WO2016056650A1 - 植物のバイオマスを増大させる新規遺伝子及びその利用 - Google Patents

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雄司 中野
忠男 浅見
朋子 宮地
あゆみ 山上
典子 石川
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日本たばこ産業株式会社
国立研究開発法人 理化学研究所
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Definitions

  • the present invention relates to a novel gene that increases plant biomass, and more particularly, a plant into which the gene has been introduced, a method for increasing plant biomass using the gene, and a biomass increased using the gene.
  • the present invention relates to a method for producing a plant.
  • Biomass is generally understood as an expression of the amount of organisms (bio) existing in a certain space at a specific point in time as the amount of substance (mass). Biomass is sometimes referred to as “biomass” or “biomass” in Japanese, and sometimes referred to as “standing ⁇ crop ”in ecology.
  • the digitization of biomass is usually performed by mass or energy amount, but may be expressed by the dry weight of the corresponding organism per unit area. In biomass, plants are often used, and increasing the biomass of plants not only provides biofuels and renewable energy, but also stabilizes the food supply in terms of increasing crop production. It is also considered useful.
  • Brassinosteroids are a group of compounds having a steroid skeleton, and a representative example is brassinolide.
  • Brassinosteroids are: (i) promotion of elongation of stems, leaves and roots, (ii) promotion of cell division, (iii) promotion of differentiation from mesophyll cells into ducts or temporary ducts, (iv) ethylene synthesis. It has actions such as promotion, (v) seed germination promotion, and (vi) addition of resistance to environmental stress.
  • Non-patent Document 1 Attempts have been made to increase the yield by introducing the brassinosteroid biosynthesis gene into rice using the physiological activity of such brassinosteroid.
  • Non-patent Document 1 Attempts have been made to increase the yield by introducing the brassinosteroid biosynthesis gene into rice using the physiological activity of such brassinosteroid.
  • the effect was not always sufficient.
  • Several genes related to brassinosteroid synthesis and signal transduction have been identified so far, but the gene that sufficiently realizes the increase in plant biomass has not yet been identified.
  • the present invention has been made in view of the above problems, and an object thereof is to identify a novel gene that effectively increases plant biomass and to provide the gene together with its utilization technology.
  • the present inventors screened Arabidopsis thaliana mutants based on the selection of the embryonic axis morphology of the seedlings in the dark and in the presence of brassinosteroid (Brz), an inhibitor of brassinosteroid biosynthesis. Attempts were made to isolate related genes. Specifically, mutants were screened using a method based on FOX hunting system (Full-length cDNA over-expression Gene Gene Hunting System) to search for related genes. As a result, a mutant with extremely strong brassinazole resistance was found, and further genetic analysis revealed that the bil7 (Brz-insensitive-long-hypocotyl 7) gene was involved in the mutation. .
  • FOX hunting system Full-length cDNA over-expression Gene Gene Hunting System
  • the present inventors further produced a construct that expresses the bil7 gene, and introduced it into a plant to produce a transformant that overexpresses the gene. And when the form of the said transformant was investigated, it became clear that growth was promoted compared with the wild body in various points, such as flower stem length. Based on these findings, the present inventors have completed the present invention.
  • the present invention is preferably carried out in the following manner, but is not limited thereto.
  • nucleic acid is a nucleic acid derived from a monocotyledonous plant or a dicotyledonous plant, and the plant is a monocotyledonous plant.
  • a method for increasing plant biomass comprising introducing a nucleic acid encoding a protein into a plant, the protein comprising: Comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, An amino acid sequence having 25% or more identity or 75% or more similarity to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 or 11, Said method characterized in that it has the activity of increasing the biomass of the plant.
  • nucleic acid is a nucleic acid derived from a monocotyledonous plant or a dicotyledonous plant, and the plant is a monocotyledonous plant.
  • a method for producing a plant with increased biomass comprising introducing a nucleic acid encoding a protein into the plant, wherein the protein comprises: Comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, An amino acid sequence having 25% or more identity or 75% or more similarity to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 or 11, Said method characterized in that it has the activity of increasing the biomass of the plant.
  • nucleic acid is a nucleic acid derived from a monocotyledonous plant or a dicotyledonous plant, and the plant is a monocotyledonous plant.
  • a construct comprising a nucleic acid encoding a protein and a promoter, the protein comprising: Comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, An amino acid sequence having 25% or more identity or 75% or more similarity to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 or 11, Said construct, characterized in that it has an activity of increasing plant biomass.
  • a vector comprising the construct of any one of embodiments 13-15.
  • a host cell comprising the vector of embodiment 16.
  • nucleic acid is a nucleic acid derived from a monocotyledonous plant or a dicotyledonous plant, and the plant is a monocotyledonous plant.
  • [Aspect 20] (1) a step of measuring the expression level of a protein or a nucleic acid encoding the same in a test plant and a wild-type plant, Comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, An amino acid sequence having 25% or more identity or 75% or more similarity to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 or 11, Having the activity of increasing the biomass of the plant, the process, (2) A step of comparing the expression levels obtained in step (1), (3) selecting a test plant showing an expression level higher than that in a wild-type plant; A method for screening a plant with increased biomass, comprising:
  • nucleic acid is a monocotyledonous or dicotyledonous nucleic acid and the plant is a monocotyledonous plant.
  • [Aspect 24] (1) a step of measuring the expression level of a protein or a nucleic acid encoding the same in a test plant and a wild-type plant, Comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, An amino acid sequence having 25% or more identity or 75% or more similarity to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 or 11, Having the activity of increasing the biomass of the plant, the process, (2) A step of comparing the expression levels obtained in step (1), (3) a step of confirming that the expression level in the test plant is higher than the expression level in the wild-type plant; A method for determining a plant having increased biomass.
  • nucleic acid is a monocotyledonous or dicotyledonous nucleic acid
  • the plant is a monocotyledonous plant.
  • plant biomass can be effectively increased. Further, by using the present invention, it is possible to provide a plant in which biomass is effectively increased and a method for producing the plant, and further, a means useful for screening a plant in which biomass is increased, and a substance that increases plant biomass. Screening methods can be provided.
  • FIG. 1 is a drawing showing br7-1D's resistance to brassinazole (Brz) under dark conditions. From FIG. 1, it is clear that bil7-1D shows Brz resistance in germination in the dark.
  • A shows the state of hypocotyl elongation in Brz 0, 0.3, 1, 3 ⁇ M conditions on the 7th day in the dark.
  • B shows the elongation length of the hypocotyl under conditions of Brz 0, 0.3, 1, 3 ⁇ M on the seventh day in the dark.
  • C shows the elongation rate of the hypocotyl in the dark day 7 under conditions of Brz 0, 0.3, 1, 3 ⁇ M.
  • FIG. 2 is a drawing showing the morphological characteristics of bil7-1D. From FIG. 2, it is clear that bil7-1D exhibits a growth promoting form.
  • FIG. 3 is a drawing showing morphological characteristics of petals, pods and seeds of bil7-1D. From FIG. 3, it is clear that bil7-1D increases the seed weight.
  • FIG. 5 is a drawing showing the expression levels of BIL7 candidate genes in bil7-1D on the 7th day in the dark. From FIG. 5, it is clear that high expression of BIL7 candidate gene is observed in bil7-1D.
  • FIG. 6 is a drawing showing the Brz resistance and BIL7 expression level of a BIL7 high expression transformant (BIL7-OX) and a BIL7 expression suppression transformant (BIL7-RNAi) under dark conditions. From FIG. 6, it is clear that the higher the BIL7 expression level, the more hypocotyl elongation occurs in germination under dark Brz conditions.
  • BIL7-OX BIL7 high expression transformant
  • BIL7-RNAi BIL7 expression suppression transformant
  • WT wild-type, BIL7-OX1, 2: 35S :: BIL7 overexpressor 1, 2, BIL7-RNAi: BIL7-RNAi suppressor.
  • FIG. 7 is a drawing showing the morphological characteristics of BIL7-OX and BIL7-RNAi. From FIG. 7, it is clear that the line with higher expression level of BIL7 shows a flower stem elongation form at maturity.
  • WT wild-type, BIL7-OX1, 2: 35S :: BIL7 overexpressor 1, 2, BIL7-RNAi: BIL7-RNAi suppressor.
  • FIG. 7 shows the morphological characteristics of BIL7-OX and BIL7-RNAi.
  • BIL7-OX shows an increasing tendency of the number of secondary flower stems and seed weight.
  • FIG. 9 is a diagram showing an increase in biomass in an OsBIL7 high-expressing transformant (OsBIL7-OX). A shows the result at T1.
  • FIG. 10 is a drawing showing the grass appearance of an OsBIL7 rice transformant after 17 days of potting.
  • FIG. 11 is a drawing showing the grass appearance of mature OsBIL7 rice transformants. In rice (variety: Yukihikari), the transformed OsBIL7 recombinant (left) was observed to be more vigorous than the control vector recombinant (right).
  • FIG. 12 is a drawing showing the grass shape of a BIL7 rice transformant after 17 days of potting. In rice (variety: Yukihikari), the transformed BIL7 recombinant (left) was observed to be more vigorous than the control vector recombinant (right).
  • FIG. 13 is a drawing showing the appearance of BIL7 rice transformants in the mature stage. In rice (variety: Yukihikari), the transformed BIL7 recombinant (right) was observed to be more vigorous than the control vector recombinant (left).
  • the bil7 (Brz-insensitive-long-hypocotyl 7) gene is used as a nucleic acid that contributes to an increase in plant biomass.
  • the bil7 gene is a gene involved in brassinosteroid signal transduction found from a mutant in which the length of the hypocotyl is found even in the presence of brassinosteroid (Brz), an inhibitor of brassinosteroid biosynthesis. Can be seen in plants.
  • the nucleotide sequence of the bil7 gene and the amino acid sequence of the protein encoded by the gene that is, the BIL7 protein
  • the protein in the present invention has a common motif of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 below. Have.
  • SEQ ID NO: 1 Ala-Pro-Pro-Ser-Ser-Pro-Ala-Ser-X1-X2-X3-Ser-X4-X5-X6-Ser-X7-X8-X9-X10-Pro-X11-Gly-Pro-Tyr- Ala-X12-Glu-X13-X14-X15-Val-X16-Pro-Pro-Val-Phe-Ser-X17-X18-X19-Thr-X20-Pro-Ser-X21-Ala-Pro-X22-Thr- Pro-Pro-X23-Pro-Ser-Ser-Pro-X24-Val-Pro-X25-Ala-X26-Pro-X27-Ser-Pro-X28-Ser-Pro (Where X1 is Phe or Tyr, X2 is Phe, Leu, Thr or Ala, X3 is Gln, Pro, His or Asn, X4 is Glu, Gly, Asp, Ala or Met, X
  • X11 is preferably 17 to 29 amino acid residues, more preferably 20 to 26 amino acid residues, and X23 is preferably 3 to 12 amino acid residues, more preferably 8 to 12 amino acids.
  • X26 is preferably 23 to 49 amino acid residues, more preferably 23 to 30 amino acid residues, and X28 is preferably 5 amino acid residues.
  • the plant having the BIL7 protein containing the above-mentioned common motif is not particularly limited.
  • Arabidopsis thaliana soybean (Glycine max), rice (Oryza sativa), corn (Zea mays), radish (Raphanus sativus) , Poplar (Populus trichocarpa), grape (Vitis vinifera), Physcomitrella patens and the like.
  • the nucleotide sequence of mRNA (and cDNA) encoding BIL7 protein of each plant and the amino acid sequence of BIL7 protein have been identified, and Genbank accession numbers are registered as shown in the following table.
  • the BIL7 protein having the above-mentioned common motif includes homologues of the BIL7 protein of each plant.
  • Arabidopsis thaliana BIL7 has three types of homologous proteins.
  • the nucleotide sequence and amino acid sequence of mRNA (and cDNA) are registered with Genbank accession numbers as shown in the following table.
  • the protein according to the present invention also contains 25% or more identity or 75% or more similarity to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 or 11 on the basis of the Arabidopsis thaliana or rice BIL7 protein in addition to the common motif. It contains the amino acid sequence which has sex.
  • the common motif that is, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is an amino acid having 25% or more identity or 75% or more similarity to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 or 11. Included in the sequence (in other words, the common motif (that is, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1) is 25% or more identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 or 11, or 75% or more.
  • amino acid sequence identity refers to amino acid sequence identity between two proteins of interest, and in an optimal alignment of amino acid sequences created using mathematical algorithms known in the art. It is represented by the percentage (%) of matching amino acid residues.
  • the identity of amino acid sequences can be determined by visual inspection and mathematical calculation.
  • a homology search program for example, BLAST, FASTA
  • a sequence alignment program for example, ClustalW
  • processing software for example, GENETYX [registered trademark]
  • the protein according to the present invention has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 or 11 and 25% or more, 30% or more, 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 85% or more, An amino acid sequence having 90% or more, 95% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more identity can be included.
  • the protein in the present invention includes, as a preferred embodiment, an amino acid sequence having 25% or more, 30% or more, or 40% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7.
  • the identity between Arabidopsis BIL7 protein and soybean, rice and corn BIL7 proteins is 44% (soybean BIL7), 41% (rice BIL7) and 40% (corn BIL7), respectively. Therefore, the protein in the present invention includes, as a preferred embodiment, an amino acid sequence having 40% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7.
  • rice BIL7 protein and soybean and corn BIL7 protein is 42% (soybean BIL7) and 85% (corn BIL7), respectively. Therefore, the protein in the present invention has, as one preferred embodiment, 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, or 85% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11. Amino acid sequence having
  • the similarity of amino acid sequences refers to the similarity of amino acid sequences between two proteins of interest, and in the optimal alignment of amino acid sequences created using mathematical algorithms known in the art. Expressed by the percentage of amino acid residues that match and the percentage of amino acid residues that show similarity. The similarity of amino acid residues is indicated by the relationship of amino acid residues whose physicochemical properties are similar to each other.
  • aromatic amino acids Phe, Tyr, Trp
  • hydrophobic amino acids Asp, Glu
  • fat Family amino acids Ala, Leu, Ile, Val
  • polar amino acids Asn, Gln
  • basic amino acids Lys, Arg, His
  • acidic amino acids Asp, Glu
  • amino acids belonging to the same group are understood to be amino acid residues similar to each other. Amino acid residues exhibiting such similarity are predicted not to affect the protein phenotype.
  • Similarity of amino acid sequences can be determined by visual inspection and mathematical calculation as well as identity, and sequence similarity search programs well known to those skilled in the art (eg, BLAST, PSI-BLAST, HMMER), genetic It can be calculated using information processing software (for example, GENETYX [registered trademark]). Specifically, the similarity of amino acid sequences in this specification is determined by using GENETYX [registered trademark] network version ver. 11.1.3 (Genetics Co., Ltd.) and setting Protein vs Protein Global Homology as the default condition (Unit size to set compare to 2).
  • the protein according to the present invention includes the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 or 11, and 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, An amino acid sequence having a similarity of 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more can be included.
  • the protein in the present invention includes an amino acid sequence having 75% or more similarity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 as one preferred embodiment. Similarities between rice BIL7 protein and soybean and corn BIL7 proteins are 83% (soybean BIL7) and 97% (corn BIL7), respectively. Therefore, the protein in the present invention has, as one preferred embodiment, a similarity of 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 97% or more with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11. Amino acid sequence having
  • the protein in the present invention includes the above-described common motif and includes an amino acid sequence having a predetermined identity or similarity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 or 11, and further increases plant biomass. It is characterized by having activity.
  • the biomass of a plant intends an amount related to the whole plant, a part thereof, an individual organ, or a combination thereof.
  • the whole, part, or individual organ of the plant individual include, for example, the whole, aerial part, root, stem, leaf, fruit, seed, embryo, ovule, ovary, shoot apex, bud, pollen, or ear. It is done. Of these, fruits, seeds, ears, roots, stems, leaves, or strawberries are preferred.
  • the amount include number, size, length, width, weight, area, or volume.
  • biomass examples include total weight, above-ground weight (for example, above-ground dry weight), yield, stem diameter, number of stems, culm length, plant height, leaf area, number of leaves, leaf length, leaf length, leaf width. , Number of persimmons, weight of persimmon (e.g., weight of persimmon, total weight of persimmon), number of seeds, number of tillers, number of ears, number of ears, number of seeds per head, seed rate, head length, maximum head length, Examples include, but are not limited to, single head weight or total head weight.
  • “increase” may be any one of plant biomass as exemplified above as long as it is increased alone or in combination.
  • the activity to increase the biomass of the plant is evaluated by, for example, using the control biomass (parent plant, non-transformant, wild type, etc.) as an index of increase and comparing it with the control in the mature plant. Can do.
  • the control biomass parent plant, non-transformant, wild type, etc.
  • the biomass can be quantified, the numerical value is compared, for example, 1% More than 3%, more than 5%, more than 10%, more than 15%, more than 20%, more than 25%, more than 30%, more than 40%, more than 50%, more than 60%, or more than 70% It can be determined to have an activity to increase the biomass of the plant.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 can be the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 below.
  • plants having a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 as a common motif include Arabidopsis thaliana, soybean, rice, and corn.
  • homologues of BIL7 protein of these plants are also included in the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • SEQ ID NO: 2 Ala-Pro-Pro-Ser-Ser-Pro-Ala-Ser-Phe-X29-X30-Ser-X31-X32-X33-Ser-X34-X35-X36-X37-Pro-X38-Ser-X39-X40- X41-X42-Gly-Pro-Tyr-Ala-X43-Glu-Thr-Gln-X44-Val-X45-Pro-Pro-Val-Phe-Ser-X46-X47-X48-Thr-Glu-Pro-Ser- X49-Ala-Pro-X50-Thr-Pro-Pro-X51-Pro-Ser-Ser-Pro-X52-Val-Pro-X53-Ala-X54-Pro-X55-Ser-Pro-X56-Leu-X57- Ser-Pro (Wherein X29 is Phe, Leu or Thr, X30 is Gln, His, Pro or Asn, X31 is Glu, Gly
  • X38 is preferably 12 to 21 amino acid residues, more preferably 15 to 21 amino acid residues, and X51 is preferably 3 to 12 amino acid residues, more preferably 8 to 12 amino acid residues.
  • X54 is preferably 23 to 35 amino acid residues, more preferably 23 to 30 amino acid residues, and X56 is preferably 3 or 4 amino acid residues, more preferably 3 amino acids. Residue.
  • the protein in the present invention can also include an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 below.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 is included in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 (in other words, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 is represented by SEQ ID NO: 3 Included (present) as part of the represented amino acid sequence).
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 is included in an amino acid sequence having 25% or more identity or 75% or more similarity to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 or 11 (in other words, The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 is included as a part of an amino acid sequence having 25% or more identity or 75% or more similarity to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 or 11 (existing). )).
  • plants having a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 as a common motif include Arabidopsis thaliana and rice.
  • X65 is Ser or Ala
  • X66 is Asp or Glu
  • X68 is Asp or Ser
  • X69 is 5 to 10 amino acid residues
  • X70 is Trp or Ala
  • X71 is Asn or Asp
  • X72 is Arg or Trp
  • X73 is Trp or Leu
  • X74 is Leu or Val
  • X75 is Leu or Tyr
  • X76 is Lys or Phe
  • X77 is Ser or Gln
  • X78 is Arg or Lys
  • X79 is Gln or Asn
  • X80 is Arg or Gly
  • X81 is Lys or Arg
  • X82 is Gly or Ser
  • X83 is Asn or His
  • X84 is Ser or Ala
  • X85 is 20-25 amino acid residues
  • X86 is Ile or Val
  • X87 is Phe or Leu
  • X88 Is Glu or Gly
  • X89 is
  • X59 is preferably 4 to 7 amino acid residues
  • X69 is preferably 8 to 10 amino acid residues
  • X85 is preferably 21 to 22 amino acid residues
  • X97 is preferably 2 to 7 amino acid residues
  • X102 is preferably 2 to 4 amino acid residues
  • X105 is preferably 0 to 2 amino acid residues
  • X110 is preferably 10 to 17 amino acid residues
  • X118 is preferably 2 to 3 amino acid residues
  • X121 is preferably 3 to 8 amino acid residues
  • X128 is preferably 5 to 18 amino acid residues
  • X129 is preferably 13 to 28 amino acid residues
  • X130 is Preferably 1 to 2 amino acid residues
  • X140 is preferably 5 to 24 amino acid residues
  • X144 is preferably 7 to 22 amino acid residues
  • X149 is Mashiku is 8-11 amino acid residues
  • X157 is preferably from 4 to 11 amino acid residues.
  • the protein in the present invention can also include an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 below.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 is included in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 (in other words, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 is represented by SEQ ID NO: 4 Included (present) as part of the represented amino acid sequence).
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 is included in an amino acid sequence having 75% or more identity or 75% or more similarity to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 or 11 (in other words, The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 is included as a part of the amino acid sequence having 25% or more identity or 75% or more similarity to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 or 11 (existing). )).
  • plants having a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 as a common motif include Arabidopsis and soybeans.
  • SEQ ID NO: 4 Met-Arg-X160-Gly-Ala-Asn-Gly-X161-Asn-Asn-X162-X163-X164-Thr-Ile-Asn-Ala-Ala-X165-X166-Ile-Ala-Ser-X167- X168-X169-Arg-Leu-X170-Gln-X171-X172-Pro-X173-X174-X175-Lys-X176-X177-Trp-X178-Asn-X179-X180-Ser-X181-X182-X183-Cys- Phe-Gly-X184-X185-X186-X187-Arg-X188-Arg-Ile-Gly-X189-X190-Val-Leu-Val-Pro-Glu-X191-X192-X193-X194-X195-X196-X197- Asn-X198-Thr-X199-Ile-X
  • X160 is preferably 0 to 1 amino acid residue
  • X161 is preferably 0 to 3 amino acid residues
  • X199 is preferably 7 to 9 amino acid residues
  • X213 is preferably 4 to 7 amino acid residues
  • X217 is preferably 6 to 10 amino acid residues
  • X230 is preferably 4 to 5 amino acid residues
  • X236 is preferably 3 to 6 amino acid residues
  • X240 is preferably 3-9 amino acid residues
  • X246 is preferably 5-9 amino acid residues
  • X253 is preferably 3-7 amino acid residues
  • X269 is preferably 2-12 amino acid residues
  • X273 is Preferably 0 to 11 amino acid residues
  • X276 is preferably 1 to 11 amino acid residues
  • X280 is preferably 6 to 10 amino acid residues
  • X284 is preferably Properly 2 to 8 amino acid residues
  • X287 preferably 4-7 amino acid residues
  • the protein in the present invention can also include an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 below.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 is included in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 (in other words, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 is represented by SEQ ID NO: 5 Included (present) as part of the represented amino acid sequence).
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 is included in an amino acid sequence having 25% or more identity or 75% or more similarity to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 or 11 (in other words, The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 is included as a part of the amino acid sequence having 25% or more identity or 75% or more similarity to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 or 11 (present) )).
  • plants having a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 as a common motif include rice and corn.
