WO2016006628A1 - Ｒｎａ－タンパク質複合体及びこれによるｒｎａおよびタンパク質のデリバリーシステム - Google Patents

Ｒｎａ－タンパク質複合体及びこれによるｒｎａおよびタンパク質のデリバリーシステム Download PDF

Info

Publication number
WO2016006628A1
WO2016006628A1 PCT/JP2015/069634 JP2015069634W WO2016006628A1 WO 2016006628 A1 WO2016006628 A1 WO 2016006628A1 JP 2015069634 W JP2015069634 W JP 2015069634W WO 2016006628 A1 WO2016006628 A1 WO 2016006628A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
rna
sequence
protein
bases
sequences
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2015/069634
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
博英 齊藤
江里子 長田
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kyoto University NUC
Original Assignee
Kyoto University NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kyoto University NUC filed Critical Kyoto University NUC
Priority to US15/324,446 priority Critical patent/US20170327600A1/en
Priority to EP15818679.1A priority patent/EP3173482B1/en
Priority to JP2016532953A priority patent/JPWO2016006628A1/ja
Publication of WO2016006628A1 publication Critical patent/WO2016006628A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2318/00—Antibody mimetics or scaffolds
    • C07K2318/20—Antigen-binding scaffold molecules wherein the scaffold is not an immunoglobulin variable region or antibody mimetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/10—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a tag for extracellular membrane crossing, e.g. TAT or VP22
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/13—Decoys
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering nucleic acids [NA]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3513—Protein; Peptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific

