WO2016004488A1

WO2016004488A1 - Método para detecção de alfa-amilase em açúcares ou intermediários

Info

Publication number: WO2016004488A1
Application number: PCT/BR2014/000228
Authority: WO
Inventors: Jadyr Mendes de OLIVEIRA; Maurício Sergio ESTELLER; Rafael De Araújo BORGES; Rafael Ferraz ALVES
Original assignee: Prozyn Indústria E Comércio Ltda
Priority date: 2014-07-11
Filing date: 2014-07-11
Publication date: 2016-01-14
Also published as: BR112016021309A2; BR112016021309B8; BR112016021309B1

Abstract

No processo de fabricação do açúcar, as enzimas alfa-amilases de termoestabilidade intermediária podem resistir aos tratamentos térmicos empregados e continuarem ativas nas etapas posteriores do processo, acarretando em defeitos no produto final e prejuízos económicos. Para evitar tal tipo de problema, é proposto um método de detecção de atividade residual de alfa-amilase nas amostras de açúcar, baseado na viscosidade da amostra através do tempo de queda ("Falling Number"). O método se baseia no método original do "Falling Number", utilizado para medir atividade diastática em farinhas de trigo, e consiste nas seguintes etapas sequenciais: a. preparar uma amostra líquida do açúcar ou intermediários em teste na concentração de 50 a 600 g/L e com teor de sólidos solúveis variando de 5 a 60° Brix; b. adicionar a amostra liquida de açúcar ou intermediários obtida na etapa (a) em um recipiente contendo uma ou mais fonte de amido, com 1,5 g a 10 g de amido, podendo adicionar cálcio bivalente na concentração de 30 a 100 ppm em relação ao teor de amido; c. homogeneizar a solução obtida na etapa (b); d. aquecer a solução obtida na etapa (c) a temperatura de 60°C a 100° C, ao mesmo tempo em que dita solução é agitada com uma haste até sua gelatinização, que a viscosidade obtida varia entre 400 e 600 cP; e. soltar a haste no início do recipiente; f. verificar o tempo de queda da haste na solução gelificada, ao longo do comprimento total do recipiente; g. comparar o tempo de queda obtido na etapa (f) com o tempo de queda de uma amostra de açúcar sem alfa-amilase (amostra controle).

Description

MÉTODO PARA DETECÇÃO DE ALFA-AMILASE EM AÇÚCARES OU

INTERMEDIÁRIOS

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção trata de um método para detecção da presença de enzimas alfa-amilases residuais em amostras de açúcar bruto ou intermediários em que dito método avalia a viscosidade da amostra através do tempo de queda (Falling Number) .

O método de acordo com a invenção utiliza o aparelho de reologia Falling Number (método instrumental) . Este equipamento, que é originalmente utilizado para medir a atividade diastática em farinha de trigo, é aqui empregado para avaliar a presença de alfa-amilases remanescentes do processo na hidrólise do amido durante a produção de açúcares.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Cana-de-açúcar

A cana-de-açúcar, Saccharum officinarum, é uma gramínea originária da índia e introduzida no Brasil na época colonial, sendo hoje muito cultivada em regiões tropicais e subtropicais do país. As gramíneas constituem uma grande família de plantas da classe das monocotiledôneas , de folhas envolventes e caule geralmente oco. Desde a sua origem até os dias atuais ela vem passando por modificações, o que resultou em várias espécies, as quais diferem entre si principalmente quanto ao conteúdo de fibras e açúcares. Hoje, a maior parte da cana-de-açúcar cultivada é um híbrido de planta original com outras espécies da mesma família.

A sacarose, principal reserva energética da planta é estocada predominantemente nos colmos da planta. A cana de açúcar é constituída basicamente de um sistema radiculares, de colmos e de folhas que se encontram arranjadas ao redor da cana. Esta molécula energética também pode ser encontrada na parte superior da planta, onde se localiza a "ponta" ou "palmito". Com a maturação mais avançada da cana-de-açúcar a sacarose vai sendo alojada nos espaços intercelulares (BATTA e SINGH, 1986) .

A composição química da cana-de-açúcar é muito variável em função das condições climáticas, das propriedades físicas, químicas e microbiológicas do solo, do tipo de cultivo, da variedade, da idade, do estágio de maturação, do estado sanitário, entre outros fatores. Em geral os principais constituintes da cana-de-açúcar são distribuídos conforme descrito no Quadro 1 (COPERSUCAR, 2007) .

Quadro 1. Principais constituintes

da cana de açúcar.