  • SEQ ID NO: 5 Met-Gln-Ser-Gly-X294-X295-Met-Arg-Pro-Val-His-Asn-Ser-Val-Asp-Thr-Val-Asn-Ala-Ala-Val-Ala-Ile-Val- Thr-Ala-Glu-Ser-Arg-Thr-Gln-Pro-X296-Ala-Glu-X297-Arg-Arg-Lys-Trp-Ala-Asp-X298-Leu-Ser-Val-Tyr-Phe-Cys- Phe-Gly-Ser-Gln-Lys-Asn-Gly-Arg-X299-Arg-X300-X301-His-Ala-X302-Leu-Val-Pro-Glu-Pro-X303-Pro-X304-Arg-Thr- Asp-Ala-Pro-X305-X306-Glu-Ile-Pro-X307-His-Pro-
  • X299 is preferably 0 to 2 amino acid residues
  • X311 is preferably 1 to 2 amino acid residues
  • X316 is preferably 1 to 2 amino acid residues
  • X340 is preferably 0 to Two amino acid residues.
  • nucleic acid encoding the above-described protein
  • the nucleic acid means a polymer in which nucleotides are linked by a phosphate ester bond, and is used interchangeably with the terms polynucleotide and oligonucleotide.
  • the structure of the nucleic acid is not particularly limited, and may be either single-stranded or double-stranded.
  • Nucleic acids include deoxyribonucleic acid (DNA), ribonucleic acid (RNA), and hybrids thereof (eg, DNA-RNA hybrid double strands, chimeric nucleic acids in which DNA and RNA are linked to a single strand).
  • Nucleic acid constituent units mainly include purine bases such as adenine (A) and guanine (G) and pyrimidine bases such as thymine (T), cytosine (C) and uracil (U). These modifications are also included as long as translation is performed.
  • the nucleic acid used in the present invention is preferably mRNA or cDNA encoding the protein of interest.
  • the nucleic acid and protein in the present invention are not particularly limited as long as they increase plant biomass, but are preferably derived from dicotyledonous plants or monocotyledonous plants. Alternatively, it may be derived from Physcomitrella patens.
  • dicotyledonous plants include Arabidopsis, soybean, radish, poplar, grape, cotton, rapeseed, sugar beet, tobacco, tomato, etc.
  • Arabidopsis, soybean, and radish are preferable, and Arabidopsis, more preferably Soybean, more preferably Arabidopsis thaliana.
  • Examples of monocotyledonous plants include rice, corn, wheat, barley, sorghum, sugar cane, onion, and the like. Among these, rice, corn, and wheat are preferable, and rice and corn are more preferable.
  • BIL7 protein derived from various plants can be used.
  • homologues of various plant-derived BIL7 proteins can be used as the protein in the present invention, and include, for example, the Arabidopsis BIL7 homologue protein (that is, the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 23, 25, and 27). Protein) may be used.
  • the amino acid sequences of BIL7 proteins derived from various plants and homologs thereof for example, any one of SEQ ID NOs: 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, and 27
  • a protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, inserted, substituted or added, and having an activity of increasing plant biomass is also included.
  • several amino acids for example, 2 to 40, 2 to 30, 2 to 20, 2 to 10, 2 to 7, 2 to 5, 5, 4, 3, Means two amino acids.
  • Amino acid deletions, insertions, substitutions or additions can be made using methods known in the art (eg, by modifying the nucleic acid).
  • Such an amino acid sequence preferably includes the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • Mutation can be introduced into the nucleic acid by the Kunkel method, the Gapped duplex method, or the like, for example, a mutation introduction kit using site-directed mutagenesis (for example, Transformer TM Site-Directed Mutagenesis). Kit (Clontech Laboratories, Inc.) or QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent Technologies) can be used, and for introduction of mutations into nucleic acids, EMS (ethylmethanesulfonic acid), 5-bromouracil, Chemical mutagens such as 2-aminopurine, hydroxylamine, N-methyl-N'-nitro-Nnitrosoguanidine, and other carcinogenic compounds can be used, X-rays, alpha rays, beta rays, gamma rays Further, radiation such as an ion beam or ultraviolet rays can be used.
  • site-directed mutagenesis for example, Transformer TM Site-Directed Mutagenesis. Kit (Clontech Laborator
  • the amino acid sequences of BIL7 proteins derived from various plants and homologs thereof for example, any one of SEQ ID NOs: 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, and 27) 25% or more, 30% or more, 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or higher, 97% or higher, 98% or higher, 99% or higher, or 70% or higher, 80% or higher, 85% or higher, 90% or higher, 95% or higher, 96% or higher, 97% or higher, 98 %, 99% or more of similarity, and proteins having an activity of increasing plant biomass are also included.
  • the identity and similarity of amino acid sequences are as described above.
  • Such an amino acid sequence preferably includes the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the nucleic acids encoding the protein are mainly SEQ ID NOs: 6, 8, 10
  • a nucleic acid comprising a nucleotide sequence represented by any one of 12, 14, 16, 18, and 20 is used.
  • a nucleic acid containing the nucleotide sequence represented by any of SEQ ID NOs: 22, 24 and 26 is mainly used.
  • nucleic acid comprising the nucleotide sequence represented by any of SEQ ID NOs: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 and 26
  • nucleic acid comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence
  • a nucleic acid encoding a protein that hybridizes with a stringent condition and has an activity of increasing plant biomass is also included as one embodiment of the present invention.
  • under stringent conditions means to hybridize under moderately or highly stringent conditions.
  • moderately stringent conditions can be easily determined by those skilled in the art based on, for example, the length of the nucleic acid.
  • Basic conditions are shown in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, Chapter 6, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001, for example, 5 ⁇ SSC, 0.5% SDS, 1.0 mM EDTA (PH 8.0) pre-wash solution, about 50% formamide at about 42 ° C., 2 ⁇ to 6 ⁇ SSC, preferably 5 ⁇ to 6 ⁇ SSC, 0.5% SDS (or about 42 ° C.
  • hybridization solutions such as Stark solution in 50% formamide
  • Other similar hybridization solutions such as Stark solution in 50% formamide
  • cleaning conditions Preferably, moderately stringent conditions include hybridization conditions (and washing conditions) of about 50 ° C., 6 ⁇ SSC, 0.5% SDS.
  • High stringency conditions can also be readily determined by those skilled in the art, for example based on the length of the nucleic acid.
  • these conditions include hybridization at higher temperatures and / or lower salt concentrations than moderately stringent conditions (eg, containing about 0.5% SDS, about 65 ° C., 6 ⁇ SSC to 0. 2 ⁇ SSC, preferably 6 ⁇ SSC, more preferably 2 ⁇ SSC, more preferably 0.2 ⁇ SSC, or even 0.1 ⁇ SSC) and / or washing, for example hybridization as described above Defined with conditions and washing at approximately 65 ° C. to 68 ° C., 0.2 ⁇ to 0.1 ⁇ SSC, 0.1% SDS.
  • moderately stringent conditions eg, containing about 0.5% SDS, about 65 ° C., 6 ⁇ SSC to 0. 2 ⁇ SSC, preferably 6 ⁇ SSC, more preferably 2 ⁇ SSC, more preferably 0.2 ⁇ SSC, or even 0.1 ⁇ SSC
  • SSC (1 ⁇ SSC is 0.15 M NaCl and 15 mM sodium citrate) to SSPE (1 ⁇ SSPE is 0.15 M NaCl, 10 mM NaH 2 PO 4, and 1.25 mM EDTA, pH 7.4) can be substituted, and washing is performed for about 15 minutes to about 1 hour after completion of hybridization.
  • hybridization kit that does not use a radioactive substance for the probe can be used.
  • hybridization using an ECL direct labeling & detection system can be mentioned.
  • ECL direct labeling & detection system manufactured by Amersham
  • For stringent hybridization for example, 5% (w / v) Blocking reagent and 0.5M NaCl are added to the hybridization buffer in the kit, and the reaction is performed at 42 ° C. for 4 hours.
  • a condition is that 20% is performed twice at 55 ° C. for 20 minutes in 4% SDS, 0.5 ⁇ SSC, and once at room temperature for 5 minutes in 2 ⁇ SSC.
  • the identity of two nucleotide sequences can be determined by visual inspection and mathematical calculation, or more preferably, this comparison is made by comparing the sequence information using a computer program.
  • a typical preferred computer program is the Wisconsin package, version 10.0 program “GAP” from the Genetics Computer Group (GCG; Madison, Wis.) (Devereux, et al., 1984, Nucl. Acids Res. , 12: 387).
  • GAP Genetics Computer Group
  • GAP GCG run of an unary comparison matrix for nucleotides (including values of 1 for identical and 0 for non-identical), and Schwartz and Dayhoff supervised “Atlas of Polypeptide Sequence and Structure” National Biomedical Research Foundation, pages 353-358, 1979, Gribskov and Burgess, Nucl. Acids Res. 14: 6745, 1986 weighted amino acid comparison matrix; or other comparable comparison matrix; (2) 30 penalties for each gap of amino acids and one additional penalty for each symbol in each gap; or nucleotide sequence Includes 50 penalties for each gap and an additional 3 penalties for each symbol in each gap; (3) no penalty to end gaps; and (4) no maximum penalty for long gaps.
  • sequence comparison programs used by those skilled in the art are available, for example, at the National Library of Medicine website: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bls.html
  • a BLASTN program, version 2.2.7, or UW-BLAST 2.0 algorithm can be used. Standard default parameter settings for UW-BLAST 2.0 are described at the following Internet site: http://blast.wustl.edu.
  • the BLAST algorithm uses a BLOSUM62 amino acid scoring matrix and the selection parameters that can be used are: (A) Segments of query sequences with low compositional complexity (Woughton and Federhen SEG program (Computers and Chemistry, 1993); Woton and Federhen, 1996 “Analysis of compositional weight region in sequence database (Analysis of compositionally-biased in sequence data bases): 71-66”.
  • E-score Karlin and Altschul, 1990
  • the preferred E-score threshold value is 0.5 or, in order of increasing preference, 0.25, 0.1, 0.05, 0.01, 0.001, 0 .0001, 1e-5, 1e-10, 1e-15, 1e-2 A 1e-25,1e-30,1e-40,1e-50,1e-75 or 1e-100,.
  • the present invention provides a construct comprising the above-described nucleic acid and promoter.
  • the term “construct” refers to a conjugate in which a plurality of nucleic acids are linked.
  • the above-described nucleic acids and promoters are included as structural units.
  • the nucleic acid and the promoter do not need to be directly linked, and may be indirectly linked via another type of nucleic acid.
  • the promoter is preferably operably linked to the nucleic acid of the invention. “Operably linked” means that the promoter is linked so as to exert its function, ie, transcription of the nucleic acid of interest.
  • the promoter is not particularly limited as long as the target nucleic acid can be transcribed in plant cells.
  • Examples of such promoters include cauliflower mosaic virus 35S promoter (CaMV35S), various ubiquitin promoters, various actin promoters, tobacco PR1a gene promoter, nopaline synthase gene promoter, napin gene promoter, oleosin gene promoter, and the like.
  • a promoter having a function of allowing site-specific expression in plants can also be used.
  • promoters that specifically express nucleic acids eg, rice psb0 gene promoter (Japanese Patent Laid-Open No. 2010-166924)
  • promoters that specifically express nucleic acids eg, Arabidopsis FA6 promoter ( Gupta et al. 2012 Plant Cell Rep. 31:) 839-850.
  • Root-specific promoters e.g., RCc3 promoter (Xu et al. And promoters expressed in root, stem, and leaf vegetative organs (for example, Arabidopsis AS promoter: Non-Patent Document 1) and the like.
  • an inducible promoter can also be used.
  • promoters are expressed by external factors such as infection and invasion of filamentous fungi, bacteria, viruses, low temperature, high temperature, drying, ultraviolet irradiation, and spraying of specific compounds such as hormones such as auxin and brassinosteroid. Promoters and the like known to be known. Examples of such promoters include promoters of rice chitinase genes (XuXet al. 1996 Plan Mol. Biol. 30: 387) expressed by infection and invasion of filamentous fungi, bacteria, and viruses, and promoters of tobacco PR protein genes. (Ohshima et al.
  • Vector The present invention provides a vector comprising the construct described above. That is, the present invention provides a vector comprising an operably linked promoter and the nucleic acid of the present invention.
  • a vector can be conveniently prepared by ligating a desired nucleic acid to a recombination vector available in the art by a conventional method.
  • a plant transformation vector is particularly useful when the plant biomass is increased using the nucleic acid of the present invention.
  • the vector used in the present invention is not particularly limited as long as it can be used to achieve the intended effect of the present invention in plant cells.
  • pBI vectors include pBI121, pBI101, pBI101.2, pBI101.3, pBI221, and the like.
  • a binary vector such as a pBI vector is preferable in that a target nucleic acid can be introduced into a plant via Agrobacterium.
  • pBluescript vectors include pBluescript SK (+), pBluescript SK (-), pBluescript II KS (+), pBluescript II KS (-), pBluescript II SK (+), pBluescript II SK (-). Etc.
  • pUC vectors include pUC19 and pUC119. The pBluescript vector and the pUC vector are preferable in that a nucleic acid can be directly introduced into a plant.
  • binary vectors such as pGreen series (www.pgreen.ac.uk) and pCAMBIA series (www.cambia.org), pSB11 (Komari et al, 1996, Plan J, 10: 165-174), pSB200 (Komori) et al, 2004, Plant 37, 37: 315-325) and the like can also be preferably used.
  • the vector preferably includes a transcription terminator sequence including a polyadenylation site necessary for the stabilization of the transcript.
  • a transcription terminator sequence including a polyadenylation site necessary for the stabilization of the transcript.
  • One skilled in the art can appropriately select a transcription terminator sequence.
  • the transcription terminator sequence is not particularly limited as long as it has a function as a transcription termination site, and may be a known one.
  • the transcription terminator sequence can be selected according to the promoter to be used.
  • the transcription termination region of the cauliflower mosaic virus 35S (CaMV35S terminator) the transcription termination region of the nopaline synthase gene (Nos terminator), and the like can be used.
  • CaMV35S terminator the transcription termination region of the cauliflower mosaic virus 35S
  • Nos terminator nopaline synthase gene
  • the above-described recombinant expression vector by arranging the transcription terminator sequence at an appropriate position, it is possible to prevent the occurrence of a phenomenon of unnecessarily synthesizing a long transcript after being introduced into a plant cell.
  • the recombinant expression vector may further contain other nucleic acid segments.
  • the other nucleic acid segment is not particularly limited, and examples thereof include a transformant selection marker, an enhancer, and a base sequence for improving translation efficiency.
  • the recombinant expression vector may further have a T-DNA region.
  • the T-DNA region can increase the efficiency of gene transfer particularly when Agrobacterium is used to introduce the recombinant expression vector into a plant body.
  • a drug resistance gene can be used as a transformant selection marker.
  • drug resistance genes include, for example, drug resistance genes for hygromycin, bleomycin, kanamycin, gentamicin, chloramphenicol, etc. (neomycin phosphotransferase that is resistant to the antibiotics kanamycin or gentamicin. Gene, hygromycin phosphotransferase gene, which is resistant to hygromycin).
  • a phosphinothricin acetyltransferase gene resistant to the herbicide phosphinothricin can be used. Thereby, the transformed plant body can be easily selected by selecting the plant body that grows in the medium containing the antibiotic or the herbicide.
  • nucleotide sequences for improving translation efficiency include omega sequences derived from tobacco mosaic virus. By placing this omega sequence in the untranslated region (5′UTR) of the promoter, the translation efficiency of the fusion gene can be increased.
  • examples of the enhancer include an enhancer region including an upstream sequence in the CaMV35S promoter.
  • various nucleic acid segments can be included in the recombinant expression vector according to the purpose.
  • the method for constructing the recombinant expression vector is also not particularly limited, and the nucleic acid, promoter, and terminator sequences in the present invention, and other DNA segments as required are preliminarily added to the appropriately selected parent vector. What is necessary is just to introduce so that it may become an order.
  • a method of cleaving the purified nucleic acid with a suitable restriction enzyme and inserting it into a restriction enzyme site or a multicloning site of a suitable vector is used according to a conventional method ( For example, Molecular Cloning, 5.61-5.63).
  • the present invention provides a host cell (in other words, a host cell into which the nucleic acid of the present invention has been introduced) comprising the above-described vector.
  • the host cell of the present invention is not particularly limited, but is preferably a plant cell.
  • the plant cells include various forms of plant cells such as suspension culture cells, protoplasts, cells in plants, and the like.
  • Plant cells are not particularly limited, but dicotyledonous or monocotyledonous cells can be used.
  • dicotyledonous plants include Arabidopsis, soybean, cotton, rapeseed, sugar beet, tobacco, tomato, radish, grape, poplar, etc.
  • Arabidopsis, soybean, cotton, rapeseed, tobacco and tomato are preferred.
  • Preferred are Arabidopsis, soybean, cotton and rapeseed.
  • Examples of monocotyledonous plants include rice, corn, wheat, barley, sorghum, sugar cane, onion, and the like. Among these, rice, corn, wheat, and sorghum are preferred, and rice and corn are more preferred.
  • Nucleic acids derived from various plant species can also be used in the present invention, and in the present invention, the plant species from which the nucleic acid is derived may coincide with the plant species from which the host cell (plant cell) is derived, or It may be different. That is, the present invention relates to a host cell (plant cell) introduced with a nucleic acid derived from the same plant species as the plant species of the host cell (plant cell) or a vector containing the same, and the plant species of the host cell (plant cell) Can provide any of host cells (plant cells) introduced with nucleic acids derived from different plant species or vectors containing the same.
  • a host cell of the dicotyledonous plant may be selected, and when the plant from which the nucleic acid is derived is a monocotyledonous plant, A cotyledon host cell may be selected.
  • the nucleic acid is incorporated into an appropriate vector, for example, polyethylene glycol method, Agrobacterium method, liposome method, cationic liposome method, calcium phosphate precipitation method, electric pulse perforation method. (Electroporation) (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons.Section 9.1-9.9), lipofection method (GIBCO-BRL), microinjection method, particle gun method And the like, and a method for introduction into a living body by a method known to those skilled in the art.
  • the Agrobacterium method can be preferably used.
  • the nucleic acid When introducing a nucleic acid into a plant cell, the nucleic acid can be directly introduced using a microinjection method, electroporation method, polyethylene glycol method, etc., but it is incorporated into a plasmid for gene introduction into a plant, A vector can also be indirectly introduced into a plant cell via a virus or bacterium capable of infecting a plant. Examples of such viruses include cauliflower mosaic virus, tobacco mosaic virus, gemini virus, and the like as typical viruses, and examples of bacteria include Agrobacterium. When introducing a gene into a plant by the Agrobacterium method, a commercially available plasmid can be used.
  • the present invention provides a plant into which the above vector has been introduced (in other words, a plant into which the nucleic acid according to the present invention has been introduced).
  • the host cell of the present invention is a plant cell
  • the plant cell is included in the plant of the present invention (transformed plant).
  • the plant of the present invention includes not only plant cells but also whole plant bodies, plant organs (for example, roots, stems, leaves, petals, seeds, fruits, mature embryos, immature embryos, ovules, ovaries, shoot tips, cocoons, Pollen, etc.), plant tissues (eg, epidermis, phloem, soft tissue, xylem, vascular bundle, etc.), any of these sections, callus, shoot primordia, seedlings, polyblasts, hairy roots, cultured roots, etc. Is also included.
  • plant organs for example, roots, stems, leaves, petals, seeds, fruits, mature embryos, immature embryos, ovules, ovaries, shoot tips, cocoons, Pollen, etc.
  • plant tissues eg, epidermis, phloem, soft tissue, xylem, vascular bundle, etc.
  • any of these sections callus, shoot primordia, seedlings, polyblast
  • the plant of the present invention is a dicotyledonous plant or a monocotyledonous plant.
  • the dicotyledonous plants include Arabidopsis, soybean, cotton, rapeseed, sugar beet, tobacco, tomato, radish, grape, poplar, etc.
  • Arabidopsis, soybean, cotton, rapeseed, tobacco and tomato are preferred.
  • Preferred are Arabidopsis, soybean, cotton and rapeseed.
  • Examples of monocotyledonous plants include rice, corn, wheat, barley, sorghum, sugar cane, onion, and the like. Among these, rice, corn, wheat, and sorghum are preferred, and rice and corn are more preferred.
  • the species may be the same as or different from the plant species from which the nucleic acid to be introduced is derived. That is, the present invention relates to a plant into which a nucleic acid derived from a plant of the same species or a vector containing the same has been introduced (a plant into which a nucleic acid or a vector containing the same has been introduced, wherein the species of the plant is derived from the nucleic acid.
  • the plant that is the same as the plant species, and a plant into which a nucleic acid derived from a plant of a different species or a vector containing the same has been introduced (a plant into which a nucleic acid or a vector containing the same has been introduced, Any of the above-mentioned plants that are different from the plant species from which the nucleic acid is derived can be provided.
  • the introduction destination plant may be a dicotyledonous plant
  • the plant from which the nucleic acid is derived is a monocotyledonous plant
  • the previous plant may be a monocotyledonous plant.
  • the present invention can provide the following plants.
  • a dicotyledonous plant into which a nucleic acid derived from a monocotyledonous plant or a vector containing the nucleic acid has been introduced.
  • a monocotyledonous plant introduced with a nucleic acid derived from a monocotyledonous plant or a vector containing the nucleic acid preferably (I) a monocotyledonous plant introduced with a nucleic acid derived from a monocotyledonous plant or a vector containing the nucleic acid, (Ii) a monocotyledonous plant introduced with a nucleic acid derived from a dicotyledonous plant or a vector containing the same, and (iii) a dicotyledonous plant introduced with a nucleic acid derived from a dicotyledonous plant or a vector containing the same, And more preferably (I) a monocotyledonous plant into which a nucleic acid derived from a monocotyledonous plant or
  • the plant of the present invention includes a plant grown with plant cells introduced with the nucleic acid of the present invention or a vector containing the same, a plant that is a progeny, descendant or clone of the plant, and a propagation material thereof (for example, , Seeds, fruits, cuttings, tubers, tuberous roots, strains, callus, protoplasts, etc.).
  • a propagation material thereof for example, , Seeds, fruits, cuttings, tubers, tuberous roots, strains, callus, protoplasts, etc.
  • Regeneration of plant bodies from transformed plant cells can be performed by methods known to those skilled in the art depending on the type of plant cells.
  • the above technique has already been established and widely used in the technical field of the present invention, and the above method can be suitably used in the present invention.
  • the method of regenerating a plant body by redifferentiating transformed plant cells differs depending on the type of plant cell.
  • the method of Fujimura et al. (PlantPlanTissue Culture Lett. 2:74 (1995))
  • Examples of corn include the method of Shillito et al. (Bio / Technology 7: 581 (1989)) and the method of Gorden-Kamm et al. (Plant Cell 2: 603 (1990)).
  • the presence of the introduced foreign nucleic acid in the transformed plant that has been regenerated and cultivated by the above method is confirmed by a known PCR method or Southern hybridization method, or by analyzing the base sequence of DNA in the plant body. can do.
  • extraction of DNA from the transformed plant can be carried out according to a known method of J. Sambrook et al. (Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
  • an amplification reaction is performed using the DNA extracted from the regenerated plant as a template as described above.
