMSD (1.30 Hz for 58 alpha carbon pairs)) of phototropin-2. The LOV domain and the LOV1 domain both bind to FMN.
  • Dimerization of many PAS domains occurs primarily through the amphipathic alpha helix located just above the key PAS folds.
  • the TodS PAS1 domain constructed in the present invention did not contain the corresponding helix site.
  • the antiparallel opposite dimerization observed in the TodS PAS1 structure may be due to artificial consequences due to the symmetry of the crystal packing. It can be predicted from the secondary structure that there is an alpha helix site (amino acid residues 32-43) associated with the dimerization of PAS1 just above the basic PAS fold of TodS.
  • Amino acids 149 to 46 of TodS form the structure of a typical PAS domain consisting of five beta strands and three alpha helix structures, and the light receptor LOV / PAS domain of NifL, Chlamydomonas reinhardtii , of previously reported Azotobacter vinelandi . It showed a similar structure to.
  • PAS1 analyzed in the stereostructure of PAS1 (43-168) / toluene complex has a narrow ligand binding site, unlike conventional PAS domains that bind FMN, Heme, etc., and the stereostructure of the analyzed PAS1 / toluene complex.
  • SeMet-PAS1-A and SeMet-PAS1-B have the same structure, but when SeMet-PAS1-A and SeMet-PAS1-B overlap, the toluene binding-specific alpha helix difference was approximately 25 ° (Fig. 4).
  • the stereostructure of the PAS1 (43-168) / 1,2,4-TMB complex was analyzed by the above method.
  • 1,2,4-TMB has one molecule in the hydrophobic binding space of each PAS1 monomer in the electron density difference map. It confirmed that it was binding (FIG. 2D).
  • the PAS1-B monomer of the PAS1 / 1,2,4-TMB complex showed no electron density from amino acids Ala155 to Glu168 at the C-terminus, which is compared with the conformational analysis of crystals obtained with PAS1 protein alone.
  • this site forms a functionally very flexible structure (FIG. 2D).
  • the toluene binding site of the PAS1 protein is 46 phenylalanine, 48 glycine, 59 valine, 63 alanine, 79 phenylalanine, 84 Tryptophane, 85 tryptophan, 114 isoleucine, 126 valine, 128 phenylalanine, 145 alanine, 147 glycine and toluene are hydrogen bonds or water molecule-mediated hydrogen bonds. It confirmed that it accomplished.
  • the benzene ring of toluene was located in a hydrophobic space surrounded by the amino acid, and the methyl group was surrounded by 48 glycine, 59 valine, and 145 alanine.
  • 1,2,4-TMB was also located at the same site as toluene and bound to homologous amino acid residues.However, phenylalanine No. 46 is bound to toluene when PAS1 is bound to 1,2,4-TMB, which acts as an antagonist. It was confirmed that the more inclined about 70 °. This difference allows 1,2,4-TMB, which has two more methyl groups than toluene, to deform the C-terminal helix of the PAS1-B molecule, functioning as a TodS protein with poor phosphorylation signaling. Can be analyzed.
  • Toluene is a key signal effector required to activate the TodS / TodT signaling system.
  • the structure of PAS1 complexed with toluene was generally consistent with the apo-PAS1 structure (FIG. 5A).
  • Agonists were located in the hydrophobic pockets formed by the hydrophobic residues Phe46, Gly48, Val59, Ala63, Phe79, Trp84, Trp85, Ile114, Val126, Phe128, Ala145, and Gly147 in each PAS1 molecule (FIG. 5B). Buried surface area of the pocket was 247.27 ⁇ 2 From what calculated by the PISA software.
  • the benzene ring of toluene was located at sites formed mainly by the aromatic amino acids Phe46, Phe79, Trp84, Trp85, and Phe128, and Ala63, Ile114, Val126, and Gly147 were involved in the interaction.
  • the methyl group of toluene was surrounded by Gly48, Val59, Ala63, and Ala145 residues.
  • PAS1 complexed with antagonists 1,2,4-TMB was determined (FIG. 5C).
  • the same amino acid residues present in the hydrophobic pocket were involved in interacting with the antagonists (FIG. 5D).
  • the only difference between PAS1 and agonist interaction and PAS1 and antagonist interaction was found at the Phe46 position.
  • the aromatic ring of the amino acid residue in the complex with the antagonist was inclined at ⁇ 80 ° relative to the aromatic ring of the complex Phe46 with toluene in both molecule A and molecule B (FIGS. 5B and 5D).
  • the structural form of the C-terminus (amino acid residues 150-163) directly linked to the C-terminal kinase domain depends on which ligand is present.
  • the helix in the apo-PAS1 structure is completely scattered in molecule B.
  • the corresponding site was rebuilt with alpha helix (FIG. 5A).
  • the corresponding sites were completely scattered and even after Lys155 in molecule B on the electron density map (FIG. 5C).
  • molecule A showed the same alpha helix ( ⁇ 4) morphology at the C-terminal site (amino acid residues 150-163).
  • the PAS1 C-terminal region (amino acid residues 150-163) was termed a signal transfer region (STR).
  • Dimerization helix (amino acid residues 32-43) present directly above the important PAS domain was removed from the PAS1 domain for crystallization and artificially antiparallel facing dimers were created. Therefore, the structure of the PAS1 dimer was modeled based on the structure of the Azotobacter vinelandii NifL LOV domain (PDB ID: 2GJ3). Hydrophobic residues such as Val47, Leu49, and Leu131 that are outside of the beta sheet of molecule A are likely to interact with Ile39 and Leu43, His35 and Ile38, and Gly42 of molecule B, respectively, and are involved in dimerization and maintenance of structural stability Seemed to do (FIG. 11A).
  • TodS includes two modules, each containing a PAS-type sensor domain and an autokinase domain. TodS is classified as a member of the double sensor kinase family. PAS2, the PAS domain in TodS 'second module, does not detect aromatic signal molecules. Thus, the role of PAS2 is not currently well known. However, the C-terminal PAS domain of StyS, the homologue of TodS, seems to respond to the redox potential of the cell. As a result of purifying PAS2 for crystallization of PAS2, it was found that it was present as a dimer in the solution (FIG. 12A). However, crystallization of PAS2 failed.
  • PAS2 amino acid residues 611-729 was modeled using the structure of the NifL LOV domain as a template (FIG. 12B).
  • residues corresponding to the FAD binding residues (Thr78 and Leu86) of NifL, Glu666 and Leu674 (FIG. 12C) of PAS2 were mutated to alanine and variants for wild type TodS using the in vivo ⁇ -galactosidase assay system. Their activity was compared.
  • TodS (43-978) protein with His 6 tag at the C-terminus was purified purely and negatively stained for electron microscopy by single particle analysis (FIGS. 7A and 7B) at the molecular level of approximately 2 nm resolution. Apo-TodS and TodS / toluene complexes and TodS / 1,2,4-TMB complexes were analyzed.
  • the Apo-TodS protein analyzed by electron microscopy with negative staining was analyzed to have two gold particles side by side (FIG. 7b). It was judged to exist in the form of dimers in the direction.
  • the Apo-TodS and TodS / toluene complexes share similar structural characteristics in the form of dimers with slightly open N-terminal sites, but the length of the PAS1 / toluene complexes is relatively longer than that of Apo-TodS (Fig. 8a and 8b).
  • the TodS / 1,2,4-TMB complex has a high frequency of aggregation of TodS (FIG. 8C).
  • the C-terminal ⁇ 5 helix structure of the SeMet-PAS1 / toluene complex is shown in the form of a loop showing flexibility in the Apo-PAS1 protein, and the N-terminal flaring seen in Apo-TodS This flexibility was considered to be due.
  • the relatively long length of the dimer of the TodS-toluene complex was determined that ⁇ 5 helix of the PAS1 domain was formed by the binding of toluene and influenced the overall TodS morphology to perform an efficient phosphorylation function.
  • TodS / 1,2,4-TMB complex had a mixture of a dimer form and agglomeration form when TodS protein alone was present. It is consistent with the result of inducing morphological changes of TodS.
  • TodS (43-978) protein with His 6 tag at the C-terminus and the TodS (23-978) protein with GST at the N-terminus were relatively water soluble and easy to purify.
  • the purified TodS (23-978) protein was separated from the same portion as the size marker protein apoferritin (443 kDa), indicating that the protein has a fluid characteristic (FIG. 9A).
  • the electron microscopic analysis had a dimeric arrangement, and the Apo-TodS molecule had a length of 14.2 nm and a width of 7.0 nm (FIG. 9B).
  • TodS TodS (23-978) protein, which detects toluene, was similar in shape to Apo-TodS at the molecular level.
  • TodS / toluene complex protein had a length of 16.2 nm and a width of 9.4 nm, suggesting that there was a structural change to make the shape more straight (FIG. 9B).
  • multimerization of the antagonists 1,2,4-TMB and the TodS complex confirmed the morphological changes of ligand dependent TodS (FIG. 9B).
  • TodS is changed into an aligned or unaligned structure depending on the ligand, thereby modeling a molecular level mechanism for the TodS / TodT signal transduction process (FIG. 13).
  • TodS is elastic and exists as a dimer with autokinase activity.
  • the PAS1 detection domain does not effectively transmit signals to the C-terminal HK1 through the elasticity of the STR.
  • this form does not induce a functional dimer form capable of autophosphorylation of HK1.
  • the PAS1 STRs Upon detection of toluene, the PAS1 STRs are rearranged to carry signals and induce morphological changes in TodS, causing the HK1-RRR-PAS2-HK2 domain to be arranged for multistage phosphate signaling.
  • the structural fluidity between the PAS1 sensor and HK1 is essential for efficient signal transmission under certain environmental conditions.
  • the present inventors induced position-directed mutations in the pBBR-PtodS-TodST clone, so that the phenylalanine No. 46 as alanine or serine in the TodS protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, the 59th valine as alanine, aspartic acid or phenylalanine, Alanine 63 with valine or serine, 79 phenylalanine with tyrosine, glutamic acid or leucine, tryptophan 84 with histidine or alginine, 85 tryptophan with histidine, alginine or leucine, 114 isoleucine valine, phenylalanine, threonine or serine, 126 valine to alanine, serine, threonine or leucine, 128 phenylalanine to glutamic acid, histidine, aspartic acid, serine or leucine, Alanine No.
  • the 96-deep well screening method constructed in the present invention is a three-fold validation of the PAS1-dependent TodS mutant protein and wild-type TodS protein exposed to a specific ligand of 2.5 to 400 ⁇ M concentration supplied in gaseous state, resulting in final ligand binding and TodS /
  • phenylalanine was replaced with alanine or serine, 59 valine with alanine, aspartic acid or phenylalanine, 63 alanine with valine or serine, 79 phenylalanine with tyrosine, glutamic acid or leucine, 84 with tryptophan , Histidine or arginine, tryptophan 85 to histidine, arginine, or leucine, 114 isoleucine to phenylalanine, threonine or serine, 126 valine to serine, threonine, or leucine In case of substitution of phenylalanine No.
  • valine no. 47 is alanine or leucine
  • leucine no. 49 is alanine or aspartic acid
  • 58 glutamic acid is alanine or serine
  • 131 leucine is aspartic acid
  • 146 glutamic acid is alanine or leucine
  • Substitution of alanine 148 with alanine or methionine also inhibited TodS / TodT two factor signaling by 10 ⁇ M toluene as well (FIGS. 16 and 17).
  • the PAS1 protein functions as an important sensor sensor that promotes toluene degradation by up-regulating the expression of tod operon through binding to toluene.
  • the TodS the tod genes by a variety of ligand-specific binding of non-toluene Ligand binding sites can be redesigned to modulate expression to develop new sensor modules.
  • a microorganism for decomposing an aromatic hydrocarbon can be produced in which a hydrocarbon decomposed protein is expressed according to the combination of the above-described variant protein and an aromatic hydrocarbon.

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Abstract

본 발명은 PAS1 변이 단백질, 상기 PAS1 변이 단백질을 포함하는 TodS 변이 단백질, 상기 변이 단백질을 생산하는 미생물, 상기 변이 단백질을 이용하는 방향족 탄화수소 감지용 바이오센서 및 방향족 탄화수소 분해용 미생물 제제에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 PAS1 단백질 결정체, SeMet-PAS1 단백질과 톨루엔 복합체의 결정체, PAS1 단백질과 1,2,4-TMB(1,2,4-Trimethylbenzene) 복합체의 결정체 및 상기 결정체의 제조 방법, 및 이의 적용에 관한 것이다.

Description

PAS1 변이 단백질을 포함하는 TODS 변이 단백질 및 이의 용도
본 발명은 PAS1 변이 단백질, 상기 PAS1 변이 단백질을 포함하는 TodS 변이 단백질, 상기 변이 단백질을 생산하는 미생물, 상기 변이 단백질을 이용하는 방향족 탄화수소 감지용 바이오센서 및 방향족 탄화수소 분해용 미생물 제제에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 PAS1 단백질 결정체, SeMet-PAS1 단백질과 톨루엔 복합체의 결정체, PAS1 단백질과 1,2,4-TMB(1,2,4-Trimethylbenzene) 복합체의 결정체 및 상기 결정체의 제조 방법, 및 이의 적용에 관한 것이다.
토양 내 축적된 다양한 벤젠계 방향성 휘발성 화학물질들은 토양 미생물인 슈도모나스 푸티타(Pseudomoans putida) 균에 의해 탄소원으로 사용된다. 이 균은 tod 오페론 내에 다양한 톨루엔(toluene) 분해효소를 코딩하고 있고, tod 오페론의 활성은 TodS/TodT 2개 인자 신호조절 시스템에 의해 이루어진다. TodS/TodT 2개 인자 신호조절을 구성하는 TodS는 2개의 PAS 도메인과 2개의 히스티딘 키나아제(Histidine kinase, HK) 도메인, 1개의 반응 조절자(response regulator, RRR)로 구성되어 있다. 톨루엔은 TodS의 N-말단 부위의 PAS1 도메인에 결합하여 TodS 내의 2개의 히스티딘 키나아제의 자기인산화(autophosphorylation)를 유도하고, 인산화된 신호가 전사조절인자 TodT의 인산화를 촉진하여 tod 오페론의 전사조절부위 todX box에 결합함으로써 tod 오페론의 유전자 발현을 가져온다(Proc. Natl. Acad. Sci., 2006, 103, 8191-8196). 슈도모나스 푸티다 F1균의 tod 오페론은 todF, todC1, todC2, todB, todA, todD, todE로 이루어져있고, 톨루엔 2산소화효소(toluene dioxygenase, todABC1C2), cis-톨루엔 디하이드로다이올 디하이드로게나아제(cis-toluene dihydrodiol dehydrogenase, todD), 30-메틸카테콜 2,3,-디옥시게나아제(30-methylcatechol 2,3,-dioxygense, todE), 2-하이드록시-6-옥소-2,4-헥타다이에노에이트 하이드롤라아제(2-hydroxy-6-oxo-2,4-heptadienoate hydrolase, todF) 등의 톨루엔 분해 효소를 코딩하고 있다(Appl. Environ. Microbiol., 1988, 54, 1498-1503). 따라서 TodS의 PAS1 도메인과 톨루엔의 결합은 토양 내 미생물들이 톨루엔을 대체 탄소 자원으로 활용하여 생존을 유지하는데 중요하며, 이러한 톨루엔 분해효소를 발현하는 슈도모나스 균주들은 최근 석유 오염지역 등에서 생물정화 역할을 수행하는 미생물로 활용되고 있다.
한편, 석유환경 오염지역에는 다양한 벤젠계의 방향성 휘발성 화학물질들이 혼합하여 존재하고 있고, TodS의 PAS1 도메인은 톨루엔뿐만 아니라, 스티렌(styrene), m-자일렌(m-xylene), o-자일렌(o-xylene), 1,2,4-TMB 등과 같은 다양한 종류의 방향성 탄화수소가 결합이 될 수 있다. 하지만, 톨루엔 이외의 리간드들이 톨루엔보다 더 높은 결합속도로 PAS1에 결합하게 되면 tod 오페론의 활성이 원활하게 이루어지지 않으며. 결과적으로 미생물에 의한 톨루엔 이화작용이 저해되는 한계를 가지고 있다. 즉, 톨루엔 결합이 가장 강하게 생체 내 신호전달을 가능하게 하는바, 이의 매커니즘 연구 및 이를 이용한 센서 개발이 요구되고 있으나, 정확한 매커니즘 및 PAS1을 포함하는 TodS의 정확한 구조를 규명할 수 없어 어려움이 있어왔다.
최근 단백질 효소공학 연구는 표적 단백질의 입체 구조와 기능을 규명하여, 명확하고 효율적인 과학적 단백질 엔지니어링을 통한 효율적 단백질을 설계하고 개발하는 방향으로 이루어지고 있으며, 이러한 연구는 리간드 특이성과 효능을 증진시킬 수 있는 감지센서 개발 접근 방식으로 활용될 수 있다. 선택적이고 특이적인 리간드의 결합부위을 설계하여 민감도를 증대하고, 리간드 특이성을 확대한 감지센서를 개발하기 위해서는 안정한 상태의 고순도 단백질을 대량으로 확보하고 결정화를 통해 단백질의 입체구조를 규명하는 것이 필수적이다. 그러나, TodS 또는 PAS1 단백질은 안정한 상태로 순수 정제하여 결정화하기에 매우 어려운 까닭에, 그 중요성에도 불구하고 그 동안 입체구조가 밝혀지지 않았다.
본 발명자들은 PAS1 단백질의 입체구조를 규명하기 위하여 예의 노력한 결과, Apo-PAS1 단백질 결정체, SeMet-PAS1 단백질과 톨루엔과의 복합체 결정체, 및 PAS1 단백질과 1,2,4-TMB와의 복합체 결정체를 제조하여 이로부터 수득한 3차 구조를 토대로 PAS1 단백질과 리간드의 결합부위를 고해상도 원자 수준에서 규명하였다. 또한, 규명한 리간드 결합부위를 이용하여 톨루엔 이외의 다른 방향족 화학 물질과 결합하여 신호를 전달할 수 있는 새로운 기능의 감지센서를 제조할 수 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 서열번호 1의 TodS 단백질에서, 하기 (a) 내지 (w)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 변이를 가지는 TodS 변이 단백질을 제공하는 것이다;
(a) 46번 페닐알라닌을 알라닌 또는 세린으로 치환
(b) 47번 발린을 알라닌 또는 류신으로 치환,
(c) 49번 류신을 아스파틱산 또는 알라닌으로 치환,
(d) 58번 글루탐산을 알라닌 또는 세린으로 치환,
(e) 59번 발린을 알라닌, 아스파틱산 또는 페닐알라닌으로 치환,
(f) 61번 글루타민을 류신, 알지닌 또는 알라닌으로 치환,
(g) 63번 알라닌을 발린 또는 세린으로 치환,
(h) 79번 페닐알라닌을 타이로신, 글루탐산 또는 류신으로 치환,
(i) 84번 트립토판을 발린, 히스티딘 또는 알지닌으로 치환,
(j) 85번 트립토판을 히스티딘, 알지닌, 또는 류신으로 치환,
(k) 114번 아이소류신이 발린, 페닐알라닌, 쓰레오닌 또는 세린으로 치환,
(l) 126번 발린을 알라닌, 세린, 쓰레오닌, 또는 류신으로 치환,
(m) 128번 페닐알라닌을 글루탐산, 히스티딘, 아스파틱산, 세린 또는 류신으로 치환,
(n) 131번 류신을 아스파틱산으로 치환,
(o) 145번 알라닌을 세린 또는 발린으로 치환,
(p) 146번 글루탐산을 알라닌 또는 류신으로 치환,
(q) 148번 알지닌을 알라닌 또는 메티오닌으로 치환,
(r) 619번 타이로신 및 620번 글루탐산을 알라닌으로 치환,
(s) 666번 글루탐산을 알라닌으로 치환
(t) 674번 루신을 알라닌으로 치환,
(u) 691번 타이로신을 아이소류신으로 치환,
(v) 703번 알라닌을 세린으로 치환, 및
(w) 617번 내지 623번 아미노산의 결손.
본 발명의 다른 목적은 서열번호 1의 TodS 단백질 중 43번 내지 168번째 또는 23번 내지 168번째 아미노산 서열을 가지는 PAS1 단백질에서, 서열번호 1의 아미노산 서열을 기준으로, 상기 (a) 내지 (q)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 변이를 가지는 PAS1 변이 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터; 및 상기 발현 벡터가 도입된 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 변이 단백질을 생산하는 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 (i) 하기 (a) 내지 (d)의 모듈을 포함하는 센서용 모듈 조합; (ii) 상기 모듈 조합을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트; (iii) 상기 발현 카세트를 포함하는 벡터; 또는 (i) 내지 (iii) 중 어느 하나를 포함하는 미생물을 함유하는, 방향족 탄화수소 감지용 바이오센서를 제공하는 것이다:
(a) 방향족 탄화수소와 특이적으로 결합하는 상기 PAS1 변이 단백질을 포함하는 제1모듈;
(b) 제1모듈에 방향족 탄화수소가 결합시 신호를 발생 및 전달하는 제2모듈;
(c) 상기 전달된 신호에 의해 인산화되는 전사조절인자를 포함하는 제3모듈; 및
(d) 상기 인산화되는 제3모듈에 의해 표지 단백질을 발현시키는 제4모듈.