Definitions

  • the present invention relates to an RNA-protein complex having a specific structure and a method for using the same.
  • nanoscale structures using biomolecules are being constructed, and in the field of protein engineering, new creation of enzymes by molecular design is being attempted.
  • the “material” used in these attempts is a nucleic acid or protein.
  • Triangular structures have been reported as structures produced using such nucleic acids and proteins (Patent Document 1 and Non-Patent Document 1).
  • An object of the present invention is to provide an RNA or protein delivery system utilizing the characteristics of an RNA-protein complex or a functional RNA-protein complex having a novel structure.
  • the present invention has been made to solve the above problems. That is, according to one embodiment of the present invention, in order to further enhance the recognition ability of the cell using an RNA-protein complex containing a protein that specifically recognizes a cell surface antigen, the RNA structure is appropriately selected. And using an RNA-protein complex. According to another embodiment of the present invention, the function is exhibited using an RNA-protein complex containing a functional RNA and a functional protein.
  • RNA and protein delivery system using an RNA-protein complex comprising the following (1) to (3): (1) RNA comprising the following sequences (i) to (iv); (I) three or more sequences forming an RNA-protein binding motif, (Ii) two or more sequences of 15 bases or more, (Iii) a 5 ′ end sequence, and (iv) a 3 ′ end sequence, The 5 ′ terminal sequence of (iii) and the 3 ′ terminal sequence of (iv) are a total of 15 bases or more, (2) RNA comprising the following sequence; (A) three or more sequences forming an RNA-protein binding motif together with (i) of (1) above, (B) one or more sequences complementary to the sequence of 15 bases or more in (ii) of (1) above, (C) a sequence that is consecutively complementary to the 5 ′ terminal sequence and the 3 ′ terminal sequence of (iii) of (1) above, (D) a 5 ′ end sequence, and (
  • RNA-protein binding motif of (i) in (1) There are three sequences forming the RNA-protein binding motif of (i) in (1), and three sequences forming the RNA-protein binding motif of (a) in (2)
  • the number of sequences of 15 bases or more of (ii) of (1) is two, and the number of sequences complementary to the sequence of 15 bases or more of (b) of (2) is [1] The system described in.
  • [3] The sum of the sequence of (1), the 5 ′ terminal sequence of (iii) of (1) and the 3 ′ terminal sequence of (iv), the sequence of (b) of (2), or (d)
  • RNA-protein binding motif formed in (i) of (1) and (a) of (2) is a K-turn motif and forms the RNA-protein binding motif of (3)
  • the system according to any one of [1] to [4], wherein the protein to be processed is L7Ae.
  • RNA-protein complex comprising the following (1) to (4); (1) RNA comprising the following sequences (i) to (iii); (I) a sequence forming an RNA-protein binding motif, (Ii) two sequences of 7 bases or more, and (iii) siRNA sequences, (2) RNA comprising the following sequences (a) to (d); (A) a sequence that forms an RNA-protein binding motif together with (i) of (1) (b) 14 bases that are consecutively complementary to the two or more sequences of (ii) of (1) above 2 or more of the above sequences, (C) a 5 ′ end sequence, and (d) a 3 ′ end sequence, The 5 ′ terminal sequence of (c) and the 3 ′ terminal sequence of (d) are complementary in sequence to the sequence of 7 bases or more of (ii) of (1), (3) at least one protein that forms an RNA-protein binding motif with RNA formed in (i) of (1) and (a) of (2), and (4) ((1) of (1) RNA comprising
  • the RNA of (1) is three, the sequence of 14 bases or more of (b) of (2) is two, and the RNA of (4) is three. 9.
  • the sequence (ii) of (1) is 7 to 85 bases, and the sequence (b) of (2) is 14 to 92 bases [9] or [9]
  • the RNA-protein binding motif formed in (i) of (1) and (a) of (2) is a K-turn motif, and the protein of (3) is L7Ae.
  • RNA according to any one of [9] to [12], wherein the protein of (3) is a fusion protein further comprising a protein that specifically recognizes a cell surface antigen or a membrane-permeable peptide. -Protein complex.
  • the membrane-permeable peptide is AntP, HIV-derived TAT, Penetratin, Buforin II, Transportan, MAP, K-FGF, Ku70, Prion, pVEC, Pep-1, Pep-7, SynB1, HN-I and
  • the RNA-protein complex according to [13] which is a peptide selected from the group consisting of HSV-derived VP22.
  • RNA and protein delivery system using the RNA-protein complex according to any one of [14].
  • An RNA inhibitor comprising the RNA-protein complex according to any one of [9] to [14].
  • a method for degrading intracellular mRNA comprising a step of bringing a cell into contact with the RNA-protein complex according to any one of [9] to [14].
  • RNA comprising the following sequence; (I) three or more sequences forming an RNA-protein binding motif, (Ii) two or more sequences of 15 bases or more, and (iii) a 5 ′ terminal sequence and a 3 ′ terminal sequence consisting of a sequence of 15 bases or more in total, (2) RNA comprising the following sequence; (A) three or more sequences forming an RNA-protein binding motif together with (i) of (1) above, (B) one or more sequences complementary to the sequence of 15 bases or more in (ii) of (1) above, (C) a sequence complementary to the 5 ′ terminal sequence and the 3 ′ terminal sequence of (iii) of (1) above, and (d) a sequence of 15 bases or more of (ii) of (1) above Complementary 5 ′ terminal sequence and 3 ′ terminal sequence, and (3) RNA-protein binding motif with RNA formed in (i) of (1) and (a) of (2) At least one fusion protein comprising a protein and a protein that specifically recognizes a cell surface anti
  • RNA comprising the following sequences (i) to (iii); (I) a sequence forming an RNA-protein binding motif, (Ii) two sequences of 7 bases or more, and (iii) siRNA sequences, (2) RNA comprising the following sequences (a) to (d); (A) a sequence that forms an RNA-protein binding motif together with (i) of (1) (b) 14 bases that are consecutively complementary to the two or more sequences of (ii) of (1) above 2 or more of the above sequences, (C) a 5 ′ end sequence, and (d) a 3 ′ end sequence, The 5 ′ terminal sequence of (c) and the 3 ′ terminal sequence of (d) are complementary in sequence to the sequence of 7 bases or more of (ii) of (1), (3) including at least a protein that forms an RNA-protein binding motif with the RNA formed in (i) of (1) and (a) of (2), and a protein that specifically recognizes a cell surface antigen, One fusion protein, and (4) an
  • the target cell is stronger than the recognition ability that can be achieved by the protein alone. Can be recognized, which is advantageous.
  • an RNA-protein complex containing a functional RNA can be used to exert the function of the RNA, a combination of each functional protein and functional RNA can be used to maintain an RNA that has a desired function.
  • protein complexes can be provided.
  • FIG. 1 shows the structure of RNA (LS-15 RNA, LS-26 RNA, LS-48 RNA, LS-70 RNA, and LS-92 RNA) of each RNA-protein complex.
  • FIG. 2A shows the results of gel shift assay when various concentrations of L7Ae were added to LS-15 RNA. The right side of the figure shows the structure of the assumed RNA-protein complex in each band.
  • FIG. 2B shows the results of gel shift assay when various concentrations of L7Ae were added to LS-26 RNA. The right side of the figure shows the structure of the assumed RNA-protein complex in each band.
  • FIG. 2C shows the results of gel shift assay when each concentration of L7Ae was added to LS-48 RNA.
  • FIG. 2D shows the results of gel shift assay when various concentrations of L7Ae were added to LS-70 RNA.
  • the right side of the figure shows the structure of the assumed RNA-protein complex in each band.
  • FIG. 2E shows the results of gel shift assay when each concentration of L7Ae was added to LS-92 RNA.
  • the right side of the figure shows the structure of the assumed RNA-protein complex in each band.
  • Figure 2F shows the results of LS-26, LS-26 mut1 , LS-26 mut2, LS-26 gel shift assay upon addition of L7Ae for each concentration to mut3.
  • FIG. 3 shows the case where L7Ae is added to each RNA-protein complex RNA (LS-15LSRNA, LS-26 RNA, LS-48 RNA, LS-70 RNA, and LS-92 RNA) (+ L7Ae) or A high-speed AFM- (HS-AFM) image is shown when L7Ae is not added (-L7Ae).
  • L7Ae RNA-protein complex RNA
  • H-AFM high-speed AFM-
  • FIG. 4 shows a LS-26, LS-26 mut1, LS-26 mut2, when adding L7Ae to LS-26 mut3 (+ L7Ae) or was not added L7Ae (- L7Ae) to delivers high speed AFM (HS -AFM) image.
  • Figure 5 shows a LS-26, LS-26 mut1 , LS-26 mut2, in the case of adding L7Ae to LS-26 mut3, a result of measuring the uptake of L7Ae of RNA- protein complex.
  • FIG. 6 shows time-lapse images (30 sec, 35 sec, and 85 sec) analyzed by high-speed AFM (HS-AFM) when L7Ae was added to LS-26.
  • FIG. 7 shows the results of gel shift assay after Phenol treatment and 20% FBS were added to LS-26 or RNA-protein complex (Tri-26) and incubated for 30, 60 or 120 minutes.
  • FIG. 8 shows the results of gel shift assay after adding Phenol treatment and 20% human serum to LS-26 or RNA-protein complex (Tri-26) and incubating for 30 minutes, 60 minutes or 120 minutes.
  • FIG. 9A shows a schematic diagram of an RNA-protein complex having an Affibody.
  • FIG. 9B shows high-speed AFM (HS-AFM) images of LS-26 with or without L7Ae-Affibody fusion (+ L7Ae-Affibody) or without (-L7Ae-Affibody).
  • H-AFM high-speed AFM
  • FIG. 10A shows the results of gel shift assay when each concentration of L7Ae-Affibody fusion was added to LS-15 RNA.
  • the right side of the figure shows the structure of the assumed RNA-protein complex in each band.
  • FIG. 10B shows the results of gel shift assay when each concentration of L7Ae-Affibody fusion was added to LS-26 RNA.
  • the right side of the figure shows the structure of the assumed RNA-protein complex in each band.
  • FIG. 10C shows the results of gel shift assay when each concentration of L7Ae-Affibody fusion was added to LS-48 RNA.
  • the right side of the figure shows the structure of the assumed RNA-protein complex in each band.
  • FIG. 10D shows the results of gel shift assay when each concentration of L7Ae-Affibody fusion was added to LS-70 RNA.
  • the right side of the figure shows the structure of the assumed RNA-protein complex in each band.
  • FIG. 10E shows the results of gel shift assay when each concentration of L7Ae-Affibody fusion was added to LS-92 RNA.
  • the right side of the figure shows the structure of the assumed RNA-protein complex in each band.
  • RNA-protein complex Tri-15-AFB, Tri-26-AFB, Tri-48-AFB, Tri-70-AFB, and Tri-92-
  • FIG. 12A shows RNA-protein complex (Tri-26-AFB) having Affibody added to each breast cancer cell line (SKBR3, MCF-7 and MDA-MB-231). The fluorescence intensity which means the amount of protein complex is shown.
  • FIG. 12A shows RNA-protein complex (Tri-26-AFB) having Affibody added to each breast cancer cell line (SKBR3, MCF-7 and MDA-MB-231). The fluorescence intensity which means the amount of protein complex is shown.
  • FIG. 12B shows stained images (Alexa 647 (RNA) after adding RNA-protein complex (Tri-26-AFB) having Affibody to each breast cancer cell line (SKBR3, MCF-7 and MDA-MB-231). Present), Hoechst (presents cell nuclei)).
  • Figure 13 is a breast cancer cell line (SKBR3) to have each variant motifs and Affibody RNA-protein complexes (Tri-26-AFB, Tri -26 mut1 -AFB, Tri-26 mut2 -AFB, and Tri-26 mut3 - When AFB) is added, the fluorescence intensity means the amount of RNA-protein complex bound to the cells.
  • FIG. 14 shows the structure of RNA of RNA-protein complex (LS-26-siGFP RNA).
  • FIG. 15 shows a high-speed AFM (HS-AFM) image of LS-26-siGFP RNA with or without L7Ae added (+ L7Ae) or without (-L7Ae). The left figure shows an enlarged image of the right figure.
  • FIG. 16 shows the presence of Dicer with sh-GFP as a positive control when L7Ae is added or not added to RNA containing L1, L2, L3, S, and AS, which are components of LS-26-siGFP-RNA, in each combination. The result of the gel shift assay at the time of contacting with substrate sh-GFP under or absence is shown.
  • an RNA and protein delivery system using an RNA-protein complex is provided.
  • a delivery system is a system that delivers a desired substance to a target. In the present invention, it can also be called an RNA-protein complex for delivering RNA and / or protein to cells.
  • RNA-protein complex of the present invention is a first RNA-protein complex comprising the following (1) to (3); (1) a first RNA comprising the following sequences (i) to (iv); (I) three or more sequences forming an RNA-protein binding motif, (Ii) two or more sequences of 15 bases or more, (Iii) a 5 ′ end sequence, and (iv) a 3 ′ end sequence,
  • the 5 ′ terminal sequence of (iii) and the 3 ′ terminal sequence of (iv) are a total of 15 bases or more
  • RNA containing a sequence forming an RNA-protein binding motif is the RNA side contained in the binding motif between RNA and protein in a natural or known RNA-protein complex, Alternatively, it is the RNA side contained in the artificial RNA-protein binding motif obtained by the in vitro evolution method (invitro selection method).
  • a sequence that forms a natural RNA-protein binding motif is usually composed of about 5 to 30 bases, and is specific to a protein having a specific amino acid sequence noncovalently, that is, by hydrogen bonding. It is known to form bonds. Sequences forming such natural RNA-protein binding motifs are listed in Tables 1 and 2 below, and the database available on the website: http: // gibk26. bse. kyutech. ac. jp / jouhou / image / dna-protein / RNA / RNA. From html, a motif that causes a desired structural change can be appropriately selected and obtained.
  • RNA-protein binding motif preferably used in this embodiment can be estimated from the three-dimensional structure of a homologous protein that has already undergone an X-ray crystal structure analysis or NMR structure analysis or a structural analysis. Motif. Furthermore, the protein is preferably a motif that specifically recognizes the secondary structure and base sequence of RNA.
  • the RNA containing a sequence that forms an artificial RNA-protein binding motif is the RNA side in the binding motif between RNA and protein in an artificially designed RNA-protein complex.
  • the base sequence of such RNA is usually composed of about 10 to 80 bases, and forms a specific bond with a specific amino acid sequence of a specific protein non-covalently, that is, by hydrogen bonding.
  • An RNA aptamer that specifically binds to a specific protein is exemplified as the RNA containing a sequence that forms such an artificial RNA-protein binding motif.
  • An RNA aptamer that specifically binds to a desired target protein can be obtained by, for example, an evolutionary engineering method known as in vitro selection method or SELEX method.
  • the trigger protein at this time is a protein to which the RNA aptamer binds.
  • the RNA sequences listed in Table 3 below are known, and these can also be used as sequences forming the RNA-protein binding motif of the present invention.
  • the sequence forming the RNA-protein binding motif preferably has a dissociation constant Kd with the corresponding protein of about 0.1 nM to about 1 ⁇ M.
  • variants of such sequences are also encompassed by the sequences according to the present invention.
  • the mutant described in the present invention is a mutation having a dissociation constant Kd of 10%, 20%, 30%, 40% or 50% or more higher than a protein that specifically binds to a sequence forming an RNA-protein binding motif. Body or 10%, 20%, 30%, 40% or 50% or less mutant. Such mutants can be appropriately selected and used as long as an RNA-protein complex can be formed.
  • the base sequence of such a variant can hybridize under stringent conditions with a nucleic acid (complementary strand) having a sequence complementary to the sequence (positive strand) forming the RNA-protein binding motif.
  • a base sequence of a degree may be used.
  • the stringent conditions here are the melting temperature (Tm) of the nucleic acid to be bound as taught by Berger and Kimmel (1987, GuideGto Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology, Vol.152, Academic Press, San Diego CA). Can be determined based on For example, as washing conditions after hybridization, the conditions of about “1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, 37 ° C.” can be mentioned.