  • the nucleic acid of the present invention or a synthesized oligonucleotide having a nucleotide sequence appropriately selected according to the nucleotide sequence of the modified nucleic acid can be used as a primer, and an amplification reaction can be carried out in a reaction mixture in which these are mixed. .
  • amplification reaction when DNA denaturation, annealing, and extension reactions are repeated several tens of times, an amplification product of a DNA fragment containing the nucleotide sequence of the target nucleic acid can be obtained.
  • reaction solution containing the amplified product is subjected to, for example, agarose electrophoresis, it is possible to confirm that the amplified DNA fragments are fractionated and that the DNA fragments correspond to the gene of the present invention.
  • the present invention includes a plant cell into which the nucleic acid according to the present invention or a recombinant expression vector containing the same is introduced, a plant body containing the cell, a progeny and clone of the plant body, and a plant body, its progeny and clone Contains breeding material.
  • a progeny plant such as “T0 generation” which is a regenerated generation that has undergone transformation treatment or “T1 generation” which is a seed of a T0 generation plant, or a hybrid plant mated with them as one parent And its progeny plants.
  • the plant of the present invention includes a native promoter that controls the bil7 gene of a wild-type plant (including plants into which the nucleic acid of the present invention (for example, bil7 gene) has not been introduced from the outside). Also included are so-called “site-specific transformants” substituted with the various promoters described above. Such a plant has a characteristic that biomass is increased by increasing the expression of the bil7 gene originally possessed by the replaced promoter. In the present invention, as a result, a plant in which a predetermined nucleic acid (for example, bil7 gene) is strongly expressed (overexpressed) in the plant is included as one aspect. Therefore, such a site-specific transformant is also a subject of the present invention. Can be. As a method for producing such a plant, known genome editing techniques such as the CRISPR method, the ZFN method, and the TAL effector nuclease (TALEN) method can be used.
  • the transformed plant produced in this manner is expected to have an advantageous characteristic that biomass is increased as compared with a normal plant.
  • the plant used as a subject to be transformed in the present invention is not particularly limited, and various transformed plants with increased biomass can be produced by the method of the present invention.
  • the present invention provides a method for increasing plant biomass comprising the step of introducing the above-described nucleic acid into a plant. More specifically, the method of the present invention comprises a step of producing a vector comprising the nucleic acid of the present invention and a promoter operably linked thereto, a step of introducing the vector into a host cell (plant cell), and a nucleic acid.
  • This is a method for increasing plant biomass, comprising the step of regenerating a plant from a plant cell into which is introduced.
  • the method of the present invention can be obtained by utilizing the activity of increasing the plant biomass of the protein encoded by the nucleic acid of the present invention.
  • nucleic acid not only the above nucleic acid but also a vector containing the nucleic acid may be introduced into the plant.
  • the method for introducing a nucleic acid or a vector containing the nucleic acid into a plant is as described above, and the nucleic acid can be introduced into a plant through introduction into a host cell (plant cell).
  • the types of plants targeted by the method of the present invention and the relationship with the plant species from which the nucleic acid to be introduced is derived are as described above, and other terms, materials, techniques, etc. to be considered in the method are also included. Interpreted according to the above explanations and definitions.
  • the present invention provides a method for producing a plant with increased biomass, including the step of introducing the above-described nucleic acid into a plant. More specifically, the method of the present invention comprises a step of producing a vector comprising the nucleic acid of the present invention and a promoter operably linked thereto, a step of introducing the vector into a host cell (plant cell), and a nucleic acid.
  • This is a method for producing a plant with increased biomass, comprising a step of regenerating a plant from a plant cell into which is introduced.
  • the method of the present invention can be obtained by utilizing the activity of increasing the plant biomass of the protein encoded by the nucleic acid of the present invention.
  • nucleic acid not only the above nucleic acid but also a vector containing the nucleic acid may be introduced into the plant.
  • the method for introducing a nucleic acid or a vector containing the nucleic acid into a plant is as described above, and the nucleic acid can be introduced into a plant through introduction into a host cell (plant cell).
  • the types of plants targeted by the method of the present invention and the relationship with the plant species from which the nucleic acid to be introduced is derived are as described above, and other terms, materials, techniques, etc. to be considered in the method are also included. Interpreted according to the above explanations and definitions.
  • the present invention provides a screening method for plants with increased biomass using the protein or nucleic acid described above, and the method includes the following steps. (1) a step of measuring the expression level of the protein of the present invention or a nucleic acid encoding the same in a test plant and a wild type plant, (2) A step of comparing the expression levels obtained in step (1), and (3) a step of selecting a test plant that shows an expression level higher than that in a wild type plant.
  • the form of the plant targeted in the screening method of the present invention includes not only plant cells but also the whole plant, plant organs (for example, roots, stems, leaves, petals, seeds, fruits, mature embryos, as described above. , Immature embryo, ovule, ovary, shoot tip, bud, pollen, etc.), plant tissue (eg, epidermis, phloem, soft tissue, xylem, vascular bundle, etc.), these slices, callus, shoot primordia, seedling.
  • polyblasts, hairy roots, cultured roots, and the like are included, but from the viewpoint of performing screening, these are particularly preferably in a state before the plant becomes a mature body or in a young state. Therefore, seeds (ripe seeds, immature seeds), mature embryos, immature embryos, callus, shoots, seedlings, and the like are particularly preferred plant forms in the screening method of the present invention.
  • a wild-type plant is a phenotypic strain or individual found most frequently among target plants, and refers to a plant species that has not been subjected to any genetic manipulation. Any of the above forms can be used as the form of the wild type plant, but it is preferable to match the form of the test plant.
  • a method for measuring the expression level of protein or nucleic acid a method well known in the art can be used.
  • proteins are extracted from plants, antibodies against the proteins in the present invention (for example, BIL7 proteins of various plants) are prepared or obtained, and Western blotting, immunoassay (ELISA, etc.) or these using these antibodies
  • the expression level can be measured by performing the method according to the above.
  • the antibody used may be either a monoclonal antibody or a polyclonal antibody, and the antibody may be an antibody molecule itself or a fragment such as Fab, Fab ′, or F (ab ′) 2. There may be.
  • known isotopes, enzymes, fluorescent substances, luminescent substances and the like are used.
  • RNA is extracted from a plant, and a primer that can specifically amplify the nucleic acid based on the nucleotide sequence of the nucleic acid in the present invention (for example, bil7 gene of various plants), or specific A probe that can be detected in this manner is prepared or obtained, and the expression level thereof can be measured by performing RT-PCR, Northern blotting or a method according to these using the primer or probe.
  • a primer that can specifically amplify the nucleic acid based on the nucleotide sequence of the nucleic acid in the present invention (for example, bil7 gene of various plants), or specific A probe that can be detected in this manner is prepared or obtained, and the expression level thereof can be measured by performing RT-PCR, Northern blotting or a method according to these using the primer or probe.
  • the expression level of protein or nucleic acid may be qualitative or quantitative, but is preferably quantified as a numerical value (measurement value).
  • the expression level obtained from the test plant and the wild type plant can be compared with each other, and when the expression level in the test plant is higher than the expression level in the wild type plant, it can be determined that the biomass of the plant increases. By selecting a test plant, it is possible to screen for a plant having an increased plant biomass.
  • the present invention provides a method for determining a plant with increased biomass using the protein or nucleic acid described above, and the method includes the following steps. (1) a step of measuring the expression level of the protein of the present invention or a nucleic acid encoding the same in a test plant and a wild type plant, (2) A step of comparing the expression levels obtained in step (1), and (3) a step of confirming that the expression level in the test plant is higher than the expression level in the wild type plant.
  • the determination method of the present invention is synonymous with using the protein or nucleic acid of the present invention as a marker (protein marker or nucleic acid marker). That is, when the protein or nucleic acid in the present invention is detected in a plant and the expression level is higher than the expression level in the wild type, the plant is expected to increase the plant biomass.
  • the form of the plant targeted in the determination method of the present invention is the same as the above-described screening method, and includes all the parts exemplified above as the form, but in particular, the state before the plant becomes a mature body, Or the form in a young state is preferable. Therefore, seeds (ripe seeds, immature seeds), fully mature embryos, immature embryos, callus, shoots, seedlings, and the like are particularly preferable plant forms in the determination method of the present invention.
  • the expression level of the protein or nucleic acid may be qualitative or quantitative, but is preferably quantified as a numerical value (measurement value).
  • Example 1 Selection of bil7 mutant FOX hunting system (Full-length cDNA Over-expression Gene Hunting System) reveals DNA functions from changes in traits caused by introducing full-length cDNA into plants and causing high expression (WO03 / 018808).
  • Arabidopsis Arabidopsis thaliana
  • FOX line STYLE 1
  • BR brassinosteroid
  • wild-type Arabidopsis A line showing a bil (Brz-insensitive-long-hypocothl) morphology in which the hypocotyl extends compared to Arabidopsis thaliana was selected.
  • a plant exhibiting a bil form in the dark in the presence of Brz is considered to have Brz resistance.
  • the selection is performed until the second selection, and it is confirmed that the selected F1 generation plant produced by back crossing with the wild type shows bil morphology in the presence of Brz, and the bil mutation is a dominant trait. I confirmed it. Since the FOX line is a gain-of-function mutant, the dominant mutation was considered to indicate that the cause of the mutation was derived from FOX.
  • bil7-1D (Brz-insensitive-long-hypocothl 7-1D), and the analysis was advanced.
  • the hypocotyl elongation of bil7-1D in the dark in the presence of Brz 3 ⁇ M is about 2.5 times that of the wild type, and the gain-of-function mutant bil1-1D / bzr1-1D of the master transcription factor BIL1 / BZR1 for BR signaling This was considered to be a strong Brz-resistant mutation trait equivalent to a positive control showing Brz (FIG. 1).
  • Example 2 Isolation and identification of bil7-1D mutation-causing gene From morphological analysis of bil7-1D plant, it was speculated that mutation-causing gene BIL7 causes growth promotion forms such as flower stem elongation and activation of BR information transmission. . Therefore, bil7-1D mutation gene BIL7 was isolated and analyzed for homologous proteins and functional domains. Subsequently, a BIL7 high expression transformant (BIL7-OX) was prepared, and it was confirmed that the bil7-1D form was reproduced by high expression of the BIL7 candidate gene, and the BIL7 gene was confirmed.
  • BIL7-OX BIL7 high expression transformant
  • Rosetta leaves were collected from the bil7-1D mutant, and genomic DNA was extracted using Nucleon® DNA® Extraction® Kit (Amersham). Next, PCR was performed on the extracted DNA.
  • the PCR reaction solution, reaction conditions, and primers are as follows.
  • This BIL7 candidate gene was analyzed by real-time RT-PCR.
  • Total RNA was extracted from the plant body using RNeasy® Plant® Mini® Kit (QIAGEN).
  • a reaction solution was prepared using Takara PrimeScript RT RT Kit (Perfect Realtime), and cDNA was synthesized by cDNA reaction (37 ° C. 15 min, 85 ° C. 5 ° sec, 4 ° C. end).
  • Real-time PCR was performed under the following conditions using the thus synthesized cDNA as a template.
  • BIL7 candidate gene in bil7-1D was increased by about 40 times or more compared to the wild type (FIG. 5). Together with this result and bil7-1D being a dominant mutant, it was suggested that overexpression of BIL7 candidate gene is responsible for bil7-1D.
  • BIL7 had N-myristoylation prediction site and N-glycosylation prediction site in its sequence. There were no other domains that could predict function. The transmembrane region was not recognized, and the nuclear localization was inferred from the presence of a nuclear translocation signal (NLS).
  • NLS nuclear translocation signal
  • BIL7 Three types of BIL7 homologous proteins existed in Arabidopsis thaliana. Other species are homologous in a wide range of plant species such as radish (Raphanus sativus), soybean (Glycine max), poplar (Populus trichocarpa), grape (Vitis vinifera), rice (Oryza sativa), and Physcomitella patens. It was clarified that there is a protein with high. These were all new and unknown proteins with no reports. Moreover, among these homologous protein groups, a region with particularly high conservation was observed. Based on this region, amino acids showing further homology were examined, but there was no protein whose function could be estimated. In addition, the sequence portion of the myristoylation prediction site was relatively conserved in other genes, suggesting that the function of BIL7 may be related to a common function in these proteins.
  • BIL7-OX BIL7 high expression transformant
  • BIL7-OX BIL7 high expression transformant
  • the amplified BIL7 was cloned into an entry vector (pENTR) using “pENTER / D TOPO cloning kit” (Invitrogen).
  • the prepared pENTR vector was introduced into pGWB80 containing the 35S promoter and pGWB80 containing the RNAi construct using the Gateway LR Clonase IIenzyme mix (Invitrogen) by Gateway techonology, and the transformation vector pGWB2-BIL7 in which BIL7 was inserted pGWB80-BIL7-RNAi was obtained.
  • the prepared vector was introduced into Agrobacterium, and wild type Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) was transformed by the flower-dipping method.
  • 2 ⁇ l of the prepared vector was added to 50 ⁇ l of Agrobacterium competent cell, mixed and allowed to stand on ice for 30 minutes. After standing in liquid nitrogen for 1 minute, it was melted at 37 ° C. for 1 minute. After adding 250 ⁇ l of YEP liquid medium and culturing at 28 ° C. for 1 hour, it was plated on YEP medium containing kanamycin, hygromycin 50 ⁇ g / ml, and rifampicin 100 ⁇ g / ml, and the presence or absence of vector introduction was confirmed by colony PCR.
  • the Agrobacterium colonies into which the vector had been introduced were cultured overnight in a YEP liquid medium, and then the culture was scaled up to 500 ml and cultured overnight.
  • the culture solution was centrifuged at 5000 rpm for 10 minutes to remove the supernatant, and then suspended in an MS medium containing 5% (w / v) sucrose.
  • the wild type from which the pod was removed was transformed by the flower dipping method.
  • the obtained T1 seeds were selected in an MS medium containing kanamycin 25 ⁇ g / ml to obtain a BIL7 high expression transformant (BIL7-OX) and a BIL7 expression suppression transformant (BIL7-RNAi) (FIG. 6). ).
  • the morphological features found in bil7-1D described in Example 1 were investigated (FIGS. 7 and 8).
  • the rosette leaf morphology observed in bil7-1D was not observed in BIL7-OX1 having a low BIL7 expression level, but was observed only in BIL7-OX2 having a high BIL7 expression level (FIG. 7A).
  • the flower stem length and the number of secondary flower stems tended to be promoted as the BIL7 expression level increased (FIGS. 7A, B, and 8D).
  • the number of flower stalks that was almost the same as that of the wild type in bil7-1D tended to decrease slightly due to increased expression of BIL7 (FIG. 8C).
  • the higher the expression of BIL7 the smaller the number of normal sheaths, but the seed weight increased as in bil7-1D (FIGS. 8B, E, F).
  • Example 3 Transformation of Rice BIL7 Homologous Gene OsBIL7 into Rice For the BIL7 homologous gene OsBIL7 in rice, a vector connected to the downstream of the ubiquitin promoter that is a constitutive expression promoter in rice was constructed and transformed into rice. It was.
  • the rice BIL7 homologous gene OsBIL7 was cloned. Rice Japanese wild wild type total RNA was extracted with Qiagen's RNAeasyplant kit. Next, cDNA was synthesized from this using Invitrogen's SuperScript II kit. Using this cDNA as a template, OsBIL7 was amplified by PCR using the following primers.
  • the amplified OsBIL7 was cloned using "pENTER / D TOPO cloning kit” (Invitrogen).
  • Example 4 Evaluation of Biomass in Transformant of Rice Variety “Yukihikari” Overexpressed OsBIL7 Gene
  • the vector constructed in Example 3 was transformed into rice (cultivar: Yukihikari) via Agrobacterium LBA4404 strain did.
  • pSB4 Yamaari et al. 1996 Plant J 10: 165-174) was transformed. Transformation was performed according to the method of Hiei et al. (2008 Plant J 6: 271-282).
  • the concentration of hygromycin in the selection medium, regeneration medium and rooting medium was 30 ⁇ g / ml.
  • Cultivation evaluation of the obtained transformant for the present generation was performed in a greenhouse dedicated to recombinant plants of Japan Tobacco Inc. Plant Innovation Center.
  • the day length was 14.5 hours, and the temperature was 28 ° C for daytime and 21 ° C for nighttime.
  • Eighteen days after potting from the plant box 36 seedlings with good growth were selected and transplanted one by one into a polypot (diameter 12 cm, capacity: 830 cc).
  • PCR was performed on the OsBIL7 gene and the hygromycin resistance gene. As a result, the absence of the OsBIL7 gene was confirmed in 4 individuals.
  • none of the 36 control vector seedlings lacked the hygromycin resistance gene.
  • FIG. 10 shows the growth of seedlings immediately before transplanting to a polypot
  • FIG. 11 shows the state of maturity.
  • the OsBIL7 recombinant had the following characteristics compared to the control vector recombinant.
  • the culm length was 14cm high, the pan length was 4.6cm long, and the number of one grain increased by 23. Since the seed fertility was the same, the number of seeds per panicle increased by 20 grains.
  • One panicle weight increased by 0.66 kg (170%), and the total panicle weight also increased by 2.00 kg (135%).
  • the above-ground dry weight increased by 5.00 kg (140%).
  • the BIL7 gene coding region of the BIL7 gene cDNA clone (pENTR entry vector) constructed in Example 2 was amplified by PCR and ligated downstream of the ubiquitin promoter of the binary vector for rice transformation used in Example 3.
  • the primers used for PCR are as follows.
  • the obtained construct Ubi-AtBIL7 was transformed into rice (cultivar: Yukihikari) via Agrobacterium LBA4404 strain.
  • p121Hm vector a T-DNA region containing a “CaMV35S promoter, hygromycin resistance gene, NOS terminator” cassette
  • the transformation was performed according to the method of Hiei et al. (2008-Plant J-6: 271-282).
  • the concentration of hygromycin in the selection medium, regeneration medium and rooting medium was 30 ⁇ g / ml.
  • Cultivation evaluation of the obtained transformant for the present generation was performed in a greenhouse dedicated to recombinant plants of Japan Tobacco Inc. Plant Innovation Center.
  • the day length was 14.5 hours, and the temperature was 28 ° C for daytime and 21 ° C for nighttime.
  • the plants were raised from the plant box, and 36 seedlings with good growth after 20 days were selected for each seedling and transplanted to a polypot (diameter: 12 cm, capacity: 830 cm), one seedling per pot.
  • a PCR assay was performed on the BIL7 gene and the hygromycin resistance gene for all 72 recombinants including the control.
  • the measured traits were plant height 5 weeks after potting, the longest culm flag length, culm length, ear number, ear length, 1 ear grain number, 1 ear per pod seed grain weight, 1 per pod seed grain weight, 1 ear weight , Total panicle weight, aboveground dry weight, total weight.
  • the length of the heel was measured by measuring the length of the longest heel.
  • the number of spikes the number of spikes excluding delayed spikes was investigated.
  • Senju-shige was calculated by multiplying 1000 by the value obtained by dividing the weight of 1 pods by the number of pods.
  • the BIL7 recombinant had the following characteristics compared to the control vector recombinant.
  • One panicle weight increased by 0.48 kg (146%).
  • the total panicle weight also increased by 1.34 kg (120%), and finally the total bark weight corresponding to seed yield increased by 1.18 kg (120%).
  • the above-ground dry weight increased by 3.77 kg (128%).
  • Example 6 Evaluation of biomass in maize transformants overexpressing the OsBIL7 gene
  • the vector constructed in Example 3 was transformed into maize (Agrobacterium LBA4404 strain) according to the method of Ishida et al. (2007). Variety: A188) was transformed.
  • the obtained transformant was cultivated in a recombinant greenhouse of Japan Tobacco Inc. Plant Innovation Center.
  • the day length was 14.5 hours, and the temperature was a day temperature of 28 ° C and a night temperature of 20 ° C.
  • the extracted male ear was excised before flowering.
  • Pollen collected from untransformed corn (variety: A188) was crossed to silk thread sufficiently extracted from the ears to obtain T1 seeds. The seeds were used to evaluate biomass-related traits.
  • the evaluation test 6 out of 25 seeded seeds were tested in consideration of the PCR test results of the OsBIL7 gene and hygromycin resistance gene in the T0 generation, the grass shape, the number of seeds, and the seed weight.
  • the evaluation test was divided into two times (first time: 3 lines, second time: 3 lines, total 6 lines).
  • One seed per line 25 lines per line, 25 pots in total was seeded in a polypot with a capacity of 570 ml. From 17 to 18 days after sowing, a part of the leaf was cut out and immersed in a hygromycin solution, and the resistance and sensitivity of hygromycin were examined.
  • the present invention is useful in industrial fields where biomass can be used, such as food, energy, and environmental fields. By using the present invention, it is possible to effectively increase plant biomass.

