WO2016017037A1 - 免疫学的測定法に用いられるウイルス様粒子、それに用いられるブロッキング剤、及びこれらを含むキット - Google Patents

免疫学的測定法に用いられるウイルス様粒子、それに用いられるブロッキング剤、及びこれらを含むキット Download PDF

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康則 織田
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    • G01N2333/71—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for growth factors; for growth regulators

Definitions

  • the present invention relates to a virus-like particle used for an immunological assay, a blocking agent used therefor, and a kit containing these.
  • Patent Documents 1 to 8 Methods using various particles as immunoassay sensors are known (Patent Documents 1 to 8).
  • Patent Document 1 or Patent Document 2 proposes a method of using fluorescent semiconductor nanoparticles or silica particles as a detection element for immunoassay, which is a technique of performing immunoassay with fluorescence generated by nanoparticles.
  • Patent Document 8 presents a nanoparticle conjugate in which various peptides are bound using a metal material, a magnetic material, or a semiconductor material as a nucleus.
  • 2 (hereinafter also referred to as ZZ-BNC) are pre-S1 and pre-S of L-type hepatitis B virus particles (patent document 9) produced by genetic recombination using yeast.
  • Two binding domains (Z tags) for the Fc region of an antibody derived from protein A are inserted into the S2 region, and its usefulness as a production method and a drug delivery system is described in Patent Document 10.
  • Patent Document 3 discloses a method of using an enzyme-labeled antibody and BNC-ZZ in combination, a method of detecting an antibody using fluorescently labeled BNC-ZZ, and a method of using an immunoassay. It is illustrated as an example.
  • Patent Document 6 exemplifies a technique for increasing sensitivity by using BNC-ZZ for alignment of immobilized antibodies.
  • Patent Document 4 describes a method of using biotinylated BNC-ZZ for immunological measurement. By binding biotinylated HRP enzyme or biotinylated antibody to biotinylated BNC-ZZ via streptavidin. It is exemplified in the Examples that the sensitivity can be increased more than using BNC-ZZ that is not biotinylated.
  • Patent Document 5 a method for producing a hybrid type particle having a protein molecule having a ZZ tag and a protein molecule not having a Pre-S region in order to increase the sensitivity of immunological measurement by increasing the antibody binding ability of BNC-ZZ particles. And how to use it. Furthermore, in Patent Document 7, a technique for simultaneously detecting multiple antigens by weakly crosslinking an antibody to fluorescently labeled BNC-ZZ is exemplified in the Examples.
  • JP-T 2006-517985 Special Table 2002-544488 JP 2007-127626 A JP 2008-191143 A JP 2010-096677 A JP 2007-121276 A JP 2010-210444 A Special table 2007-506084 gazette JP 2001-316298 A JP 2004-002313 A
  • an element having a high affinity for the detection target substance of the detection element is used, and (2) the signal intensity generated by the detection element bound to the detection target substance is increased. Any method of raising is used.
  • the affinity to the detection target is constant, and therefore the most effective means is to increase the generated signal intensity.
  • biotinylated BNC a method for increasing the signal by increasing the amount of HRP binding using the well-known specific binding ability of biotin and streptavidin. It is only used as -ZZ (Patent Document 4) and has not been studied.
  • ZZ-BNC has an antibody binding site derived from protein A, binding to antibodies such as mouse IgG 1 , rat IgG, sheep IgG 1 , goat IgG 1 , human IgG 3 which are important in immunoassay is weak, Usage and range of use are greatly limited. Furthermore, since ZZ-BNC binds to various IgGs, binding to antibodies other than the target occurs in the environment where multiple antibodies exist, such as antibody sandwich ELISA or serum containing multiple antibodies. It is difficult to detect.
  • BNC-ZZ and its labeled and modified products are lipoproteins, and thus show nonspecific binding to glass and plastic. Non-specific adsorption not only greatly affects the immunoassay, but also becomes a serious problem even when the diluted solution is stored for a long time.
  • the present inventors have labeled such a virus-like particle when a bioactive molecule is labeled through a specific site of a protein having a self-organizing ability contained in the virus-like particle. It has been found that it can be suitably used for immunological measurement.
  • a specific blocking agent exhibits an excellent blocking effect when the above-mentioned virus-like particles are used for immunological measurement.
  • Item 1 A virus-like particle for immunological measurement containing a protein having self-assembly ability, which is modified by a bioactive molecule via a thiol group of at least one cysteine residue of the protein having self-assembly ability A virus-like particle.
  • Item 2 The virus-like particle according to Item 1, wherein the protein having the ability to self-assemble is an HBsAg protein.
  • Item 3 The virus-like particle according to Item 1, wherein the protein having the ability to self-assemble comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • Item 4 The virus-like particle according to any one of Items 1 to 3, wherein the protein having the ability to self-assemble has an antibody binding domain.
  • Item 5 The bioactive molecule according to any one of Items 1 to 4, wherein the physiologically active molecule is at least one selected from the group consisting of an enzyme, an antibody binding domain, biotin, a fluorescent dye, a luminescent dye, and an avidin compound.
  • the physiologically active molecule is at least one selected from the group consisting of an enzyme, an antibody binding domain, biotin, a fluorescent dye, a luminescent dye, and an avidin compound.
  • Item 6 The virus-like particle according to Item 5, wherein the enzyme is alkaline phosphatase and / or peroxidase.
  • the antibody binding domain is at least one selected from the group consisting of an antibody binding domain contained in protein A, an antibody binding domain contained in protein G, and an antibody binding domain contained in protein L. 6.
  • Item 8 The virus particle according to Item 4 or Item 5, wherein the antibody-binding domain has an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 3 to 5.
  • Item 9 The item 5 above, wherein the avidin compound is at least one selected from the group consisting of avidin, streptavidin, neutravidin, AVR protein, bradavidin, rhizavidin, and tamavidin (registered trademark).
  • the virus-like particle according to 1.
  • Item 10 The virus-like particle according to any one of Items 1 to 9, wherein the bioactive molecule is an antibody-binding domain, and the antibody is bound to the antibody-binding domain.
  • Item 11 A blocking agent for immunological measurement using the virus-like particle according to any one of Items 1 to 10, wherein the blocking agent is hydroxyalkyl cellulose, polyvinyl alcohol, ethylene oxide / propylene oxide A blocking agent comprising at least one selected from the group consisting of a copolymer and a copolymer composed of 2-methacryloyloxyethylphosphocholine.
  • Item 12 The blocking agent according to Item 11, wherein the hydroxyalkylcellulose is hydroxypropylmethylcellulose.
  • Item 13 The blocking agent according to Item 11, wherein the degree of polymerization of the polyvinyl alcohol is 200 to 5,000.
  • Item 14 The blocking agent according to Item 11, wherein the ethylene oxide / propylene oxide copolymer is Pluronic (registered trademark).
  • Item 15 The blocking agent according to Item 11, wherein the ethylene oxide / propylene oxide copolymer is Pluronic (registered trademark) F127 and / or Pluronic (registered trademark) P105.
  • Item 16 The blocking agent according to Item 11, wherein the copolymer composed of 2-methacryloyloxyethylphosphocholine is Biolipid (registered trademark).
  • Item 17 The blocking agent according to Item 11, wherein the polymer comprising 2-methacryloyloxyethylphosphocholine as a structural unit is Biolipid (registered trademark) 206 and / or Biolipid (registered trademark) 802.
  • Item 18 An immunoassay kit comprising the virus-like particle according to any one of Items 1 to 10 and the blocking agent according to any one of Items 11 to 17.
  • the virus-like particle according to the present invention can be immunologically measured with excellent detection sensitivity.
  • the blocking agent according to the present invention exhibits an effect of lowering the background of the obtained data and / or sensitizing the detection signal in immunological measurement performed using the virus-like particle according to the present invention.
  • the ratio can be increased significantly.
  • the S / N ratio of the obtained data can be remarkably increased.
  • FIG. 6 shows the results of Example 5.
  • FIG. The figure which shows the result of Example 24 (anti-GFP antibody).
  • the figure which shows the result of Example 24 HMG monoclonal antibody).
  • Example 31 The figure which shows the result of Example 31.
  • the figure which shows the result of Example 32 The figure which shows the result of Example 32.
  • FIG. The figure which shows the result of Example 33.
  • FIG. The figure which shows the result of Example 34.
  • the virus-like particle according to the present invention is used in an immunological assay and contains a protein having a self-organizing ability.
  • a protein having self-organization ability is obtained by modifying a bioactive molecule via a thiol group of a cysteine residue.
  • a protein having a self-organizing ability is a protein that can form a virus-like particle by involving a lipid bilayer such as an endoplasmic reticulum lumen, a cell membrane, or a nuclear membrane in a living body, particularly a cell, and a cysteine residue.
  • a lipid bilayer such as an endoplasmic reticulum lumen, a cell membrane, or a nuclear membrane in a living body, particularly a cell, and a cysteine residue.
  • the virus which has an envelope is not specifically limited,
  • the virus which belongs to Hepadnaviridae such as hepatitis B virus (HBV) and duck hepatitis B virus
  • It belongs to Paramyxoviridae such as Sendai virus (HVJ) Viruses
  • viruses belonging to the herpesviridae family such as herpes simplex virus
  • viruses belonging to the orthomyxoviridae family such as influenza virus
  • viruses belonging to the retroviridae family such as human immunodeficiency virus.
  • the protein having the ability to self-assemble is not particularly limited.
  • hepatitis B virus surface antigen (HBsAg) protein that is a protein related to the budding function of HVB
  • F protein that is a protein related to the budding function of HVJ
  • HBsAg protein, F protein, hemagglutinin-neuraminidase protein, and variants thereof are preferred.
  • the mutant is not particularly limited as long as it has at least one cysteine residue and exhibits an action capable of forming a virus-like particle as described above.
  • the number of mutagenesis is not particularly limited within the same range, but usually 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and most preferably 99% or more identity with the amino acid sequence before mutagenesis.
  • the number of mutation introductions may be such that a mutant having
  • mutagenesis here includes substitution, deletion, insertion, and the like. Specific mutagenesis can be carried out using a known method and is not particularly limited. For example, a conservative substitution technique may be employed for substitution. The term “conservative substitution technique” means that an amino acid residue is replaced with an amino acid residue having a similar side chain.
  • substitution with amino acid residues having basic side chains such as lysine, arginine, histidine and the like is a conservative substitution technique.
  • Other amino acid residues having acidic side chains such as aspartic acid and glutamic acid; amino acid residues having uncharged polar side chains such as glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine and cysteine; alanine, valine, leucine, Amino acid residues having non-polar side chains such as isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan, etc .; Amino acid residues having ⁇ -branched side chains such as threonine, valine, isoleucine, etc., fragrances such as tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine, etc.
  • substitutions between amino acid residues having a family side chain are conservative substitutions.
  • identity refers to the degree of identical amino acid sequences of two or more comparable amino acid sequences relative to each other. Therefore, the higher the identity of two amino acid sequences, the higher the identity or similarity of those sequences.
  • the amino acid sequence or level of identity is determined, for example, using FASTA, a sequence analysis tool, using default parameters. The specific methods of these analysis methods are known, and the National Center of Biotechnology Information (NCBI) website (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) may be referred to.
  • HBsAg the protein etc. which contain the amino acid sequence shown to sequence number 1 are mentioned,
  • the variant of HBsAg is the variant of HBsAg etc. which are described in patent documents 5 and 9, etc. Can be mentioned.
  • F protein the protein etc. which consist of an amino acid sequence shown by Accession * No. * NP_056877 * registered on the NCBI website; * Version: * NP_056877.1 * GI *: * 9627226, etc. are mentioned.
  • the hemagglutinin-neuraminidase protein is not particularly limited, and examples thereof include a protein having an amino acid sequence represented by Accession No. NP_056878; Version: NP_056878.1 GI: 9627227 registered on the NCBI website.
  • a protein having self-assembly ability has a cysteine residue, and a physiologically active molecule is modified through a thiol group of such cysteine residue.
  • the specific cysteine residue is not particularly limited, but a bioactive molecule is modified with a specific cysteine residue located on the surface of a virus-like particle formed based on a protein having self-assembly ability. Is preferred.
  • cysteine residue for example, in the case of the HBsAg protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, the 107th, 121st, 124th, 137th, 138th, 139th, 147th, or 149th position Of cysteine residues.
  • amino acid sequences of 9th to 28th, 80th to 98th, and 170th to 192th are presumed as transmembrane domains of this HBsAg protein.
  • F protein which consists of an amino acid sequence described in the said NCBI website
  • it is 70th, 199th, 338th, 347th, 362th, 370th, 394th, 399th, 401st, or 424
  • the second cysteine residue As transmembrane domains of this F protein, amino acid sequences of 1st to 25th, 117th to 139th, and 501 to 523 have been estimated.
  • hemagglutinin-neuraminidase protein consisting of the amino acid sequence described on the NCBI website
  • the 129th, 138th, 161st, 192nd, 216th, 258th, 271st, 352th, 357th examples include 365, 463, 469, 473, 535, 544, or 571 cysteine residues.
  • the amino acid sequence at positions 38 to 60 has been estimated.
  • the physiologically active molecule is not particularly limited, and examples thereof include enzymes, antibody binding domains, biotin, fluorescent dyes, luminescent dyes, and avidin compounds.
  • the protein according to the present invention has a plurality of cysteine residues, and a physiologically active molecule is bound via at least one cysteine residue in the protein.
  • antibody binding domains, biotin, fluorescent dyes, luminescent dyes, avidin compounds and the like not only one kind but also two or more kinds may be combined and bound via separate cysteine residues.
  • the specific enzyme is not particularly limited as long as it is an enzyme in the field of immunological measurement, and examples thereof include peroxidase and alkaline phosphatase.
  • the specific antibody binding domain is not particularly limited, but is preferably a domain that binds to the Fc domain of an antibody.
  • Specific antibody binding domain is not particularly limited, but for example, antibody binding domain (SEQ ID NO: 3) contained in protein A, antibody binding domain (SEQ ID NO: 4) contained in protein G, and antibody contained in protein L Examples include a binding domain (SEQ ID NO: 5).
  • the antibody binding domain included in the bioactive molecule may be an embodiment in which a plurality of such antibody binding domains are included in the same or different manner.
  • an antibody comprising an antibody binding domain contained in protein A, an antibody binding domain contained in protein G, and an antibody binding domain contained in protein G in that order from the N-terminal.
  • Examples include a binding domain (SEQ ID NO: 6), a ZZ tag containing the antibody binding domain contained in protein A in tandem in order from the N-terminus.
  • the antibody that binds to the antibody binding domain is not particularly limited, and the structure thereof is not limited to immunoglobulin, and any molecule having a structure that at least functions to recognize an antigen may be used.
  • An antibody having a building block structure such as
  • the origin of the antibody is not particularly limited, and antibodies derived from various animals suitable for antibody production can be used.
  • the antibody when the antibody is an immunoglobulin, its subtype is not particularly limited. Further, the subclass when the immunoglobulin is IgG, IgA or the like is not particularly limited.
  • the above-mentioned bioactive molecule is an antibody-binding domain
  • an embodiment in which such a domain is bound to the above-described antibody is also included in the virus-like particle according to the present invention.
  • the binding between the antibody binding domain and the antibody may be a strong binding (sometimes referred to as an irreversible binding in the present specification) using a known crosslinking agent.
  • Known crosslinking agents include BS 3 and the like.
  • Biotin, fluorescent dye, and luminescent dye are not particularly limited as long as they are usually used in the field of immunological measurement, and known ones may be used as appropriate.
  • Specific avidin compounds are not particularly limited, and examples thereof include avidin, streptavidin, neutravidin, AVR protein, bradavidin, rhizavidin, and tamavidin.
  • the virus-like particle according to the present invention is obtained by using a kit or the like that obtains a virus-like particle containing a protein having self-organization ability using a known method and modifies it via a cysteine residue.
  • a physiologically active molecule may be bound.
  • a known means such as gel filtration may be employed as appropriate for the purification step.
  • a known cross-linking agent After binding the bioactive molecule, a known cross-linking agent is used by a known method to bind the cysteine residue of the protein having self-organization ability contained in the virus-like particle to the bioactive molecule. A process of strengthening may be performed.
  • Known crosslinking agents include BS 3 and the like.
  • the virus-like particle according to the present invention further binds to a bioactive molecule (hereinafter sometimes referred to as a second bioactive molecule in the specification).
  • a bioactive molecule hereinafter sometimes referred to as a second bioactive molecule in the specification.
  • virus-like particles having a protein with the ability to self-assemble are also included.
  • an embodiment in which the lipid component constituting the lipid bilayer membrane of the virus-like particle and the second physiologically active molecule are bound, other than the cysteine residue of the protein having the self-organizing ability described above Examples include a mode in which the second physiologically active molecule binds via an amino acid residue or a sugar chain, and a mode in which the second physiologically active molecule is incorporated at a specific site of the protein having the self-organizing ability.
  • the second bioactive molecule described above can be the same as the bioactive molecule modified via the cysteine residue described above.
  • an antibody binding domain is incorporated as the second physiologically active molecule in the N-terminal region of the above-mentioned protein having self-assembly ability
  • a protein having the self-assembly ability consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 And virus-like particles. That is, such a protein having self-assembly ability has an antibody binding domain as a bioactive molecule via the N-terminal region of such protein and the thiol group of at least one cysteine residue of such protein. Also good.
  • the second physiologically active molecule is bound to the sugar chain of the protein having the above-mentioned self-organization ability, it can be obtained by subjecting the terminal sugar residue of the sugar chain such as sialic acid to aldehyde formation. Can do.
  • the binding between the protein having self-organization ability and the second physiologically active molecule may be subjected to a treatment for strengthening the binding using a known crosslinking agent as described above.
  • Known crosslinking agents include BS 3 and the like.
  • the second physiologically active molecule is an antibody binding domain
  • an embodiment in which an antibody is bound to such a domain is also included in the virus-like particle according to the present invention.
  • the virus-like particle according to the present invention also includes an embodiment in which a crosslinking treatment for strengthening the bond is performed as necessary.
  • Known crosslinking agents include BS 3 and the like.
  • a preferred embodiment of the virus-like particle according to the present invention includes a protein having self-assembly ability, (1) an antibody-binding domain in the N-terminal region of the protein, and the above-mentioned specific cysteine residue of the protein
  • a mode in which an antibody-binding domain is bound to the N-terminal region of the protein and the antibody-binding domain is bound via the above-mentioned specific cysteine residue of the protein in [Production Example 5] in the following Examples) “AGG-BNC-ZZ” corresponds to this.
  • the immunological measurement method defined in the present specification is not particularly limited as long as it is a measurement method that employs an antigen-antibody binding action by an antibody as a measurement principle.
  • Western blotting method ELISA method
  • immunochromatography method Immunostaining method
  • EIA method EIA method
  • FIA method FIA method
  • various modified methods based on these methods EIA method, FIA method, and various modified methods based on these methods.
  • the blocking agent according to the present invention is used in an immunological assay using the above-described virus-like particle according to the present invention.
  • Such a blocking agent exhibits the effect of decreasing the background of data obtained in the above-described immunological measurement and / or sensitizing the detection signal, and can significantly increase the S / N ratio.
  • Such an effect is not evaluated only by the obtained data, but can also be evaluated, for example, by confirming the suppression of the adsorption of the above virus-like particles to a laboratory instrument widely used in immunological measurement methods.
  • the virus-like particles and immunological measurement method can be as described in detail in ⁇ Virus-like particles> above.
  • the blocking agent according to the present invention contains hydroxyalkyl cellulose, polyvinyl alcohol, an ethylene oxide / propylene oxide copolymer, a copolymer composed of 2-methacryloyloxyethylphosphocholine, or two or more of these. .
  • Hydroxyalkyl cellulose is not particularly limited, but preferably has an alkyl group having about 1 to 4 carbon atoms.
  • hydroxypropylcellulose, hydroxyethylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, hydroxyethylmethylcellulose, hydroxypropylethylcellulose, hydroxyethylethylcellulose and the like can be mentioned, among which hydroxypropylmethylcellulose is preferable.
  • the hydroxyalkyl cellulose contained in the blocking agent according to the present invention may be a combination of two or more of the above-mentioned compounds.
  • Specific acquisition methods include purchase from the market and production using known methods. Etc.
  • the polyvinyl alcohol may be a polymer having vinyl alcohol as a monomer unit.
  • the degree of polymerization of polyvinyl alcohol is not particularly limited, but is usually preferably about 200 to 5,000, more preferably about 500 to 2,000.
  • polyvinyl alcohol since usually used polyvinyl alcohol is often obtained by saponifying polyvinyl acetate, it may have vinyl acetate as a monomer unit as described above. Based on such a viewpoint, the saponification degree (mol%) of the above-mentioned polyvinyl alcohol is usually about 80 to 98, preferably about 85 to 98.