  • the complementary strand is preferably one that maintains a hybridized state with the target positive strand even when washed under such conditions.
  • washing is performed under more severe hybridization conditions such as “0.5 ⁇ SSC, 0.1% SDS, 42 ° C.”, more strictly “0.1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, 65 ° C.”
  • the conditions for maintaining the hybridized state between the positive strand and the complementary strand can be mentioned. Specifically, it comprises a base sequence having at least 90%, preferably at least 95%, 96%, 97%, 98% or 99% sequence identity with the RNA sequence contained in the RNA-protein binding motif described above. .
  • Such mutants can maintain a constant bond with a protein that specifically binds to a sequence that forms an RNA-protein binding motif and contribute to the formation of an RNA-protein complex.
  • RNA-protein binding motif A specific example of the sequence forming the RNA-protein binding motif according to this embodiment is a sequence to which L7Ae (Moore T et al., Structure Vol. 12, pp. 807-818 (2004)) binds. boxC motif (5′-GGCGUGAUGAGC-3 ′) (SEQ ID NO: 1), kink-loop (SEQ ID NO: 2), and kink-loop2 (SEQ ID NO: 3).
  • MS2 stem loop motif 22: Keryer-Bibens C, Barreau C, Osborne HB (2008) Tethering of proteins to RNAs by bacteriophage proteins. Biol Cell 100: 125-138
  • Fr15 24: Batey RT, Williamson JR (1996) Interaction of the Bacillus stearothermophilus ribosomal protein S15 with 16 S rRNA: I. Defining the minimal RNA . J Mol Biol 261: 536-549).
  • a further specific example is an enzyme that performs aminoacylation, which is known to have Threonyl-tRNA synthetase (Cell (Cambridge, Mass.) V97, which binds to its own mRNA and has feedback inhibition that inhibits translation.
  • pp.371-381 (1999)) is a sequence to which 5′-GGCGGUAUGUGAUCUUUCGUUGUGGUCACCACUGCGCC-3 ′ (SEQ ID NO: 4), and variants thereof.
  • R9-2 5′-GGGGUGUCGAGCGUAGGAAGAAAGCCGGGGGGCUGGCAGAUAAUGUUAUAGC-3 ′ (SEQ ID NO: 5), which is a base sequence forming an RNA-protein binding motif derived from Bcl-2 family CED-9, which is a cancer cell-specific endogenous protein , And variants thereof, nucleotide sequences derived from aptamers of RNA sequences that bind to NF-kappaB, and variants thereof.
  • a sequence of 15 bases or more, (iii) a 5 ′ terminal sequence, and (iv) a 3 ′ terminal sequence included in the first RNA included in the first RNA-protein complex of the present invention is arbitrary.
  • the sequence may be a sequence, but preferably includes sequences that do not include sequences complementary to each other and do not take tertiary structure with the first RNA alone.
  • the total of the 5 ′ terminal sequence of (iii) and the 3 ′ terminal sequence of (iv) contained in the first RNA included in the first RNA-protein complex of the present invention is 15 bases or more.
  • the 5 ′ terminal sequence and the 3 ′ terminal sequence are linked, it means 15 bases or more.
  • the 3 ′ terminal sequence has 14 bases or more. It means that there is.
  • the first RNA contained in the first RNA-protein complex of the present invention is, for example, (5 'terminal sequence)-(sequence forming an RNA-protein binding motif)-[(sequence of 15 bases or more)- (Sequence forming an RNA-protein binding motif) n- (3 ′ terminal sequence) in this order, where “-” means ligation, [(sequence of 15 bases or more)-(RNA-protein binding Sequence Forming Motif)] n means that the linked sequence is repeated n times. The repetition is exemplified by 2 to 10 times.
  • [(sequence of 15 bases or more)-(sequence forming an RNA-protein binding motif)] is 2 repetitions, that is, The first RNA is one RNA having three sequences forming an RNA-protein binding motif and two sequences having 15 bases or more.
  • the sequence that forms the RNA-protein binding motif together with the sequence contained in the first RNA contained in the second RNA contained in the first RNA-protein complex of the present invention is the RNA-protein binding motif described above. Is a sequence that assists in the formation of the motif. Depending on the RNA-protein binding motif to be selected, the sequence may be omitted, for example, complementary to a part of the RNA-protein binding motif. It is an array containing an array. For example, when the sequence forming the RNA-protein binding motif contained in the first RNA is boxC motif (SEQ ID NO: 1), the sequence is boxD motif (SEQ ID NO: 6). Double-stranded RNA that forms a protein-binding motif is sometimes referred to as K-turn.
  • the 5 ′ terminal sequence and the 3 ′ terminal sequence included in the first RNA, which are included in the second RNA included in the first RNA-protein complex of the present invention, are consecutively complementary sequences. This means a sequence that is complementary to the sequence of RNA in which the 5 ′ terminal sequence and the 3 ′ terminal sequence are linked and in the order 3 ′ terminal sequence ⁇ 5 ′ terminal sequence. Since it is desirable that the 5 ′ terminal sequence and the 3 ′ terminal sequence included in the first RNA have a total of 15 bases or more, the complementary sequence included in the second RNA may also include 15 bases or more. desirable.
  • the 5 ′ terminal sequence and the 3 ′ terminal sequence contained in the second RNA contained in the first RNA-protein complex of the present invention are continuously complementary to a sequence of 15 bases or more contained in the first RNA.
  • target means that the 5 ′ terminal sequence and the 3 ′ terminal sequence are linked to form an RNA sequence consisting of 3 ′ terminal sequence ⁇ 5 ′ terminal sequence in the order of 15 bases or more contained in the first RNA. Means complementary to the sequence. Therefore, it is desirable that the 5 'terminal sequence and the 3' terminal sequence contained in the second RNA have 15 bases or more in total.
  • the second RNA contained in the first RNA-protein complex of the present invention is, for example, (5 ′ terminal sequence)-(sequence that forms an RNA-protein binding motif with the first RNA)-[(first Comprising a sequence complementary to a sequence of 15 bases or more contained in RNA of RNA)-(sequence forming an RNA-protein binding motif together with the first RNA)] n- (3 ′ terminal sequence), One (sequence complementary to a sequence of 15 bases or more contained in the first RNA) to (sequence complementary to the 5 ′ terminal sequence and 3 ′ terminal sequence contained in the first RNA) It is obtained by replacing.
  • the second RNA is: One RNA having three sequences that form an RNA-protein binding motif together with the first RNA and one sequence complementary to a sequence of 15 bases or more contained in the first RNA.
  • the fusion protein means a protein in which two or more kinds of proteins are functionally linked. Functionally linked means that the protein is linked so as to function, and examples include linkage via a spacer sequence.
  • the spacer sequence is preferably an arbitrary 2 to 200 amino acid sequence.
  • the amino acid sequence of the spacer sequence is not particularly limited as long as it does not adversely affect the function of the protein contained in the fusion protein, but is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 28.
  • the fusion protein (3) comprises at least a protein that forms an RNA-protein binding motif.
  • the protein can be appropriately selected according to the RNA of the RNA-protein binding motif. Although it does not specifically limit, For example, it is the protein (protein) of Table 1, Table 2, and Table 3. In one embodiment of the present invention, when the RNA-protein binding motif is K-turn, L7Ae (Moore T et al., Structure Vol. 12, pp. 807-818 (2004)) is exemplified.
  • At least one fusion protein (3) contained in the first RNA-protein complex of the present invention has a function of specifically recognizing a cell surface antigen in addition to a function of forming an RNA-protein binding motif.
  • a fusion protein of a protein forming an RNA-protein binding motif and a protein having a function of specifically recognizing a cell surface antigen is particularly preferred.
  • a protein having a function of specifically recognizing a cell surface antigen is a protein that specifically binds to a cell surface antigen, and examples thereof include an antibody, a ligand protein, and an Affibody.
  • Affibody is a protein produced by modifying a part of Protein A IgG binding domain, and an Affibody that binds to a desired cell surface antigen can be appropriately selected by screening.
  • cell surface protein is HER2
  • Affibody is (ZHER2: 342) 2 (Lina E., et al., PLOS ONE 2012, 7, 11, e49579), Anti-ErbB2 Affibody Molecule (ab31889) (Abcam) And the like.
  • the number of proteins contained in the RNA-protein complex depends on the number of sequences forming the RNA-protein binding motif contained in the first RNA, it is possible to contain 3 or more. is there. At least one of the three or more proteins may be the fusion protein (3), and may contain two or more fusion proteins (3). When two or more (3) fusion proteins are included, these may be the same (3) fusion proteins or different (3) fusion proteins.
  • the protein that forms the RNA-protein binding motif can be a specific protein that binds depending on the sequence that forms the RNA-protein binding motif. By changing and fusing the desired protein to this, the desired protein can be included in the RNA-protein complex.
  • the protein included in the RNA-protein complex may optionally include one or more fusion proteins including proteins that form RNA-protein binding motifs and other functional proteins.
  • examples of other functional proteins include membrane permeable peptides, signal peptides, endosome release peptides, and cytotoxic proteins.
  • the fusion protein may be a protein comprising two or more other functional proteins having different functions, such as a protein that forms an RNA-protein binding motif and a cell surface antigen. It may be a fusion protein of a protein and a membrane permeable peptide. Alternatively, it may be a fusion protein of these and a protein containing an endosome release peptide.
  • the membrane-permeable peptide is Drosophila-derived AntP, HIV-derived TAT (Frankel, A. et al, Cell 55, 1189-93 (1988) or Green, M. & Loewenstein, P. M. Cell. 55, 1179-88 (1988)), Penetratin (Derossi, D. et al, J. Biol. Chem. 269, 10444-50 (1994)), Buforin II (Park, C. B. et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA 97, 8245-50 (2000)), Transportan (Pooga, M. et al. FASEB J.
  • a signal peptide is an amino acid sequence involved in transport or localization of a protein to a specific organelle in the cell.
  • the organelle include nucleus, cytoplasm, endoplasmic reticulum, mitochondria, Golgi apparatus, and peroxisome.
  • a signal peptide that is exemplified and can be transported and localized in a desired organelle that is desired to exert its function can be appropriately selected.
  • a signal peptide capable of cytoplasmic transport is preferable, and an example of such a signal peptide is a nuclear export signal (NES). (WO 2012/008361).
  • NES include, but are not limited to, peptides having the following amino acid sequences.
  • LPPLERLTL (SEQ ID NO: 7] (NES sequence derived from HIV-1 Rev protein)
  • LALKLAGLDI (NES sequence derived from PKI- ⁇ )
  • SLEGAVSEISLRD [SEQ ID NO: 10] (NES sequence derived from Dsk-1)
  • LPVLENLTL [SEQ ID NO: 11] (TFIIIA-derived NES sequence)
  • LASLMNLGMS [SEQ ID NO: 12] (NES sequence derived from Matrin3)
  • examples of the cytotoxic protein include proteins that induce immune cells, proteins that induce cell death, and proteins that cause pores in the cell membrane.
  • proteins that induce immune cells include antibody Fc sites, complements, etc.
  • proteins that induce cell death include ⁇ -galactosidase, diphtheria toxin, Pseudomonas toxin, ricin, cholera toxin, retinoblastoma gene, p 53, Herpes simplex thymidine kinase, chickenpox-zoster thymidine kinase, cytosine deaminase, nitroreductase, cytochrome p-4502 B1, thymidine phosphorylase, purine nucleoside phosphorylase, alkaline phosphatase, carboxypeptidase A and G2, linamarase, ⁇ -lactamase And xanthine oxidase, and examples of proteins that cause pores
  • the endosome release peptide means that the structure taken up by endocytosis escapes from the endosome by the effect of this peptide, and the structure is transferred to the cytoplasm, thereby preventing the degradation by the lysosome.
  • hemagglutinin and GALA of influenza viruses are exemplified.
  • the complex can be transferred to the cytoplasm.
  • the RNA-protein complex delivered to the target cell is transported from the cell surface to the inside and trapped in the endosome, it can exert the function of knocking down the expression of the target gene by moving to the cytoplasm .
  • the sequence of 15 bases or more contained in the first RNA-protein complex of the present invention may have no particular upper limit. For example, 150 bases or less, 100 bases or less, 92 bases or less, 90 bases or less, 80 bases Hereinafter, it is a sequence of 70 bases or less, 60 bases or less, 50 bases or less, or 48 bases or less, and more preferably a sequence of 26 bases.
  • the first RNA-protein complex of the present invention comprises a step of designing each of the first RNA, second RNA, fusion protein or protein constituting the first RNA-protein complex so as to have the molecular characteristics described above, Mixing the first RNA, the second RNA, and the fusion protein under conditions known to those skilled in the art by obtaining each of the first RNA, the second RNA, the fusion protein or the protein by a conventional genetic engineering technique. And a step of forming a complex.
  • the first RNA, the second RNA, the fusion protein or the protein can be obtained by an in vitro synthesis method using a template DNA containing a promoter sequence as a template.
  • the step of forming a complex can be performed by preparing an RNA duplex under conditions for hybridizing an RNA strand known per se, and then contacting with a protein.
  • the first RNA-protein complex thus formed is used for carrying out an RNA and protein delivery system in an aqueous solution system.
  • RNA or protein contained in the RNA-protein complex can be appropriately selected.
  • cell recognition efficiency can be increased by appropriately selecting the length of the RNA sequence.
  • the sequence of RNA can be performed by appropriately changing the sequence of 15 bases or more, 5 'terminal sequence, and 3' terminal sequence contained in the RNA. In particular, it can be carried out by appropriately changing the number of bases of a sequence of 15 bases or more contained in the RNA and the total number of bases of the 5 'terminal sequence and 3' terminal sequence.
  • the change can be carried out particularly from the viewpoint of increasing the binding ability of the cell surface antigen. Therefore, by measuring the binding ability to a desired cell surface antigen using the first RNA-protein complex in which the number of bases is appropriately changed, the number of bases that enhance cell recognition ability can be determined.
  • RNA is usually easily degraded in the presence of serum, but the present invention can be carried out in the presence of serum by forming the complex.
  • serum the serum of the same origin as the cell used as object is illustrated, For example, fetal bovine serum, human serum, etc. are mentioned.
  • One embodiment of the implementation in the presence of serum is exemplified by intravenous administration of the first RNA-protein complex to a target organism.
  • RNA-protein complex of the present invention is a second RNA-protein complex comprising the following (1) to (4); (1) a first RNA comprising the following sequences (i) to (iii); (I) a sequence forming an RNA-protein binding motif, (Ii) two sequences of 7 bases or more, and (iii) siRNA sequences, (2) a second RNA comprising the following sequences (a) to (d); (A) a sequence that forms an RNA-protein binding motif together with (i) of (1) (b) 14 bases that are consecutively complementary to the two or more sequences of (ii) of (1) above 2 or more of the above sequences, (C) a 5 ′ end sequence, and (d) a 3 ′ end sequence, The 5 ′ terminal sequence of (c) and the 3 ′ terminal sequence of (d) are complementary in sequence to the sequence of 7 bases or more of (ii) of (1), (3) at least one protein that forms an RNA-protein binding motif with RNA formed in (i) of (1)
  • the sequence that forms the RNA-protein binding motif contained in the first RNA used in the second RNA-protein complex of the present invention, and the sequence that forms the RNA-protein binding motif together with the first RNA, are as described above. The same as the first RNA-protein complex can be used.