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Abstract

　本発明は、植物のバイオマスを効果的に増大させる新規遺伝子を同定し、当該遺伝子をその利用技術と共に提供することを目的とする。　本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含み、配列番号７又は１１で表されるアミノ酸配列と２５％以上の同一性又は７５％以上の類似性を有するアミノ酸配列を含み、植物のバイオマスを増大させる活性を有することを特徴とするタンパク質をコードする核酸およびその利用技術を提供する。

Description

植物のバイオマスを増大させる新規遺伝子及びその利用
　本発明は、植物のバイオマスを増大させる新規遺伝子に関し、より詳細には、当該遺伝子が導入された植物、当該遺伝子を用いて植物のバイオマスを増大させる方法、及び当該遺伝子を用いてバイオマスが増大した植物を作製する方法などに関する。
　バイオマスとは、一般に、特定の時点においてある空間に存在する生物（bio）の量を物質の量（mass）として表現したものと理解されている。バイオマスは、日本語では「生物体量」または「生物量」の語が用いられる場合があり、生態学では「現存量（standing crop）」と呼ばれることもある。バイオマスの数値化は、通常、質量又はエネルギー量で行われるが、単位面積当たりの該当生物の乾重量で表されることもある。バイオマスにおいては、多くの場合、植物が利用されており、植物のバイオマスを増大させることは、バイオ燃料や再生可能エネルギーの提供のみならず、農作物の生産量を上昇させる点で食料供給の安定化にも有用であると考えられている。
　植物バイオマスの増大に関して、産業上有益な植物の新品種を開発するために、植物同士を交配させて後代を選抜する交配育種法や、植物に突然変異を誘発させる突然変異育種法などが従来行われている。また近年では、有用遺伝子を植物に導入してその機能を発現させる遺伝子組換え植物も開発されている。このような新品種の開発のためには優れた性質を付与し得る遺伝子を集積する方法が有効であるが、作物のさらなる生産性の向上が望まれる状況にあって、利用できる遺伝子の種類は未だ少なく、特に多収形質等のバイオマスの増大に関与する遺伝子については、その特定が望まれている。
　植物の生育促進には多くの場合、植物ホルモンが影響を及ぼしており、その一つとしてブラシノステロイドが知られている。ブラシノステロイドは、ステロイド骨格を有する化合物の一群であり、代表的なものとしてブラシノリドがある。植物の生育に関し、ブラシノステロイドは、（ｉ）茎、葉及び根の伸長成長促進、（ｉｉ）細胞分裂促進、（ｉｉｉ）葉肉細胞から導管又は仮導管への分化促進、（ｉｖ）エチレン合成促進、（ｖ）種子の発芽促進、並びに（ｖｉ）環境ストレスへの耐性付加などの作用を有している。このようなブラシノステロイドの生理活性を利用し、ブラシノステロイド生合成遺伝子をイネに導入することによってその収量を増加させる試みが行われている（非特許文献１）。しかしながら、その効果は必ずしも十分なものとはいえなかった。また、ブラシノステロイドの合成や情報伝達に関する遺伝子はこれまでにいくつか同定されているが、植物のバイオマス増大を十分に実現する遺伝子の特定には未だ至っていない。
Chuan-yin Wu et al. The Plant Cell, 2008, 20(8):2130-2145
　上述したように、植物のバイオマスを増大させる遺伝子、特に種子収量を向上させる遺伝子の探索は、未だ十分であるとはいえない。このため、植物のバイオマスを効果的に増大させる新規な遺伝子を見出し、当該遺伝子を利用した技術を開発すること、例えば、当該遺伝子を利用してバイオマスを増大させた植物体を開発すること等が強く求められている。
　本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、植物のバイオマスを効果的に増大させる新規遺伝子を同定し、当該遺伝子をその利用技術と共に提供することである。
　本発明者らは、ブラシノステロイド生合成の阻害剤であるブラシナゾール（Ｂｒｚ）の存在下且つ暗所での芽生えの胚軸形態を選択基準として、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）の変異体のスクリーニング及び関連遺伝子の単離を試みた。具体的には、FOX hunting system（Full-length cDNA Over-expression Gene Hunting System）による方法を用いて変異体のスクリーニングを行い、関連遺伝子を探索した。その結果、ブラシナゾール耐性が極めて強い変異体が見出され、さらに遺伝子解析を行ったところ、ｂｉｌ７（Brz-insensitive-long-hypocotyl 7）遺伝子がその変異に関与していることが明らかとなった。
　本発明者らはさらに、ｂｉｌ７遺伝子を発現するコンストラクトを作製し、これを植物に導入して当該遺伝子を過剰発現する形質転換体を作製した。そして、当該形質転換体の形態を調べたところ、花茎長等の種々の点で野生体に比べて生育が促進されていることが明らかとなった。これらの知見に基づき、本発明者らは、本発明を完成するに至った。
　本発明は、好ましくは以下に記載するような態様により行われるが、これに限定されるものではない。
［態様１］
　タンパク質をコードする核酸が導入された植物であって、該タンパク質が、
配列番号１で表されるアミノ酸配列を含み、
配列番号７又は１１で表されるアミノ酸配列と２５％以上の同一性又は７５％以上の類似性を有するアミノ酸配列を含み、
植物のバイオマスを増大させる活性を有することを特徴とする、前記植物。
［態様２］
　配列番号１で表されるアミノ酸配列が、配列番号２で表されるアミノ酸配列である、態様１の植物。
［態様３］
　タンパク質が、配列番号３～５のいずれかで表されるアミノ酸配列を含む、態様１又は２の植物。
［態様４］
　核酸が単子葉植物又は双子葉植物由来の核酸であり、植物が単子葉植物である、態様１～３のいずれか１の植物。
［態様５］
　タンパク質をコードする核酸を植物に導入する工程を含む、植物のバイオマスを増大させる方法であって、該タンパク質が、
配列番号１で表されるアミノ酸配列を含み、
配列番号７又は１１で表されるアミノ酸配列と２５％以上の同一性又は７５％以上の類似性を有するアミノ酸配列を含み、
植物のバイオマスを増大させる活性を有することを特徴とする、前記方法。
［態様６］
　配列番号１で表されるアミノ酸配列が、配列番号２で表されるアミノ酸配列である、態様５の方法。
［態様７］
　タンパク質が、配列番号３～５のいずれかで表されるアミノ酸配列を含む、態様５又は６の方法。
［態様８］
　核酸が単子葉植物又は双子葉植物由来の核酸であり、植物が単子葉植物である、態様５～７のいずれか１の方法。
［態様９］
　タンパク質をコードする核酸を植物に導入する工程を含む、バイオマスが増大した植物の作製方法であって、該タンパク質が、
配列番号１で表されるアミノ酸配列を含み、
配列番号７又は１１で表されるアミノ酸配列と２５％以上の同一性又は７５％以上の類似性を有するアミノ酸配列を含み、
植物のバイオマスを増大させる活性を有することを特徴とする、前記方法。
［態様１０］
　配列番号１で表されるアミノ酸配列が、配列番号２で表されるアミノ酸配列である、態様９の方法。
［態様１１］
　タンパク質が、配列番号３～５のいずれかで表されるアミノ酸配列を含む、態様９又は１０の方法。
［態様１２］
　核酸が単子葉植物又は双子葉植物由来の核酸であり、植物が単子葉植物である、態様９～１１のいずれか１の方法。
［態様１３］
　タンパク質をコードする核酸およびプロモーターを含むコンストラクトであって、該タンパク質が、
配列番号１で表されるアミノ酸配列を含み、
配列番号７又は１１で表されるアミノ酸配列と２５％以上の同一性又は７５％以上の類似性を有するアミノ酸配列を含み、
植物のバイオマスを増大させる活性を有することを特徴とする、前記コンストラクト。
［態様１４］
　配列番号１で表されるアミノ酸配列が、配列番号２で表されるアミノ酸配列である、態様１３のコンストラクト。
［態様１５］
　タンパク質が、配列番号３～５のいずれかで表されるアミノ酸配列を含む、態様１３又は１４のコンストラクト。
［態様１６］
　態様１３～１５のいずれか１のコンストラクトを含む、ベクター。
［態様１７］
　態様１６のベクターを含む、宿主細胞。
［態様１８］
　態様１７のベクターが導入された、植物。
［態様１９］
　核酸が単子葉植物又は双子葉植物由来の核酸であり、植物が単子葉植物である、態様１８の植物。
［態様２０］
（１）被験植物および野生型植物において、タンパク質又はそれをコードする核酸の発現量を測定する工程であって、該タンパク質が、
配列番号１で表されるアミノ酸配列を含み、
配列番号７又は１１で表されるアミノ酸配列と２５％以上の同一性又は７５％以上の類似性を有するアミノ酸配列を含み、
植物のバイオマスを増大させる活性を有することを特徴とする、前記工程、
（２）工程（１）により得られた発現量を比較する工程、
（３）野生型植物での発現量よりも高い発現量を示す被験植物を選択する工程、
を含む、バイオマスが増大した植物のスクリーニング方法。
［態様２１］
　配列番号１で表されるアミノ酸配列が、配列番号２で表されるアミノ酸配列である、態様２０の方法。
［態様２２］
　タンパク質が、配列番号３～５のいずれかで表されるアミノ酸配列を含む、態様２０又は２１の方法。
［態様２３］
　核酸が単子葉植物又は双子葉植物由来の核酸であり、植物が単子葉植物である、態様２０～２２のいずれか１の方法。
［態様２４］
（１）被験植物および野生型植物において、タンパク質又はそれをコードする核酸の発現量を測定する工程であって、該タンパク質が、
配列番号１で表されるアミノ酸配列を含み、
配列番号７又は１１で表されるアミノ酸配列と２５％以上の同一性又は７５％以上の類似性を有するアミノ酸配列を含み、
植物のバイオマスを増大させる活性を有することを特徴とする、前記工程、
（２）工程（１）により得られた発現量を比較する工程、
（３）被験植物での発現量が野生型植物での発現量よりも高いことを確認する工程、
を含む、バイオマスが増大した植物を判定する方法。
［態様２５］
　配列番号１で表されるアミノ酸配列が、配列番号２で表されるアミノ酸配列である、態様２４の方法。
［態様２６］
　タンパク質が、配列番号３～５のいずれかで表されるアミノ酸配列を含む、態様２４又は２５の方法。
［態様２７］
　核酸が単子葉植物又は双子葉植物由来の核酸であり、植物が単子葉植物である、態様２４～２６のいずれか１の方法。
　本発明によれば、植物のバイオマスを効果的に増大させることができる。また、本発明を用いることにより、バイオマスが効果的に増大した植物及びその作製方法を提供することができ、さらに、バイオマスが増大した植物のスクリーニングに有用な手段、及び植物のバイオマスを増大させる物質のスクリーニング方法を提供することができる。
図１は、暗所条件下におけるbil7-1Dのブラシナゾール（Ｂｒｚ）耐性を示す図面である。図１より、bil7-1Dは暗所での発芽においてＢｒｚ耐性を示すことが明らかである。Ａは、暗所７日目でのBrz 0、0.3、1、3μM条件における胚軸伸長の様子を示す。Ｂは、暗所７日目でのBrz 0、0.3、1、3μM条件における胚軸の伸長長を示す。Ｃは、暗所７日目でのBrz 0、0.3、1、3μM条件における胚軸の伸長率を示す。Scale bar = 3 mm、Error bar = S.D.、n = 30、***：P < 0.001、Student t test relative to Brz 0μM。 図２は、bil7-1Dの形態学的特徴を示す図面である。図２より、bil7-1Dは生育促進的な形態を示すことが明らかである。Ａは、60日目の植物の様子を示す（Scale bar = 10 cm）。Ｂは、40日目の植物体のロゼッタ葉の形態を示す（Scale bar = 1 cm）。Ｃは、70日目の植物体の花茎長を示す（n = 12）。Ｄは、70日目の植物体の花茎数を示す（n = 12）。Ｅは、70日目の植物体の二次花茎数を示す（n = 12）。Error bar = S.D.、***：P < 0.001、Student t test relative to WT。 図３は、bil7-1Dの花弁、鞘及び種子における形態学的特徴を示す図面である。図３より、bil7-1Dは種子の重量が増加することが明らかである。Ａは、bil7-1Dの正常開花（左）と開花異常（右）とを示す（Scale bar = 1 mm）。Ｂは、bil7-1Dの正常な鞘（左）と開花異常の鞘（右）とを示す（Scale bar = 5 mm）。Ｃは、野生型の種子（左）とbil7-1Dの種子（右）とを示す（Scale bar = 0.5 mm）。Ｄは、70日目の植物体の花数を示す（n = 12）。Ｅは、70日目の植物体の正常鞘数を示す（n = 12）。Ｆは、１鞘当たりの種子数を示す（n = 12）。Ｇは、種子100粒の重量を示す（n = 5）。Error bar = S.D.、*：P < 0.1、**：P < 0.01、***：P < 0.001、Student t test relative to WT。 図４は、bil7-1Dの花茎伸長期間及び開花期間を示す図面である。Ａは、開花期のロゼッタ葉の枚数を示す（n = 5）。Ｂは、開花までに要した日数を示す（n = 5）。Ｃは、花茎長の経時的変化及び開花期間を示す（n = 24）。Error bar = S.D.、*：P < 0.1、***：P < 0.001、Student t test relative to WT。 図５は、暗所7日目でのbil7-1DにおけるBIL7候補遺伝子の発現量を示す図面である。図５より、bil7-1DにおいてBIL7候補遺伝子の高発現が認められることが明らかである。 図６は、暗所条件下におけるBIL7高発現形質転換体（BIL7-OX）及びBIL7発現抑制形質転換体（BIL7-RNAi）のＢｒｚ耐性及びBIL7発現量を示す図面である。図６より、BIL7発現量の高いラインほど暗所Brz条件下の発芽において胚軸伸長を示すことが明らかである。Ａは、暗所7日目でのBrz 3μM条件における胚軸を示す（Scale bar = 3 mm）。Ｂは、暗所7日目でのBrz 3μM条件における胚軸長を示す（Error bar = S.D.、n = 50、***：P < 0.001、Student t test relative to WT）。Ｃは、27日目の植物体の各ラインのBIL7発現量を示す（Error bar = S.D.）。WT：wild-type、BIL7-OX1、2：35S::BIL7 overexpressor 1、2、BIL7-RNAi：BIL7-RNAi suppressor。 図７は、BIL7-OX及びBIL7-RNAiの形態学的特徴を示す図面である。図７より、BIL7発現量の高いラインほど成熟時に花茎伸長形態を示すことが明らかである。Ａは、63日目の植物の様子を示す（Scale bar = 10 cm）。Ｂは、86日目の植物体の花茎長を示す（n = 10、Error bar = S.D.、*：P < 0.1、***：P < 0.001、Student t test relative to WT）。WT：wild-type、BIL7-OX1、2：35S::BIL7 overexpressor 1、2、BIL7-RNAi：BIL7-RNAi suppressor。 図８は、BIL7-OX及びBIL7-RNAiの形態学的特徴を示す図面である。図８より、BIL7-OXは二次花茎数及び種子重量の増加傾向を示すことが明らかである。Ａは、72日目の植物体のロゼッタ葉の形態を示す（Scale bar = 5 cm）。Ｂは、各ラインの種子を示す（Scale bar = 1 mm）。Ｃは、86日目の植物体の花茎数を示す（n = 10）。Ｄは、86日目の植物体の二次花茎長を示す（n = 10）。Ｅは、86日目の植物体の正常鞘数を示す（n = 10）。Ｆは、種子100粒の重量を示す（n = 5）。Error bar = S.D.、*：P < 0.1、**：P < 0.01、***：P < 0.001、Student t test relative to WT、WT：wild-type、BIL7-OX1、2：35S::BIL7 overexpressor 1、2、BIL7-RNAi：BIL7-RNAi suppressor。 図９は、OsBIL7高発現形質転換体（OsBIL7-OX）におけるバイオマス増大を示す図面である。Ａは、Ｔ１での結果を示す。Ａより、イネにおけるBIL7相同性遺伝子OsBIL7を高発現化したイネ-OsBIL7-OX株（T1）において、１株当たりの植物体の総重量、分けつ数、籾粒数、稔実種子数（150%）の増加が認められることが明らかである。Ｂは、Ｔ２での結果を示す。Ｂより、イネにおけるBIL7相同性遺伝子OsBIL7を高発現化したイネ-OsBIL7-OX株（T2）において、１株当たりの分けつ数、籾粒数、稔実種子数（140%）の増加が認められることが明らかである。 図１０は、OsBIL7イネ形質転換体の鉢上げ17日後における草姿を示す図面である。イネ（品種：ゆきひかり）において、形質転換したOsBIL7組換え体（左）は対照用ベクターの組換え体（右）より、やや生育旺盛である様子が観察された。 図１１は、OsBIL7イネ形質転換体の成熟期における草姿を示す図面である。イネ（品種：ゆきひかり）において、形質転換したOsBIL7組換え体（左）は対照用ベクターの組換え体（右）より、生育旺盛である様子が観察された。 図１２は、BIL7イネ形質転換体の鉢上げ17日後における草姿を示す図面である。イネ（品種：ゆきひかり）において、形質転換したBIL7組換え体（左）は対照用ベクターの組換え体（右）より、生育旺盛である様子が観察された。 図１３は、BIL7イネ形質転換体の成熟期における草姿を示す図面である。イネ（品種：ゆきひかり）において、形質転換したBIL7組換え体（右）は対照用ベクターの組換え体（左）より、生育旺盛である様子が観察された。
（１）核酸及びタンパク質
　本発明では、植物バイオマスの増大に寄与する核酸としてｂｉｌ７（Brz-insensitive-long-hypocotyl 7）遺伝子が用いられる。ｂｉｌ７遺伝子は、ブラシノステロイド生合成阻害剤であるブラシナゾール（Ｂｒｚ）の存在下でも胚軸の徒長が見られる変異体から見出された、ブラシノステロイドシグナル伝達に関与する遺伝子であり、種々の植物において見ることができる。ｂｉｌ７遺伝子のヌクレオチド配列及び当該遺伝子がコードするタンパク質（即ち、ＢＩＬ７タンパク質）のアミノ酸配列は各種植物によって相違するが、本発明におけるタンパク質は、下記の配列番号１で表されるアミノ酸配列の共通モチーフを有している。
　配列番号１：
Ala-Pro-Pro-Ser-Ser-Pro-Ala-Ser-X1-X2-X3-Ser-X4-X5-X6-Ser-X7-X8-X9-X10-Pro-X11-Gly-Pro-Tyr-Ala-X12-Glu-X13-X14-X15-Val-X16-Pro-Pro-Val-Phe-Ser-X17-X18-X19-Thr-X20-Pro-Ser-X21-Ala-Pro-X22-Thr-Pro-Pro-X23-Pro-Ser-Ser-Pro-X24-Val-Pro-X25-Ala-X26-Pro-X27-Ser-Pro-X28-Ser-Pro
（式中、X1はPhe又はTyr、X2はPhe、Leu、Thr又はAla、X3はGln、Pro、His又はAsn、X4はGlu、Gly、Asp、Ala又はMet、X5はPro、Gly、Leu又はAla、X6はPro、Ala、Thr又はSer、X7はAla、Ile、Val、Ser、又はThr、X8はThr、Val、Ser又はAla、X9はGln又はHis、X10はSer又はThr、X11は15～30個のアミノ酸残基、X12はHis又はAsn、X13はThr又はPro、X14はGln又はAla、X15はLeu又はPro、X16はSer又はThr、X17はThr又はAla、X18はTyr又はPhe、X19はThr、Ile又はPro、X20はGlu又はAla、X21はSer又はThr、X22はIle、Val、Tyr又はPhe、X23は3～15個のアミノ酸残基、X24はGlu又はAsp、X25はPhe又はTyr、X26は20～50個のアミノ酸残基、X27はGly、Glu又はAsp、X28は5又は6個のアミノ酸残基を示す。）
　上記アミノ酸配列において、Ｘ１１は好ましくは１７～２９個のアミノ酸残基、より好ましくは２０～２６個のアミノ酸残基、Ｘ２３は好ましくは３～１２個のアミノ酸残基、より好ましくは８～１２個のアミノ酸残基、Ｘ２６は好ましくは２３～４９個のアミノ酸残基、より好ましくは２３～３０個のアミノ酸残基、Ｘ２８は好ましくは５個のアミノ酸残基である。
　上記の共通モチーフを含むＢＩＬ７タンパク質を有する植物としては、特に限定されないが、例えば、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、ダイズ（Glycine max）、イネ（Oryza sativa）、トウモロコシ（Zea mays）、ダイコン（Raphanus sativus）、ポプラ（Populus trichocarpa）、ブドウ（Vitis vinifera）、ヒメツリガネゴケ（Physcomitrella patens）などが挙げられる。各植物のＢＩＬ７タンパク質をコードするｍＲＮＡ（及びｃＤＮＡ）のヌクレオチド配列及びＢＩＬ７タンパク質のアミノ酸配列は同定されており、下記の表の通りGenbankアクセッション番号が登録されている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　また、上記共通モチーフを有するＢＩＬ７タンパク質には、各植物のＢＩＬ７タンパク質のホモログも含まれる。例えば、シロイヌナズナＢＩＬ７には３種類のホモログタンパク質が存在しており、そのｍＲＮＡ（及びｃＤＮＡ）のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列については、下記の表の通りGenbankアクセッション番号が登録されている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　本発明におけるタンパク質はまた、上記共通モチーフを含むことに加え、シロイヌナズナ又はイネのＢＩＬ７タンパク質を基準として、配列番号７又は１１で表されるアミノ酸配列と２５％以上の同一性又は７５％以上の類似性を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とする。本発明では、上記共通モチーフ（即ち、配列番号１で表されるアミノ酸配列）は、配列番号７又は１１で表されるアミノ酸配列と２５％以上の同一性又は７５％以上の類似性を有するアミノ酸配列に包含される（換言すれば、上記共通モチーフ（即ち、配列番号１で表されるアミノ酸配列）は、配列番号７又は１１で表されるアミノ酸配列と２５％以上の同一性又は７５％以上の類似性を有するアミノ酸配列の一部として含まれる（存在する））。
　本明細書においてアミノ酸配列の同一性とは、対象とする２つのタンパク質間のアミノ酸配列の同一性をいい、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて作成されたアミノ酸配列の最適なアラインメントにおいて一致するアミノ酸残基の割合（％）によって表される。アミノ酸配列の同一性は、視覚的検査及び数学的計算により決定することができ、当業者に周知のホモロジー検索プログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ）や配列整列プログラム（例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷ））、あるいは遺伝情報処理ソフトウェア（例えば、ＧＥＮＥＴＹＸ［登録商標］）などを用いて算出することができる。本明細書におけるアミノ酸配列の同一性は、具体的には、ＤＤＢＪ（DNA Data Bank of Japan）のウェブサイトで公開されている系統解析プログラムＣｌｕｓｔａｌＷ（http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/index.php?lang=ja）を用い、初期設定の条件（Version 2.1、Alignment type: slow、DNA Weight Matrix: Gonnet、GAP OPEN: 10、GAP EXTENSION: 0.1）で求めることができる。
　本発明におけるタンパク質は、配列番号７又は１１で表されるアミノ酸配列と２５％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
　シロイヌナズナのＢＩＬ７タンパク質とそのホモログとの間の同一性は、それぞれ４１％（ホモログ１）、４３％（ホモログ２）及び２８％（ホモログ３）である。そのため本発明におけるタンパク質は、好ましい一つの態様として、配列番号７で表されるアミノ酸配列と２５％以上、３０％以上又は４０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む。シロイヌナズナのＢＩＬ７タンパク質とダイズ、イネ及びトウモロコシのＢＩＬ７タンパク質との間の同一性は、それぞれ４４％（ダイズＢＩＬ７）、４１％（イネＢＩＬ７）及び４０％（トウモロコシＢＩＬ７）である。そのため本発明におけるタンパク質は、好ましい一つの態様として、配列番号７で表されるアミノ酸配列と４０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む。イネのＢＩＬ７タンパク質とダイズ及びトウモロコシのＢＩＬ７タンパク質との間の同一性は、それぞれ４２％（ダイズＢＩＬ７）及び８５％（トウモロコシＢＩＬ７）である。そのため本発明におけるタンパク質は、好ましい一つの態様として、配列番号１１で表されるアミノ酸配列と４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上又は８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