  • the polyvinyl alcohol contained in the blocking agent according to the present invention may be a combination of two or more of the above-mentioned compounds.
  • Specific acquisition methods include purchase from the market, production using a known method, etc. Is mentioned.
  • the ethylene oxide / propylene oxide copolymer is not particularly limited as long as it is a copolymer having ethylene oxide and propylene oxide as monomer units, and is preferably, for example, Pluronic (registered trademark) or an equivalent thereof. .
  • More preferable ethylene oxide / propylene oxide copolymers include Pluronic L31, Pluronic L35, Pluronic L64, Pluronic P94, Pluronic F68, Pluronic F87, Pluronic F-127, Pluronic P-105, and the like (trademark of BASF). As an equivalent of these, poloxamer (trademark of ICI) can be mentioned. Of these, Pluronic F-127 or Pluronic P-105, equivalents thereof, and the like are most preferable.
  • the ethylene oxide / propylene oxide copolymer contained in the blocking agent according to the present invention may be a combination of two or more of the above-mentioned compounds.
  • Specific methods for obtaining the market include those on the market (BSAF and ICI). Etc.) and production using a known method.
  • the copolymer composed of 2-methacryloyloxyethyl phosphocholine is not particularly limited as long as it is a copolymer having 2-methacryloyloxyethyl phosphocholine and other monomer components as constituent units.
  • examples of the copolymer composed of 2-methacryloyloxyethylphosphocholine include Lipidure (registered trademark), Biolipide (registered trademark), and equivalents thereof.
  • Preferred examples of the copolymer composed of 2-methacryloyloxyethylphosphocholine include Lipidure BL-405, Lipidure BL-203, Lipidure BL-1002, Lipidure BL-103, Lipidure BL-206, Lipidure BL-802, These equivalents and the like can be mentioned and are not particularly limited. Among them, lipid BL-206, lipid BL-802, equivalents thereof and the like are most preferable (in this text, for example, lipid BL-802 is lipid 802. And simplified description).
  • the copolymer composed of 2-methacryloyloxyethylphosphocholine contained in the blocking agent according to the present invention may be a combination of two or more of the above-mentioned compounds.
  • the purchase from (NOF Corporation), the manufacture using a well-known method, etc. are mentioned.
  • the content of the hydroxyalkyl cellulose, polyvinyl alcohol, ethylene oxide / propylene oxide copolymer, or copolymer composed of 2-methacryloyloxyethylphosphocholine contained in the blocking agent according to the present invention is not particularly limited.
  • the total weight of the copolymer composed of hydroxyalkyl cellulose, polyvinyl alcohol, ethylene oxide / propylene oxide copolymer and 2-methacryloyloxyethylphosphocholine with respect to 100 parts by weight of the blocking agent is 0.001 to 100 parts by weight. It may be about a part.
  • hydroxyalkyl cellulose polyvinyl alcohol, ethylene oxide / propylene oxide copolymer, or a copolymer itself composed of 2-methacryloyloxyethylphosphocholine may be used as the blocking agent according to the present invention.
  • the hydroxyalkyl cellulose, the polyvinyl alcohol, the ethylene oxide / propylene oxide copolymer, 2-methacryloyloxy which are used in the immunological measurement method, as long as the above effects are not hindered.
  • Components other than the copolymer composed of ethylphosphocholine may be included. Although it does not specifically limit with a specific other component, For example, antiseptic
  • the blocking agent according to the present invention may be provided in a form included in water, a buffer solution, or the like that is widely used in advance in an immunological measurement method, and is provided as a solid form. You may provide in the aspect which can be dissolved in the above-mentioned water, a buffer solution, etc., and can be prepared and used at the time of use.
  • the amount of the blocking agent according to the present invention is not particularly limited, but may be usually about 0.0001 to 5 parts by volume with respect to 100 parts by volume of a buffer solution or the like used in immunological measurement.
  • the immunological measurement kit according to the present invention includes the above-described virus-like particle according to the present invention and the above-described blocking agent according to the present invention.
  • Virus-like particles and blocking agents are as detailed above in ⁇ Blocking Agents>.
  • the immunological measurement can be the same as the immunological measurement method described in detail in the above ⁇ virus-like particle>.
  • the immunological measurement kit according to the present invention may further contain a reaction vessel, a coloring / luminescent substrate, a reaction solution, a standard substance, a disposable instrument, a manual, and the like.
  • the virus-like particle according to the present invention and the blocking agent according to the present invention are filled in separate containers (packs, bottles, etc.), respectively. It may be filled in the same container.
  • the virus-like particles and the blocking agent may be provided in a form that is contained in water, a buffer solution, and the like.
  • the blocking agent is provided in a powder form, and water, a buffer solution, and the like when performing immunological measurement. And may be provided in an embodiment that is appropriately prepared (diluted) at the time of use.
  • BNC-L is a virus-like particle containing the HBsAg protein having the self-assembling ability consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and was prepared by the method described in Japanese Patent No. 4085231 or Japanese Patent No. 4936272.
  • the BNC-L-expressing yeast prepared in Japanese Patent No. 4085231 is cultured, and the cell disruption solution obtained by disrupting the cultured cell using glass beads is treated at 70 ° C. for 20 minutes.
  • the sample was subjected to heat treatment. After the heat treatment, it was subjected to a centrifugation step, and the resulting supernatant was collected and then purified using a cellulofine sulfate column and a gel filtration column, concentrated to a protein concentration of 0.2 mg / mL or more, and BNC- L was obtained.
  • BNC-L containing a protein having the self-assembling ability consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 forms particles and contains about 110 molecules of the protein per particle (Yamada et al. , Vaccine 19, 3154-3163, 2001).
  • BNC-ZZ is a self-organization represented by SEQ ID NO: 2 having two antibody-binding domains (Z domains) of protein A in tandem at the N-terminus of the HBsAg protein contained in BNC-L
  • SEQ ID NO: 2 having two antibody-binding domains (Z domains) of protein A in tandem at the N-terminus of the HBsAg protein contained in BNC-L
  • the BNC-ZZ-expressing yeast prepared in Japanese Patent No. 4212921 is cultured, and the bacterial cell disruption solution obtained by disrupting the cultured bacterial cells using glass beads is maintained at 70 ° C. for 20 minutes.
  • the sample was subjected to heat treatment. After the heat treatment, it was subjected to a centrifugation step, and the resulting supernatant was recovered, purified using a Porcine IgG column and a gel filtration column, concentrated to a protein concentration of 0.2 mg / mL or more, and BNC-ZZ. Got.
  • a protein having the self-organizing ability consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is estimated to be contained in about 110 molecules per BNC-ZZ particle by analogy with the above BNC-L.
  • BNC-ZZ forms a complex that retains the antigen-binding ability of the antibody by binding between the antibody-binding domain of the particle and the Fc domain of the antibody.
  • the enzyme label of BNC-ZZ forms a similar complex.
  • the complex may be referred to as a mixed complex.
  • HRP labeling via SH groups contained about 110 HRP molecules per BNC-ZZ particle. That is, it is suggested that about one HRP molecule is crosslinked to the SH group of at least one cysteine residue in the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 above.
  • the BNC-ZZ used in the preparation of HRP-labeled BNC-ZZ was subjected to HRP labeling under mild conditions that did not affect the particle shape.
  • the particle diameter was measured by the dynamic light scattering method, and as a result, it was 58 nm after labeling compared to 54 nm before labeling, and no significant difference was observed. Therefore, NH 2 groups and SH groups HRP label, it is clear that the NH 2 group and SH group derived from the amino acid residues exposed on both the particle surface.
  • the SEQ ID NO: 2 shows the amino acid sequence of the protein contained in the BNC-ZZ based, if for example an NH 2 group, NH 2 group of the N-terminal or first, 43 th, 67 th, 70 th, 98 Via the NH 2 group of the lysine residue side chain of any of the 1st, 112th, 113th, 121st, 125th, 128th, 156th, 170th, 171st, 179th, 308th, or 327th This suggests that it is HRP labeled.
  • HRP labeling is performed via the SH group of any one of the cysteine residues at 293, 307, 310, 323, 324, 325, 333, or 335. It is suggested that.
  • Example 1 Experiments were conducted to measure the HRP activity of HRP-labeled BNC-ZZ prepared by the two methods shown in Production Example 3 above.
  • SAT-blue solution (Dojindo Laboratories) was used as a substrate for HRP, absorbance at 492 nm (Abs 492 nm) was measured, and specific activity was determined using the amount of protein calculated by measuring absorbance at 280 nm.
  • HNC-labeled BNC-ZZ (hereinafter sometimes referred to as NH 2 -HRP-labeled BNC-ZZ) via the NH 2 group is 0.351 unit / ⁇ g (U / ⁇ g).
  • the specific activity of BNC-ZZ HRP-labeled via the SH group (hereinafter sometimes referred to as SH-HRP-labeled BNC-ZZ) was 0.844 U / ⁇ g. That is, NH 2 -HRP labeled BNC-ZZ showed only about 41% activity of SH-HRP labeled BNC-ZZ.
  • unit shows the specific increase value of Abs 492nm value when it measures using SAT-blue which is a substrate on said conditions.
  • the BNC-ZZ used for the preparation of the ALP-labeled BNC-ZZ was subjected to ALP labeling under conditions such that the particle shape was not destroyed. .
  • each ALP-labeled BNC-ZZ is also ALP-labeled on the NH 2 group or SH group in the same amino acid residue as the above-mentioned HRP-labeled BNC-ZZ.
  • Example 2 An experiment was conducted to measure the ALP activity of ALP-labeled BNC-ZZ prepared by the two methods shown in Production Example 4 above. Using pNPP (Sigma Fast p-nitrophenyl phosphate tablets) as a substrate for ALP, the absorbance at 405 nm (Abs 405 nm) was measured, and the specific activity was determined using the amount of protein calculated by measuring the absorbance at 280 nm. .
  • pNPP Sigma Fast p-nitrophenyl phosphate tablets
  • the specific activity of the ALP enzyme of BNC-ZZ ALP-labeled via the NH 2 group (hereinafter sometimes referred to as NH 2 -ALP-labeled BNC-ZZ) is 3.56 U / ⁇ g
  • BLP-ZZ ALP-labeled via the SH group (hereinafter, this may be referred to as SH-ALP-labeled BNC-ZZ) was 5.61 U / ⁇ g. That is, NH 2 -ALP labeled BNC-ZZ showed only about 60% of the activity of SH-ALP labeled BNC-ZZ.
  • the unit indicates a specific increase in Abs 405 nm value when the substrate pNPP is reacted under the above conditions.
  • a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 containing one binding domain derived from protein A having the Z domain and two binding domains derived from protein G was prepared in E. coli (hereinafter, this may be referred to as AGG). ). EMCS (Dojindo) was added to the AGG protein solution to introduce a maleimide group into the amino group of AGG.
  • BNC-ZZ [Production Example 2] is subjected to a reduction treatment using TCEP (Thermo Scientific), and the crosslinking treatment is performed by incubating the reduced BNC-ZZ and AGG into which a maleimide group is introduced.
  • BNC-ZZ was obtained. That is, AGG-BNC-ZZ is a virus-like particle containing a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having AGG bound thereto via a cysteine residue in the protein.
  • Example 3 An experiment was conducted to compare the HRP enzyme activity of HRP-labeled AGG-BNC-ZZ [Production Example 6] with the enzyme activity of SH-HRP-labeled BNC-ZZ [Production Example 3]. A fixed amount of both was taken, a TMB solution (One-Step TMB Ultra, Thermo Scientific) as a substrate of HRP was added thereto, and Abs 450 nm was measured.
  • TMB solution One-Step TMB Ultra, Thermo Scientific
  • SH-HRP-labeled BNC-ZZ [Production Example 3] and a rabbit-derived anti-mouse IgG antibody (Bethyl) are mixed to form a complex of both, and BS 3 (Dojin Chemical), which is a cross-linking agent, is terminated.
  • the concentration was 0, 50, 200, 400, or 1000 ⁇ M.
  • excess rabbit-derived anti-mouse IgG antibody was removed using Protein A Sepharose resin (GE Healthcare) to obtain an HRP-labeled BNC-ZZ / rabbit-derived anti-mouse IgG antibody complex.
  • Example 4 An experiment was conducted to measure the HRP activity of the HRP-labeled BNC-ZZ / rabbit-derived anti-mouse IgG antibody complex [Production Example 7]. Using the HRP-labeled BNC-ZZ / antibody complex, the HRP activity was measured by the method described in Example 3. The results are shown in Table 1. Abs 450 nm shows almost the same value at any crosslinker concentration, indicating that the activity of HRP hardly changes.
  • IgG having no antigenic properties obtained by purifying from normal mouse serum with protein A / G sepharose (GE Healthcare) at various concentrations in each well of the ELISA plate. Added and solidified. Then, it blocked using k-Block-e (made by a vehicle company).
  • HRP-labeled BNC-ZZ and anti-mouse IgG rabbit-derived antibody complex with a cross-linking agent concentration of 0 M that is, when no cross-linking treatment is performed, in the presence of control rabbit-derived IgG, compared with non-coexistence
  • the response to immobilized mouse-derived IgG was reduced to 70% in all concentration ranges.
  • the HRP-labeled BNC-ZZ / rabbit-derived anti-mouse IgG antibody complex was subjected to crosslinking treatment using 50 ⁇ M BS 3 , in the presence of control rabbit-derived IgG, a slight amount of the immobilized mouse-derived IgG was obtained. A decrease in reaction is seen, indicating that reversible binding remains.
  • Example 6 An experiment was conducted to evaluate the residual antibody binding activity and reversible antibody binding activity of the HRP-labeled BNC-ZZ / rabbit-derived anti-mouse IgG antibody complex [Production Example 7].
  • a control rabbit-derived IgG was used instead of the rabbit-derived anti-mouse IgG antibody.
  • a composite was prepared. The concentrations of BS 3 used are 0 ⁇ M, 50 ⁇ M, and 200 ⁇ M.
  • the ALP-labeled rabbit antibody increased the ALP enzyme activity depending on the amount added, and when the 1/1000 dilution was added, the ALP enzyme activity was more than 4 times that of the non-added one. This indicates that the ALP-labeled rabbit antibody is bound to the antibody binding site of BNC-ZZ or HRP-labeled BNC-ZZ.
  • BNC-SA is a virus-like particle containing a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and having SA bound thereto via a cysteine residue of the protein.
  • HRP was cross-linked to the obtained BNC-SA using Peroxidase Labeling Kit-NH 2 to obtain HRP-labeled BNC-SA.
  • a biotinylated anti-mouse IgG antibody derived from rabbit was obtained using Biotin Labeling Kit-NH 2 (Dojin Chemical).
  • the HRP-labeled BNC-SA and rabbit-derived biotinylated anti-mouse IgG antibody were mixed in an equal amount as a protein amount to prepare an HRP-labeled BNC-SA / rabbit-derived anti-mouse IgG antibody complex.
  • Example 7 An experiment was conducted to measure the HRP activity of the HRP-labeled BNC-SA / anti-mouse IgG antibody complex.
  • the HRP activity of the HRP-labeled BNC-SA / rabbit-derived anti-mouse IgG antibody complex [Production Example 8] was measured in the same manner as in Example 1 above.
  • the HRP activity of the HRP-labeled BNC-SA / rabbit-derived anti-mouse IgG antibody complex was about 1/8 that of the control SH-HRP-labeled BNC-ZZ. From the results of Example 1, since the HRP activity of NH 2 -HRP-labeled BNC-ZZ is about 1 / 2.4 of SH, the HRP activity of HRP-labeled BNC-SA / rabbit-derived anti-mouse IgG antibody is It can be judged that it is about 1/3 compared with NH 2 -HRP-labeled BNC-ZZ.
  • Example 8 Experiments were conducted to examine the adsorption of BNC-ZZ to the container and the effect of the blocking agent.
  • an ELISA kit (HB Pre-S1 Antigen Quantitative ELISA Kit, Rapid, manufactured by Vehicle) for measuring the Pre-S1 region on the particle surface of BNC-ZZ was used and measured according to the attached manual. The results are shown in Table 2.
  • Example 9 Experiments were conducted to examine the adsorption of HRP-labeled BNC-ZZ to the container and the effect of the blocking agent.
  • the residual rate of HRP-labeled BNC-ZZ in each sample was calculated based on the Abs 450 nm value of a sample obtained by diluting a sample that had been similarly stored in an MPC-treated tube at 500 ⁇ g / mL to 300 ng / mL. Table 3 shows the results.
  • Example 10 Experiments were conducted to examine the effects of BNC-ZZ adsorption and blocking agents on PVDF membranes.
  • the PVDF membrane is cut into small pieces and subjected to blocking treatment by immersing in PBS containing various concentrations of blocking agents shown in Table 4 at room temperature for 1 hour, and washed with PBS-T three times to bind to the membrane. No blocking agent was removed.
  • a reaction solution prepared by dissolving BNC-ZZ [Production Example 2] at a concentration of 300 ng / mL in PBS-T containing various concentrations of blocking agents shown in Table 4 was added to the blocked PVDF membrane at room temperature for 1 hour. After that, the mixture was reacted with an HRP-labeled rabbit antibody dissolved in PBS-T for 20 minutes at room temperature.
  • the plate is washed 5 times with PBS-T, reacted with ECL Prime (GE Healthcare), which is an HRP luminescence substrate, and luminescence is emitted for 20 minutes using a luminescence detection device (ChemiDoc XRS, Bio-Rad). It measured by exposing.
  • Example 11 Experiments were conducted to examine the effect of the blocking agent and the adsorption of HRP-labeled BNC-ZZ to the PVDF membrane.
  • a solution membrane blocking solution prepared by dissolving 5% skim milk, 10% skim milk + 3% fish gelatin (funakoshi), 4% block ace and 5% bovine serum albumin in TBS was prepared.
  • the PVDF membrane cut into small pieces was subjected to a blocking treatment using the membrane blocking solution. The membrane blocking treatment was controlled as an untreated PVDF membrane.
  • TBS-T containing SH-HRP-labeled BNC-ZZ [Production Example 3] is prepared, and 1% skim milk, 1% Block Ace, 1% BSA, or 2% gelatin is added, A reaction blocking solution was prepared, and the reaction blocking solution was added to the PVDF membrane.
  • TBS-T containing SH-HRP-labeled BNC-ZZ was used as a control. After the addition, a PVDF membrane that was appropriately washed was detected in the same manner as in Example 10. The results are shown in Table 5.
  • the reaction blocking solution containing BSA is removed and the adsorption of HRP-labeled BNC-ZZ to the PVDF membrane is strongly suppressed compared to the control. It was done.
  • the degree of signal intensity obtained from the PVDF membrane was high regardless of the type of blocking treatment of the PVDF membrane.
  • Example 12 Experiments were conducted to examine the effects of HRP-labeled BNC-ZZ adsorption on the PVDF membrane and chemical blocking agents.
  • Various blocking agents shown in Table 6 were dissolved so as to have a concentration of 1% in TBS.
  • TBS in which 5% skim milk was dissolved in TBS was prepared. These were used to block the PVDF membrane, then reacted with SH-HRP-labeled BNC-ZZ [Production Example 3], and then evaluated in the same manner as in Example 11. The results are shown in Table 6.
  • Example 13 Experiments were performed to effect the effect of HRP-labeled BNC-ZZ in Western blot. From the results of Examples 11 and 12, when SH-HRP-labeled BNC-ZZ is used in a PVDF membrane, Pluronic F-127, Pluronic P-105, HPMC, PVA2000, PVA500, Lipidure206 and Lipidure802 are used as blocking agents. Then, the adsorption of HRP-labeled BNC-ZZ to the membrane was suppressed, and it was assumed from the results of Example 10 that the effect was higher when a blocking agent was included in the reaction solution of HRP-labeled BNC-ZZ.
  • Example 14 Experiments were conducted to examine the effect of various blocking agents on the specific binding of probes in ELISA.
  • Control mouse-derived IgG polyclonal
  • an ELISA plate on which control mouse-derived IgG was not immobilized was prepared, and a plate subjected to blocking treatment with k-Block-e was prepared.
  • Example 15 Next, experiments were conducted to examine the effect of various probes on adsorption to the ELISA plate and the specific reaction of various blocking agents by changing the concentration of the blocking agent used in Example 14.
  • the GFP protein prepared using E. coli was immobilized on an ELISA plate and blocked using k-Block-e.
  • the HRP-labeled BNC-ZZ / rabbit-derived anti-GFP antibody complex was prepared using a rabbit-derived anti-GFP antibody instead of the rabbit-derived anti-mouse IgG antibody with the concentration of BS 3 in Production Example 7 being 1000 ⁇ M.
  • the above-described control rabbit-derived IgG was used in place of the anti-GFP rabbit antibody, and Abs 450 nm was measured by the same method as shown in Example 9.
