WO2015181390A1 - Diagnose von krebserkrankungen - Google Patents

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WO2015181390A1
WO2015181390A1 PCT/EP2015/062050 EP2015062050W WO2015181390A1 WO 2015181390 A1 WO2015181390 A1 WO 2015181390A1 EP 2015062050 W EP2015062050 W EP 2015062050W WO 2015181390 A1 WO2015181390 A1 WO 2015181390A1
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cancer
cancer cells
microfluidic
cells
cell detection
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PCT/EP2015/062050
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Sylvain Tourel
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Aba Gmbh & Co. Kg
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
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    • B01L3/502761—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip specially adapted for handling suspended solids or molecules independently from the bulk fluid flow, e.g. for trapping or sorting beads, for physically stretching molecules
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
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    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/56—Staging of a disease; Further complications associated with the disease

Definitions

  • the invention relates to a method for the diagnosis of cancer and its use, in particular for the provision of profiles and their use.
  • Cancer is a class of diseases caused by
  • cancer and cancer covers a class of diseases that have in common that they form malignant tumors, and more than 200 different tumors have been identified to date.
  • the hallmark of all malignant tumors is the uncontrolled proliferation of cells that displace healthy tissue (invasion of adjacent tissue) and metastases to form in tissues of the whole body (distant metastases) .
  • stage III Classification of cancer into stages I, II, III and IV (or A-D) or staging by TNM classification as well as information on the aggressiveness of the disease. From stage III (C) it can be determined that the tumor grows beyond its area of origin and displaces the surrounding tissue. From stage IV (D) are
  • Tumor markers are predominantly proteins or peptides that are present in the blood or other body fluids of the patient or on the body
  • tumor markers are also detectable on cells of normal tissue and are characterized in tumors only by their different frequencies.
  • a variety of different tumor markers have been linked to various cancers.
  • CTCs cancer cells in early diagnosis.
  • the cells are cancer cells
  • CTC circulating tumor cells
  • DTC disseminated tumor cells
  • CTCs are slightly larger than the blood cells in the blood, such as red or white blood cells or even
  • CTCs for Tumor Diagnosis.
  • the presence of CTCs in peripheral blood is an indication of a possible scattering of cells of a solid tumor at a very early stage, in which conventional metastatic examination methods (CT, etc.), yet no metastasis can be detected. Therefore, both the detection and characterization of CTCs in peripheral blood are promising approaches, systemic
  • tumor cancer as well as cancer cells, tumor cells are synonymous to read.
  • Retention times for the purposes of this invention means the time the cancer cells take to travel through a suitable “column” (from injection to detection).
  • the speed can be determined. From several runs, the mean retention time as well as the mean velocity of the cancer cells can be determined.
  • the mobile phase can be any carrier with a
  • Flow rate such as gas or liquid, which may have a conventional gradient.
  • buffers such as PBS and the like. as well as such
  • Liquids that are suitable for cancer cells like
  • Growth media e.g. DMEM growth medium, RPMI growth medium.
  • the gradient can be arbitrary, in particular a concentration gradient or pressure gradient.
  • Suitable pumps are e.g. commercially available from Fluigent, which are particularly suitable for microfluidics (below).
  • a “column” in the sense of this invention is preferably a device of "microfluidics” (also called “chip”), in particular containing a microchannel or microcapillary
  • Diameter of a cancer cell (about 10 to 30 pm).
  • the length of such a microchannel may vary from 1 mm to 10 cm or more.
  • the width is for example 10 to 150 pm or even more to 1,000 pm. Usually such are
  • Microchannels rectangular in cross-section e.g., 80 x 20 pm.
  • channels which have a depth of approximately 20 ⁇ m, in particular 10 to 30 ⁇ m.
  • the flow rate is preferably 0.02 pl / min to 10 pl / min.
  • the microfluidic contains a suitable sample holder.