　本明細書においてアミノ酸配列の類似性とは、対象とする２つのタンパク質間のアミノ酸配列の類似性をいい、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて作成されたアミノ酸配列の最適なアラインメントにおいて一致するアミノ酸残基及び類似性を示すアミノ酸残基の割合（％）によって表される。アミノ酸残基の類似性は、物理化学的な性質が相互に類似するアミノ酸残基の関係により示され、例えば、芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）、疎水性アミノ酸（Ａｓｐ、Ｇｌｕ）、脂肪族アミノ酸（Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ）、極性アミノ酸（Ａｓｎ、Ｇｌｎ）、塩基性アミノ酸（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）、酸性アミノ酸（Ａｓｐ、Ｇｌｕ）、ヒドロキシル基を含むアミノ酸（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ）、側鎖の小さいアミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ）などのグループにおいて、同一のグループに属するアミノ酸同士は、相互に類似するアミノ酸残基であると理解される。このような類似性を示すアミノ酸残基は、タンパク質の表現型に影響を及ぼさないことが予測される。アミノ酸配列の類似性は、同一性と同様に視覚的検査及び数学的計算により決定することができ、当業者に周知の配列類似性検索プログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ、ＨＭＭＥＲ）や、遺伝情報処理ソフトウェア（例えば、ＧＥＮＥＴＹＸ［登録商標］）などを用いて算出することができる。本明細書におけるアミノ酸配列の類似性は、具体的には、ＧＥＮＥＴＹＸ［登録商標］ネットワーク版ver. 11.1.3（株式会社ゼネティックス）を用い、Protein vs Protein Global Homologyを初期設定の条件（Unit size to compareを２に設定する）で求めることができる。
　本発明におけるタンパク質は、配列番号７又は１１で表されるアミノ酸配列と７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の類似性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
　シロイヌナズナのＢＩＬ７タンパク質とダイズ、イネ及びトウモロコシのＢＩＬ７タンパク質との間の類似性は、それぞれ７６％（ダイズＢＩＬ７）、７６％（イネＢＩＬ７）及び７５％（トウモロコシＢＩＬ７）である。そのため本発明におけるタンパク質は、好ましい一つの態様として、配列番号７で表されるアミノ酸配列と７５％以上の類似性を有するアミノ酸配列を含む。イネのＢＩＬ７タンパク質とダイズ及びトウモロコシのＢＩＬ７タンパク質との間の類似性は、それぞれ８３％（ダイズＢＩＬ７）及び９７％（トウモロコシＢＩＬ７）である。そのため本発明におけるタンパク質は、好ましい一つの態様として、配列番号１１で表されるアミノ酸配列と７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上の類似性を有するアミノ酸配列を含む。
　本発明におけるタンパク質は、上記の共通モチーフを含み、且つ配列番号７又は１１で表されるアミノ酸配列と所定の同一性又は類似性を有するアミノ酸配列を含むことに加え、さらに植物のバイオマスを増大させる活性を有することを特徴とする。
　本明細書において植物のバイオマスとは、植物個体の全体、一部、個別器官、あるいはその組み合わせに係る量を意図する。植物個体の全体、一部、あるいは個別器官としては、例えば、全体、地上部、根、茎、葉、果実、種子、胚、胚珠、子房、茎頂、葯、花粉、又は穂等が挙げられる。これらの中では、果実、種子、穂、根、茎、葉、又は葯が好ましい。また、量としては、例えば、数、大きさ、長さ、幅、重量、面積、又は体積等が挙げられる。従って、バイオマスの例としては、全体重、地上部重（例えば、地上部乾物重）、収量、茎径、茎数、稈長、草丈、葉面積、葉数、止葉長、葉身長、葉幅、籾数、籾重（例えば、千籾重、全籾重）、種子数、分げつ数、穂数、一穂粒数、一穂稔実粒数、稔実率、穂長、最大穂長、一穂重又は全穂重等を挙げることができるが、これに限らない。また、「増大」とは、上記に例示されるような植物のバイオマスのいずれかが単独で、又は複数が組み合わさって増大していればよい。
　植物のバイオマスを増大させる活性は、例えば、増大の指標としてコントロール（親植物、非形質転換体、野生型等）のバイオマスを用い、植物の成熟体において当該コントロールと比較することにより評価を行うことができる。コントロールとの比較により増大が見られた場合には植物のバイオマスを増大させる活性を有すると判定することができ、当該バイオマスが数値化可能であれば、数値を比較した上で、例えば、１％以上、３％以上、５％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、又は７０％以上の増大が見られた場合に植物のバイオマスを増大させる活性を有すると判定することができる。
　本発明において、配列番号１で表されるアミノ酸配列は、下記の配列番号２で表されるアミノ酸配列とすることができる。配列番号２で表されるアミノ酸配列を共通モチーフとして含むタンパク質を有する植物としては、例えば、シロイヌナズナ、ダイズ、イネ、トウモロコシなどが挙げられる。また、これらの植物のＢＩＬ７タンパク質のホモログ（例えば、シロイヌナズナＢＩＬ７のホモログタンパク質）も、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質に含まれる。
　配列番号２：
Ala-Pro-Pro-Ser-Ser-Pro-Ala-Ser-Phe-X29-X30-Ser-X31-X32-X33-Ser-X34-X35-X36-X37-Pro-X38-Ser-X39-X40-X41-X42-Gly-Pro-Tyr-Ala-X43-Glu-Thr-Gln-X44-Val-X45-Pro-Pro-Val-Phe-Ser-X46-X47-X48-Thr-Glu-Pro-Ser-X49-Ala-Pro-X50-Thr-Pro-Pro-X51-Pro-Ser-Ser-Pro-X52-Val-Pro-X53-Ala-X54-Pro-X55-Ser-Pro-X56-Leu-X57-Ser-Pro
（式中、X29はPhe、Leu又はThr、X30はGln、His、Pro又はAsn、X31はGlu、Gly、Asp又はAla、X32はPro、Gly又はLeu、X33はPro、Ala、Thr又はSer、X34はAla、Val、Ile又はThr、X35はThr、Ala、Val又はSer、X36はGln又はHis、X37はSer又はThr、X38は10～25個のアミノ酸残基、X39はIle、Val、Ala又はMet、X40はPhe又はTyr、X41はAla又はThr、X42はIle、Val又はThr、X43はHis又はAsn、X44はLeu又はPro、X45はSer又はThr、X46はThr又はAla、X47はTyr又はPhe、X48はThr又はIle、X49はSer又はThr、X50はIle、Phe又はTyr、X51は3～15個のアミノ酸残基、X52はGlu又はAsp、X53はPhe又はTyr、X54は20～35個のアミノ酸残基、X55はGly、Glu又はAsp、X56は3～5個のアミノ酸残基、X57はIle又はArgを示す。）
　上記アミノ酸配列において、Ｘ３８は好ましくは１２～２１個のアミノ酸残基、より好ましくは１５～２１個のアミノ酸残基、Ｘ５１は好ましくは３～１２個のアミノ酸残基、より好ましくは８～１２個のアミノ酸残基、Ｘ５４は好ましくは２３～３５個のアミノ酸残基、より好ましくは２３～３０個のアミノ酸残基、Ｘ５６は好ましくは３又は４個のアミノ酸残基、より好ましくは３個のアミノ酸残基である。
　本発明におけるタンパク質はまた、下記の配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むことができる。上記の配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列は、配列番号３で表されるアミノ酸配列に包含される（換言すれば、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列は、配列番号３で表されるアミノ酸配列の一部として含まれる（存在する））。また、配列番号３で表されるアミノ酸配列は、配列番号７又は１１で表されるアミノ酸配列と２５％以上の同一性又は７５％以上の類似性を有するアミノ酸配列に包含される（換言すれば、配列番号３で表されるアミノ酸配列は、配列番号７又は１１で表されるアミノ酸配列と２５％以上の同一性又は７５％以上の類似性を有するアミノ酸配列の一部として含まれる（存在する））。配列番号３で表されるアミノ酸配列を共通モチーフとして含むタンパク質を有する植物としては、例えば、シロイヌナズナ、イネなどが挙げられる。
　配列番号３：
Met-X58-Ser-Gly-X59-Asn-X60-X61-Asp-Thr-X62-Asn-Ala-Ala-Ala-X63-Ala-Ile-X64-X65-X66-X67-X68-Arg-X69-Arg-Lys-Trp-X70-X71-X72-X73-Ser-X74-X75-X76-Cys-Phe-Gly-Ser-X77-X78-X79-X80-X81-Arg-Ile-X82-X83-X84-Val-Leu-Val-Pro-Glu-Pro-X85-Pro-Phe-X86-Ala-Pro-Pro-Ser-Ser-Pro-Ala-Ser-Phe-X87-Gln-Ser-X88-X89-X90-Ser-X91-X92-Gln-Ser-Pro-Val-Gly-X93-X94-Ser-Phe-Ser-Pro-Leu-X95-X96-Asn-X97-Pro-Ser-Ile-Phe-Ala-Ile-Gly-Pro-Tyr-Ala-His-Glu-Thr-Gln-Leu-Val-Ser-Pro-Pro-Val-Phe-Ser-X98-X99-Thr-Thr-Glu-Pro-Ser-X100-Ala-Pro-X101-Thr-Pro-Pro-X102-Ser-X103-X104-Leu-Thr-Thr-X105-Pro-Ser-Ser-Pro-Glu-Val-Pro-X106-Ala-X107-Leu-X108-X109-Ser-X110-Glu-X111-Gln-X112-Tyr-Gln-X113-X114-Pro-X115-Ser-Pro-X116-Gly-X117-Leu-Ile-Ser-Pro-Ser-X118-Ser-Gly-X119-X120-Ser-Pro-Phe-Pro-Asp-X121-Ser-X122-Phe-Pro-X123-Phe-X124-Val-X125-X126-Pro-Pro-Lys-X127-Leu-X128-Gly-X129-His-X130-Val-Ser-Phe-X131-Leu-X132-X133-X134-X135-Val-X136-Arg-Cys-X137-X138-X139-Lys-X140-Pro-X141-X142-Ser-X143-Asp-X144-Ser-Leu-X145-X146-X147-Lys-Glu-Phe-X148-Phe-X149-Val-X150-X151-X152-X153-X154-Ala-X155-X156-Lys-X157-Trp-Ser-Phe-Phe-Pro-Val-X158-Gln-X159-Gly
（式中、X58はArg又はGln、X59は3～10個のアミノ酸残基、X60はVal又はSer、X61はPhe又はVal、X62はIle又はVal、X63はSer又はVal、X64はAla又はVal、X65はSer又はThr、X66はSer又はAla、X67はAsp又はGlu、X68はAsp又はSer、X69は5～10個のアミノ酸残基、X70はTrp又はAla、X71はAsn又はAsp、X72はArg又はTrp、X73はTrp又はLeu、X74はLeu又はVal、X75はLeu又はTyr、X76はLys又はPhe、X77はSer又はGln、X78はArg又はLys、X79はGln又はAsn、X80はArg又はGly、X81はLys又はArg、X82はGly又はSer、X83はAsn又はHis、X84はSer又はAla、X85は20～25個のアミノ酸残基、X86はIle又はVal、X87はPhe又はLeu、X88はGlu又はGly、X89はPro又はGly、X90はPro又はAla、X91はAla又はIle、X92はThr又はVal、X93はIle又はAla、X94はLeu又はPro、X95はPro又はSer、X96はCys又はPro、X97は1～10個のアミノ酸残基、X98はThr又はAla、X99はTyr又はPhe、X100はSer又はThr、X101はIle又はPhe、X102は1～5個のアミノ酸残基、X103はIle又はVal、X104はTyr又はHis、X105は0～5個のアミノ酸残基、X106はPhe又はTyr、X107はGln又はLys、X108はPhe又はLeu、X109はAsn又はThr、X110は10～20個のアミノ酸残基、X111はPhe又はLeu、X112はPhe又はSer、X113はLeu又はIle、X114はPro又はTyr、X115はGly又はGlu、X116はLeu又はIle、X117はGln又はArg、X118は1～5個のアミノ酸残基、X119はPro又はThr、X120はThr又はCys、X121は1～10個のアミノ酸残基、X122はLeu又はThr、X123はHis又はSer、X124はGln又はPro、X125はSer又はArg、X126はAsp又はGlu、X127はLeu又はIle、X128は3～20個のアミノ酸残基、X129は10～30個のアミノ酸残基、X130は1～5個のアミノ酸残基、X131はAsp又はGlu、X132はAsp又はThr、X133はAla又はVal、X134はAsp又はGlu、X135はHis又はAsp、X136はIle又はAla、X137はVal又はLeu、X138はAsp又はGlu、X139はGln又はLys、X140は3～25個のアミノ酸残基、X141はGlu又はArg、X142はAla又はGlu、X143はSer又はAsn、X144は5～25個のアミノ酸残基、X145はGly又はArg、X146はSer又はLys、X147はAsn又はAla、X148はAsn又はLys、X149は5～15個のアミノ酸残基、X150はAsp又はGly、X151はGlu又はSer、X152はHis又はAsp、X153はArg又はTrp、X154はSer又はTrp、X155はSer又はAsn、X156はPro又はGlu、X157は5～15個のアミノ酸残基、X158はMet又はAla、X159はSer又はProを示す。）
　上記アミノ酸配列において、Ｘ５９は好ましくは４～７個のアミノ酸残基、Ｘ６９は好ましくは８～１０個のアミノ酸残基、Ｘ８５は好ましくは２１～２２個のアミノ酸残基、Ｘ９７は好ましくは２～７個のアミノ酸残基、Ｘ１０２は好ましくは２～４個のアミノ酸残基、Ｘ１０５は好ましくは０～２個のアミノ酸残基、Ｘ１１０は好ましくは１０～１７個のアミノ酸残基、Ｘ１１８は好ましくは２～３個のアミノ酸残基、Ｘ１２１は好ましくは３～８個のアミノ酸残基、Ｘ１２８は好ましくは５～１８個のアミノ酸残基、Ｘ１２９は好ましくは１３～２８個のアミノ酸残基、Ｘ１３０は好ましくは１～２個のアミノ酸残基、Ｘ１４０は好ましくは５～２４個のアミノ酸残基、Ｘ１４４は好ましくは７～２２個のアミノ酸残基、Ｘ１４９は好ましくは８～１１個のアミノ酸残基、Ｘ１５７は好ましくは４～１１個のアミノ酸残基である。
　本発明におけるタンパク質はまた、下記の配列番号４で表されるアミノ酸配列を含むことができる。上記の配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列は、配列番号４で表されるアミノ酸配列に包含される（換言すれば、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列は、配列番号４で表されるアミノ酸配列の一部として含まれる（存在する））。また、配列番号４で表されるアミノ酸配列は、配列番号７又は１１で表されるアミノ酸配列と７５％以上の同一性又は７５％以上の類似性を有するアミノ酸配列に包含される（換言すれば、配列番号４で表されるアミノ酸配列は、配列番号７又は１１で表されるアミノ酸配列と２５％以上の同一性又は７５％以上の類似性を有するアミノ酸配列の一部として含まれる（存在する））。配列番号４で表されるアミノ酸配列を共通モチーフとして含むタンパク質を有する植物としては、例えば、シロイヌナズナ、ダイズなどが挙げられる。
　配列番号４：
Met-Arg-X160-Gly-Ala-Asn-Gly-X161-Asn-Asn-X162-X163-X164-Thr-Ile-Asn-Ala-Ala-Ala-X165-X166-Ile-Ala-Ser-X167-X168-X169-Arg-Leu-X170-Gln-X171-X172-Pro-X173-X174-X175-Lys-X176-X177-Trp-X178-Asn-X179-X180-Ser-X181-X182-X183-Cys-Phe-Gly-X184-X185-X186-X187-Arg-X188-Arg-Ile-Gly-X189-X190-Val-Leu-Val-Pro-Glu-X191-X192-X193-X194-X195-X196-X197-Asn-X198-Thr-X199-Ile-X200-X201-X202-X203-Phe-X204-Ala-Pro-Pro-Ser-Ser-Pro-Ala-Ser-Phe-X205-X206-Ser-Glu-Pro-Pro-Ser-X207-X208-Gln-Ser-Pro-X209-X210-Ile-Leu-Ser-X211-X212-Pro-X213-Ser-Ile-Phe-Ala-Ile-Gly-Pro-Tyr-Ala-His-Glu-Thr-Gln-Leu-Val-Ser-Pro-Pro-Val-Phe-Ser-Thr-X214-Thr-Thr-Glu-Pro-Ser-X215-Ala-Pro-X216-Thr-Pro-Pro-X217-Thr-Thr-Pro-Ser-Ser-Pro-Glu-Val-Pro-Phe-Ala-Gln-Leu-X218-X219-X220-Asn-X221-X222-X223-X224-X225-X226-X227-X228-X229-Phe-X230-Tyr-X231-Phe-X232-X233-Tyr-Gln-Leu-X234-Pro-Gly-Ser-Pro-X235-Gly-Gln-Leu-Ile-Ser-Pro-X236-Ser-X237-X238-X239-Ser-Pro-Phe-Pro-Asp-X240-Ser-Leu-X241-X242-X243-Phe-Gln-X244-X245-Asp-X246-Ser-X247-X248-X249-X250-Gly-X251-X252-Thr-Pro-X253-Gln-X254-X255-X256-X257-Pro-X258-X259-X260-Val-Ser-X261-X262-X263-X264-Ala-X265-X266-Val-X267-X268-Cys-Val-X269-Lys-Leu-X270-Thr-X271-X272-Pro-X273-Glu-X274-X275-Ser-Asp-X276-Glu-X277-X278-X279-His-X280-Lys-Glu-Phe-Asn-Phe-X281-X282-X283-Glu-X284-Leu-X285-X286-Asp-X287-Ala-Ser-X288-Ser-Asn-X289-Trp-Ser-Phe-Phe-Pro-X290-X291-X292-X293-Gly
（式中、X160は0～3個のアミノ酸残基、X161は0～5個のアミノ酸残基、X162はVal又はThr、X163はPhe又はLeu、X164はAsp又はGlu、X165はSer又はThr、X166はAla又はVal、X167はSer又はVal、X168はAsp又はGlu、X169はAsp又はAsn、X170はHis又はAsp、X171はSer又はPro、X172はSer又はHis、X173はIle又はHis、X174はHis又はVal、X175はLys又はGln、X176はArg又はLys、X177はLys又はSer、X178はTrp又はGly、X179はArg又はTrp、X180はTrp又はLeu、X181はLeu又はIle、X182はLeu又はTyr、X183はLys又はTrp、X184はSer又はHis、X185はSer又はArg、X186はArg又はLys、X187はGln又はAsn、X188はLys又はGln、X189はAsn又はHis、X190はSer又はAla、X191はPro又はArg、X192はVal又はIle、X193はSer又はPro、X194はMet又はSer、X195はSer又はGly、X196はSer又はThr、X197はSer又はAsp、X198はSer又はAla、X199は5～15個のアミノ酸残基、X200はThr又はIle、X201はThr又はPro、X202はLeu又はPhe、X203はPro又はHis、X204はIle又はVal、X205はPhe又はLeu、X206はGln又はHis、X207はAla又はVal、X208はThr又はAla、X209はVal又はSer、X210はGly又はAla、X211はPhe又はLeu、X212はSer又はThr、X213は1～10個のアミノ酸残基、X214はTyr又はPhe、X215はSer又はThr、X216はIle又はPhe、X217は3～15個のアミノ酸残基、X218はPhe又はLeu、X219はAsn又はAsp、X220はSer又はPro、X221はHis又はAsn、X222はGln又はLys、X223はThr又はAsn、X224はGly又はSer、X225はSer又はGlu、X226はTyr又はThr、X227はGly又はTyr、X228はTyr又はGln、X229はLys又はArg、X230は3～7個のアミノ酸残基、X231はGlu又はAsp、X232はGln又はHis、X233はPhe又はSer、X234はPro又はHis、X235はLeu又はVal、X236は1～10個のアミノ酸残基、X237はGly又はSer、X238はPro又はThr、X239はThr又はSer、X240は1～10個のアミノ酸残基、X241はPhe又はLeu、X242はPro又はLeu、X243はHis又はAsn、X244はVal又はThr、X245はSer又はAsp、X246は3～10個のアミノ酸残基、X247はPro又はHis、X248はLys又はGln、X249はThr又はGly、X250はAla又はSer、X251はVal又はSer、X252はThr又はLeu、X253は1～10個のアミノ酸残基、X254はLys又はAla、X255はIle又はSer、X256はVal又はPhe、X257はPro又はLeu、X258はHis又はSer、X259はLys又はHis、X260はPro又はTrp、X261はPhe又はIle、X262はAsp又はGlu、X263はLeu又はVal、X264はAsp又はSer、X265はAsp又はGln、X266はHis又はGlu、X267はIle又はPhe、X268はArg又はAsn、X269は1～15個のアミノ酸残基、X270はArg又はLys、X271はThr又はAsp、X272はPhe又はAla、X273は0～15個のアミノ酸残基、X274はAla又はThr、X275はSer又はPro、X276は1～15個のアミノ酸残基、X277はSer又はArg、X278はMet又はVal、X279はAsn又はHis、X280は5～10個のアミノ酸残基、X281はGly又はAsp、X282はThr又はAsn、X283はAsp又はAla、X284は1～10個のアミノ酸残基、X285はThr又はVal、X286はVal又はAla、X287は1～10個のアミノ酸残基、X288は1～7個のアミノ酸残基、X289はAsp又はAsn、X290はVal又はMet、X291はMet又はIle、X292はGln又はArg、X293はSer又はProを示す。）
　上記アミノ酸配列において、Ｘ１６０は好ましくは０～１個のアミノ酸残基、Ｘ１６１は好ましくは０～３個のアミノ酸残基、Ｘ１９９は好ましくは７～９個のアミノ酸残基、Ｘ２１３は好ましくは４～７個のアミノ酸残基、Ｘ２１７は好ましくは６～１０個のアミノ酸残基、Ｘ２３０は好ましくは４～５個のアミノ酸残基、Ｘ２３６は好ましくは３～６個のアミノ酸残基、Ｘ２４０は好ましくは３～９個のアミノ酸残基、Ｘ２４６は好ましくは５～９個のアミノ酸残基、Ｘ２５３は好ましくは３～７個のアミノ酸残基、Ｘ２６９は好ましくは２～１２個のアミノ酸残基、Ｘ２７３は好ましくは０～１１個のアミノ酸残基、Ｘ２７６は好ましくは１～１１個のアミノ酸残基、Ｘ２８０は好ましくは６～１０個のアミノ酸残基、Ｘ２８４は好ましくは２～８個のアミノ酸残基、Ｘ２８７は好ましくは４～７個のアミノ酸残基、Ｘ２８８は好ましくは３～５個のアミノ酸残基である。
　本発明におけるタンパク質はまた、下記の配列番号５で表されるアミノ酸配列を含むことができる。上記の配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列は、配列番号５で表されるアミノ酸配列に包含される（換言すれば、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列は、配列番号５で表されるアミノ酸配列の一部として含まれる（存在する））。また、配列番号５で表されるアミノ酸配列は、配列番号７又は１１で表されるアミノ酸配列と２５％以上の同一性又は７５％以上の類似性を有するアミノ酸配列に包含される（換言すれば、配列番号５で表されるアミノ酸配列は、配列番号７又は１１で表されるアミノ酸配列と２５％以上の同一性又は７５％以上の類似性を有するアミノ酸配列の一部として含まれる（存在する））。配列番号５で表されるアミノ酸配列を共通モチーフとして含むタンパク質を有する植物としては、例えば、イネ、トウモロコシなどが挙げられる。
　配列番号５：