  • the obtained results were obtained by dividing each signal value by each noise value with the value obtained in the absence of anti-GFP antibody as the noise value and the value obtained in the presence of anti-GFP antibody as the specific signal value.
  • the numerical values are shown in Table 9 as the S / N ratio.
  • Example 16 Experiments were conducted to evaluate the antibody binding activity of HRP-labeled BNC-ZZ. Antibody binding activities of NH 2 -HRP-labeled BNC-ZZ and SH-HRP-labeled BNC-ZZ prepared in Production Example 3 were compared by ELISA. Control rabbit-derived IgG was immobilized on an ELISA plate, and each well was blocked with 1% Block Ace. HRP-labeled BNC-ZZ solutions having various concentrations of 0, 9.375, 18.75, 37.5, 75, 150, 300, 600 ng / mL as BNC-ZZ protein amounts were prepared, and the final concentration was 0.05. % PBS-T added so as to contain Pluronic F-127 was added to the well to react, washed, Abs 450 nm was measured by the method shown in Example 9. The result is shown in FIG.
  • the HRP-labeled BNC-ZZ was bound to the maximum amount of the immobilized antibody at these concentrations.
  • concentrations lower than this the magnification of the measured values obtained with SH-HRP-labeled BNC-ZZ and NH 2 -HRP-labeled BNC-ZZ is high, and on average when the HRP-labeled BNC-ZZ concentration is 37.5 ng or less. It was about 7.24 times higher.
  • labeling via the SH group can utilize the antibody binding ability of BNC-ZZ more, and also has higher HRP activity. It can be concluded that labeling via the SH group is far superior, since it can form a label approximately 7.2 times higher.
  • the HRP-labeled BNC-ZZ is via an SH group.
  • Example 17 Experiments were conducted to examine the application of HRP-labeled BNC-ZZ in ELISA.
  • An ELISA plate immobilized with Pre-S2 product number BCL-AGS2-21
  • Pre-S2 product number BCL-AGS2-21
  • a peptide of the surface antigen of hepatitis B virus was blocked with k-Block-e, and various concentrations of anti-Pre -S2 mouse antibody (Special Immunology Laboratory, 2APS42) was added.
  • Example 18 In the same manner as in Example 17, an antibody detection type ELISA of HRP-labeled BNC-ZZ was examined.
  • the recombinant protein of Leishmania parasite and the control human antiserum used in this experiment were both provided by Aichi Medical University, Department of Infection and Immunology.
  • An ELISA plate on which a recombinant protein of a protozoan that is a Leishmania pathogen was immobilized instead of Pre-S2 was blocked with k-Block-e, and various concentrations of control human antiserum were added.
  • Example 19 Practical measurement of HRP-labeled BNC-ZZ in ELISA was examined.
  • the ELISA plate immobilized with GFP protein was blocked with k-Block-e.
  • An anti-GFP mouse IgG antibody with a known concentration was used as a standard, and a mouse anti-GFP antiserum diluted 100 times or more as a sample was added to each well of the ELISA plate.
  • Example 20 Experiments were conducted to evaluate the antibody binding activity of ALP-labeled BNC-ZZ.
  • An ELISA plate solid-phased using IgG derived from control rabbits was blocked with 1% Block Ace, and each well was treated with NH 2 -ALP-labeled BNC-ZZ or SH-ALP-labeled BNC-ZZ prepared in Preparation Example 4 above.
  • Pluronic F-127 having a final concentration of 0.05% was used together with ALP-labeled BNC-ZZ. The results are shown in FIG.
  • the measured values obtained with SH-ALP-labeled BNC-ZZ at all BNC-ZZ concentrations were higher than that of NH 2 -ALP-labeled BNC-ZZ.
  • the measured value obtained with SH-ALP-labeled BNC-ZZ was about 1.7 times higher than that of NH 2 -ALP-labeled BNC-ZZ.
  • This magnification is almost the same level as the difference in ALP specific activity between the two (the former is 5.61 and the latter is 3.56 units / ⁇ g, which is 1.6 times higher), and any ALP-labeled BNC-ZZ It was suggested that almost the maximum amount was bound to the immobilized antibody.
  • Example 21 Experiments were conducted to examine the application of ALP-labeled BNC-ZZ to ELISA.
  • Various concentrations of SH-ALP-labeled BNC-ZZ [Production Example 4] or ALP-labeled rabbit-derived anti-mouse IgG antibody were added to each well for reaction. After washing, Abs 405 nm was measured in the same manner as in Example 2.
  • Pluronic® F-127 was used together with ALP-labeled BNC-ZZ so that the final concentration was 0.05%. The result is shown in FIG.
  • ALP-labeled BNC-ZZ When ALP-labeled BNC-ZZ was used, a reaction much higher than that of an ALP-labeled antibody was observed, suggesting that ALP-labeled BNC-ZZ is useful for highly sensitive antibody detection.
  • Example 22 Experiments were conducted to evaluate the antibody binding activity of HRP-labeled AGG-BNC-ZZ.
  • An ELISA plate was immobilized using control pig-derived IgG (manufactured in-house prepared by the method of Example 5), and then blocked with 0.5% casein.
  • HRP-labeled AGG-BNC-ZZ of various concentrations shown in the graph the horizontal axis of FIG. 8 to each well Production Example 6] or NH 2 chromatography HRP-labeled BNC-ZZ Production Example 3] was added as a probe reaction, washed Thereafter, Abs 450 nm was measured in the same manner as in Example 9. Pluronic F-127 was added to the probe so that the final concentration was 0.05%. The results are shown in FIG.
  • the HRP activity of HRP-labeled AGG-BNC-ZZ is known to be 1/3 of that of HRP-labeled BNC-ZZ.
  • HRP-labeled AGG-BNC-ZZ should show 1/3 of the reaction of HRP-labeled BNC-ZZ with respect to solid-phased porcine-derived IgG.
  • HRP-labeled AGG-BNC-ZZ was actually a reaction of about 1 / 1.1-1.2.4 compared with HRP-labeled BNC-ZZ. This indicates that HRP-labeled AGG-BNC-ZZ has higher antibody binding activity than HRP-labeled BNC-ZZ. From the above results, it is shown that both HRP-labeled AGG-BNC-ZZ and HRP-labeled BNC-ZZ have antibody binding activity superior to that of antibodies.
  • Example 23 An experiment was conducted to evaluate the protein G-derived antibody binding ability of HRP-labeled AGG-BNC-ZZ. A similar experiment was performed except that mouse-derived IgG 1 which is considered to be difficult to bind with BNC-ZZ instead of the control pig-derived IgG shown in Example 22 was immobilized. The results are shown in FIG.
  • HRP-labeled AGG-BNC-ZZ showed high binding reaction to mouse IgG 1.
  • HRP-labeled BNC-ZZ almost no detection was possible with HRP-labeled BNC-ZZ. This is because the antibody binding site derived from protein G of HRP-labeled AGG-BNC-ZZ functions well, and HRP-labeled AGG-BNC-ZZ is high even for antibodies that are difficult to bind at the antibody binding site derived from protein A. It shows that it has a binding force.
  • Example 24 An application experiment of HRP-labeled AGG-BNC-ZZ to ELISA was conducted. GFP protein produced using E. coli was immobilized on an ELISA plate and then blocked using k-Block-e. Rabbit-derived anti-GFP antibody was added to each well at various concentrations shown on the horizontal axis of the graph of FIG. 10, and 100 ng / mL HRP-labeled AGG-BNC-ZZ [Production Example 6] or SH-HRP-labeled BNC-ZZ [ Production Example 3] was added as a probe for reaction, and after washing, Abs 450 nm was measured in the same manner as in Example 9. Pluronic F-127 was added to the probe so that the final concentration was 0.05%. The results are shown in FIG.
  • HRP-labeled AGG-BNC-ZZ like SH-HRP-labeled BNC-ZZ used as a control, showed a reaction depending on the added antibody concentration, but the former reaction was about 1 ⁇ 2 compared to the latter. . Considering that the HRP activity of HRP-labeled AGG-BNC-ZZ is 1/3 that of HRP-labeled BNC-ZZ, it was found that HRP-labeled AGG-BNC-ZZ exhibits a reaction higher than that of HRP-labeled BNC-ZZ.
  • HRP-labeled AGG-BNC-ZZ can be used in an antibody detection type ELISA even in a practical measurement system. Further, HRP-labeled AGG-BNC-ZZ indicates that mouse IgG 1 that cannot be detected by HRP-labeled BNC-ZZ can also be detected, indicating that it is very useful.
  • Example 25 Experiments were conducted to examine the antibody binding activity of the HRP-labeled BNC-ZZ / rabbit derived anti-mouse IgG antibody complex.
  • the ELISA plate was immobilized using control mouse-derived IgG, and then blocked by reacting with k-Block-e for 1 hour.
  • Example 26 It was confirmed whether anti-OVA mouse IgE and anti-OVA mouse IgG present in anti-OVA mouse antiserum obtained by immunization with ovalbumin (OVA) could be measured practically.
  • OVA was immobilized on an ELISA plate and then blocked using h-Block-e. To this plate, each anti-OVA mouse antiserum diluted 100 times or more was added.
  • As a probe for measuring IgE a complex prepared by using SH-HRP labeled BNC-ZZ [Production Example 3] and anti-mouse IgE (Nordic immunology Lab) according to the method of [Production Example 7] at a BS 3 concentration of 1000 ⁇ M, and HRP labeling Anti-mouse IgE was used.
  • the antibody titer of anti-OVAIgE in mouse serum is 3807 ⁇ 1439 nunit / mL when HRP-labeled BNC-ZZ / anti-mouse IgE complex is used, and 3558 ⁇ 935 nunit / mL when HRP-labeled anti-mouse IgE is used. Yes, both showed similar values.
  • the antibody titer of anti-OVA mouse IgG was 4175 ⁇ 8717 ⁇ unit / mL. As described above, it was found that the antibody titer measurement of IgE and IgG is sufficiently possible in the measurement system using these complexes and has practical utility.
  • Example 27 Using the HRP-labeled BNC-SA / rabbit derived anti-mouse IgG antibody complex prepared in [Production Example 8], an experiment was conducted to confirm the binding reaction to mouse IgG. Control mouse-derived IgG was immobilized on an ELISA plate and then blocked using 1% Block Ace.
  • the HRP-labeled BNC-SA / antibody complex showed about 1 ⁇ 2 binding activity compared to the mixed complex of HRP-labeled BNC-ZZ and antibody in which HRP was labeled through the same NH 2 group. If the enzymatic activity of the HRP think the former is about 1/3, HRP-labeled BNC-SA / antibody complexes high ability to bind to the antibody from the mixed complex of NH 2 over HRP-labeled BNC-ZZ and antibody It shows that. On the other hand, when compared with the HRP-labeled antibody, the HRP-labeled BNC-SA / antibody complex showed about twice the reaction. As described above, it was found that the HRP-labeled BNC-SA / antibody complex has a higher binding ability to the antibody than the HRP-labeled anti-mouse IgG antibody, and is useful.
  • Example 28 In the same manner as in Example 13, the HuH7 cell extract was subjected to Western blotting. The membrane was blocked with 5% skim milk, and the primary antibody used was a mouse-derived anti-vimentin antibody (Progen, 1/1000 dilution). HRP-labeled anti-mouse IgG antibody from rabbit containing 1% skim milk as a probe (Rockland, 1/10000; 2nd Ab in the figure), or HRP-labeled BNC containing 0.1% Pluronic F-127 and 1% skim milk -ZZ [Production Example 3] was used. The results are shown in FIG.
  • Example 29 Western blotting was performed in the same manner as in Example 28.
  • the anti-vimentin mouse antibody used as the primary antibody was diluted 1/3000 and detected with the HRP-labeled anti-mouse IgG antibody (Rockland, # 611-1302, 1/10000 dilution) as the secondary antibody (Detect- in the figure) 1) After that, it was further dissolved in a solution containing 0.1% Lipidure 802 to detect HRP-labeled BNC-ZZ as an additional probe (Detect-2 in the figure). The results are shown in FIG.
  • the band signal can be strengthened simply by re-detection (Detection-2) using HRP-labeled BNC-ZZ as an additional probe. You can see that it was made. Although no data is shown, the signal hardly increased even when a secondary antibody was added. Therefore, HRP-labeled BNC-ZZ is very useful because it can sensitize a signal only by adding it.
  • Example 30 Western blotting was performed in the same manner as in Example 28.
  • Anti-vimentin mouse antibody Progen, 1/2000 dilution
  • anti-GAPDH rabbit antibody EPITOMICS, 1/10000 dilution
  • HRP-labeled anti-mouse IgG antibody Rockland
  • HRP-labeled anti-rabbit IgG antibody Santa Cruz
  • HRP-labeled BNC-ZZ HRP-ZZ
  • HRP-labeled BNC-ZZ was used together with Pluronic F-127 in an amount to give a final concentration of 0.1%. The results are shown in FIG.
  • Example 31 As a sample, a GFP-Histag protein whose concentration was adjusted in a 2-fold dilution series was added to the HuH7 cell extract, and this was subjected to Western blotting in the same manner as in Example 28. HRP diluted with PBS-T containing 0.1% Lipidure 206 after reacting with anti-GAPDH rabbit antibody (EPITOMICS, 1/10000) and anti-GFP rabbit antibody (Rockland, 1/2000) as primary antibodies Simultaneous detection using labeled BNC-ZZ (HRP-ZZ). The results are shown in FIG.
  • Example 32 Western blotting was performed in the same manner as in Example 28.
  • Anti-vimentin mouse antibody Progen, 1/2000
  • HRP-labeled BNC-ZZ were mixed in equal amounts in advance, and the mixed complex was added to the PVDF membrane to detect by one-step method.
  • TBS-T containing 0.1% Pluronic F-127 was used as the reaction solution of the mixed complex of HRP-labeled BNC-ZZ and antibody.
  • As a control it was also detected by a two-step operation in which a reaction with an anti-Vimentin mouse antibody was followed by a reaction with an HRP-labeled anti-mouse antibody (Rockland, 1/5000). The results are shown in FIG.
  • the operation time until detection is 5 minutes for blocking (Q1 in the figure) or 15 minutes (Q2 in the figure), then 5 minutes for the washing to be performed, and then The reaction to be performed (primary antibody + HRP-labeled BNC-ZZ) is 30 minutes, then the washing to be performed is 25 minutes (5 minutes ⁇ 5: Q1) or 15 minutes (3 minutes ⁇ 5: Q2), and the total time is about 65 minutes
  • the two-step method using an HRP-labeled anti-mouse antibody M in the figure
  • blocking is performed for 60 minutes, then washing is performed for 10 minutes (5 minutes ⁇ 2), then primary antibody reaction is performed for 60 minutes, The subsequent washing was 15 minutes (5 minutes ⁇ 3), the subsequent secondary antibody reaction was 60 minutes, the subsequent washing was 25 minutes (5 minutes ⁇ 5), and the total time was about 230 minutes.
  • the conventional two-step method requires a total of 230 minutes until the signal is detected using the protein transfer membrane.
  • the one-step method using the HRP-labeled BNC-ZZ (Q1, Q2 in the figure).
  • the cleaning time and other times were shortened to 65 minutes, and the same result could be obtained. Therefore, it was found that HRP-labeled BNC-ZZ has utility that enables rapid detection Western blot.
  • Example 33 Western blotting was performed in the same manner as in Example 28.
  • Anti-p53 rabbit antibody (Santa Cruz, 1/200) as the primary antibody
  • ALP-labeled anti-rabbit IgG antibody (Sigma, 1/50000) as the secondary antibody
  • SH-ALP-labeled BNC-ZZ [Production Example 4] CDP-Star (NEB) was used as a substrate for ALP. The results are shown in FIG.
  • ALP-labeled BNC-ZZ is a highly useful probe even in Western blotting, and HRP-labeled BNC- It was suggested that various uses shown in the examples of the present application using ZZ are possible.
  • Example 34 Western blotting was performed in the same manner as in Example 28 except that A431 cell extract was used. After antibody species as the primary antibody reacted with an anti-EGFR antibody is a mouse IgG 1 (Cell Singnaling, 1/ 1000 dilution) or anti-p53 rabbit antibody (Santa Cruz, 1/200 dilution), 0.1% The reaction was carried out with HRP-labeled AGG-BNC-ZZ [Production Example 6] or HRP-labeled BNC-ZZ [Production Example 3] diluted with TBS-T containing Pluronic F-127. The results are shown in FIG.
  • HRP-labeled BNC-ZZ Z in the figure
  • HRP-labeled AGG-BNC-ZZ A in the figure
  • detection was possible.
  • anti-p53 antibody which is a rabbit IgG
  • detection was possible using either HRP-labeled BNC-ZZ or HRP-labeled AGG-BNC-ZZ.
  • HRP labeled AGG-BNC-ZZ is also readily bound to the mouse IgG 1 for having the antibody binding site derived from a protein G, HRP-labeled BNC-ZZ because with only the antibody combining site of protein A from good agreement with that hardly bind to mouse IgG 1, utility of the HRP-labeled AGG-BNC-ZZ was demonstrated.
  • Example 35 An ELISA plate on which Pre-S2, which is a peptide of the surface antigen of hepatitis B virus, was immobilized was blocked, and various concentrations of anti-Pre-S2 antibody were added to each well. Next, HRP-labeled BNC-L [Production Example 9] was added and allowed to react. After washing, Abs 450 nm was measured by the method shown in Example 9 (antigen sandwich ELISA). The result is shown in FIG.
  • HRP-labeled BNC-L can be sufficiently used as a probe for ELISA measurement.
  • Example 36 The ELISA plate solid-phased with various concentrations of rabbit IgG was blocked, and SH-HRP-labeled BNC- (sugar chain) -AGG [Production Example 10] was added to each well for reaction. After washing, Example 9 Abs 450 nm was measured by the method shown. The results are shown in FIG.
  • HRP can be transmitted via SH group at the cysteine residue of protein present on the surface of HVJ-E (Genome One, Ishihara Sangyo), a virus-like particle containing Sendai virus envelope protein. Labeling gave HRP-labeled HVJ-E.
  • Example 37 The HRP activity [Preparation Example 11] of HRP-labeled HVJ-E was measured by the same method as in Example 1. As a result, it was 0.05 U / ⁇ g.
  • Virus-like particles having a transmembrane protein often have SH groups in or near the transmembrane region of the protein. This example shows that labeling via SH groups is possible even in HVJ-E, and that SH groups present in virus-like particles are useful as labeling targets.