  • a suitable microfluidics is for example commercially available
  • the so-called "straight channel chips" made of PMMA or Topas from Microfluidic ChipShop are preferably made of a transparent material and the design, ie the guidance of the microchannel can be arbitrary, but a channel guide according to FIG Each substraight can be easily equipped with different stationary phases.
  • Each microfluidic device produced can be provided with a barcode.
  • the detection of the cancer cells entering the column and / or cancer cells emerging from the column can be carried out by conventional means known to those skilled in the art (light barriers, electrodes, conductivity measurement), so that the retention times as well as the velocities can be determined reliably and precisely , Furthermore, the
  • Cancer cells to be labeled with a sensor for detection e.g. a fluorescent label, a fluorophore (e.g., BISBENZIMIDE HOECHST NO 33342 TRIHYDROCL 1) or other label.
  • a sensor for detection e.g. a fluorescent label, a fluorophore (e.g., BISBENZIMIDE HOECHST NO 33342 TRIHYDROCL 1) or other label.
  • the cell detection can also optically based on the
  • Microfluidics done, for example, with a microscope or a fluorescence microscope. Optical detection is possible based on contrast differences.
  • the cell detection is carried out by means of computer-aided readout, namely a microscope combined with a camera (so-called
  • Microscope camera eg inverted microscope Leica (objective 4 and 10) among others
  • a cell detection software eg Medealab, Er Weg, see example.
  • Motion analysis can be done.
  • a window can also be the (average) retention time as well
  • the said cancer cells have on the surface specific tumor markers or cell surface molecules, e.g. CD45, Pan-CK, CD133, N-cadherin, E-cadherin, aSMA, ASGPR1, Twist, C-Met, Epithelial Cell Adhesion Molecule (EpCAM, CD326),
  • tumor markers or cell surface molecules e.g. CD45, Pan-CK, CD133, N-cadherin, E-cadherin, aSMA, ASGPR1, Twist, C-Met, Epithelial Cell Adhesion Molecule (EpCAM, CD326),
  • Carcioembryonic antigen CEA
  • Alpha Ferroprotein AFP
  • Carbohydrate antigen 19/9 CA 19-9
  • Cancer antigen 72/4 CA 72-4
  • Cancer antigen 125 Cancer antigen 15/3 ( CA 15-3)
  • neuron-specific enolase NSE
  • SCC squamous cell carcinoma antigen
  • CYFRA cytokeratin fragment
  • HCG Chorionic gonadotropin
  • PSA prostate specific antigen
  • HSG human thyroglobulin
  • MCA mucin-like cancer associated antigen
  • the time required is advantageously directly proportional to the amount of tumor markers contained on a cancer cell and allows the specific profiling or the creation of a profile ("Fingerprint") of at least one cancer cell examined, in particular CTC.
  • the stationary phase over several areas each have different receptors for
  • Has tumor markers see, for example, Figure 2.
  • these respective areas can be arranged one behind the other on the stationary phase.
  • the invention relates to a method for diagnosing cancer or characterizing cancer cells, wherein the
  • Retention times of cancer cells are determined, wherein the determination of the retention time by means of a microfluidic, in particular by means of a microchannel (also microcapillary) takes place and at least one receptor for a tumor marker, in particular several areas of
  • Preparation of such regions can be accomplished using linkers known to those skilled in the art, e.g. Biotin / (strept) avidin, etc., so that the receptor is sufficiently fixed in the stationary phase.
  • linkers known to those skilled in the art, e.g. Biotin / (strept) avidin, etc.
  • a biotin-aptamer / antibody (receptor) can be fixed / coupled with streptavidin (see example).
  • other coupling systems are well known to those skilled in the art, e.g. Molecular Imprinting (Seung-Woo Lee, Toyoki Kunitake, Handbook of Molecular Imprinting: Advanced Sensor Applications, CRC-Press (2012)).
  • Tumor markers are coated. That the microchannel is accordingly designed with a modified stationary phase, referred to below and below as "coating".