Met-Gln-Ser-Gly-X294-X295-Met-Arg-Pro-Val-His-Asn-Ser-Val-Asp-Thr-Val-Asn-Ala-Ala-Ala-Val-Ala-Ile-Val-Thr-Ala-Glu-Ser-Arg-Thr-Gln-Pro-X296-Ala-Glu-X297-Arg-Arg-Lys-Trp-Ala-Asp-X298-Leu-Ser-Val-Tyr-Phe-Cys-Phe-Gly-Ser-Gln-Lys-Asn-Gly-Arg-X299-Arg-X300-X301-His-Ala-X302-Leu-Val-Pro-Glu-Pro-X303-Pro-X304-Arg-Thr-Asp-Ala-Pro-X305-X306-Glu-Ile-Pro-X307-His-Pro-Pro-Pro-Pro-Val-Phe-Pro-Phe-Val-Ala-Pro-Pro-Ser-Ser-Pro-Ala-Ser-Phe-Leu-Gln-Ser-X308-X309-X310-Ser-Ile-Val-Gln-Ser-Pro-X311-Gly-Ala-Pro-X312-Phe-Ser-Pro-Leu-Ser-Pro-Asn-Ser-X313-Ser-Pro-Thr-Gly-Pro-Pro-Ser-Ile-Phe-Ala-Ile-Gly-Pro-Tyr-Ala-His-Glu-Thr-Gln-Leu-Val-Ser-Pro-Pro-Val-Phe-Ser-Ala-Phe-Thr-Thr-Glu-Pro-Ser-Thr-Ala-Pro-Phe-Thr-Pro-Pro-Pro-Glu-Ser-Val-His-Leu-Thr-Thr-Pro-Ser-Ser-Pro-Glu-Val-Pro-Tyr-Ala-Lys-Leu-Leu-Thr-Ser-Ile-Asn-Asn-Ser-Lys-Asn-X314-Glu-X315-Gly-X316-Leu-Gln-Ser-Tyr-X317-X318-Tyr-Pro-X319-Ser-Pro-Ile-Gly-Arg-Leu-Ile-Ser-Pro-Ser-Ser-X320-Cys-Ser-Gly-Thr-X321-Ser-Pro-Phe-Pro-Asp-Pro-Glu-X322-Gln-X323-Ser-Ser-Arg-Ser-X324-X325-X326-X327-Phe-Pro-Val-Arg-Glu-Pro-Pro-Lys-Ile-Leu-Asp-Gly-Glu-Gly-X328-Ala-Thr-Gln-Lys-Leu-Ile-Pro-Arg-His-Met-Arg-Asn-Gly-Gly-Ser-Leu-Leu-Asp-Gly-X329-Ile-Ser-Ala-Ala-Val-Pro-Val-Val-Asp-Phe-Ser-Ala-Arg-Leu-Gln-X330-Asn-X331-His-Ala-Met-Asp-His-Arg-Val-Ser-Phe-Glu-Leu-Thr-Val-Glu-Asp-Val-Ala-Arg-Cys-Leu-Glu-Lys-Lys-Thr-X332-Ile-X333-Gly-X334-Ser-X335-X336-Ala-Ser-Phe-X337-Leu-X338-Pro-Thr-Gly-X339-Gly-Asp-X340-His-X341-Arg-Glu-Ser-Asn-X342-X343-Arg-Ala-Gly-Leu-X344-Val-Asp-Glu-X345-Tyr-His-Asp-Leu-Pro-Glu-Lys-Ala-Arg-Arg-Ser-Leu-Ser-Leu-Arg-X346-Ala-Lys-Glu-Phe-X347-Phe-Asn-Asn-Val-Asp-X348-X349-Ser-Val-Glu-Pro-Ser-Val-Gly-Ser-Asp-Trp-Trp-Ala-Asn-Glu-Lys-Val-Ala-Gly-X350-Thr-X351-Glu-Pro-X352-Lys-X353-Trp-Ser-Phe-X354-Pro-Val-X355-Gln-Pro-Gly-Val-Ser
（式中、X294はSer又はGly、X295はGlu又はAsp、X296はGln又はPro、X297はPro又はGln、X298はTrp又はArg、X299は0～5個のアミノ酸残基、X300はIle又はVal、X301はSer又はAsn、X302はVal又はAla、X303はLeu又はAla、X304はPro又はGln、X305はMet又はAla、X306はPro又はAla、X307はIle又はAsn、X308はGly又はGlu、X309はGly又はPro、X310はAla又はThr、X311は0～5個のアミノ酸残基、X312はSer又はAla、X313はPro又はGln、X314はAla又はGly、X315はThr又はAla、X316は0～5個のアミノ酸残基、X317はGln又はPro、X318はIle又はAsn、X319はGlu又はAsp、X320はAla又はGly、X321はCys又はSer、X322はVal又はMet、X323はThr又はAla、X324はThr又はAla、X325はPhe又はLeu、X326はPro又はArg、X327はSer又はLeu、X328はIle又はVal、X329はHis又はGln、X330はAsn又はPro、X331はAsp又はGlu、X332はAsn又はAla、X333はAsn又はSer、X334はGlu又はAsp、X335はAla又はGly、X336はAla又はThr、X337はArg又はHis、X338はVal又はAla、X339はAsn又はSer、X340は0～5個のアミノ酸残基、X341はPro又はHis、X342はAsp又はGlu、X343はThr又はAla、X344はCys又はTyr、X345はThr又はSer、X346はLys又はLeu、X347はLys又はAsn、X348はAla又はVal、X349はPro又はGly、X350はIle又はMet、X351はSer又はThr、X352はArg又はLys、X353はSer又はAsn、X354はPhe又はHis、X355はAla又はValを示す。）
　上記アミノ酸配列において、Ｘ２９９は好ましくは０～２個のアミノ酸残基、Ｘ３１１は好ましくは１～２個のアミノ酸残基、Ｘ３１６は好ましくは１～２個のアミノ酸残基、Ｘ３４０は好ましくは０～２個のアミノ酸残基である。
　本発明では、上述したタンパク質をコードする核酸が用いられる。本明細書において核酸とは、ヌクレオチドがリン酸エステル結合で連結した高分子を意味し、ポリヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドの用語と互換可能に使用される。核酸の構造は、特に限定されず、１本鎖及び２本鎖のいずれであってもよい。核酸には、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）及びこれらの混成物（例えば、ＤＮＡ－ＲＮＡのハイブリッド２本鎖、ＤＮＡ及びＲＮＡが１本鎖に連結されたキメラ核酸）が含まれる。核酸の構成単位には、主としてアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）等のプリン塩基及びチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）等のピリミジン塩基が含まれるが、対象のタンパク質への翻訳を行う限り、これらの修飾物も含まれる。本発明で用いられる核酸は、好ましくは対象のタンパク質をコードするｍＲＮＡ又はｃＤＮＡである。
　本発明における核酸及びタンパク質は、植物のバイオマスを増大させる限り特に限定されないが、双子葉植物又は単子葉植物由来であることが好ましい。あるいは、ヒメツリガネゴケ由来であってよい。双子葉植物としては、例えば、シロイヌナズナ、ダイズ、ダイコン、ポプラ、ブドウ、ワタ、ナタネ、テンサイ、タバコ、トマトなどが挙げられ、これらのうち好ましくはシロイヌナズナ、ダイズ、ダイコンであり、より好ましくはシロイヌナズナ、ダイズであり、さらに好ましくはシロイヌナズナである。単子葉植物としては、イネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、ソルガム、サトウキビ、タマネギなどが挙げられ、これらのうち好ましくはイネ、トウモロコシ、コムギであり、より好ましくはイネ、トウモロコシである。
　本発明におけるタンパク質としては、各種植物由来のＢＩＬ７タンパク質を利用することができ、例えば、シロイヌナズナ、ダイズ、イネ、トウモロコシ、ダイコン、ポプラ、ブドウ、又はヒメツリガネゴケ由来のＢＩＬ７タンパク質（即ち、配列番号７、９、１１、１３、１５、１７、１９及び２１のいずれかで表されるアミノ酸配列を含むタンパク質）とすることができる。また、本発明におけるタンパク質には各種植物由来のＢＩＬ７タンパク質のホモログも利用可能であり、例えば、シロイヌナズナＢＩＬ７のホモログタンパク質（即ち、配列番号２３、２５及び２７のいずれかで表されるアミノ酸配列を含むタンパク質）を用いてもよい。
　本発明ではまた、一つの態様として、各種植物由来のＢＩＬ７タンパク質及びそのホモログのアミノ酸配列（例えば、配列番号７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５及び２７のいずれかで表されるアミノ酸配列）において、１又は数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ植物のバイオマスを増大させる活性を有するタンパク質も含まれる。ここで、数個のアミノ酸としては、例えば、２～４０個、２～３０個、２～２０個、２～１０個、２～７個、２～５個、５個、４個、３個、２個のアミノ酸を意味する。アミノ酸の欠失、挿入、置換又は付加は、当該技術分野において公知の方法を用いて（例えば、核酸を改変することにより）行うことができる。また、このようなアミノ酸配列は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むことが好ましい。
　核酸への変異の導入は、Kunkel法またはGapped duplex法等又はこれに準ずる方法により行うことができ、例えば、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばTransformerTM Site-Directed Mutagenesis Kit（Clontech Laboratories, Inc.）、又はQuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit（Agilent Technologies）が使用可能である。また、核酸への変異の導入には、ＥＭＳ（エチルメタンスルホン酸）、５－ブロモウラシル、２－アミノプリン、ヒドロキシルアミン、Ｎ－メチル－Ｎ’－ニトロ－Ｎニトロソグアニジン、その他の発ガン性化合物のような化学的変異剤が使用可能であり、Ｘ線、アルファー線、ベータ線、ガンマ線、イオンビーム等の放射線又は紫外線も使用可能である。
　本発明ではまた、一つの態様として、各種植物由来のＢＩＬ７タンパク質及びそのホモログのアミノ酸配列（例えば、配列番号７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５及び２７のいずれかで表されるアミノ酸配列）において、２５％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の同一性、又は、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の類似性を有し、且つ植物のバイオマスを増大させる活性を有するタンパク質も含まれる。アミノ酸配列の同一性及び類似性に関しては、上記に説明した通りである。また、このようなアミノ酸配列は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むことが好ましい。
　本発明におけるタンパク質として、シロイヌナズナ、ダイズ、イネ、トウモロコシ、ダイコン、ポプラ、ブドウ、又はヒメツリガネゴケ由来のＢＩＬ７タンパク質を用いた場合、当該タンパク質をコードする核酸としては、主として、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８及び２０のいずれかで表されるヌクレオチド配列を含む核酸が用いられる。また、シロイヌナズナＢＩＬ７の３種類のホモログタンパク質を用いた場合、当該タンパク質をコードする核酸としては、主として、配列番号２２、２４及び２６のいずれかで表されるヌクレオチド配列を含む核酸が用いられる。
　配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４及び２６のいずれかで表されるヌクレオチド配列を含む核酸については、そのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなる核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ植物のバイオマスを増大させる活性を有するタンパク質をコードする核酸も、本発明の一態様として含まれる。
　ここで、「ストリンジェントな条件下」とは、中程度または高程度にストリンジェントな条件においてハイブリダイズすることを意味する。具体的には、中程度にストリンジェントな条件は、例えば、核酸の長さに基づき、一般の技術を有する当業者によって、容易に決定することが可能である。基本的な条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，第３版，第６章，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　２００１に示され、例えば５×ＳＳＣ、０．５％　ＳＤＳ、１．０ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の前洗浄溶液、約４２℃での、約５０％ホルムアミド、２×ないし６×ＳＳＣ、好ましくは５×ないし６×ＳＳＣ、０．５％　ＳＤＳ（または約４２℃での約５０％ホルムアミド中の、スターク溶液などの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）のハイブリダイゼーション条件、及び例えば、約５０℃ないし６８℃、０．１×、ないし、６×ＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳの洗浄条件の使用が含まれる。好ましくは中程度にストリンジェントな条件は、約５０℃、６×ＳＳＣ、０．５％　ＳＤＳのハイブリダイゼーション条件（及び洗浄条件）を含む。
　高ストリンジェントな条件もまた、例えば核酸の長さに基づき、当業者によって、容易に決定することが可能である。一般に、こうした条件は、中程度にストリンジェントな条件よりも高い温度及び／又は低い塩濃度でのハイブリダイゼーション（例えば、０．５％程度のＳＤＳを含み、約６５℃、６×ＳＳＣないし０．２×ＳＳＣ、好ましくは６×ＳＳＣ、より好ましくは２×ＳＳＣ、より好ましくは０．２×ＳＳＣ、あるいは０．１×ＳＳＣのハイブリダイゼーション）及び／又は洗浄を含み、例えば上記のようなハイブリダイゼーション条件、及びおよそ６５℃、ないし６８℃、０．２×ないし０．１×ＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳの洗浄を伴うと定義される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の緩衝液では、ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ　ＮａＣｌおよび１５ｍＭ　クエン酸ナトリウムである）にＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４、および１．２５ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４である）を代用することが可能であり、洗浄はハイブリダイゼーションが完了した後で１５分間ないし１時間程度行う。
　また、プローブに放射性物質を使用しない市販のハイブリダイゼーションキットを使用することもできる。具体的には、ＥＣＬ　ｄｉｒｅｃｔ　ｌａｂｅｌｉｎｇ　＆　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を使用したハイブリダイゼーション等が挙げられる。ストリンジェントなハイブリダイゼーションとしては、例えば、キット中のｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒにＢｌｏｃｋｉｎｇ試薬を５％（ｗ／ｖ）、ＮａＣｌを０．５Ｍになるように加え、４２℃で４時間行い、洗浄は、０．４％　ＳＤＳ、０．５ｘＳＳＣ中で、５５℃で２０分を２回、２ｘＳＳＣ中で室温、５分を一回行う、という条件が挙げられる。
　本発明ではまた、一つの態様として、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４及び２６のいずれかで表されるヌクレオチド配列と７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有し、且つ植物のバイオマスを増大させる活性を有するタンパク質をコードする核酸も含まれる。
　２つのヌクレオチド配列の同一性は、視覚的検査と数学的計算により決定可能であるか、またはより好ましくは、この比較はコンピュータ・プログラムを使用して配列情報を比較することによってなされる。代表的な、好ましいコンピュータ・プログラムは、遺伝学コンピュータ・グループ（ＧＣＧ；ウィスコンシン州マディソン）のウィスコンシン・パッケージ、バージョン１０．０プログラム「ＧＡＰ」である（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，　ｅｔ　ａｌ．，　１９８４，　Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，　１２：　３８７）。この「ＧＡＰ」プログラムの使用により、２つのヌクレオチド配列の比較の他に、２つのアミノ酸配列の比較、ヌクレオチド配列とアミノ酸配列との比較を行うことができる。ここで、「ＧＡＰ」プログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）ヌクレオチドについての（同一物について１、及び非同一物について０の値を含む）一元（ｕｎａｒｙ）比較マトリックスのＧＣＧ実行と、Ｓｃｈｗａｒｔｚ及びＤａｙｈｏｆｆ監修「ポリペプチドの配列および構造のアトラス（Ａｔｌａｓ　ｏｆ　Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）」国立バイオ医学研究財団、３５３－３５８頁、１９７９により記載されるような、ＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＢｕｒｇｅｓｓ，　Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，　１４：　６７４５，　１９８６の加重アミノ酸比較マトリックス；又は他の比較可能な比較マトリックス；（２）アミノ酸の各ギャップについて３０のペナルティと各ギャップ中の各記号について追加の１のペナルティ；又はヌクレオチド配列の各ギャップについて５０のペナルティと各ギャップ中の各記号について追加の３のペナルティ；（３）エンドギャップへのノーペナルティ：及び（４）長いギャップへは最大ペナルティなし、が含まれる。当業者により使用される他の配列比較プログラムでは、例えば、米国国立医学ライブラリーのウェブサイト：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bls.htmlにより使用が利用可能なＢＬＡＳＴＮプログラム、バージョン２．２．７、またはＵＷ－ＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムが使用可能である。ＵＷ－ＢＬＡＳＴ２．０についての標準的なデフォルトパラメーターの設定は、以下のインターネットサイト：http://blast.wustl.eduに記載されている。さらに、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、ＢＬＯＳＵＭ６２アミノ酸スコア付けマトリックスを使用し、使用可能である選択パラメーターは以下の通りである：（Ａ）低い組成複雑性を有するクエリー配列のセグメント（ＷｏｏｔｔｏｎおよびＦｅｄｅｒｈｅｎのＳＥＧプログラム（Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　１９９３）により決定される；ＷｏｏｔｔｏｎおよびＦｅｄｅｒｈｅｎ，　１９９６「配列データベースにおける組成編重領域の解析（Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌｌｙ　ｂｉａｓｅｄ　ｒｅｇｉｏｎｓ　ｉｎ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｄａｔａｂａｓｅｓ）」Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，　２６６：　５４４－７１も参照されたい）、又は、短周期性の内部リピートからなるセグメント（ＣｌａｖｅｒｉｅおよびＳｔａｔｅｓ（Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　１９９３）のＸＮＵプログラムにより決定される）をマスクするためのフィルターを含むこと、及び（Ｂ）データベース配列に対する適合を報告するための統計学的有意性の閾値、またはＥ－スコア（ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ，　１９９０）の統計学的モデルにしたがって、単に偶然により見出される適合の期待確率；ある適合に起因する統計学的有意差がＥ－スコア閾値より大きい場合、この適合は報告されない）；好ましいＥ－スコア閾値の数値は０．５であるか、または好ましさが増える順に、０．２５、０．１、０．０５、０．０１、０．００１、０．０００１、１ｅ－５、１ｅ－１０、１ｅ－１５、１ｅ－２０、１ｅ－２５、１ｅ－３０、１ｅ－４０、１ｅ－５０、１ｅ－７５、または１ｅ－１００である。
（２）コンストラクト
　本発明は、上記の核酸及びプロモーターを含むコンストラクトを提供する。本明細書においてコンストラクトとは、複数の核酸を連結させた結合物を意味し、本発明では、その構成単位として上記の核酸とプロモーターとが含まれる。本発明における核酸とプロモーターとは直接的に連結されている必要はなく、別種の核酸を介して間接的に連結されていてもよい。プロモーターは、本発明の核酸に作動可能に連結していることが好ましい。「作動可能に連結する」とは、プロモーターがその機能を発揮するように、即ち、対象とする核酸の転写を行うように連結することを意味する。
　プロモーターは、対象とする核酸の転写を植物細胞内で行うことができる限り、特に限定されない。そのようなプロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（ＣａＭＶ３５Ｓ）、各種ユビキチンプロモーター、各種アクチンプロモーター、タバコＰＲ１ａ遺伝子プロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子プロモーター、ナピン遺伝子プロモーター、オレオシン遺伝子プロモーター等が挙げられる。
　また、本発明では、植物において部位特異的に発現させる機能を有するプロモーターも用いることができる。そのようなプロモーターとしては、葉部特異的に核酸を発現するプロモーター（例えば、イネｐｓｂ０遺伝子プロモーター（特開２０１０－１６６９２４））、茎部特異的に核酸を発現するプロモーター（例えば、シロイヌナズナＦＡ６プロモーター（Gupta et al. 2012 Plant Cell Rep. 31: 839-850.））、根部特異的に核酸を発現するプロモーター（例えば、ＲＣｃ３プロモーター（Xu et al. 1995 Plant Mol Biol 27: 237-248））、主に根、茎、葉の栄養器官で発現するプロモーター（例えば、シロイヌナズナＡＳプロモーター：非特許文献１）等が挙げられる。
　また、本発明では、誘導性プロモーターも使用可能である。そのようなプロモーターとしては、例えば、糸状菌・細菌・ウイルスの感染や侵入、低温、高温、乾燥、紫外線の照射、オーキシンやブラシノステロイドといったホルモン等の特定の化合物の散布等の外因によって発現することが知られているプロモーター等が挙げられる。このようなプロモーターとしては、例えば、糸状菌・細菌・ウイルスの感染や侵入によって発現するイネキチナーゼ遺伝子のプロモーター（Xu et al. 1996 Plant Mol．Biol．30：387）やタバコのＰＲタンパク質遺伝子のプロモーター（Ohshima et al. 1990 Plant Cell 2:95）、低温によって誘導されるイネの「ｌｉｐ１９」遺伝子のプロモーター（Aguan et al. 1993 Mol. Gen. Genet. 240:1）、高温によって誘導されるイネの「ｈｓｐ８０」遺伝子と「ｈｓｐ７２」遺伝子のプロモーター（Van Breusegem et al. 1994 Planta 193:57）、乾燥によって誘導されるシロイヌナズナの「ｒａｂ１６」遺伝子のプロモーター（Nundy et al. 1990 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:1406）、紫外線の照射によって誘導されるパセリのカルコン合成酵素遺伝子のプロモーター（Schulze-Lefert et al. 1989 EMBO J. 8:651）、嫌気的条件で誘導されるトウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター（Walker et al. 1987 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:6624）、塩ストレスによって誘導されるプロモーター（Shinozaki, K. and Yamaguchi-Shinozaki, K., Curr. Opin. Plant Biol. 3, 217-223 (2000)）等が挙げられる。
（３）ベクター
　本発明は、上記のコンストラクトを含むベクターを提供する。即ち、本発明では、作動可能に連結されたプロモーターと本発明における核酸とを含むベクターが提供される。