Constituintes Sólidos Solúveis {%)

Açúcares 75 - 93

Sacarose 70 - 91

Glicose 2 - 4

Frutose 2 - 4

Sais 3,0 - 5,0

De ácidos inorgânicos 1,5 - 4,5

De ácidos orgânicos 1,0 - 3,0

Proteínas 0,5 - 0,6

Amidos 0,001 - 0,05

Gomas 0,3 - 0,6

Ceras e graxas 0,05 - 0,15

Corantes 3,0 - 5,0

Fonte: Copersucar, 2007

A sacarose confere aos alimentos diferentes propriedades de interesse industrial, como: poder dulçor, aumento da viscosidade e consistência, conservação, substrato para fermentação alcoólica, diminuição do ponto de congelamento, cor e realce de aroma e sabor. A sacarose é apresentada como açúcar VHP, VVHP, açúcar cristal, açúcar refinado amorfo, açúcar de confeiteiro, açúcar refinado granulado, açúcar liquido, açúcar liquido invertido.

Uso de alfa-amilase no processo de produção de açúcar

0 amido é considerado uma substância indesejável presente na cana-de-açúcar, pois causa problemas durante o processamento nas usinas e refinarias. Dentre os principais problemas relacionados a esta molécula ao longo do processo podemos citar: o aumento da viscosidade do caldo e do melaço; dificuldade de cristalização; redução da taxa de centrifugação e baixa qualidade do açúcar (cor, pontos pretos, filtrabilidade, etc.) (EGGLESTON et al . , 2007). Vale ressaltar que essas desvantagens citadas anteriormente acarretam um aumento do custo do processamento da matéria- prima até a produção do produto acabado (açúcar bruto) . Um estudo realizado por CUDDIHY et al. (2006) mostrou que - concentrações de amido entre 200-250 ppm podem causar problemas durante o processamento de açúcar bruto na refinaria. Assim, a remoção do amido no processamento da cana-de-açúcar torna-se indispensável para que se aumente a capacidade, volume e qualidade da produção (ANYNGWA et al., 1993) .

A α-amilase bacteriana termoestável é utilizada durante toda a safra nas usinas de açúcar. A principal função desta molécula é hidrolisar as ligações a-1,4 glicosidicas do amido presente ao longo do processo industrial (VALLEE et al., 1959), facilitando assim a filtração e cristalização da sacarose. Como relatado anteriormente, altas concentrações de amido no caldo de cana interferem no processamento, aumentando a viscosidade, diminuindo a taxa de filtração e reduzindo o rendimento do açúcar bruto.

0 fornecimento de açúcar bruto contendo mais que 150 ppm de amido (baseado em Brix) sofre penalidades em muitos países, dentre eles a África do Sul (MOHABIR e KHESWA, 2003) . De acordo com KAMPEN (2006) aplicações da enzima α-amilase na ordem de 1000 ppm em relação a amido (base seca) são capazes de remover eficientemente esses polissacarídeos, o que corresponde a aplicação 2,5 ppm de α-amilase no caldo misto.

Ao aplicar alfa-amilases microbianas de diferentes origens (Aspergillus kawachi, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus Spp, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus spp, Bacillus stearothermophilus , Bacillus licheniformis , Bacillus subtilis , Bacillus licheniformis , Microbacterium imperiales) para reduzir o amido durante a produção do açúcar, tais enzimas acabam por compor o produto final (açúcar bruto), efeito conhecido como residual.

Existem diferentes pontos de dosagem da enzima alfa-amilase no processo de fabricação do açúcar. Um dos pontos utilizados para adição da enzima é o tanque de xarope, em que há a necessidade de altas quantidades de enzimas para atingir uma alta eficiência de hidrólise. Outros pontos de dosagem comuns são antes da entrada do caldo no decantador (favorece a atividade de amilases termoresistentes) e no último efeito do evaporador (favorece ação das amilases de termoestabilidade intermediária) . As condições de temperatura nestes pontos de dosagem são muito diferentes. As alfa-amilases termoresistentes atuam no decantador nas condições extremas dessa etapa (105°C por 1,5 hora). Porém devido à alta termotolerância desta enzima, ela continua ativa no açúcar após todas as etapas posteriores, resultando em residual de atividade de alfa-amilase no produto final. A dosagem de enzimas termoresistentes no evaporador (65-75°C por 30-90 minutos) além de não possibilitar condições ótimas para ação da enzima, não contribui de forma eficaz à inativação da mesma, resultando também em residual de atividade enzimática no produto final. Mesmo enzimas de termoestabilidade intermediária dosadas neste ponto não sofrem desestabilização significativa, deixando atividade residual para as etapas seguintes. A partir da etapa de evaporação, a temperatura dos próximos processos unitários do processo tende a diminuir, o que permite que as alfa- amilases continuem ativas nas etapas posteriores do processo. Nessas condições, o açúcar produzido poderá carregar atividade de alfa-amilase, que é extremamente deletéria para alguns alimentos que empregam açúcar e amido em sua composição.