  • sequence of 7 or more bases contained in the first RNA of the second RNA-protein complex of the present invention may be any sequence, but preferably a sequence complementary to the other 7 or more base sequences. Examples are sequences that do not include the first RNA alone and do not take tertiary structure.
  • the siRNA sequence contained in the first RNA of the second RNA-protein complex of the present invention is one RNA sequence of double-stranded RNA constituting the siRNA, and any mRNA that is a target of RNA interference And preferably a sequence of 18 to 35 bases.
  • Such sequences can be searched using search software provided free of charge on various websites. Examples of such sites include the siRNA Target Finder (http://www.ambion.com/jp/techlib/misc/siRNA_finder.html) and the pSilencer TM Expression Vector insert design tool (http://www.ambion.com/jp/techlib/misc/siRNA_finder.html).
  • the first RNA of the second RNA-protein complex of the present invention is, for example, 5 ′ (siRNA sequence)-(sequence of 7 bases or more)-(sequence forming RNA-protein binding motif)-(7 bases
  • the above sequence) is arranged in the order of 3 'or 5' (sequence of 7 bases or more)-(sequence forming RNA-protein binding motif)-(sequence of 7 bases or more)-(siRNA sequence) 3 '.
  • first RNAs are preferably contained, and examples thereof include 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 and the like. Most preferably 3.
  • the first RNA of the RNA-protein complex may have a different sequence from each other or may be composed of the same sequence. However, it is desirable not to include sequences complementary to each other in order to avoid binding between the first RNAs.
  • a sequence of 14 bases or more that is complementary to two sequences of 7 bases or more contained in the first RNA contained in the second RNA of the second RNA-protein complex of the present invention is the first sequence.
  • a sequence on the 3 ′ end side of a sequence of 7 bases or more contained in one RNA and a sequence on the 5 ′ end side of a sequence of 7 bases or more contained in another first RNA are generated.
  • a sequence complementary to the sequence is meant.
  • the number of sequences contained in the second RNA of 14 bases or more that are complementary to two or more sequences of 7 bases or more contained in the first RNA is the first RNA contained in the second RNA-protein complex. When the number of the first RNA is three, the number of sequences of 14 bases or more contained in the second RNA is two.
  • the 5 ′ terminal sequence and the 3 ′ terminal sequence contained in the second RNA of the second RNA-protein complex of the present invention are successively complementary to a sequence of 7 bases or more contained in the first RNA.
  • Is a part of the sequence of RNA in which the 5 ′ end sequence and the 3 ′ end sequence are linked to each other in the order of 3 ′ end sequence ⁇ 5 ′ end sequence, and the 5 ′ end sequence and 3 ′ end sequence Means that the sequence including any of the terminal sequences is complementary to a sequence of 7 bases or more contained in the first RNA, and more preferably an RNA comprising the sequence of 3 ′ end sequence-5 ′ end sequence Is a sequence on the 3 ′ end side of 7 bases or more contained in the first RNA and a sequence on the 5 ′ end side of 7 bases or more contained in the other first RNA.
  • the 3 ′ terminal sequence and the 5 ′ terminal sequence included in the second RNA are 14 bases or more in total.
  • the 3 ′ terminal sequence included in the second RNA is 13 bases
  • the 5 ′ terminal sequence contained in the RNA is one or more bases.
  • the second RNA of the second RNA-protein complex of the present invention is, for example, (5 ′ terminal sequence)-(sequence that forms an RNA-protein binding motif together with the first RNA)-[(first RNA2 A sequence of 14 bases or more complementary to a sequence of 7 bases or more)-(sequence that forms an RNA-protein binding motif with the first RNA)] m- (3 ′ terminal sequence), Any one (sequence complementary to a sequence of 15 bases or more contained in the first RNA) is continuously complementary to the 5 ′ terminal sequence and the 3 ′ terminal sequence contained in the first RNA. Array).
  • the number m of repeats of the portion surrounded by “[” and “]” in the second RNA is one less than the number of the first RNA, and in the case of two repeats, RNA-protein together with the first RNA It is an RNA having three sequences that form a binding motif.
  • the protein contained in the second RNA-protein complex of the present invention may be the same as the protein or protein fusion of (3) described in the above-mentioned first RNA-protein complex.
  • the protein comprised in the RNA-protein complex in one embodiment of the present invention may comprise a protein fusion comprising other functional proteins in addition to the protein forming the RNA-protein binding motif.
  • the number of proteins contained in the second RNA-protein complex of the present invention depends on the number of the first RNA, so that there are three or more types.
  • a specific protein can be used depending on the sequence that forms the RNA-protein binding motif. Therefore, the sequence that forms the RNA-protein binding motif is appropriately changed.
  • the desired protein can be included in the RNA-protein complex.
  • a fusion protein comprising a protein that forms an RNA-protein binding motif and a fusion protein comprising a protein that specifically recognizes a cell surface antigen, and a protein that forms an RNA-protein binding motif and other functional proteins
  • An RNA-protein complex containing two or more of can be formed.
  • the third RNA containing a sequence complementary to the siRNA sequence contained in the RNA of the second RNA-protein complex of the present invention is a sequence complementary to the siRNA sequence of (1) (iii) described above. These are sequences that can form siRNA by forming a duplex with the siRNA sequence and exert its effects. Accordingly, it is preferable that the third RNA has a sequence in which two bases located on the 3 'end side thereof do not form a complementary strand with the siRNA sequence of (1) (iii). Desirably, the third RNA is included in the RNA-protein complex in the same number as the first RNA.
  • a sequence that promotes transport of the complex to the cytoplasm is further added to the 5 ′ end of the first RNA or the 3 ′ end of the third RNA contained in the second RNA-protein complex of the present invention.
  • Such sequences that facilitate transport to the cytoplasm include tRNA sequences. Since tRNA is one of the promoters that recognize RNA polymerase and also functions as a cytoplasmic transport signal, it may help the siRNA function of the second RNA-protein complex of the present invention to be exerted. (Japanese Patent No. 3831785).
  • the second RNA-protein complex of the present invention has a function of siRNA contained in the complex, it can be used as an RNA inhibitor. Furthermore, it can be used in a method for suppressing mRNA corresponding to the siRNA sequence in the cell by introducing the second RNA-protein complex into the cell.
  • the method for introducing the second RNA-protein complex into the cell can be carried out in the same manner as the method for introducing the first RNA-protein complex into the cell.
  • Such a method can also be referred to as a method for degrading intracellular mRNA, which comprises the step of contacting the cell with an RNA-protein complex. At this time, the contact with the cell can be performed in vivo or in vitro.
  • RNA or protein contained in the RNA-protein complex can be appropriately selected.
  • the cell recognition ability can be increased by appropriately selecting the length of the RNA sequence.
  • the RNA sequence can be changed by appropriately changing two 7-base or more sequences, 5 'terminal sequence, and 3' terminal sequence contained in the RNA.
  • the RNA can be carried out by appropriately changing the number of bases of two or more 7 base sequences contained in the RNA and the total number of bases of the 5 'terminal sequence and 3' terminal sequence.
  • the change can be carried out particularly from the viewpoint of increasing the binding ability of the cell surface antigen. Therefore, by measuring the binding ability to a desired cell surface antigen using the second RNA-protein complex in which the number of bases is appropriately changed, the number of bases that enhance cell recognition ability can be determined.
  • the sequence (ii) of (1) in the second RNA-protein complex, using the binding ability to a cell surface antigen as an index, the sequence (ii) of (1), (1 It can also be said to be a method of selecting the base length of the sequence (iii) in (), the sequence (b) in (2) and the sequence (d) in (2).
  • Triangular RNA-protein complex (Tri-RNP, FIG. 1) was prepared as described in Ohno, H. et al., Nat. Nanotechnol. 2011, 6, 116. Specifically, it has a K-turn RNA motif at the apex, and each side is long (L-RNA) and short (S-RNA) of 15, 26, 48, 70, and 92 bases, respectively.
  • DsRNAs consisting of LS-15 (L-15: SEQ ID NO: 13 and S-15: SEQ ID NO: 14), LS-26 (L-26: SEQ ID NO: 15 and S-26: SEQ ID NO: 16), LS-48 (L- 48: SEQ ID NO: 17 and S-48: SEQ ID NO: 18), LS-70 (L-70 SEQ ID NO: 19 and S-70 SEQ ID NO: 20) and LS-92 (L-92 SEQ ID NO: 21 and S-92 SEQ ID NO: 22) (FIG. 1).
  • RNA was prepared using MEGAshortscript T7 kit (Ambion) based on the DNA template described above.
  • L-RNA and S-RNA were treated with an RNP-binding solvent (a solution comprising 150 ml KCl, 1.5 mM MgCl 2 and 20 mM HEPES-KOH (pH 7.5)) at 80 ° C. for 3 minutes, and then at room temperature. By cooling for 10 minutes, the RNAs were hybridized to produce a double-stranded RNA (LS-RNA) having a loop structure.
  • RNP-binding solvent a solution comprising 150 ml KCl, 1.5 mM MgCl 2 and 20 mM HEPES-KOH (pH 7.5)
  • L7Ae was prepared by transfection of E. coli (Rosetta (DE3) / pLysSpRARE2) with a plasmid (pET-28 (+) vector (Novagen) into which the L7Ae sequence was introduced).
  • Tri-15 Tri-26
  • Tri-48 Tri-70
  • Tri-92 Tri-92
  • one side has a length of approximately 13.7, 16.7, 22.6, 28.5 and 34.4 nm. It is thought.
  • Tri-RNP Tri-26 and Tri-48
  • HFM high-speed AFM
  • 10 ⁇ 2 ⁇ 0.1 ⁇ M cantilever BL-AC10EGS, Olympus
  • the cantilever was set with a spring constant of 0.1-0.2 N / m at 400-1000 KHz resonance frequency.
  • the probe was deposited on the cantilever with an electron beam.
  • a mica surface was coated with 0.1% APTES, and a 50 nM sample dissolved in an RNP binding solvent and an AFM observation solvent (20 mM Tris-HCl (pH 7.6) and 10 mM MgCl2) was left on mica. Images were analyzed using software such as ImageJ and WSxM.
  • LS-RNAs of five different sizes exhibited a loop structure in the structure of double-stranded RNA.
  • L7Ae when contacted with L7Ae, it was confirmed to exhibit a triangular structure.
  • the state of RNA binding to the K-turn motif is confirmed as a dot at the apex of Tri-RNP, the inside of the triangle surrounded by three sides is confirmed as a cavity, and when it is contacted with L7Ae, it has a single structure (Fig. 3). In Tri-92, however, the triangular structure was confirmed to be slightly deformed.
  • mutant K-turn motifs (mut box C: SEQ ID NO: 23, mut box D: SEQ ID NO: 24) one, two or three with LS-RNA (Tri-26 mut1 , Tri-26 mut2 and Tri -26 mut3 ) was confirmed by EMSA.
  • EMSA the structural change according to the number of each mutant K-turn motif was confirmed (FIG. 4).
  • n 114, 135, 93, and 188 structures were measured and the ratio of structure formation was calculated.
  • the content ratio of the L7Ae and K-turn motifs and the ratio of the confirmed actual structure were (Fig. 5). From these results, it was confirmed that the interaction between the three L7Ae and the K-turn motif was performed at the apex of the triangle.
  • RNA-protein complex RNP structural change from time-lapse image
  • HS-AFM RNA-protein complex
  • changes in RNA structure after addition of L7Ae were observed by time-lapse imaging (FIG. 6). From time-lapse images, it was confirmed that when L7Ae was directly bound to three LS-26 K-turn motifs, the K-turn motif was bent at an angle of 60 degrees, and this structural change shifted to a triangular structure. On the other hand, it was also confirmed that the protein transitions from the triangular structure to the loop structure by dissociating the protein from the RNA.
  • RNA-protein complex (RNP) in the presence of serum was confirmed. Specifically, 20% FBS was added to 50 nM LS-26 or a mixture of 50 nM LS-26 and 300 nM L7Ae, incubated at 37 ° C for 0 min, 30 min, 60 min and 120 min, then 10 mM EDTA ( pH 8.0) and phenol were added, and electrophoresis was performed using polyacrylamide gel, and RNA stability was observed. As a result, it was confirmed that the formation of RNP in LS-26 in the presence of L7Ae enhances its stability in the serum-containing buffer (FIG. 7).
  • Tri-26-AFB When LS-26 was used as RNA (Tri-26-AFB), the triangular structure was confirmed by HS-AFM, and it was also confirmed that a substance presumed to be AFB was added to each vertex (FIG. 9B). ). Furthermore, L7Ae-AFB was confirmed to bind to the K-turn motif in the same manner as Tri-26 using EMSA (FIG. 10).
  • Tri-AFB binds to breast cancer cells. Specifically, remove the breast cancer cell line (SKBR3) (ATCC) culture medium, add Opti-MEM, then add 10 nM LS-RNA labeled with Alexa-647, or 10 nM Tri-AFB, The cells were cultured at 37 ° C. and 5% CO 2 for 1 hour. The binding of Tri-AFB to the cells after incubation was analyzed with a flow cytometer. As a result, Tri-26-AFB had the highest recognition ability (FIG. 11).
  • SKBR3 breast cancer cell line
  • Opti-MEM Opti-MEM
  • Tri-26-AFB Three different breast cancer cell lines (SKBR3 (HER2 strong positive), MCF-7 (HER2 weak positive) and MDA-MB-231 (HER2 negative)) were used to examine the selective recognition ability of Tri-26-AFB. In the same manner, it was confirmed that Tri-26-AFB selectively recognizes SKBR3 as expected (FIG. 12).
  • Tri-26 mutant having a mutation K-Turm motif Tri-26 mut1, Tri- 26 mut2 and Tri-26 mut3
  • the binding ability with SKBR3 was weakened (FIG. 13). This suggests that the increase in the number of binding between AFB and HER2 affected the recognition ability.
  • RNA can be transported to the target cell surface by using Tri-AFB.
  • RNPs capable of binding to cells have an optimal size.
  • the RNP shown in FIG. 14 was constructed. Specifically, S-26, L-26-1 (SEQ ID NO: 29), L-26-2 (SEQ ID NO: 30), L-26-3 so as to have siRNA for GFP on the three sides of LS-26. Five RNAs (SEQ ID NO: 31) and antisense-GFP (SEQ ID NO: 32) were hybridized in the same manner as described above to prepare LS-26-siGFP.
  • Tri-26-siGFP having a triangular structure was prepared by mixing LS-26-siGFP and L7Ae, and the structure was confirmed using HS-AFM. It was confirmed that the structure considered to have taken the expected shape (the upper part of FIG. 15). On the other hand, in the absence of L7Ae, it was confirmed to take a heterogeneous RNA structure (lower part of FIG. 15). From the above, a triangular structure (Tri-26-siGFP) having a structure containing three duplexes having siRNA function could be constructed.
  • Tri-26-siGFP Tri-26-siGFP
  • 500 nM LS-26-siGFPs (L-26-1, S-26 and antisense-GFP hybridized RNA, L-26-2, S-26 and antisense-GFP hybridized RNA , L-26-3, S-26 and antisense-GFP hybridized RNA and LS-26-siGFP) or 500 nM LS-26-siGFP and 3 ⁇ M L7Ae 1 ⁇ L of 10 mM ATP, 0.5 ⁇ L 50 mM MaCl 2 , 4 ⁇ L of Dicer Reaction buffer, 1 ⁇ L of recombinant Dicer (Genlantis) were added with water to 10 ⁇ L, and incubated at 37 ° C.
  • Tri-26-siGFP was confirmed to contribute to RNA cleavage by Dicer in the same manner as sh-GFP (SEQ ID NO: 33) used as a control (FIG. 16). Therefore, it was suggested that even if Tri-26-siGFP having a triangular structure by the interaction between L7Ae and the K-turn motif has an effect of siRNA without steric hindrance.
  • RNPs having a triangular structure can stabilize RNA and have functions of cell recognition, degradation of mRNA by siRNA, and inhibition.
  • Tri-26-siGFP As a positive control for Hela cells stably expressing GFP (Hela-GFP), 1 nM and 5 nM Tri-26-siGFP, 1 nM and 5 nM LS-26-siGFP, and 3 nM and 15 nM Each of the sh-GFP was transfected. The knockdown activity of GFP was measured by flow cytometry according to the expression level of GFP. As a result, it was shown that both Tri-26-siGFP and LS-26-siGFP can knock down GFP with an activity about 3 times that of sh-GFP.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