  • Microfluidic be designed in such a way that portions of the micro channel have coatings and others
  • a microfluidic device may have a coating and another microfluidic device in the same design may not have a coating.
  • a first window may have no coating and a second or further window may have a coating.
  • This procedure allows comparative investigations or serves as control / reference.
  • FIG. 5 shows by way of example a calibration curve and allows the calculation of the equilibrium constant or the like. Consequently, the method according to the invention can be standardized and allows the repeatable reproduction of the
  • the results can be recorded and systemized as desired and displayed in profiles.
  • profiles can be assigned to one or more patients / test persons, also within the framework of a personalized medicine or with existing data (eg "big data” or “data cloud”), for example to be matched to another tumor diagnosis.
  • ((mean) retention times or (mean) rates of cancer cells) can be collected and stored in an (electronic) database.
  • the different profiles can be used on the basis of the database
  • the invention relates to a method for risk stratification of
  • risk stratification comprises finding patients
  • a risk stratification according to the invention consequently allows an effective treatment method of cancers with anticancer drugs.
  • the invention also relates to the identification of patients at increased risk and / or an unfavorable one
  • inventive method therefore allows clinical
  • the invention also relates to a method for
  • the method according to the invention therefore relates to the therapy control of cancers.
  • the invention relates to the diagnosis and / or risk stratification for prognosis, to the differential diagnostic early detection and recognition, to the assessment of the degree of severity and to the therapy-accompanying course assessment of a cancer
  • Diagnosis, prognosis, stratification and / or detection can be performed.
  • the invention also relates to the use of a kit comprising a microfluidic according to the invention for carrying out the method according to one of the preceding embodiments, if necessary., Including further conventional auxiliaries.
  • the invention relates to a kit comprising a microfluidic according to the invention for carrying out the method including means for computer-aided readout of microfluidics, in particular a microscope combined with a camera (so-called microscope camera) and a cell detection software including conventional computer (IT hardware) and database.
  • a microscope combined with a camera (so-called microscope camera)
  • a cell detection software including conventional computer (IT hardware) and database.
  • the invention relates to a method in which cancer cells are enriched in a first step from a body sample, and then only the retention times
  • DEP di-electrophoresis
  • dielectrophoretic chip for continuous bioparticle filtering, focusing, sorting, trapping, and detecting, Biomicrofluidics. 2007 May 10; 1 (2): 21503, Cheng IF, Chang HC, Hou D, Chang HC; Microelectromechanical Systems, Journal of (Volume: 16, Issue: 4), A Programmable Biochip for the Applications of Trapping and Adaptive Multisorting Using Dielectrophoresis Array, Ting Chen Shih; Nat. Tsing Hua Univ., Hsinchu, Kuang-han Chu;
  • Sample preparation can consist of body fluids,
  • Chip Microfluidics
  • sterile filtered PBS filled One end is connected to the chip via the olive, the other end is immersed in a 50ml tube containing approx. 25ml PBS.
  • the cells are controlled by gravity by raising and lowering the 50ml tube (this gives an exact control of the cell possible)
  • the 50ml tube is mounted on tripod clamps to always reach the same flow speed.
  • Jurkat cells were grown in RPMI medium (5% CO 2 , 37 degrees C) (RPMI medium with penicillin, streptomycin and L-glutamine and 25 mM Hepes (order number Lonza: 09-774F, 10 ml 100 mM Na pyruvate (order number Lonza BE13-115E), 50 ml FBS
  • Capillaries from Chipshop (20 pm wide, 20 pm deep, 5.7 cm long) were used and coated with a polystreptavidin R coating kit (Biotez, Berlin, product no .: BTCK-MC0020) according to instructions.
  • This coating is prepared in 5 steps: pre-coating, 8 degrees C, incubate overnight, 5x wash with 0.9% NaCl solution, polystreptavidin R 50ug / mL, 8 degrees C, incubate overnight, wash 5x with dd water .