Casos assim já ocorreram em algumas indústrias de laticínios que empregam açúcar como edulcorante e amido como espessante em algumas bebidas e sobremesas lácteas. A combinação de amido e açúcar com residual de alfa-amilase favorece a hidrólise do amido e consequentemente a desestabilização do produto, trazendo prejuízos financeiros para a indústria de laticínios, e penalidades para as Usinas fornecedoras deste açúcar (RAVAGNANI et al., 2011).

Nos Estados Unidos houve dois casos de indústrias fabricantes de molho de churrasco (bariíecue) que utilizaram melaço final contendo atividade residual de alfa-amilases que causou a liquefação do produto final, levando a prejuízos financeiros. Neste sentido, tem surgido a necessidade do desenvolvimento de produtos à base de enzimas que sejam capazes de hidrolisar eficientemente o amido, entretanto que sejam desnaturadas ou inativadas nos processos industriais finais de modo a evitar o efeito residual nos açúcares brutos obtidos (EGGLESTON et al., 2007) . Este tipo de problema poderia ter sido evitado ou minimizado caso alguma destas indústrias tivessem disponível em mãos um método rápido e confiável de detecção de atividade residual de alfa-amilase nas amostras de açúcar.

Diante dos problemas acima apresentados em relação ao efeito residual da alfa-amilase em açúcares, há a necessidade do desenvolvimento de métodos para detecção da enzima em amostras de açúcar ou intermediários com o intuito de evitar o seu uso indevido e os prejuízos associados .

Detecção de alfa-amilase em amostras de açúcar ou intermediários

Na literatura existem algumas metodologias para a quantificação de α-amilase em açúcar bruto baseadas na determinação de açúcares redutores: 1) método Iodométrico 2) método de Phadebas 3) método BPNPG7 {benzylidene blocked p-nitrophenyl maltoheptaoside) 4) método de Bernfeld modificado. De forma geral os métodos citados acima (físico-químicos) envolvem um custo maior de operação, devido principalmente ao custo dos reagentes e equipamentos sofisticados. Além disso, para obtenção dos resultados finais há a exigência de um tempo maior para obter e processar os dados. A seguir são discutidos com mais detalhes cada um dos métodos:

1. Método Iodométrico: este método baseia-se na descoloração do complexo amido-iodo devido a ação das enzimas presentes na solução a ser testada. Assim, é possível correlacionar a quantidade de enzima presente com a absorbância da solução contendo o complexo amido-iodo. Vale ressaltar a necessidade de uma curva padrão de alfa- amilases para que seja possível estimar a quantidade de enzimas. Entretanto este método não se mostrou eficiente nem viável para determinação de alfa-amilases em açúcar bruto, visto que não é possível estabelecer uma correlação linear entre a concentração de enzimas e unidades de atividade enzimática. Outra desvantagem do método é a baixa sensibilidade. Assim, apesar de ser bem conhecido principalmente para determinação de alfa-amilases na indústria de panificação, este método não é adequando para quantificar alfa-amilases residuais em amostras de açúcar.

2. Método de Phadebas: este método baseia-se na hidrólise do polímero insolúvel amido-cibacron blue pelas α-amilases e a liberação de fragmentos de coloração azul que podem ser quantificados através da absorbârieia no comprimento de onda de 620 nm. EGGLESTON (2005) rela ou que este método é mais adequado para determinação qualitativa de α-amilases em açúcar bruto. Dentre as principais desvantagens desta metodologia destaca-se o alto custo do reagente Phadebas e do papel de filtro específico (W atman) necessário para a realização do ensaio. Além disso, 6 prazo de validade do reagente é bem curto. ?