高次構造を有するＲＮＡ－タンパク質複合体を利用した、ＲＮＡおよびタンパク質のデリバリーシステム、および、新規高次構造を有するＲＮＡ－タンパク質複合体。

Description

ＲＮＡ－タンパク質複合体及びこれによるＲＮＡおよびタンパク質のデリバリーシステム
　本発明は、特異的な構造を有するＲＮＡ－タンパク質複合体とその使用方法に関する。
　ナノテクノロジーの分野において生体分子を用いたナノスケール構造体の構築が行われており、またタンパク質工学の分野では分子設計による酵素の新規創成が試みられている。それらの試みにおいて使用されている「材料」は核酸あるいはタンパク質である。
　このような核酸およびタンパク質を用いて作製された構造体として、三角形構造体が報告されている（特許文献１および非特許文献１）。
　しかし、このような三角形構造を有する核酸およびタンパク質から成る複合体の機能については知られておらず、その使用方法について具体的な報告はなされていない。
WO2010/010862
Ohno H, et al., Nat Nanotechnol. 2011 6:116-120.
　ＲＮＡ－タンパク質複合体の特性を利用したＲＮＡまたはタンパク質のデリバリーシステムまたは新規構造を有する機能性ＲＮＡ－タンパク質複合体の提供を目的とする。
　本発明は、上記課題を解決するためになされたものである。すなわち、本発明は、一実施の形態によれば、細胞表面抗原を特異的に認識するタンパク質を含むＲＮＡ－タンパク質複合体を用いて当該細胞の認識能をより高めるため、ＲＮＡ構造を適宜選択してＲＮＡ－タンパク質複合体を用いることを特徴とする。
　本発明は、別の実施の形態によれば、機能性ＲＮＡおよび機能性タンパク質を含むＲＮＡ－タンパク質複合体を利用して当該機能を発揮させることを特徴とする。
　すなわち、本発明は以下の特徴を有する：
[１]次の（１）から（３）を含むＲＮＡ－タンパク質複合体による、ＲＮＡおよびタンパク質のデリバリーシステム。
（１）次の（i）から（iv）の配列を含むＲＮＡ；
（i）ＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成する配列を３つ以上、
（ii）１５塩基以上の配列を２つ以上、
（iii）５’末端配列、および
（iv）３’末端配列であって、
当該（iii）の５’末端配列および（iv）の３’末端配列が合計して１５塩基以上の配列であり、
（２）次の配列を含むＲＮＡ；
（a）前記（１）の（i）と共にＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成する配列を３つ以上、
（b）前記（１）の（ii）の１５塩基以上の配列に相補的な配列を１つ以上、
（c）前記（１）の（iii）の５’末端配列および３’末端配列に連続して相補的な配列、
（d）５’末端配列、および
（e）３’末端配列であって、
当該（d）の５’末端配列および（e）の３’末端配列が、前記（１）の（ii）の１５塩基以上の配列に連続して相補的であり、ならびに
（３）前記（１）の（i）および前記（２）の（a）で形成されるＲＮＡとＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成するタンパク質および細胞表面抗原を特異的に認識するタンパク質を含む、少なくとも１つの融合タンパク質。
[２]前記（１）の（i）のＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成する配列が３つであり、前記（２）の（a）のＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成する配列が３つであり、前記（１）の（ii）の１５塩基以上の配列が２つであり、ならびに前記（２）の（b）の１５塩基以上の配列に相補的な配列が１つである、[１]に記載のシステム。
[３]前記（１）の配列、前記（１）の(iii)の５’末端配列および（iv）の３’末端配列の合計、前記（２）の（b）の配列、または（d）に前記（２）の(d)の５’末端配列および（e）の３’末端配列の合計が、１５塩基以上９２塩基以下である、[１]または[２]に記載のシステム。
[４]前記（１）の配列、前記（１）の(iii)の５’末端配列および（iv）の３’末端配列の合計、前記（２）の（b）の配列、または（d）に前記（２）の(d)の５’末端配列および（e）の３’末端配列の合計を、細胞表面抗原への結合能を高めるように、塩基長が適宜選択されている、[１]から[３]のいずれか１項に記載のシステム。
[５]前記（１）の（i）および前記（２）の（a）で形成されるＲＮＡ－タンパク質結合モチーフが、Ｋ-ｔｕｒｎモチーフであり、前記（３）のＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成するタンパク質が、L7Aeである、[１]から[４]のいずれか１項に記載のシステム。
[６]前記（３）の細胞表面抗原を特異的に認識するタンパク質が、HER2を認識するタンパク質である、[１]から[５]のいずれか１項に記載のシステム。
[７]前記HER2を認識するタンパク質が、Affibodyである、[６]に記載のシステム。
[８]血清存在下でデリバリーが行われる、[１]から[７]のいずれか１項に記載のシステム。
[９]次の（１）から（４）を含むＲＮＡ－タンパク質複合体；
（１）次の（i）から（iii）の配列を含むＲＮＡ；
（i）ＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成する配列、
（ii）７塩基以上の配列を２つ、および
（iii）ｓｉＲＮＡ配列、
（２）次の（a）から（d）の配列を含むＲＮＡ；
（a）前記（１）の（i）と共にＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成する配列
（b）前記（１）の前記（ii）の２つの７塩基以上の配列に連続して相補的な１４塩基以上の配列を２つ以上、
（c）５’末端配列、および
（d）３’末端配列であって、
当該（c）の５’末端配列および（d）の３’末端配列が、前記（１）の前記（ii）の７塩基以上の配列に連続して相補的であり、
（３）前記（１）の（i）および前記（２）の（a）で形成されるＲＮＡとＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成するタンパク質を少なくとも１つ、ならびに
（４）前記（１）の（iii）のｓｉＲＮＡ配列に相補的な配列を含むＲＮＡ。
[１０] 前記（１）のＲＮＡが３つであり、前記（２）の（b）の１４塩基以上の配列を２つであり、および前記（４）のＲＮＡが３つである、請求項９に記載のＲＮＡ－タンパク質複合体。
[１１]前記（１）の（ii）の配列が、７塩基以上８５塩基以下であり、前記（２）の（b）の配列が、１４塩基以上９２塩基以下である、[９]または[１０]に記載のＲＮＡ－タンパク質複合体。
[１２]前記（１）の（i）および前記（２）の（a）で形成されるＲＮＡ－タンパク質結合モチーフが、Ｋ-ｔｕｒｎモチーフであり、前記（３）のタンパク質が、L7Aeである、[９]から[１１]のいずれか１項に記載のＲＮＡ－タンパク質複合体。
[１３]前記（３）のタンパク質が、細胞表面抗原を特異的に認識するタンパク質または膜透過性ペプチドをさらに含む融合タンパク質である、[９]から[１２]のいずれか１項に記載のＲＮＡ－タンパク質複合体。
[１４]前記膜透過性ペプチドが、AntP、HIV由来のTAT、Penetratin、Buforin II、Transportan、MAP、K-FGF、Ku70、Prion、pVEC、Pep-1、Pep-7、SynB1、HN-IおよびHSV由来のVP22から成る群より選択されるペプチドである、[１３]に記載のＲＮＡ－タンパク質複合体。
　[９]から[１４]のいずれか１項に記載のＲＮＡ－タンパク質複合体による、ＲＮＡおよびタンパク質のデリバリーシステム。
[１５][９]から[１４]のいずれか１項に記載のＲＮＡ－タンパク質複合体を含む、ＲＮＡ阻害剤。
[１６][９]から[１４]のいずれか１項に記載のＲＮＡ－タンパク質複合体と細胞を接触させる工程を含む、細胞内のｍＲＮＡを分解する方法。
[１７]前記ＲＮＡ－タンパク質複合体と細胞を血清存在下で接触させる、[１６]に記載の方法。
[１８]（１）次の配列を含むＲＮＡ；
（i）ＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成する配列を３つ以上、
（ii）１５塩基以上の配列を２つ以上、ならびに
（iii）合わせて１５塩基以上の配列から成る５’末端配列および３’末端配列、
（２）次の配列を含むＲＮＡ；
（a）前記（１）の（i）と共にＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成する配列を３つ以上、
（b）前記（１）の（ii）の１５塩基以上の配列に相補的な配列を１つ以上、
（c）前記（１）の（iii）の５’末端配列および３’末端配列に連続して相補的な配列、および
（d）前記（１）の（ii）の１５塩基以上の配列に連続して相補的な５’末端配列および３’末端配列、ならびに
（３）前記（１）の（i）および前記（２）の（a）で形成されるＲＮＡとＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成するタンパク質および細胞表面抗原を特異的に認識するタンパク質を含む、少なくとも１つの融合タンパク質、
を含むＲＮＡ－タンパク質複合体において、細胞表面抗原への結合能を指標として、前記（１）の（ii）の配列、前記（１）の（iii）の配列、前記（２）の（b）の配列、および前記（２）の（d）の配列の塩基長を選択する方法。
[１９]（１）次の（i）から（iii）の配列を含むＲＮＡ；
（i）ＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成する配列、
（ii）７塩基以上の配列を２つ、および
（iii）ｓｉＲＮＡ配列、
（２）次の（a）から（d）の配列を含むＲＮＡ；
（a）前記（１）の（i）と共にＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成する配列
（b）前記（１）の前記（ii）の２つの７塩基以上の配列に連続して相補的な１４塩基以上の配列を２つ以上、
（c）５’末端配列、および
（d）３’末端配列であって、
当該（c）の５’末端配列および（d）の３’末端配列が、前記（１）の前記（ii）の７塩基以上の配列に連続して相補的であり、
（３）前記（１）の（i）および前記（２）の（a）で形成されるＲＮＡとＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成するタンパク質および細胞表面抗原を特異的に認識するタンパク質を含む、少なくとも１つの融合タンパク質、ならびに
（４）前記（１）の（iii）のｓｉＲＮＡ配列に相補的な配列を含むＲＮＡ、
を含むＲＮＡ－タンパク質複合体において、細胞表面抗原への結合能を指標として、前記（１）の（ii）の配列、および前記（２）の（b）の配列の塩基長を選択する方法。
　本発明によれば、本発明で提供される細胞表面抗原への結合能を有するタンパク質を含むＲＮＡ－タンパク質複合体を用いることで、タンパク質単独によって成し得る認識能よりもより強く対象となる細胞を認識することができるため、有利である。また、機能的ＲＮＡを含むＲＮＡ－タンパク質複合体を用いても当該ＲＮＡの機能が発揮されることから、各機能的タンパク質および機能的ＲＮＡの組み合わせを用いることで、所望の機能を保持するＲＮＡ－タンパク質複合体を提供できるため、有利である。
図１は、各ＲＮＡ－タンパク質複合体のＲＮＡ（LS-15 RNA、LS-26 RNA、LS-48 RNA、LS-70 RNA、およびLS-92 RNA）の構造を示す。 図２Aは、LS-15 RNAへ各濃度のL7Aeを添加した際のゲルシフトアッセイの結果を示す。図右に、各バンドにおける想定されるＲＮＡ－タンパク質複合体の構造を示す。図２Bは、LS-26 RNAへ各濃度のL7Aeを添加した際のゲルシフトアッセイの結果を示す。図右に、各バンドにおける想定されるＲＮＡ－タンパク質複合体の構造を示す。図２Cは、LS-48 RNAへ各濃度のL7Aeを添加した際のゲルシフトアッセイの結果を示す。図右に、各バンドにおける想定されるＲＮＡ－タンパク質複合体の構造を示す。図２Dは、LS-70 RNAへ各濃度のL7Aeを添加した際のゲルシフトアッセイの結果を示す。図右に、各バンドにおける想定されるＲＮＡ－タンパク質複合体の構造を示す。図２Eは、LS-92 RNAへ各濃度のL7Aeを添加した際のゲルシフトアッセイの結果を示す。図右に、各バンドにおける想定されるＲＮＡ－タンパク質複合体の構造を示す。図２Fは、LS-26、LS-26mut1、LS-26mut2、LS-26mut3へ各濃度のL7Aeを添加した際のゲルシフトアッセイの結果を示す。図右に、各バンドにおける想定されるＲＮＡ－タンパク質複合体の構造を示す。 図３は、各ＲＮＡ－タンパク質複合体のＲＮＡ（LS-15 RNA、LS-26 RNA、LS-48 RNA、LS-70 RNA、およびLS-92 RNA）へL7Aeを添加した場合（+ L7Ae）またはL7Aeを添加しなかった場合（- L7Ae）にける高速AFM (HS-AFM)像を示す。各上図は下図を拡大した像を示す。 図４は、LS-26、LS-26mut1、LS-26mut2、LS-26mut3へL7Aeを添加した場合（+ L7Ae）またはL7Aeを添加しなかった場合（- L7Ae）にける高速AFM (HS-AFM)像を示す。 図５は、LS-26、LS-26mut1、LS-26mut2、LS-26mut3へL7Aeを添加した場合における、ＲＮＡ－タンパク質複合体中のL7Aeの取り込み量を測定した結果を示す。 図６は、LS-26へL7Aeを添加した時の高速AFM (HS-AFM)で解析したタイムラプス像（30 sec、35 sec、および85 sec）を示す。上図には、構造の模式図を示す。 図７は、LS-26またはＲＮＡ－タンパク質複合体（Tri-26）へPhenol処理および20% FBSを添加して30分、60分または120分インキュベートした後のゲルシフトアッセイの結果を示す。 図８は、LS-26またはＲＮＡ－タンパク質複合体（Tri-26）へPhenol処理および20% ヒト血清を添加して30分、60分または120分インキュベートした後のゲルシフトアッセイの結果を示す。 図９Aは、Affibodyを有するＲＮＡ－タンパク質複合体の模式図を示す。図９Bは、L7Ae-Affibody融合体を添加（+L7Ae-Affibody）または非添加（-L7Ae-Affibody）のLS-26の高速AFM (HS-AFM)像を示す。左図は右図の拡大像を示す。 図１０Aは、LS-15 RNAへ各濃度のL7Ae-Affibody融合体を添加した際のゲルシフトアッセイの結果を示す。図右に、各バンドにおける想定されるＲＮＡ－タンパク質複合体の構造を示す。図１０Bは、LS-26 RNAへ各濃度のL7Ae-Affibody融合体を添加した際のゲルシフトアッセイの結果を示す。図右に、各バンドにおける想定されるＲＮＡ－タンパク質複合体の構造を示す。図１０Cは、LS-48 RNAへ各濃度のL7Ae-Affibody融合体を添加した際のゲルシフトアッセイの結果を示す。図右に、各バンドにおける想定されるＲＮＡ－タンパク質複合体の構造を示す。図１０Dは、LS-70 RNAへ各濃度のL7Ae-Affibody融合体を添加した際のゲルシフトアッセイの結果を示す。図右に、各バンドにおける想定されるＲＮＡ－タンパク質複合体の構造を示す。図１０Eは、LS-92 RNAへ各濃度のL7Ae-Affibody融合体を添加した際のゲルシフトアッセイの結果を示す。図右に、各バンドにおける想定されるＲＮＡ－タンパク質複合体の構造を示す。 図１１は、乳癌細胞株（SKBR3）へ各Affibodyを有するＲＮＡ－タンパク質複合体（Tri-15-AFB、Tri-26-AFB、Tri-48-AFB、Tri-70-AFB、およびTri-92-AFB）を添加した際に、当該細胞へ結合したＲＮＡ－タンパク質複合体量を意味する蛍光強度を示す。 図１２Aは、各乳癌細胞株（SKBR3、MCF-7およびMDA-MB-231）へAffibodyを有するＲＮＡ－タンパク質複合体（Tri-26-AFB）を添加した際に、当該細胞へ結合したＲＮＡ－タンパク質複合体量を意味する蛍光強度を示す。図１２Bは、各乳癌細胞株（SKBR3、MCF-7およびMDA-MB-231）へAffibodyを有するＲＮＡ－タンパク質複合体（Tri-26-AFB）を添加した後の染色像（Alexa 647（ＲＮＡを呈す）、Hoechst（細胞核を呈す））を示す。 図１３は、乳癌細胞株（SKBR3）へ各変異モチーフおよびAffibodyを有するＲＮＡ－タンパク質複合体（Tri-26-AFB、Tri-26mut1-AFB、Tri-26mut2-AFB、およびTri-26mut3-AFB）を添加した際に、当該細胞へ結合したＲＮＡ－タンパク質複合体量を意味する蛍光強度を示す。 図１４は、ＲＮＡ－タンパク質複合体のＲＮＡ（LS-26-siGFP RNA）の構造を示す。 図１５は、L7Aeを添加（+L7Ae）または非添加（-L7Ae）のLS-26-siGFP RNAの高速AFM (HS-AFM)像を示す。左図は右図の拡大像を示す。 図１６は、LS-26-siGFP RNAの構成要素であるL1、L2、L3、SおよびASを各組み合わせで含むＲＮＡにL7Aeを添加または非添加の場合もしくは陽性対照としてsh-GFPをDicerの存在下または非存在下で基質であるsh-GFPに接触させた際のゲルシフトアッセイの結果を示す。
　以下に、本発明を、実施形態を挙げて詳細に説明する。以下の実施形態は本発明を限定するものではない。
　本発明の一実施形態によれば、ＲＮＡ－タンパク質複合体による、ＲＮＡおよびタンパク質のデリバリーシステムを提供する。デリバリーシステムとは、標的物へ所望の物質を送達させるシステムであり、本発明においては、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を細胞へ送達するためのＲＮＡ－タンパク質複合体と言い換えることもできる。
　本発明のＲＮＡ－タンパク質複合体の一実施形態は、次の（１）から（３）を含む第一のＲＮＡ－タンパク質複合体である；
（１）次の（i）から（iv）の配列を含む第一のＲＮＡ；
（i）ＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成する配列を３つ以上、
（ii）１５塩基以上の配列を２つ以上、
（iii）５’末端配列、および
（iv）３’末端配列であって、
当該（iii）の５’末端配列および（iv）の３’末端配列が合計して１５塩基以上の配列であり、
（２）次の（a）から（e）の配列を含む第二のＲＮＡ；
（a）前記（１）の（i）と共にＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成する配列を３つ以上、
（b）前記（１）の（ii）の１５塩基以上の配列に相補的な配列を１つ以上、
（c）前記（１）の（iii）の５’末端配列および３’末端配列に連続して相補的な配列、
（d）５’末端配列、および
（e）３’末端配列であって、
当該（d）の５’末端配列および（e）の３’末端配列が、前記（１）の（ii）の１５塩基以上の配列に連続して相補的であり、ならびに
（３）前記（１）の（i）および前記（２）の（a）で形成されるＲＮＡとＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成するタンパク質および細胞表面抗原を特異的に認識するタンパク質を含む、少なくとも１つの融合タンパク質。
　本発明において、（１）の（i）ＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成する配列を含むＲＮＡとは、天然または既知のＲＮＡ－タンパク質複合体における、ＲＮＡとタンパク質との結合モチーフに含まれるＲＮＡ側、または試験管内進化法（in vitro selection法）により得られた人工的なＲＮＡ－タンパク質結合モチーフに含まれるＲＮＡ側である。
　天然のＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成する配列は、通常、約５～３０塩基で構成されており、特定のアミノ酸配列を保有するタンパク質と、非共有結合的に、すなわち水素結合により、特異的な結合を形成することが知られている。このような天然のＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成する配列は、以下の表１及び表２、及びウェブサイト上で利用できるデータベース：ｈｔｔｐ：／／ｇｉｂｋ２６．ｂｓｅ．ｋｙｕｔｅｃｈ．ａｃ．ｊｐ／ｊｏｕｈｏｕ／ｉｍａｇｅ／ｄｎａ－ｐｒｏｔｅｉｎ／ＲＮＡ／ＲＮＡ．ｈｔｍｌから、所望の構造変化を生ずるモチーフを適宜選択して入手することができる。本実施形態において好ましく用いられるＲＮＡ－タンパク質結合モチーフは、Ｘ線結晶構造解析またはＮＭＲによる構造解析が既に行われているモチーフ、あるいは構造解析がなされている相同タンパク質の立体構造から立体構造を推定可能なモチーフである。さらに、タンパク質がＲＮＡの二次構造及び塩基配列を特異的に認識するモチーフであることが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
  