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Abstract

本発明は、検出感度に優れ、且つ検出バックグラウンドを顕著に抑制する免疫学的測定法を提供することを目的とする。その解決手段は、ウイルス様粒子であって、該ウイルス様粒子が自己組織化能を有するタンパク質を含み、該自己組織化能を有するタンパク質の少なくとも１つのシステイン残基のチオール基を介して生理活性分子によって修飾されてなるウイルス様粒子を提供することである。

Description

免疫学的測定法に用いられるウイルス様粒子、それに用いられるブロッキング剤、及びこれらを含むキット
　本発明は免疫学的測定法に用いられるウイルス様粒子、それに用いられるブロッキング剤、及びこれらを含むキットに関する。
　各種の粒子をイムノアッセイのセンサーとして利用する方法が知られている（特許文献１～８）。例えば、特許文献１又は特許文献２では蛍光性の半導体ナノ粒子またはシリカ粒子をイムノアッセイの検出素子として利用する方法が提示されており、ナノ粒子が発生する蛍光でイムノアッセイを行う手法である。
　一方、特許文献８では金属材料、磁性材料、または半導体材料を核として各種ペプチドを結合させたナノ粒子コンジュゲートが提示されている。
　Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原を有するウイルス様粒子であって、斯かる抗原のＮ末端にあるＰｒｅ－Ｓ１及びＰｒｅ－Ｓ２領域に、プロテインＡ由来の抗体のＦｃ領域に対する結合ドメイン（Ｚタグ）がタンデムで２個挿入されたもの（以後ＺＺ－ＢＮＣと呼ぶことがある。）は、酵母を用いて遺伝子組み換えで製造したＬ型のＢ型肝炎ウイルス粒子（特許文献９）のＰｒｅ－Ｓ１及びＰｒｅ－Ｓ２領域にプロテインＡ由来の抗体のＦｃ領域に対する結合ドメイン（Ｚタグ）を２個挿入したものであり、その製造法や薬物送達システムとしての有用性は特許文献１０に記載されている。
　このＢＮＣ－ＺＺの持つ高いセンサー素子としての機能に注目し、特許文献３では酵素標識抗体とＢＮＣ－ＺＺを併用した利用方法、蛍光標識したＢＮＣ－ＺＺによる抗体検出法、イムノアッセイで利用する方法が実施例として例示されている。特許文献６ではＢＮＣ－ＺＺを固相化抗体の整列に利用して感度を高める手法が例示されている。特許文献４ではビオチン化したＢＮＣ－ＺＺの免疫学的測定への利用方法が記載されており、ビオチン化ＢＮＣ－ＺＺにストレプトアビジンを介してビオチン化ＨＲＰ酵素を又はビオチン化抗体を結合させることで、ビオチン化されていないＢＮＣ－ＺＺを用いるよりも感度上昇が図れることが実施例に例示されている。
　特許文献５ではＢＮＣ－ＺＺ粒子の持つ抗体結合能を上げることで免疫学的測定の感度を上げるためＺＺタグを持つタンパク質分子とＰｒｅ－Ｓ領域を持たないタンパク質分子を有するハイブリッド型の粒子の製法と利用方法が記載されている。さらに、特許文献７では蛍光標識したＢＮＣ－ＺＺへ抗体を弱く架橋することによって多抗原を同時検出する手法が実施例に例示されている。
特表２００６－５１７９８５号公報 特表２００２－５４４４８８号公報 特開２００７－１２７６２６号公報 特開２００８－１９１１４３号公報 特開２０１０－０９６６７７号公報 特開２００７－１２１２７６号公報 特開２０１０－２１０４４４号公報 特表２００７－５０６０８４号公報 特開２００１－３１６２９８号公報 特開２００４－００２３１３号公報
Ｖａｃｃｉｎｅ　１９，３１５４－３１６３、２００１
　一般に、イムノアッセイにおいて感度を上昇させるためには、（１）検出素子の検出対象物質に対し高い親和性を持つ素子を利用する、（２）検出対象物質と結合した検出素子の発生するシグナル強度を上げるの、何れかの手法が用いられる。ここで、上述のようなＢＮＣ－ＺＺを検出素子として利用する場合、その検出対象への親和性は一定であるため、発生するシグナル強度を上げることが最も有効な手段となる。
　しかしながら、ＢＮＣ－ＺＺを利用したことが開示された文献では、よく知られたビオチンとストレプトアビジンの特異的結合能を利用し、ＨＲＰ結合量を上昇させてシグナルを上昇させる方法が、ビオチン化ＢＮＣ－ＺＺとして用いられている（特許文献４）に過ぎず、その検討は行われてこなかった。
　ＺＺ－ＢＮＣはプロテインＡ由来の抗体結合部位を持つため、免疫学的測定法で重要なマウスＩｇＧ１、ラットＩｇＧ、ヒツジＩｇＧ１、ヤギＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ３などの抗体との結合が弱く、使用法や使用範囲が大きく制限される。さらにＺＺーＢＮＣは各種ＩｇＧと結合するため、複数抗体が存在する環境、例えば、抗体サンドイッチＥＬＩＳＡや複数抗体が存在する血清等の評価では目的外の抗体との結合が起こるため、抗体特異的な検出が困難である。
　そして、実用化を考えた場合、ＢＮＣ－ＺＺやその標識体や修飾体はリポタンパク質であるため、ガラスやプラスチックに非特異的な結合を示す。非特異的吸着はイムノアッセイに大きな影響を与えるのみならず、希釈溶液の長時間保存でも大きな問題となる。
　本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、ウイルス様粒子に含まれる自己組織化能を有するタンパク質の特定の部位を介して生理活性分子を標識すると、斯かるウイルス様粒子を免疫学的測定に好適に用いることができることを見出した。
　更に、特定のブロッキング剤が上述のウイルス様粒子を免疫学的測定に用いる際に優れたブロッキング効果を発揮することを見出した。
　本発明は斯かる知見に基づいて完成されたものであり、以下に示す広い態様の発明を含むものである。
　項１　自己組織化能を有するタンパク質を含む免疫学的測定用ウイルス様粒子であって、該自己組織化能を有するタンパク質の少なくとも１つのシステイン残基のチオール基を介して生理活性分子によって修飾されてなる、ウイルス様粒子。
　項２　前記自己組織化能を有するタンパク質がＨＢｓＡｇタンパク質である、上記項１に記載のウイルス様粒子。
　項３　前記自己組織化能を有するタンパク質が配列番号１に示すアミノ酸配列を含む上記項１のウイルス様粒子。
　項４　前記自己組織化能を有するタンパク質が抗体結合ドメインを有する、上記項１～項３の何れか１項に記載のウイルス様粒子。
　項５　前記生理活性分子が、酵素、抗体結合ドメイン、ビオチン、蛍光色素、発光色素、及びアビジン化合物からなる群より選択される少なくとも１種である、上記項１～項４の何れか１項に記載のウイルス様粒子。
　項６　前記酵素が、アルカリホスファターゼ及び／又はペルオキシダーゼである、上記項５に記載のウイルス様粒子。
　項７　前記抗体結合ドメインが、プロテインＡに含まれる抗体結合ドメイン、プロテインＧに含まれる抗体結合ドメイン、及びプロテインＬに含まれる抗体結合ドメインからなる群より選択される少なくとも１種である、上記項４又は項５に記載のウイルス様粒子。
　項８　前記抗体結合ドメインが、配列番号３～５の何れかに示されるアミノ酸配列からなる上記項４又は項５に記載のウイルス粒子。
　項９　前記アビジン化合物が、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、ＡＶＲタンパク質、ブラダビジン（Ｂｒａｄａｖｉｄｉｎ）、リザビジン（Ｒｈｉｚａｖｉｄｉｎ）、及びタマビジン（登録商標）からなる群より選択される少なくとも１種である、上記項５に記載のウイルス様粒子。
　項１０　上記項１～９の何れか１項に記載のウイルス様粒子であって、生理活性分子が抗体結合ドメインであり、該抗体結合ドメインに抗体が結合してなるウイルス様粒子。
　項１１　上記項１～項１０の何れか１項に記載のウイルス様粒子を用いた免疫学的測定用ブロッキング剤であって、当該ブロッキング剤が、ヒドロキシアルキルセルロース、ポリビニルアルコール、エチレンオキサイド／プロピレンオキサイド共重合体、及び２－メタクリロイルオキシエチルホスホコリンで構成される共重合体からなる群より選択される少なくとも１種を含むブロッキング剤。
　項１２　前記ヒドロキシアルキルセルロースがヒドロキシプロピルメチルセルロースである上記項１１に記載のブロッキング剤。
　項１３　前記ポリビニルアルコールの重合度が、２００～５０００である、上記項１１に記載のブロッキング剤。
　項１４　前記エチレンオキサイド／プロピレンオキサイド共重合体が、プルロニック（登録商標）である上記項１１に記載のブロッキング剤。
　項１５　前記エチレンオキサイド／プロピレンオキサイド共重合体が、プルロニック（登録商標）Ｆ１２７及び／又はプルロニック（登録商標）Ｐ１０５である上記項１１に記載のブロッキング剤。
　項１６　２－メタクリロイルオキシエチルホスホコリンで構成される共重合体が、バイオリピジュア（登録商標）である、上記項１１に記載のブロッキング剤。
　項１７　２－メタクリロイルオキシエチルホスホコリンを構成単位とする重合体がバイオリピジュア（登録商標）２０６及び／又はバイオリピジュア（登録商標）８０２である、上記項１１記載のブロッキング剤。
　項１８　上記項１～項１０の何れか１項に記載のウイルス様粒子と上記項１１～項１７の何れか１項に記載のブロッキング剤を含む免疫学的測定用キット。
　本発明に係るウイルス様粒子は、優れた検出感度で免疫学的測定を行うことができる。
　本発明に係るブロッキング剤は、本発明に係るウイルス様粒子を用いて行う免疫学的測定において、得られるデータのバックグラウンドの低下及び／又は検出シグナルを増感させる作用を発揮し、Ｓ／Ｎ比を顕著に上昇させることが可能となる。
　本発明に係るキットを用いた免疫学的測定によると、得られるデータのＳ／Ｎ比を顕著に上昇させることが可能となる。
実施例５の結果を示す図。 実施例６の結果を示す図。 実施例１６の結果を示す図。 実施例１７の結果を示す図。 実施例１８の結果を示す図。 実施例２０の結果を示す図。 実施例２１の結果を示す図。 実施例２２の結果を示す図。 実施例２３の結果を示す図。 実施例２４の結果を示す図（抗ＧＦＰ抗体）。 実施例２４の結果を示す図（ＨＭＧモノクローナル抗体）。 実施例２５の結果を示す図。 実施例２７の結果を示す図。 実施例２８の結果を示す図。 実施例２９の結果を示す図。 実施例３０の結果を示す図。 実施例３１の結果を示す図。 実施例３２の結果を示す図。 実施例３３の結果を示す図。 実施例３４の結果を示す図。 実施例３５の結果を示す図。 実施例３６の結果を示す図。
＜ウイルス様粒子＞
　本発明に係るウイルス様粒子は、免疫学的測定法に用いられ、自己組織化能を有するタンパク質を含む。自己組織化能を有するタンパク質は、そのシステイン残基のチオール基を介して、生理活性分子が修飾されてなる。
　自己組織化能を有するタンパク質とは、生体内、特に細胞内で小胞体ルーメン、細胞膜、核膜等の脂質二重膜を巻き込んでウイルス様粒子を形成し得るタンパク質であり、且つシステイン残基を有する範囲において特に限定はされないが、例えば、エンベローブを有するウイルスの出芽機能に関連するタンパク質、エンベローブタンパク質、又はこれらの変異体等が挙げられる。
　エンベローブを有するウイルスは、特に限定はされないが、例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、アヒルＢ型肝炎ウイルス等のヘパドナウイルス科に属するウイルス；センダイウイルス（ＨＶＪ）等のパラミクソウイルス科に属するウイルス；単純ヘルペスウイルス等のヘルペスウイルス科に属するウイルス；インフルエンザウイルス等のオルトミクソウイルス科に属するウイルス；ヒト免疫不全ウイルス等のレトロウイルス科に属するウイルス等が挙げられる。
　自己組織化能を有するタンパク質は特に限定はされないが、例えば、ＨＶＢの出芽機能に関連するタンパク質であるＢ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）タンパク質；ＨＶＪの出芽機能に関連するタンパク質であるＦプロテイン、ヘマグルチニンーノイラミニダーゼタンパク質、又はこれらの変異体が挙げられる。中でもＨＢｓＡｇタンパク質、Ｆプロテイン、ヘマグルチニンーノイラミニダーゼタンパク質、これらの変異体等が好ましい。
　変異体とは、少なくとも一つ以上のシステイン残基を有し、且つ上述のようなウイルス様粒子を形成し得る作用を発揮する範囲に限りにおいて、特に限定はされることはなく、具体的な変異導入数も同様の範囲において、特に限定はされないが、通常は変異導入前のアミノ酸配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する変異体となるような変異導入数とすればよい。
　なお、ここでいう変異導入とは、置換、欠失、挿入等を包含する。具体的な変異導入については、公知の方法を用いて実施することができ、特に限定はされないが、例えば置換であれば保存的な置換技術を採用すればよい。用語「保存的な置換技術」とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換されることを意味する。
　例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン等といった塩基性側鎖を有するアミノ酸残基同士で置換されることが、保存的な置換技術にあたる。その他、アスパラギン酸、グルタミン酸等といった酸性側鎖を有するアミノ酸残基；グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン等といった非帯電性極性側鎖を有するアミノ酸残基；アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン等といった非極性側鎖を有するアミノ酸残基；スレオニン、バリン、イソロイシン等といったβ－分枝側鎖を有するアミノ酸残基、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン等といった芳香族側鎖を有するアミノ酸残基同士での置換も同様に、保存的な置換にあたる。
　用語「同一性」とは、２以上の対比可能なアミノ酸配列の、お互いに対する同一のアミノ酸配列の程度をいう。従って、ある２つのアミノ酸配列の同一性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。アミノ酸配列又同一性のレベルは、例えば、配列分析用ツールであるＦＡＳＴＡを用い、デフォルトパラメータを用いて決定される。これらの解析方法の具体的な手法は公知であり、National Center of Biotechnology Information（ＮＣＢＩ）のウェブサイト（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を参照すればよい。
　ＨＢｓＡｇとは、特に限定はされないが、例えば配列番号１に示すアミノ酸配列を含むタンパク質等が挙げられ、そのＨＢｓＡｇの変異体とは、例えば特許文献５や９に記載されるＨＢｓＡｇの変異体等が挙げられる。Ｆプロテインとは、特に限定はされないが、例えばＮＣＢＩのウェブサイトに登録されたAccession No. NP_056877 ; Version: NP_056877.1 GI : 9627226にて示されるアミノ酸配列からなるタンパク質等が挙げられる。ヘマグルチニンーノイラミニダーゼタンパク質とは、特に限定はされないが、例えばＮＣＢＩのウェブサイトに登録されたAccession No. NP_056878 ; Version: NP_056878.1 GI : 9627227にて示されるアミノ酸配列からなるタンパク質等が挙げられる。
　自己組織化能を有するタンパク質はシステイン残基を有しており、斯かるシステイン残基のチオール基を介して生理活性分子が修飾されてなる。具体的なシステイン残基は、特に限定はされないが、自己組織化能を有するタンパク質に基づいて形成されたウイルス様粒子の表面に位置する特定のシステイン残基に生理活性分子が修飾されてなることが好ましい。
　このようなシステイン残基として、例えば上述の配列番号１に示すアミノ酸配列からなるＨＢｓＡｇタンパク質であれば、１０７番目、１２１番目、１２４番目、１３７番目、１３８番目、１３９番目、１４７番目、又は１４９番目のシステイン残基が挙げられる。なお、このＨＢｓＡｇタンパク質の膜貫通ドメインとして９～２８番目、８０～９８番目、及び１７０～１９２番目のアミノ酸配列が推定されている。
　例えば、上記ＮＣＢＩのウェブサイトに記載されたアミノ酸配列からなるＦプロテインであれば、７０番目、１９９番目、３３８番目、３４７番目、３６２番目、３７０番目、３９４番目、３９９番目、４０１番目、又は４２４番目のシステイン残基が挙げられる。なお、このＦプロテインの膜貫通ドメインとして、１～２５番目、１１７～１３９番目、及び５０１～５２３番目のアミノ酸配列が推定されている。
　例えば、上記ＮＣＢＩのウェブサイトに記載されたアミノ酸配列からなるヘマグルチニンーノイラミニダーゼタンパク質であれば、１２９番目、１３８番目、１６１番目、１９２番目、２１６番目、２５８番目、２７１番目、３５２番目、３５７番目、３６５番目、４６３番目、４６９番目、４７３番目、５３５番目、５４４番目、又は５７１番目のシステイン残基が挙げられる。なお、このヘマグルチニンーノイラミニダーゼタンパク質の膜貫通ドメインとして、３８～６０番目のアミノ酸配列が推定されている。
　生理活性分子とは特に限定はされないが、例えば酵素、抗体結合ドメイン、ビオチン、蛍光色素、発光色素、アビジン化合物等が挙げられる。上述のように、本発明に係る自己組織化能を有するタンパク質のシステイン残基は複数存在し、この中の少なくとも１つのシステイン残基を介して生理活性分子が結合することから、上述の酵素、抗体結合ドメイン、ビオチン、蛍光色素、発光色素、アビジン化合物等のうち、１種のみならず２種以上が組み合わさって別個のシステイン残基を介して結合していてもよい。
　具体的な酵素とは、通常、免疫学的測定の分野で酵素であれば、特に限定はされず、例えばペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等が挙げられる。
　具体的な抗体結合ドメインは、特に限定はされないが、抗体のＦｃドメインに結合するドメインであることが好ましい。具体的な抗体結合ドメインは、特に限定はされないが、例えばプロテインＡに含まれる抗体結合ドメイン（配列番号３）、プロテインＧに含まれる抗体結合ドメイン（配列番号４）、及びプロテインＬに含まれる抗体結合ドメイン（配列番号５）等が挙げられる。
　生理活性分子に包含される抗体結合ドメインとは、このような抗体結合ドメインが同一又は異なって複数含まれた態様であってもよい。このような態様として、例えば、Ｎ末端から順に、プロテインＡに含まれる抗体結合ドメイン、プロテインＧに含まれる抗体結合ドメイン、及びプロテインＧに含まれる抗体結合ドメインの順に配置されたアミノ酸配列からなる抗体結合ドメイン（配列番号６）、Ｎ末端から順にプロテインＡに含まれる抗体結合ドメインをタンデムで含むＺＺタグ等が挙げられる。
　抗体結合ドメインに結合する抗体は、特に限定はされず、その構造もイムノグロブリンに限定はされず、少なくとも抗原を認識する機能を発揮する構造を有する分子であればよく、例えば多価化抗体などといった積み木構造を有する抗体であってもよい。
　また、抗体の由来も特に限定されず、抗体産生に適した種々の動物に由来する抗体を用いることができる。
　例えば、抗体がイムノグロブリンである場合、そのサブタイプは特に限定はされない。また、イムノグロブリンがＩｇＧ、ＩｇＡ等である場合のサブクラスも特に限定はされない。
　上述の生理活性分子が抗体結合ドメインである場合、斯かるドメインと上述の抗体が結合した態様も、本発明に係るウイルス様粒子に包含される。なお、抗体結合ドメインと抗体の結合は、更に公知の架橋剤を用いて強固な結合（本明細書中で、不可逆的な結合と呼ぶことがある。）とされていてもよい。公知の架橋剤として、ＢＳ３等が挙げられる。
　ビオチン、蛍光色素、及び発光色素は通常、免疫学的測定の分野で用いられるものであれば、特に限定はされず公知のものを適宜用いればよい。
　具体的なアビジン化合物は、特に限定はされないが、例えば、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、ＡＶＲタンパク質、ブラダビジン（Ｂｒａｄａｖｉｄｉｎ）、リザビジン（Ｒｈｉｚａｖｉｄｉｎ）、タマビジン等が挙げられる。
　本発明に係るウイルス様粒子は、公知の方法を用いて自己組織化能を有するタンパク質を含むウイルス様粒子を入手し、これに対してシステイン残基を介して修飾するキット等を用いて上述の生理活性分子を結合させればよい。また、結合させた後に、適宜ゲル濾過等の公知の手段を採用して、精製工程に供してもよい。
　なお、生理活性分子を結合させた後に、公知の架橋剤を公知の方法で使用して、ウイルス様粒子に含まれる自己組織化能を有するタンパク質のシステイン残基と、生理活性分子との結合を強固にする処理が行われていてもよい。公知の架橋剤として、ＢＳ３等が挙げられる。
　本発明に係るウイルス様粒子には、上述のシステイン残基と結合する生理活性分子の他に、更に生理活性分子（以後明細書中で第２の生理活性分子と呼ぶことがある。）が結合する自己組織化能を有するタンパク質を有する態様ウイルス様粒子も包含される。
　このような態様のウイルス様粒子として、ウイルス様粒子の脂質二重膜を構成する脂質成分と第２の生理活性分子が結合する態様、上述の自己組織化能を有するタンパク質のシステイン残基以外のアミノ酸残基又は糖鎖を介して第２の生理活性分子が結合する態様、上記自己組織化能を有するタンパク質の特定の部位に第２の生理活性分子が組み込まれた態様が挙げられる。
　上述の第２の生理活性分子は、上述のシステイン残基を介して修飾される生理活性分子と同様とすることができる。
　例えば、第２の生理活性分子として抗体結合ドメインが上述の自己組織化能を有するタンパク質のＮ末端領域に組み込まれた態様として、配列番号２に示すアミノ酸配列からなる自己組織化能を有するタンパク質を有するウイルス様粒子が挙げられる。すなわち、このような自己組織化能を有するタンパク質は、斯かるタンパク質のＮ末端領域及び斯かるタンパク質の少なくとも１つのシステイン残基のチオール基を介して生理活性分子として抗体結合ドメインを有していてもよい。
　例えば、上述の自己組織化能を有するタンパク質の糖鎖に第２の生理活性分子が結合する態様であれば、シアル酸等の糖鎖の末端糖残基をアルデヒド化する処理を施して得ることができる。
　自己組織化能を有するタンパク質と、第２の生理活性分子の結合は、上述のように公知の架橋剤を使用して、結合を強固にする処理が行われていてもよい。公知の架橋剤として、ＢＳ３等が挙げられる。
　また、第２の生理活性分子が抗体結合ドメインである場合、斯かるドメインに抗体が結合した態様も、本発明に係るウイルス様粒子に包含される。必要に応じて当該結合を強固にするための架橋処理が施された態様も、本発明に係るウイルス様粒子に包含される。公知の架橋剤として、ＢＳ３等が挙げられる。