3. _M_-é__t——o——d_o____d_o__—B_P__N_P__G__7_: este método baseia-se «.·no uso do substrato maltoheptosídeo que possui em uma das extremidades da molécula um grupo terminal p-nitrofenol , e da enzima coadjuvante α-glicosidase . Na presença de a- amilases acontece a hidrólise da maltoheptosídeo ao acaso e em seguida a α-glicosidase hidrolisa os subprodutos liberando o p-nitrofenol . A mistura final desenvolve coloração amarelada do p-nitrofenol que pode ser medida pelo espectrofotômetro . Esta metodologia aplicada para determinação de α-amilase residual não se mostra adequada, pois a solução enzimática contendo as α-amilases extraídas de açúcar apresenta coloração que acaba por causar interferência no método. 4. Método de Bernfeld Modificado: este método, que foi modificado por BOURNE et al. (1979) , baseia-se na medida de açúcares redutores formados a partir do substrato amido solúvel que é hidrolisado por alfa-amilases presentes no açúcar bruto. A α-amilase residual da amostra é extraída segundo um protocolo que utiliza etanol para precipitação em temperaturas baixas das enzimas presentes na solução de açúcar bruto, que em seguida é dissolvido em água destilada. Este método se mostra bem eficiente na quantificação de α-amilases residuais presentes em amostras de açúcar bruto, inclusive com ótima reprodutibilidade. Entretanto como principais desvantagens destaca-se a necessidade de equipamentos sofisticados e com custo elevado (centrífuga refrigerada, etc.) que seria um empecilho para as práticas rotineiras da Usina. Além disso, o tempo de análise seria em torno de 1 hora, que também é um tempo considerável, principalmente pensando em medidas corretivas urgentes para adequar o processo de produção. Avaliação da viscosidade da amostra através do tempo de queda (.Falling Number)

O método conhecido como " Falling Number" foi desenvolvido em 1968 por Peter Perten (GB1197087, GB1215347) para a determinação de viscosidade e consistência de um fluido (ex. farinha e água) . Esses documentos mostram a invenção do equipamento de Falling Number, seus componentes e em que se baseia a análise. Este método foi desenvolvido e posteriormente utilizado para medir a viscosidade como um parâmetro de qualidade de uma amostra de farinha (suspensão) , já que o grão de trigo, dependendo de condições climáticas, possui mais ou menos atividade diastásica. Neste sentido a presença de enzimas na farinha é um indicativo da degradação do amido e assim da qualidade desta matéria prima, principalmente na área de panificação. Vale destacar que o método do Falling Number foi testado e padronizado internacionalmente (AACC 56-81B, ICC 107, ISO 3093) e atualmente sua aplicação destina-se a determinação da atividade da alfa-amilase em grãos e farinhas de cerais, principalmente trigo, centeio e cevada. Porém nunca foi utilizado ou adaptado para medir enzimas em outros substratos, como o açúcar.

Assim, o equipamento de Falling Number (FN) é usado normalmente pela indústria moageira (moinhos) para se definir a quantidade de alfa-amilases em mesclas de trigo (ou farinha) , de modo a correlacionar este parâmetro com a qualidade da amostra. Para a execução deste teste no FN é necessário uma quantidade de 10 gramas de amostra de farinha a ser testada, além de 25 mL de água deionizada. Primeiramente é adicionada a farinha aos tubos viscosimétricos de vidro, seguida da adição da água. Logo em seguida os tubos são agitados em equipamento homogeneizador e analisados segundo o tempo de queda (TQ) . De maneira resumida a correlação do tempo de queda com a qualidade da farinha se dá pela seguinte, relação:

- TQ < 150 segundos: atividade alta de enzimas com baixa qualidade do pão;

- 300 < TQ < 200 segundos: atividade ótima de enzimas com alta qualidade do pão;

- TQ > 300 segundos: atividade baixa de enzimas com baixa qualidade do pão.

Diante do exposto, a presente invenção propõe um novo método para detecção de residual de alfa-amilase em amostras de açúcar bruto ou intermediários além de outras matérias advindas do processo (caldo primário, caldo secundário, mel final, etc.) utilizando o método do Falling Number originalmente utilizado para medir atividade diastática em farinhas de trigo. Esta metodologia tem como principais vantagens a rapidez e a facilidade na execução, que pode ser executada por um técnico treinado e o resultado obtido em menos de 5 minutos. Em relação aos custos para a realização do teste, o principal gasto seria com a compra do equipamento e a manutenção de rotina. Os custos com os reagentes seriam mínimos, visto que os principais compostos necessários seriam: amido (podendo ser de diversas fontes) e água destilada para a diluição da amostra de açúcar.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

A presente invenção trata de método para detecção de alfa-amilase em açúcares ou intermediários em que o dito método avalia a viscosidade da amostra através do tempo de queda (Falling Number) e compreende as etapas de:

a. preparar uma amostra líquida de açúcar ou intermediários ;

b. adicionar a amostra líquida de açúcar ou intermediários obtida na etapa (a) em um recipiente apropriado contendo uma ou mais fonte de amido;

c. homogeneizar a solução obtida na etapa (b) ;

d. aquecer a solução obtida na etapa (c) ao mesmo tempo em que dita solução é agitada com uma haste até sua gelatinização;

e. soltar a haste no início do recipiente; f. verificar o tempo de queda da haste na solução gelificada, ao longo do comprimento total do recipiente;

g. comparar o tempo de queda obtido na etapa (f) com o tempo de queda de uma amostra de açúcar sem alfa-amilase (amostra controle) . DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção propõe um método inovador rápido de detecção de atividade residual de alfa-amilase em açúcar e/ou intermediários do processo de produção do açúcar. O método é baseado no principio do aparelho reológico de determinação de poder diastásico de farinha de trigo, o Falling Number (FN) .