  • SGC8 is a specific aptamer against Jurkat CEM cells that fold at 95 degrees C, 5min and 95C -> 20 degrees C, 2 degrees C / min. Steps :
  • Exposure Time 42.0, frame rate: 30 fps
  • FIG. 2 describes a microfluidic system with several regions of different receptors for tumor markers
  • FIG. 3 shows a profile or fingerprint according to the invention.
  • FIG. 4 shows the reproducibility of the retention times or velocities of the biotin aptamer ST A 10 against Jurkat cells by means of a microfluidic device according to Example 1.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Diagnose von Krebs und dessen Verwendung, insbesondere zur Bereitstellung von Profilen und deren Verwendung.

Description

Diagnose von Krebserkrankungen Be s ehre ibung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Diagnose von Krebs und dessen Verwendung, insbesondere zur Bereitstellung von Profilen und deren Verwendung.
Krebs ist eine Klasse von Erkrankungen, die durch
unkontrolliertes Zellwachstum und durch die Streuung
entarteter Zellen im Körper gekennzeichnet ist und im Fall der Metastasierung schließlich zum Tod des Patienten führt.
Unter der Bezeichnung „Krebs und Krebserkrankungen" wird eine Krankheitsklasse zusammengefasst , die gemeinsam haben, dass sie maligne Tumore bilden. Bis heute wurden mehr als 200 verschiedene Tumore identifiziert. Charakteristisch für alle malignen Tumore ist die unkontrollierte Proliferation der Zellen, die Fähigkeit gesundes Gewebe verdrängen zu können (Invasion des benachbarten Gewebes) und Metastasen in Gewebe des ganzen Körpers ausbilden zu können (Fernmetastasen) . Diese drei Prozesse sind für das Fortschreiten von Krebs
charakteristisch und sie werden als Kriterien zur
Klassifizierung von Krebs in die Krebsstadien I, II, III und IV (bzw. A-D) bzw. zur Stadieneinteilung mittels TNM- Klassifikation als auch zur Aussage über die Aggressivität der Erkrankung herangezogen. Ab Stadium III (C) ist feststellbar, dass der Tumor über sein Entstehungsgebiet hinauswächst und das umliegende Gewebe verdrängt. Ab Stadium IV (D) sind
Fernmetastasten feststellbar. Je nach Krebsstadium ist eine unterschiedliche Behandlung empfehlenswert, um einen
Heilungserfolg zu erzielen. Daher ist die frühzeitige
Identifikation als auch die Einschätzung der Aggressivität der Tumorzellen von hoher Bedeutung, um das geeignete
Therapieverfahren für einen Patienten auszuwählen. Die Diagnose von Krebserkrankungen erfolgt vor allem durch
bildgebende Verfahren, wie MRT, CT und dergleichen, als auch durch den Nachweis von spezifischen Tumormarkern. Tumormarker sind vorwiegend Proteine oder Peptide, die im Blut oder anderen Körperflüssigkeiten des Patienten oder auf der
Zelloberfläche nachgewiesen werden und deren erhöhte
Konzentration auf einen Tumor hinweist.
Da sich maligne Tumorzellen aus mutierten Zellen des
Normalgewebes entwickeln, sind die Tumormarker auch auf Zellen des Normalgewebes nachweisbar und zeichnen sich in Tumoren lediglich durch ihre unterschiedliche Häufigkeit aus. Eine Vielzahl an unterschiedlichen Tumormarkern wurde mit diversen Krebserkrankungen in Verbindung gebracht .
Als besonders geeignete Krebszellen in der frühen Diagnostik erweisen sich „CTCs". Bei den Zellen handelt es sich
insbesondere um zirkulierende Tumorzellen (engl, circulating tumor cells, CTC oder (plur.) CTCs), mesenchymale Stammzellen aus peripherem Blut oder anderen Körperflüssigkeiten sowie disseminierte Tumorzellen aus Knochenmark (engl, disseminated tumor cells, DTC) (nachstehend gemeinsam: „CTC") .