본 발명의 또 다른 목적은 (i) 하기 (a) 내지 (d)의 모듈을 포함하는 센서용 모듈 조합; (ii) 상기 모듈 조합을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트; 또는 (iii) 상기 발현 카세트를 포함하는 벡터를 포함하는 미생물을 함유하는, 방향족 탄화수소 분해용 미생물 제제을 제공하는 것이다:
(a) 방향족 탄화수소와 특이적으로 결합하는 상기 PAS1 변이 단백질을 포함하는 제1모듈;
(b) 제1모듈에 방향족 탄화수소가 결합시 신호를 발생 및 전달하는 제2모듈;
(c) 상기 전달된 신호에 의해 인산화되는 전사조절인자를 포함하는 제3모듈; 및
(d) 상기 인산화되는 제3모듈에 의해 방향족 탄화수소 분해 단백질을 발현시키는 제4모듈.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 바이오센서를 포함하는, 방향족 탄화수소 감지용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 미생물 제제를 포함하는, 방향족 탄화수소 분해용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 바이오센서를 시료에 노출시키는 단계를 포함하는, 방향족 탄화수소 감지방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 미생물 제제를 이용하여 방향족 탄화수소를 분해하는 단계를 포함하는, 방향족 탄화수소 분해방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 (a) 표 3에 나타낸 PAS1 단백질의 원자좌표, 표 4에 나타낸 SeMet-PAS1 단백질과 톨루엔 복합체의 원자좌표, 또는 표 5에 나타낸 PAS1 단백질과 1,2,4-TMB(1,2,4-Trimethylbenzene) 복합체의 원자좌표를 이용하여, PAS1 단백질 또는 이의 복합체의 3차 구조를 설계하는 단계;
(b) 상기 설계된 3차 구를 이용하여 PAS1 변이 단백질을 생성하는 단계; 및
(c) 상기 생성된 PAS1 변이 단백질과 주어진 리간드 간의 결합 활성을 측정하는 단계를 포함하는,
야생형 PAS1 단백질에 대하여 리간드 결합 활성이 변이된, PAS1 변이 단백질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1의 TodS 단백질로부터 43번째 내지 168번째 아미노산 서열을 가지는 PAS1 단백질을 결정화시키는 단계를 포함하는, PAS1 단백질을 결정화시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1의 TodS 단백질 중 43번 내지 168번째 아미노산 서열을 가지는 PAS1 단백질과 톨루엔 또는 1,2,4-TMB(1,2,4-Trimethylbenzene)의 혼합물을 결정화시키는 단계를 포함하는, PAS1 단백질과 톨루엔 또는 1,2,4-TMB의 복합체를 결정화시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 공간군(space group)이 P21이고, 단위 셀 디멘션(unit-cell dimension)은 a=41.114Å, b=49.314Å, c=56.222Å, α=90°, β=109.22°, γ=90°인, 서열번호 1의 TodS 단백질로부터 43번째 내지 168번째 아미노산 서열을 가지는 PAS1 단백질 결정체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 공간군이 P212121이고, 단위 셀 디멘션은 a=41.342Å, b=47.744Å, c=126.522Å, α=β=γ=90°인, 서열번호 1의 TodS 단백질로부터 43번째 내지 168번째 아미노산 서열을 가지는 PAS1 단백질 중 메티오닌이 셀레노메티오닌인 SeMet-PAS1 단백질과 톨루엔 복합체의 결정체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 공간군이 P212121이고, 단위 셀 디멘션은 a=45.387Å, b=51.016Å, c=100.728Å, α=β=γ=90°인, 서열번호 1의 TodS 단백질로부터 43번째 내지 168번째 아미노산 서열을 가지는 PAS1 단백질과 1,2,4-TMB(1,2,4-Trimethylbenzene) 복합체의 결정체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 (a) 표 3에 나타낸 PAS1 단백질의 원자좌표, 표 4에 나타낸 SeMet-PAS1 단백질과 톨루엔 복합체의 원자좌표 또는 표 5에 나타낸 PAS1 단백질과 1,2,4-TMB(1,2,4-Trimethylbenzene) 복합체의 원자좌표를 이용하여 PAS1 단백질 또는 이의 복합체의 3차 구조를 설계하는 단계; (b) 상기 설계된 3차 구조를 이용하여 PAS1에 결합하는 후보 물질을 생성하는 단계; 및 (c) 상기 후보 물질이 PAS1 단백질 또는 PAS1을 포함하는 TodS 단백질과 리간드 간의 결합을 조절하는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는, PAS1 단백질 또는 TodS 단백질과 리간드 간의 결합을 조절하는 물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에서 제공하는 PAS1 단백질과 PAS1/1,2,4-TMB 복합체 단백질 결정체 및 SeMet-PAS1/톨루엔 단백질 복합체의 결정체, 결정화시키는 방법 및 이의 3차원적 구조정보는, tod 유전자를 포함하는 다양한 세균의 환경오염정화 관련된 오염물질 분해 유전자들의 발현 증대를 목적하는 신기능의 감지센서 개발에 유용하게 이용될 수 있다. 또한, 본 발명에서 제공하는 PAS1 변이 단백질 또는 이를 포함하는 TodS 변이 단백질은 방향족 탄화수소 감지 및 분해에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1a는 PAS1 단백질의 발현을 위해 사용한 아미노산 서열을 나타낸 도이다.
도 1b는 PAS1 단백질이 크기배제 크로마토그래피에서도 이량체 형태로 존재함을 확인한 도이다.
도 1c는 SeMet-PAS1/톨루엔 복합체, PAS1/1,2,4-TMB 복합체의 결정체 유도 및 TodS 변이단백질의 생체 내 신호전달 스크리닝에 사용한 벤젠계 방향족 화학물질을 표시한 도이다.
도 2a는 PAS1 (43 - 168) 단백질(Apo-PAS1)의 이량체 내 대칭 짝을 분석한 도이다.
도 2b는 Apo-PAS1 (43 - 168)의 구조를 리본으로 나타낸 도이다. 비대칭 유닛에는 두개의 PAS1 분자(분자 A 및 분자 B)가 있다.
도 2c는 SeMet-PAS1 (43 - 168)/톨루엔 복합체의 이량체 내 대칭 짝을 분석한 도이다.
도 2d는 PAS1 (43 - 168)/1,2,4-TMB 복합체의 이량체 내 대칭 짝을 분석한 도이다.
도 3은 SeMet-PAS1 (43 - 168) 단백질과 톨루엔 간의 결합을 구조적으로 분석한 도이다. PAS1의 결합에 필수적인 잔기들을 리간드와 함께 나타내었다.
도 4는 SeMet-PAS1 (43 - 168)/톨루엔 복합체 이량체를 구성하는 각 단량체 SeMet-PAS1-A와 SeMet-PAS1-B를 이차원적으로 겹쳐놓았을 때 보이는 구조적 차이를 표시한 도이다.
도 5a는 아고니스트 톨루엔과 복합체를 형성한 TodS PAS1 구조를 나타낸 도이다. 비대칭 단위에 두개의 톨루엔과 결합한 PAS1 분자가 있다. Apo-PAS1의 분자 B에서 정렬되지 않은 부위에 대응되는, 분자 B의 정렬되지 않은 C-말단 알파 헬릭스를 붉은색으로 표시하였다.
도 5b는 톨루엔 결합 포켓을 나타낸 도이다. 포켓은 정전기적 표면 표현(electrostatic surface representation)에서 검은색으로 표시되어 있다. PAS1에 의한 톨루엔 감지의 구체적인 환경을 분자 A 및 분자 B에서 확대하였다. 톨루엔 (붉은색)은 소수성의 PAS1 잔기(녹색)에 의해 둘러싸여 있다.
도 5c는 안타고니스트 1,2,4-TMB와 복합체를 형성한 PAS1의 구조를 나타낸 도이다. 비대칭 단위에 두개의 안타고니스트와 결합된 PAS1 분자가 있다. 1,2,4-TMB 분자는 붉은 색의 탄소 원자로 표시되어 있다. Apo-PAS1의 분자 B에서 정렬되지 않은 부위에 대응되는, 분자 B의 정렬되지 않은 C-말단 부위는 붉은색으로 표시되어 있다.
도 5d는 1,2,4-TMB 결합 포켓을 나타낸 도이다. 포켓은 정전기적 표면 표현에서 검은색으로 표시되어 있다. PAS1에 의한 1,2,4-TMB 결합의 구체적인 환경을 분자 A 및 분자 B에서 확대하였다. 특히, 1,2,4-TMB(붉은색)은 톨루엔 결합 포켓에서와 동일한 소수성 잔기(녹색)에 의해서 둘러싸여 있다. Apo-PAS1에서 소수성 포켓을 형성하기 위해 필요한 대응되는 잔기(노란색)는 톨루엔과 1,2,4-TMB 결합 잔기와 각각 겹쳐져 있다.
도 5e는 톨루엔과 결합하는 PAS1 (23-168)과 그 돌연변이들의 열역학적 파라미터를 나타낸 도이다. ORIGIN 소프트웨어 패키지 (MicroCal Inc., 미국)의 두개의 연속된 결합 모델을 사용하여 얻어졌다. 각 단백질 변이체와 톨루엔의 반응으로부터 생성된 열 데이터에서, 반응 버퍼에 톨루엔을 첨가하여 생성된 열 데이터를 뺐다. 야생형 PAS1(23-168)와 톨루엔 분자의 결합에 대한 대표적인 ITC 프로파일을 왼쪽에 나타내었다.
도 6은 PAS1 (43 - 168) 단백질(Apo-PAS1), PAS1 (43 - 168)/1,2,4-TMB 복합체 및 SeMet-PAS1 (43 - 168)/톨루엔 복합체의 SeMet-PAS1-B 단량체 구조를 겹쳐 놓고, PAS1-B 단백질의 각 리간드 결합 특이적 구조 변화를 원으로 표시한 도이다. SeMet-PAS1/톨루엔 복합체의 경우 톨루엔 결합 시 SeMet-PAS1-B의 E146과 R148의 결합으로 고정된 형태의 α5 헬릭스가 형성된다.
도 7a는 크기배제 크로마토그래피에서 TodS 단백질이 사량체의 크기를 갖는 길고 유연한 형태를 갖는 이량체로 존재함을 확인한 도이다.
도 7b는 C-말단에 His6 태그를 가진 TodS (서열번호 1의 43 - 978번째 아미노산 서열) 단백질을 순수 분리하여, 니켈-골드 분자를 히스티딘 마커와 결합시킨 후 음성 염색하여 전자현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 도이다. 도 6b를 통하여 두 개의 골드 분자가 나란히 위치함을 확인하고, TodS 단백질이 이량체로 존재함을 확인하였다(화살표와 원으로 표시).
도 8a는 TodS(43-978) 단백질 단독(Apo-TodS)으로도 이량체로 존재함을 확인한 도이다.
도 8b는 TodS(43-978)/톨루엔 복합체 단백질도 이량체로 존재하나, TodS 단백질 단독으로 존재할 때에 비해, 길이가 길어진 양태를 보이는 것을 확인한 도이다.
도 8c는 TodS(43-978)/1,2,4-TMB 복합체 단백질도 이량체로 존재하나, 대다수의 단백질이 뭉침 현상을 보이는 것을 확인한 도이다.
도 9a는 정제된 TodS (서열번호 1 23 - 978번째 아미노산 서열, TodS(23-978)) 단백질의 사이즈 배제 크로마토그래피 분석 결과를 나타낸 도이다. TodS(23-978)를 표준 분자량 마커인 β-amylase (200kDa), apoferritin (443kDa)과 비교하였다.
도 9b는 TodS(23-978) 단백질(Apo-TodS) 및 이의 복합체(Toluene-TodS, 1,2,4-TMB-TodS)의 분자 외형을 보여주는 전자현미경 사진이다. 스케일 바: 20 nm.
도 10은 리간드 결합 부위를 변이시킨 PAS1 도메인을 포함하는 TodS 변이 단백질들의 리간드 결합 특이적 생체 내 TodS/TodT 2개 인자 신호전달 능력을 검증하기 위한, 96-딥-웰 플레이트 기반 스크리닝 시스템(in vivo β-galactosidase assay system)의 원리를 나타낸 모식도이다.
도 11a는 Azotobacter vinelandii NifL LOV 도메인(PDB ID: 2GJ3)의 구조하에서 모델화된 PAS1의 이량체 구조를 나타낸 도이다. 이량체화에 관여되는 것으로 예측된 소수성 잔기들을 녹색과 회색으로 각각 분자 A와 분자 B에 표시하였다.
도 11b는 이량체화에 관여하는 잔기들을 톨루엔 환경에서 생체내 β-갈락토시다아제 분석 시스템을 사용하여 평가하였다. 모든 결과들을 3번의 독립적인 실험을 통해 얻었다.
도 12a는 정제된 PAS2의 사이즈 배제 크로마토그래피 분석결과를 나타낸 도이다. 정제된 PAS2를 표준 분자량 마커인 카보닉 언하이드라제(carbonic anhydrase, 29 kDa)와 비교한 결과, 용액에서 이량체로서 분석되었다.
도 12b는 Azotobacter vinelandii NifL LOV 도메인 (PDB ID: 2GJ3)의 이량체 구조(녹색, 청록색)에 기초하여 모델화된 PAS2 구조(자홍색)를 나타낸 도이다. 각 NifL PAS 도메인에 결합한 FAD를 나타내었다. 이량체화에 관여하는 것으로 예측된 PAS2의 N-말단의 알파 헬릭스 (Ser611 내지 Ser622)를 표시하였다.
도 12c는 NifL FAD 결합 잔기인 Thr78과 Leu86에 대응하는 PAS2의 Glu666과 Leu674를 나타낸 도이다.
도 12d는 생체내 β-갈락토시다아제 분석 시스템을 사용하여 다양한 리간드 결합에 관여할 것으로 예측된 PAS2 잔기들을 평가한 도이다.
도 12e는 톨루엔이 결합된 PAS1 구조와 모델화된 PAS2 구조를 겹친 도이다.
도 13은 TodS/TodT의 신호 전달 과정에 대하여 분자 수준의 매커니즘 모델을 나타낸 도이다. PAS1 이량체에서 분자 A와 분자 B를 각각 어두운 녹색과 밝은 녹색으로 표시하였다. TodT 이량체를 밝은 노란색과 어두운 노란색으로 표시하였다. 톨루엔 분자는 붉은색으로 표시하였다.
도 14는 효능제(agonist)인 톨루엔 또는 길항제(antagonist)인 1,2,4-TMB 리간드를 100 μM의 농도로 가스 형태로 공급하였을 때, TodS 변이 단백질들을 발현하는 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) KT2440-PXZ 형질전환체들의 생체 내 베타 갈락토시다아제 활성 결과를 보여주는 도이다. PAS1/톨루엔 복합체의 입체구조 기반으로 규명된 10개의 아미노산 잔기를 위치-지정 변형시킨 PAS1 도메인을 포함한 TodS 변이 단백질들이 각각 야생형 TodS와 비교하여 100μM의 효능제인 톨루엔 또는 길항제인 1,2,4-TMB 리간드에 대해 보이는 반응을 상기 스크리닝 시스템으로 검증한 결과, 10개의 아미노산 잔기 모두 TodS/TodT 2개 인자 신호전달에 중요한 것으로 검증되었다.
도 15a는 10μM의 농도에서 각 리간드를 처리하여, 야생형 PAS1을 포함하는 TodS(WT)와 톨루엔 결합부위의 아미노산 잔기들을 위치-지정 돌연변이 유도 방법으로 치환시킨 10개의 TodS 변이 단백질간의 신호전달 능력을 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 15b는 리간드 농도 의존적으로, 야생형 TodS와 10종의 TodS 변이 단백질의 생체 내 베타 갈락토시다아제 활성 결과를 비교한 도이다.
도 16은 PAS1의 이량체화에 관여하는 아미노산들을 변형시킨 TodS 변이 단백질을 발현하는 슈도모나스 푸티다 KT2440-PXZ 형질전환체들의 리간드 농도 의존적 생체 내 베타 갈락토시다아제 활성 결과를 보여주는 도이다.
도 17은 톨루엔과 결합 특이적으로 구조변화가 일어나는 PAS1-B의 α5 헬릭스 형성부위의 아미노산들을 변이시킨 TodS 변이 단백질을 발현하는 슈도모나스 푸티다 KT2440-PXZ 형질전환체들의 리간드 농도 의존적 생체 내 베타 갈락토시다아제 활성 결과를 보여주는 도이다.
도 18a는 PAS1 단백질 61번 글루탐산 아미노산 잔기의 생화학적 특성을 변화시킨 TodS 변형단백질을 발현하는 슈도모나스 푸티다 KT2440-PXZ 형질전환체들의 리간드 농도(10μM, 50μM, 100μM) 의존적 생체 내 베타 갈락토시다아제 활성 결과를 보여주는 도이다.
도 18b는 10μM의 리간드를 가스 형태로 공급하였을 때, Q61R TodS와 Q61A TodS 변이 단백질들을 발현하는 슈도모나스 푸티다 KT2440-PXZ 형질전환체들의 생체 내 베타 갈락토시다아제 활성 결과를 보여주는 도이다.
도 19는 저농도의 톨루엔(0 내지 10μM)을 가스 형태로 공급하였을 때, Q61R TodS와 Q61A TodS 변이 단백질들을 발현하는 슈도모나스 푸티다 KT2440-PXZ 형질전환체들의 생체 내 베타 갈락토시다아제 활성 결과를 보여주는 도이다.
본 발명의 하나의 양태는 TodS 변이 단백질을 제공한다.
본 발명의 TodS 변이 단백질은 다양한 방향족 탄화수소에 대한 민감도가 야생형 TodS 단백질보다 높거나 또는 낮게 변화되어, 방향족 탄화수소의 감지 및/또는 분해에 유용하게 이용될 수 있다.
구체적으로, 서열번호 1의 TodS 단백질에서, 하기 (a) 내지 (w)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 변이를 가지는 TodS 변이 단백질을 제공한다;
(a) 46번 페닐알라닌을 알라닌 또는 세린으로 치환
(b) 47번 발린을 알라닌 또는 류신으로 치환,
(c) 49번 류신을 아스파틱산 또는 알라닌으로 치환,
(d) 58번 글루탐산을 알라닌 또는 세린으로 치환,
(e) 59번 발린을 알라닌, 아스파틱산 또는 페닐알라닌으로 치환,
(f) 61번 글루타민을 류신, 알지닌 또는 알라닌으로 치환,
(g) 63번 알라닌을 발린 또는 세린으로 치환,
(h) 79번 페닐알라닌을 타이로신, 글루탐산 또는 류신으로 치환,
(i) 84번 트립토판을 발린, 히스티딘 또는 알지닌으로 치환,
(j) 85번 트립토판을 히스티딘, 알지닌, 또는 류신으로 치환,
(k) 114번 아이소류신이 발린, 페닐알라닌, 쓰레오닌 또는 세린으로 치환,
(l) 126번 발린을 알라닌, 세린, 쓰레오닌, 또는 류신으로 치환,
(m) 128번 페닐알라닌을 글루탐산, 히스티딘, 아스파틱산, 세린 또는 류신으로 치환,
(n) 131번 류신을 아스파틱산으로 치환,
(o) 145번 알라닌을 세린 또는 발린으로 치환,
(p) 146번 글루탐산을 알라닌 또는 류신으로 치환,
(q) 148번 알지닌을 알라닌 또는 메티오닌으로 치환,
(r) 619번 타이로신 및 620번 글루탐산을 알라닌으로 치환,
(s) 666번 글루탐산을 알라닌으로 치환
(t) 674번 루신을 알라닌으로 치환,
(u) 691번 타이로신을 아이소류신으로 치환,
(v) 703번 알라닌을 세린으로 치환, 및
(w) 617번 내지 623번 아미노산의 결손.
본 발명에서 용어, "TodS 단백질"은 방향족 탄화수소를 감지하여 인산 신호를 발생 및 전달하는 단백질을 의미하며, 2개의 PAS 도메인과 2개의 히스티딘 키나아제(Histidine kinase, HK) 도메인, 1개의 반응 조절자(response regulator, RRR)를 포함한다. 상기 TodS 단백질은 슈도모나스 (Pseudomoans) 속 미생물 유래, 구체적으로 슈도모나스 푸티타(Pseudomoans putida) 유래일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 TodS 단백질은 특별히 이에 제한되지 않으나, NCBI 유전자 은행과 같은 공지의 데이터베이스를 통하여 이의 서열을 용이하게 수득할 수 있으며, 그 예로 GenBank ID: A5W4E3.1인 단백질일 수 있으며, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 또는 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 가질 수 있다.
본 발명에서 용어, "TodS 변이 단백질"은 야생형 TodS 유전자 내의 PAS1 단백질에 하나 이상의 아미노산을 치환, 삽입, 제거 또는 변형한 단백질을 의미하며, 본 발명의 목적상 상기 TodS 변이 단백질은 톨루엔에 대한 민감도를 높이거나 낮추기 위해 변이시키거나, 톨루엔 외의 리간드에 대한 민감도를 변화시키기 위해 변이시킨 단백질을 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 TodS 변이 단백질은 구체적으로는 TodS 단백질인 서열번호 1의 아미노산 서열에서 46번 페닐알라닌, 47번 발린, 48번 글라이신, 49번 류신, 58번 글루탐산, 59번 발린, 61번 글루타민, 63번 알라닌, 79번 페닐알라닌, 84번 트립토판, 85번 트립토판, 114번 아이소류신, 126번 발린, 128번 페닐알라닌, 131번 류신, 145번 알라닌, 146번 글루탐산, 147번 글라이신, 148번 알지닌, 619번 타이로신, 620번 글루탐산, 666번 글루탐산, 674번 루신, 691번 타이로신 및 703번 알라닌으로 이루어진 군 중에서 하나 이상이 변이된 단백질, 예컨대 다른 아미노산으로 치환된 형태의 단백질일 수 있다. 또한, 상기 군 중, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 또는 23개 변이를 포함하는 변이 단백질일 수 있다.
또한, 상기 TodS 변이 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 617번 내지 623번 아미노산이 결손된 단백질 또는 상기 치환된 형태의 TodS 변이 단백질에 추가적으로 617번 내지 623번 아미노산이 결손된 단백질이 수 있다.