　本発明に係るウイルス様粒子の好ましい態様は、自己組織化能を有するタンパク質を含み、（１）当該タンパク質のＮ末端領域に抗体結合ドメインを有し、且つ当該タンパク質の上述する特定のシステイン残基を介して酵素が結合した態様（下記実施例の〔製造例３〕における「ＳＨ－ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺ」及び〔製造例４〕における「ＳＨ－ＡＬＰ標識ＢＮＣ－ＺＺ」がこれに相当する）；（２）当該タンパク質のＮ末端領域に抗体結合ドメインを有し、且つ当該タンパク質の上述する特定のシステイン残基を介して抗体結合ドメインが結合した態様（下記実施例の〔製造例５〕における「ＡＧＧ－ＢＮＣ－ＺＺ」がこれに対応する。）；（３）当該タンパク質のＮ末端領域に抗体結合ドメインを有し、当該タンパク質の上述する特定のシステイン残基を介して抗体結合ドメインが結合し、且つ当該タンパク質のＮ末端又はリジン残基を介して酵素が結合する態様（下記実施例の〔製造例６〕における「ＨＲＰ標識ＡＧＧ－ＢＮＣ－ＺＺ」がこれに対応する。）；（４）当該タンパク質の上述する特定のシステイン残基を介してアビジン化合物が結合する態様（下記実施例の〔製造例８〕における「ＢＮＣ－ＳＡ」がこれに対応する。）；（５）当該タンパク質の上述する特定のシステイン残基を介してアビジン化合物が結合し、且つ当該タンパク質のリジン残基を介して酵素が結合する態様（下記実施例の〔製造例８〕における「ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＳＡ」がこれに対応する。）；（６）当該タンパク質の上述する特定のシステイン残基を介して酵素が結合する態様（下記実施例の〔製造例９〕における「ＨＲＰ標識ＢＮＣ－Ｌ」がこれに対応する。）；（７）当該タンパク質の糖鎖を介して抗体結合ドメインが結合し、且つ当該タンパク質の上述する特定のシステイン残基を介して酵素が結合する態様（下記実施例の〔製造例１０〕における「ＳＨ－ＨＲＰ標識ＢＮＣ－（糖鎖）ーＡＧＧ」がこれに対応する。）；（８）当該タンパク質の上述する特定のシステイン残基を介して酵素が結合する態様（下記実施例の〔製造例１１：ＨＲＰ標識ＨＶＪ－Ｅ〕がこれに対応する。）等が挙げられる。
　本明細書において定義する免疫学的測定法とは、抗体による抗原ー抗体結合作用を測定原理として採用する測定方法であれば、特に限定はされないが、例えば、ウェスタンブロッティング法、ＥＬＩＳＡ法、イムノクロマト法、免疫染色法、ＥＩＡ法、ＦＩＡ法、及びこれらを基にした各種変法等が挙げられる。
＜ブロッキング剤＞
　本発明に係るブロッキング剤は、上述の本発明に係るウイルス様粒子を用いた免疫学的測定法に用いられる。斯かるブロッキング剤は、上述の免疫学的測定において得られるデータのバックグラウンドの低下及び／又は検出シグナルを増感させる作用を発揮し、Ｓ／Ｎ比を顕著に上昇させることが可能となる。
　このような効果は得られるデータでのみ評価されるものではなく、例えば免疫学的測定法において汎用される実験器具への上述のウイルス様粒子の吸着抑制を確認することによっても評価される。
　ウイルス様粒子及び免疫学的測定法は、上記＜ウイルス様粒子＞にて詳述した通りとすることができる。
　本発明に係るブロッキング剤は、ヒドロキシアルキルセルロース、ポリビニルアルコール、エチレンオキサイド／プロピレンオキサイド共重合体、２－メタクリロイルオキシエチルホスホコリンで構成される共重合体、又はこれらのうちの２種以上を含むものである。
　ヒドロキシアルキルセルロースとは、特に限定はされることはないが、炭素数が１～４程度のアルキル基を有することが好ましい。例えばヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルエチルセルロース、ヒドロキシエチルエチルセルロース等が挙げられ、これら中でもヒドロキシプロピルメチルセルロースが好ましい。
　本発明に係るブロッキング剤に含まれるヒドロキシアルキルセルロースは、上述の化合物を２種以上組み合わせたものであってもよく、具体的な入手方法としては、市場からの購入、公知の方法を用いた製造等が挙げられる。
　ポリビニルアルコールとは、ビニルアルコールをモノマー単位とするポリマーであればよい。ポリビニルアルコールの重合度は特に限定はされないが、通常２００～５０００程度が好ましく、より好ましくは５００～２０００程度である。
　また、通常用いられるポリビニルアルコールはポリ酢酸ビニルを鹸化して得られるものであることが多いため、上述のように酢酸ビニルをモノマー単位として有していてもよい。このような観点に基づき、上述のポリビニルアルコールの鹸化度（モル％）は、通常８０～９８程度とすればよく、好ましくは８５～９８程度である。
　本発明に係るブロッキング剤に含まれるポリビニルアルコールは、上述の化合物を２種以上組み合わせたものであってもよく、具体的な入手方法としては、市場からの購入、公知の方法を用いた製造等が挙げられる。
　エチレンオキサイド／プロピレンオキサイド共重合体とは、エチレンオキサイドとプロピレンオキサイドをモノマー単位とする共重合体であればよく、特に限定はされないが、例えばプルロニック（登録商標）又はその同等品であることが好ましい。
　より好ましいエチレンオキサイド／プロピレンオキサイド共重合体としては、プルロニックＬ３１、プルロニックＬ３５、プルロニックＬ６４、プルロニックＰ９４、プルロニックＦ６８、プルロニックＦ８７、プルロニックＦ－１２７、プルロニックＰ－１０５等（以上、ＢＡＳＦ社商標）が挙げられ、これらの同等品としてポロキサマー（ＩＣＩ社商標）が挙げられる。これら中でも、プルロニックＦ－１２７又はプルロニックＰ－１０５、その同等品等が最も好ましい。
　本発明に係るブロッキング剤に含まれるエチレンオキサイド／プロピレンオキサイド共重合体は、上述の化合物を２種以上組み合わせたものであってもよく、具体的な入手方法としては、市場（ＢＳＡＦ社やＩＣＩ社など）からの購入、公知の方法を用いた製造等が挙げられる。
　２－メタクリロイルオキシエチルホスホコリンで構成される共重合体とは、２－メタクリロイルオキシエチルホスホコリン及びその他のモノマー成分を構成単位とする共重合体であればよく、特に限定はされない。
　より具体的には、上述の２－メタクリロイルオキシエチルホスホコリンで構成される共重合体としては、リピジュア（登録商標）、バイオリピジュア（登録商標）、これらの同等品等が挙げられる。
　好ましい２－メタクリロイルオキシエチルホスホコリンで構成される共重合体としては、例えば、リピジュアＢＬ－４０５、リピジュアＢＬ－２０３、リピジュアＢＬ－１００２、リピジュアＢＬ－１０３、リピジュアＢＬ－２０６、リピジュアＢＬ－８０２、これらの同等品等が挙げられ、特に限定はされないが、中でも、リピジュアＢＬ－２０６、リピジュアＢＬ－８０２、これらの同等品等が最も好ましい（なお、本文中では、例えばリピジュアＢＬ－８０２はリピジュア８０２と簡略記載した）。
　本発明に係るブロッキング剤に含まれる２－メタクリロイルオキシエチルホスホコリンで構成される共重合体は、上述の化合物を２種以上組み合わせたものであってもよく、具体的な入手方法としては、市場（日油株式会社）からの購入、公知の方法を用いた製造等が挙げられる。
　本発明に係るブロッキング剤に含まれるヒドロキシアルキルセルロース、ポリビニルアルコール、エチレンオキサイド／プロピレンオキサイド共重合体、又は２－メタクリロイルオキシエチルホスホコリンで構成される共重合体の含有量は、特に限定はされないが、ブロッキング剤１００重量部に対するヒドロキシアルキルセルロース、ポリビニルアルコール、エチレンオキサイド／プロピレンオキサイド共重合体及び２－メタクリロイルオキシエチルホスホコリンで構成される共重合体の総重量が、０．００１重量部～１００重量部程度とすればよい。すなわち、ヒドロキシアルキルセルロース、ポリビニルアルコール、エチレンオキサイド／プロピレンオキサイド共重合体、又は２－メタクリロイルオキシエチルホスホコリンで構成される共重合体そのものを本発明に係るブロッキング剤としてもよい。
　本発明に係るブロッキング剤には、上述の効果を妨げない範囲に限り、免疫学的測定法にて用いられる、上記ヒドロキシアルキルセルロース、ポリビニルアルコール、エチレンオキサイド／プロピレンオキサイド共重合体、２－メタクリロイルオキシエチルホスホコリンで構成される共重合体以外の成分が含まれていてもよい。具体的な他の成分とは、特に限定はされないが、例えば、防腐剤、ｐＨ調整剤、塩、界面活性剤、安定化剤等が挙げられる。また、本発明に係るブロッキング剤は、予め免疫学的測定法にて汎用される、水、緩衝液等に含まれた態様にて提供されてもよく、固体状のものとして提供され、これを上述の水、緩衝液等に溶解させて用時調製して用いることのできる態様で提供されてもよい。
　本発明に係るブロッキング剤の使用量は特に限定はされないが、例えば免疫学的測定において用いる緩衝液等の溶液１００容量部に対して、通常は０．０００１～５容量部程度とすればよい。
＜免疫学的測定用キット＞
　本発明に係る免疫学的測定用キットとは、上述の本発明に係るウイルス様粒子と上述の本発明に係るブロッキング剤とを含む。
　ウイルス様粒子及びブロッキング剤は、上記＜ブロッキング剤＞にて詳述した通りである。免疫学的測定とは、上記＜ウイルス様粒子＞にて詳述した免疫学的測定法と同様とすることができる。
　本発明に係る免疫学的測定用キットには、更に、反応容器、発色・発光基質、反応溶液、標準物質、ディスポーザブル器具、マニュアル等を含んでいてもよい。
　なお、本発明に係る免疫学的測定用キットにおいて、上述の本発明に係るウイルス様粒子と、上述の本発明に係るブロッキング剤とは、それぞれ別の容器（パック、ボトル等）に充填されていてもよく、同一の容器に充填されていてもよい。また、ウイルス様粒子及びブロッキング剤は、水、緩衝液等に含まれる態様で提供されていてもよく、特にブロッキング剤は粉末状で提供され、免疫学的測定を行う際に水、緩衝液等で適宜用時調製（希釈）して用いられる態様で提供されてもよい。
　以下に、本発明をより詳細に説明するための実施例を示す。ただし、本願発明が下記に示す実施例に限定されないのは言うまでもない。
　〔製造例１：ＢＮＣ－Ｌの調製〕
　ＢＮＣ－Ｌとは配列番号１に示すアミノ酸配列からなる自己組織化能を有するＨＢｓＡｇタンパク質を含むウイルス様粒子であり、特許第４０８５２３１号又は特許第４９３６２７２号に記載されている方法で調製した。
　具体的には、特許第４０８５２３１号で調製したＢＮＣ－Ｌを発現する酵母を培養し、ガラスビーズを利用して培養菌体を破砕して得られた菌体破砕液を７０℃にて２０分間の熱処理に供した。熱処理後に遠心工程に供し、得られた上清を回収した後に、硫酸セルロファインカラム及びゲル濾過カラムを用いて精製し、タンパク質濃度が０．２ｍｇ／ｍＬ以上となるように濃縮して、ＢＮＣ－Ｌを得た。
　なお、配列番号１に示すアミノ酸配列からなる自己組織化能を有するタンパク質を含むＢＮＣ－Ｌは粒子を形成し、粒子当たり当該タンパク質が１１０分子程度含まれることが報告されている（Yamada et al., Vaccine 19, 3154-3163, 2001）。
　〔製造例２：ＢＮＣ－ＺＺの調製〕
　ＢＮＣ－ＺＺとは、ＢＮＣ－Ｌ〔製造例１〕に含まれるＨＢｓＡｇタンパク質のＮ末端に、プロテインＡの２つの抗体結合ドメイン（Ｚドメイン）をタンデムで有する、配列番号２にて示される自己組織化能を有するタンパク質を含むウイルス様粒子であって、特許第４２１２９２１号及び特許第４９３６２７２号に記載されている方法で調製した。
　具体的には、特許第４２１２９２１号で調製したＢＮＣ－ＺＺを発現する酵母を培養し、ガラスビーズを利用して培養菌体を破砕して得られた菌体破砕液を７０℃にて２０分間の熱処理に供した。熱処理後に遠心工程に供し、得られた上清を回収した後に、Porcine IgGカラム及びゲル濾過カラムを用いて精製し、タンパク質濃度が０．２ｍｇ／ｍＬ以上となるように濃縮して、ＢＮＣ－ＺＺを得た。
　なお、配列番号２に示すアミノ酸配列からなる自己組織化能を有するタンパク質は上記のＢＮＣ－Ｌの類推からＢＮＣ－ＺＺ粒子当たり１１０分子程度含まれると推定される。また、ＢＮＣ－ＺＺは、抗体と混合すると粒子の抗体結合ドメインと抗体のＦｃドメインとの結合による抗体の抗原結合能を保持した複合体を形成する。ＢＮＣ－ＺＺの酵素標識体も同様の複合体を形成する。以下、当該複合体を混合複合体と呼ぶことがある。
　〔製造例３：ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺの調製〕
　ＢＮＣ-ＺＺ〔製造例２〕に対して、ＳＨ基を介してＨＲＰ標識するためのキット及びＮＨ２基を介してＨＲＰ標識するためのキット（それぞれ、Peroxidase Labeling Kit-SH及びPeroxidase Labeling Kit-NH2；共に同仁化学）を利用し、これらのマニュアルに従ってＨＲＰ標識後、ゲル濾過カラムにより精製し、２種類のＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺを得た。
　なお、ＳＨ基を介したＨＲＰ標識ではＢＮＣ－ＺＺ粒子当たり、１１０分子程度のＨＲＰ分子が含まれることを確認した。すなわち、上述の配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質中の少なくとも１つのシステイン残基のＳＨ基に１分子程度のＨＲＰ分子が架橋されていることが示唆される。
　また、ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺの作製時に用いたＢＮＣ－ＺＺはその粒子形状に影響を与えない緩和な条件にてＨＲＰ標識処理を施した。実際、粒子径を動的光散乱法にて測定した結果、標識前54nmに対し、標識後は58nmであり、大きな差は認められなかった。したがって、ＨＲＰ標識されるＮＨ２基及びＳＨ基は、共に粒子表面に露出したアミノ酸残基に由来するＮＨ２基及びＳＨ基であることが明らかである。
　ＢＮＣ－ＺＺに含まれるタンパク質のアミノ酸配列を示す配列番号２を基にすれば、例えばＮＨ２基であれば、Ｎ末端のＮＨ２基、若しくは１番目、４３番目、６７番目、７０番目、９８番目、１１２番目、１１３番目、１２１番目、１２５番目、１２８番目、１５６番目、１７０番目、１７１番目、１７９番目、３０８番目、又は３２７番目の何れかのリジン残基側鎖のＮＨ２基を介してＨＲＰ標識されていることが示唆される。
　一方で、ＳＨ基であれば、例えば、２９３番目、３０７番目、３１０番目、３２３番目、３２４番目、３２５番目、３３３番目、又は３３５番目の何れかのシステイン残基のＳＨ基を介してＨＲＰ標識されていることが示唆される。
　実施例１
　上記製造例３に示す２種類の方法にて調製したＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺのＨＲＰ活性を測定する実験を行った。ＨＲＰの基質としてSAT-blue溶液（同仁化学）を用い、４９２ｎｍの吸光度（Abs 492nm）を測定し、また２８０ｎｍの吸光度を測定して算出したタンパク質量を用いて比活性を求めた。
　その結果、ＮＨ２基を介してＨＲＰ標識したＢＮＣ－ＺＺ（以後これをＮＨ２－ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺと呼ぶことがある。）の比活性は０．３５１ｕｎｉｔ／μｇ（Ｕ／μｇ）であり、一方でＳＨ基を介してＨＲＰ標識したＢＮＣ－ＺＺ（以後これをＳＨ－ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺと呼ぶことがある。）の比活性は０．８４４Ｕ／μｇであった。すなわち、ＮＨ２－ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺはＳＨ－ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺの約４１％の活性しか示さなかった。なお、ｕｎｉｔは基質であるSAT-blueを上記の条件で用いて測定した時のAbs 492nm値の特異的な上昇値を示す。
　この結果は、ＨＲＰというタンパク質分子が標識できるレベルでアクセス可能なＮＨ２基はＳＨ基と比べると少ないことを示唆している。また、より多くのＨＲＰ分子がＳＨ基を介しては標識可能なことから、この標識法の方が、ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺをより高感度の抗体検出プローブとして利用できる可能性を持つことが明らかとなった。
　〔製造例４：ＡＬＰ標識ＢＮＣ－ＺＺの調製〕
　ＢＮＣ-ＺＺ〔製造例２〕に対してＳＨ基を介してＡＬＰ標識するためのキット及びＮＨ２基を介してＡＬＰ標識するためのキット（それぞれ、Alkaline Phosphatase Labeling Kit-SH及びAlkaline Phosphatase Labeling Kit-NH2；共に同仁化学）を利用し、これらのマニュアルに従ってＡＬＰ標識後、ゲル濾過カラムにより精製し、２種類のＡＬＰ標識ＢＮＣ－ＺＺを得た。
　また、製造例３にて作製したＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺと同様に、ＡＬＰ標識ＢＮＣ－ＺＺの作製時用いたＢＮＣ－ＺＺは、その粒子形状が破壊されないような条件にてＡＬＰ標識処理を施した。
　従って、それぞれのＡＬＰ標識ＢＮＣ－ＺＺにおいても、上述のＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺと同様のアミノ酸残基におけるＮＨ２基又はＳＨ基にＡＬＰ標識されていることが示唆される。
　実施例２
　上記製造例４に示す２種類の方法にて調製したＡＬＰ標識ＢＮＣ－ＺＺのＡＬＰ活性を測定する実験を行った。ＡＬＰの基質としてｐＮＰＰ（Sigma Fast p-nitro phenyl phosphate tablets）を用い、４０５ｎｍの吸光度（Abs 405nm）を測定し、また、２８０ｎｍの吸光度を測定して算出したタンパク質量を用いて比活性を求めた。
　その結果、ＮＨ２基を介してＡＬＰ標識したＢＮＣ－ＺＺ（以後これをＮＨ２－ＡＬＰ標識ＢＮＣ－ＺＺと呼ぶことがある。）のＡＬＰ酵素の比活性は３．５６Ｕ／μｇであり、一方で、ＳＨ基を介してＡＬＰ標識したＢＮＣ－ＺＺ（以後これをＳＨ－ＡＬＰ標識ＢＮＣ－ＺＺと呼ぶことがある。）は５．６１Ｕ／μｇであった。すなわち、ＮＨ２－ＡＬＰ標識ＢＮＣ－ＺＺはＳＨ－ＡＬＰ標識ＢＮＣ－ＺＺの約６０％の活性しか示さなかった。なお、ｕｎｉｔは基質であるｐＮＰＰを上記の条件で反応させた時のAbs 405nm値の特異的な上昇値を示す。
　この結果、より多くのＡＬＰ分子がＳＨ基を介して標識可能なことがわかり、本標識法の方が、ＡＬＰ標識ＢＮＣ－ＺＺをより高感度の抗体検出プローブとして利用できる可能性を持つことが明らかとなった。
　〔製造例５：ＡＧＧ－ＢＮＣ－ＺＺの調製〕
　上記Ｚドメインを有するプロテインＡ由来の結合ドメイン１個とプロテインＧ由来の結合ドメイン２個を含む配列番号６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質を大腸菌で調製した（以下、これをＡＧＧと呼ぶことがある）。ＡＧＧタンパク質溶液にＥＭＣＳ（同仁化学）を添加して、ＡＧＧのアミノ基にマレイミド基を導入した。
　ＢＮＣ－ＺＺ〔製造例２〕を、ＴＣＥＰ（Thermo Scientific）を用いて還元処理し、還元処理されたＢＮＣ－ＺＺとマレイミド基が導入されたＡＧＧとをインキュベートすることで架橋反応を行い、ＡＧＧ－ＢＮＣ－ＺＺを得た。すなわち、ＡＧＧ－ＢＮＣ－ＺＺとは上記配列番号２にて示されるアミノ酸配列からなるタンパク質を含むウイルス様粒子であって、当該タンパク質中のシステイン残基を介してＡＧＧが結合した粒子である。
〔製造例６：ＨＲＰ標識ＡＧＧ－ＢＮＣ－ＺＺの調製〕
　Peroxidase labeling Kit-NH2を用い、そのマニュアルに従ってＡＧＧ－ＢＮＣ－ＺＺ〔製造例５〕にＨＲＰを標識し、ＨＲＰ標識ＡＧＧ－ＢＮＣ－ＺＺを得た。
　実施例３
　ＨＲＰ標識ＡＧＧ－ＢＮＣ－ＺＺ〔製造例６〕のＨＲＰ酵素活性を、ＳＨ―ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺ〔製造例３〕の酵素活性と比較検討するための実験を行った。両者の一定量を取り、そこへＨＲＰの基質であるＴＭＢ溶液（One-Step TMB Ultra、Thermo Scientific）を添加し、Abs 450nmを測定した。
　その結果、ＨＲＰ標識ＡＧＧ－ＢＮＣ－ＺＺのＨＲＰ比活性はＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺの約１／３であることが分かった。ＢＮＣ－ＺＺをＮＨ２基又はＳＨ経由でＨＲＰ標識し、ＨＲＰ活性を検討した実施例２の結果から判断し、ＡＧＧ－ＢＮＣ－ＺＺもＢＮＣ－ＺＺとほぼ同様の効率でＮＨ２基を介したＨＲＰ標識が可能であることが明らかとなった。
　〔製造例７：ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺ／ウサギ由来抗マウスＩｇＧ抗体複合体の調製〕
　製造例２に記載したようにＢＮＣ－ＺＺと抗体を混合すると混合複合体が形成される。この混合複合体は抗体のＦｃ領域とＢＮＣ－ＺＺの抗体結合部位との結合が可逆的なため複数の抗体存在下では、結合した抗体の入れ替わりがおこる。そこでこの結合を不可逆的な結合にすれば、結合した抗体の持つ結合能をＢＮＣ－ＺＺに付与できると考えられる。そこで抗体結合ドメインと抗体との結合を架橋したものを以下の様に製造した。即ち、ＳＨ―ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺ〔製造例３〕とウサギ由来抗マウスＩｇＧ抗体(Bethyl)を混合して両者の複合体を形成させ、更に架橋剤であるＢＳ３（同仁化学）をそれぞれ終濃度で0、50、200、400、又は1000μＭとなる様に加えた。次いで、Protein A Sepharose樹脂（GE Healthcare）用いて余剰のウサギ由来抗マウスＩｇＧ抗体を除去し、ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺ／ウサギ由来抗マウスＩｇＧ抗体複合体を得た。
　実施例４
　ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺ／ウサギ由来抗マウスＩｇＧ抗体複合体〔製造例７〕のＨＲＰ活性を測定する実験を行った。ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺ／抗体複合体を用い、実施例３に記載する方法でＨＲＰ活性測定を行った。結果を表１に示す。何れの架橋剤濃度を用いた場合でもAbs 450nmはほぼ同じ値を示し、ＨＲＰの活性が殆ど変化しないことを示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　実施例５
　ＳＨ―ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺ／抗体複合体に結合した抗体の結合様式を評価するために競合実験を行った。正常マウス血清からプロテインA/Gセファロース（GE Healthcare）で精製して得た、抗原特性を持たないＩｇＧ（以下、コントロールマウス由来ＩｇＧと呼ぶことがある。）をＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに各種濃度で添加して固相化した。その後、k-Block-e（ビークル社製）を用いてブロッキングした。
　ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺ／ウサギ由来抗マウスＩｇＧ抗体複合体〔製造例７〕と、コントロールウサギ由来ＩｇＧ（上記と同様に調製、自社製）を混合してインキュベーションした後、その混合物を固相化済みの各ウェルに添加し反応させ、洗浄後、実施例３と同様の方法でＡｂｓ４５０ｎｍを測定した。その結果を図１に示す。
　ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺと抗マウスＩｇＧウサギ由来抗体複合体であって、用いた架橋剤濃度が０Ｍのもの、すなわち架橋処理を行わない場合、コントロールウサギ由来ＩｇＧの共存下では、非共存下に比べ、固相化されたマウス由来ＩｇＧに対する反応は全ての濃度範囲で７０％まで低下した。ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺ／ウサギ由来抗マウスＩｇＧ抗体複合体に５０μＭのＢＳ３を用いて架橋処理を施した場合、コントロールウサギ由来ＩｇＧ存在下では、固相化されたマウス由来ＩｇＧに対して若干の反応の低下がみられ、可逆的な結合が残っていることを示す。そして２００μＭの濃度のＢＳ３を用いて架橋処理を施した複合体では、コントロールウサギ由来ＩｇＧを添加してもマウス由来ＩｇＧに対する反応には全く変化がなかった。即ち、２００μＭのＢＳ３で架橋させたＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺ／ウサギ由来抗マウスＩｇＧ抗体複合体では、それに結合する抗体の入れ替わりが起こらず、不可逆的な結合による複合体が出来ていることを示す。
　以上のことから、２００μＭ以上の濃度のＢＳ３で架橋させたＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺ／ウサギ由来抗マウスＩｇＧ抗体複合体では不可逆的な結合による複合体ができることが明らかとなった。
　実施例６
　ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺ／ウサギ由来抗マウスＩｇＧ抗体複合体〔製造例７〕の残存抗体結合活性及び可逆的抗体結合活性を評価する実験を行った。上記製造例７に示す各種濃度の架橋剤を用いて処理したＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺ／ウサギ由来抗マウスＩｇＧ抗体複合体の製造法において、ウサギ由来抗マウスＩｇＧ抗体に換えて、コントロールウサギ由来ＩｇＧとの複合体を作製した。なお、使用したＢＳ３の濃度は、０μＭ、５０μＭ、及び２００μＭである。これら複合体をＥＬＩＳＡ用プレートの各ウェルに加えて固相化し、更にk-Block-e（ビークル社製）を用いてブロッキングした。次いで、各ウェルに1/10000、1/5000、及び1/1000に希釈したＡＬＰ標識ウサギ由来抗マウスＩｇＧ抗体（Invitrogen）を添加し反応させ、洗浄後、実施例２と同様の方法でAbs405nmを測定した。結果を図２に示す。
　ＢＮＣ－ＺＺやＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺではＡＬＰ標識したウサギ抗体は添加量に依存してＡＬＰ酵素活性が増大し、1/1000希釈を添加時では非添加時に比べ４倍以上になった。このことはＡＬＰ標識ウサギ抗体がＢＮＣ－ＺＺやＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺの抗体結合部位に結合していることを示している。一方、ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺとコントロールウサギ由来ＩｇＧを予め混合しただけで形成させた混合複合体（図中のＺＺ－ＨＲＰ　０）や、ＢＳ３の５０μＭを加えて架橋させた複合体（図中のＺＺ－ＨＲＰ　５０）では1/1000希釈添加時で、非添加時に比べ前者で１７０％、後者で１３７％のＡＬＰ活性が見られた。これらの複合体ではＡＬＰ標識ウサギ抗体が結合可能であることを示しており、その一方で、ＢＳ３の２００μＭで架橋させた複合体の場合（図中のＺＺ－ＨＲＰ　２００）、ＡＬＰ標識ウサギ抗体の結合は見られなかった。
　以上のことから、ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺと抗体の複合体の場合、ＢＳ３の２００μＭ以上の濃度で架橋させればＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺに残存する抗体結合活性は無く、可逆的な結合もないことを示している。
〔製造例８：ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＳＡ／抗マウスＩｇＧ抗体複合体の調製〕
　ＥＭＣＳを用いて、ストレプトアビジン（ＳＡ；Thermo Scientific社製）のアミノ基にマレイミド基（ＭＡＬ基）を導入した。次いで、ＢＮＣ－Ｌ〔製造例１〕と上記ＭＡＬ基が導入されたＳＡとインキュベートすることで、架橋反応を行い、ＳＡ標識ＢＮＣ－Ｌ（以下、ＢＮＣ－ＳＡと呼ぶことがある。）を得た。すなわち、ＢＮＣ－ＳＡとは配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質を含むウイルス様粒子であって、当該タンパク質のシステイン残基を介してＳＡが結合している粒子である。更に、得られたＢＮＣ－ＳＡにPeroxidase Labeling Kit- NH2を用いてＨＲＰを架橋させ、ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＳＡを得た。また、Biotin Labeling Kit-NH2（同仁化学）を利用してウサギ由来のビオチン化抗マウスＩｇＧ抗体を得た。そして上記ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＳＡとウサギ由来ビオチン化抗マウスＩｇＧ抗体をタンパク質量として等量混合してＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＳＡ／ウサギ由来抗マウスＩｇＧ抗体複合体を調製した。
　実施例７
　ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＳＡ／抗マウスＩｇＧ抗体複合体のＨＲＰ活性を測定する実験を行った。上記実施例１と同様の方法にてＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＳＡ／ウサギ由来抗マウスＩｇＧ抗体複合体〔製造例８〕のＨＲＰ活性を測定した。
　その結果、ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＳＡ／ウサギ由来抗マウスＩｇＧ抗体複合体のＨＲＰ活性は、対照のＳＨ－ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺの約１／８であることが分かった。実施例１の結果から、ＮＨ２－ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺのＨＲＰ活性は、ＳＨの約１／２．４であることから、ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＳＡ／ウサギ由来抗マウスＩｇＧ抗体のＨＲＰ活性は、ＮＨ２－ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺと比べると約１／３であると判断することができる。
　実施例８
　ＢＮＣ－ＺＺの容器への吸着とブロッキング剤の効果を検討するための実験を行った。ＢＮＣ－ＺＺ〔製造例２〕をＰＢＳに３００ｎｇ／ｍＬになる様に溶解した溶液をポリエチレン製マイクロチューブ中に分注し、そこに表２に示す各種ブロッキング剤を添加した。各チューブを密栓後、室温で４日間、容器を回転させながら放置した後、溶液中に残存するＢＮＣ－ＺＺ量を測定した。測定にはＢＮＣ－ＺＺの粒子表面のＰｒｅ－Ｓ１領域を測定するＥＬＩＳＡキット（HB Pre-S1 Antigen Quantitative ELISA Kit, Rapid、ビークル社製）を利用し、付属のマニュアルに従って測定した。結果を表２に示す。
　ＰＢＳのみの場合、溶液中には１．３％のＢＮＣ－ＺＺが残存し、殆どが容器に吸着されることが分かった。これに各種ブロッキング剤を添加すると何れも抑制効果を示したが、効果の高かったのはスキムミルク、ブロックエース（大日本製薬）、Pluronic F-127、Lipidure802であった。
　実施例９
　ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺの容器への吸着とブロッキング剤の効果を検討する実験を行った。表３に示す各種ブロッキング剤を含む終濃度３００ｎｇ／ｍＬのＳＨ－ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺ〔製造例３〕のＰＢＳ溶液を調製し、それぞれ表面処理なしのポリエチレン製チューブ、ＭＰＣ（2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine）処理したチューブ、及びガラスチューブに入れた。すべてのチューブを密栓し、回転させながら４℃で２日間放置し、溶液中に含まれるＨＲＰ活性を次の方法で測定した。即ち、２μｇ／ｍＬのブタＩｇＧをＥＬＩＳＡ用９６穴マイクロプレートの各ウェルへ添加して固相化した。次いで１％ブロックエースを添加しブロッキングした。ここへ上述の各種チューブ中で放置したＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺ溶液を各ウェルに添加し、固相化したブタＩｇＧへ結合させた。次いで、各ウェルにＴＭＢ溶液（1-Step TMB slow:Thermo Scientific）添加した後、Ａｂｓ４５０ｎｍ値をプレートリーダーにて測定した。各サンプルのＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺの残存率は、コントロールとして５００μｇ／ｍＬでＭＰＣ処理チューブに同様に保存していたものを３００ｎｇ／ｍＬに希釈して得られたもののAbs４５０ｎｍ値を基に算出した。表３にその結果を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　ブロッキング剤を含まない溶液（表中のＰＢＳ）を無処理のプラスチックチューブへ入れたものでは２日で７８％、ガラスチューブへは４８％の吸着が起こった。ＭＰＣ処理チューブでは吸着は抑え得られたが１０％の吸着が残った。ここへ各種ブロッキング成分を添加すると何れも抑制効果が見られたが、良好な結果を示したものはＢＳＡ、ＨＰＭＣ、Pluronic F-127、Pluronic P-105であった。
　実施例１０
　ＰＶＤＦ膜に対するＢＮＣ－ＺＺの吸着とブロッキング剤の効果を検討するための実験を行った。ＰＶＤＦ膜を小片に切り分け、表４に示す各種濃度のブロッキング剤を含有するＰＢＳ中に室温で１時間浸すことでブロッキング処理を行い、ＰＢＳ－Ｔにて３回洗浄することで膜に結合していないブロッキング剤を除去した。次いで、表４に示す各種濃度のブロッキング剤を含有するＰＢＳ－Ｔに、ＢＮＣ－ＺＺ〔製造例２〕を３００ｎｇ／ｍＬの濃度で溶解した反応溶液を上記ブロッキング済のＰＶＤＦ膜と室温で１時間反応させ、その後、ＰＢＳ－Ｔに溶解したＨＲＰ標識ウサギ抗体と室温で２０分間反応させた。
　反応終了後、ＰＢＳ－Ｔにて５回洗浄し、ＨＲＰの発光用基質であるECL Prime（GE Healthcare）と反応させ、発光検出装置（ChemiDoc XRS, Bio-Rad）を利用して発光を２０分間露光することで測定した。
　なお、コントロールとしてブロッキング成分を含まないＰＢＳ－Ｔで同じ処理を行ったものを利用した。結果を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　ブロッキング剤を含有しないＰＢＳのみで処理したＰＶＤＦ膜は、全体が黒くなりＰＶＤＦ膜にＢＮＣ－ＺＺが大量に吸着したことが明らかであった。
　一方、各種ブロッキング剤を用いてＰＶＤＦ膜にブロッキング処理を施し、更に反応させるＢＮＣ－ＺＺ溶液中に同じブロッキング剤を含有させた場合には、何れのブロッキング剤でもＰＶＤＦ膜へのＢＮＣ－ＺＺの吸着は殆ど認められなかった。
　以上のことから、本実験で利用した全てのブロッキング剤は、ＰＶＤＦ膜のブロッキング処理と反応液中に添加して行うブロッキング処理の両方に用いた場合、ブロッキング効果を発揮することが明らかとなった。
　実施例１１
　ＰＶＤＦ膜へのＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺの吸着とブロッキング剤の効果を検討するための実験を行った。ＴＢＳに、５％のスキムミルク、１０％のスキムミルク＋３％の魚ゼラチン（フナコシ）、４％のブロックエース、５％の牛血清アルブミンとなる様に溶解した溶液（メンブレンブロッキング液）を調製した。小片に切り分けたＰＶＤＦ膜を、上記メンブレンブロッキング液を用いてブロッキング処理に供した。メンブレンブロッキング処理のコントロールは未処理のＰＶＤＦ膜とした。
　次いで、ＳＨ－ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺ〔製造例３〕を含むＴＢＳ－Ｔを調製し、さらに１％のスキムミルク、１％のブロックエース、１％のＢＳＡ、又は２％のゼラチンを添加して、反応ブロッキング液を調製し、上記ＰＶＤＦ膜に反応ブロッキング液を添加した。コントロールとしてＳＨ－ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺを含むＴＢＳ－Ｔを用いた。添加後、適宜洗浄したＰＶＤＦ膜を、実施例１０と同様の方法にて検出した。結果を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　ＰＶＤＦ膜をブロッキング処理せず、ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺを含むＴＢＳ－Ｔを添加した場合には、像全体が黒くなり、そのシグナル強度のスコアは＋＋＋＋＋であった。これは、ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺが大量にＰＶＤＦ膜に吸着したことを示す。一方で、各種メンブレンブロッキング液で処理したＰＶＤＦ膜にＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺを含むＴＢＳ－Ｔを添加した場合、ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺのＰＶＤＦ膜への吸着は抑制されたが、依然として明らかな吸着反応が見られた。また、ＰＶＤＦ膜をメンブレンブロッキング液で処理し、更に各ブロッキング液を添加した場合には、ＢＳＡを含む反応ブロッキング液を除き、コントロールと比べ、ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺのＰＶＤＦ膜への吸着が強く抑制された。ＢＳＡを含む反応ブロッキング液では、他の反応ブロッキング液とは異なり、ＰＶＤＦ膜のブロッキング処理の種類にかかわらず、ＰＶＤＦ膜から得られるシグナル強度の程度が高かった。
　以上の結果は、ＰＶＤＦ膜へのブロッキング処理が、ＰＶＤＦ膜へのＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺの吸着抑制に重要であり、さらに反応ブロッキング液の種類がそれ以上に重要であることを示す。ＰＶＤＦ膜へのブロッキング液は何れも同程度の効果であったが、反応ブロッキング液としては、ブロックエース、スキムミルク、魚ゼラチンはほぼ同程度の効果であるが、ＢＳＡは弱いことがわかった。
　実施例１２
　ＰＶＤＦ膜へのＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺ吸着と化学性ブロッキング剤の効果検討するための実験を行った。ＴＢＳにそれぞれ１％の濃度となるように表６に示す各種ブロッキング剤を溶解させた。対照としてＴＢＳに５％スキムミルクが溶解したＴＢＳを調製した。これらを用いてＰＶＤＦ膜をブロッキングし、次いで、ＳＨ－ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺ〔製造例３〕と反応させた後、実施例１１と同様の方法にて評価した。結果を表６に示す。
　５％スキムミルクでブロッキング処理したＰＶＤＦ膜では、膜全体に薄い黒化が見られＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺの膜への吸着が完全には抑制されていなかった。検討した化合物の内、Pluronic F-127、Pluronic P-105、ＨＰＭＣ、PVA2000、PVA500、Lipidure206、及びLipidure802では膜の黒化は殆ど起こらず、強い抑制効果が認められた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　実施例１３
　ウエスタンブロットにおけるＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺの効果をするための実験を行った。実施例１１及び１２の結果から、ＳＨ－ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺをＰＶＤＦ膜で利用する際には、ブロッキング剤としてPluronic F-127、Pluronic P-105、ＨＰＭＣ、PVA2000、PVA500、Lipidure206及びLipidure802を利用するとＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺの膜への吸着を抑制し、さらに実施例１０の結果からＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺの反応液中にブロッキング剤を含有させるとさらに効果が高いことが想定された。
　そこでこれらのブロッキング剤を反応液中に含有させた時の効果を、抗vimentin抗体及びＳＨ－ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺ〔製造例３〕を用いたＨｕＨ７細胞抽出液のウエスタンブロットにより検討した。検出方法は、実施例１０と同様に行った。なお、メンブレンのブロッキングは５％スキムミルクで行い、下記表７に示す各種ブロッキング剤を１％の終濃度となるようにしたものを反応時のブロッキングに用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　１％のスキムミルクを追加した対照実験ではバックグラウンドとして膜全体に薄い黒化が起こった。一方で、反応液にPluronic F-127、Pluronic P-105、ＨＰＭＣ、PVA2000、PVA500、Lipidure 206及びLipidure 802を添加した場合には、ブロッキング剤の種類により多少効果の差はあるが、何れもバックグラウンドは対照より低く吸着抑制に有効であることがわかった。一方、抗体特異的なバンドのシグナル強度は何れのブロッキング剤でも殆ど変化はなかった。
　以上の結果から、ブロッキング剤をＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺの反応液中に加えることで、ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺの非特異的吸着を抑制可能であり、その時、抗体特異的なシグナルは保持されることが分かった。
　実施例１４
　ＥＬＩＳＡにおけるプローブの特異的結合に対する各種ブロッキング剤の効果を検討する実験を行った。コントロールマウス由来ＩｇＧ（ポリクローナル）をＥＬＩＳＡ用プレートに固相化した。対照としてコントロールマウス由来ＩｇＧを固相化しないＥＬＩＳＡプレートを用意し、共にk-Block-eによってブロッキング処理を行ったプレートを準備した。
　これらのプレートに各種プローブ（ＢＮＣ－ＺＺ〔製造例２〕、ＳＨ－ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺ〔製造例３〕、ＨＲＰ標識ＡＧＧ－ＢＮＣ－ＺＺ〔製造例６〕、ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺ／ウサギ由来抗マウスＩｇＧ抗体複合体〔製造例７〕、及びＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＳＡ／ウサギ由来抗マウスＩｇＧ抗体複合体〔製造例８〕）を一定濃度で添加し、固相化したコントロールマウス由来ＩｇＧとの結合反応を観察した。
　なお、各種プローブと共に、表８に示す各種ブロッキング剤をそれぞれ終濃度で０．１％となるようにして用いた。ブロッキング剤の対照として、終濃度が０．２％となるようにカゼインを含有させたPBS-Tを用いた。
　なお、ＢＮＣ－ＺＺに対してはＨＲＰ標識したウサギ由来のコントロールＩｇＧ抗体を同時に添加し反応後洗浄し、実施例９と同様の方法にてＡｂｓ４５０ｎｍを測定した。測定値はプローブ毎に、固相化抗体ありでブロッキング成分を含有しない反応液での反応を１００％とし、それぞれの固相化抗体なしの値をブランク値として引いたものを特異的反応として示した。結果を表８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　ブロッキング成分を全く添加しないで抗体とプローブとの反応を行った場合、非特異的結合は非常に高く特異的な反応はほとんど見られなかった。対照として用いたカゼインの場合、ＳＨ－ＨＲＰ－ＢＮＣ－ＺＺではかなりの特異的反応が見られたが、その他のプローブに対する反応は低かった。ブロッキング剤の中ではＨＰＭＣとＰＶＡでは特異的反応は低かったが、他のものではプローブによって大きさは異なったものの、良好な特異的反応を示すものが見られた。
　実施例１５
　次いで、実施例１４にて用いたブロッキング剤の濃度を変えて、各種プローブのＥＬＩＳＡプレートへの吸着と各種ブロッキング剤の特異的反応に対する効果を検討する実験を行った。大腸菌を用いて調製したＧＦＰタンパク質をＥＬＩＳＡ用プレートに固相化し、k-Block-eを用いてブロッキングした。
　このプレートに、各種ブロッキング剤を添加した各種プローブ（ＳＨ－ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺ〔製造例３〕とウサギ由来抗ＧＦＰ抗体の混合複合体；ＨＲＰ標識ＡＧＧ－ＢＮＣ－ＺＺ〔製造例６〕とウサギ由来抗ＧＦＰ抗体の混合複合体；ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺ／ウサギ由来抗ＧＦＰ抗体複合体）を添加し抗原との結合反応を観察した。そして表９に示す各種ブロッキング剤を終濃度がそれぞれ０．０１％、０．０５％、０．１％となるように３つの条件で検討した。
　なお、ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺ／ウサギ由来抗ＧＦＰ抗体複合体は、製造例７におけるＢＳ３の濃度を１０００μＭとし、ウサギ由来抗マウスＩｇＧ抗体に換えて、ウサギ由来抗ＧＦＰ抗体を用いて調製した。対照は抗ＧＦＰウサギ抗体の代わりに上述のコントロールウサギ由来ＩｇＧを利用し、実施例９に示す方法と同様の方法でＡｂｓ４５０ｎｍを測定した。
　得られた結果は抗ＧＦＰ抗体が非存在下で得られた値をノイズ値とし、抗ＧＦＰ抗体が存在下で得られた値を特異的シグナル値として、各シグナル値を各ノイズ値で割った数値をＳ／Ｎ比として表９に表した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　種々のブロッキング剤はプローブ毎に異なったＳ／Ｎ比を示し、ブロッキング剤の濃度が高いと高いＳ／Ｎ比を示すもの、それとは逆にブロッキング剤の濃度が低いと高いＳ／Ｎ比を示すものもあった。これらのブロッキング剤は何れも適切な使用濃度で利用すれば、ＢＮＣ－ＺＺ等のプローブをＥＬＩＳＡで利用する際に有効であることが示唆された。