　ベクターは、簡便には当業界において入手可能な組換え用ベクターに所望の核酸を常法により連結することによって、調製することができる。本発明における核酸を用いて植物のバイオマスを増大させる場合には、植物形質転換用ベクターが特に有用である。本発明で使用されるベクターは、植物細胞中で本発明の目的とする効果を達成するために使用できるものであれば特に限定されず、例えば、ｐＢＩ系のベクター、pBluescript系のベクター、ｐＵＣ系のベクター等を使用できる。ｐＢＩ系のベクターとしては、例えば、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１０１．２、ｐＢＩ１０１．３、ｐＢＩ２２１などが挙げられる。ｐＢＩ系のベクター等のバイナリーベクターは、アグロバクテリウムを介して植物に目的の核酸を導入できるという点で好ましい。また、pBluescript系のベクターとしては、例えば、pBluescript SK(+)、pBluescript SK(-)、pBluescript II KS(+)、pBluescript II KS(-)、pBluescript II SK(+)、pBluescript II SK(-)などが挙げられる。ｐＵＣ系のベクターとしては、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１９等を挙げることができる。pBluescript系のベクター、ｐＵＣ系ベクターは、植物に核酸を直接導入することができるという点で好ましい。さらにはpGreenシリーズ（www.pgreen.ac.uk）、pCAMBIAシリーズ（www.cambia.org）などのバイナリーベクターや、pSB11（Komari et al, 1996, Plant J, 10: 165-174）、pSB200（Komori et al, 2004, Plant J, 37: 315-325）などのスーパーバイナリーベクターも好ましく使用することができる。
　また、上記ベクターは、転写産物の安定化に必要なポリアデニレーション部位を含む転写ターミネーター配列を含むことが好ましい。当業者は、転写ターミネーター配列を適切に選択することができる。
　転写ターミネーター配列は、転写終結部位としての機能を有していれば特に限定されるものではなく、公知のものであってもよい。転写ターミネーター配列は、使用するプロモーターに応じて選択可能であり、例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓの転写終結領域（ＣａＭＶ３５Ｓターミネーター）、ノパリン合成酵素遺伝子の転写終結領域（Ｎｏｓターミネーター）等を用いることができる。上記組換え発現ベクターにおいては、転写ターミネーター配列を適当な位置に配置することにより、植物細胞に導入された後に、不必要に長い転写物を合成する現象等の発生を防止することができる。
　また、上記組換え発現ベクターには、さらに他の核酸セグメントを含んでいてもよい。当該他の核酸セグメントは特に限定されるものではないが、形質転換体選別マーカー、エンハンサー、翻訳効率を高めるための塩基配列等を挙げることができる。また、上記組換え発現ベクターは、さらにＴ－ＤＮＡ領域を有していてもよい。Ｔ－ＤＮＡ領域は特にアグロバクテリウムを用いて上記組換え発現ベクターを植物体に導入する場合に遺伝子導入の効率を高めることができる。
　形質転換体選別マーカーとしては、例えば薬剤耐性遺伝子を用いることができる。かかる薬剤耐性遺伝子の具体的な一例としては、例えば、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、カナマイシン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール等に対する薬剤耐性遺伝子を挙げることができる（抗生物質カナマイシン又はゲンタマイシンに耐性であるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、ハイグロマイシンに耐性であるハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子）。また、除草剤ホスフィノスリシンに耐性であるホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子等も利用可能である。これにより、上記抗生物質や除草剤を含む培地中で生育する植物体を選択することによって、形質転換された植物体を容易に選別することができる。
　翻訳効率を高めるためのヌクレオチド配列としては、例えばタバコモザイクウイルス由来のｏｍｅｇａ配列を挙げることができる。このｏｍｅｇａ配列をプロモーターの非翻訳領域（５’ＵＴＲ）に配置させることによって、上記融合遺伝子の翻訳効率を高めることができる。
　また、エンハンサーとしては、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター内の上流側の配列を含むエンハンサー領域があげられる。このように、上記組換え発現ベクターには、その目的に応じて、さまざまな核酸セグメントを含ませることができる。
　組換え発現ベクターの構築方法についても特に限定されるものではなく、適宜選択された母体となるベクターに、本発明における核酸、プロモーター、及びターミネーター配列、並びに必要に応じて他のＤＮＡセグメントを所定の順序となるように導入すればよい。核酸を母体となるベクターに挿入するには、常法にしたがい、精製された核酸を適当な制限酵素で切断し、適当なベクターの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入する方法などが用いられる（例えば、Molecular Cloning, 5.61-5.63）。
　当業者においては、所望の遺伝子を有するベクターを、一般的な遺伝子工学技術によって、適宜、作製することが可能である。通常、市販の種々のベクターを利用することにより容易に作製できる。
（４）宿主細胞
　本発明は、上記のベクターを含む宿主細胞（換言すれば、本発明における核酸が導入された宿主細胞）を提供する。
　本発明の宿主細胞は、特に限定されないが、植物細胞であることが好ましい。当該植物細胞には、種々の形態の植物細胞、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、植物体中の細胞等が含まれる。
　植物細胞は、特に限定されないが、双子葉植物由来又は単子葉植物由来の細胞を用いることができる。双子葉植物としては、シロイヌナズナ、ダイズ、ワタ、ナタネ、テンサイ、タバコ、トマト、ダイコン、ブドウ、ポプラなどが挙げられ、これらのうち好ましくはシロイヌナズナ、ダイズ、ワタ、ナタネ、タバコ、トマトであり、さらに好ましくはシロイヌナズナ、ダイズ、ワタ、ナタネである。単子葉植物としては、イネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、ソルガム、サトウキビ、タマネギなどが挙げられ、これらのうち好ましくはイネ、トウモロコシ、コムギ、ソルガムであり、より好ましくはイネ、トウモロコシである。
　本発明における核酸も種々の植物種由来のものを用いることができ、本発明では、核酸が由来する植物種と宿主細胞（植物細胞）が由来する植物種とは一致していてもよく、或いは相違していてもよい。即ち、本発明は、宿主細胞（植物細胞）の植物種と同一の植物種由来の核酸又はこれを含むベクターが導入された宿主細胞（植物細胞）、及び宿主細胞（植物細胞）の植物種とは異なる植物種由来の核酸又はこれを含むベクターが導入された宿主細胞（植物細胞）のいずれをも提供することができる。また、本発明では、核酸が由来する植物が双子葉植物の場合には、双子葉植物の宿主細胞を選択してもよく、また、核酸が由来する植物が単子葉植物の場合には、単子葉植物の宿主細胞を選択してもよい。
　宿主細胞内で対象の核酸を発現させる方法としては、当該核酸を適当なベクターに組み込み、例えば、ポリエチレングリコール法、アグロバクテリウム法、リポソーム法、カチオニックリポソーム法、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法（エレクトロポレーション）（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons．Section 9.1-9.9）、リポフェクション法（GIBCO-BRL社製）、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法等の当業者に公知の方法により生体内に導入する方法が挙げられる。本発明においては、アグロバクテリウム法を好ましく使用することができる。植物細胞内に核酸を導入する場合、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール法等を用いて直接的に核酸を導入することもできるが、植物への遺伝子導入用プラスミドに組込み、これをベクターとして、植物感染能のあるウイルスあるいは細菌を介して、間接的に植物細胞に導入することもできる。かかるウイルスとしては、例えば、代表的なウイルスとして、カリフラワーモザイクウイルス、タバコモザイクウイルス、ジェミニウイルス等が挙げられ、細菌としては、アグロバクテリウム等が挙げられる。アグロバクテリウム法により、植物への遺伝子導入を行う場合には、市販のプラスミドを用いることができる。
（５）形質転換植物
　本発明は、上記のベクターが導入された植物（換言すれば、本発明における核酸が導入された植物）を提供する。本発明の宿主細胞が植物細胞である場合、当該植物細胞は本発明の植物（形質転換植物）に包含される。本発明の植物には、植物細胞のみならず、植物体全体、植物器官（例えば、根、茎、葉、花弁、種子、果実、完熟胚、未熟胚、胚珠、子房、茎頂、葯、花粉等）、植物組織（例えば、表皮、篩部、柔組織、木部、維管束等）、これらの切片、カルス、苗条原基、実生、多芽体、毛状根及び培養根等のいずれもが含まれる。
　本発明の植物は、双子葉植物又は単子葉植物である。双子葉植物としては、シロイヌナズナ、ダイズ、ワタ、ナタネ、テンサイ、タバコ、トマト、ダイコン、ブドウ、ポプラなどが挙げられ、これらのうち好ましくはシロイヌナズナ、ダイズ、ワタ、ナタネ、タバコ、トマトであり、さらに好ましくはシロイヌナズナ、ダイズ、ワタ、ナタネである。単子葉植物としては、イネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、ソルガム、サトウキビ、タマネギなどが挙げられ、これらのうち好ましくはイネ、トウモロコシ、コムギ、ソルガムであり、より好ましくはイネ、トウモロコシである。
　本発明の植物においては、上記の宿主細胞と同様に、その種は、導入される核酸が由来する植物種と一致していてもよく、或いは相違していてもよい。即ち、本発明は、同一種の植物由来の核酸又はこれを含むベクターが導入された植物（核酸又はこれを含むベクターが導入された植物であって、該植物の種は、該核酸が由来する植物種と同一である、前記植物）、及び異なる種の植物由来の核酸又はこれを含むベクターが導入された植物（核酸又はこれを含むベクターが導入された植物であって、該植物の種は、該核酸が由来する植物種と異なる、前記植物）のいずれをも提供することができる。また、本発明において、核酸が由来する植物が双子葉植物の場合には、導入先の植物は双子葉植物であってよく、また、核酸が由来する植物が単子葉植物の場合には、導入先の植物は単子葉植物であってよい。
　本発明は、以下の植物を提供することができる。
（ｉ）単子葉植物由来の核酸又はこれを含むベクターが導入された単子葉植物。
（ｉｉ）双子葉植物由来の核酸又はこれを含むベクターが導入された単子葉植物。
（ｉｉｉ）双子葉植物由来の核酸又はこれを含むベクターが導入された双子葉植物。
（ｉｖ）単子葉植物由来の核酸又はこれを含むベクターが導入された双子葉植物。
これらのうち、好ましくは、
（ｉ）単子葉植物由来の核酸又はこれを含むベクターが導入された単子葉植物、
（ｉｉ）双子葉植物由来の核酸又はこれを含むベクターが導入された単子葉植物、及び
（ｉｉｉ）双子葉植物由来の核酸又はこれを含むベクターが導入された双子葉植物、
であり、より好ましくは、
（ｉ）単子葉植物由来の核酸又はこれを含むベクターが導入された単子葉植物、及び
（ｉｉ）双子葉植物由来の核酸又はこれを含むベクターが導入された単子葉植物、
である。
　本発明の植物には、本発明における核酸又はこれを含むベクターが導入された植物細胞を生育させた植物体、及び当該植物体の後代、子孫またはクローンである植物、並びにこれらの繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等）が含まれる。形質転換植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である。上記技術については既に確立し、本発明の技術分野において広く用いられており、本発明において上記方法を好適に用いることができる。
　形質転換された植物細胞を再分化させて植物体を再生させる方法は、植物細胞の種類により異なるが、例えばイネであればFujimuraら（Plant Tissue Culture Lett. 2:74 (1995)）の方法が挙げられ、トウモロコシであればShillitoら（Bio/Technology 7:581 (1989)）の方法やGorden-Kammら（Plant Cell 2:603(1990)）の方法が挙げられる。上記手法により再生され、かつ栽培した形質転換植物体中の導入された外来核酸の存在は、公知のＰＣＲ法やサザンハイブリダイゼーション法によって、又は植物体中のＤＮＡの塩基配列を解析することによって確認することができる。この場合、形質転換植物体からのＤＮＡの抽出は、公知のJ.Sambrookらの方法（Molecular Cloning、第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）にしたがって実施することができる。
　例えば、再生させた植物体中に存在する外来核酸を、ＰＣＲ法を用いて解析する場合には、上記のように再生植物体から抽出したＤＮＡを鋳型として増幅反応を行う。また、本発明の核酸、あるいは改変された核酸のヌクレオチド配列に従って適当に選択されたヌクレオチド配列をもつ合成したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、これらを混合させた反応液中において増幅反応を行うこともできる。増幅反応においては、ＤＮＡの変性、アニーリング、伸張反応を数十回繰り返すと、対象の核酸のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片の増幅生成物を得ることができる。増幅生成物を含む反応液を例えばアガロース電気泳動にかけると、増幅された各種のＤＮＡ断片が分画されて、そのＤＮＡ断片が本発明の遺伝子に対応することを確認することが可能である。
　一旦、ゲノム内に対象の核酸が導入された形質転換植物体が得られれば、該植物体から有性生殖又は無性生殖により子孫を得ることが可能である。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。本発明には、本発明における核酸又はこれを含む組換え発現ベクターが導入された植物細胞、該細胞を含む植物体、該植物体の子孫及びクローン、並びに該植物体、その子孫、及びクローンの繁殖材料が含まれる。つまり、本発明には、形質転換処理を施した再分化当代である「Ｔ０世代」やＴ０世代の植物の種子である「Ｔ１世代」などの後代植物や、それらを片親にして交配した雑種植物やその後代植物が含まれる。
　本発明の植物（形質転換植物）には、野生型植物（外部から本発明の核酸（例えば、ｂｉｌ７遺伝子）が導入されていない植物を含む）の有するｂｉｌ７遺伝子を制御するネイティブプロモーターについて、これを、上記の各種プロモーターに置換した、いわゆる「部位特異的形質転換体」も含まれる。このような植物は、置換されたプロモーターによって当該植物がもともと有しているｂｉｌ７遺伝子の発現が亢進することにより、バイオマスが増大するという特性を有する。本発明では、結果的に所定の核酸（例えば、ｂｉｌ７遺伝子）が植物内で強発現（過剰発現）する植物も一態様として含まれるため、このような部位特異的形質転換体も本発明の対象となり得る。このような植物を作製する方法として、ＣＲＩＳＰＲ法、ＺＦＮ法やＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）法などの公知のゲノム編集技術を用いることができる。
　このようにして作出された形質転換植物は、通常の植物に比べて、バイオマスが増大するという有利な特性を有することが期待される。本発明で形質転換をする対象として用いられる植物は特に限定されるものではなく、本発明の方法により、バイオマスが増大する種々の形質転換植物を作製することができる。
（６）植物のバイオマスを増大させる方法
　本発明は、上記の核酸を植物に導入する工程を含む、植物のバイオマスを増大させる方法を提供する。より具体的には、本発明の方法は、本発明における核酸及びこれと作動可能に連結されたプロモーターを含むベクターを作製する工程、当該ベクターを宿主細胞（植物細胞）に導入する工程、そして核酸が導入された植物細胞から植物体を再生する工程を含む、植物のバイオマスを増大させる方法である。本発明における核酸がコードするタンパク質が有する植物のバイオマスを増大させる活性を利用することにより、本発明の方法が得られる。
　本発明の方法では、上記の核酸のみならず、当該核酸を含むベクターを植物に導入してもよい。核酸又はこれを含むベクターを植物に導入する方法は上記に説明した通りであり、宿主細胞（植物細胞）への導入を通じて植物に当該核酸を導入することができる。また、本発明の方法で対象とされる植物の種類や導入される核酸が由来する植物種との関係等も上述した通りであり、その他当該方法で考慮されるべき用語、材料、手法等も上記の説明及び定義等に準じて解釈される。
（７）バイオマスが増大した植物の作製方法
　本発明は、上記の核酸を植物に導入する工程を含む、バイオマスが増大した植物の作製方法を提供する。より具体的には、本発明の方法は、本発明における核酸及びこれと作動可能に連結されたプロモーターを含むベクターを作製する工程、当該ベクターを宿主細胞（植物細胞）に導入する工程、そして核酸が導入された植物細胞から植物体を再生する工程を含む、バイオマスが増大した植物の作製方法である。本発明における核酸がコードするタンパク質が有する植物のバイオマスを増大させる活性を利用することにより、本発明の方法が得られる。
　本発明の方法では、上記の核酸のみならず、当該核酸を含むベクターを植物に導入してもよい。核酸又はこれを含むベクターを植物に導入する方法は上記に説明した通りであり、宿主細胞（植物細胞）への導入を通じて植物に当該核酸を導入することができる。また、本発明の方法で対象とされる植物の種類や導入される核酸が由来する植物種との関係等も上述した通りであり、その他当該方法で考慮されるべき用語、材料、手法等も上記の説明及び定義等に準じて解釈される。
（８）バイオマスが増大した植物のスクリーニング方法
　本発明は、上記に説明したタンパク質又は核酸を利用したバイオマスが増大した植物のスクリーニング方法を提供し、当該方法には下記の工程が含まれる。
（１）被験植物および野生型植物において、本発明におけるタンパク質又はそれをコードする核酸の発現量を測定する工程、
（２）工程（１）により得られた発現量を比較する工程、及び
（３）野生型植物での発現量よりも高い発現量を示す被験植物を選択する工程。
　本発明のスクリーニング方法において対象とされる植物の形態としては、上記と同様に、植物細胞のみならず、植物体全体、植物器官（例えば、根、茎、葉、花弁、種子、果実、完熟胚、未熟胚、胚珠、子房、茎頂、葯、花粉等）、植物組織（例えば、表皮、篩部、柔組織、木部、維管束等）、これらの切片、カルス、苗条原基、実生、多芽体、毛状根及び培養根等が含まれるが、スクリーニングを行うという観点から、これらは特に植物が成熟体となる前の状態、或いは幼若な状態であることが好ましい。そのため、種子（完熟種子、未熟種子）、完熟胚、未熟胚、カルス、苗条、実生等は、本発明のスクリーニング方法において特に好ましい植物の形態である。
　本明細書において野生型植物とは、対象とされる植物の中で最も高い頻度で見いだされる表現型の系統又は個体であり、主として何らの遺伝子操作も行われていない植物種をいう。野生型植物の形態は、上記の形態のいずれもが利用可能であるが、被験植物の形態と一致させることが好ましい。
　タンパク質又は核酸の発現量を測定する方法は、当該技術分野において周知の方法を利用することができる。例えば、タンパク質については、植物からタンパク質を抽出し、本発明におけるタンパク質（例えば、各種植物のＢＩＬ７タンパク質）に対する抗体を作製又は入手し、当該抗体を用いてウェスタンブロッテング、イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ等）又はこれらに準ずる方法を行うことにより、その発現量を測定することができる。使用される抗体はモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれであってもよく、また、当該抗体は抗体分子それ自体であってもよいし、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦ(ａｂ’)２等のフラグメントであってもよい。また、抗体の標識には、自体公知の放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質等が用いられる。核酸の発現量については、例えば、植物からＲＮＡを抽出して、本発明における核酸（例えば、各種植物のｂｉｌ７遺伝子）のヌクレオチド配列に基づいて当該核酸を特異的に増幅し得るプライマー、又は特異的に検出し得るプローブを作製又は入手し、当該プライマー又はプローブを用いてＲＴ－ＰＣＲ、ノーザンブロッテング又はこれらに準ずる方法を行うことにより、その発現量を測定することができる。
　タンパク質又は核酸の発現量は定性的であっても定量的であってもよいが、数値（測定値）として定量化することが好ましい。被験植物および野生型植物より得られた発現量を相互に比較し、被験植物における発現量が野生型植物における発現量よりも多い場合に植物のバイオマスが増大すると判定することができ、そのような被験植物を選択することによって、植物のバイオマスが増大した植物のスクリーニングを行うことができる。
（９）バイオマスが増大した植物を判定する方法
　本発明は、上記に説明したタンパク質又は核酸を利用したバイオマスが増大した植物を判定する方法を提供し、当該方法には下記の工程が含まれる。
（１）被験植物および野生型植物において、本発明におけるタンパク質又はそれをコードする核酸の発現量を測定する工程、
（２）工程（１）により得られた発現量を比較する工程、及び
（３）被験植物での発現量が野生型植物での発現量よりも高いことを確認する工程。
　本発明の判定方法は、本発明におけるタンパク質又は核酸をマーカー（タンパク質マーカー又は核酸マーカー）として使用することと同義である。即ち、本発明におけるタンパク質又は核酸が植物において検出され、且つその発現量が野生型での発現量よりも高い場合には、当該植物は植物のバイオマスが増大することが期待される。
　本発明の判定方法において対象とされる植物の形態は、上記のスクリーニング方法と同様であり、上記に例示したあらゆる部位等がその形態として含まれるが、特に植物が成熟体となる前の状態、或いは幼若な状態にある形態が好ましい。そのため、種子（完熟種子、未熟種子）、完熟胚、未熟胚、カルス、苗条、実生等は、本発明の判定方法において特に好ましい植物の形態である。
　本発明の判定方法におけるタンパク質又は核酸の発現量の測定方法は、当該技術分野において周知の方法を利用することができ、その具体例は上記のスクリーニング方法で説明した通りである。また、本発明においてタンパク質又は核酸の発現量は定性的であっても定量的であってもよいが、数値（測定値）として定量化することが好ましい。被験植物および野生型植物より得られた発現量を相互に比較し、被験植物における発現量が野生型植物における発現量よりも多いことを確認することによって、植物のバイオマスが増大すると判定することができる。
　以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらも本発明の技術的範囲に含まれる。
実施例１　bil7変異体の選抜
　FOX hunting system（Full-length cDNA Over-expression Gene Hunting System）は、完全長cDNAを植物に導入して高発現させることによりもたらされる形質の変化からDNAの機能を明らかにする方法である（WO03/018808）。ここでは、約8,800種のアラビドプシス（シロイヌナズナ）FOXライン（Ichikawa et al. 2006）より、ブラシノステロイド（BR）生合成阻害剤であるブラシナゾール（Brz）存在下、暗所で、野生型アラビドプシス（シロイヌナズナ）と比べて胚軸が伸長するbil（Brz-insensitive-long-hypocothl）形態を示すラインの選抜を行った。Brz存在下、暗所においてbil形態を示す植物体は、Brz耐性を有していると考えられる。選抜は二次選抜まで行い、選抜されたラインについては野生型とのback crossにより作出した交配F１世代植物体がBrz存在暗所下でbil形態を示すことを確認し、bil変異が優性形質である事を確認した。FOXラインは機能獲得型変異体であるため、優性変異はその変異原因がFOXに由来することを示すと考えられた。
　まずFOXライン20～40ラインの種子を混合し、暗所において、Brz 3μM発芽条件下で育成し、胚軸伸長ラインを一次選抜した。次に一次選抜の個体を育成し、得られた種子を、再び暗所、Brz 3μM発芽条件下で育成して胚軸伸長ラインを二次選抜した。なお、二次選抜時には、bil形態が強いものが1/4、中程度のものが2/4、野生型と同等のものが1/4に分離したことからもbil変異が優性形質である事が確認できた。この選抜の結果、野生型Columbia-0（Col-0）より明らかに胚軸伸長を示す数ラインの候補変異体を得た。その中で、最も長い胚軸伸長形態を示したNo.72ラインをbil7-1D（Brz-insensitive-long-hypocothl 7-1D）と名付け、解析を進めることとした。bil7-1DのBrz 3μM存在暗所下における胚軸伸長は、野生型の約2.5倍であり、BR情報伝達のマスター転写因子BIL1／BZR１の機能獲得型変異体bil1-１D/bzr1-1D（耐Brzを示すポジティブコントロール）と同等の強い耐Brz変異形質であると考えられた（図１）。