A presente invenção trata de método para detecção de alfa-amilase em açúcares ou intermediários em que o dito método avalia a viscosidade da amostra através do tempo de queda {Falling Number) e compreende as etapas de:

a. preparar uma amostra liquida de açúcar ou intermediários ;

b. adicionar a amostra liquida de açúcar ou intermediários obtida na etapa (a) em um recipiente apropriado contendo uma ou mais fonte de amido;

c. homogeneizar a solução obtida na etapa (b) ;

d. aquecer a solução obtida na etapa (c) ao mesmo tempo em que dita solução é agitada com uma haste até sua gelatinização ;

e. soltar a haste no inicio do recipiente; f. verificar o tempo de queda da haste na solução gelificada, ao longo do comprimento total do recipiente;

g. comparar o tempo de queda obtido na etapa (f) com o tempo de queda de uma amostra de açúcar sem alfa-amilase (amostra controle) .

Para efeitos da presente invenção, o termo açúcar é definido como cristais de sacarose (dissacarideos ) obtidos através do processamento da cana de açúcar dentro das Usinas usados para diversas aplicações, principalmente em alimentos; e seus intermediários são definidos como os produtos obtidos após várias etapas da produção do açúcar como caldo (entre a moenda e o decantador) , xarope (tanque de xarope) , mel A, mel B, mel rico, mel pobre, mel final, melaço ou suas misturas (resíduo obtido após a centrifugação do xarope) .

De acordo com a invenção, a amostra líquida de açúcar ou intermediários é preparada a partir de açúcar no estado sólido (bruto) misturado com água destilada, sendo que o açúcar no estado sólido é escolhido entre açúcar bruto, demerara, mascavo, VHP, VVHP, açúcar branco, cristal branco (tipos I, II, III, IV e Especial) , açúcar refinado ou suas misturas. Em amostras preparadas a partir de açúcar no estado sólido a sua concentração varia entre 50 e 600 g/L; preferencialmente entre 80 g/L e 550 g/L; e mais especificamente entre 110 g/L e 500 g/L. Preferencialmente, emprega-se amostras preparadas de açúcar no estado sólido na concentração de 500 g/L.

Alternativamente, a amostra líquida de açúcar ou intermediários pode ser preparada a partir de açúcar no estado líquido escolhido entre caldo de cana, caldo primário, caldo secundário, caldo misto, caldo clarificado, caldo caleado, caldo sulfitado, caldo recuperado, xarope, mel A, mel B, mel rico, mel pobre, mel final, melaço ou suas misturas. Nas amostras de açúcar ou intermediários preparadas a partir de açúcar no estado líquido, o brix (teor de sólidos) varia entre 5 e 60°Brix; preferencialmente entre 8 e 55°Brix, mais especificamente entre 11 e 50°Brix. Preferencialmente, o teor de sólidos é de 20°Brix.

Como fonte de amido empregada no método segundo a invenção podem ser utilizados farinha de trigo, farinha de trigo enriquecida com ferro e/ou ácido fólico, farinha de arroz, farelo de trigo, farinha de milho, fubá, farinha de mandioca, tapioca, fécula de mandioca (polvilho doce ou polvilho azedo) , farinha de aveia, farinha de centeio, farinha de cevada, farinha de soja, farinha de girassol, amido solúvel, fécula de batata, amido modificado ou suas misturas. Preferencialmente, emprega-se amido modificado. Já a quantidade utilizada de fonte de amido varia entre 1,5 g e 10 g; preferencialmente entre 2 g e 8 g; mais preferencialmente, entre 3 g e 6 g, dependendo do teor de amido da fonte.

Segundo a invenção, o teor de amido contido no recipiente no qual será adicionada a amostra liquida de açúcar da etapa (a) varia entre 0,5 g e 4 g; preferencialmente entre 1 g e 3,8 g.

Vale ressaltar a viscosidade da solução obtida na etapa (d) (considerando o amido na forma gelatinizada) deve estar dentro da faixa de leitura {range) do aparelho que pode variar entre 400 e 600 cP, preferencialmente entre 400 e 500 cP.

A verificação da viscosidade foi realizada no equipamento Viscolite VL700-T15 ( small-sample portable viscometer) . Vale destacar que os valores de viscosidade podem variar, sem mudanças significativas, dependendo do equipamento .