더욱 구체적으로는, 상기 TodS 변이 단백질은 TodS 단백질인 서열번호 1의 아미노산 서열에서, (a) 46번 페닐알라닌이 알라닌 또는 세린으로 치환, (b) 47번 발린이 알라닌 또는 류신으로 치환, (c) 49번 류신이 아스파틱산 또는 알라닌으로 치환, (d) 58번 글루탐산이 알라닌 또는 세린으로 치환, (e) 59번 발린이 알라닌, 아스파틱산 또는 페닐알라닌으로 치환, (f) 61번 글루타민이 류신, 알지닌 또는 알라닌으로 치환, (g) 63번 알라닌이 발린 또는 세린으로 치환, (h) 79번 페닐알라닌이 타이로신, 글루탐산 또는 류신으로 치환, (i) 84번 트립토판이 발린, 히스티딘 또는 알지닌으로 치환, (j) 85번 트립토판이 히스티딘, 알지닌, 또는 류신으로 치환, (k) 114번 아이소류신이 발린, 페닐알라닌, 쓰레오닌 또는 세린으로 치환, (l) 126번 발린이 알라닌, 세린, 쓰레오닌, 또는 류신으로 치환, (m) 128번 페닐알라닌이 글루탐산, 히스티딘, 아스파틱산, 세린 또는 류신으로 치환, (n) 131번 류신이 아스파틱산으로 치환, (o) 145번 알라닌이 세린 또는 발린으로 치환, (p) 146번 글루탐산이 알라닌 또는 류신으로 치환, (q) 148번 알지닌이 알라닌 또는 메티오닌(methionine)으로 치환, (r) 619번 타이로신 및 620번 글루탐산을 알라닌으로 치환, (s) 666번 글루탐산이 알라닌으로 치환, (t) 674번 루신이 알라닌으로 치환, (u) 691번 타이로신이 아이소류신으로 치환, (v) 703번 알라닌이 세린으로 치환, 및 (w) 617번 내지 623번 아미노산의 결손으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 변이를 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 TodS 변이 단백질은 상기 변이 단백질뿐 아니라, 야생형 TodS 단백질에 비하여 방향족 탄화수소와 결합하는 능력이 조절된 이상, 상기 변이 위치를 포함하면서, 서열번호 1의 TodS 아미노산 서열과 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 더욱 구체적으로는 95% 이상, 가장 구체적으로는 97%, 98% 또는 99% 이상의 유사성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 단백질도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
본 발명에서 방향족 탄화수소는 본 발명의 변이 단백질과 결합할 수 있는 방향족 탄화수소는 제한없이 포함될 수 있으며, 벤젠(benzene), 에틸벤젠(ethylbenzene), 프로필벤젠(propylbenzene), 부틸벤젠(butylbenzene), 니트로벤젠(nitrobenzene), 클로로벤젠(chlorobenzene), 플루오로벤젠(fluorobenzene), 톨루엔(toluene), 스티렌(styrene), o-자일렌(o-xylene), m-자일렌(m-xylene), p-자일렌(p-xylene), o-클로로톨루엔(o-chlorotoluene), m-클로로톨루엔(m-chlorotoluene), p-클로로톨루엔(p-chlorotoluene), o-톨루이딘(o-toluidine), m-톨루이딘(m-toluidine), p-톨루이딘(p-toluidine), 카테콜(catechol), 1,2,4-TMB(1,2,4-Trimethylbenzene), 1,2,3-TMB(1,2,3-Trimethylbenzene), 1,3,5-TMB(1,3,5-Trimethylbenzene), 1-나프톨(1-naphthol) 및 2,3-디히드록시나프탈렌(2,3-dihydroxynaphthalene)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물일 수 있다.
본 발명에서 서열번호 1의 43 - 978번째 또는 23 - 978번째 아미노산 서열을 가진 TodS 단백질은 각각 TodS (43 - 978) 또는 TodS (23 - 978)와 혼용된다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 서열번호 1의 TodS 단백질 중, 23번 내지 168번 아미노산 서열, 또는 43번 내지 168번째 아미노산 서열을 가지는 PAS1 단백질에서, 서열번호 1의 아미노산 서열을 기준으로, 상기 (a) 내지 (q)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 변이를 가지는 PAS1 변이 단백질을 제공한다.
본 발명의 PAS1 변이 단백질은 다양한 방향족 탄화수소에 대한 민감도가 야생형 PAS1 단백질보다 높거나 또는 낮게 변화되어, 방향족 탄화수소의 감지 및/또는 분해에 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명에서 용어, "PAS1 단백질"은 톨루엔을 리간드로 감지하여 결합하여 톨루엔에 대한 센서 기능을 나타낼 수 있는, TodS 단백질의 N-말단에 위치한 단백질 부위를 말한다. 구체적으로, PAS1 단백질은 톨루엔과 결합할 수 있으며, 상기 결합에 의하여 PAS1 단백질의 구조변화에 의해 TodS 단백질의 형태 변화(conformational change)가 TodS 단백질의 자가인산화과정을 활성화하고 TodS에 의해 인산화된 TodT가 tod 오페론의 전사조절부위 DNA와 결합하여 tod 유전자들을 활성화 시킬 수 있다.
상기 PAS1 단백질 구조를 형성하는 아미노산 서열 및 염기서열과 같은 정보는 NCBI GenBank와 같은 데이터베이스로부터 얻을 수 있으며, 그 예로 서열번호 1로 표시된 TodS 단백질의 43번 아미노산 내지 168번 아미노산 서열(서열번호 3), 또는 23번 아미노산 내지 168번 아미노산 서열(서열번호 5)일 수 있다. 또한, 상기 PAS1 단백질은 상기 서열번호 3 또는 서열번호 5의 아미노산 서열을 가지는 단백질뿐만 아니라, 이와 80% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 보다 더욱 구체적으로는 97%, 98% 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이러한 상동성을 갖는 서열로서 실질적으로 서열번호 또는 서열번호 4의 단백질과 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 경우도 본 발명의 범주에 포함됨은 자명하다.
본 발명에서 용어, "PAS1 변이 단백질"은 야생형 PAS1 단백질에 하나 이상의 아미노산을 치환, 삽입, 제거 또는 변형한 단백질을 의미하며, 본 발명의 목적상 상기 PAS1 변이 단백질은 톨루엔 리간드에 대한 민감도를 높이거나 낮추기 위해 변형시키거나, 톨루엔 외의 리간드에 대한 민감도를 변화시키기 위해 변경시킨 단백질을 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 PAS1 변이 단백질은 야생형 PAS1 단백질에 비하여 방향족 탄화수소와 결합하는 능력이 조절된 이상, 상기 (a) 내지 (q)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 변이를 포함하면서, 서열번호 1의 43번 내지 168번째 아미노산 서열, 또는 23번 내지 168번째 아미노산 서열과 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 더욱 구체적으로는 95% 이상, 가장 구체적으로는 97%, 98% 또는 99% 이상의 유사성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 단백질도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
본 발명에서 서열번호 1의 43 - 168번째 또는 23 - 168번째 아미노산 서열을 가진 PAS1 단백질은 각각 PAS1 (43 - 168) 또는 PAS1 (23 - 168)와 혼용된다.
본 발명의 일 실시예에서는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가진 TodS 단백질에서 46번 페닐알라닌이 알라닌 또는 세린으로, 59번 발린이 알라닌, 아스파틱산 또는 페닐알라닌으로, 63번 알라닌이 발린 또는 세린으로, 79번 페닐알라닌이 타이로신, 글루탐산 또는 류신으로, 84번 트립토판이 발린, 히스티딘 또는 알지닌으로, 85번 트립토판이, 히스티딘, 말지닌, 또는 류신으로, 114번 아이소퓨신이 발린, 페닐알라닌, 쓰레오닌(threonine) 또는 세린으로, 126번 발린이 알라닌, 세린, 쓰레오닌, 또는 류신으로, 128번 페닐알라닌이 글루탐산, 히스티딘, 아스파틱산, 세린 또는 류신으로, 145번 알라닌이 세린 또는 발린으로, 47번 발린이 알라닌 또는 류신으로, 49번 류신이 아스파틱산 또는 알라닌으로, 58번 글루탐산이 알리닌 또는 세린으로 131번 류신 아스파틱산으로, 61번 글루타민이 류신, 알지닌, 알라닌으로, 146번 글루탐산이 알라닌 또는 류신으로, 또는 148번 알지닌이 알라닌 또는 메티오닌으로 치환시킨 PAS1 변이 단백질을 포함하는 TodS 변이 단백질을 제조하여, 리간드에 따른 감지 능력을 확인하였다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가진 TodS 단백질에서 619번 타이로신 및 620번 글루탐산을 알라닌으로 치환, 666번 글루탐산을 알라닌으로 치환, 674번 루신을 알라닌으로 치환, 691번 타이로신을 아이소류신으로 치환, 703번 알라닌을 세린으로 치환, 또는 617번 내지 623번 아미노산이 결손된, TodS 변이 단백질을 제조하여, 리간드에 따른 감지 능력을 확인하였다.
본 발명에서 상기 서열번호 1의 TodS 단백질에서 114번 아이소류신이 발린으로 치환된 TodS 변이 단백질(I114V TodS, 서열번호 7); 또는 상기 TodS 변이 단백질의 아미노산 서열에서 43 내지 168번째, 또는 23번째 내지 168번째 아미노산 서열을 가지는 PAS1 변이 단백질은 톨루엔 및 m-자일렌으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 방향족 탄화수소 감지 센서로서 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 I114V TodS의 경우, 도 10에 기술된 방법을 사용하여 활성을 확인하였을 때, 야생형 TodS와 비교하여, 톨루엔에 의한 TodS/TodT 신호전달을 여전히 나타냈을 뿐만 아니라, 야생형 TodS에 비해 2 내지 5배 이상 민감도가 증가되는 결과를 나타내었다(실험예 10).
따라서 상기 I114V TodS는 톨루엔 또는/및 m-자일렌 감지 센서로서 사용될 수 있다. 예컨대, I114V TodS를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, TodT를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 tod 오페론의 프로모터에 작동가능하게 연결된 리포터 유전자의 3가지 구성 요소를 포함하는 시스템을 미생물에 도입하는 방법 등으로 톨루엔 또는/및 m-자일렌 감지 센서로서 사용할 수 있다.
또한, 본 발명에서 서열번호 1의 TodS 단백질에서 61번 아미노산인 글루타민이 알지닌으로 치환된 TodS 변이 단백질(Q61R TodS, 서열번호 8) 또는 상기 TodS 변이 단백질의 아미노산 서열에서 43 내지 168번째, 또는 23번째 내지 168번째 아미노산 서열을 가지는 PAS1 변이 단백질은 톨루엔, 스티렌, m-자일렌, o-자일렌 및 1,2,4-TMB(1,2,4-Trimethylbenzene)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 방향족 탄화수소 감지 센서로서 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 Q61R TodS의 경우, 도 8에 기술된 방법을 사용하여 활성을 확인하였을 때, 야생형 TodS와 비교하여, 톨루엔에 의한 TodS/TodT 신호전달을 2 내지 4배 가량 민감하게 인지하였을 뿐만 아니라, 스티렌, m-자일렌 및 o-자일렌에 대해서도 야생형 TodS에 비해 높은 민감도를 나타내었다(실험예 10).
따라서 상기 Q61R TodS는 톨루엔, 스티렌, m-자일렌, 또는/및 o-자일렌 감지 센서로서 사용될 수 있다. 예컨대, Q61R TodS를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, TodT를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 tod 오페론의 프로모터에 작동가능하게 연결된 리포터 유전자의 3가지 구성 요소를 포함하는 시스템을 미생물에 도입하는 방법 등으로 톨루엔, 스티렌, m-자일렌, 또는/및 o-자일렌 감지 센서로서 사용할 수 있다.
본 발명에서 PAS1 단백질은 TodS 단백질의 특정 도메인에 해당하므로, PAS1 변이 단백질은 TodS 변이 단백질에 포함된다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 TodS 변이 단백질 또는 PAS1 변이 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 발현 벡터; 및 상기 발현 벡터가 도입된 형질전환체를 제공한다.
상기 변이 단백질에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
본 발명에서 제공하는 상기 TodS 변이 단백질 또는 PAS1 변이 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터는 특별히 이에 제한되지 않으나, 포유류 세포(예를 들어, 사람, 원숭이, 토끼, 래트, 햄스터, 마우스 세포 등), 식물 세포, 효모 세포, 곤충 세포 또는 박테리아 세포(예를 들어, 대장균 등)를 포함하는 진핵 또는 원핵세포에서 상기 폴리뉴클레오티드를 복제 및/또는 발현할 수 있는 벡터가 될 수 있고, 바람직하게는 숙주세포에서 상기 폴리뉴클레오티드가 발현될 수 있도록 적절한 프로모터에 작동 가능하도록 연결되며, 적어도 하나의 선별 마커를 포함하는 벡터가 될 수 있다,
본 발명에서 용어, "형질전환체"는 상기 벡터로 형질 전환된 숙주세포로 본 발명의 수용성, 또는 수용성 및 결정성을 갖는 TodS 변이 단백질 또는 PAS1 변이 단백질을 다량으로 생산할 수 있는 형질전환체를 의미하며, 또한 상기 TodS 변이 단백질 또는 PAS1 변이 단백질이 도입되어 NMR 등을 통한 신기능의 감지센서 개발 후보물질을 스크리닝할 수 있는 형질전환체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 형질전환체는 방향족 탄화수소와 같은 오염물질을 분해하는 미생물 균주로서도 제작될 수 있다.
본 발명에서 제공하는 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체는 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 발현벡터가 도입되어 형질전환 된 대장균, 슈도모나스 등의 박테리아 세포(예, 슈도모나스 푸티다); 효모 세포; 피치아 파스토리스 등의 균류 세포; 또는 식물 세포가 될 수 있다.
본 발명에서 용어, "도입"은 상기 PAS1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 숙주세포에 전달하는 방법을 의미한다. 이와 같은 도입은 칼슘 포스페이트-DNA 공침전법, DEAE-덱스트란-매개 트랜스펙션법, 폴리브렌-매개 형질감염법, 전기충격법, 미세주사법, 리포좀 융합법, 리포펙타민 및 원형질체 융합법 등의 당 분야에 공지된 여러 방법에 의해 수행될 수 있다. 또한, 형질도입은 감염(infection)을 수단으로 하여 바이러스 입자를 사용하여 목적물을 세포 내로 전달시키는 것을 의미한다. 아울러, 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 도입할 수 있다. 본 발명에서 도입은 형질전환과 혼용되어 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 TodS 변이 단백질 또는 PAS1 변이 단백질을 생산하는 미생물을 제공한다.
상기 변이 단백질에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
상기 TodS 변이 단백질 또는 PAS1 변이 단백질을 생산하는 미생물은 돌연변이 없이 상기 변이 단백질을 야생형 단백질로 생산하는 미생물뿐만 아니라, 인위적인 및/또는 자연적인 돌연변이에 의해 상기 변이 단백질을 생산하게 된 미생물을 포함한다. 구체적으로, 상기 TodS 변이 단백질 또는 PAS1 변이 단백질을 생산하는 미생물은 슈도모나스(Pseudomonas) 속 미생물, 더욱 구체적으로 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 (i) 하기 (a) 내지 (d)의 모듈을 포함하는 센서용 모듈 조합; (ii) 상기 모듈 조합을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트; (iii) 상기 발현 카세트를 포함하는 벡터; 또는 (i) 내지 (iii) 중 어느 하나를 포함하는 미생물을 함유하는, 방향족 탄화수소 감지용 바이오센서를 제공한다:
(a) 방향족 탄화수소와 특이적으로 결합하는 상기 PAS1 변이 단백질을 포함하는 제1모듈;
(b) 제1모듈에 방향족 탄화수소가 결합시 신호를 발생 및 전달하는 제2모듈;
(c) 상기 전달된 신호에 의해 인산화되는 전사조절인자를 포함하는 제3모듈; 및
(d) 상기 인산화되는 제3모듈에 의해 표지 단백질을 발현시키는 제4모듈.
본 발명의 PAS1 변이 단백질이 방향족 탄화수소와 특이적으로 결합하여 키나아제 단백질의 자기인산화를 유도하여 인산 신호를 발생 및 전달시키면, 상기 전달된 신호에 의해 전사조절인자가 활성화되어 표지 단백질의 프로모터에 결합하여 표지 단백질을 발현시킨다. 즉, 제1모듈 내지 제4모듈을 포함하는 센서용 모듈 조합에 의해 방향족 탄화수소의 종류에 따라 표지 단백질이 발현되므로, 상기 모듈 조합을 포함하는 바이오센서는 방향족 탄화수소 감지 용도로 사용될 수 있다.
상기 변이 단백질, 벡터 및 방향족 탄화수소에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
상기 제2모듈의 신호는 PAS1 변이 단백질이 특정 방향족 탄화수소와 특이적으로 결합함에 따라 발생하는 신호를 의미한다. 구체적으로 제2모듈의 신호는 PAS1 변이 단백질과 특정 방향족 탄화수소의 결합에 의해 키나아제 단백질이 자기인산화되어 발생 및/또는 전달될 수 있으며, 더욱 구체적으로 1차 키나아제 단백질(HK 1)의 자기인산화에 의해 발생된 인산 신호가 반응 조절자(response regulator, RRR), PAS2 단백질, 및 2차 키나아제 단백질(HK 2)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질을 통해 전달될 수 있다. 또한, 상기 키나아제 단백질, 반응 조절자 및 PAS2 단백질은 인산 신호를 발생 및/또는 전달할 수 있는 한 특별히 제한되지 않으나, 구체적으로 슈노모나스 속 미생물, 더욱 구체적으로 슈도모나스 푸티다 유래일 수 있다.
또한, 상기 제2모듈은 본 발명의 TodS 변이 단백질 중에서 PAS1 변이 단백질을 제외한 단백질을 포함할 수 있다. 그 예로는 자기인산화에 의해 인산 신호를 발생 및/또는 전달할 수 있는 한, 본 발명의 TodS 변이 단백질 중에서 PAS1 변이 단백질을 제외한 단백질의 아미노산 서열과 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 더욱 구체적으로는 95% 이상, 가장 구체적으로는 97%, 98% 또는 99% 이상의 유사성을 나타내는 아미노산 서열을 가지는 단백질도 포함할 수 있다.
본 발명에서 제3모듈은 제2모듈로부터 전달된 인산 신호에 의해 인산화되어 활성화되는 전사조절인자를 포함한다. 상기 활성화되는 전사조절인자는 표지 단백질을 발현시킬 수 있는 한 제한되지 않으나, 구체적으로 TodT 단백질일 수 있으며, 더욱 구체적으로 슈노모나스 속 미생물 유래, 더더욱 구체적으로 슈도모나스 푸티다 유래일 수 있다. 또한, 상기 TodT 단백질의 아미노산 서열 및 염기서열과 같은 정보는 NCBI GenBank와 같은 데이터베이스로부터 얻을 수 있으며, 그 예로 서열번호 9로 표시된 아미노산 서열 또는 서열번호 10으로 표시되는 염기서열일 수 있다. 또한, 상기 TodT 단백질은 상기 서열번호 9의 아미노산 서열 또는 서열번호 10의 염기서열을 가지는 단백질뿐만 아니라, 이와 80% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 보다 더욱 구체적으로는 97%, 98% 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열 또는 염기서열을 포함할 수 있다. 이러한 상동성을 갖는 서열로서 실질적으로 서열번호 9 또는 서열번호 10의 단백질과 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 서열을 갖는 경우도 본 발명의 범주에 포함됨은 자명하다.
본 발명에서 제4모듈은 제3모듈에 의해 표지 단백질을 발현시키는 모듈을 의미한다. 구체적으로, 상기 단백질의 발현은 제3모듈의 인산화되어 활성화된 전사조절인자가 표지 단백질을 발현시키는 프로모터에 결합하여 이루어질 수 있다.
구체적으로, 본 발명에서 제4모듈은 제3모듈의 인산화된 전사조절인자가 결합하는 프로모터 및 상기 프로모터와 작동 가능하게 연결된 표지 단백질을 코딩하는 유전자를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 프로모터는 인산화된 전사조절인자가 결합하여 표지 단백질을 발현시킬 수 있는 한 제한되지 않으나, 구체적으로 todX 프로모터일 수 있으며, 더욱 구체적으로 슈노모나스 속 미생물 유래, 더더욱 구체적으로 슈도모나스 푸티다 유래일 수 있다. 또한, 상기 todX 프로모터의 염기서열과 같은 정보는 NCBI GenBank와 같은 데이터베이스로부터 얻을 수 있으며, 그 예로 서열번호 7으로 표시된 염기서열일 수 있다. 또한, 상기 todX 프로모터는 상기 서열번호 7의 염기서열을 가지는 프로모터뿐만 아니라, 이와 80% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 보다 더욱 구체적으로는 97%, 98% 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 염기서열을 포함할 수 있다. 이러한 상동성을 갖는 서열로서 실질적으로 서열번호 7의 프로모터와 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 염기서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 염기서열을 갖는 경우도 본 발명의 범주에 포함됨은 자명하다.
또한, 상기 표지 단백질은 구체적으로 형광단백질 및 변종(GFP, YFP, RFP, CFP 등), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase), 반딧불 루시퍼라제(firefly luciferase), 생물 발광의 미생물(비브리오(Vibrio), 제노르하브두스(Xenorhabdus), 포토르하브두스(Photorhabdus), 및 포토박테리움(Photobacterium) 등) 및 베타-갈락토시다아제(β-galactosidase)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 더욱 구체적으로는 베타-갈락토시다아제일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 방향족 탄화수소 감지용 바이오센서로 사용될 수 있는 미생물은 제1모듈 내지 제4모듈의 모듈 조합을 포함하여 방향족 탄화수소에 따라 특이적으로 표지 단백질을 발현시킬 수 있는한 제한되지 않으나, 구체적으로 슈노모나스 속 미생물, 더더욱 구체적으로 슈도모나스 푸티다일 수 있다.