　人工のＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成する配列を含むＲＮＡとは、人工的に設計したＲＮＡ－タンパク質複合体における、ＲＮＡとタンパク質との結合モチーフ中のＲＮＡ側である。このようなＲＮＡの塩基配列は、通常、約１０～８０塩基で構成されており、特定のタンパク質の特定のアミノ酸配列と、非共有結合的に、すなわち水素結合により、特異的な結合を形成するよう設計する。このような人工的なＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成する配列を含むＲＮＡとしては、特定のタンパク質に特異的に結合するＲＮＡアプタマーが例示される。標的となる所望のタンパク質に対し特異的に結合するＲＮＡアプタマーは、例えば、in vitro selection法またはSELEX法として知られている進化工学的手法より得ることができる。このときのトリガータンパク質は、当該ＲＮＡアプタマーが結合するタンパク質となる。例えば、以下の表３に挙げるＲＮＡ配列が知られており、これらもまた本発明のＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成する配列として用いることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
  
　本実施形態において、ＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成する配列は、対応するタンパク質との解離定数Ｋｄが、約０．１ｎＭ～約１μＭ程度であるものが好ましい。
　また、これらのＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成する配列自体に加え、このような配列の変異体も本発明による当該配列に包含される。本発明で述べる変異体とは、ＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成する配列に特異的に結合するタンパク質との間の解離定数Ｋｄが１０％、２０％、３０％、４０％または５０％以上高い変異体もしくは１０％、２０％、３０％、４０％または５０％以下の変異体である。このような変異体は、ＲＮＡ－タンパク質複合体が形成できる限り、適宜選択して用いることができる。また、このような変異体の塩基配列は、当該ＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成する配列（正鎖）に対する相補的な配列を有する核酸（相補鎖）とストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができる程度の塩基配列でもよい。ここでストリンジェントな条件は、Berger and Kimmel(1987,Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology,Vol.152,Academic Press,San Diego CA）に教示されるように、結合する核酸の融解温度(Tm)に基づいて決定することができる。例えばハイブリダイズ後の洗浄条件として、通常「1×SSC、0.1％SDS、37℃」程度の条件を挙げることができる。相補鎖は、かかる条件で洗浄しても対象とする正鎖とハイブリダイズ状態を維持するものであることが好ましい。特に制限されないが、より厳しいハイブリダイズ条件として「0.5×SSC、0.1％SDS、42℃」程度の洗浄条件、さらに厳しくは「0.1×SSC、0.1％SDS、65℃」程度の洗浄条件で洗浄しても正鎖と相補鎖とがハイブリダイズ状態を維持する条件を挙げることができる。具体的には、上述のＲＮＡ－タンパク質結合モチーフに含まれるＲＮＡの配列と少なくとも90％、好ましくは少なくとも95％、96％、97％、98％または99％の配列同一性を有する塩基配列からなる。かかる変異体は、ＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成する配列に特異的に結合するタンパク質との間で、一定の結合を保持し、ＲＮＡ－タンパク質複合体の形成に寄与することができる。
　本実施形態によるＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成する配列の具体的な例としては、Ｌ７Ａｅ（Ｍｏｏｒｅ　Ｔ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　Ｖｏｌ．　１２，　ｐｐ．　８０７－８１８　（２００４））が結合する配列である、boxC motif（５’－ＧＧＣＧＵＧＡＵＧＡＧＣ－３’）（配列番号１）、ｋｉｎｋ－ｌｏｏｐ（配列番号２）、ｋｉｎｋ－ｌｏｏｐ２（配列番号３）が挙げられる。
　別の具体例としては、ＭＳ２コートタンパク質が特異的に結合する配列であるＭＳ２ステムループモチーフ（22：Keryer-Bibens C, Barreau C, Osborne HB (2008) Tethering of proteins to RNAs by bacteriophage proteins. Biol Cell 100:125-138）、バチルスのリボソームタンパク質Ｓ１５が結合する配列であるＦｒ１５（24：Batey RT, Williamson JR (1996) Interaction of the Bacillus stearothermophilus ribosomal protein S15 with 16 S rRNA: I. Defining the minimal RNA site. J Mol Biol 261:536-549）が挙げられる。
　さらなる具体例には、アミノアシル化を行う酵素であって、自身のｍＲＮＡに結合し、翻訳を阻害するフィードバック阻害を持つことが知られているＴｈｒｅｏｎｙｌ－ｔＲＮＡ　ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（Ｃｅｌｌ　（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，　Ｍａｓｓ．）　ｖ９７，　ｐｐ．３７１－３８１　（１９９９））が結合する配列である、５’－ＧＧＣＧＵＡＵＧＵＧＡＵＣＵＵＵＣＧＵＧＵＧＧＧＵＣＡＣＣＡＣＵＧＣＧＣＣ－３’（配列番号４）、およびその変異体がある。また、癌細胞特異的な内在性タンパク質であるＢｃｌ－２ファミリーＣＥＤ－９由来のＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成する塩基配列である、Ｒ９－２；５’－ＧＧＧＵＧＣＵＵＣＧＡＧＣＧＵＡＧＧＡＡＧＡＡＡＧＣＣＧＧＧＧＧＣＵＧＣＡＧＡＵＡＡＵＧＵＡＵＡＧＣ－３’ （配列番号５）、およびその変異体、ＮＦ－ｋａｐｐａＢに結合するＲＮＡ配列のアプタマー由来の塩基配列およびその変異体が挙げられる。
　本発明の第一のＲＮＡ－タンパク質複合体に含まれる第一のＲＮＡに含まれる、（ii）１５塩基以上の配列、（iii）５’末端配列、および（iv）３’末端配列は任意の配列であって良いが、好ましくは互いに相補的な配列を含まず、第一のＲＮＡ単独で３次構造を取らない配列が例示される。
　本発明の第一のＲＮＡ－タンパク質複合体に含まれる第一のＲＮＡに含まれる、（iii）の５’末端配列および（iv）の３’末端配列が合計して１５塩基以上とは、当該５’末端配列と３’末端配列とが連結した場合において、１５塩基以上であることを意味し、例えば、５’末端配列が、１塩基であった場合、３’末端配列は１４塩基以上であることを意味する。
　本発明の第一のＲＮＡ－タンパク質複合体に含まれる第一のＲＮＡは、例えば、（５’末端配列）－（ＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成する配列）－［（１５塩基以上の配列）－（ＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成する配列）］ｎ－（３’末端配列）の順に構成され、ここで「－」は連結を意味し、［（１５塩基以上の配列）－（ＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成する配列）］ｎは連結した配列がｎ回繰り返されることを意味する。当該繰り返しは、例えば、２回から１０回が例示されるが、好ましくは、［（１５塩基以上の配列）－（ＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成する配列）］は２回の繰り返しであり、すなわち第一のＲＮＡは、ＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成する配列を３つ、１５塩基以上の配列を２つ有する１つのＲＮＡである。
　本発明の第一のＲＮＡ－タンパク質複合体に含まれる第二のＲＮＡに含まれる、第一のＲＮＡに含まれる配列と共にＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成する配列とは、上述したＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成する場合において、当該モチーフの形成を補助する配列であり、選択するＲＮＡ－タンパク質結合モチーフによっては、当該配列は省略することもでき、例えば、ＲＮＡ－タンパク質結合モチーフの一部に相補的な配列を含む配列である。例えば、第一のＲＮＡに含まれるＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成する配列が、boxC motif（配列番号１）である場合、当該配列は、boxD motif（配列番号６）であり、この場合のＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成する二本鎖ＲＮＡをK-turnと称することもある。
　本発明の第一のＲＮＡ－タンパク質複合体に含まれる第二のＲＮＡに含まれる、第一のＲＮＡに含まれる５’末端配列および３’末端配列に連続して相補的な配列とは、当該５’末端配列と３’末端配列とが連結して３’末端配列－５’末端配列の順で成るＲＮＡの配列に対して相補的な配列を意味する。第一のＲＮＡに含まれる５’末端配列および３’末端配列は、合わせて１５塩基以上であることが望ましいことから、第二のＲＮＡに含まれる相補的な配列も１５塩基以上であることが望ましい。
　本発明の第一のＲＮＡ－タンパク質複合体に含まれる第二のＲＮＡに含まれる、５’末端配列および３’末端配列が、第一のＲＮＡに含まれる１５塩基以上の配列に連続して相補的であるとは、当該５’末端配列と３’末端配列とが連結して３’末端配列－５’末端配列の順で成るＲＮＡの配列が、第一のＲＮＡに含まれる１５塩基以上の配列に対して相補的であることを意味する。従って、第二のＲＮＡに含まれる５’末端配列および３’末端配列は、合わせて１５塩基以上であることが望ましい。
　本発明の第一のＲＮＡ－タンパク質複合体に含まれる第二のＲＮＡは、例えば、（５’末端配列）－（第一のＲＮＡと共にＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成する配列）－［（第一のＲＮＡに含まれる１５塩基以上の配列に相補的な配列）－（第一のＲＮＡと共にＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成する配列）］ｎ－（３’末端配列）の順に構成され、いずれか、一つの（第一のＲＮＡに含まれる１５塩基以上の配列に相補的な配列）を、（第一のＲＮＡに含まれる５’末端配列および３’末端配列に連続して相補的な配列）に置き換えることによって得られる。第二のＲＮＡにおける“［”および“］”で囲まれる部分の繰り返しの数ｎは、第一のＲＮＡの繰り返しの数ｎと同一であり、２回の繰り返しの場合、第二のＲＮＡは、第一のＲＮＡと共にＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成する配列を３つ、第一のRNAに含まれる１５塩基以上の配列に相補的な配列を１つ有する１つのＲＮＡである。
　第一のＲＮＡ－タンパク質複合体に含まれるタンパク質は、少なくとも１つが、（３）の融合タンパク質であれば、残りの２つ以上は、ＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成するタンパク質であればよく、融合タンパク質でなくてもよい。本発明において融合タンパク質とは、2種類以上のタンパク質が機能的に連結しているタンパク質を意味する。機能的に連結しているとは、当該タンパク質が機能するように連結されていることを意味し、例えば、スペーサー配列を介しての連結が挙げられる。スペーサー配列は、任意の２～２００アミノ酸の配列とすることが好ましい。スペーサー配列のアミノ酸配列は、融合タンパク質に含まれるタンパク質の機能に悪影響を与えない配列であれば特に制限されないが、配列番号２８に記載のアミノ酸配列である。（３）の融合タンパク質は、ＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成するタンパク質を少なくとも含んでなる。当該タンパク質は、ＲＮＡ－タンパク質結合モチーフのＲＮＡに合わせて適宜選択することができる。特に限定されないが、例えば、表１、表２、表３に記載のタンパク質（蛋白質）である。本発明の一実施態様において、ＲＮＡ－タンパク質結合モチーフがK-turnである場合、L7Ae（Moore T et al., Structure Vol. 12, pp. 807-818 (2004)）が例示される。
　本発明の第一のＲＮＡ－タンパク質複合体に含まれる（３）の少なくとも一つの融合タンパク質は、ＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成する機能に加え、細胞表面抗原を特異的に認識する機能を有する融合タンパク質であり、例えば、ＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成するタンパク質と細胞表面抗原を特異的に認識する機能を有するタンパク質との融合タンパク質である。
　本発明において、細胞表面抗原を特異的に認識する機能を有するタンパク質とは、細胞表面抗原と特異的に結合するタンパク質であり、例えば、抗体、リガンドタンパク質、およびAffibodyが挙げられる。Affibodyは、Protein A のIgG 結合ドメインの一部を改変して作製したタンパク質であり、スクリーニングによって所望の細胞表面抗原と結合するAffibodyを適宜選択することができる。細胞表面タンパク質が、HER2であるとき、Affibodyとして、(ZHER2:342)2（Lina E., et al., PLOS ONE 2012, 7, 11, e49579）、Anti-ErbB2 Affibody Molecule (ab31889)（アブカム社）などが例示される。
　本発明において、ＲＮＡ－タンパク質複合体に含まれるタンパク質の数は、第一のＲＮＡに含まれるＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成する配列の数に依存するため、３つ以上を含有させることが可能である。３つ以上のタンパク質のうち、少なくとも１つが、（３）の融合タンパク質であればよく、２つ以上の（３）の融合タンパク質を含んでいてもよい。２つ以上の（３）の融合タンパク質を含む場合、これらは、同種の（３）の融合タンパク質であってもよく、異なる（３）の融合タンパク質であってもよい。ＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成するタンパク質は、ＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成する配列に依存し結合する、特異的なタンパク質を用いることが可能であるため、ＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成する配列を適宜変更し、かつ、これに所望のタンパク質を融合させることで、所望のタンパク質をＲＮＡ－タンパク質複合体に含ませることが可能となる。ＲＮＡ－タンパク質複合体に含まれるタンパク質は、任意選択的に、ＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成するタンパク質および他の機能的タンパク質を含む融合タンパク質を１種または２種以上含んでも良い。
　本発明において、他の機能的なタンパク質とは、膜透過性ペプチド、シグナルペプチド、エンドソームリリースペプチドまたは細胞障害性タンパク質などが例示される。
　本発明において、融合タンパク質は、互いに機能の異なる他の機能的なタンパク質を２種以上含んで成るタンパク質でもよく、例えば、ＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成するタンパク質、細胞表面抗原を特異的に認識するタンパク質および膜透過性ペプチドの融合タンパク質でも良い。あるいは、これらと、エンドソームリリースペプチド含むタンパク質の融合タンパク質であっても良い。
　本発明において、膜透過性ペプチドとは、ショウジョウバエ由来のAntP、HIV由来のTAT (Frankel, A. et al, Cell 55,1189-93 (1988)又はGreen, M. & Loewenstein, P. M. Cell 55, 1179-88 (1988))、Penetratin (Derossi, D. et al, J. Biol. Chem. 269, 10444-50 (1994))、Buforin II (Park, C. B. et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA 97, 8245-50 (2000))、Transportan (Pooga, M. et al. FASEB J. 12, 67-77 (1998))、MAP (model amphipathic peptide) (Oehlke, J. et al. Biochim. Biophys. Acta. 1414, 127-39 (1998))、K-FGF (Lin, Y. Z. et al. J. Biol. Chem. 270, 14255-14258 (1995))、Ku70 (Sawada, M. et al. Nature Cell Biol. 5, 352-7 (2003))、Prion (Lundberg, P. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 299, 85-90 (2002))、pVEC (Elmquist, A. et al. Exp. Cell Res. 269, 237-44 (2001))、Pep-1 (Morris, M. C. et al. Nature Biotechnol. 19, 1173-6 (2001))、Pep-7 (Gao, C. et al. Bioorg. Med. Chem. 10, 4057-65 (2002))、SynB1 (Rousselle, C. et al. Mol. Pharmacol. 57, 679-86 (2000))、HN-I (Hong, F. D. & Clayman, G L. Cancer Res. 60, 6551-6 (2000))、及びHSV由来のVP22等のタンパク質の細胞通過ドメインなどが例示される。膜透過性ペプチドを、ＲＮＡ－タンパク質複合体に含ませることにより、ＲＮＡ－タンパク質複合体を、細胞膜を透過させることにより細胞内部に輸送することが可能である。
　本発明において、シグナルペプチドとは、タンパク質の細胞内の特定のオルガネラに輸送または局在化に係わるアミノ酸配列であり、オルガネラとしては、核、細胞質、小胞体、ミトコンドリア、ゴルジ体、またはペルオキシソームなどが例示され、機能を発揮させたい所望のオルガネラに輸送および局在化するシグナルペプチドを適宜選択することができる。例えば、後述する第二のＲＮＡ－タンパク質複合体に含まれるｓｉＲＮＡの機能を発揮させたい場合、細胞質輸送を成し得るシグナルペプチが好ましく、そのようなシグナルペプチドとして核外輸送シグナル（NES）が例示される（WO 2012/008361）。NESの具体例としては、下記の配アミノ酸配列を有するペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
LPPLERLTL 　　　　　［配列番号７］（HIV-1 Revタンパク由来NES配列）
ALQKKLEELELDE 　　　［配列番号８］（MAPKK由来NES配列）
LALKLAGLDI　　　　　［配列番号９］（PKI-α由来NES配列）
SLEGAVSEISLRD 　　　［配列番号１０］（Dsk-1由来NES配列）
LPVLENLTL 　　　　　［配列番号１１］（TFIIIA由来NES配列）
LASLMNLGMS　　　　　［配列番号１２］（Matrin3由来NES配列）
　本発明において、細胞障害性タンパク質とは、免疫細胞を誘因するタンパク質、細胞死を誘発するタンパク質、細胞膜に孔を生じさせるタンパク質などが例示される。免疫細胞を誘因するタンパク質として、抗体のFc部位、補体などが例示され、細胞死を誘発するタンパク質として、β－ガラクトシダーゼ、ジフテリア毒素、シュードモナス毒素、リシン、コレラ毒素、網膜芽細胞腫遺伝子、p 53、単純ヘルペスチミジンキナーゼ、水痘－帯状疱疹チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ニトロレダクターゼ、シトクロムp-4502 B1、チミジンホスホリラーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、アルカリホスファターゼ、カルボキシペプチダーゼAおよびG2、リナマラーゼ(linamarase)、β－ラクタマーゼおよびキサンチンオキシダーゼが例示され、細胞膜に孔を生じさせるタンパク質として、パーフォリン、Bacillus thuringiensis A1470 株が産生するパラスポリンなどが例示される。細胞障害性タンパク質を、ＲＮＡ－タンパク質複合体に含ませることにより、ＲＮＡ－タンパク質複合体がデリバリーされた細胞において、免疫細胞の誘因、細胞死、細胞膜に孔を生じさせるなどの機能を発揮させることができる。
　本発明において、エンドソームリリースペプチドとは、エンドサイトーシスにより取り込まれた構造体が、このペプチドの効果によりエンドソームから脱出し、構造体を細胞質へ移行させることで、リソソームによる分解を回避する効果などを有するペプチドが例示される。例えば、インフルエンザウイルスのヘマグルチニンおよびGALAなどが例示される。エンドソームリリースペプチドをＲＮＡ－タンパク質複合体に含ませることにより、当該複合体を細胞質へ移行させることができる。例えば、標的細胞にデリバリーされるＲＮＡ－タンパク質複合体が細胞表面より内部に輸送され、エンドソームにトラップされた場合、細胞質に移行することで標的遺伝子の発現をノックダウンする機能を発揮させることができる。
　本発明の第一のＲＮＡ－タンパク質複合体に含まれる１５塩基以上の配列とは、特に上限はなくとも良いが、例えば、１５０塩基以下、１００塩基以下、９２塩基以下、９０塩基以下、８０塩基以下、７０塩基以下、６０塩基以下、５０塩基以下、４８塩基以下の配列であり、より好ましくは、２６塩基の配列である。
　本発明の第一のＲＮＡ－タンパク質複合体は、これを構成する第一のＲＮＡ、第二のＲＮＡ、融合タンパク質もしくはタンパク質のそれぞれを、上記の分子的特徴を備えるように設計する工程と、第一のＲＮＡ、第二のＲＮＡ、融合タンパク質もしくはタンパク質のそれぞれを通常の遺伝子工学的手法によって得る工程と、当業者に公知の条件下において第一のＲＮＡ、第二のＲＮＡ、融合タンパク質を混合し、複合体を形成させる工程とにより得ることができる。遺伝子工学的手法によって得る工程は、第一のＲＮＡ、第二のＲＮＡ、融合タンパク質もしくはタンパク質のそれぞれは、プロモーター配列を含むテンプレートDNAを鋳型として用いたin vitro合成法により、得ることができる。複合体を形成させる工程は、自体公知のＲＮＡ鎖をハイブリダイズする条件によりＲＮＡ二重鎖を作製後、タンパク質と接触させることによって行い得る。このように形成された第一のＲＮＡ－タンパク質複合体は、水溶液系でＲＮＡ及び蛋白質のデリバリーシステムを実施するために用いられる。
　本発明の第一のＲＮＡ－タンパク質複合体を利用したデリバリーシステムを用いる場合、タンパク質のみを用いるデリバリーシステムよりも細胞認識効率が上がることが確認されている。従って、より効率的なデリバリーを成し得るため、適宜ＲＮＡ－タンパク質複合体に含まれるＲＮＡまたはタンパク質を選択することができる。好ましくは、ＲＮＡの配列の長さを適宜選択することによって、細胞認識効率を上げることができる。ＲＮＡの配列は、当該ＲＮＡに含まれる１５塩基以上の配列、５’末端配列、および３’末端配列を適宜変更することで行い得る。特には、当該ＲＮＡに含まれる１５塩基以上の配列の塩基数、及び、５’末端配列、および３’末端配列の合計の塩基数を適宜変更することで行い得る。変更は、特には、細胞表面抗原の結合能を高める観点から実施することができる。したがって、塩基数を適宜変更した第一のＲＮＡ－タンパク質複合体を用いて、所望の細胞表面抗原に対する結合能を測定することで、細胞認識能が高くなる塩基数を決定することができる。この点で、本発明は、一実施形態によれば、第一のＲＮＡ－タンパク質複合体において、細胞表面抗原への結合能を指標として、前記（１）の（ii）の配列、前記（１）の（iii）の配列、前記（２）の（b）の配列、および前記（２）の（d）の配列の塩基長を選択する方法ということもできる。