　実施例１６
　ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺの抗体結合活性を評価する実験を行った。製造例３にて調製したＮＨ２－ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺとＳＨ－ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺの抗体結合活性をＥＬＩＳＡにて比較した。コントロールウサギ由来ＩｇＧをＥＬＩＳＡプレートに固相化し、各ウェルを１％のブロックエースを用いてブロッキングした。ＢＮＣ－ＺＺタンパク質量として０、９．３７５、１８．７５、３７．５、７５、１５０、３００、６００ｎｇ／ｍＬの各種濃度のＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺ溶液を調製し、更に終濃度が０．０５％となるようにPluronic F-127を含むように添加したＰＢＳ－Ｔをウェルに添加し反応させ、洗浄後、
実施例９に示す方法にてＡｂｓ４５０ｎｍを測定した。その結果を図３に示す。
　全ての濃度で、ＳＨ－ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺで得られた測定値の方がＮＨ２－ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺのそれより高かった。特に、３００ｎｇ／ｍＬや６００ｎｇ／ｍＬの濃度ではＳＨ－ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺで得られた測定値の方がＮＨ２－ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺのそれより約２．１倍から２．７倍高かった。この倍率は、上記実施例１に示す両者のＨＲＰ比活性の違い（前者が０．８４４で後者が０．３５１Ｕ／μｇであるので、約２．４倍高い）とほぼ同じレベルであり、何れのＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺもこれらの濃度では固相化抗体にほぼ最大量結合していることが示唆された。一方、これより低い濃度では、ＳＨ－ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺとＮＨ２－ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺで得られた測定値の倍率は高くなり、ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺ濃度が３７．５ｎｇ以下では平均で約７．２４倍まで高くなった。このことは、低濃度域ではＳＨ－ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺの方がより多く固相化抗体に結合したことを示しており、ＨＲＰの比活性が約２．４倍違うことを勘案すると、ＳＨ－ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺはＮＨ２－ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺより、抗体に対する結合親和性が３倍程度も強いことが示唆される。ＮＨ２基を介する標識は粒子を構成するＢＮＣ－ＺＺタンパク質の主にリジン残基をターゲットにして行われるが、リジン残基は抗体結合部位に多く存在することから、ＮＨ２基を介した標識は抗体結合部位に影響を与え抗体の結合を阻害するものと考えられる。一方で、ＳＨ基はＢＮＣ－ＺＺタンパク質の膜貫通領域中の外部露出部位に存在することからＳＨ基をターゲットにした場合、抗体結合能に影響を与えないと考えることができる。
　従って、ＢＮＣ－ＺＺをＨＲＰ標識する場合、ＳＨ基を介して標識した方がＢＮＣ－ＺＺの抗体結合能をより活かすことができること、更にＨＲＰ活性も高く、抗体に対する結合活性とＨＲＰ標識を併せて約７．２倍高い標識物を形成できることから、ＳＨ基を介した標識のほうが遥かに優れていると結論される。以下、特に断らない限り、ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺとはＳＨ基を介したものである。
　実施例１７
　ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺのＥＬＩＳＡにおける応用について検討する実験を行った。Ｂ型肝炎ウイルスの表面抗原のペプチドであるPre-S2（ビークル社製、製品番号BCL-AGS2-21）で固相化したＥＬＩＳＡプレートを、k-Block-eでブロッキングし、各種濃度の抗Pre-S2マウス抗体（特殊免疫研究所、2APS42）を添加した。次いで、終濃度が０．０５％となるようにPluronic F-127が添加されたＰＢＳ－Ｔに溶解したＨＲＰ標識抗マウス抗体、ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺ〔製造例３〕、又はこれらを同濃度で併用したものを添加し反応させ、洗浄後、実施例９と同様の方法にてＡｂｓ４５０ｎｍを測定した。結果を図４に示す。
　図中、白三角印の「ＨＲＰ－ＺＺ」に示すように、ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺを利用すると、図中、黒丸印の「２ｎｄ　ＩｇＧ」に示すように抗マウス抗体で検出した時と比べて１０倍程度感度が上昇しており、図中、黒四角印の「ＨＲＰ－ＺＺ＋ＩｇＧ」に示すようにこれらの両者を併用すると３０倍程度も感度が上昇することが明らかとなった。
　実施例１８
　実施例１７と同様に、ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺの抗体検出型ＥＬＩＳＡについて検討した。本実験で用いたリーシュマニア原虫の組換タンパク質とコントロールヒト抗血清は何れも愛知医科大学、感染・免疫学講座教室から提供を受けたものである。Ｐｒｅ－Ｓ２に代えてリーシュマニアの病原体である原虫の組換タンパク質を固相化したＥＬＩＳＡプレートを、ｋ－Ｂｌｏｃｋ－ｅでブロッキングし、コントロールヒト抗血清の各種濃度を添加した。次いで、終濃度が０．０５％となるようにPluronic F-127が添加されたＰＢＳ－Ｔに溶解したＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧ抗体、ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺ〔製造例３〕、又はこれらを同濃度で併用したものを添加し反応させ、洗浄後、基質としてＡＢＴＳ（１－ＳＴＥＰ　ＡＢＴＳ，Thermo Scientific）にてＡｂｓ４０５ｎｍを測定した。結果を図５に示す。なお、測定値は抗体価をUnit/mLとして表した。
　図中、白四角印の「ＨＲＰ－ＺＺ」に示すように、ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺを利用すると、図中、黒三角印の「２ｎｄ　ＩｇＧ」に示すように抗ヒトＩｇＧ抗体で検出した時と比べて１０倍弱感度が上昇しており、図中、黒丸印の「ＨＲＰ－ＺＺ＋ＩｇＧ」に示すようにこれらの両者を併用すると３０倍程度も感度が上昇することが明らかとなった。
　以上の実施例１７及び１８に示す結果から、ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺは抗体検出型ＥＬＩＳＡで高感度検出に有用であり、特に検出抗体と共存させると更に高感度での検出が可能なことが判った。
　実施例１９
　ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺのＥＬＩＳＡにおける実践的測定を検討した。ＧＦＰタンパク質で固相化されたＥＬＩＳＡプレートを、k-Block-eでブロッキングした。濃度が既知の抗ＧＦＰマウスＩｇＧ抗体をスタンダードとし、サンプルとしてマウス抗ＧＦＰ抗血清を１００倍以上に希釈したものを、それぞれ上記ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに添加した。次いで、終濃度が０．０５％となるようにPluronic F-127が添加されたＰＢＳに溶解したＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺ〔製造例３〕、ウサギ由来抗マウスＩｇＧ抗体とＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺの混合複合体、又はウサギ由来ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体をそれぞれ添加し反応させ、洗浄後、実施例９に示す方法と同様にＡｂｓ４５０ｎｍを測定した。測定した値は、スタンダード抗体で得られたそれぞれの検量線に基づいて、抗血清中の抗ＧＦＰマウスＩｇＧの濃度をｍｅａｎ±ｓｔｄ（ｎｇ／ｍＬ、ｎ＝３）として計算した。
　その結果、ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺ、ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺと抗マウスＩｇＧの混合複合体で測定した値は、それぞれ１５６１３±９３６、１５４０３±１１９２であり、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体で定量した１５４００±１０９とよく一致し、十分な定量性を持つことが明らかとなった。
　実施例２０
　ＡＬＰ標識ＢＮＣ－ＺＺの抗体結合活性を評価するための実験を行った。コントロールウサギ由来ＩｇＧを用いて固相化したＥＬＩＳＡプレートを１％のブロックエースでブロッキングし、各ウェルに上記製造例４にて作製したＮＨ２－ＡＬＰ標識ＢＮＣ－ＺＺ又はＳＨ－ＡＬＰ標識ＢＮＣ－ＺＺをＢＮＣ－ＺＺタンパク質量に換算してそれぞれ0、9.375、18.75、37.5、75、150、300、600ｎｇ／ｍＬを５０μＬずつ各ウェルに添加し反応後、洗浄し、実施例２と同様の方法にてＡｂｓ４０５ｎｍを測定した。なお、ＡＬＰ標識ＢＮＣ－ＺＺと共に、終濃度が０．０５％となるPluronic F-127を用いた。結果を図６に示す。
　全てのＢＮＣ－ＺＺの濃度でＳＨ－ＡＬＰ標識ＢＮＣ－ＺＺで得られた測定値の方がＮＨ２－ＡＬＰ標識ＢＮＣ－ＺＺのそれより高かった。６００ｎｇ／ｍＬの濃度ではＳＨ－ＡＬＰ標識ＢＮＣ－ＺＺで得られた測定値の方がＮＨ２－ＡＬＰ標識ＢＮＣ－ＺＺのそれより約１．７倍程度高かった。この倍率は、両者のＡＬＰ比活性の違い（前者が５．６１で後者が３．５６ｕｎｉｔ／μｇであるので、１．６倍高い）とほぼ同じレベルであり、何れのＡＬＰ標識ＢＮＣ－ＺＺも固相化抗体にほぼ最大量結合していることが示唆された。一方、これより低い濃度では、ＳＨ－ＡＬＰ標識ＢＮＣ－ＺＺとＮＨ２－ＡＬＰ標識ＢＮＣ－ＺＺで得られた測定値の倍率は高くなり、ＢＮＣ－ＺＺ濃度が３７．５ｎｇ以下では平均で３．６倍程度にまで高くなった。
　このことは、低濃度域ではＳＨ－ＡＬＰ標識ＢＮＣ－ＺＺの方がより多く固相化抗体に結合したことを示唆している。ＡＬＰの比活性が１．６倍程度違うことを勘案するとＳＨ－ＡＬＰ標識ＢＮＣ－ＺＺはＮＨ２－ＡＬＰ標識ＢＮＣ－ＺＺより、抗体に対する結合親和性が２．３倍強いと推定される。ＮＨ２基経由の標識ではＳＨ基を介した場合より抗体結合能が低下した原因は、上記実施例１６に記載したＨＲＰ標識の場合と同じ原因であると考えられる。
　実施例２１
　ＡＬＰ標識ＢＮＣ－ＺＺのＥＬＩＳＡへの応用を検討するための実験を行った。コントロールマウス由来ＩｇＧ（ポリクローナル）で固相化されたＥＬＩＳＡプレートを、０．５％のカゼインを用いてブロッキングした。各ウェルに各種濃度のＳＨ－ＡＬＰ標識ＢＮＣ－ＺＺ〔製造例４〕又はＡＬＰ標識ウサギ由来抗マウスＩｇＧ抗体を添加し反応させ、洗浄後、実施例２と同様の方法にてＡｂｓ４０５ｎｍを測定した。
　なお、ＡＬＰ標識ＢＮＣ－ＺＺと共に、終濃度が０．０５％となるようにPluronic F-127を用いた。その結果を図７に示す。
　ＡＬＰ標識ＢＮＣ－ＺＺを利用するとＡＬＰ標識した抗体よりも遙かに高い反応が見られ、ＡＬＰ標識ＢＮＣ－ＺＺが高感度の抗体検出に有用であることが示唆された。
　実施例２２
　ＨＲＰ標識ＡＧＧ－ＢＮＣ－ＺＺの抗体結合活性を評価するための実験を行った。コントロールブタ由来ＩｇＧ（実施例５の方法で調製した自社製）を用いてＥＬＩＳＡプレートを固相化し、次いで０．５％カゼインを用いてブロッキングした。各ウェルに図８のグラフ横軸に示した各種濃度のＨＲＰ標識ＡＧＧ－ＢＮＣ－ＺＺ〔製造例６〕又はＮＨ２ーＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺ〔製造例３〕をプローブとして添加し反応させ、洗浄後、実施例９と同様の方法でＡｂｓ４５０ｎｍを測定した。なお、プローブには終濃度が０．０５％となるようにPluronic F-127を加えた。結果を図８に示す。
　実施例３で示した様に、ＨＲＰ標識ＡＧＧ－ＢＮＣ－ＺＺのＨＲＰ活性はＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺの１／３であることが分かっているので、両プローブの抗体結合活性が同じと考えた場合、固相化したブタ由来ＩｇＧに対しＨＲＰ標識ＡＧＧ－ＢＮＣ－ＺＺはＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺの１／３の反応を示すはずである。
　しかし、実際にはＨＲＰ標識ＡＧＧ－ＢＮＣ－ＺＺはＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺと比べると、１／１．１～１／２．４程度の反応であった。このことはＨＲＰ標識ＡＧＧ－ＢＮＣ－ＺＺはＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺより高い抗体結合活性を持つことを示している。以上の結果から、ＨＲＰ標識ＡＧＧ－ＢＮＣ－ＺＺ及びＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺはいずれも抗体より優れた抗体結合活性を持つことを示している。
　実施例２３
　ＨＲＰ標識ＡＧＧ－ＢＮＣ－ＺＺのプロテインＧ由来抗体結合能を評価するための実験を行った。実施例２２に示すコントロールブタ由来ＩｇＧに代えてＢＮＣ－ＺＺでは結合しにくいと考えられている、マウス由来ＩｇＧ１を用いて固相化し、その他は、同様の実験を行った。結果を図９に示す。
　ＨＲＰ標識ＡＧＧ－ＢＮＣ－ＺＺはマウスＩｇＧ１に対して高い結合反応を示した。一方、ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺでは殆ど検出できなかった。このことはＨＲＰ標識ＡＧＧ－ＢＮＣ－ＺＺのプロテインＧ由来の抗体結合部位がうまく機能しており、プロテインＡ由来の抗体結合部位では結合しにくい抗体に対してもＨＲＰ標識ＡＧＧ－ＢＮＣ－ＺＺは高い結合力を有することを示している。
　実施例２４
　ＨＲＰ標識ＡＧＧ－ＢＮＣ－ＺＺのＥＬＩＳＡへの応用実験を行った。大腸菌を利用して製造したＧＦＰタンパク質をＥＬＩＳＡプレートへ固相化し、次いで、k-Block-eを用いてブロッキングした。各ウェルへウサギ由来抗ＧＦＰ抗体を図１０のグラフ横軸に示した各種濃度で添加し、更に１００ｎｇ／ｍＬのＨＲＰ標識ＡＧＧ－ＢＮＣ－ＺＺ〔製造例６〕又はＳＨーＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺ〔製造例３〕をプローブとして加え反応させ、洗浄後、実施例９と同様の方法にてＡｂｓ４５０ｎｍを測定した。なお、プローブには終濃度が０．０５％となるようにPluronic F-127を加えた。結果を図１０に示す。
　ＨＲＰ標識ＡＧＧ－ＢＮＣ－ＺＺは対照として用いたＳＨ－ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺと同じく、添加した抗体濃度に依存した反応を示したが、前者の反応は後者に比べると約１／２であった。ＨＲＰ標識ＡＧＧ－ＢＮＣ－ＺＺのＨＲＰ活性がＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺの１／３であることを考慮すると、ＨＲＰ標識ＡＧＧ－ＢＮＣ－ＺＺはＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺ以上の反応を示すことが分かった。
　次いでウサギ由来抗ＧＦＰ抗体に代えて、マウス由来抗ＨＭＧ１モノクローナル抗体（コスモバイオ；ＩｇＧ１）を用いて固相化処理を行い、それ以外は同様の方法で実験を行った。結果を図１１に示す。
　ＨＲＰ標識ＡＧＧ－ＢＮＣ－ＺＺを検出プローブとして利用した場合、添加した抗体濃度に依存した反応を示したが、ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺの場合には反応は殆ど見られなかった。
　以上の結果は実践的な測定系においてもＨＲＰ標識ＡＧＧ－ＢＮＣ－ＺＺは抗体検出型ＥＬＩＳＡにて利用可能であることを示している。また、ＨＲＰ標識ＡＧＧ－ＢＮＣ－ＺＺはＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺでは検出できないマウスＩｇＧ１も検出できることを示しており、非常に有用性が高いことを示している。
　実施例２５
　ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺ／ウサギ由来抗マウスＩｇＧ抗体複合体の抗体結合活性を検討するための実験を行った。コントロールマウス由来ＩｇＧを用いて、ＥＬＩＳＡ用プレートを固相化し、次いで、k-Block-eで１時間反応させてブロッキングした。各ウェルに架橋剤ＢＳ３を用いて製造したＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺ／ウサギ由来抗マウスＩｇＧ抗体の複合体〔製造例７〕のうち、架橋剤ＢＳ３濃度が２００μＭ及び１０００μＭで作製したものを、それぞれ０、０．５５、１．６５、４．９４、１４．８、４４．４、１３３、４００ｎｇ／ｍＬの濃度のものをプローブとして添加し反応させ、洗浄後、実施例９と同様の方法でＡｂｓ４５０ｎｍを測定した。なお、プローブには終濃度が０．０５％となるようにPluronic F-127を加えた。結果を図１２に示す。
　用いた両複合体の濃度に依存した反応が見られた。複合体調製時の架橋剤が２００μＭと１０００μＭを比較すると、後者は結合活性が若干低下したが、両者とも実用レベルの抗体結合活性を示した。
　実施例２６
　卵白アルブミン（ＯＶＡ）を免疫して得られた抗ＯＶＡマウス抗血清中に存在する抗ＯＶＡマウスＩｇＥ、抗ＯＶＡマウスＩｇＧの両者を実践的に測定できるかどうかを確認した。ＯＶＡをＥＬＩＳＡプレートに固相化し、次いでh-Block-eを用いてブロッキングした。このプレートに各抗ＯＶＡマウス抗血清を１００倍以上に希釈したものを加えた。ＩｇＥ測定用プローブとして、ＳＨーＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺ〔製造例３〕と抗マウスＩｇＥ（Nordic immunology Lab）を〔製造例７〕の方法に従いＢＳ３濃度を１０００μＭとして調製した複合体と、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＥを用いた。ＩｇＧ測定用プローブとしてはＳＨーＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺ〔製造例３〕とウサギ由来抗マウスＩｇＧ抗体の混合複合体を用いた。それぞれの測定に用意したプレートのウェルにこれらのプローブを添加し反応させ、洗浄後、実施例９と同様の方法でＡｂｓ４５０ｎｍを測定した。測定値はスタンダード抗体を用いて作製した検量線を用い、スタンダード抗体の抗体価を基準にして各抗体の抗体価を、ｍｅａｎ±ｓｔｄ（ｕｎｉｔ／ｍＬ、ｎ＝３）で算出した。
　マウス血清中の抗ＯＶＡＩｇＥの抗体価はＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺ／抗マウスＩｇＥ複合体を用いた場合が３８０７±１４３９ｎｕｎｉｔ／ｍＬであり、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＥを用いた場合が３５５８±９３５ｎｕｎｉｔ／ｍＬであり、両者は同様の値を示した。
　また、抗ＯＶＡマウスＩｇＧの抗体価は４１７５±８７１７μｕｎｉｔ／ｍＬであった。以上、これらの複合体を利用した測定系ではＩｇＥやＩｇＧの抗体価測定が十分に可能であり、実践的な有用性を持つことが分かった。
　実施例２７
　〔製造例８〕で調製したＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＳＡ／ウサギ由来抗マウスＩｇＧ抗体の複合体を利用し、マウスＩｇＧに対する結合反応を確認する実験を行った。コントロールマウス由来ＩｇＧをＥＬＩＳＡプレートに固相化し、次いで１％のブロックエースを用いてブロッキングした。各ウェルにプローブとしてＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＳＡ／ウサギ由来抗マウスＩｇＧ抗体複合体〔製造例８〕、及び対照としてＮＨ２ーＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺ〔製造例３〕と抗マウスＩｇＧウサギ抗体（Bethyl）の混合複合体並びにウサギ由来ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体の各プローブを、それぞれ0、0.55、1.65、4.94、14.8、44.4、133、400ng/mLの濃度で添加し反応させ、洗浄後、実施例９と同様の方法でＡｂｓ４５０ｎｍを測定した。なお、プローブには終濃度が０．０５％となるようにPluronic F-127を加えた。その結果を図１３に示す。
　いずれのプローブも加える濃度に依存して反応は大きくなった。ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＳＡ／抗体複合体は、同じＮＨ２基を介してＨＲＰを標識したＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺと抗体の混合複合体と比較して約１／２の結合活性を示した。ＨＲＰの酵素活性は前者が約１／３であることを考えると、ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＳＡ／抗体複合体はＮＨ２ーＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺと抗体の混合複合体より抗体への結合能は高いことを示す。一方ＨＲＰ標識抗体と比較した場合、ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＳＡ／抗体複合体は、約２倍の反応を示した。以上、ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＳＡ／抗体複合体はＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体より抗体への結合能が高く、有用性があることが分かった。