본 발명에서 바이오센서는 추가로 표지 단백질의 발현을 측정할 수 있는 물질을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에서는 슈도모나스 퓨티다 KT2440 염색체의 mexC 유전자에 TodT 결합 프로모터 PtodX, β-갈락토시다아제의 유전자 lacZ, 및 스트렙토마이신 저항 유전자 Sm R로 구성된 카세트(PtodX-lacZ-Sm R)가 삽입되어 있는, 슈도모나스 퓨티다 KT24400-PXZ 리포터 균주를 제작하였고, 상기 리포터 균주에 PAS1 내 톨루엔 결합부위에 위치-지정 돌연변이를 일으킨 TodS/TodT 플라스미드를 형질전환시켜 슈도모나스 형질전환체들을 제작하였다. 상기 슈도모나스 형질전환체들을 96-웰 딥 플레이트(96-well deep plate)에 배양하고, 효능제인 톨루엔, 스티렌, m-자일렌 또는 길항제인 o-자일렌, 1,2,4-TMB 리간드를 각각 가스형태로 공급하여 생체 내 β-갈락토시다아제 단백질 생성을 유도한 후, 4-MUG(4-methylumbelliferyl β-galactopyranoside) 기질을 이용하여 β-갈락토시다아제 단백질의 활성을 측정하였다(실시예 6). 그 결과, 서열번호 1의 아미노산 서열에서I114V 또는 Q61R로 변형된 PAS1 또는 TodS 변이 단백질을 포함하는 슈도모나스 형질전환체들은 각각 m-자일렌과 o-자일렌 등에 대한 β-갈락토시다아제 활성이 매우 증가하여 상기 방향족 탄화수소 감지용 바이오센서로 사용될 수 있음을 알 수 있었다(실험예 10).
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 (i) 하기 (a) 내지 (d)의 모듈을 포함하는 센서용 모듈 조합; (ii) 상기 모듈 조합을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트; 또는 (iii) 상기 발현 카세트를 포함하는 벡터를 포함하는 미생물을 함유하는, 방향족 탄화수소 분해용 미생물 제제를 제공한다:
(a) 방향족 탄화수소와 특이적으로 결합하는 본 발명의 PAS1 변이 단백질을 포함하는 제1모듈;
(b) 제1모듈에 방향족 탄화수소가 결합시 신호를 발생 및 전달하는 제2모듈;
(c) 상기 전달된 신호에 의해 인산화되는 전사조절인자를 포함하는 제3모듈; 및
(d) 상기 인산화되는 제3모듈에 의해 방향족 탄화수소 분해 단백질을 발현시키는 제4모듈.
본 발명의 방향족 탄화수소 분해용 미생물 제제의 모듈 조합은 상기 바이오센서의 모듈 조합에서 제4모듈의 표지 단백질이 방향족 탄화수소 분해 단백질로 교체되어 있는 형태이다. 즉, 제1모듈 내지 제4모듈을 포함하는 모듈 조합에 의해 방향족 탄화수소의 종류에 따라 방향족 탄화수소 분해 단백질이 발현되므로, 상기 모듈 조합을 포함하는 미생물 제제는 방향족 탄화수소를 분해하는 데에 사용될 수 있다.
상기 변이 단백질, 벡터, 방향족 탄화수소, 제1모듈, 제2모듈 및 제3모듈에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
상기 제4모듈의 방향족 탄화수소 분해 단백질은 방향족 탄화수소를 분해하는 것으로 알려진 다양한 단백질 중에서 선택할 수 있으며, 1 종의 방향족 탄화수소를 분해하기 위해 필요한 2 이상의 단백질이거나, 또는 2 이상의 방향족 탄화수소를 분해할 수 있는 하나 이상의 단백질 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 제4모듈의 방향족 탄화수소 분해 단백질은 톨루엔을 분해하는 데에 필요한 톨루엔 디옥시게나아제(toluene dioxygenase, todABC1C2), cis-톨루엔 디하이드로다이올 디하이드로게나아제(cis-toluene dihydrodiol dehydrogenase, todD), 30-메틸카테콜 2,3,-디옥시게나아제(30-methylcatechol 2,3,-dioxygense, todE) 및 2-하이드록시-6-옥소-2,4-헥타다이에노에이트 하이드롤라아제(2-hydroxy-6-oxo-2,4-heptadienoate hydrolase, todF)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 구체적으로, 제4모듈의 방향족 탄화수소 분해 단백질은 스티렌을 분해하는 데에 필요한 스티렌 모노옥시게나아제(styrene monooxygenase, styAB), 스티렌 옥시드 이소머라아제(styrene oxide isomerase, styC), 페닐아세트알데히드 디하이드로게나아제(penylacetaldehyde dehydrogenase, styD), 및 페닐아세틸 코에이 리가아제(phenylacetyl coA ligase, paaF2)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 구체적으로, 제4모듈의 방향족 탄화수소 분해 단백질은 m-자일렌을 분해하는 데에 필요한 자일렌 모노옥시게나아제(xylene monooxygenase), 벤질 알콜 디하이드로게나아제(benzyl alcohol dehydrogenase), 벤즈알데하이드 디하이드로게나아제(benzaldehyde dehydrogenase), 톨루에이트 디옥시게나아제(toluate dioxygenase), 및 1,2-디하이드록시-3-메틸시클로헥사-3,5-디엔카르복실레이트 디하이드로게나아제(1,2-dihydroxy-3-methylcyclohexa-3,5-dienecarboxylate dehydrogenase)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 구체적으로, 제4모듈의 방향족 탄화수소 분해 단백질은 o-자일렌을 분해하는 데에 필요한 자일렌 모노옥시게나아제(xylene monooxygenase), 벤질 알콜 디하이드로게나아제(benzyl alcohol dehydrogenase), 벤즈알데하이드 디하이드로게나아제(benzaldehyde dehydrogenase), 톨루에이트 디옥시게나아제(toluate dioxygenase), 1,2-디하이드록시-6-메틸시클로헥사-3,5-디엔카르복실레이트 디하이드로게나아제(1,2-dihydroxy-6-methylcyclohexa-3,5-dienecarboxylate dehydrogenase), o-자일렌 3,4-디옥시게나아제(o-xylene 3,4-dioxygenase), 카테콜 2,3-디옥시게나아제(catechol 2,3-dioxygenase), o-자일렌 4,5-디옥시게나아제(o-xylene 4,5-dioxygenase), 및 4,5-디메틸카테콜 2,3-디옥시게나아제(4,5-dimethylcatechol 2,3-dioxygenase)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 방향족 탄화수소 분해용 미생물 제제로 사용될 수 있는 미생물은 상기 제1모듈 내지 제4모듈의 모듈 조합을 포함하여 방향족 탄화수소에 따라 특이적으로 분해 단백질을 발현시킬 수 있는 한 제한되지 않으나, 구체적으로 슈노모나스 속 미생물, 더더욱 구체적으로 슈도모나스 푸티다일 수 있다.
또한, 슈도모나스 속 미생물은 톨루엔 이외에도 스티렌의 이화작용을 위하여 styABCD 오페론을 필요로 하고, styABCD 오페론은styS/styR 2개 인자 신호전달 체계에 의해 조절 받는다. 스티렌에 의해 styS는 styR을 인산화시켜 sty 오페론의 발현을 상향조절 하지만, styS는 또한 스티렌보다 선호하는 글루코스에 존재 하에서는 sty 오페론의 발현을 저해하기도 한다. StyS 역시 TodS와 같이 센서 키나아제로 기능하며, 스티렌 결합은 PAS 도메인에서 이루어질 것으로 추정된다. 따라서, 톨루엔과 결합하는 PAS1 단백질의 입체구조 정보를 기반하여 재설계하여 제작된 PAS1 변이 단백질은, 스트렌 결합에 의해 특이적으로 반응하는 StyS로 도입되어 토양 내 스티렌 오염물질을 분해하는 미생물 균주의 제작을 가능하게 할 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 바이오센서를 포함하는, 방향족 탄화수소 감지용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 미생물 제제를 포함하는, 방향족 탄화수소 분해용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 바이오센서를 시료에 노출시키는 단계를 포함하는, 방향족 탄화수소 감지방법을 제공한다.
본 발명의 바이오센서는 시료에 함유된 방향족 탄화수소의 종류에 따라 표지 단백질이 발현되므로, 발현된 표지 단백질을 측정하여 특정 방향족 탄화수소를 감지할 수 있다.
본 발명의 방향족 탄화수소 감지방법은 추가적으로 바이오센서의 표지 단백의 발현 수준을 측정하여 대조군과 비교하는 단계를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 방향족 탄화수소 감지방법은 추가적으로 표지 단백의 발현 수준이 대조군에 비하여 증가하는 경우, 시료에 방향족 탄화수소가 존재하는 것으로 판단하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 미생물 제제를 이용하여 방향족 탄화수소를 분해하는 단계를 포함하는, 방향족 탄화수소 분해방법을 제공한다.
본 발명의 미생물 제제는 방향족 탄화수소의 종류에 따라 방향족 탄화수소 분해 단백질이 발현되므로, 특정 방향족 탄화수소를 분해할 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 서열번호 1의 TodS 단백질로부터 43번째 내지 168번째 아미노산 서열을 가지는 PAS1 단백질을 결정화시키는 단계를 포함하는, PAS1 단백질을 결정화시키는 방법과, 서열번호 1의 TodS 단백질로부터 43번째 내지 168번째 아미노산 서열을 가지는 PAS1 단백질과 톨루엔 또는 1,2,4-TMB(1,2,4-Trimethylbenzene)의 혼합물을 결정화시키는 단계를 포함하는, PAS1 단백질과 톨루엔 또는 1,2,4-TMB의 복합체를 결정화시키는 방법을 제공한다.
상기 PAS1 단백질 단독의 결정체('Apo-PAS1'으로 명명), 나아가 상기 TodS의 PAS1 단백질 부위에 결합하는 리간드인 톨루엔 및 1,2,4-TMB(1,2,4-Trimethylbenzene) 각각과 PAS1 단백질의 복합체의 결정체의 제조 방법에 대한 본 발명의 구체적인 내용은 하기와 같다.
본 발명에서 용어, " Apo-PAS1"은 PAS1 단백질 단독으로 형성된 결정체를 의미한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면 PAS1 단백질은 리간드가 없는 상태에서도 두 분자의 이량체로 존재하나, 아미노산 150번에서 168번 사이의 구조는 유연성이 높다.
본 발명에서 용어, "SeMet-PAS1 단백질"은 PAS1의 메티오닌이 셀레노메티오닌(selenomethionine, SeMet)으로 치환된 단백질을 의미한다. 상기 셀레노메티오닌이란, 메티오닌을 구성하는 황(32S)을 동족원소인 셀레늄(75Se)으로 치환한 아미노산을 말한다. 셀레노메티오닌은 원래의 메티오닌과 유사한 동태 및 화학적 성질을 보이며, X-선 결정학에서 현재까지 밝혀진 유사한 형태의 입체구조가 없을 경우 3차원적 결정 구조를 얻기 위한 위상문제 해결을 위해 사용된다. 이러한 단백질의 구조를 분석하기 위해 메티오닌을 셀레노메티오닌으로 치환하여 결정화하는 방법을 셀레노메티오닌법이라고 지칭하기도 한다. 본 발명의 일 실시예에서는 톨루엔과의 복합체 제조에 있어서 결정화된 단백질의 위상문제를 해결하기 위해, 단백질을 구성하는 메티오닌이 셀레노메티오닌으로 치환된 SeMet-PAS1을 제조하여 톨루엔과 혼합하여 결정화하였다. 상기 셀레노메티오닌(selenomethionine, SeMet)-치환 PAS1 단백질을 얻기 위해서, 메티오닌 영양 요구체 E.coli B834(DE3) 균주(Novagen)를 50mg/ml의 SeMet을 첨가한 최소 배지에서 배양하였다. 상기 배양한 배양물에서 SeMet-치환 PAS1 단백질은 5mM 메티오닌을 모든 버퍼에 첨가하여 정제-수득하였다.
본 발명에서 용어, "톨루엔(toluene)"은, 방향족탄화수소로서 벤젠의 수소 하나가 메틸기로 치환된 무색의 휘발성, 가연성 액체, 메틸벤젠을 말한다. 상기 톨루엔, 대부분 석유로부터 촉매 개량방법에 의해 생산되나, 일부는 에틸렌과 프로필렌 제조 과정에서 가솔린 열분해 과정을 통해 분리 생산된다. 상기 톨루엔은 C6H5CH3의 화학식을 가질 수 있다.
본 발명에서 용어, "SeMet-PAS1 단백질과 톨루엔의 복합체"는 SeMet-PAS1 단백질과 톨루엔 간의 상호작용에 의해 형성된 복합체를 의미한다. 구체적으로는 PAS1 단백질의 소수성 리간드 결합 부위의 46번 페닐알라닌(phenylalanine), 48번 글라이신(glycine), 59번 발린(valine), 63번 알라닌(alanine), 79번 페닐알라닌, 84번 트립토판(tryptophan), 85번 트립토판, 114번 아이소류신(isoleucine), 126번 발린, 128번 페닐알라닌, 145번 알라닌, 147번 글라이신과 톨루엔이 수소 결합(Hydrogen bond) 또는 물 분자-매개 수소 결합에 의하여 형성된 복합체를 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 SeMet-PAS1 단백질과 톨루엔 간의 결합 구조를 본 발명에서 제작한 결정체 구조를 분석하여 확인하였다. 구체적으로, 톨루엔이 PAS1 소수성 리간드 결합 부위에 결합하는 것을 확인하였다. 두 SeMet-PAS1 단량체들 간에 밀접한 결합은 각 SeMet-PAS1 단량체 47번 발린, 49번 류신 및 131번 류신을 통해 일어났다. 또한, PAS1 단백질에 리간드 결합이 일어날 때 나타난 46번 페닐알라닌, 146번 글루탐산과 148번 알지닌의 구조 변화는 TodS 단백질 이량체의 형태 변화와 tod 오페론 유전자들로의 신호 전달에 매우 중요하였다. 더욱이, 톨루엔 리간드의 벤젠 링은 46번 페닐알라닌, 79번 페닐알라닌, 84번 트립토판, 85번 트립토판, 128번 페닐알라닌에 의해 형성된 공간에 위치하며, 63번 알라닌, 114번 아이소류신, 126번 발린, 147번 글라이신도 톨루엔과의 결합에 중요한 역할을 하였다. 또한 톨루엔의 메틸 그룹은 48번 글라이신, 59번 발린, 145번 알라닌 아미노산 잔기들에 둘러싸여 있음을 확인하였다.
본 발명에서 용어, "1,2,4-TMB(1,2,4-trimethylbenzene)"는, 가연성 방향족 탄화수소로서 세 개의 메틸기로 포함하는 무색의 휘발성 액체 형태일 수 있다. 상기 1,2,4-TMB는 대부분 석유나 석탄으로부터 생산된다. 상기 1,2,4-TMB는 C9H12의 화학식을 가질 수 있다. 본 발명에서 1,2,4-TMB는 PAS1 단백질과 결합할 수 있으며, 상기 결합에 의하여 PAS1 단백질의 구조변화에 의해 나타나는 TodS 단백질의 형태 변화(conformational change)가 TodS 단백질의 자가 인산화과정을 불활성화 시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "PAS1 단백질과 1,2,4-TMB의 복합체"는 PAS1 단백질과 1,2,4-TMB 간의 상호작용에 의해 형성된 복합체를 의미한다. 1,2,4-TMB 리간드도 톨루엔과 같이 PAS1 단백질의 소수성 리간드 결합 부위의 46번 페닐알라닌, 48번 글라이신, 59번 발린, 63번 알라닌, 79번 페닐알라닌, 84번 트립토판, 85번 트립토판, 114번 아이소류신, 126번 발린, 128번 페닐알라닌, 145번 알라닌, 또는/및 147번 글라이신과 수소 결합(Hydrogen bond) 또는 물 분자-매개 수소 결합을 하여, 상기 복합체를 형성할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "결정화"를 이룰 수 있게 한다는 것 또는 "결정성"을 갖는다는 것은 단백질을 X-선 단백질 3차 구조 분석을 위한 적합한 상태로 만들어주기 위해 단백질 분자에 변이를 도입하는 등으로 균일한 액상으로부터 일정한 모양과 크기를 갖는 고체입자를 형성하게 하거나 단백질의 결정 상태를 더욱 안정하게 하는 것을 말한다. 단백질의 3차원 구조는 단백질의 생체 내 작용을 이해하고, 분자기전을 규명하는데 매우 중요하다. 즉, 고분자인 단백질을 구성하는 원자의 배열과 3차원 구조를 안다면, PAS1 단백질과 톨루엔 복합체의 3차 구조 분석이 가능하며 PAS1 단백질과 톨루엔 간의 특이적 결합 부위 조절을 통해 리간드 특이성의 확대 및 민감도 증대를 가능하게 하는 신기능의 감지센서 제작의 기반을 마련할 수 있다. 그러나, 단백질, 또는 단백질과 리간드 복합체의 3차 구조의 구조 규명은 일반적으로 매우 어려웠다. 이는, PAS1 단백질 단독 또는 이의 복합체의 3차 구조 분석을 위해서는 먼저 해당 단백질을 결정체로 만들어야 하며, 이를 분석해야 하기 때문이다. 또한, 안정적인 결정체를 수득할 수 있는지 여부는 단백질의 종류에 따라 달라지며, 특히 결정화 조건은 단백질에 따라 전혀 다를 수 있기 때문이다.
상기 단계에서 결정화시키는 방법은 공지의 다양한 결정화 방법을 이용할 수 있으며, 구체적으로 증기 확산법(vapor diffusion method)에 의해 수행될 수 있다. 상기 증기 확산법은 시팅 드롭 증기 확산법(sitting drop vapo-diffusion method) 또는 방울 혼합 증기 확산법(Hanging-drop vapor diffusion method)을 포함하며, 더욱 구체적으로 시팅 드롭 증기 확산법에 의해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "시팅 드롭 증기 확산법"이란 밀폐된 공간에 모액의 작은 방울과 훨씬 큰 규모의 저수조(reservoir) 용액이 분리된 채 공존할 때, 이들 사이에 물 또는 다른 휘발성 물질의 이동이 일어나게 되고, 단백질의 용액조건에서 슈퍼포화상태가 되며, 그러한 열역학적 준안정 상태에서 침전제의 변화에 따라 단백질이 침전되는 것을 이용한 결정화 방법이다. 단백질이 침전될 때, 그 속도가 느리게 진행되면서 안정된 결정화 상태가 되고, 침전제로 알려져 있는 것은 농축상태의 단백질 용액의 용해도를 줄여 주는 역할을 하게 되며, 단백질 분자 주위의 상대적인 흡착층을 감소시키기 위하여 단백질들은 서로 모여들며 이것이 결정을 형성하게 된다. 저수조 용액은 이와 같은 침전제, 완충액, 염, 계면활성제(detergent) 등이 여러 농도로 섞여 있게 되는데, 단백질 용액과 이런 다양한 조건의 저수조 용액이 보통의 경우 1:1의 비율로 섞어 방울을 형성하게 되고, 이렇게 얻어진 방울을 마이크로브릿지(microbrige) 위에 놓은 후 밀봉한다. 이때, 초기에는 방울 중 단백질의 농도가 저수조 용액의 농도와 차이가 있어서 단백질이 결정 상태로 존재하지 않는다. 이렇게 밀봉된 상태로 놓아두면 서서히 평형이 이루어지고, 상기에 설명한 원리에 의해 특정상태의 조건에서 결정이 형성될 수 있는 것이다. 이와 같은 시팅 드롭 증기 평형법에서 저수조 용액 중의 침전제뿐만 아니라 염, 완충액 및 계면활성제의 종류와 적정 농도, 용액의 pH 및 실험온도는 단백질의 종류에 따라 달리 선택되고 경우에 따라서는 단백질의 결정형성에 있어서 아주 중요한 요소가 된다.
본 발명에서 용어, "방울 혼합 증기 확산법(Hanging-drop vapor diffusion method)"은 단백질의 결정화 방법 중 하나로서, 단백질 구조를 분석하기에 충분한 크기의 결정을 제공하는 방법이다. 방울 혼합 증기 확산법은 샘플이 포함된 시약과 액체 상태의 순수한 시약을 증기 평형 상태에 있는 용기 상단에 부착한다. 용기에 비해 시약의 함량이 적은 샘플이 평형에 도달하기 위해서, 샘플에 포함된 물이 용기로 떨어지게 하므로 액체 상태의 시약과 농도가 같아질 때까지 샘플에 함유된 물이 제거되고, 결과적으로 평형 상태에 도달한 단백질 결정을 얻을 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 시팅 드롭 증기 확산법을 이용하여 PAS1 단백질의 결정체(Apo-PAS1), SeMet-PAS1 단백질과 톨루엔의 복합체, 및 PAS1 단백질과 1,2,4-TMB 복합체의 결정체를 수득하였다.
본 발명은 PAS1 단백질 단독 또는 이의 톨루엔 또는 1,2,4-TMB 복합체의 결정체를 제조할 수 있는 최적화된 방법을 제공한다. 상기 방법은 시팅 드롭 증기 확산법을 통해 수행될 수 있다.
구체적으로, 상기 PAS1 단백질과 톨루엔 또는 1,2,4-TMB를 1:2 내지 1:20(PAS1 단백질: 톨루엔 또는 1,2,4-TMB), 보다 구체적으로는 1:2의 몰비율로 혼합한 것일 수 있다.
본 발명의 방법에 사용되는 상기 PAS1 단백질은 별도로 발현시키거나 천연에 존재하는 단백질을 정제하는 과정을 통해 수득된 단백질일 수 있으며, 상기 정제는 당업계에 잘 알려진 정제 방법일 수 있다. 따라서, 상기 방법에서 결정화시키는 단계를 수행하기에 앞서, PAS1 단백질을 정제하는 단계를 포함할 수 있으며, 상기 단백질의 정제는 친화성 크로마토그래피 등 공지의 정제 방법에 의하여 수행될 수 있다. 예컨대, 면역친화성 크로마토그래피, 수용체 친화성 크로마토그래피, 소수성 작용 크로마토그래피, 렉틴 친화성 크로마토그래피, 크기배제 크로마토그래피, 양이온 또는 음이온 교환 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 및 역상 HPLC 등을 포함하는 종래의 크로마토그래피 방법에 의해 숙주 세포가 자라는 배지에서 분리될 수 있다. 또한, PAS1 단백질에 특이적 태그, 라벨 또는 킬레이트 모이어티를 융합하여 융합 단백질을 수득하여 특이적 결합 파트너 또는 제제에 의해 인식하여 정제하는 방법이 있다. 정제된 단백질은 원하는 단백질 부분으로 절단되거나 그 자체로 남아있을 수 있다. 융합 단백질의 절단으로 절단 과정에서 부가적인 아미노산을 가지는 원하는 단백질 형태가 만들어질 수 있다
또한 구체적으로, 상기 결정화는 암모늄 포스페이트 및 트리스 하이드로클로라이드를 포함하는 저수조 용액 조건 하에서 이루어지는 것일 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 결정화는 2.8 내지 3.0M 암모늄 포스페이트(예, ammonium phosphate dibasic, trihydrate) 및 0.01 내지 0.1M, 구체적으로는 0.1M 트리스 하이드로클로라이드(Tris-Hydrochloride, pH 8.0 내지 8.5)를 포함하는 용액 조건에서 이루어지는 것일 수 있다.