　第一のＲＮＡ－タンパク質複合体を含むデリバリーシステムにおいて、ＲＮＡは通常血清の存在下では分解されやすいが、当該複合体を形成させることにより本発明は、血清存在下で実施することができ。血清としては、特に限定されないが、デリバリーシステムにおいて、対象となる細胞と同種起源の血清が例示され、例えば、ウシ胎児血清、ヒト血清等が挙げられる。血清存在下での実施の一つの態様として、第一のＲＮＡ－タンパク質複合体を対象となる生体に、静脈内投与することが例示される。
　本発明のＲＮＡ－タンパク質複合体の他の実施形態は、次の（１）から（４）を含む第二のＲＮＡ－タンパク質複合体である；
（１）次の（i）から（iii）の配列を含む第一のＲＮＡ；
（i）ＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成する配列、
（ii）７塩基以上の配列を２つ、および
（iii）ｓｉＲＮＡ配列、
（２）次の（a）から（d）の配列を含む第二のＲＮＡ；
（a）前記（１）の（i）と共にＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成する配列
（b）前記（１）の前記（ii）の２つの７塩基以上の配列に連続して相補的な１４塩基以上の配列を２つ以上、
（c）５’末端配列、および
（d）３’末端配列であって、
当該（c）の５’末端配列および（d）の３’末端配列が、前記（１）の前記（ii）の７塩基以上の配列に連続して相補的であり、
（３）前記（１）の（i）および前記（２）の（a）で形成されるＲＮＡとＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成するタンパク質を少なくとも１つ、ならびに
（４）前記（１）の（iii）のｓｉＲＮＡ配列に相補的な配列を含む第三のＲＮＡ。
　本発明の第二のＲＮＡ－タンパク質複合体において用いられる第一のＲＮＡに含まれるＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成する配列、および第一のＲＮＡと共にＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成する配列は、上述の第一のＲＮＡ－タンパク質複合体と同一のものが用いられ得る。
　本発明の第二のＲＮＡ－タンパク質複合体の第一のＲＮＡに含まれる７塩基以上の配列は、任意の配列であって良いが、好ましくは他の７塩基以上の配列に相補的な配列を含まず、第一のＲＮＡ単独で３次構造を取らない配列が例示される。
　本発明の第二のＲＮＡ－タンパク質複合体の第一のＲＮＡに含まれるｓｉＲＮＡ配列とは、ｓｉＲＮＡを構成する二本鎖ＲＮＡの一方のＲＮＡ配列であって、ＲＮＡ干渉の標的となる任意のｍＲＮＡの一部であり、好ましくは、１８塩基から３５塩基の配列である。このような配列は、種々のwebサイト上に無料で提供される検索ソフトを用いて検索が可能である。このようなサイトとしては、例えば、いずれもAmbionが提供するsiRNA Target Finder（http://www.ambion.com/jp/techlib/misc/siRNA_finder.html）及びpSilencerTM Expression Vector用 インサート デザインツール（http://www.ambion.com/jp/techlib/misc/psilencer_converter.html）、RNAi Codexが提供するGeneSeer（http://codex.cshl.edu/scripts/newsearchhairpin.cgi）が挙げられるがこれらに限定されず、QIAGEN、タカラバイオ、SiSearch、Dharmacon、Whitehead Institute、Invitrogen、Promega等のwebサイト上でも同様に検索が可能である。
　本発明の第二のＲＮＡ－タンパク質複合体の第一のＲＮＡは、例えば、５’（ｓｉＲＮＡ配列）－（７塩基以上の配列）－（ＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成する配列）－（７塩基以上の配列）３’の順または、５’（７塩基以上の配列）－（ＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成する配列）－（７塩基以上の配列）－（ｓｉＲＮＡ配列）３’の順に構成される。
　本発明の第二のＲＮＡ－タンパク質複合体において、第一のＲＮＡは、少なくとも３つ以上含まれることが好ましく、例えば、１０、９、８、７、６、５、４などが挙げられる。最も好ましくは、３である。ＲＮＡ－タンパク質複合体の第一のＲＮＡは、互いに異なる配列を有しても良く、また、同じ配列で構成されても良い。ただし、当該第一のＲＮＡ同士で結合することを避けるため、互いに相補的な配列を含まないことが望ましい。
　本発明の第二のＲＮＡ－タンパク質複合体の第二のＲＮＡに含まれる、第一のＲＮＡに含まれる２つの７塩基以上の配列に連続して相補的な１４塩基以上の配列とは、第一のＲＮＡに含まれる７塩基以上の配列のうち３’末端側にある配列と他の第一のＲＮＡに含まれる７塩基以上の配列のうち５’末端側にある配列とが連結して生じる配列に相補的な配列を意味する。第一のＲＮＡに含まれる２つの７塩基以上の配列に連続して相補的な１４塩基以上の第二のＲＮＡに含まれる配列の数は、第二のＲＮＡ－タンパク質複合体に含まれる第一のＲＮＡの数に依存しており、当該第一のＲＮＡが３つの場合、当該第二のＲＮＡに含まれる１４塩基以上の配列は、２つである。
　本発明の第二のＲＮＡ－タンパク質複合体の第二のＲＮＡに含まれる、５’末端配列、および３’末端配列が、第一のＲＮＡに含まれる７塩基以上の配列に連続して相補的であるとは、当該５’末端配列と３’末端配列とが連結して３’末端配列－５’末端配列の順で成るＲＮＡの配列の一部であって、５’末端配列および３’末端配列のいずれの配列も含む配列が第一のＲＮＡに含まれる７塩基以上の配列に相補的であることを意味し、より好ましくは、３’末端配列－５’末端配列の順で成るＲＮＡの配列が、第一のＲＮＡに含まれる７塩基以上のうち３’末端側にある配列と他の第一のＲＮＡに含まれる７塩基以上のうち５’末端側にある配列とが連結して生じる配列に相補的な配列である。従って、第二のＲＮＡに含まる３’末端配列および５’末端配列は、合わせて１４塩基以上となり、例えば、第二のＲＮＡに含まれる３’末端配列が、１３塩基である場合、第二のＲＮＡに含まれる５’末端配列は１塩基以上である。
　本発明の第二のＲＮＡ－タンパク質複合体の第二のＲＮＡは、例えば、（５’末端配列）－（第一のＲＮＡと共にＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成する配列）－［（第一のＲＮＡ２つの７塩基以上の配列に連続して相補的な１４塩基以上の配列）－（第一のＲＮＡと共にＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成する配列）］ｍ－（３’末端配列）の順に構成され、いずれか、一つの（第一のＲＮＡに含まれる１５塩基以上の配列に相補的な配列）を、（第一のＲＮＡに含まれる５’末端配列および３’末端配列に連続して相補的な配列）に置き換えることによって得られる。第二のＲＮＡにおける“［”および“］”で囲まれる部分の繰り返しの数ｍは、第一のＲＮＡの数よりも１だけ少なく、２回の繰り返しの場合、第一のＲＮＡと共にＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成する配列を３つ有するＲＮＡである。
　本発明の第二のＲＮＡ－タンパク質複合体に含まれるタンパク質は、上述の第一のＲＮＡ－タンパク質複合体において説明した、（３）のタンパク質もしくはタンパク質融合体と同一のものが用いられ得る。したがって、本発明の一実施態様におけるＲＮＡ－タンパク質複合体に含まれるタンパク質は、ＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成するタンパク質に加え、他の機能的なタンパク質を含むタンパク質融合体を含み得る。
　本発明の第二のＲＮＡ－タンパク質複合体に含まれるタンパク質は、第一のＲＮＡの数に依存するため、３種以上である。ＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成するタンパク質は、ＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成する配列に依存して特異的なタンパク質を用いることが可能であるため、ＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成する配列を適宜変更することで、所望のタンパク質をＲＮＡ－タンパク質複合体に含ませることが可能となる。例えば、ＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成するタンパク質および細胞表面抗原を特異的に認識するタンパク質を含む融合タンパク質を１種含み、ＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成するタンパク質および他の機能的タンパク質を含む融合タンパク質を２種以上含むＲＮＡ－タンパク質複合体を形成することができる。
　本発明の第二のＲＮＡ－タンパク質複合体のＲＮＡに含まれる、ｓｉＲＮＡ配列に相補的な配列を含む第三のＲＮＡは、前述した（１）（iii）のｓｉＲＮＡ配列に相補的な配列であり、当該ｓｉＲＮＡ配列と二重鎖を形成することでｓｉＲＮＡを構成し、その効果を発揮することができる配列である。したがって、第三のＲＮＡは、その３’末端側に位置する２塩基が、（１）（iii）のｓｉＲＮＡ配列とは相補鎖を形成しない配列となっていることが好ましい。第三のＲＮＡは、第一のＲＮＡと同数が、ＲＮＡ－タンパク質複合体に含まれることが望ましい。
　本発明の第二のＲＮＡ－タンパク質複合体に含まれる第一のＲＮＡの５’末端または第三のＲＮＡの３’末端には、さらに、当該複合体の細胞質への輸送を促進する配列を付加してもよく、このような細胞質への輸送を促進する配列には、ｔＲＮＡの配列がある。ｔＲＮＡは、ＲＮＡ ポリメラーゼを認識するプロモーターの一つであるととともに、細胞質輸送シグナルとしての機能も果たすため、本発明の第二のＲＮＡ－タンパク質複合体のｓｉＲＮＡ機能の発揮を補助する可能性がある（日本特許第3831785号）。
　本発明の第二のＲＮＡ－タンパク質複合体は、複合体に含まれるｓｉＲＮＡによる機能を有することから、ＲＮＡ阻害剤として用いることができる。さらに、第二のＲＮＡ－タンパク質複合体を細胞内に導入することで当該細胞におけるｓｉＲＮＡ配列に対応するｍＲＮＡを抑制する方法に用いることができる。第二のＲＮＡ－タンパク質複合体を細胞内に導入する方法としては、第一のＲＮＡ－タンパク質複合体を細胞内に導入する方法と同様にして実施することができる。かかる方法は、ＲＮＡ－タンパク質複合体と細胞を接触させる工程を含む、細胞内のｍＲＮＡを分解する方法ともいうことができる。このとき、細胞との接触は、in vivoで行うこともできるし、in vitroで行うこともできる。
　本発明の一実施態様において、第二のＲＮＡ－タンパク質複合体に含まれる、ＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成するタンパク質と細胞表面抗原を特異的に認識するタンパク質の融合タンパク質を含む場合、デリバリーシステムに用いることができる。デリバリーの実施は、第一のＲＮＡ－タンパク質複合体と同様の態様で行うことができる。そこで、より効率的なデリバリーを成し得るため、適宜ＲＮＡ－タンパク質複合体に含まれるＲＮＡまたはタンパク質を選択することができる。好ましくは、ＲＮＡの配列の長さを適宜選択することによって、細胞認識能を上げることができる。ＲＮＡの配列の変更は、当該ＲＮＡに含まれる２つの７塩基以上の配列、５’末端配列、および３’末端配列を適宜変更することで行い得る。
　特には、当該ＲＮＡに含まれる２つの７塩基以上の配列の塩基数、及び、５’末端配列、および３’末端配列の合計の塩基数を適宜変更することで行い得る。変更は、特には、細胞表面抗原の結合能を高める観点から実施することができる。したがって、塩基数を適宜変更した第二のＲＮＡ－タンパク質複合体を用いて、所望の細胞表面抗原に対する結合能を測定することで、細胞認識能が高くなる塩基数を決定することができる。この点で、本発明は、一実施形態によれば、第二のＲＮＡ－タンパク質複合体において、細胞表面抗原への結合能を指標として、前記（１）の（ii）の配列、前記（１）の（iii）の配列、前記（２）の（b）の配列、および前記（２）の（d）の配列の塩基長を選択する方法ということもできる。
　以下に、本発明を、実施例を用いてより詳細に説明する。以下の実施例は本発明を限定するものではない。
　ＲＮＡ－タンパク質複合体の作製
　三角形構造ＲＮＡ－タンパク質複合体（Tri-RNP、図１）を、Ohno, H. et al.,. Nat. Nanotechnol. 2011, 6, 116.の記載に従い作製した。詳細には、K-turn ＲＮＡモチーフを頂点に有し、一辺が、それぞれ、15塩基、26塩基、48塩基、70塩基および92塩基の長鎖（L-RNA）および短鎖（S-RNA）からなるdsRNAsを設計した。それぞれ、LS-15（L-15：配列番号１３およびS-15：配列番号１４）、LS-26（L-26：配列番号１５およびS-26：配列番号１６）、LS-48（L-48：配列番号１７およびS-48：配列番号１８）、LS-70（L-70配列番号１９およびS-70配列番号２０）およびLS-92（L-92配列番号２１およびS-92配列番号２２）と称す（図１）。ＲＮＡは、前述のDNAテンプレートを元にMEGAshortscript T7 kit（Ambion）を用いて作製した。得られたL-RNAとS-RNAをRNP結合溶媒（150ml KCl、1.5ｍM MgCl2および20ｍM HEPES-KOH(pH 7.5)から成る溶液）にて、80℃で3分間処理した後、室温にて10分間冷却することで、ＲＮＡどうしをハイブリダイズさせ、ループ構造を有する二重鎖ＲＮＡ （LS-RNA）を作製した。
　さらに、Ohno, Hらの記載に従い、LS-RNAへL7Aeを添加することで、相互作用により5つの異なる大きさの三角形構造を形成させた。L7Aeは、プラスミド（L7Ae配列を導入したpET-28(+) vector (Novagen)）を大腸菌（Rosetta(DE3)/pLysSpRARE2）にトランスフェクションすることで作製した。
　得られた5種のTri-RNPを、Tri-15、Tri-26、Tri-48、Tri-70およびTri-92と称し、1辺は、およそ13.7、16.7、22.6、28.5および34.4 nmの長さと考えられる。
　続いて、電気泳動移動度シフト解析（EMSA）より、L7Aeと当該LS-RNAの相互作用を分析した。ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動後、ポリアクリルアミドゲルを、SYBR Green IおよびII（Lonza）で染色し、RNA-タンパク質複合体の形成を観察した。その結果、期待通り、全てのLS-RNAにおいてL7Aeとの相互作用により三角形構造体を形成していることが確認された（図２）。
　続いて、Tri-RNPを視覚的に観察した。Tri-RNP (Tri-26およびTri-48)を、高速AFM (HS-AFM)（Nano Live Vision, Research Institute of Biomolecules Metrology）および10×2×0.1μMのカンチレバー（BL-AC10EGS, Olympus）を用いて液相で観察した。400-1000 kHz共鳴周波数で0.1-0.2 N/mのバネ定数にてカンチレバーを設定した。プローブは、電子ビームでカンチレバーに沈着させた。0.1％ APTESでマイカ表面をコーティングし、RNP結合溶媒とAFM観察溶媒（20mM Tris-HCl (pH7.6)および10 mM MgCl2）に溶解させた50 nMのサンプルをマイカ上に静置した。画像は、ImageJおよびWSxMなどのソフトウエアを用いて解析した。
　その結果、L7Aeと接触させない場合、５つの異なる大きさのLS-RNAは二重鎖ＲＮＡの構造でループ構造を呈した。一方、L7Aeと接触させた場合、三角形構造を呈することが確認された。RNA がK-turnモチーフと結合している様子が、Tri-RNPの頂点のドットとして確認され、3辺で囲まれた三角形内部は空洞で確認され、L7Aeと接触させた場合は、単一構造を呈することが確認された（図３）。ただし、Tri-92では、三角形構造が、少し変形することが確認された。
　続いて、変異K-turnモチーフ（mut box C：配列番号２３、mut box D：配列番号２４）を１つ、２つまたは３つ有するLS-RNA（Tri-26mut1、Tri-26mut2およびTri-26mut3）をEMSAより確認した。その結果、それぞれの変異K-turnモチーフの数に応じた構造変化が確認された（図４）。このとき、それぞれ n=114,135, 93, 188個の構造体を計測し、構造形成の割合を算出した結果、L7AeとK-turnモチーフの含有比率と、確認された実際の構造の比率は、統計的に一致していた（図５）。これらの結果より、３つのL7AeとK-turnモチーフの相互作用が、三角形の頂点で行われていることが確認された。
　タイムラプス画像によるＲＮＡ－タンパク質複合体（RNP）の構造変化の検出
　上述したHS-AFMを用いて、L7Ae添加後のＲＮＡ構造における変化をタイムラプス撮像より観察した（図６）。タイムラプス画像により、L7Aeが直接３つのLS-26のK-turnモチーフに結合すると、K-turnモチーフが60度の角度に折り曲げられ、この構造変化より、三角形構造へ移行することを確認した。一方、ＲＮＡからタンパク質が解離することで、三角形構造からループ構造へと移行することも確認された。
　タンパク質との相互作用によるＲＮＡの安定性の改良
　血清の存在下におけるＲＮＡ－タンパク質複合体（RNP）の構造安定性について確認した。詳細には、50 nM LS-26または50 nM LS-26と300nM L7Aeとの混合物に20％ FBSを添加し、37℃で0分、30分、60分および120分インキュベート後、10 mM EDTA (pH8.0)およびフェノールを添加し、ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動し、RNAの安定性を観察した。その結果、LS-26においてL7Aeの存在下でRNPを形成させることで、血清含有緩衝液における、その安定性が亢進することが確認された（図７）。一方、L7Aeの非存在下では、LS-26は、30分間の血清処理で分解することが確認された。また、Tri-26mut3を用いた場合、分解は抑制されなかった。同じ結果が、ヒト血清（20％）においても観察された（図８）。これらの結果より、三角形構造を形成することで、血清存在下などの生理的条件下においても、ＲＮＡの安定性が高まることが確認された。
　細胞認識能を有する機能的RNP
　Tri-RNPに特定の癌細胞を認識する機能を付加した。詳細には、affibodyZHER2:342ペプチド（配列番号２５および２６）のN末端でSSSGSSSGSSSG（配列番号２７および２８）を介しL7AeのC末端と融合したタンパク質（L7Ae-AFB）を、上述のとおり、Ohno, Hらの記載に従い、プラスミドを大腸菌にトランスフェクションすることで用意した。このL7Ae-AFBをLS-RNAに添加し、RNPを構築した（Tri-AFB、図９Ａ）。LS-26をＲＮＡとして用いた場合（Tri-26-AFB）の三角形構造をHS-AFMにて確認し、各頂点にAFBと推定される物質が付加されていることも確認できた（図９Ｂ）。さらに、EMSAを用いてTri-26と同様にL7Ae-AFBが、K-turnモチーフに結合することが確認された（図１０）。
　続いて、当該Tri-AFBが、乳癌細胞に結合するか否かについて確認した。詳細には、乳癌細胞株（SKBR3）（ATCC）の培養液を除去し、Opti-MEMを加えた後、Alexa-647でラベルした10 nM LS- RNA、または10 nM Tri-AFBを添加し、37℃、5％CO2下で1時間培養した。インキュベート後の細胞へのTri-AFBの結合は、フローサイトメーターで分析した。その結果、Tri-26-AFBが、最も認識能が高かった（図１１）。Tri-26-AFBの選択的認識能を調べるため、3つの異なる乳癌細胞株（SKBR3（HER2強陽性株）、MCF-7（HER2弱陽性株）およびMDA-MB-231（HER2陰性株））を用いて同様に調べたところ、Tri-26-AFBは予想通りSKBR3を選択的に認識することが確認された（図１２）。
　さらに、変異K-turmモチーフを有するTri-26変異体（Tri-26mut1、Tri-26mut2およびTri-26mut3）を用いて同様に調べたところ、変異K-turmモチーフの数に応じて、SKBR3との結合能が弱くなることが確認された（図１３）。このことは、AFBとHER2との結合数の増加が認識能に影響したためと示唆される。
　これらの結果より、Tri-AFBを用いることで、ＲＮＡを対象細胞表面へと輸送することが可能であることが示唆された。ただし、細胞への結合能を有するRNPは最適な大きさがあることも確認された。
　ｓｉＲＮＡ機能を有する機能的RNP
　三角形構造を有するRNPが、ｓｉＲＮＡとしての機能を有するかについて検討を行うため、図１４に示すRNPを構築した。詳細には、LS-26の3辺にGFPに対するｓｉＲＮＡを有するように、S-26、L-26-1（配列番号２９）、L-26-2（配列番号３０）、L-26-3（配列番号３１）およびantisense-GFP（配列番号３２）との５つのＲＮＡを上述と同様にハイブリダイズしてLS-26-siGFPを作製した。続いて、LS-26-siGFPとL7Aeとを混合することで三角形構造を有するTri-26-siGFPを作製し、HS-AFMを用いて構造を確認したところ、三角形の各辺に、GFPに対するｓｉＲＮＡと思われる構造物が確認され、予想された形状を取ることが確認された（図１５上段）。一方、L7Aeの非存在下では、不均一なＲＮＡ構造を取ることが確認された（図１５下段）。以上より、ｓｉＲＮＡ機能を有する3つの二重鎖を含有する構造を持つ三角形構造（Tri-26-siGFP）を構築することができた。
　このTri-26-siGFPが、Dicerによる基質認識に関与するかについて検討した。詳細には、500 nM LS-26-siGFP類（L-26-1、S-26およびantisense-GFPのハイブリダイズしたＲＮＡ、L-26-2、S-26およびantisense-GFPのハイブリダイズしたＲＮＡ、L-26-3、S-26およびantisense-GFPのハイブリダイズしたＲＮＡならびにLS-26-siGFP）または500 nM LS-26-siGFPと3 μM L7Aeの混合物を1 μL の10 mM ATP、0.5μL の50 mM MaCl2、4 μL のDicer Reaction buffer、1 μL のリコンビナントDicer（Genlantis）に水を加え、10 μLとし、37℃で16時間インキュベートした。インキュベート後、Dicer Stop Solutionを加え、Dicerにより切断されたRNAと切断されずに残存したRNAを、ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて、確認した。Tri-26-siGFPは、対照として用いたsh-GFP（配列番号３３）と同様にDicerによるＲＮＡ切断に寄与することが確認された（図１６）。従って、L7AeとK-turnモチーフの相互作用により三角形構造をとるTri-26-siGFPであっても、立体障害なくｓｉＲＮＡの効果を有することが示唆された。
　以上より、三角形構造を有するRNPは、ＲＮＡを安定化し、細胞認識能とｓｉＲＮＡによるｍＲＮＡの分解、並びに阻害の機能を保有させることができることが示唆された。
　次いで、Tri-26-siGFPによる細胞内でのノックダウン活性を調べた。GFPを安定的に発現するHela細胞（Hela-GFP）に、1 nM及び5 nMのTri-26-siGFP、1 nM及び5 nMのLS-26-siGFP、及び3 nM及び15 nMの陽性対照としてのsh-GFPをそれぞれトランスフェクトした。GFPのノックダウン活性は、GFPの発現レベルにより、フローサイトメトリーを用いて測定した。その結果、Tri-26-siGFP、LS-26-siGFPともに、sh-GFPの３倍程度の活性にて、GFPをノックダウンできることが示された。