Ainda em relação a etapa (d) , a temperatura de aquecimento varia entre 60°C e 100°C; preferencialmente entre 95°C e 100°C.

No caso de amostras de açúcar com baixa atividade baixa enzimática, opcionalmente, adiciona-se na etapa (b) ions de cálcio bivalente como indutor enzimático à amostra liquida de açúcar na concentração variando entre 30 e 100 ppm em relação ao teor de amido; preferencialmente, 50 a 60 ppm. Alternativamente, pode-se trabalhar com uma solução mais concentrada, atentando-se sempre à viscosidade da solução final na etapa (d) , que deve estar dentro do limite de detecção do aparelho.

No caso de amostras muito concentradas, estas podem ser diluídas de forma que atendam a faixa de viscosidade aceita pelo aparelho.

Outro ponto que deve ser levado em consideração é a necessidade de uma amostra de açúcar bruto sem enzimas (controle) para que se possa comparar a amostra a ser analisada segundo o tempo de queda. Caso não seja possível um açúcar controle, pode-se usar uma endo/exo protease (hidrólise a - 50°C por 30 minutos) que irá hidrolisar qualquer proteína presente (alfa-amilase) e utilizar esta solução como branco.

O principio deste método baseia-se na ação de enzimas presentes na amostra de açúcar sobre o amido, que pode ser detectável através do equipamento Falling Number que correlacionada os parâmetros viscosidade e tempo de queda. A viscosidade está diretamente relacionada ao tempo de queda da haste dentro tubo contendo esta amostra de amido. Assim, é possível inferir que quando existe a presença de enzimas no açúcar ocorre uma diminuição da viscosidade (hidrólise do amido) e consequentemente uma diminuição do tempo de queda de uma haste. A FIGURA 1 ilustra o método desenvolvido para detecção de enzimas residuais no açúcar, em que A: fonte de amido; B: amostra líquida de açúcar; C: equipamento Falling Number; D: análise da viscosidade da solução A + B. O método baseia-se na viscosidade de uma solução de amido interagindo com uma solução de açúcar.

A seguir são apresentados alguns exemplos de realizações da invenção, não devendo, contudo serem estes tomados para efeitos limitativos do escopo da mesma. Para exemplificar o método segundo a invenção para detecção de alfa-amilases em açúcar, foram feitos testes em laboratório com amostras de açúcar coletadas de duas Usinas que dosam regularmente alfa-amilases em diferentes pontos do processo produtivo de fabricação de açúcar.

Exemplo 1)

Foi realizado a mensuração do residual de alfa- amilase em açúcar branco em uma Usina que usa alfa-amilase termoresistente . Foram coletadas amostras de açúcar cinco em cinco horas a partir do inicio da aplicação das enzimas e analisadas segundo o método da invenção. Vale ressaltar que como controle do teste de residual foram usadas amostras de açúcar bruto onde não foram dosadas alfa- amilases durante o processo. Da mesma maneira como relatado anteriormente, as amostras foram coletadas de cinco em cinco horas e analisadas pelo método em questão.

Para a realização do teste foram utilizados 3 gramas de amido modificado (Amidomax 5550- Cargill) e uma solução de açúcar a ser testada na concentração de 500 g/L. 0 teste foi conduzido em sala com temperatura controlada entre 22°C e 24°C durante 3 horas.

Em uma Usina de Álcool e Açúcar que dosa alfa- amilase termoresistente, foram dosados cerca de 10 ppm de alfa-amilases termoresistentes no decantador.

A FIGURA 2 apresenta os resultados obtidos para a amostra controle (sem uso de enzima) e a amostra com a utilização da alfa-amilases termoresistentes.

A partir dos dados obtidos pela análise segundo a metodologia baseada na viscosidade, pode-se observar uma diferença muito pronunciada em relação ao tempo de queda das amostras (com enzima e sem enzima) coletadas ao longo do tempo. As amostras de açúcar que não foram utilizadas alfa-amilases durante o processo industrial apresentaram um tempo de queda da haste no equipamento Falling Number próximo a 740 segundos. Ao analisarmos as amostras onde foram utilizadas ^~alfa-amilases durante o processamento, pode-se observar que houve um diminuição do tempo de queda para valores próximos a 450 segundos. Estes resultados demostram que a presença de enzimas residuais (a-amilases) no açúcar bruto final, que em contato com o amido presente no equipamento foi capaz de hidrolisar o mesmo e diminuir a viscosidade da solução e diminuir o tempo de queda.

Para confirmar os resultados obtidos no método da presente invenção, as mesmas amostras foram enviadas para a Unicamp para análise do açúcar segundo a metodologia de Bernfeld modificada e validada por FIGUEIRA (2009) .