CTCs sind etwas größer als die Blutzellen im Blut, wie zum Beispiel rote oder weiße Blutkörperchen oder auch
Blutplättchen und können mittels Filter (z.B mittels Parylene) aus Patienten- oder Probandenblut angereichert werden (DE 20 2012 003 212 Ul, WO2010/135603) , auch wenn nur ein CTC sich unter 10E10 Blutzellen im peripheren Blut befindet, wie es bei Krebspatienten vorkommen kann. DE 10 2010 032 081 AI
beschreibt eine Membranfiltration zur Anreicherung und
Isolierung von CTCs zu Zwecken der Tumordiagnose. Das Vorkommen von CTCs in peripherem Blut ist ein Hinweis auf eine mögliche Streuung von Zellen eines soliden Tumors zu einem sehr frühen Stadium, in dem mit üblichen bildgebenden Untersuchungsverfahren (CT, etc.) noch keine Metastasierung nachgewiesen werden kann. Daher stellen sowohl der Nachweis als auch die Charakterisierung von CTCs in peripherem Blut vielversprechende Ansätze dar, systemische
Tumorzellausbreitung sehr frühzeitig zu erkennen und CTCs als prognostischen Marker zu nutzen. Dadurch könnten Prognosen und kontinuierliche Beobachtung von systemischen Therapien
ausgesprochen bzw. durchgeführt werden. Weiterhin könnte die Charakterisierung und Bewertung von CTCs als diagnostisches Instrument genutzt werden, um eine geeignete Behandlung für solide Tumore auszuwählen.
Ausgehend von diesem Stand der Technik hat sich der Erfinder die Aufgabe gestellt, ein neues Verfahren zur Diagnose von Krebszellen, insbesondere CTCs, bereitzustellen.
Überraschender Weise kann mittels der Bestimmung von
Retentionszeiten von Krebszellen ein Diagnoseverfahren
durchgeführt werden.
Im Sinne dieser Erfindung sind die Begriffe Tumor, Krebs als auch Krebszellen, Tumorzellen synonym zu lesen.
Erfindungsgemäß bevorzugt sind jedoch CTC.
„Retentionszeiten" im Sinne dieser Erfindung bedeutet die Zeit, die die Krebszellen zum Durchwandern einer geeigneten „Säule" benötigen (von der Injektion bis zur Detektion) .
Erfindungsgemäß wird unter „Retention" der verzögerte
Durchfluss von einzelnen Krebszellen der mobilen Phase durch Wechselwirkung mit der stationären Phase verstanden, wie in der Chromatographie üblich. Krebszellen, die keine Wechselwirkung mit einer stationären Phase aufweisen entsprechen der Totzeit der mobilen Phase. Aus den
Retentionszeiten kann die Geschwindigkeit ermittelt werden. Aus mehreren Durchläufen kann die mittlere Retentionszeit als auch die mittlere Geschwindigkeit der Krebszellen bestimmt werden .
Die mobile Phase kann ein beliebiger Träger mit einer
Durchflussrate sein, wie Gas oder Flüssigkeit, welche einen üblichen Gradienten aufweisen kann. Besonders geeignet sind als mobile Phase Puffer, wie PBS u.a. als auch solche
Flüssigkeiten, die für Krebszellen geeignet, wie
Wachstumsmedien, z.B. DMEM-Wachstumsmedium, RPMI- Wachstumsmedium. u.a. Der Gradient kann beliebig sein, insbesondere ein Konzentrationsgradient oder Druckgradient sein. Geeignete Pumpen sind z.B. von der Firma Fluigent kommerziell erhältlich, die besonders für eine Mikrofluidik (unten) geeignet sind.