Claims (19)

  1. 　次の（１）から（３）を含むＲＮＡ－タンパク質複合体による、ＲＮＡおよびタンパク質のデリバリーシステム。
    　（１）次の（i）から（iv）の配列を含むＲＮＡ；
    （i）ＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成する配列を３つ以上、
    （ii）１５塩基以上の配列を２つ以上、
    （iii）５’末端配列、および
    （iv）３’末端配列であって、
    当該（iii）の５’末端配列および（iv）の３’末端配列が合計して１５塩基以上の配列であり、
    　（２）次の配列を含むＲＮＡ；
    （a）前記（１）の（i）と共にＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成する配列を３つ以上、
    （b）前記（１）の（ii）の１５塩基以上の配列に相補的な配列を１つ以上、
    （c）前記（１）の（iii）の５’末端配列および３’末端配列に連続して相補的な配列、
    （d）５’末端配列、および
    （e）３’末端配列であって、
    当該（d）の５’末端配列および（e）の３’末端配列が、前記（１）の（ii）の１５塩基以上の配列に連続して相補的であり、ならびに
    　（３）前記（１）の（i）および前記（２）の（a）で形成されるＲＮＡとＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成するタンパク質および細胞表面抗原を特異的に認識するタンパク質を含む、少なくとも１つの融合タンパク質。
  2. 　前記（１）の（i）のＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成する配列が３つであり、前記（２）の（a）のＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成する配列が３つであり、前記（１）の（ii）の１５塩基以上の配列が２つであり、ならびに前記（２）の（b）の１５塩基以上の配列に相補的な配列が１つである、請求項１に記載のシステム。
  3. 　前記（１）の配列、前記（１）の(iii)の５’末端配列および（iv）の３’末端配列の合計、前記（２）の（b）の配列、または（d）に前記（２）の(d)の５’末端配列および（e）の３’末端配列の合計が、１５塩基以上９２塩基以下である、請求項１または２に記載のシステム。
  4. 　前記（１）の配列、前記（１）の(iii)の５’末端配列および（iv）の３’末端配列の合計、前記（２）の（b）の配列、または（d）に前記（２）の(d)の５’末端配列および（e）の３’末端配列の合計を、細胞表面抗原への結合能を高めるように、塩基長が適宜選択されている、請求項１から３のいずれか１項に記載のシステム。
  5. 　前記（１）の（i）および前記（２）の（a）で形成されるＲＮＡ－タンパク質結合モチーフが、Ｋ-ｔｕｒｎモチーフであり、前記（３）のＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成するタンパク質が、L7Aeである、請求項１から４のいずれか１項に記載のシステム。
  6. 　前記（３）の細胞表面抗原を特異的に認識するタンパク質が、HER2を認識するタンパク質である、請求項１から５のいずれか１項に記載のシステム。
  7. 　前記HER2を認識するタンパク質が、Affibodyである、請求項６に記載のシステム。
  8. 　血清存在下でデリバリーが行われる、請求項１から７のいずれか１項に記載のシステム。
  9. 　次の（１）から（４）を含むＲＮＡ－タンパク質複合体；
    （１）次の（i）から（iii）の配列を含むＲＮＡ；
    （i）ＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成する配列、
    （ii）７塩基以上の配列を２つ、および
    （iii）ｓｉＲＮＡ配列、
    （２）次の（a）から（d）の配列を含むＲＮＡ；
    （a）前記（１）の（i）と共にＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成する配列
    （b）前記（１）の前記（ii）の２つの７塩基以上の配列に連続して相補的な１４塩基以上の配列を２つ以上、
    （c）５’末端配列、および
    （d）３’末端配列であって、
    当該（c）の５’末端配列および（d）の３’末端配列が、前記（１）の前記（ii）の７塩基以上の配列に連続して相補的であり、
    （３）前記（１）の（i）および前記（２）の（a）で形成されるＲＮＡとＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成するタンパク質を少なくとも１つ、ならびに
    （４）前記（１）の（iii）のｓｉＲＮＡ配列に相補的な配列を含むＲＮＡ。
  10. 　前記（１）のＲＮＡが３つであり、前記（２）の（b）の１４塩基以上の配列を２つであり、および前記（４）のＲＮＡが３つである、請求項９に記載のＲＮＡ－タンパク質複合体。
  11. 　前記（１）の（ii）の配列が、７塩基以上８５塩基以下であり、前記（２）の（b）の配列が、１４塩基以上９２塩基以下である、請求項９または１０に記載のＲＮＡ－タンパク質複合体。
  12. 　前記（１）の（i）および前記（２）の（a）で形成されるＲＮＡ－タンパク質結合モチーフが、Ｋ-ｔｕｒｎモチーフであり、前記（３）のタンパク質が、L7Aeである、請求項９から１１のいずれか１項に記載のＲＮＡ－タンパク質複合体。
  13. 　前記（３）のタンパク質が、細胞表面抗原を特異的に認識するタンパク質または膜透過性ペプチドをさらに含む融合タンパク質である、請求項９から１２のいずれか１項に記載のＲＮＡ－タンパク質複合体。
  14. 　前記膜透過性ペプチドが、AntP、HIV由来のTAT、Penetratin、Buforin II、Transportan、MAP、K-FGF、Ku70、Prion、pVEC、Pep-1、Pep-7、SynB1、HN-IおよびHSV由来のVP22から成る群より選択されるペプチドである、請求項１３に記載のＲＮＡ－タンパク質複合体。
  15. 　請求項９から１４のいずれか１項に記載のＲＮＡ－タンパク質複合体を含む、ＲＮＡ阻害剤。
  16. 　請求項９から１４のいずれか１項に記載のＲＮＡ－タンパク質複合体と細胞を接触させる工程を含む、細胞内のｍＲＮＡを分解する方法。
  17. 　前記ＲＮＡ－タンパク質複合体と細胞を血清存在下で接触させる、請求項１６に記載の方法。
  18. 　（１）次の配列を含むＲＮＡ；
    （i）ＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成する配列を３つ以上、
    （ii）１５塩基以上の配列を２つ以上、ならびに
    （iii）合わせて１５塩基以上の配列から成る５’末端配列および３’末端配列、
    　（２）次の配列を含むＲＮＡ；
    （a）前記（１）の（i）と共にＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成する配列を３つ以上、
    （b）前記（１）の（ii）の１５塩基以上の配列に相補的な配列を１つ以上、
    （c）前記（１）の（iii）の５’末端配列および３’末端配列に連続して相補的な配列、
    および
    （d）前記（１）の（ii）の１５塩基以上の配列に連続して相補的な５’末端配列および３’末端配列、ならびに
    　（３）前記（１）の（i）および前記（２）の（a）で形成されるＲＮＡとＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成するタンパク質および細胞表面抗原を特異的に認識するタンパク質を含む、少なくとも１つの融合タンパク質、
    を含むＲＮＡ－タンパク質複合体において、細胞表面抗原への結合能を指標として、前記（１）の（ii）の配列、前記（１）の（iii）の配列、前記（２）の（b）の配列、および
    前記（２）の（d）の配列の塩基長を選択する方法。
  19. 　（１）次の（i）から（iii）の配列を含むＲＮＡ；
    （i）ＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成する配列、
    （ii）７塩基以上の配列を２つ、および
    （iii）ｓｉＲＮＡ配列、
    　（２）次の（a）から（d）の配列を含むＲＮＡ；
    （a）前記（１）の（i）と共にＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成する配列
    （b）前記（１）の前記（ii）の２つの７塩基以上の配列に連続して相補的な１４塩基以上の配列を２つ以上、
    （c）５’末端配列、および
    （d）３’末端配列であって、
    当該（c）の５’末端配列および（d）の３’末端配列が、前記（１）の前記（ii）の７塩基以上の配列に連続して相補的であり、
    　（３）前記（１）の（i）および前記（２）の（a）で形成されるＲＮＡとＲＮＡ－タンパク質結合モチーフを形成するタンパク質および細胞表面抗原を特異的に認識するタンパク質を含む、少なくとも１つの融合タンパク質、ならびに
    　（４）前記（１）の（iii）のｓｉＲＮＡ配列に相補的な配列を含むＲＮＡ、
    を含むＲＮＡ－タンパク質複合体において、細胞表面抗原への結合能を指標として、前記（１）の（ii）の配列、および前記（２）の（b）の配列の塩基長を選択する方法。
PCT/JP2015/069634 2014-07-09 2015-07-08 Ｒｎａ－タンパク質複合体及びこれによるｒｎａおよびタンパク質のデリバリーシステム Ceased WO2016006628A1 (ja)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US15/324,446 US20170327600A1 (en) 2014-07-09 2015-07-08 Rna-protein complex, and rna and protein delivery system using the same
EP15818679.1A EP3173482B1 (en) 2014-07-09 2015-07-08 Rna-protein complex, and rna and protein delivery system using same
JP2016532953A JPWO2016006628A1 (ja) 2014-07-09 2015-07-08 Ｒｎａ−タンパク質複合体及びこれによるｒｎａおよびタンパク質のデリバリーシステム

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2014-141431 2014-07-09
JP2014141431 2014-07-09

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2016006628A1 true WO2016006628A1 (ja) 2016-01-14

Family

ID=55064257

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2015/069634 Ceased WO2016006628A1 (ja) 2014-07-09 2015-07-08 Ｒｎａ－タンパク質複合体及びこれによるｒｎａおよびタンパク質のデリバリーシステム

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20170327600A1 (ja)
EP (1) EP3173482B1 (ja)
JP (2) JPWO2016006628A1 (ja)
WO (1) WO2016006628A1 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017010568A1 (ja) * 2015-07-16 2017-01-19 国立大学法人京都大学 Ｒｎａ－タンパク質複合体とその使用
WO2018174158A1 (ja) 2017-03-22 2018-09-27 国立大学法人京都大学 細胞質送達ペプチド

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114106109B (zh) * 2021-11-25 2024-06-04 嘉华药锐科技(北京)有限公司 一种细胞质靶向的rna结合蛋白富集试剂及其制备方法及应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005079843A1 (ja) * 2004-02-25 2005-09-01 Ttc Co., Ltd. 新規リポソーム
JP2007537700A (ja) * 2003-07-04 2007-12-27 アフィボディ・アーベー Ｈｅｒ２に対する結合親和性を有するポリペプチド
WO2010010862A1 (ja) * 2008-07-22 2010-01-28 独立行政法人科学技術振興機構 Ｒｎａ－蛋白質複合体相互作用モチーフを利用して人工ｒｎｐナノ構造体を構築する方法
WO2010067811A1 (ja) * 2008-12-09 2010-06-17 独立行政法人科学技術振興機構 ＲＮＰモチーフを利用した、蛋白質応答型ｓｈＲＮＡ／ＲＮＡｉ制御システムの構築

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007537700A (ja) * 2003-07-04 2007-12-27 アフィボディ・アーベー Ｈｅｒ２に対する結合親和性を有するポリペプチド
WO2005079843A1 (ja) * 2004-02-25 2005-09-01 Ttc Co., Ltd. 新規リポソーム
WO2010010862A1 (ja) * 2008-07-22 2010-01-28 独立行政法人科学技術振興機構 Ｒｎａ－蛋白質複合体相互作用モチーフを利用して人工ｒｎｐナノ構造体を構築する方法
WO2010067811A1 (ja) * 2008-12-09 2010-06-17 独立行政法人科学技術振興機構 ＲＮＰモチーフを利用した、蛋白質応答型ｓｈＲＮＡ／ＲＮＡｉ制御システムの構築

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HIROHIDE SAITO: "RNA-Protein nanotechnology & synthetic biology", JOURNAL OF JAPANESE BIOCHEMICAL SOCIETY, vol. 86, no. l, 25 February 2014 (2014-02-25), pages 81 - 85, XP008185526 *
OHNO, H. ET AL.: "Synthetic RNA-protein complexshaped like an equilateral triangle.", NAT. NANOTECHNOL., vol. 6, 2011, pages 116 - 120, XP055346447 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017010568A1 (ja) * 2015-07-16 2017-01-19 国立大学法人京都大学 Ｒｎａ－タンパク質複合体とその使用
WO2018174158A1 (ja) 2017-03-22 2018-09-27 国立大学法人京都大学 細胞質送達ペプチド

Also Published As

Publication number Publication date
JP2020022497A (ja) 2020-02-13
EP3173482A4 (en) 2018-02-28
JPWO2016006628A1 (ja) 2017-04-27
US20170327600A1 (en) 2017-11-16
EP3173482A1 (en) 2017-05-31
EP3173482B1 (en) 2020-01-01
JP6969810B2 (ja) 2021-11-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7566853B2 (ja) Ｃｒｉｓｐｒ／ｃｐｆ１システム及び方法
Souza et al. 3D Cell-SELEX: Development of RNA aptamers as molecular probes for PC-3 tumor cell line
Kim et al. Identification of DNA aptamers toward epithelial cell adhesion molecule via cell-SELEX
Wei et al. Development of an antisense RNA delivery system using conjugates of the MS2 bacteriophage capsids and HIV-1 TAT cell penetrating peptide
JP6969810B2 (ja) Ｒｎａ−タンパク質複合体及びこれによるｒｎａおよびタンパク質のデリバリーシステム
Chen et al. Targeted inhibition of oncogenic miR-21 maturation with designed RNA-binding proteins
EP2221367B1 (en) Protein-responsive translation control system utilizing rna-protein interaction motif
JP7221865B2 (ja) 細胞膜透過ペプチドおよびこれを含む細胞内伝達体
JP2013531988A (ja) 細胞透過性ペプチドおよびその使用
CN113727993A (zh) 通过遗传密码子扩展以靶蛋白选择性方式制备工程化靶蛋白的手段和方法
US10781442B2 (en) High-speed in vitro screening method
CN106795205B (zh) 细胞膜穿透肽及其作为生物活性物质传递体的用途
KR20220075231A (ko) 진핵 반합성 유기체
CN111849874A (zh) Nme变体物种表达和抑制
KR20210031927A (ko) 압타머 기반 가역적 세포 선택과 관련된 조성물 및 방법
Zhang et al. Targeting folded RNA: a branched peptide boronic acid that binds to a large surface area of HIV-1 RRE RNA
Janas et al. The selection of aptamers specific for membrane molecular targets
Danielson et al. A novel p19 fusion protein as a delivery agent for short-interfering RNAs
Lee et al. Screening of cell‐penetrating peptides using mRNA display
Karan et al. A systematic analysis of affinity tags in the haloarchaeal expression system, Haloferax volcanii for protein purification
CN102245766B (zh) 采用RNP基序构建蛋白应答shRNA/RNAi控制体系
JP7644429B2 (ja) 細胞透過性トランスポザーゼ
Rao et al. A novel lysine-rich domain and GTP binding motifs regulate the nucleolar retention of human guanine nucleotide binding protein, GNL3L
KR101641920B1 (ko) EpCAM에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머 및 이의 용도
WO2024073414A2 (en) Programmable nuclease-peptidase compositions

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 15818679

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2016532953

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2015818679

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2015818679

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 15324446

Country of ref document: US