Este método de Bernfeld modificado por BOURNE et al. (1979), baseia-se na medida de açúcares redutores formados a partir do substrato amido solúvel. Primeiramente, a alfa-amilase residual da amostra de açúcar bruto foi extraída para continuação do protocolo. Para a preparação do substrato a suspensão de 3 g de amido solúvel (Merck) em 50 mL de água destilada foi aquecida por 10 minutos em ebulição. Após resfriamento até temperatura ambiente foi adicionado 50 mL de tampão fosfato 0,2 M pH 6,9 e o volume foi completado para 100 mL com água destilada. A mistura de 2,0 mL de solução 3% de amido solúvel em tampão fosfato 0,1 M pH 6,9; 0,1 mL de solução 0,5 M de cloreto de cálcio, 0,4 mL tampão fosfato 0,1 M pH 6,9 e 1,0 mL de solução de alfa-amilase foi incubada a 50°C por 20 minutos. Alíquotas de 0,5 mL da mistura de reação foram transferidas para tubos de ensaio e os açúcares redutores determinados pelo método de Somogyi-Nelson (1945) . Os resultados são mostrados na FIGURA 3.

Os resultados obtidos pela metodologia de Bernfeld modificada mostram que as amostras de açúcar ondem foram dosadas alfa-amilases no decantador apresentam residual no produto final. Por outro lado, o açúcar produzido sem a utilização de enzimas (controle) não apresentaram enzimas no produto final, o que era esperado. Neste sentido, os resultados corroboram com os obtidos no método segundo a invenção baseada na viscosidade/tempo de queda.

Exemplo 2

Foi realizada a mensuração do residual de alfa- amilase em açúcar branco em uma Usina Y que usa alfaamilase termoresistente . Foram coletadas amostras de açúcar cinco em cinco horas a partir do inicio da aplicação das enzimas e analisadas de acordo com o método da presente invenção. Em relação aos parâmetros do teste, foram dosados cerca de 8 ppm de alfa-amilases termoresistentes no evaporador. Vale ressaltar que como controle do teste de residual foram usadas amostras de açúcar bruto onde não foram dosadas alfa-amilases durante o processo.

Para a realização do teste foram utilizados 3 gramas de amido modificado (Amidomax 5550- Cargill) e uma solução de açúcar a ser testada na concentração de 500 g/L. O teste foi conduzido em sala com temperatura controlada entre 22°C e 24°C durante 3 horas.

A FIGURA 4 apresenta os resultados obtidos para a amostra controle (sem uso de enzima) e a amostra com a utilização da -amilases termoresistentes aplicadas no evaporador .

Neste segundo exemplo na Usina Y da aplicação, é possível observar que nas amostras onde não foram dosadas enzimas durante o processo o tempo de queda de acordo com o método da invenção foi de aproximadamente 740 segundos, assim como obtido no exemplo anterior. Ao analisar o tempo de queda das amostras de açúcar que receberam a alfa- amilase termoresistente no evaporarador , observa-se que houve uma queda acentuada do tempo de queda para valores próximos a 300 segundos, o que mostra mais uma vez a presença de -amilases no açúcar capaz de hidrolisar o amido e diminuir a viscosidade da solução. Vale destacar que o tempo de queda deste teste foi menor (300 s) quando comparado ao teste anterior (450 s) , devido provavelmente ao ponto de dosagem (evaporador) que favorece que com que as enzimas permaneçam ativas devido ao menor tempo e temperatura, insuficiente para desnaturá-las.

Para confirmar os resultados obtidos com o método da viscosidade/tempo de queda, as mesmas amostras foram analisadas na Faculdade de Engenharia de Alimentos da Unicamp segundo o Método de Bernfeld Modificado e validada por FIGUEIRA (2009), conforme detalhado no Exemplo 1.

A FIGURA 5 apresenta o resultado obtido pelo método de Bernfeld modificado que revela novamente que as amostras de açúcar obtidas sem a aplicação de alfa-amilases não apresentaram evidências de residuais de enzimas. Por outro lado, os açúcares ondem foram dosadas alfa-amilases na concentração de 8 ppm no evaporador apresentaram valores de concentração de enzimas em valores próximos a 1 ppm no produto final. Neste sentido os resultados corroboram com os obtidos segundo a metodologia baseada na viscosidade/tempo de queda.