상기와 같은 조성을 가진 저수조 용액에, PAS1 단백질 또는 이의 리간드를 추가로 포함하는 단백질 용액을 첨가하여 이를 혼합하고, 평형화하여 결정체를 제조할 수 있다.
상기 PAS1 단백질을 포함하는 단백질 용액은 PAS1 단백질을 5 내지 10 mg/ml의 농도로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 단백질 용액은 10 mg/ml의 농도로 PAS1 단백질을 포함하는 용액일 수 있다.
상기 저수조 용액에 단백질 용액을 혼합하는 경우에는, 저수조 용액과 단백질 용액이 바람직하게는 1:1의 비율이 되도록 혼합하나, 이에 제한되지 않는다.
이와 같이 혼합한 용액을 저수조 위쪽을 밀폐한 커버슬립 아래, 또는 용기 상단에 부착하여 결정체가 커지도록 할 수 있다.
여기서, 상기 결정화시키는 단계는 얼음 위에서 1 내지 24시간, 그 예로 1 내지 2시간 동안 정치시키는 것을 통해 이루어지는 것일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, 21℃에서 시팅 드랍 증기 확산법을 이용한 정제된 PAS1과 톨루엔을 1:2 몰비율로 혼합하여 1시간 동안 얼음상에 정치시켜 복합체를 얻을 수 있었다. 상기 단백질의 결정화는 3.0M 암모늄 포스페이트(ammonium phosphate dibasic, trihydrate), pH 8.0의 0.1M 트리스 하드로클로라이드(Tris-Hydrochloride) 조건하에서 최적 형성되었다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 PAS1 단백질 결정체, SeMet-PAS1 단백질과 톨루엔 복합체의 결정체 및 PAS1 단백질과 1,2,4-TMB 복합체의 결정체를 제공한다.
상기 PAS1, SeMet-PAS1, 톨루엔, 1,2,4-TMB, 복합체 및 결정체에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
구체적으로, 상기 PAS1 단백질 결정체는 공간군(space group)이 P21이고, 단위 셀 디멘션(unit-cell dimension)은 a=41.114Å, b=49.314Å, c=56.222Å, α=90°, β=109.22°, γ=90°인, 서열번호 1의 TodS 단백질로부터 43번째 내지 168번째 아미노산 서열을 가지는 PAS1 단백질 결정체일 수 있다.
또한, 구체적으로 상기 SeMet-PAS1 단백질과 톨루엔 복합체의 결정체는 공간군이 P212121이고, 단위 셀 디멘션은 a=41.342Å, b=47.744Å, c=126.522Å, α=β=γ=90°인, 서열번호 1의 TodS 단백질로부터 43번째 내지 168번째 아미노산 서열을 가지는 PAS1 단백질 중 메티오닌이 셀레노메티오닌인 SeMet-PAS1 단백질과 톨루엔 복합체의 결정체일 수 있다.
또한, 구체적으로 상기 PAS1 단백질과 1,2,4-TMB 복합체의 결정체는 공간군이 P212121이고, 단위 셀 디멘션은 a=45.387Å, b=51.016Å, c=100.728Å, α=β=γ=90°인, 서열번호 1의 TodS 단백질로부터 43번째 내지 168번째 아미노산 서열을 가지는 PAS1 단백질과 1,2,4-TMB(1,2,4-Trimethylbenzene) 복합체의 결정체일 수 있다.
본 발명에서 용어, "공간군(space group)"이란 결정의 단위 세포(unit cell)의 대칭(symmetry)을 의미하며, 대칭요소들을 조합하면 군(group)을 형성한다. 상기 공간은 공간 그룹과 혼용된다.
본 발명에서 용어, "단위 셀 디멘션(unit-cell dimension)"은 격자계수로도 불리며, 단위 셀은 공간군을 구성하는 가장 해석이 용이한 최소 반복 단위(repeating unit)으로, 세 crystallographic axes로 정의되며, 이 세 벡터(vector)에 대한 길이(a, b, c)와 이들이 서로 이루는 각(α, β, γ)을 의미한다. 상기 a, b, c는 각각 A, B 및 C로 표시될 수 있다.
상기 위상정보는 중금속 치환법(Multiple Isomorphous Replacement), 다중파장분석법(Multiwavelength Anomalous Dispersion) 및 구조 치환법(Molecular Replacement) 등을 통해 얻을 수 있다. 첫째, 중금속치환법은 여러 결정을 중금속으로 치환하여 데이터를 모은 후 그 정보를 분석, 위상정보를 얻는 것이다. 둘째, 다중파장분석법은 중금속 대신에 결정 내의 특이적인 금속 또는 원자를 이용하여 여러 파장에서의 그 원자의 변칙(anomalous)을 이용하여 데이터를 모은 후 위상 정보를 얻는 것으로 널리 이용되고 있는 기술 중 하나이다. 즉 여러 결정에서 데이터를 수집하는 번거로움 없이 하나의 결정으로부터 분자생물학적 방법을 이용하여 아미노산 메티오닌이 셀레노메티오닌(Se-Met)으로 치환되어 이 셀레늄 원자를 이용하여 쉽게 데이터를 얻을 수 있으나 이 방법은 꼭 방사광에서만 얻어야 하는 단점이 있다. 셋째, 구조 치환법은 이미 알려진 유사한 구조로부터 위상문제를 해결하는 방법으로, 이는 알려진 구조가 증가함에 따라 널리 이용되는 방법으로서, 각각의 구조를 데이터로부터 얻은 후, 이 데이터와 우리의 모델이 최대한 잘 맞게 해주는 정밀화단계 과정이 진행된다. 이러한 과정은 공지의 여러가지 프로그램(CCP4, Coot, Quanta, CNS 등)을 이용하여 수행되며, 각각의 각도 및 결합길이 등의 표준화 과정이 필요한데, 이 과정에서는 컴퓨터의 성능과 눈으로 보고 직접 모델을 얻어진 전자밀도 지도에 맞추는 과정이 반복 수행된다. 구조 정밀화 작업 후 분석단계에서는 그 구조로부터 여러 가지 정보를 유추 해석해 내며, 이러한 분석단계에서 구조에 바탕을 둔 작용 기작에 대한 연구를 할 수 있으며, 이러한 정확한 작용기작에 대한 연구는 신약개발에 필요한 여러 가지 정보를 얻어내는 기반이 된다. 또한, 그 단백질에 대한 조절화합물과의 복합체의 구조를 통해서는 직접적인 관련 잔기들을 알 수 있으므로, 그 다음 단계의 조절화합물 연구에 중요한 정보를 제공하게 된다.
본 발명의 일 실시예에서는 본 발명의 결정체를 위한 분산 데이터를 Apo-PAS1 단백질은 1.5Å 해상도로 측정하였고. SeMet-PAS1/톨루엔 복합체의 결정체 크리스탈에 대한 단일파장 비정상 회절 데이터는 1.65Å 해상도로, PAS1/1,2,4-TMB 복합결정체 수집하였다. 모든 데이터는 HKL2000 소프트웨어 패키지로 분석하였다. SeMet-PAS1/톨루엔 복합체의 구조는 Se 원자로부터 나오는 비정상 신호를 SOLVE 프로그램으로 분석하여 알아내었다. 밀도 조절 및 순차적 자동화 모델 빌딩 과정은 RESOLVE 프로그램으로 수행하였다. 복합체 결정 구조는 SeMet 결정의 부분 개선 모델을 이용하는 MOLREP 프로그램를 이용하여 분자 치환을 통해 1.65Å 해상도로 밝혔다. 복합체 결정 구조는 COOT 프로그램으로 교정되고 REFMAC5를 이용하여 개선하였다. 이러한 방법으로 얻은 PAS1 단독 단백질(Apo-PAS1), SeMet-PAS1 단백질과 toluene 복합체, PAS1과 1,2,4-TMB 복합체에 대한 원자 좌표 및 구조 인자 진폭(Structure factor amplitudes)는 PDB(Protein Data Bank)에 기탁하였으며, 이에 대한 각각의 접근 코드(Accession code)는 PAS1 단독 단백질 (Apo-PAS1)이 3X18, SeMet-PAS1/toluene 볼합체는 3X19, 또한 PAS1/1,2,4-TMB는 접근 코드가 3X1A이다. 이에 대한 결정체 정보는 표 3에, 원자좌표는 표 4 내지 6에 각각 나타내었다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 (a) 표 4에 나타낸 PAS1 단백질의 원자좌표, 표 5에 나타낸 SeMet-PAS1 단백질과 톨루엔 복합체의 원자좌표 또는 표 6에 나타낸 PAS1 단백질과 1,2,4-TMB(1,2,4-Trimethylbenzene) 복합체의 원자좌표를 이용하여 PAS1 단백질 또는 이의 복합체의 3차 구조를 설계하는 단계; (b) 상기 설계된 3차 구조를 이용하여 PAS1에 결합하는 후보 물질을 생성하는 단계; 및 (c) 상기 후보 물질이 PAS1 단백질 또는 PAS1을 포함하는 TodS 단백질과 리간드 간의 결합을 조절하는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는, PAS1 단백질 또는 TodS 단백질과 리간드 간의 결합을 조절하는 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
상기 PAS1 단백질, 복합체, 톨루엔, 1,2,4-TMB 등에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
상기 PAS1 단백질 또는 이의 복합체에 대한 원자좌표는 컴퓨터와 같은 계산 장치로의 연속적인 사용을 위한 매체에 저장될 수 있다. 전형적으로 상기 좌표는 자기 또는 광학매체와 같은 다량의 데이터를 저장하는 데 유용한 매체(즉, 플로피 디스크, 하드 디스크, 컴팩트 디스크, 마그네토-광학 매체 또는 전자 매체 등)에 저장될 수 있다. 이와 관련한 컴퓨터, 저장매체, 네트워킹 및 다른 장치 또는 기술의 선택은 구조/계산 화학 분야의 당업자에게 익숙할 것이다.
상기 스크리닝 방법의 (a) 단계는 상기 복합체에 대한 3차 구조에 대한 원자 좌표 등에 대한 데이터를 적절한 소프트웨어 프로그램과 함께 컴퓨터 상에 입력하는 단계; 및 시각화 및 추가적인 컴퓨터 조작이 가능한 3차원적 단백질 구조로 나타내는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 스크리닝 방법의 (b) 단계는 상기 설계된 3차 구조를 이용하여 PAS1에 결합하는 후보 물질을 생성하는 단계이다.
본 발명에서 규명한 PAS1 단백질 또는 이의 복합체의 3차원 구조를 바탕으로 원자좌표 및/또는 3차원 구조 표시에 대한 데이터를 포함하는 컴퓨터-판독 매체를 이용하여 상호작용 부위를 포함하는 다양한 단백질 부위에 대한 정보를 제공받을 수 있다. 이러한 과정을 통하여 수많은 신약 후보물질들에 대한 실질적인 실험을 수행하지 않고도 그 반응 양상을 예측할 수 있고, 그 결과에 따라 선별된 물질에 한하여 실험을 수행함으로써 신약 개발의 경제성을 증대시킬 수 있다.
본 발명에서 용어, "후보 물질"은 PAS1과 결합할 수 있는 물질인 이상, 방향족 화합물들을 제한 없이 포함한다. 즉, 상기 분석된 PAS1 단백질 또는 이의 복합체의 3차 구조를 기반으로 해당 PAS1 부위에 결합할 수 있는 구조를 가진다고 예측되거나, 결합할 수 있는 구조를 가지도록 합성, 제조 또는 변형된 물질을 제한 없이 포함할 수 있다. 그 예로, PAS1에 결합하는 방향족 탄화수소일 수 있으며, 보다 구체적인 예로 하기 기술하는 방향족 탄화수소일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 방법에서 상기 (c) 단계는 상기 후보 물질이 PAS1 단백질 또는 PAS1을 포함하는 TodS 단백질과 리간드 간의 결합을 조절하는지 여부를 확인하는 단계이다.
구체적으로, 상기 후보 물질이 단백질과 리간드 간의 결합을 조절하는지 여부는 PAS1 단백질 또는 PAS1 단백질을 포함하는 TodS 단백질을 함유하는, 바이오센서를 이용하여, 후보 물질에 의해 발현되는 표지 단백질의 수준을 측정함으로써 확인할 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 (c) 단계는 (i) 하기 (a') 내지 (d')의 모듈을 포함하는 센서용 모듈 조합; (ii) 상기 모듈 조합을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트; (iii) 상기 발현 카세트를 포함하는 벡터; 또는 (i) 내지 (iii) 중 어느 하나를 포함하는 미생물을 함유하는, 바이오센서를 이용하여, 후보 물질에 의해 발현되는 표지 단백질의 수준을 측정함으로써 수행될 수 있다:
(a') PAS1 단백질을 포함하는 제1모듈;
(b') 제1모듈에 후보 물질이 결합시 신호를 발생 및 전달하는 제2모듈;
(c') 상기 전달된 신호에 의해 인산화되는 전사조절인자를 포함하는 제3모듈; 및
(d') 상기 인산화되는 제3모듈에 의해 표지 단백질을 발현시키는 제4모듈.
상기 PAS1 단백질이 후보 물질과 특이적으로 결합하여 키나아제 단백질의 자가인산화를 유도하여 인산 신호를 발생 및 전달시키면, 상기 전달된 신호에 의해 전사조절인자가 활성화되어 표지 단백질의 프로모터에 결합하여 표지 단백질을 발현시킨다. 즉, 제1모듈 내지 제4모듈을 포함하는 센서용 모듈 조합에 의해 후보 물질에 따라 표지 단백질이 발현되므로, 표지 단백질의 발현 수준을 측정하여 PAS1 단백질 또는 TodS 단백질과 리간드 간의 결합을 조절하는 물질을 스크리닝할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 표지 단백질로서 베타-갈락토시다아제(β-galactosidase) 단백질을 사용하였다.
이에 따라서, (d) 상기 후보 물질이 대조군에 비하여 표지 단백질의 발현을 증가시키면 TodS의 효능제로, 대조군에 비하여 표지 단백질의 발현을 감소시키면 TodS의 길항제로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 (a) 표 4에 나타낸 PAS1 단백질의 원자좌표, 표 5에 나타낸 SeMet-PAS1 단백질과 톨루엔 복합체의 원자좌표 또는 표 6에 나타낸 PAS1 단백질과 1,2,4-TMB 복합체의 원자좌표를 이용하여 PAS1 단백질 또는 이의 복합체의 3차 구조를 설계하는 단계; (b) 상기 설계된 3차 구조를 이용하여 PAS1 변이 단백질을 생성하는 단계; 및 (c) 상기 생성된 PAS1 변이 단백질과 주어진 리간드 간의 결합 활성을 측정하는 단계를 포함하는, 야생형 PAS1 단백질에 대하여 리간드 결합 활성이 변이된, PAS1 변이 단백질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
상기 PAS1 단백질, 복합체, 톨루엔, 1,2,4-TMB, (a) 단계 등에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
상기 (b) 단계는 설계된 3차 구조를 이용하여 PAS1 변이 단백질을 생성하는 단계이고, 상기 (c) 단계는 상기 생성된 PAS1 변이 단백질과 주어진 리간드 간의 결합 활성을 측정하는 단계이다.
구체적으로, 상기 변이 단백질과 주어진 리간드 간의 결합 활성 측정은 바이오센서를 이용하여, 생성된 PAS1 변이 단백질과 리간드의 결합에 의해 발현되는 표지 단백질의 수준을 측정함으로써 수행될 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 (c) 단계는 (i) 하기 (a') 내지 (d')의 모듈을 포함하는 센서용 모듈 조합; (ii) 상기 모듈 조합을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트; (iii) 상기 발현 카세트를 포함하는 벡터; 또는 (i) 내지 (iii) 중 어느 하나를 포함하는 미생물을 함유하는, 바이오센서를 이용하여 상기 생성된 PAS1 변이 단백질과 주어진 리간드 간의 결합에 의해 발현되는 표지 단백질의 수준을 측정함으로써 수행될 수 있다.
(a') 리간드와 특이적으로 결합하는 상기 생성된 PAS1 변이 단백질을 포함하는 제1모듈;
(b') 제1모듈에 리간드가 결합시 신호를 발생 및 전달하는 제2모듈;
(c') 상기 전달된 신호에 의해 인산화되는 전사조절인자를 포함하는 제3모듈; 및
(d') 상기 인산화되는 제3모듈에 의해 표지 단백질을 발현시키는 제4모듈.
상기 생성된 PAS1 변이 단백질이 리간드와 특이적으로 결합하여 키나아제 단백질의 자가인산화를 유도하여 인산 신호를 발생 및 전달시키면, 상기 전달된 신호에 의해 전사조절인자가 활성화되어 표지 단백질의 프로모터에 결합하여 표지 단백질을 발현시킨다. 즉, 제1모듈 내지 제4모듈을 포함하는 센서용 모듈 조합에 의해 생성된 PAS1 변이 단백질에 따라 표지 단백질이 발현되므로, 표지 단백질의 발현 수준을 측정하여 야생형 PAS1 단백질에 대하여 방향족 탄화수소 결합 활성이 변이된, PAS1 변이 단백질을 스크리닝할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 표지 단백질로서 베타-갈락토시다아제(β-galactosidase) 단백질을 사용하였다.
상기 Apo-PAS1 및 SeMet-PAS1 단백질/톨루엔, PAS1/1,2,4-TMB 복합체의 3차 구조의 전부 또는 일부를 이용하는 경우, PAS1 단백질과 톨루엔의 결합에 중요한 PAS1 단백질의 결합부위를 재설계하여 다양한 리간드에 대한 새로운 감지센서를 디자인하여 제작할 수 있다. 본 발명자들이 확인한 바에 따르면, SeMet-PAS1 단백질과 톨루엔의 결합에 의하여 TodS 단백질의 형태변화가 일어나서 TodT의 인산화가 변화되고, TodT의 tod 오페론의 전사조절부위 DNA 간의 결합이 조절된다. 따라서, PAS1 단백질과 톨루엔의 결합을 조절하는 결합부위를 재설계하고, tod 오페론의 활성을 베타 갈락토시다아제 리포터 단백질을 이용해 스크리닝하는 방법으로, 궁극적으로 PAS1 단백질과 tod 오페론의 전사조절을 가능하게 하는 새로운 기질에 대한 PAS1 단백질 내 리간드 결합 부위를 규명하는 스크리닝을 할 수 있다.
또한, 본 발명의 방법은 (d) 야생형 PAS1 단백질의 값에 비해 측정된 리간드 결합 활성이 변화된 경우, 야생형 PAS1 단백질에 대하여 리간드 결합 활성이 변이된, PAS1 변이 단백질로 판정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 톨루엔과 비교하여 PAS1 단백질과 결합하는 친화도가 유사하거나 높은 물질로서, 야생형 PAS1 단백질 대조군에 비하여 결합부위가 재설계된 PAS1 단백질, 즉 PAS1 변이 단백질과 상기 후보 물질의 결합이 높아져, tod 오페론 전사 활성 신호로 기능하는지를 베타 갈락토시다아제 발현에 의해 분해되는 형광물질로 재설계된 결합부위의 민감도를 정량화하여 비교할 수 있다. 이러한 스크리닝을 통해 결합부위의 재설계가 야생형 PAS1의 기능을 유지 또는 증진 시키는 정도와 비교하여 신기능의 방향족 화학물질의 감지센서로 판단할 수 있다. 특히, 상기 톨루엔은 PAS1에 결합하여 tod 오페론의 전사를 활성화 할 수 있다고 알려져 있으므로, 상기 SeMet-PAS1의 구조적 정보를 이용하여 PAS1에 결합하는 다양한 결합친화도를 가진 휘발성 방향성 화학물질들이 PAS1과 결합하지 못하도록 또는 PAS1과 결합하여 톨루엔과 같이 신호를 전달하도록 PAS1의 리간드 결합부위를 재설계할 수 있다. 이에 PAS1의 리간드 결합부위 재설계는 특정 화학물질 대한 결합 친화도를 높이고, 신호전달이 가능한 구조로의 변화를 유도하는 신기능의 감지센서 디자인을 하고 미생물에 도입하여 토양 내 석유오염물질을 지속적으로 모니터링 하거나, 특정 오염물질을 감지하여 분해하는 미생물 리포터 균주를 제작 할 수 있다. 즉, 생물 정화에 사용될 수 있다.
본 발명에서 용어, "생물 정화"는 미생물을 이용해 환경(토양, 대기, 강, 바다)에 축적된 다양한 난분해성 오염물질을 감지하고, 무해화하는 과정으로 미생물을 이용한 환경오염 물질을 정화하는 방법을 지칭한다. 바이오리메디에이션은 경제적이고 환경친화적인 방법으로 환경오염정화 및 복구 방법으로 활용되는 유망 기술의 하나이다. 따라서, 본 발명의 입체구조 정보를 기반으로 설계하여 제작된 PAS1 감지센서들은 벤젠계 방향족 휘발성 환경오염물질을 영양원으로 활용하는 유전자를 포함한 미생물 균주에 도입되어 오염물질 감지 민감도를 증대하고, 분해를 촉진하는 효과를 기대할 수 있다.