Eine „Säule" im Sinne dieser Erfindung ist bevorzugt eine Vorrichtung einer „Mikrofluidik" (auch „Chip" genannt) , insbesondere enthaltend einen Mikrokanal oder Mikrokapillare. Ganz besonders bevorzugt sind solche Mikrokanäle im
Durchmesser einer Krebszelle (ca. 10 bis 30 pm) . Die Länge eines solchen Mikrokanals kann von 1 mm bis 10 cm oder mehr variieren. Die Breite beträgt beispielsweise 10 bis 150 pm oder auch mehr bis 1.000 pm. Üblicher Weise sind solche
Mikrokanäle rechteckig im Querschnitt (z.B. 80 x 20 pm) .
Erfindungsgemäß bevorzugt sind solche Kanäle die eine Tiefe von ca. 20 pm, insbesondere 10 bis 30 pm aufweisen.
Die Durchflussrate beträgt vorzugsweise 0,02 pl/min bis 10 pl/min. Weiterhin enthält die Mikrofluidik eine geeignete Probenaufnahme. Eine geeignete Mikrofluidik ist z.B. käuflich erhältlich und zwar so genannte „Straight Channel Chips" aus PMMA oder Topas von Microfluidic ChipShop. Die Mikrofluidik besteht vorzugsweise aus einem transparenten Material und das Design, d.h. die Führung des Mikrokanals kann beliebig sein, bevorzugt ist jedoch eine Kanalführung gem. Figur 2, so dass jede Teilgerade leicht mit jeweils verschiedenen stationären Phasen bestückt werden kann.
Eine jede hergestellte Mikrofluidik kann mit einem Barcode versehen sein.
Die Detektion der in die Säule eintretenden Krebszellen und / oder aus der Säule austretenden Krebszellen (= Zelldetektion) kann mit üblichen dem Fachmann bekannten Mitteln erfolgen (Lichtschranken, Elektroden, Leitfähigkeitsmessung) , so dass die Retentionszeiten als auch die Geschwindigkeiten sicher und präzise bestimmt werden können. Weiterhin können die
Krebszellen zur Detektion mit einem Sensor markiert sein, z.B. eine Fluoreszenzmarkierung, ein Fluorophor (z.B. BISBENZIMIDE HOECHST NO 33342 TRIHYDROCL 1) oder ein sonstiges Label aufweisen .
Die Zelldetektion kann ebenfalls optisch anhand der
Mikrofluidik erfolgen, beispielsweise mit einem Mikroskop oder einem Fluoreszenzmikroskop. Eine optische Detektion ist anhand von Kontrastunterschieden möglich.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Zelldetektion mittels computergestützter Auslesung und zwar einem Mikroskop kombiniert mit einer Kamera (so genannte
Mikroskop-Kamera, z.B. inverted Mikroskop Leica (Objektiv 4 und 10) u.a.) unter Verwendung einer Zelldetektionssoftware (z.B. Medealab, Erlangen, siehe Beispiel). Eine solche Zelldetektionssoftware erlaubt das
computergestützte Erfassen der Krebszellen in einem beliebigen Fenster (Ausschnitt) im Mikrokanal, so dass die Krebszellen individuell gezählt werden können, als auch eine
Bewegungsanalyse erfolgen kann. Anhand eines solchen Fensters kann ebenfalls die (mittlere) Retentionszeit als auch
(mittlere) Geschwindigkeit der Krebszellen ermittelt werden.