Referências

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1) MÉTODO PARA DETECÇÃO DE ALFA-AMILASE EM AÇÚCARES OU INTERMEDIÁRIOS caracterizado pelo fato do dito método avaliar a viscosidade da amostra através do tempo de queda (Falling Number) e compreender as etapas de:

a. preparar uma amostra liquida de açúcar ou intermediários ;

c. homogeneizar a solução obtida na etapa (b) ;

2) MÉTODO PARA DETECÇÃO DE ALFA-AMILASE EM AÇÚCARES OU INTERMEDIÁRIOS segundo reivindicação 1 caracterizado pelo fato de que a amostra liquida de açúcar ou intermediários é preparada a partir de açúcar no estado sólido misturado com água destilada, sendo que o açúcar no estado sólido é escolhido entre açúcar bruto, demerara, mascavo, VHP, VVHP, açúcar branco, cristal branco (tipos I, II, III, IV e Especial), açúcar refinado ou suas misturas.

3) MÉTODO PARA DETECÇÃO DE ALFA-AMILASE EM AÇÚCARES OU INTERMEDIÁRIOS segundo reivindicação 2 caracterizado pelo fato de que a amostra liquida de açúcar ou intermediários preparada a partir de açúcar no estado sólido apresenta concentração variando entre 50 e 600 g/L; preferencialmente entre 80 g/L e 550 g/L; e mais especificamente entre 110 g/L e 500 g/L; preferencialmente, 500 g/L.

4) MÉTODO PARA DETECÇÃO DE ALFA-AMILASE EM AÇÚCARES OU INTERMEDIÁRIOS segundo reivindicação 1 caracterizado pelo fato de que a amostra liquida de açúcar ou intermediários é preparada a partir de açúcar no estado liquido escolhido entre caldo de cana, caldo primário, caldo secundário, caldo misto, caldo clarificado, caldo caleado, caldo sulfitado, caldo recuperado, xarope, mel A, mel B, mel rico, mel pobre, mel final, melaço ou suas misturas .

5) MÉTODO PARA DETECÇÃO DE ALFA-AMILASE EM

AÇÚCARES OU INTERMEDIÁRIOS segundo reivindicação 4 caracterizado pelo fato de que a amostra liquida de açúcar ou intermediários preparada a partir de açúcar no estado liquido apresenta brix (teor de sólidos) variando 5 e 60°Brix; preferencialmente entre 8 e 55°Brix, mais especificamente entre 11 e 50°Brix; preferencialmente, 20°Brix.

6) MÉTODO PARA DETECÇÃO DE ALFA-AMILASE EM AÇÚCARES OU INTERMEDIÁRIOS segundo reivindicação 1 caracterizado pelo fato de que a fonte de amido é escolhida entre farinha de trigo, farinha de trigo enriquecida com ferro e/ou ácido fólico, farinha de arroz, farelo de trigo, farinha de milho, fubá, farinha de mandioca, tapioca, fécula de mandioca (polvilho doce ou polvilho azedo) , farinha de aveia, farinha de centeio, farinha de cevada, farinha de soja, farinha de girassol, amido solúvel, fécula de batata, amido modificado ou suas misturas. 7) MÉTODO PARA DETECÇÃO DE ALFA-AMILASE EM AÇÚCARES OU INTERMEDIÁRIOS segundo reivindicação 1 caracterizado pelo fato da quantidade de fonte de amido variar entre 1,5 g e 10 g; preferencialmente entre 2 g e 8 g; mais preferencialmente, entre 3 g e 6 g, dependendo do teor de amido da fonte.

8) MÉTODO PARA DETECÇÃO DE ALFA-AMILASE EM AÇÚCARES OU INTERMEDIÁRIOS segundo reivindicação 1 caracterizado pelo fato de que o teor de amido contido no recipiente no qual será adicionada a amostra liquida de açúcar da etapa (a) variar entre 0,5 g e 4 g; preferencialmente entre 1 g e 3,8 g.

9) MÉTODO PARA DETECÇÃO DE ALFA-AMILASE EM AÇÚCARES OU INTERMEDIÁRIOS segundo reivindicação 1 caracterizado pelo fato de que a viscosidade da solução gelatinizada obtida na etapa (d) varia entre 400 e 600 cP; preferencialmente, 400 e 500 cP.

10) MÉTODO PARA DETECÇÃO DE ALFA-AMILASE EM AÇÚCARES OU INTERMEDIÁRIOS segundo reivindicação 1 caracterizado pelo fato da temperatura de aquecimento da etapa (d) variar entre 60°C e 100°C; preferencialmente, 95°C a 100°C.

11) MÉTODO PARA DETECÇÃO DE ALFA-AMILASE EM AÇÚCARES OU INTERMEDIÁRIOS segundo reivindicação 1 caracterizado por compreender opcionalmente, na etapa (b) , a adição de cálcio bivalente na amostra liquida de açúcar em concentração variando entre 30 e 100 ppm em relação ao teor de amido; preferencialmente, entre 50 a 60 ppm.