본 발명에서 톨루엔의 분해효과는 todS/todT 유전자를 도입한 세균, 특히 슈도모나스 푸티다 KT2440 균 유래의 베타 갈락토시다아제 리포터 발현 균주에서 밝혔으나, PAS1 단백질의 구조변화에 의해 tod 오페론의 발현이 증대됨은, 이 균주에 제한되지 않는다.
이러한 본 발명의 방법에 적용될 수 있는 기질 혹은 리간드는 방향족 탄화수소일 수 있으며, 그 예로 벤젠(benzene), 에틸벤젠(ethylbenzene), 프로필벤젠(propylbenzene), 부틸벤젠(butylbenzene), 니트로벤젠(nitrobenzene), 클로로벤젠(chlorobenzene), 플루오로벤젠(fluorobenzene), 톨루엔(toluene), 스티렌(styrene), o-자일렌(o-xylene), m-자일렌(m-xylene), p-자일렌(p-xylene), o-클로로톨루엔(o-chlorotoluene), m-클로로톨루엔(m-chlorotoluene), p-클로로톨루엔(p-chlorotoluene), o-톨루이딘(o-toluidine), m-톨루이딘(m-toluidine), p-톨루이딘(p-toluidine), 카테콜(catechol), 1,2,4-TMB(1,2,4-Trimethylbenzene), 1,2,3-TMB(1,2,3-Trimethylbenzene), 1,3,5-TMB(1,3,5-Trimethylbenzene), 1-나프톨(1-naphthol) 및 2,3-디히드록시나프탈렌(2,3-dihydroxynaphthalene)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에서 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 이들에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 박테리아 균주, 플라스미드, 및 성장조건
본 발명에서 사용되는 박테리아 균주와 제조된 플라스미드를 하기 표 1에 정리하였다. 서열번호 1의 아미노산 서열 중 43 - 978번째 아미노산 서열 또는 23 - 978번째 아미노산 서열을 가지는 TodS (TodS (43 - 978), TodS (23 - 978))단백질을 코딩하는, todS 유전자를 슈도모나스 퓨티다(Pseudomonas Putida) F1 genomic DNA를 주형으로 하여 PCR을 통해 증폭하였다. 그 후 C-말단에 6개의 히스티딘 태그가 결합되는 단백질의 발현 벡터 pET28b(+) (Novagene, 미국)의 NcoI과 XhoI 부위를 통해 상기 증폭된 TodS 단백질(서열번호 1의 43 - 978번째 아미노산 서열)의 유전자를 삽입하였다. 또한, N-말단에 GST가 결합된 단백질 발현 벡터 pGST-Parallell(Sheffield et al., 1999)의 BamHI과 XhoI 부위를 통해 상기 TodS 단백질(서열번호 1의 23 - 978번째 아미노산 서열)의 유전자를 삽입하였다.
또한, 서열번호 1의 아미노산 서열 중 43 - 168번째 아미노산 서열을 가지는 PAS1 (서열번호 3, PAS1 (43 - 168), 도 1a) 단백질 또는 23 - 168번째 아미노산 서열을 가지는 PAS1 (서열번호 5, PAS1 (23 - 168)) 단백질을 코딩하는, pas1 유전자(각각 서열번호 4 및 서열번호 6)와 서열번호 1의 아미노산 서열 중 611 - 729번째 아미노산 서열을 가지는 PAS2 단백질을 코딩하는, pas2 유전자를 TodS 발현 벡터를 이용하여 PCR을 통해 증폭한 후, N-말단에 6개의 히스티딘 태그 및 rTEV 프로테아제 절단 부위(rTEV protease cleavage site)를 가지는 pHis-Parallell 벡터(Sheffield et al., 1999)의 NcoI과 XhoI 부위에 삽입하였다. 슈도모나스 퓨티다 F1의 todST 프로모터와 todST 유전자를 각각 TodSTpp-u 및 TodSTpp-m 프라이머와 TodST-F 및 TodST-R 프라이머를 사용하여 PCR을 통해 증폭하였다. 상기 todST 프로모터를 pBBRBB-eGFP 벡터(Vick et al., 2011)의 NsiI과 XbaI 부위에 삽입하여 pBBR-PtodST를 만들었다. 그 후, 야생형 todST 프로모터 하에 todST를 발현시키기 위하여 pBBR-PtodST의 SacI과 HindIII 부위에 todST를 삽입하여 pBBR-PtodST-TodST를 만들었다. 상기 발현 플라스미드는 녹색 형광 단백질 유전자를 포함하고 있지 않았다.
또한, 돌연변이체를 QuicKChange Site-Directed Mutagenesis kit(Stratagene, USA)를 사용하여 위치-지정 돌연변이를 통해 만들었다. 결정 구조를 알아내기 위한 셀레노메티오닌(selenomethionine, SeMet)으로의 치환을 위해, PAS1 (43 - 168)에 L71M 돌연변이를 유도하였다. 모든 돌연변이체들을 DNA 서열분석을 통해 확인하였다(Macrogene, 한국). 플라스미드들과 다양한 돌연변이체를 만들기 위해 사용된 프라이머를 하기 표 2에 나타내었다.
별다른 기재가 없는 한, 대장균(E.coli) 및 슈도모나스 퓨티다 균주는 각각 37℃ LB(Luria-Bertani) 배지, 30℃ LB 배지에 항생제를 하기 농도로 첨가한 배지에서 배양하였다.
대장균 - 100㎍/ml 암피실린(ampicillin), 50㎍/ml 카나마이신(kanamycin), 및 100㎍/ml 스트렙토마이신(streptomycin).
톨루엔은 시그마 (SigmaAldrich, USA)에서 구입하였다.
표 1
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a: AmpR은 암피실린 내성(ampicilin resistant); KmR은 카나마이신 내성(Kanamycin resistant); SmR은 스트렙토마이신 내성 (streptomycin resistant); TcR은 테트라사이클린 내성(tetracyclin resistant)이다.
b: 변이체 표현에서 첫번째 문자는 원래 아미노산, 숫자는 변이된 위치, 마지막 문자는 변이로 인해 치환된 아미노산을 의미한다.
표 2
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실시예 2: PAS1 단백질과 TodS 단백질의 발현 및 정제
E. coli BL21 Star (DE3) system (Invitrogen, 미국)을 0.5mM IPTG(isopropyl β-D-thiogalactopyranoside)와 함께 18°C에서 밤새 배양하여, N-말단에 His6 태그를 가진 PAS1 (43 - 168)과 PAS2 단백질을 발현시켰다. 모든 정제 단계는 버퍼 A(50 mM Tris-HCl pH 8.0 및 300 mM NaCl을 포함)를 사용하여 수행되었다. 배양된 세포들을 수확하여, 버퍼 A로 재현탁 시킨 후, 초음파로 분쇄하였다. 상기 분쇄액을 4°C에서 1시간 동안 16,000 x g로 원심분리하였다. 그 후 세포의 용해물을 Ni-NTA (Qiagen, 미국) 친화성 컬럼에 로딩하여, 6개의 히스티딘이 결합된 단백질을 200mM 이미다졸(imidazole)로 용출시켰다. 용출된 단백질을 rTEV 프로테아제 처리; Superdex G75 컬럼(GE Healthcare, 미국)을 사용한 사이즈 배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography); 및 His6 태그와 잘려지지 않은 His6 태그를 가진 단백질을 제거하기 위한 추가적인 Ni-NTA 친화 크로마토그래피를 사용하여 추가적으로 정제하였다(도 1b). 버퍼 A에 존재하는 정제된 단백질을 이후의 사용을 위해 15mg/ml의 농도로 농축하여, - 80°C에 보관하였다.
또한, N-말단에 His6 태그를 가진 PAS1 (23 - 168)과 이의 돌연변이 단백질을 전술한 방법과 같이 E. coli C41(DE3) system (Lucigen, 미국)을 사용하여 발현시킨 후, ITC(isothermal titration calorimetry) 분석에 사용하기 위해, 5% 글리세롤 및 2mM DTT를 포함하는 버퍼 A를 사용하여 Ni-NTA 친화 크로마토그래피로 정제하였다.
또한, SeMet이 치환된 PAS1(L71M)을 메티오닌 영양요구주인 E. coli B834 (DE3) (Novagen)를 사용하여, 50mg/ml의 SeMet가 함유된 최소 배지에서 발현시켰다. SeMet-PAS1(L71M)의 정제 절차는 버퍼에 5mM 메티오닌을 첨가하는 것을 제외하고는 야생형 단백질의 정제 절차와 동일하였다.
또한, C-말단에 His6 태그를 가진 TodS (43 - 978) 단백질을 E. coli BL21 Star (DE3) system (Invitrogen, 미국)에서 발현시켰고, Ni-NTA 친화 크로마토그래피 및 Superdex G200 컬럼(GE Healthcare, 미국)을 이용한 사이즈 배제 크로마토그래피를 사용하여 전술한 방법으로 정제하였다.
또한, N-말단에 GST가 융합된 TodS (23 - 978) 단백질을 전술한 방법과 같이 E. coli BL21-CodonPlus (DE3)-RIPL system (Agilent, 미국)에 서 발현시켰다. 배양된 세포를 수확한 후, PBS (pH 7.3, LPS solution, 대한민국), 5% 글리세롤, 2mM DTT, 및 프로테아제 억제제 칵테일(GenDEPOT, USA)을 포함하는 버퍼에 재현탁 시켜, 초음파로 분쇄하였다. 상기 분쇄액을 4°C에서 1시간 동안 16,000 x g로 원심분리하였다. 그 후 세포 용해물을 Glutathione Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare, 스웨덴) 친화 컬럼에 로딩한 후, 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 300 mM NaCl, 5% 글리세롤, 2mM DTT, 및 프로테아제 억제제 칵테일을 함유하는 버퍼를 사용하여 컬럼을 세척하였다. GST 융합 단백질을 10mM 감소된 글루타치온(glutathione)으로 용출시켰다. rTEV 프로테아제 처리; Superdex G200 컬럼을 이용한 사이즈 배제 크로마토그래피; 및 GST와 잘려지지 않은 GST 융합 단백질을 제거하기 위한, GST 친화 크로마토그래피를 사용하여 상기 용출된 단백질을 추가적으로 정제하였다. 정제된 TodS (23 - 978) 단백질을 TEM(transmission electron microscopy) 분석에 사용하였다.
실시예 3: PAS1 단백질의 결정화, 분산 및 구조 분석
21℃에서 시팅 드랍 증기 확산법을 이용한 정제된 PAS1 (43 - 168) 단백질을 단독으로 또는 SeMet-PAS1과 톨루엔(도 1c)을 1:2 몰비율로 혼합하여 1시간 동안 얼음상에 정치시켜 복합체를 얻을 수 있었다. PAS1과 1,2,4-TMB(도 1c)를 또한 1:2 몰비율로 혼합하여 1시간 동안 얼음상에 정치시켜 복합체를 얻을 수 있었다.
상기 PAS1 단독 단백질(Apo-PAS1) 및 복합체의 결정화는 다음과 같은 조건하에서 형성되었다:
Apo-PAS1과 PAS1/1,2,4-TMB 복합체는 2.8 내지 3.0M 암모늄 포스페이트(ammonium phosphate dibasic, trihydrate), pH 8.0 내지 8.5의 0.1M 트리스 하드로클로라이드(Tris-Hydrochloride)를 포함하는 용액 조건에서, SeMet-PAS/톨루엔 복합체 는 3.0 M 암모늄 포스페이트, pH 8.0, 0.1M 트리스 하드로클로라이드를 포함하는 용액 조건에서 복합체의 결정을 얻었다.
성장된 결정체는 3.0M 암모늄 포스페이트(ammonium phosphate dibasic, trihydrate), pH 8.0의 0.1M 트리스 하드로클로라이드를 포함하는 용액 조건에서 복합체의 결정체가 최적 형성되었다.
Apo-PAS1 단백질 결정체를 위한 분산 데이터는 1.5Å 해상도로 측정하였다 (도 2a). SeMet-치환 PAS1/톨루엔 복합체 단백질 결정체는 상기 개시된 바와 동일한 방법으로 결정화하였다. SeMet-치환 크리스탈에 대한 단일파장 비정상 회절 데이터는 1.65 Å 해상도로 수집하였다(도 2b). PAS1/1,2,4-TMB 복합체 단백질 결정체는 상기 개시된 바와 동일한 방법으로 결정화하였고 단일파장 비정상 회절 데이터는 2.0 Å 해상도로 수집하였다(도 2c). 모든 데이터는 HKL2000 소프트웨어 패키지로 분석하였다.
PAS1/톨루엔 복합체의 구조는 Se 원자로부터 나오는 비정상 신호를 SOLVE 프로그램으로 분석하여 알아내었다. 밀도 조절 및 순차적 자동화 모델 빌딩 과정은 RESOLVE 프로그램으로 수행하였다. 복합체 결정 구조는 SeMet 결정의 부분 개선 모델을 이용하는 MOLREP 프로그램를 이용하여 분자 치환을 통해 1.65Å 해상도로 밝혔다. 복합체 결정 구조는 COOT 프로그램으로 교정되고 REFMAC5를 이용하여 개선하였다. 해당 개선은 TLS(translation-liberation-screw) 과정을 포함했다. 최종 개선된 모델은 Rfree과 Rcryst값이 각각 0.23 과 0.18를 나타내었다.
PAS1 단백질 결정체의 경우 PAS1-A와 PAS1-B의 Asn164에서 Glu168 영역은 아무런 전자밀도를 보이지 않았다. 하지만 SeMet-치환 PAS1/톨루엔 복합체 단백질 결정체는 SeMet-PAS1-A의 Glu166에서 Glu168 영역 및 SeMet-PAS1-B의 Glu168만 아무런 전자밀도를 보이지 않았다(도 3 내지 5).
한편, PAS1/1,2,4-TMB 복합체 단백질 결정체는 PAS1-A의 Glu166에서 Glu168 영역에서만 전자밀도가 보이지 않았으나, PAS1-B의 경우는 Ala155에서부터 Glu168까지 아무런 전자밀도를 보이지 않았기에, 유연성이 높은 부분임을 추측할 수 있었다. 따라서 상기 전자밀도를 보이지 않는 잔기들은 모델에 포함되지 않았다.
Apo-PAS1, SeMet-PAS1 단백질과 toluene 복합체, PAS1과 1,2,4-TMB 복합체에 대한 결정화 데이터 통계는 하기 표 3에, 원자좌표는 표 4 내지 6에 각각 나타내었다.
표 3
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[규칙 제91조에 의한 정정 07.03.2016]　
표 4
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표 6
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Figure WO-DOC-407
실시예 3: PAS1 단백질의 ITC 분석
PAS1 (23 - 168) 단백질과 리간드 사이의 상호작용을 ITC를 통해 분석하였다. 정제된 N-말단 His6 태그를 가진 PAS1 (23 - 168) 단백질과 이의 돌연변이 단백질을 50mM Tris-HCl pH7.5, 200mM KCl, 2mM MgCl2, 1mM DTT, 및 0.1mM EDTA가 포함된 버퍼로 투석하였다. 그 후 진공 흡입기를 15분 동안 사용하여 샘플에서 가스를 제거하고, 로딩전 샘플에 에탄올(최종 농도 0.2%)을 첨가하였다. 0.2% 에탄올을 함유하는 리간드들을 상기 가스 제거에 사용한 버퍼로 희석하였다. 25°C에서 적정을 수행하였다. VP-ITC (MicroCal Inc., 미국)를 사용하여 열량측정법 (calorimetric assay)을 수행하였다. 스터링(stirring) 속도는 분당 300 회전이고, thermal power를 10초마다 기록하였다. 0.2% 에탄올에 녹아있는 2 - 6mM의 톨루엔은 반응 셀 (reaction cell, ~1.6mL)에 있는 50μM 단백질 (이량체로 계산되었음)에 대하여 적정되었다. 실험기구와 함께 제공된 Origin package (version 7)를 사용하여 적정의 열분석 (Thermogram analysis)을 수행하였다.
실시예 5: TodS 단백질의 전자현미경 및 단일 입자 분석
실시예 5-1: TodS (43 - 978) 단백질
C-말단에 His6 태그를 가진 TodS (43 - 978) 단백질(표 1)을 대장균에서 과발현시켜, 상기 방법으로 대량 분리 정제한 후 전자현미경 및 단일입자 분석을 실시하였다(도 7a 내지 도 8c).
정제된 Apo-TodS 단백질, TodS/톨루엔 복합체 및 TodS/1,2,4-TMB 복합체 단백질들을 각각 500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.1 mM EDTA 용액에 최종 농도 100 내지 200 nM로 희석하여, 각 시료 용액 5μL를 3분간 공기 중에서 글로 방전(glow-discharged)시킨 탄소-코팅 망에 처리했다. 상기 망은 1% 우라닐 아세테이트(uranyl acetate)를 이용하여 즉시 음성 염색하였다. 망을 Technai G2 Spirit Twin 투과전자현미경(FEI, Hillsboro, OR, USA)에서 확인하였으며, 이미지를 0.36 nm/pixel 배율로 4K X 4K Ultrascan 895 CCD (Gatan, Pleasanton, CA, USA)로 저장하였다.
단일 분자 분석에서는, 단일 분자 이미지 분석을 위해, 각각의 분자 이미지가 선택되었으며 SPIDER 프로그램(Health Research, Rensselaer, NY, USA)을 이용하였다. 총 921개의 TodS 입자, 582개의 TodS/톨루엔 입자, 및 1631개의 TodS/1,2,4-TMB 입자들을 분석에 사용하였고, 클래스 평균은 기존에 알려진 임의의 방법으로 구하였다. 세 개의 시료의 유사한 view를 비교하여, 데이터들을 융합하고, 동시-정렬하여 분별하였다. 유사하게 관찰된 TodS 영역의 평균을 추후 분석을 위해 선택하였다. UCSF 키메라 프로그램을 시각화, 원자 모델 및 평균에 해당 비교 분석을 위해 사용하였다.
실시예 5-2: TodS (23 - 978) 단백질
N-말단에 GST가 융합된 TodS (23 - 978) 단백질을 대장균에서 과발현시켜, 상기 방법으로 대량 분리 정제한 후 전자현미경 및 단일입자 분석을 실시하였다 (도 9a 내지 도 9b).
정제된 Apo-TodS 단백질, TodS/톨루엔 복합체 및 TodS/1,2,4-TMB 복합체단백질들을 각각 PBS (pH 7.3), 5% 글리세롤, 2mM DTT, 및 프로테아제 억제제 칵테일을 포함하는 버퍼를 사용하여 최종농도 ~100 - 200nM로 희석하였다. 각각의 최종 용액 5μl를 사용하여 실시예 5-1과 동일한 방법으로 전자현미경 및 단일입자 분석을 수행하였다. 총 482개의 apo-TodS 입자, 411개의 TodS/톨루엔 입자 411 입자, 및 459개의 odS/1,2,4-TMB 입자들을 분석에 사용하였다.
실시예 6: 생체내 β-갈락토시다아제 분석 시스템( in vivo β-galactosidase assay system)
실시예 6-1: 슈도모나스 퓨티다 리포터 균주의 제작
in vivo β-갈락토시다아제 분석을 수행하기 위해, 슈도모나스 퓨티다 KT24400-PXZ 리포터 균주를 제작하였다. 상기 균주는 슈도모나스 퓨티다 KT2440 염색체의 mexC 유전자에 TodT 결합 프로모터 PtodX(서열번호 11), β-갈락토시다아제 단백질(서열번호 12)의 유전자 lacZ(서열번호 13), 및 스트렙토마이신 저항 유전자 Sm R로 구성된 카세트(PtodX-lacZ-Sm R)가 삽입되어 있는 형태이다. 리포터 균주 제작을 위해 다수의 유전자 복제 단계를 수행하였다. 첫째, 슈도모나스 퓨티다 KT2440 mexC 유전자의 539 bp, 509 bp의 절편 및 pEXT21 플라스미드 Sm R 유전자를 각각 mexCn-u와 mexCn-d, mexCc-u와 mexCc-d, 및 Sm-N과 Sm-C의 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭하였다. 상기 3 종류의 PCR 생산물을 각각 EcoRI과 BamHI, BamHI과 SphI, 및 BamHI을 사용하여 절단하였다. 그 후 절단된 결과물을 pBR322 (New England Biolabs, Inc., 미국)의 EcoRI와 SphI 부위에 삽입하여 pSYK123를 얻었다. 그 후, PtodX-lacZ-Sm R 카세트가 mexC 염기서열에 삽입된, pSYK124를 만들기 위해, pSYK123의 HindIII 부위에 pEXT20-todST-PtodX의 PtodX-lacZ 발현 융합 카세트가 삽입되었다. 결국, 5528 bp의 mexC-PtodX-lacZ-Sm R-mexC 카세트를 mexCn-u와 mexCc-d 프라이머를 사용하여 PCR을 통해 증폭하였고, SmaI에 의해 절단된 pK18mobsacB(Schafer et al., 1994)에 삽입하여 pSYK135를 만들었다. 그 후, 슈도모나스 퓨티다 KT2440를 전기천공법을 통해 pSYK135로 형질전환시켰다. Km R과 수크로즈에 민감한 슈도모나스 퓨티다 형질전환체들을 50㎍/ml의 카나마이신과 10% 수크로즈가 첨가된 LB 배지에서 이중으로 선별하였다. 선별된 형질전환체에서 single-crossover event를 PCR을 통해 추가적으로 확인하였다. 두번의 교차(second crossover)에 의해서 형성된, 염색체에 삽입된 PtodX-lacZ-Sm R 카세트를 가진 리포터 균주, 슈도모나스 퓨티다 KT2440-PXZ를 100㎍/ml의 스트렙토마이신이 첨가된 LB 플레이트에서 선별하였다.