　bil7-1Dの形態的特徴を解析する為、成熟時の形態観察を行った。bil7-1D変異体の生育がほぼ止まったと思われた60日目の成熟個体について形態解析を行った結果、bil7-1Dは野生型に比べ花茎長が約1.5倍に伸長することが明らかとなった（図２Ａ、Ｃ）。また、野生型と比べ、花茎数はほぼ変わらないが、二次花茎数は約2倍に増加していることが明らかとなった（図２Ｄ、Ｅ）。また、ロゼッタ葉は野生型に比べ丸みを帯びており、bil1-1D/bzr1-1Dのロゼッタ葉に似た形態を示した（図２Ｂ）。
　さらに、生殖器官について解析を行った。bil7-1Dでは、花において花弁の展開が正常に起こらず（図３Ａ）、そのため花が存在していても正常な鞘が生成してこない現象が、全てでは無いものの約45％程度の花において観察された（図３Ｂ）。そのため、bil7-1Dでは、野生型に比べ花の数は増加するが、正常な鞘の数は減少していた（図３Ｄ、Ｅ）。また、1鞘当たりの種子数も減少していたことから、総種子数は減少していた（図３Ｆ）。種子は野生型に比べて大きくなり（図３Ｃ）、種子重量については野生型に比べ約2倍に増加していた（図３Ｇ）。
　bil7-1Dの生育過程について解析した結果、若干の開花遅延（図４Ａ）、生育遅延（図４Ｂ）の傾向はあるものの、開花遅延型であると報告されているbil1-1D/bzr1-1D（Zhang et al. 2013）の値を考慮すると、野生型と大きな差は無いと考えられた。また経時的観察では、bil7-1Dは花茎伸長の速度は野生型とほぼ変わらないものの、野生型が播種後約45日目で開花期が停止し、花茎伸長も停止するのに対し、bil7-1Dは約60日目まで開花期および花茎伸長が継続した（図４Ｃ）。これらの結果より、bil7-1Dは花茎伸長において顕著に生育促進的な形態を示すことが明らかとなった。
実施例２　bil7-1D変異原因遺伝子の単離と同定
　bil7-1D植物体の形態解析から、変異原因遺伝子BIL7は花茎伸長などの生育促進形態や、BR情報伝達の活性化を引き起こすと推測された。そこでbil7-1D変異原因遺伝子BIL7を単離し、相同性タンパク質の解析や機能ドメインの探索を行った。続いてBIL7高発現形質転換体（BIL7-OX）を作製し、BIL7候補遺伝子を高発現させることによりbil7-1D形態が再現されることを確認して、BIL7遺伝子の確定を行った。
2-1　bil7-1D変異原因遺伝子の単離
　bil7-1D変異体の導入cDNAについて、変異体ゲノムをテンプレートとし、35S CaMVプロモーターとNOSターミネーターに特異的なプライマーを用いたPCR法とシークエンスにより遺伝子断片を得た。
　bil7-1D変異体からロゼッタ葉を採取し、Nucleon DNA Extraction Kit（Amersham）を用いて、ゲノムDNAを抽出した。次に抽出したDNAに対してPCRを行った。PCR反応液、反応条件、プライマーは以下のとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　このようにして得られたPCR産物について塩基配列を決定した結果、機能が未知の新規タンパク質をコードする遺伝子がBIL7候補遺伝子として提示された。
　このBIL7候補遺伝子の発現をリアルタイムRT-PCRにより解析した。RNeasy Plant Mini Kit（QIAGEN）を用いて植物体からTotal RNAを抽出した。次にTakara PrimeScript RT regant Kit （Perfect Realtime）を用いて反応液を作製し、cDNA反応（37℃ 15min、85℃ 5 sec、4℃ end）にてcDNAを合成した。このようにして合成されたcDNAをテンプレートとして、以下の条件でリアルタイムPCRを行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　その結果、bil7-1DにおけるBIL7候補遺伝子の発現量が、野生型に比べ約40倍以上増加していた（図５）。この結果とbil7-1Dが優性の変異体であることと併せて、BIL7候補遺伝子の過剰発現がbil7-1Dの原因であると示唆された。
2-2　BIL7遺伝子のアミノ酸配列の解析
　BIL7候補遺伝子が機能未知のタンパク質をコードしていることから、翻訳産物の機能を推測するため、BIL7のアミノ酸配列を基に、PROSITE（http://prosite.expasy.org/）およびPSORT（http://psort.hgc.jp/form.html）データベースによるモチーフ検策とGENETYX-MACによる疎水性解析を行った。
　その結果、BIL7はその配列にN-ミリストイル化予測サイトとN-グリコシル化予測サイトが存在した。その他には機能を予測出来るようなドメインは存在しなかった。膜貫通領域は認められず、核移行シグナル（NLS）が存在する事から核局在が推測された。
　BIL7相同タンパク質はシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）に3種存在した。また他種植物では、ダイコン（Raphanus sativus）、ダイズ（Glycine max）、ポプラ（Populus trichocarpa）、ブドウ（Vitis vinifera）、イネ（Oryza sativa）、ヒメツリガネコケ（Physcomitella patens）など広い植物種において相同性の高いタンパク質が存在することが明らかとなった。これらはいずれも報告例の無い新規かつ機能未知のタンパク質であった。また、これらの相同タンパク質群の中で、特に保存性が高い領域が認められた。この領域を基にさらに相同性を示すアミノ酸の検策を行ったが、機能が推測できるようなタンパク質は存在しなかった。また、ミリストイル化予測サイトの配列部分は、他の遺伝子でも比較的保存性が見られたことから、BIL7の機能はこれらタンパク質において共通する機能と関係している可能性が示唆された。
2-3　BIL7高発現形質転換体（BIL7-OX）の作製及び形態観察
　BIL7遺伝子を35S CaMVプロモーターの下流に連結したコンストラクトを野生型アラビトプシス（シロイヌナズナ）に形質転換してBIL7高発現形質転換体（BIL7-OX）を作製し、形態の観察を行った。
　野生型アラビトプシス（シロイヌナズナ）のロゼッタ葉からRNeasy Plant Mini Kit（QIAGEN）を用いRNAを抽出した。次に「SuperScriptTM III First-Strand Synthesis System for RT-PCR」（Invitrogen）を用いて、kitのプロトコールに従いcDNAを合成した。このcDNAを鋳型として、以下のプライマーを用いたPCR法を行ってBIL7を増幅した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　増幅したBIL7は、「pENTER/D TOPO cloning kit」（Invitrogen）を用いて、エントリーベクター（pENTR）へのクローニングを行った。作製したpENTRベクターをGateway techonology により「Gateway LR Clonase IIenzyme mix（Invitrogen）」を用いて、35Sプロモーターを含むpGWB2及びRNAiコンストラクトを含むpGWB80に導入し、BIL7が挿入された形質転換用ベクターpGWB2-BIL7及びpGWB80-BIL7-RNAiを得た。
　次に作製したベクターをアグロバクテリウムに導入し、flower dipping法により野生型アラビトプシス（シロイヌナズナ）の形質転換をおこなった。
　アグロバクテリウムコンピテントセル50μlに対し、2μlの作製したベクターを加え、混和し氷上で30分静置した。液体窒素中に1分間静置した後、37℃で1分融解した。YEP液体培地を250μl加え、28℃で1時間培養した後、カナマイシンおよびハイグロマイシン50μg/ml、リファンピシン100μg/mlを含むYEP培地に撒き、コロニーPCRにてベクター導入の有無を確認した。
　ベクターが導入されたアグロバクテリウムのコロニーをYEP液体培地で1晩培養し、その後、培養液を500mlにスケールアップし1晩培養した。培養液を5000rpm、10分間遠心し上清を取り除いた後、5%(w/v)スクロースを含むMS培地に懸濁した。鞘を除去した野生型にflower dipping法により形質転換をおこなった。得られたT1種子をカナマイシン25μg/mlを含むMS培地にて選抜をおこなって、BIL7高発現形質転換体（BIL7-OX）及びBIL7発現抑制形質転換体（BIL7-RNAi）を得た（図６）。
　BIL7-OXラインについて、実施例１で述べたbil7-1Dに見られた形態的特徴を調査した（図７、８）。その結果、bil7-1Dに見られたロゼット葉形態は、BIL7発現量の低いBIL7-OX1では見られずBIL7発現量の高いBIL7-OX2にのみ認められた（図７Ａ）。花茎長および二次花茎数においては、BIL7発現量の多いラインほど促進される傾向を示した（図７Ａ、Ｂ、図８Ｄ）。また、bil7-1Dでは野生型とほぼ変わらなかった花茎数は、若干、BIL7発現増加により花茎数が減少する傾向が見られた（図８Ｃ）。種子においては、BIL7の発現が高い程正常な鞘数は減少したものの、bil7-1Dと同様に種子重量は増加した（図８Ｂ、Ｅ、Ｆ）。
　以上のように、bil7-1Dで観察された成熟形態は全てBIL7-OXラインにおいても観察された。胚軸のBrz耐性形態での観察結果とあわせ、BIL7候補遺伝子の高発現によりbil7-1Dの形態が再現されたと考えられた。これらの結果より、この遺伝子がbil7-1Dの原因遺伝子であることが確認できた。
実施例３　イネのBIL7相同遺伝子OsBIL7のイネへの形質転換
　イネにおけるBIL7相同遺伝子OsBIL7について、イネでの構成的発現プロモーターであるユビキチンプロモーター下流に接続したベクターを構築し、イネへの形質転換を行った。
　最初にイネのBIL7相同遺伝子OsBIL7のクローニングを行った。イネ日本晴野生型total RNAをQiagenのRNA easy plantキットで抽出した。次にこれよりInvitrogenのSuperScript IIキットを用いてcDNAを合成した。このcDNAを鋳型にして、以下のプライマーでPCRしてOsBIL7を増幅した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　増幅したOsBIL7は、「pENTER/D TOPO cloning kit」（Invitrogen）を用いて、クローニングを行った。
　次に作製したベクターを用いてイネへの形質転換を行った。イネの品種は日本晴を用いた。前記で構築したベクターを、アグロバクテリウムEHA105株を用いて高速形質転換法（Toki et al. Plant J. 47:969-76, 2006）により形質転換を行った。得られた形質転換T1世代、T2ホモ世代について、収量形質の調査を行った。その結果、T1世代、T2ホモ世代のいずれにおいても、分けつ数の増加、種子収量の増加などが認められた（図９Ａ、Ｂ）。
　以上から、BIL7はイネにおいても収量を向上させることが確認された。
実施例４　OsBIL7遺伝子を過剰発現させたイネ品種「ゆきひかり」の形質転換体におけるバイオマス評価
　実施例３で構築したベクターを、アグロバクテリウムLBA4404株を介してイネ（品種：ゆきひかり）に形質転換した。同時に、pSB4（komari et al. 1996 Plant J 10: 165-174）を対象として形質転換した。形質転換は、Hiei et al.(2008 Plant J 6:271-282)の方法に準じて行った。選抜培地、再分化培地及び発根培地におけるハイグロマイシンの濃度は30μg/mlとした。得られた形質転換体の当代（T0世代）の栽培評価は、日本たばこ産業株式会社植物イノベーションセンターの組換え体専用温室にて行った。日長は14.5時間の長日条件、温度は昼温28℃、夜温21℃とした。プラントボックスから鉢上げ18日後に、生育良好な苗を各36苗選定し、1苗ずつポリポット（直径12 cm、容量：830 cc）に移植した。導入遺伝子の有無を調査するため、OsBIL7遺伝子及びハイグロマイシン抵抗性遺伝子についてPCR検定を行った。その結果、4個体でOsBIL7遺伝子の欠落が確認された。一方、対照用ベクターの全36苗の中にはハイグロマイシン抵抗性遺伝子が欠落した個体はなかった。したがって、32苗のOsBIL7組換え体及び36苗の対照用ベクター組換え体のデータをとりまとめた。測定した形質は、稈長、分げつ数、穂数、穂長、1穂粒数、1穂稔実粒数、1穂重、全穂重、地上部乾物重、及び全籾重とした。なお、稈長は最も長い稈の長さを測定した。穂長、1穂粒数、1穂稔実粒数、1穂重は、稈長を測定した稈（＝最も長い稈）の穂を測定の対象とした。穂数は遅れ穂を除いた穂の数を調査した。収穫は早生個体から順に行った。形質調査完了後にデータをとりまとめ、統計解析を行った。その結果として各種形質の平均値を表９に示す。また、ポリポットに移植する直前の苗の生育状況を図１０に、成熟期の状況を図１１にそれぞれ示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　OsBIL7組換え体は対照用ベクターの組換え体に比較して以下の特性を持つことが明らかとなった。稈長は14 cm高く、穂長は4.6 cm長く、1穂粒数は23粒多くなった。種子稔性が同等だったため、1穂稔実粒数は20粒多くなった。1穂重は0.66 g増大し（170％）、全穂重も2.00 g増大した（135％）。最終的に種子収量に相当する全籾重は1.80 g増大した（135％）。さらに、地上部乾物重は5.00 g増大した（140％）。
　以上をまとめると、イネ品種「ゆきひかり」においても、OsBIL7遺伝子をユビキチンプロモーターで過剰発現させると、イネの地上部バイオマスを増大させると同時に種子収量も増大させることが明らかとなった。
実施例５　シロイヌナズナBIL7遺伝子を過剰発現させたイネの形質転換体におけるバイオマス評価
　シロイヌナズナBIL7遺伝子を単子葉植物のイネで過剰発現させた場合に、イネに収量増加の効果がもたらされるかどうかを調べた。
　実施例２で構築したBIL7遺伝子cDNAクローン（pENTRエントリーベクター）のBIL7遺伝子コーディング領域をPCRで増幅し、実施例３で使用したイネ形質転換用バイナリーベクターのユビキチンプロモーター下流に連結した。PCRに使用したプライマーは以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　得られたコンストラクトUbi-AtBIL7を、アグロバクテリウムLBA4404株を介してイネ（品種：ゆきひかり）に形質転換した。同時に、pIG121Hmの改変型であるp121Hmベクター（T-DNA領域に「CaMV35Sプロモーター、ハイグロマイシン耐性遺伝子、NOSターミネーター」カセットを含む）を対照として形質転換した。形質転換は、Hiei et al.(2008 Plant J 6:271-282)の方法に準じて行った。選抜培地、再分化培地及び発根培地のハイグロマイシンの濃度は30μg/mlとした。得られた形質転換体の当代（T0世代）の栽培評価は、日本たばこ産業株式会社植物イノベーションセンターの組換え体専用温室にて行った。日長は14.5時間の長日条件、温度は昼温28℃、夜温21℃とした。プラントボックスから鉢上げし、20日後の生育の良好な苗を各36苗選定し、ポリポット（直径12 cm、容量：830 cc）に1ポットにつき1苗ずつ移植した。導入遺伝子の有無を調査するため、対照を含む全ての組換え体72個体に対して、BIL7遺伝子及びハイグロマイシン抵抗性遺伝子についてPCR検定を行った。測定した形質は、鉢上げ5週間後の草丈、最長稈の止葉長、稈長、穂数、穂長、1穂粒数、1穂稔実粒数、1穂稔実粒重、1穂重、全穂重、地上部乾物重、全籾重とした。なお、稈長は最も長い稈の長さを測定した。穂長、1穂粒数、1穂稔実粒数、1穂稔実粒重、1穂重は、稈長を測定した稈（＝最も長い稈）の穂を測定の対象とした。穂数は遅れ穂を除いた穂の数を調査した。千籾重は、1穂稔実籾重を1穂稔実粒数で割った値に1000を掛けて算出した。
　栽培したBIL7組換え体36個体についてBIL7遺伝子の有無を検定した。その結果、BIL7組換え体ではBIL7遺伝子が欠落した個体はなかった。また、対照用ベクターの全36個体の中にもハイグロマイシン抵抗性遺伝子が欠落した個体はなかった。したがって、BIL7組換え体36個体及び対照用ベクターの組換え体36個体のデータをとりまとめた。その結果として各種形質の平均値を表１１に示す。また、ポリポットに移植する直前の苗の生育状況を図１２に、成熟期の状況を図１３にそれぞれ示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　BIL7組換え体は対照用ベクターの組換え体に比較して以下の特性を持つことが明らかとなった。播種して5週間後の草丈は15 cm高く、止葉長は9 cm長く、稈長は13 cm高かった。穂長は4.2 cm長く、1穂粒数は14粒多くなった。種子稔性がほぼ同等だったため、1穂稔実粒数は13粒多くなった。千籾重は2.6 g重かった。1穂重は0.48 g増大した（146％）。全穂重も1.34 g増大し（120％）、最終的に種子収量に相当する全籾重は1.18 g増大した（120％）。さらに、地上部乾物重は3.77 g増大した（128％）。
　以上をまとめると、イネ品種「ゆきひかり」において、BIL7遺伝子をユビキチンプロモーターで過剰発現させると、イネの地上部バイオマスを増大させると同時に種子収量も増大させることが明らかとなった。
実施例６　OsBIL7遺伝子を過剰発現させたトウモロコシの形質転換体におけるバイオマス評価
　実施例３で構築したベクターを、Ishida et al. (2007)の方法に準じて、アグロバクテリウムLBA4404株を介してトウモロコシ（品種：A188）に形質転換した。得られた形質転換体の栽培は、日本たばこ産業株式会社植物イノベーションセンターの組換え体専用温室にて行った。日長は14.5時間、温度は昼温28℃、夜温20℃とした。抽出した雄穂は、開花前に切除した。雌穂から十分に抽出した絹糸に、形質転換していないトウモロコシ（品種：A188）から採取した花粉を交配し、T1種子を得た。この種子を用いてバイオマス関連形質の評価試験を行った。なお、評価試験は、T0世代でのOsBIL7遺伝子及びハイグロマイシン抵抗性遺伝子のPCR検定結果、草姿、種子数、及び種子重量を考慮し、採種された25個体のうち6個体を供試した。当該評価試験は2回（１回目：3系統、２回目：3系統の計6系統）に分けて行った。容量570 mlのポリポットに1系統あたり1粒ずつ（1系統２５粒、計２５ポット）播種した。播種後17～18日に葉の一部を切り取り、ハイグロマイシン溶液に浸漬し、ハイグロマイシンの抵抗性及び感受性を調査した。初期生育の劣る個体を除き、1系統あたり16個体を容量5100 ccのポリポットへ移植し、栽培を継続した。測定した形質は、絹糸抽出日数、全葉数、第9葉から第13葉の葉身長及び草丈とした。なお、絹糸抽出日数は播種から絹糸抽出日までの日数、草丈は播種後84日の最終草丈を測定した。各系統について、ハイグロマイシン抵抗性個体（即ち、OsBIL7遺伝子保有個体とみなした）とハイグロマイシン感受性個体（即ち、OsBIL7遺伝子欠落個体とみなした）の比較を行った。その結果を表１２に示す。その結果、絹糸抽出日数及び全葉数ついては、抵抗性個体と感受性個体間に差は認められなかった。一方、草丈及び第９葉ないし第１３葉の葉身長については、抵抗性個体が感受性個体に比較し増大していた（表１２）。
　以上をまとめると、トウモロコシ品種「A188」において、OsBIL7遺伝子を過剰発現させると、トウモロコシの地上部バイオマスを増大させることが明らかとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　本発明は、バイオマスが利用可能な産業分野、例えば、食品分野、エネルギー分野、環境分野等において有用である。本発明を用いることによって、植物のバイオマスを効果的に増大させることが可能となる。

Claims (27)

  1. 　タンパク質をコードする核酸が導入された植物であって、該タンパク質が、
    配列番号１で表されるアミノ酸配列を含み、
    配列番号７又は１１で表されるアミノ酸配列と２５％以上の同一性又は７５％以上の類似性を有するアミノ酸配列を含み、
    植物のバイオマスを増大させる活性を有することを特徴とする、前記植物。
  2. 　配列番号１で表されるアミノ酸配列が、配列番号２で表されるアミノ酸配列である、請求項１に記載の植物。
  3. 　タンパク質が、配列番号３～５のいずれかで表されるアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載の植物。
  4. 　核酸が単子葉植物又は双子葉植物由来の核酸であり、植物が単子葉植物である、請求項１～３のいずれか１項に記載の植物。
  5. 　タンパク質をコードする核酸を植物に導入する工程を含む、植物のバイオマスを増大させる方法であって、該タンパク質が、
    配列番号１で表されるアミノ酸配列を含み、
    配列番号７又は１１で表されるアミノ酸配列と２５％以上の同一性又は７５％以上の類似性を有するアミノ酸配列を含み、
    植物のバイオマスを増大させる活性を有することを特徴とする、前記方法。
  6. 　配列番号１で表されるアミノ酸配列が、配列番号２で表されるアミノ酸配列である、請求項５に記載の方法。
  7. 　タンパク質が、配列番号３～５のいずれかで表されるアミノ酸配列を含む、請求項５又は６に記載の方法。
  8. 　核酸が単子葉植物又は双子葉植物由来の核酸であり、植物が単子葉植物である、請求項５～７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 　タンパク質をコードする核酸を植物に導入する工程を含む、バイオマスが増大した植物の作製方法であって、該タンパク質が、
    配列番号１で表されるアミノ酸配列を含み、
    配列番号７又は１１で表されるアミノ酸配列と２５％以上の同一性又は７５％以上の類似性を有するアミノ酸配列を含み、
    植物のバイオマスを増大させる活性を有することを特徴とする、前記方法。
  10. 　配列番号１で表されるアミノ酸配列が、配列番号２で表されるアミノ酸配列である、請求項９に記載の方法。
  11. 　タンパク質が、配列番号３～５のいずれかで表されるアミノ酸配列を含む、請求項９又は１０に記載の方法。
  12. 　核酸が単子葉植物又は双子葉植物由来の核酸であり、植物が単子葉植物である、請求項９～１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 　タンパク質をコードする核酸およびプロモーターを含むコンストラクトであって、該タンパク質が、
    配列番号１で表されるアミノ酸配列を含み、
    配列番号７又は１１で表されるアミノ酸配列と２５％以上の同一性又は７５％以上の類似性を有するアミノ酸配列を含み、
    植物のバイオマスを増大させる活性を有することを特徴とする、前記コンストラクト。
  14. 　配列番号１で表されるアミノ酸配列が、配列番号２で表されるアミノ酸配列である、請求項１３に記載のコンストラクト。
  15. 　タンパク質が、配列番号３～５のいずれかで表されるアミノ酸配列を含む、請求項１３又は１４に記載のコンストラクト。
  16. 　請求項１３～１５のいずれか１項に記載のコンストラクトを含む、ベクター。
  17. 　請求項１６に記載のベクターを含む、宿主細胞。
  18. 　請求項１７に記載のベクターが導入された、植物。
  19. 　核酸が単子葉植物又は双子葉植物由来の核酸であり、植物が単子葉植物である、請求項１８に記載の植物。
  20. （１）被験植物および野生型植物において、タンパク質又はそれをコードする核酸の発現量を測定する工程であって、該タンパク質が、
    配列番号１で表されるアミノ酸配列を含み、
    配列番号７又は１１で表されるアミノ酸配列と２５％以上の同一性又は７５％以上の類似性を有するアミノ酸配列を含み、
    植物のバイオマスを増大させる活性を有することを特徴とする、前記工程、
    （２）工程（１）により得られた発現量を比較する工程、
    （３）野生型植物での発現量よりも高い発現量を示す被験植物を選択する工程、
    を含む、バイオマスが増大した植物のスクリーニング方法。
  21. 　配列番号１で表されるアミノ酸配列が、配列番号２で表されるアミノ酸配列である、請求項２０に記載の方法。
  22. 　タンパク質が、配列番号３～５のいずれかで表されるアミノ酸配列を含む、請求項２０又は２１に記載の方法。
  23. 　核酸が単子葉植物又は双子葉植物由来の核酸であり、植物が単子葉植物である、請求項２０～２２のいずれか１項に記載の方法。
  24. （１）被験植物および野生型植物において、タンパク質又はそれをコードする核酸の発現量を測定する工程であって、該タンパク質が、
    配列番号１で表されるアミノ酸配列を含み、
    配列番号７又は１１で表されるアミノ酸配列と２５％以上の同一性又は７５％以上の類似性を有するアミノ酸配列を含み、
    植物のバイオマスを増大させる活性を有することを特徴とする、前記工程、
    （２）工程（１）により得られた発現量を比較する工程、
    （３）被験植物での発現量が野生型植物での発現量よりも高いことを確認する工程、
    を含む、バイオマスが増大した植物を判定する方法。
  25. 　配列番号１で表されるアミノ酸配列が、配列番号２で表されるアミノ酸配列である、請求項２４に記載の方法。
  26. 　タンパク質が、配列番号３～５のいずれかで表されるアミノ酸配列を含む、請求項２４又は２５に記載の方法。
  27. 　核酸が単子葉植物又は双子葉植物由来の核酸であり、植物が単子葉植物である、請求項２４～２６のいずれか１項に記載の方法。
     
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