Die besagten Krebszellen weisen auf der Oberfläche spezifische Tumormarker oder Zelloberflächenmoleküle auf, wie z.B. CD45, Pan-CK, CD133, N-Cadherin, E-Cadherin, aSMA, ASGPR1, Twist, C- Met, epitheliale Zelladhäsionsmolekül (EpCAM, CD326),
Carcioembryonales Antigen (CEA) , Alpha Ferroprotein (AFP) , Carbohydrate-Antigen 19/9 (CA 19-9), Cancer-Antigen 72/4 (CA 72-4), Cancer-Antigen 125, Cancer-Antigen 15/3 (CA 15-3), Neuronenspezifische Enolase (NSE) , Squamous cell Carcinoma antigen (SCC) , Cytokeratin-Fragment (CYFRA) , Humanes
Choriongonadotropin (HCG) , Prostataspezifisches Antigen (PSA) , Humanes Thyreoglobulin (HTG) , Mucin-like Cancer associated antigen (MCA) . Weitere Tumormarker können der allgemeinen Literatur entnommen werden. Aufgrund dieser Tumormarker können mit der stationären Phase dynamische Wechselwirkungen
auftreten. Besonders bevorzugt sind jedoch erfindungsgemäß solche stationären Phasen die Rezeptoren für Tumormarker aufweisen, wie Antikörper (polyklonale oder monoklonale) , Aptamere, Peptide, Proteine oder andere dem Fachmann bekannte Rezeptoren für Tumormarker.
Je mehr Wechselwirkungen zwischen den Krebszellen in der mobilen Phase und der stationären Phasen auftreten, desto länger beträgt die charakteristische Retentionszeit. Die benötigte Zeit ist vorteilhaft direkt proportional zur Menge der auf einer Krebszelle enthaltenen Tumormarker und erlaubt die spezifische Profilierung bzw. das Erstellen eines Profils („Fingerprint" ) mindestens einer untersuchten Krebszelle, insbesondere CTC.
Weiterhin ist bevorzugt, dass die stationäre Phase über mehrere Bereiche jeweils verschiedene Rezeptoren für
Tumormarker aufweist, siehe exemplarisch Figur 2. Bevorzugt können diese jeweiligen Bereiche hintereinander auf der stationären Phase ausgelegt sein.
Daher betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Diagnose von Krebs oder Charakterisierung von Krebszellen, wobei die
Retentionszeiten von Krebszellen, vorzugsweise CTC, bestimmt werden, wobei die Bestimmung der Retentionszeit mittels einer Mikrofluidik, insbesondere mittels eines Mikrokanals (auch Mikrokapillare) erfolgt und mindestens einen Rezeptor für einen Tumormarker, insbesondere mehrere Bereiche von
verschiedenen Rezeptoren für Tumormarker aufweist. Zur
Herstellung solcher Bereiche können dem Fachmann bekannte Linker verwendet werden, wie z.B. Biotin/ ( Strept ) avidin, o.a, so dass der Rezeptor hinreichend in der stationären Phase fixiert ist. Z.B. kann auf diese Weise ein Biotin- Aptamer/Antikörper (Rezeptor) mit vorgelegtem Streptavidin fixiert /gekoppelt werden (siehe Beispiel). Selbstverständlich sind andere Koppelungssysteme dem Fachmann einschlägig bekannt, wie z.B. das Molecular Imprinting (Seung-Woo Lee, Toyoki Kunitake, Handbook of Molecular Imprinting: Advanced Sensor Applications, CRC-Press (2012)).
Auf diese Weise kann eine Mikrofluidik mit einen oder
mehreren, gleichen oder verschiedenen Rezeptor (en) für
Tumormarker beschichtet werden. D.h. der Mikrokanal ist entsprechend mit einer modifizierten stationären Phase, vor- und nachstehend „Beschichtung" genannt, ausgestaltet.
Bevorzugt werden Aptamere eingesetzt, da die richtige Konformation mittels Rückfaltung (z.B. 5 min. bei 85 Grad C mit anschließender Abkühlung auf Raumtemperatur) wieder- bzw. in situ hergestellt werden kann.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann die
Mikrofluidik in der Weise gestaltet sein, dass Teilbereiche des Mikrokanals Beschichtungen aufweisen und andere
Teilbereiche keine Beschichtung aufweisen.
Weiterhin kann eine Mikrofluidik eine Beschichtung aufweisen und eine weitere Mikrofluidik im gleichen Design kann keine Beschichtung aufweisen.