실시예 6-2: 생체내 β-갈락토시다아제 리포터 발현 측정
PAS1 내 톨루엔 결합부위에 위치-지정 돌연변이를 일으킨 TodS 단백질들의 생체 내 인산화 신호전달 능력의 변화를 각각 야생형 TodS와 비교하여 측정하기 위해 PAS1-의존-TodS/TodT 플라스미드를 포함한 슈도모나스에 형질전환체들을 카나마이신 항생제를 포함한 LB 배지 200㎕가 들어 있는 96-웰 딥 플레이트(96-well deep plate)에 배양하고, 효능제인 톨루엔, 스티렌, m-자일렌 또는 길항제인 o-자일렌, 1,2,4-TMB 리간드를 각각 가스형태로 2.5 내지 400μM 농도로 공급하여 30℃, 500 rpm에서 4-5시간 배양하여 생체 내 β-갈락토시다아제 단백질 생성을 유도하였다.
20㎕의 슈도모나스 형질전환체들과 80㎕의 Z-완충액을 혼합하여, 세포 밀도를 595nm에서 측정한 후, 25㎕의 4-MUG(4-methylumbelliferyl β-galactopyranoside) 기질을 1 mg/ml의 농도로 넣고, 25℃ 내지 37℃에서 1시간 반응한 후, 30㎕의 1M 소디움카보네이트 용액을 넣어 효소반응을 중지시켰다. 그 다음, 365nm/465nm에서 분해된 7-하이드록시-4-메틸쿠마린(7-hydroxy-4-methylcoumarin)의 형광을 측정하여, 각 균주의 MUG 값을 [(F365nm/465nm)/60 (min) x cell density at Abs585]로 계산하였다 (도 10). 데이터는 최소 3번 실험을 반복한 값의 평균 ± 표준 편차(SD)를 나타낸다.
상기 스크리닝 방법은, 공기중의 가스 상태로 특정 리간드를 공급하면 슈도모나스 형질전환체에서 발현된 PAS1-의존 TodS 단백질이 특정 리간드와 결합하여 PAS1-B 단량체 구조가 변화되면, TodS의 활성화를 위한 형태 변화가 유도되고, TodS에 의해 인산화된 TodT가 PtodX에 결합하여 tod 오페론 대신 연결된 β-갈락토시다아제 효소의 전사활성을 상향 조절하게 되어, 생체 내 β-갈락토시다아제 효소에 의해 분해된 형광물질의 양을 365nm/465nm에서 정량적으로 측정하는 원리다. 96-딥웰 플레이트를 이용한 스크리닝 방법은, 동시에 다수의 PAS1-의존 TodS 변이 단백질을 발현하는 슈도모나스 형질전환체를 야생형과 함께, 가스형태로 공급되는 특정 리간드에 대한 반응을 3 반복으로 검증할 수 있도록 구축하였다.
실험예 1 : PAS1 단백질의 구조
정제된 PAS1 (43 - 168) 단백질을 상기 결정화 방법으로 단독으로 결정화하여 Apo-PAS1의 입체구조를 확보하였고(도 2a), 비대칭적 유닛의 두 분자(PAS1-A 와 PAS1-B)를 포함한 입체구조는 리간드 존재 유무와 관계없이 두 분자의 이량체 구조를 이루고 있음을 크기배제 크로마토 그래피를 통해서도 확인할 수 있었다(도 1b). PAS1 단백질 입체구조에서 분석된 두 분자는 각각 C-말단 부위의 아미노산 150-163 부위에서 비대칭성을 보여주었는데, PAS1-A에서 헬릭스로 구조를 형성하는 아미노산 150-163 부위가 PAS1-B에서는 루프의 형태로 존재하며, Asn164에서 Glu168 영역은 아무런 전자밀도를 보이지 않은 것으로 보아, 이 부위의 유연성을 추측할 수 있었다.
각 PAS1 도메인의 구조는 45 - 149번째 아미노산 서열에 해당하는, 5개의 가닥이 역평행을 이루는 베타 시트와 3개의 알파 헬릭스로 구성된 다른 PAS 도메인의 구조와 매우 유사하였다(도 2b). 추가적인 알파 헬릭스(α4, 아미노산 잔기 150 - 163)는 분자 A에서 기본적인 PAS 폴드(fold)의 바로 밖에 위치하고 있었다. 특이적으로, α4와 대응되는 부위인 분자 B의 C-말단 부위는 완전히 정렬이 엉망이었다. PAS1의 중추는 녹조류(Chlamydomonas reinhardtii)의 광수용체(photoreceptor)의 LOV 도메인 (PDB ID: 1N9L, 11% 서열 상동성, RMSD (82 알파 탄소 쌍에 대한 1.52Å)) 및 아라비돕시스(Arabidopsis)의 청색광 수용체인 phototropin-2의 LOV1 도메인 (PDB ID: 2Z6D, 11% 서열 상동성, RMSD (58 알파 탄소 쌍에 대한 1.30Å))의 중추와 가장 유사하였다. 상기 LOV 도메인 및 LOV1 도메인은 모두 FMN과 결합한다.
많은 PAS 도메인들의 이량체화(dimerization)는 주로 핵심적인 PAS 폴드의 바로 윗 부위에 위치하는 양친매성의 알파 헬릭스를 통해 일어난다. 본 발명에서 제작된 TodS PAS1 도메인은 상응하는 헬릭스 부위를 포함하고 있지 않았다. 따라서, TodS PAS1 구조에서 관찰되는, 역평행의 마주보는 이량체화는 결정 팩킹(packing)의 대칭(symmetry)으로 인한 인위적인 결과 때문일 수 있다. TodS의 기본적인 PAS 폴드의 바로 윗 부분에 PAS1의 이량체화와 관련된 알파 헬릭스 부위 (아미노산 잔기 32 - 43)가 존재함을 이차구조(secondary structure)로부터 예측하 수 있다.
실험예 2 : SeMet-PAS1/톨루엔 복합체 단백질의 구조
상기 방법으로 SeMet-PAS1 (43 - 168)/톨루엔 복합체의 입체구조를 분석한 결과, 1.6 Å의 고해상도로 Apo-PAS1 (43 - 168) 결정체와 같이 비대칭적 유닛으로 두 분자(SeMet-PAS1-A 와 SeMet-PAS1-B)를 포함하고 있음을 확인하였다(도 2c). 톨루엔은 각 PAS1 단량체 내 소수성 결합 공간에 각각 한 분자씩 결합하는 것을 확인하였다(도 3). PAS1 단독 단백질 결정체의 경우 PAS1-A와 PAS1-B의 Asn164에서 Glu168 영역의 전자밀도를 볼 수 없었으나, SeMet-치환 PAS1/톨루엔 복합체 단백질 결정체의 경우는, SeMet-PAS1-A의 Glu166에서 Glu168 영역 및 SeMet-PAS1-B의 Glu168에서만 아무런 전자밀도를 보이지 않았다. 따라서 상기 전자밀도를 보이지 않는 잔기들은 모델에 포함되지 않았다. TodS의 46번 아미노산에서 149번 아미노산은 다섯 개의 베타 가닥과 세 개의 알파 헬릭스 구조로 이루어져 있는 전형적인 PAS 도메인의 구조를 형성하며, 기존에 보고된 Azotobacter vinelandi의 NifL, Chlamydomonas reinhardtii의 빛 수용체 LOV/PAS도메인과 유사한 구조를 보였다.
하지만, PAS1 (43 - 168)/톨루엔 복합체의 입체구조에서 분석된 PAS1은 FMN, Heme 등과 결합하는 기존의 PAS 도메인들과 달리 좁은 리간드 결합부위를 가지고 있으며, 상기 분석된 PAS1/톨루엔 복합체의 입체구조는 TodS의 히스티딘 키나제 1 도메인과 연결되는 알파 헬릭스 구조(아미노산 150부터 163까지)를 포함하고 있다. 따라서, PAS1-B의 알파 헬릭스 구조변화가 TodS의 히스티딘 키나제 1 도메인과의 연결에 영향을 주어, TodS의 형태 변화를 유도할 것으로 분석되었다. SeMet-PAS1-A와 SeMet-PAS1-B는 동일한 구조를 가지나, SeMet-PAS1-A와 SeMet-PAS1-B룰 겹쳐놓으면, 톨루엔 결합 특이적으로 형성된 알파 헬릭스가 약 25° 기울기 차이가 있었다(도 4).
실험예 3 : PAS1/1,2,4-TMB 복합체 단백질의 구조
상기 방법으로 PAS1 (43 - 168)/1,2,4-TMB 복합체의 입체구조를 분석한 결과, 전자 밀도 차이 지도에서 1,2,4-TMB가 각 PAS1 단량체의 소수성 결합 공간에 한 분자씩 결합하고 있는 것을 확인하였다(도 2d). 하지만, PAS1/1,2,4-TMB 복합체의 PAS1-B 단량체는 C-말단에 위치한 아미노산 Ala155에서부터 Glu168까지 아무런 전자밀도를 보이지 않았고, 이것은 PAS1 단백질 단독으로 얻은 결정체의 입체구조 분석결과와 비교해 보아, 이 부위가 기능적으로 매우 유연한 구조를 형성하고 있음을 예측할 수 있었다 (도 2d). 또한 155번 라이신의 경우도 1,2,4-TMB 결합시 전자밀도가 보이지 않았다. 상기 분석된 SeMet-PAS1/톨루엔 복합체의 입체구조와 비교하여, PAS1/1,2,4-TMB 복합체의 PAS1-B의 유연한 알파 헬릭스 구조는 TodS의 히스티딘 키나제 1 도메인과의 연결에 영향을 주어, PAS1-B의 1,2,4-TMB 결합은 TodS의 형태 변화를 비활성적으로 유도할 것으로 분석되었다.
실험예 4: PAS1의 톨루엔/1,2,4-TMB 결합부위에 대한 분석
상기 SeMet-PAS1/톨루엔 복합체 결정체의 전자 밀도 차이 지도 분석 결과, 톨루엔은 각 SeMet-PAS1-A와 SeMet-PAS1-B 두 분자의 소수성 결합 공간 (hydrophobic binding pocket)에 한 분자씩 결합하는 것을 확인하였다(도 2a, 도3). 구체적으로는, TodS 아미노산 서열 1번에서 PAS1 단백질의 톨루엔 결합 부위는 46번 페닐알라닌(phenylalanine), 48번 글라이신(glycine), 59번 발린(valine), 63번 알라닌(alanine), 79번 페닐알라닌, 84번 트립토판 (tryptophane), 85번 트립토판, 114번 아이소류신(isoleucine), 126번 발린, 128번 페닐알라닌, 145번 알라닌, 147번 글라이신과 톨루엔이 수소 결합(Hydrogen bond) 또는 물 분자-매개 수소 결합을 이루는 것을 확인하였다. 톨루엔의 벤젠 링이 상기 아미노산으로 둘러싸인 소수성 공간에 위치하며, 메틸기는 48번 글라이신, 59번 발린, 그리고 145번 알라닌에 둘러싸여 있었다. 흥미롭게도, 1,2,4-TMB 역시 톨루엔과 같은 부위에 위치하며 상동 아미노산 잔기들과 결합하고 있었으나, 각각 길항제로 작용하는 1,2,4-TMB의 PAS1 결합시 46번 페닐알라닌은 톨루엔 결합시보다 약 70°가량 기울어져 있음을 확인하였다. 이러한 차이는 톨루엔보다 2개의 메틸기를 더 가진 1,2,4-TMB가 PAS1-B 분자의 C-말단 헬릭스를 비정형화 상태로 만들어, 인산화 신호전달이 원활하지 못한 형태의 TodS 단백질로 기능하도록 하는 것으로 분석할 수 있다.
실험예 5: PAS1 단백질의 신호 감지
톨루엔은 TodS/TodT 신호 전달 시스템을 활성화 시키는데 필요한 핵심적인 신호 효능제(signal effector)이다. 톨루엔과 복합체를 형성하는 PAS1의 구조는 일반적으로 apo-PAS1 구조와 일치하였다(도 5a). 각각의 PAS1 분자에서 소수성 잔기인 Phe46, Gly48, Val59, Ala63, Phe79, Trp84, Trp85, Ile114, Val126, Phe128, Ala145, 및 Gly147에 의해 형성된 소수성 포켓에 아고니스트가 위치하였다(도 5b). 포켓의 파묻힌 표면부위는 PISA 소프트웨어에 의해 계산된 바에 의하면 247.27Å2 이었다. 구체적으로, 주로 방향족 아미노산인 Phe46, Phe79, Trp84, Trp85, 및 Phe128에 의해 형성된 부위에 톨루엔의 벤젠 고리가 위치하고, Ala63, Ile114, Val126, 및 Gly147는 상호작용에 관여하였다. 톨루엔의 메틸 그룹은 Gly48, Val59, Ala63, 및 Ala145 잔기에 의해서 둘러쌓여 있었다.
또한, 안타고니스트 1,2,4-TMB와 복합체를 형성하는 PAS1의 구조를 결정하였다(도 5c). 소수성 포켓에 존재하는 동일한 아미노산 잔기들은 안타고니스트와 상호작용에 관여하였다(도 5d). PAS1과 아고니스트와의 상호작용 및 PAS1과 안타고니스트와의 상호작용의 유일한 차이점이 Phe46 위치에서 발견되었다. 안타고니스트와 의 복합체에서 아미노산 잔기의 방향족 고리는, 분자 A와 분자 B 모두에서 톨루엔과의 복합체 Phe46의 방향족 고리에 대하여 상대적으로 ~80°기울어져 있었다(도 5b 및 5d)
리간드와 결합하는데 가장 핵심적인 잔기를 정제된 PAS1 (23-168) 단백질을 사용한 ITC 분석을 통해 분석하였다. PAS1 이량체의 각 분자에 대한 2.6μM 및 38.3μM의 톨루엔 결합 친화도(K d, 해리상수)를 가진 연속적인 결합 모델을 통해 PAS1 이량체와 톨루엔을 위한 ITC 커브의 최적화를 수행하였다. PAS1에 F46A, F79Y, 및 W85H의 돌연변이를 도입함으로써, 톨루엔의 결합 친화도가 상당히 감소되었다. 특히, 돌연변이에 대한 톨루엔의 첫 번째 결합은 야생형(WT)에 비해 대략 5 - 50배의 약한 상호작용을 나타내었다. ITC에 의해 측정된 단백질에 결합하는 톨루엔의 열역학적 파라미터를 도 5e에 나타내었다.
C-말단의 키나아제 도메인과 직접적으로 연결되어 있는 C-말단(아미노산 잔기 150-163)의 구조적 형태는 어떤 리간드가 존재하는지에 따라서 다르다. 전술한 바와 같이, apo-PAS1 구조에서 헬릭스는 분자 B에서 완전히 흩어져 있다. 톨루엔과 결합한 PAS1 구조에서, 대응되는 부위는 알파 헬릭스가 재건되었다(도 5a). 안타고니스트 1,2,4-TMB의 경우, 대응되는 부위는 완전히 흩어져 있었고, 심지어 전자 밀도 지도에서는 분자 B에서 Lys155 이후에는 존재하지 않았다(도 5c). 모든 구조들에서 분자 A는 C-말단 부위(아미노산 잔기 150 - 163)에서 동일한 알파 헬릭스(α4) 형태를 보여주었다. 이러한 결과는 효능제 의존적인 PAS1 감지에 의해, TodS의 C-말단 키나아제 도메인에 대한 분자적 신호 전달을 시사하는 것이다. PAS1 C-말단 부위(아미노산 잔기 150 - 163)를 신호 전달 부위(STR, signal transfer region)라고 명명하였다.
실험예 6: PAS1 의존적 Tod S의 형태 분석
본 발명에서 분석한 Apo-PAS1, SeMet-PAS1/톨루엔 및 PAS1/1,2,4-TMB 복합체 입체구조 결과에 따르면, PAS1 단백질 내 같은 결합부위에 경쟁적으로 결합하는 톨루엔과 1,2,4-TMB과 같은 방향족 탄화수소들은, PAS1-B 분자 46번 페닐알라닌의 방향족 고리의 각도를 변화시켜 히스티딘 키나아제와 PAS1 도메인을 연결하는 아미노산 150-163 부위를 각각 정형화 혹은 비정형화된 C-말단 구조로 변형-유지함으로써, TodS의 다단계 인산화 신호전달이 리간드 특이적으로 조절되는 것으로 분석되었다(도 5a 내지 6).
또한, PAS1 단백질 내 소수성 결합공간의 리간드 결합부위를 위치-지정 돌연변이 생성 방법으로 변형시킨 PAS1 변이 단백질들이 대부분 단백질 정제과정에서 뭉침현상이 일어나는 등 단백질 구조에 심각한 영향을 받는 것은 PAS1-B분자의 소수성 결합공간과 C-말단의 헬릭스 구조 부위가 TodS의 리간드 특이적 신호전달에 필수적이라는 것을 시사한다. Apo-TodS 단백질과 1,2,4-TMB가 결합된 TodS 단백질의 전자현미경적 관찰 결과에서 보이는 TodS 이량체의 짧은 길이 및 뭉침현상도 PAS1-B 단량체의 비정형화된 C-말단 구조가 TodS 형태를 변화시켰음을 확인하게 한다(도 7a 내지 도 8c).
실험예 7: PAS1 단백질의 이량체화
중요한 PAS 도메인의 바로 윗 부위에 존재하는 이량체화 헬릭스 (아미노산 잔기 32-43)를 결정화를 위해 PAS1 도메인에서 제거하고, 인위적으로 역평행의 마주보는 이량체를 만들었다. 따라서, Azotobacter vinelandii NifL LOV 도메인의 구조(PDB ID: 2GJ3)에 기초하여 PAS1 이량체의 구조를 모델화하였다. 분자 A의 베타 시트 바깥에 존재하는 Val47, Leu49, 및 Leu131과 같은 소수성 잔기들은 각각 분자 B의 Ile39과 Leu43, His35과 Ile38, 및 Gly42와 상호작용 할 것으로 보이고, 이량체화 및 구조적 안정성의 유지에 관여할 것으로 보였다(도 11a).
따라서, 야생형 TodST 또는 이의 돌연변이체를 발현하는 플라스미드를 가진 슈도모나스 퓨티다 KT24400-PXZ 리포터 균주를 이용한 생체내 β-갈락토시다아제 분석 시스템(도 10)을 사용하여, 각 돌연변이체의 리간드 결합 및 다단계 신호 전달 능력을 평가하였다. 그 결과, V47L, L49D, 및 L131D 돌연변이체들은 톨루엔 환경에서 β-갈락토시다아제의 활성이 완전히 파괴되었다(도 11b). 이는 상기 잔기들이 PAS1의 이량화에 필수적 역할을 함을 시사하는 것이다. 이에 반하여, 베타 시트 밖에 위치하는, 전하를 띈 잔기인 Glu58의 돌연변이는 PAS1 이량화에 영향을 주지 않았다(도 11b).
실험예 8: TodS/TodT 시스템에서 PAS2의 역할
TodS는 PAS-형태 센서 도메인과 오토키나아제(autokinase) 도메인을 각각 함유하는 2개의 모듈을 포함한다. TodS는 두개의 센서 키나아제(double sensor kinase) 패밀리 멤버로 분류된다. TodS의 두 번째 모듈에 있는 PAS 도메인인 PAS2는 방향족 신호 분자를 감지하지 않는다. 따라서, 현재 PAS2의 역할은 명확히 알려져 있지 않다. 그러나, TodS의 동족체(homologue)인 StyS의 C-말단의 PAS 도메인은 세포의 산화환원 전위에 반응할 것으로 보인다. PAS2의 결정화를 위해 PAS2를 발현시켜 정제한 결과, 용액 내에서 이량체로 존재함을 알 수 있었다(도 12a). 그러나 PAS2의 결정화는 실패하였다.
서열 분석을 통해 PAS2가 Azotobacter vinelandii NifL LOV 도메인의 구조와 유사한 구조를 가질 것으로 예측되었다(PDB ID: 2GJ3). 따라서, NifL LOV 도메인의 구조를 주형으로 하여 PAS2 (아미노산 잔기 611 - 729)의 구조를 모델화하였다(도 12b). NifL의 FAD 결합 잔기 (Thr78 및 Leu86)에 대응되는 잔기들 중에서, PAS2의 Glu666 및 Leu674(도 12c)를 알라닌으로 변이시켜, 생체내 β-갈락토시다아제 분석 시스템을 사용하여 야생형 TodS에 대한 변이체들의 활성을 비교하였다. 그 결과, 야생형과 돌연변이 사이의 효소 활성에는 차이가 없음을 알 수 있었다(도 12d). 톨루엔과 복합체를 형성한 PAS1의 구조를 상기 모델화된 구조에 겹쳐(도 12e), PAS1과 톨루엔의 결합에 핵심적 역할을 하는, Ile114 및 Val126 잔기와 상응하는, PAS2의 Tyr691 및 Ala703 잔기를 선택하였다. Tyr691 및 Ala703 위치의 TodS 돌연변이체들은 야생형 TodS와 비교하여 톨루엔 신호 전달 능력에 큰 차이가 없었다(도 12d).
이러한 결과들을 통해, 알려진 바와 같이 PAS2 도메인이 톨루엔 또는 FAD 센서로서 기능하지 않는다는 것을 알 수 있었다. TodS가 이량체로서 기능하기 때문에, 인산의 전달(phospho-relay)을 정교하게 조절하는 과정에서 PAS2의 이량화가 중요하다는 가정을 하였다. 모델화된 PAS2 구조를 통해, Ser611 내지 Ser622까지를 둘러싸는 첫 번째 알파 헬릭스가 PAS2의 이량체화에 관여할 것으로 예측되었다. 흥미롭게도, TodS (아미노산 잔기 617 - 623)의 이량체화 부위를 결손시키면 m-자일렌 및 스티렌과 같은 약한 아고니스트에 대한 β-갈락토시다아제 활성의 기초적인 수준이 증가되었다(도 12d). 또한, 이중 돌연변이 (Y619A 및 E620A)가 일어난 TodS에서도 동일한 결과를 얻었다(도 12d). 이러한 결과들은 PAS2가 TodS의 정확한 이량체의 유지를 통해, C-말단의 HK2 및 TodT에 대해 phospho-relay를 정교하게 조절하는 기능을 함을 의미한다.