　実施例２８
　実施例１３の方法と同様に、ＨｕＨ７細胞の抽出液をウエスタンブロットに供した。メンブレンのブロッキングは５％のスキムミルクを用い、使用した一次抗体はマウス由来抗vimentin抗体（Progen、1/1000希釈）である。プローブとして１％スキムミルクを含有するウサギ由来ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Rockland、1/10000；図中の２ｎｄ　Ａｂ）、又は０．１％のPluronic F-127及び１％スキムミルクを含有するＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺ〔製造例３〕を用いた。結果を図１４に示す。
　プローブとしてウサギ由来ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体を用いて検出した場合、抽出液を１／１０に希釈するとバンドのシグナルが確認できなかったが、ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺを用いた場合には、１／１０に希釈の抽出液でも同等のシグナルが得られた。したがって、ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺが高感度検出に有効であることが分かる。
　実施例２９
　実施例２８と同様の方法でウエスタンブロットを行った。１次抗体として用いた上記抗vimentinマウス抗体を1/3000希釈とし、２次抗体としてＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Rockland、#611-1302、1/10000希釈）で検出し（図中のDetect-1）、その後、更に、０．１％Lipidure802を含む溶液に溶解してＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺを追加プローブとして検出した（図中のDetect-2）。結果を図１５に示す。
　２次抗体として用いたＨＲＰ標識抗マウス抗体では検出感度が悪い場合（Detection-1）、ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺを追加プローブとして用いて再検出（Detection-2）するだけでバンドシグナルを強めることができたことが分かる。なお、データは示していないが２次抗体を追加してもシグナルは殆ど上昇しなかった。従って、ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺは追加するだけでシグナルを増感できるため非常に有用性が高い。
　実施例３０
　実施例２８と同様の方法で、ウエスタンブロットを行った。１次抗体として抗vimentinマウス抗体（Progen、1/2000希釈）、抗ＧＡＰＤＨウサギ抗体（EPITOMICS、1/10000希釈）、又はこれらの両者を用い、２次抗体としてＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Rockland）、ＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（Santa Cruz）、又はＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺ（ＨＲＰ－ＺＺ）を用いて検出した結果である。なお、ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺは終濃度が０．１％となる量のPluronic F-127と共に用いた。結果を図１６に示す。
　ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺを利用した場合、それぞれの２次抗体で検出した位置に、一度でvimentinとＧＡＰＤＨを検出することが出来ることが分かる。また、ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺの場合は、抗体の由来する動物種が異なっても同等に同時に検出できることも示された。
　実施例３１
　サンプルとしてＨｕＨ７細胞抽出液に２倍の希釈系列で濃度調製したＧＦＰ－Ｈｉｓｔａｇタンパク質を添加し、これを実施例２８と同様の方法でウェスタンブロッティングに供した。１次抗体として抗ＧＡＰＤＨウサギ抗体（EPITOMICS、1/10000）及び抗ＧＦＰウサギ抗体（Rockland、1/2000）と反応させ、その後、０．１％のLipidure 206を含有するＰＢＳ－Ｔで希釈したＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺ（ＨＲＰ－ＺＺ）を用いて同時に検出した。結果を図１７に示す。
　ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺを利用した場合、ＧＦＰタンパク質は添加した濃度に従ってシグナルは増強し、定量性があることが分かった。
　実施例３２
　実施例２８と同様の方法で、ウエスタンブロットを行った。抗vimentinマウス抗体（Progen、1/2000）とＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺを予め等量混合し、その混合複合体をＰＶＤＦ膜へ加えることでワンステップ法により検出した。なお、ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺと抗体の混合複合体の反応液は０．１％Pluronic F-127を含有するＴＢＳ－Ｔを用いた。対照として抗Vimentinマウス抗体との反応の後に、ＨＲＰ標識抗マウス抗体（Rockland、1/5000）で反応を行った２ステップ操作によっても検出した。結果を図１８に示す。ワンステップ法は、ＰＶＤＦ膜へのタンパク質のトランスファーの後、検出までの操作時間として、ブロッキングに５分（図中のＱ１）又は１５分（図中のＱ２）、次いで行う洗浄に５分、次いで行う反応（一次抗体＋ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺ）に３０分、次いで行う洗浄に２５分（５分×５：Ｑ１）又は１５分（３分×５：Ｑ２）で、総時間が６５分程度であるのに対し、ＨＲＰ標識抗マウス抗体を用いた２ステップ法（図中のＭ）ではブロッキングに６０分、次いで行う洗浄に１０分（５分×２）、次いで行う１次抗体反応に６０分、次いで行う洗浄に１５分（５分×３）、次いで行う２次抗体反応に６０分、次いで行う洗浄に２５分（５分×５）で、総時間が２３０分程度であった。
　通常法の２ステップ法では、タンパク質転写膜を利用してシグナルを検出するまで合計２３０分の工程が必要であったが、ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺを利用したワンステップ法（図中のＱ１，Ｑ２）の場合、洗浄時間やその他の時間を短縮することで６５分に短縮して同等の結果を得ることができた。したがって、ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺは迅速検出ウエスタンブロットを可能とする有用性を持つことがわかった。
　実施例３３
　実施例２８と同様の方法で、ウエスタンブロットを行った。１次抗体として抗ｐ５３ウサギ抗体（Santa Cruz、1/200）を、２次抗体としてＡＬＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（Sigma、1/50000）、又はＳＨ－ＡＬＰ標識ＢＮＣ－ＺＺ〔製造例４〕を用い、ＡＬＰ用基質としてCDP-Star(NEB)を採用した。結果を図１９に示す。
　ＡＬＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体で検出した場合とＡＬＰ標識ＢＮＣ－ＺＺで検出した場合ではほぼ同等のシグナルが得られ、ＡＬＰ標識ＢＮＣ－ＺＺはウエスタンブロットでも有用性の高いプローブであり、ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺを用いた本願の実施例で示した種々の使用法が可能であることが示唆された。
　実施例３４
　実施例２８と同じ方法で、ただしＡ４３１細胞抽出液に代えてウエスタンブロットを行った。１次抗体として抗体種がマウスＩｇＧ１である抗ＥＧＦＲ抗体（Cell Singnaling、1/1000希釈）、又は抗ｐ５３ウサギ抗体（Santa Cruz、1/200希釈）と反応させた後、０．１％のPluronic F-12７含有するＴＢＳ－Ｔで希釈したＨＲＰ標識ＡＧＧ－ＢＮＣ－ＺＺ〔製造例６〕又はＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺ〔製造例３〕で反応させた。結果を図２０に示す。
　マウスＩｇＧ１である抗ＥＧＦＲ抗体を用いた場合には、ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺ（図中のＺ）では全く検出できなかったが、ＨＲＰ標識ＡＧＧ－ＢＮＣ－ＺＺ（図中のＡ）を利用した場合には検出が可能であった。一方、ウサギＩｇＧである抗ｐ５３抗体を利用した場合には、ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺを用いてもＨＲＰ標識ＡＧＧ－ＢＮＣ－ＺＺを用いてもよく検出できた。
　以上の結果は、ＨＲＰ標識ＡＧＧ－ＢＮＣ－ＺＺはプロテインＧ由来の抗体結合部位を持つためマウスＩｇＧ１にも容易に結合し、ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺはプロテインＡ由来の抗体結合部位のみを持つためマウスＩｇＧ１には殆ど結合しないこととよく一致し、ＨＲＰ標識ＡＧＧ－ＢＮＣ－ＺＺの有用性が証明された。
　〔製造例９：ＨＲＰ標識ＢＮＣ－Ｌの調製〕
　Peroxidase Labeling Kit-SHを用いて、ＢＮＣ－Ｌ〔製造例１〕のＳＨ基を介してＨＲＰ標識を施し、ＨＲＰ標識ＢＮＣ－Ｌを得た。
　実施例３５
　Ｂ型肝炎ウイルスの表面抗原のペプチドであるPre-S2を固相化したＥＬＩＳＡプレートをブロッキングし、各ウェルに各種濃度の抗Pre-S2抗体を添加した。次いで、ＨＲＰ標識ＢＮＣ－Ｌ〔製造例９〕を添加し反応させ、洗浄後、実施例９に示す方法にてＡｂｓ４５０ｎｍを測定した（抗原サンドイッチＥＬＩＳＡ）。その結果を図２１に示す。
　その結果、ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＬはＥＬＩＳＡ測定のプローブとして十分に用い得ることが明らかとなった。
　〔製造例１０：ＳＨ－ＨＲＰ標識ＢＮＣ－（糖鎖）ーＡＧＧ〕
　ＢＮＣ－Ｌ〔製造例１〕をＮａＩＯ４で酸化処理し、ＢＮＣ－Ｌに付加された糖鎖中の糖残基にアルデヒド基を形成させた。次いでＡＧＧタンパク質と反応させて、アルデヒド基とＡＧＧペプチドのリジン残基を結合させた。反応物にＮａＢＨ４溶液を添加し、ゲル濾過処理に供してＢＮＣ－ＡＧＧを得た。更に、Peroxidase Labeling Kit-SHを用いて、得られたＢＮＣ－ＡＧＧのＳＨ基を介してＨＲＰ標識を施した。すなわち、得られたＢＮＣは、その糖鎖を介してＡＧＧが結合しており、更に、そのＳＨ基を介してＨＲＰが結合している（以後、ＳＨ－ＨＲＰ標識ＢＮＣ－（糖鎖）ーＡＧＧと呼ぶことがある。）。
　実施例３６
　各種濃度のウサギＩｇＧで固相化されたＥＬＩＳＡプレートをブロッキングし、各ウェルにＳＨ－ＨＲＰ標識ＢＮＣ－（糖鎖）ーＡＧＧ〔製造例１０〕を添加し反応させ、洗浄後、実施例９に示す方法にてＡｂｓ４５０ｎｍを測定した。結果を図２２に示す。
　ＳＨ－ＨＲＰ標識ＢＮＣ－（糖鎖）ーＡＧＧによるＡｂｓ４５０ｎｍ値は、対照として用いたＳＨ－ＨＲＰ標識ＢＮＣ－ＺＺ〔製造例４〕と比べて低かったものの、十分な検出能を有することが分かった。
　〔製造例１１：ＨＲＰ標識ＨＶＪ－Ｅの調製〕
　Peroxidase Labeling Kit-SHを用いて、センダイウイルスのエンベローブタンパク質を含むウイルス様粒子であるＨＶＪ－Ｅ（Genome One, 石原産業）の粒子表面に存在するタンパク質のシステイン残基におけるＳＨ基を介してＨＲＰを標識し、ＨＲＰ標識ＨＶＪ－Ｅを得た。
　実施例３７
　実施例１と同様の方法にて、ＨＲＰ標識ＨＶＪ－ＥのＨＲＰ活性〔製造例１１〕を測定したところ、０．０５Ｕ/μｇであった。
　膜貫通型のタンパク質を持つウイルス様粒子では、タンパク質の膜貫通領域内又は近傍にＳＨ基を有する場合が多い。本実施例ではＨＶＪ－ＥにおいてでもＳＨ基を介した標識が可能であることを示しており、ウイルス様粒子に存在するＳＨ基は標識のターゲットとして有用であることを示している。

Claims (12)

  1. 自己組織化能を有するタンパク質を含む免疫学的測定用ウイルス様粒子であって、該自己組織化能を有するタンパク質の少なくとも１つのシステイン残基のチオール基を介して生理活性分子によって修飾されてなる、ウイルス様粒子。
  2. 前記自己組織化能を有するタンパク質がＨＢｓＡｇタンパク質である、請求項１に記載のウイルス様粒子。
  3. 前記自己組織化能を有するタンパク質が配列番号１に示すアミノ酸配列を含む請求項１のウイルス様粒子。
  4. 前記自己組織化能を有するタンパク質が抗体結合ドメインを有する、請求項１～３の何れか１項に記載のウイルス様粒子。
  5. 前記生理活性分子が、酵素、抗体結合ドメイン、ビオチン、蛍光色素、発光色素、及びアビジン化合物からなる群より選択される少なくとも一種である、請求項１～４の何れか１項に記載のウイルス様粒子。
  6. 前記抗体結合ドメインが、プロテインＡ中の抗体結合ドメイン、プロテインＧ中の抗体結合ドメイン、及びプロテインＬ中の抗体結合ドメインからなる群より選択される少なくとも一種である、請求項４又は５に記載のウイルス様粒子。
  7. 前記抗体結合ドメインが、配列番号３～５の何れかに示されるアミノ酸配列からなる請求項４又は５に記載のウイルス粒子。
  8. 請求項１～７の何れか１項に記載のウイルス様粒子であって、生理活性分子が抗体結合ドメインであり、該抗体結合ドメインに抗体が結合してなるウイルス様粒子。
  9. 請求項１～８の何れか１項に記載のウイルス様粒子を用いた免疫学的測定用ブロッキング剤であって、当該ブロッキング剤が、ヒドロキシアルキルセルロース、ポリビニルアルコール、エチレンオキサイド／プロピレンオキサイド共重合体、及び２－メタクリロイルオキシエチルホスホコリンで構成される共重合体からなる群より選択される少なくとも１種を含むブロッキング剤。
  10. 前記エチレンオキサイド／プロピレンオキサイド共重合体が、プルロニック（登録商標）である請求項９に記載のブロッキング剤。
  11. ２－メタクリロイルオキシエチルホスホコリンで構成される共重合体が、バイオリピジュア（登録商標）である、請求項９に記載のブロッキング剤。
  12. 請求項１～８の何れか１項に記載のウイルス様粒子と請求項９～１２の何れか１項に記載のブロッキング剤を含む免疫学的測定用キット。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2021500367A (ja) * 2017-10-24 2021-01-07 エヴォックス・セラピューティクス・リミテッド 操作された細胞外小胞の親和性精製
WO2022124288A1 (ja) * 2020-12-07 2022-06-16 大日本塗料株式会社 粒状物質をイムノクロマトグラフィー法によって検出する方法及びそのためのキット
WO2024075847A1 (ja) * 2022-10-06 2024-04-11 積水メディカル株式会社 非特異反応抑制剤、非特異反応抑制剤の使用方法、非特異反応抑制方法、生化学的測定用試薬、検体前処理液、及び生化学的測定用試薬キット

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL3489685T3 (pl) 2011-11-21 2024-03-18 Zoetis Services Llc Sygnał amplifikacji w testach immunologicznych z przepływem bocznym i pokrewnych
TWI691716B (zh) 2014-08-13 2020-04-21 美商艾巴希斯公司 電漿特異性結合搭配物檢定中之信號放大
WO2017024163A1 (en) 2015-08-04 2017-02-09 Abaxis, Inc. Signal amplification in solution-based plasmonic specific-binding partner assays
KR20240039224A (ko) * 2017-01-30 2024-03-26 조에티스 서비시즈 엘엘씨 용액-기반 플라스몬 특이적-결합 파트너 검정 및 금속성 나노구조체
CN108918479A (zh) * 2018-04-04 2018-11-30 苏州遵道生物科技有限公司 定量检测白细胞介素-6的时间分辨荧光免疫层析试纸条及其制备方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001066309A (ja) * 1998-12-28 2001-03-16 Sekisui Chem Co Ltd ウイルス抗原の調製法
JP2005500257A (ja) * 2001-03-14 2005-01-06 ダコサイトメーション・デンマーク・アクティーゼルスカブ 新規なｍｈｃ分子構築物、ならびに診断および処置のためにこれらの構築物を用いる方法、ならびにｍｈｃ分子の使用
WO2005001480A1 (en) * 2003-06-27 2005-01-06 Proteome Systems Intellectual Property Pty Ltd Method of isolating a protein
JP2008191143A (ja) * 2007-01-11 2008-08-21 Toray Ind Inc 免疫学的測定用ビオチン化ナノ粒子
WO2013041730A1 (en) * 2011-09-23 2013-03-28 Universität Stuttgart Please note that the status of the person identified in Box 1 changed from Applicant for all designated States except US to Applicant for all designated States. Serum half-life extension using immunoglobulin binding domains
JP2014100095A (ja) * 2012-11-20 2014-06-05 Kyushu Univ タンパク質検出用融合タンパク質およびタンパク質の検出方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7776322B2 (en) * 2004-08-16 2010-08-17 Stefan Kochanek Modified viral vector particles

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001066309A (ja) * 1998-12-28 2001-03-16 Sekisui Chem Co Ltd ウイルス抗原の調製法
JP2005500257A (ja) * 2001-03-14 2005-01-06 ダコサイトメーション・デンマーク・アクティーゼルスカブ 新規なｍｈｃ分子構築物、ならびに診断および処置のためにこれらの構築物を用いる方法、ならびにｍｈｃ分子の使用
WO2005001480A1 (en) * 2003-06-27 2005-01-06 Proteome Systems Intellectual Property Pty Ltd Method of isolating a protein
JP2008191143A (ja) * 2007-01-11 2008-08-21 Toray Ind Inc 免疫学的測定用ビオチン化ナノ粒子
WO2013041730A1 (en) * 2011-09-23 2013-03-28 Universität Stuttgart Please note that the status of the person identified in Box 1 changed from Applicant for all designated States except US to Applicant for all designated States. Serum half-life extension using immunoglobulin binding domains
JP2014100095A (ja) * 2012-11-20 2014-06-05 Kyushu Univ タンパク質検出用融合タンパク質およびタンパク質の検出方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YAMAMOTO S ET AL.: "In situ fabrication of ionic polyacrylamide-based preconcentrator on a simple poly(methyl methacrylate) microfluidic chip for capillary electrophoresis of anionic compounds", ANAL CHEM., vol. 80, 2008, pages 8224 - 8230 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2021500367A (ja) * 2017-10-24 2021-01-07 エヴォックス・セラピューティクス・リミテッド 操作された細胞外小胞の親和性精製
JP7328217B2 (ja) 2017-10-24 2023-08-16 エヴォックス・セラピューティクス・リミテッド 操作された細胞外小胞の親和性精製
US11975070B2 (en) 2017-10-24 2024-05-07 Evox Therapeutics Ltd Affinity purification of engineered extracellular vesicles
WO2022124288A1 (ja) * 2020-12-07 2022-06-16 大日本塗料株式会社 粒状物質をイムノクロマトグラフィー法によって検出する方法及びそのためのキット
JP7451385B2 (ja) 2020-12-07 2024-03-18 大日本塗料株式会社 粒状物質をイムノクロマトグラフィー法によって検出する方法及びそのためのキット
WO2024075847A1 (ja) * 2022-10-06 2024-04-11 積水メディカル株式会社 非特異反応抑制剤、非特異反応抑制剤の使用方法、非特異反応抑制方法、生化学的測定用試薬、検体前処理液、及び生化学的測定用試薬キット

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