실험예 9: 전자 현미경을 이용한 TodS 단백질의 구조 분석
실험예 9-1: TodS (43 - 978) 단백질의 구조 분석
C-말단에 His6 태그를 가진 TodS (43 - 978) 단백질을 순수분리 정제한 후 음성 염색하여 단일 입자 분석법으로 전자 현미경 분석을 한 결과(도 7a 및 7b), 대략 2 nm 해상도의 분자 수준에서 Apo-TodS과 TodS/톨루엔 복합체, TodS/1,2,4-TMB 복합체의 형태를 분석할 수 있었다.
니켈-골드 입자로 C-말단의 His6 태그를 가진 TodS 단백질을 표지 한 후, 음성 염색으로 전자현미경 분석한 Apo-TodS 단백질은 두 개의 골드 입자를 나란히 가지고 있는 것으로 분석되어(도 7b), 동방향의 이량체 형태로 존재하는 것으로 판단되었다. 또한 Apo-TodS과 TodS/톨루엔 복합체는 N-말단 부위가 약간 벌어져 있는 이량체 형태로 유사한 구조적 특징을 공유하고 있었으나, PAS1/톨루엔 복합체의 길이가 Apo-TodS에 비해 상대적으로 긴 양상을 보였다(도 8a 및 8b). 또한, TodS/1,2,4-TMB 복합체는 TodS의 뭉침 현상(aggregation) 이 나타나는 빈도가 높은 것을 확인하였다(도 8c).
상기에서, SeMet-PAS1/톨루엔 복합체의 입체구조에서 보이는 C-말단의 α5 헬릭스 구조가 Apo-PAS1 단백질에서는 유연성을 보이는 루프의 형태로 보여진 바, Apo-TodS에서 보여지는 N-말단부위의 벌어짐은 이러한 유연성 때문일 것으로 판단되었다. 한편, TodS-톨루엔 복합체의 이량체의 길이가 상대적으로 긴 것은, PAS1 도메인의 α5 헬릭스가 톨루엔의 결합에 의해 형성되고, 효율적 인산화 기능을 수행하도록 전체 TodS의 형태에 영향을 준 것으로 판단되었다. 또한 TodS/1,2,4-TMB 복합체의 형태는, TodS 단백질 단독으로 있을 때 보이는 이량체 형태와 뭉침현상이 보이는 형태가 혼재하여 존재함을 확인하였고, 이는 리간드 특이적 PAS1 단백질의 구조변화가 TodS의 형태변화를 유도한다는 결과와 일치하였다.
실험예 9-2: TodS (23-978) 단백질의 구조 분석
완전한 길이의 TodS 단백질은 상당히 유동적(flexible)이고 쉽게 뭉쳐지므로, in vitro에서 단백질을 정제하고 생화학적인 실험을 수행하는 것은 어렵다. 그러나, C-말단에 His6 태그를 가진 TodS (43-978) 단백질과 N-말단의 GST가 결합된 TodS (23-978) 단백질은 상대적으로 수용성이 있고 정제과정이 용이하였다. 사이즈 배제 크로마토그래피 분석 결과, 정제된 TodS (23-978) 단백질은 크기 마커 단백질인 apoferritin (443 kDa)과 동일한 부분에서 분리되어 나왔고, 이를 통해 단백질이 유동적인 특성을 가짐을 알 수 있었다(도 9a). 또한, 전자 현미경 분석을 통해 이량체적인 배열을 가짐을 알 수 있었고, Apo-TodS 분자는 14.2nm의 길이 및 7.0nm의 너비를 가지고 있음을 알 수 있었다(도 9b).
PAS1의 톨루엔 감지에 따라 구조적 변화를 야기하여(특히, 아미노산 잔기 150 - 163) TodS/TodT 신호 전달에 영향을 주므로, TodS의 특성은 톨루엔의 존재하에 영향을 받을 것이라 예측하였다. 톨루엔을 감지한 TodS (23-978) 단백질은 분자적 수준에서 볼 때, Apo-TodS와 유사한 형태를 가지고 있었다. 그러나, TodS/톨루엔 복합체 단백질은 16.2nm의 길이 및 9.4nm의 너비를 가지고 있었고, 이는 더욱 곧은 형태가 되도록 구조적 변화가 있었음을 시사하는 것이다(도 9b). 또한, 안타고니스트 1,2,4-TMB와 TodS 복합체의 다량체화를 통해, 리간드 의존적인 TodS의 형태적 변화를 확인하였다(도 9b).
이러한 결과들은 TodS가 신호 전달의 활성화를 위해 리간드 의존적인 구조 변화를 겪음을 시사하는 것이다.
상기 결과를 종합하여, 리간드에 따라 TodS가 정렬되거나 또는 정렬되지 않은 구조로 변화함을 알 수 있었고, 이를 통해 TodS/TodT 신호 전달 과정에 대하여 분자 수준의 매커니즘을 모델을 만들었다(도 13). TodS는 신축성을 가지며, 오토키나아제(autokinase) 활성을 가지는 이량체로 존재한다. 이러한 상태에서 PAS1 감지 도메인은 STR의 신축성을 통해 C-말단의 HK1으로 신호를 효과적으로 전달하지 못한다. 따라서, 이러한 형태는 HK1의 자기인산화(autophosphorylation)가 가능한, 기능적인 이량체 형태를 유도하지 못한다. 톨루엔을 감지했을 때, PAS1 STR들은 신호를 전달하도록 재배열되고, TodS에 형태적 변화를 유도하여 HK1-RRR-PAS2-HK2 도메인이 다단계의 인산 신호 전달을 위해 배열되도록 만든다. TodS의 이량체 구조뿐만아니라, PAS1 센서 및 HK1 사이의 구조적 유동성은 특정 환경 조건 하에서 효율적인 신호 전달에 필수적이다.
실험예 10: PAS1 의존적 TodS의 돌연변이체의 생체내 베타 갈락토시다아제 발현 스크리닝 및 신기능 감지센서 선발
상기 SeMet-PAS1/톨루엔 복합체 입체구조 분석에 의거, 46번 페닐알라닌(phenylalanine), 48번 글라이신(glycine), 59번 발린(valine), 63번 알라닌(alanine), 79번 페닐알라닌, 84번 트립토판 (tryptophane), 85번 트립토판, 114번 아이소류신(isoleucine), 126번 발린, 128번 페닐알라닌, 145번 알라닌, 147번 글라이신이 톨루엔과 수소 결합(Hydrogen bond) 또는 물 분자-매개 수소 결합을 이루고, 특히 46번 페닐알라닌, 146번 알지닌, 148번 글루탐산이 SeMet-PAS1-B 분자의 C-말단 헬릭스 구조변화에 필수적임을 확인하였다(도 3 내지 6).
이에 본 발명자들은 pBBR-PtodS-TodST 클론에 위치-지정 돌연변이를 유도하여 서열번호 1의 아미노산 서열을 가진 TodS 단백질에서 46번 페닐알라닌을 알라닌 또는 세린으로, 59번 발린을 알라닌, 아스파틱산 또는 페닐알라닌으로, 63번 알라닌을 발린 또는 세린으로, 79번 페닐알라닌을 타이로신(tyrosine), 글루탐산 또는 류신으로, 84번 트립토판을 발린, 히스티딘(histidine) 또는 알지닌으로, 85번 트립토판을 히스티딘, 알지닌 또는 류신으로, 114번 아이소류신을 발린, 페닐알라닌, 쓰레오닌(threonine) 또는 세린으로, 126번 발린을 알라닌, 세린, 쓰레오닌 또는 류신으로, 128번 페닐알라닌을 글루탐산, 히스티딘, 아스파틱산, 세린 또는 류신으로, 145번 알라닌을 세린 또는 발린으로, 47번 발린을 알라닌 또는 류신으로, 49번 류신을 아스파틱산 또는 알라닌으로, 58번 글루탐산을 알라닌 또는 세린으로, 131번 류신을 아스파틱산으로, 61번 글루타민을 류신, 알지닌, 알라닌으로, 146번 글루탐산을 알라닌 또는 류신으로, 148번 알지닌을 알라닌 또는 메티오닌(methionine)으로 치환시킨 후, 슈도모나스 퓨티다 KT2440-PXZ 리포터 균주로 도입하였다 (표 1). 상기 TodS 변이 단백질을 발현하는 슈도모나스 퓨티다 KT2440-PXZ 리포터 균주는 특정 리간드 공급에 의해 생체 내에서 TodS 변이 단백질과 TodT의 단백질의 인산화을 순차적으로 유도하였다. 본 발명에서 구축된 96-딥 웰 스크리닝 방법은 가스 상태로 공급되는 2.5 내지 400μM 농도의 특정 리간드에 노출된 PAS1-의존 TodS 변이 단백질과 야생형 TodS 단백질을 3반복으로 검증하여, 최종 리간드 결합과 TodS/TodT 2개 인자 신호전달에 중요한 PAS1 단백질의 아미노산들을 각각 선발하였다(도 14 내지 19).
상기 스크리닝 결과, 46번 페닐알라닌을 알라닌 또는 세린으로, 59번 발린을 알라닌, 아스파틱산 또는 페닐알라닌으로, 63번 알라닌을 발린 또는 세린으로, 79번 페닐알라닌을 타이로신, 글루탐산 또는 류신으로, 84번 트립토판을 발린, 히스티딘 또는 알지닌으로, 85번 트립토판을 히스티딘, 알지닌, 또는 류신으로, 114번 아이소류신을 페닐알라닌, 쓰레오닌(threonine) 또는 세린으로, 126번 발린을 세린, 쓰레오닌, 또는 류신으로, 128번 페닐알라닌을 글루탐산, 히스티딘, 아스파틱산, 세린 또는 류신으로, 145번 알라닌을 세린 또는 발린으로 치환한 경우, 모두 10 μM 내지 100 μM 톨루엔에 의한 TodS/TodT 2개 인자 신호전달이 저해되었다(도 14 내지 15b).
그러나, 126번 발린을 알라닌으로 치환한 경우는 10μM 톨루엔에 대한 민감도가 낮아지기는 했으나, 100μM 톨루엔에 의해서는 여전히 신호전달이 이루어졌다(도 15b).
또한, 114번 아이소류신을 페닐알라닌 또는 세린으로 치환한 경우에는 100 μM의 톨루엔이 공급되어도 다른 잔기와 마찬가지로 톨루엔 결합이 저해되었으나(도 14), 114번 아이소류신을 발린으로 치환한 경우(I114V TodS)는 50-100μM m-자일렌에도 높은 신호전달 활성을 나타내었고, 이것은 야생형 TodS와 비교하여 약 2-4배 이상 높은 민감도를 보이는 것으로 확인되었다(도 15b).
또한, 47번 발린을 알라닌, 또는 류신으로, 49번 류신을 알라닌, 또는 아스파틱산으로, 58번 글루탐산을 알리닌 또는 세린으로, 131번 류신을 아스파틱산으로, 146번 글루탐산을 알라닌 또는 류신으로, 148번 알지닌을 알라닌 또는 메티오닌으로 치환시킨 경우, 역시 모두 10μM 톨루엔에 의한 TodS/TodT 2개 인자 신호전달이 저해되었다(도 16 및 17).
또한, 61번 글루타민이 알지닌으로 치환된, Q61R TodS의 경우에는 톨루엔에 비해 4배, 스티렌, m-자일렌에 비해 2 내지 5배 이상 민감도가 증대되었고, 야생형의 TodS의 길항제인 o-자일렌에도 TodS/TodT 2개 인자 신호전달이 매우 높게 이루어졌다(도 18a 내지 도 19). 이에, 톨루엔 결합부위를 디자인한 각 I114V와 Q61R로 변형된 PAS1과 TodS 단백질을 각각 m-자일렌과 o-자일렌 등에 민감하게 반응하는 신기능의 감지센서 모듈(ePAS1)로 선발하였다.
상기 결과를 종합하면, PAS1 단백질은 톨루엔과의 결합을 통하여, tod 오페론의 발현을 상향 조절함으로써, 톨루엔 분해를 촉진하게 되는 중요한 감지센서 단백질로 기능한다. 따라서, 본 발명의 Apo-PAS1, SeMet-PAS1/톨루엔, PAS1/1,2,4-TMB 복합체의 3차원적 입체구조를 이용하여, TodS가 톨루엔이외의 다양한 리간드 특이적 결합에 의해 tod 유전자의 발현을 조절하도록 리간드 결합부위를 재디자인하여 신기능의 감지센서 모듈을 개발할 수 있다. 또한, 96 딥 웰에서 가스 상인 리간드에 반응하여 생체 내 베타 갈락토시다아제 발현을 유도하는 PAS1 변이 단백질들을 동시에 대량 스크리닝하는 방범을 구축하여 민감도 높은 신기능의 감지센서를 선발할 수 있다.
또한, 본 발명의 PAS1 변이 단백질 또는 TodS 변이 단백질과 공지된 탄화수소 분해 단백질을 이용하여, 상기 변이 단백질과 방향족 탄화수소의 결합에 따라 탄화수소 분해 단백질이 발현되는, 방향족 탄화수소 분해용 미생물을 제작할 수 있다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그 리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (24)

  1. 서열번호 1의 TodS 단백질에서, 하기 (a) 내지 (w)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 변이를 가지는 TodS 변이 단백질;
    (a) 46번 페닐알라닌을 알라닌 또는 세린으로 치환
    (b) 47번 발린을 알라닌 또는 류신으로 치환,
    (c) 49번 류신을 아스파틱산 또는 알라닌으로 치환,
    (d) 58번 글루탐산을 알라닌 또는 세린으로 치환,
    (e) 59번 발린을 알라닌, 아스파틱산 또는 페닐알라닌으로 치환,
    (f) 61번 글루타민을 류신, 알지닌 또는 알라닌으로 치환,
    (g) 63번 알라닌을 발린 또는 세린으로 치환,
    (h) 79번 페닐알라닌을 타이로신, 글루탐산 또는 류신으로 치환,
    (i) 84번 트립토판을 발린, 히스티딘 또는 알지닌으로 치환,
    (j) 85번 트립토판을 히스티딘, 알지닌, 또는 류신으로 치환,
    (k) 114번 아이소류신이 발린, 페닐알라닌, 쓰레오닌 또는 세린으로 치환,
    (l) 126번 발린을 알라닌, 세린, 쓰레오닌, 또는 류신으로 치환,
    (m) 128번 페닐알라닌을 글루탐산, 히스티딘, 아스파틱산, 세린 또는 류신으로 치환,
    (n) 131번 류신을 아스파틱산으로 치환,
    (o) 145번 알라닌을 세린 또는 발린으로 치환,
    (p) 146번 글루탐산을 알라닌 또는 류신으로 치환,
    (q) 148번 알지닌을 알라닌 또는 메티오닌으로 치환,
    (r) 619번 타이로신 및 620번 글루탐산을 알라닌으로 치환,
    (s) 666번 글루탐산을 알라닌으로 치환
    (t) 674번 루신을 알라닌으로 치환,
    (u) 691번 타이로신을 아이소류신으로 치환,
    (v) 703번 알라닌을 세린으로 치환, 및
    (w) 617번 내지 623번 아미노산의 결손.
  2. 제1항에 있어서, 서열번호 1의 TodS 단백질에서 114번 아이소류신이 발린으로 치환된 TodS 변이 단백질은 톨루엔 및 m-자일렌으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 방향족 탄화수소 감지 센서용인 것인, TodS 변이 단백질.
  3. 제1항에 있어서, 서열번호 1의 TodS 단백질에서 61번 글루타민이 알지닌으로 치환된 TodS 변이 단백질은 톨루엔, 스티렌, m-자일렌, o-자일렌 및 1,2,4-TMB(1,2,4-Trimethylbenzene)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 방향족 탄화수소 감지 센서용인 것인, TodS 변이 단백질.
  4. 서열번호 1의 TodS 단백질 중 43번 내지 168번째 또는 23번 내지 168번째 아미노산 서열을 가지는 PAS1 단백질에서, 서열번호 1의 아미노산 서열을 기준으로, 제1항의 (a) 내지 (q)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 변이를 가지는 PAS1 변이 단백질.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  6. 제5항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 발현 벡터.
  7. 제6항의 발현 벡터가 도입된, 미생물.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 단백질을 생산하는 미생물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 미생물은 슈도모나스(Pseudomonas) 속인 것인, 미생물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 미생물은 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)인 것인, 미생물.
  11. (i) 하기 (a) 내지 (d)의 모듈을 포함하는 센서용 모듈 조합; (ii) 상기 모듈 조합을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트; (iii) 상기 발현 카세트를 포함하는 벡터; 또는 (i) 내지 (iii) 중 어느 하나를 포함하는 미생물을 함유하는, 방향족 탄화수소 감지용 바이오센서:
    (a) 방향족 탄화수소와 특이적으로 결합하는 제4항의 PAS1 변이 단백질을 포함하는 제1모듈;
    (b) 제1모듈에 방향족 탄화수소가 결합시 신호를 발생 및 전달하는 제2모듈;
    (c) 상기 전달된 신호에 의해 인산화되는 전사조절인자를 포함하는 제3모듈; 및
    (d) 상기 인산화되는 제3모듈에 의해 표지 단백질을 발현시키는 제4모듈.
  12. 제11항에 있어서, 상기 신호는 키나아제 단백질의 자기인산화 (autophosphorylation)에 의해 발생 또는 전달되는 것인, 바이오센서.
  13. 제11항에 있어서, 상기 전사조절인자은 슈노모나스 속 미생물 유래 TodT 단백질인 것인, 바이오센서.
  14. 제11항에 있어서, 상기 제4모듈의 발현은 슈노모나스 속 미생물 유래 todX 프로모터에 의한 것인, 바이오센서.
  15. 제11항에 있어서, 추가로 표지 단백질의 발현을 측정할 수 있는 물질을 포함하는 것인, 바이오센서.
  16. (i) 하기 (a) 내지 (d)의 모듈을 포함하는 센서용 모듈 조합; (ii) 상기 모듈 조합을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트; 또는 (iii) 상기 발현 카세트를 포함하는 벡터를 포함하는 미생물을 함유하는, 방향족 탄화수소 분해용 미생물 제제:
    (a) 방향족 탄화수소와 특이적으로 결합하는 제4항의 PAS1 변이 단백질을 포함하는 제1모듈;
    (b) 제1모듈에 방향족 탄화수소가 결합시 신호를 발생 및 전달하는 제2모듈;
    (c) 상기 전달된 신호에 의해 인산화되는 전사조절인자를 포함하는 제3모듈; 및
    (d) 상기 인산화되는 제3모듈에 의해 방향족 탄화수소 분해 단백질을 발현시키는 제4모듈.
  17. 제11항의 바이오센서를 포함하는, 방향족 탄화수소 감지용 조성물.
  18. 제16항의 미생물 제제를 포함하는, 방향족 탄화수소 분해용 조성물.
  19. 제11항의 바이오센서를 시료에 노출시키는 단계를 포함하는, 방향족 탄화수소 감지방법.
  20. 제16항의 미생물 제제를 이용하여 방향족 탄화수소를 분해하는 단계를 포함하는, 방향족 탄화수소 분해방법.
  21. (a) 표 3에 나타낸 PAS1 단백질의 원자좌표, 표 4에 나타낸 SeMet-PAS1 단백질과 톨루엔 복합체의 원자좌표, 또는 표 5에 나타낸 PAS1 단백질과 1,2,4-TMB(1,2,4-Trimethylbenzene) 복합체의 원자좌표를 이용하여, PAS1 단백질 또는 이의 복합체의 3차 구조를 설계하는 단계;
    (b) 상기 설계된 3차 구조를 이용하여 PAS1 변이 단백질을 생성하는 단계; 및
    (c) 상기 생성된 PAS1 변이 단백질과 주어진 리간드 간의 결합 활성을 측정하는 단계를 포함하는,
    야생형 PAS1 단백질에 대하여 리간드 결합 활성이 변이된, PAS1 변이 단백질을 스크리닝하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 (c) 단계는 (i) 하기 (a') 내지 (d')의 모듈을 포함하는 센서용 모듈 조합; (ii) 상기 모듈 조합을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트; (iii) 상기 발현 카세트를 포함하는 벡터; 또는 (i) 내지 (iii) 중 어느 하나를 포함하는 미생물을 함유하는, 바이오센서를 이용하여 상기 생성된 PAS1 변이 단백질과 주어진 리간드 간의 결합에 의해 발현되는 표지 단백질의 수준을 측정함으로써 수행되는 것인, 방법.
    (a') 주어진 리간드와 특이적으로 결합하는 상기 생성된 PAS1 변이 단백질을 포함하는 제1모듈;
    (b') 제1모듈에 리간드가 결합시 신호를 발생 및 전달하는 제2모듈;
    (c') 상기 전달된 신호에 의해 인산화되는 전사조절인자를 포함하는 제3모듈; 및
    (d') 상기 인산화되는 제3모듈에 의해 표지 단백질을 발현시키는 제4모듈.
  23. 제21항에 있어서, (d) 야생형 PAS1 단백질의 값에 비해 측정된 리간드 결합 활성이 변화된 경우, 야생형 PAS1 단백질에 대하여 리간드 결합 활성이 변이된, PAS1 변이 단백질로 판정하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  24. 제21항에 있어서, 상기 리간드는 벤젠(benzene), 에틸벤젠(ethylbenzene), 프로필벤젠(propylbenzene), 부틸벤젠(butylbenzene), 니트로벤젠(nitrobenzene), 클로로벤젠(chlorobenzene), 플루오로벤젠(fluorobenzene), 톨루엔(toluene), 스티렌(styrene), o-자일렌(o-xylene), m-자일렌(m-xylene), p-자일렌(p-xylene), o-클로로톨루엔(o-chlorotoluene), m-클로로톨루엔(m-chlorotoluene), p-클로로톨루엔(p-chlorotoluene), o-톨루이딘(o-toluidine), m-톨루이딘(m-toluidine), p-톨루이딘(p-toluidine), 카테콜(catechol), 1,2,4-TMB(1,2,4-Trimethylbenzene), 1,2,3-TMB(1,2,3-Trimethylbenzene), 1,3,5-TMB(1,3,5-Trimethylbenzene), 1-나프톨(1-naphthol) 및 2,3-디히드록시나프탈렌(2,3-dihydroxynaphthalene)으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 방법.
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