Im Rahmen der bevorzugten Methode zur Zelldetektion mittels computergestützter Auslesung mittels einer Mikroskop-Kamera kann ein erstes Fenster keine Beschichtung aufweisen und ein zweites oder weiteres Fenster eine Beschichtung aufweisen.
Dieses Vorgehen erlaubt vergleichende Untersuchungen oder dient der Kontrolle/Referenz.
Je nach verwendeter Mikrofluidik kann beispielsweise in
Abhängigkeit der Beschichtung eine Kalibrierung erfolgen. Die Figur 5 zeigt exemplarisch eine Kalibrierungskurve und erlaubt die Berechnung der Gleichgewichtskonstante oder dergleichen. Folglich kann das erfindungsgemäße Verfahren standardisiert werden und erlaubt die wiederholbare Reproduktion der
Messergebnisse ( (mittlere) Retentionszeiten oder (mittlere) Geschwindigkeiten der Krebszellen) .
Die Ergebnisse können in Abhängigkeit der Versuchsparameter (Mikrofluidik, Beschichtung, Krebszelle, Tumormarker, etc.) beliebig erfasst und systematisiert werden und in Profilen dargestellt werden. Solche Profile können einem oder mehreren Patienten/Probanden zugeordnet werden, auch im Rahmen einer personalisierten Medizin oder mit bestehenden Daten (z.B. „big data" oder „Datenwolke") z.B. zu einer anderen Tumordiagnose abgeglichen werden.
Die einzelnen Profile aus den erhaltenen Messergebnissen
( (mittlere) Retentionszeiten oder (mittlere) Geschwindigkeiten der Krebszellen) können in einer (elektronischen) Datenbank gesammelt und abgelegt werden. Anhand der Datenbank können beispielsweise die verschiedenen Profile miteinander
verglichen und systematisch ausgewertet werden.
Dies erlaubt vorteilhaft eine Risikostratifizierung oder Therapiesteuerung, da beispielsweise Metastasen und andere Risiken erkannt werden können. Weiterhin können vorteilhaft Patienten nach Risikogruppen stratifiziert werden.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft daher die Erfindung ein Verfahren zur Risikostratifizierung von
Probanden/Patienten. Der Begriff „Risikostratifizierung" umfasst erfindungsgemäß das Auffinden von Patienten,
insbesondere Notfallpatienten und Risikopatienten, mit der schlechteren Prognose, zwecks intensiverer Diagnostik und Therapie/Behandlung von Krebserkrankungen mit dem Ziel einen möglichst günstigen Verlauf der Krankheit zu ermöglichen. Eine erfindungsgemäße Risikostratifizierung erlaubt in Folge ein effektives Behandlungsverfahren von Krebserkrankungen mit Krebsmedikamenten .
Daher betrifft die Erfindung ebenfalls die Identifizierung von Patienten mit erhöhtem Risiko oder/und einer ungünstigen
Prognose von Krebserkrankungen und zwar bei symptomatischen und / oder asymptomatischen Patienten, insbesondere
Notfallpatienten . Besonders vorteilhaft kann insbesondere in Fällen der Notfall- und /oder Intensivmedizin mittels des erfindungsgemäßen
Verfahren eine sichere Stratifizierung erfolgen. Das
erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht daher klinische
Entscheidungen, die zu einem schnellen Therapieerfolg und zur Vermeidung von Todesfällen führen. Solche klinischen
Entscheidungen umfassen ebenfalls weiterführende Behandlung mittels Arzneimitteln zur Behandlung oder Therapie von
Krebserkrankungen .
Daher betrifft die Erfindung ebenfalls ein Verfahren zur
Diagnose und / oder Risikostratifizierung von Patienten von Krebserkrankungen zur Durchführung von klinischen
Entscheidungen, wie weiterführende Behandlung und Therapie mittels Arzneimitteln, insbesondere in der zeitlich kritischen Intensivmedizin oder Notfallmedizin, einschließlich der
Entscheidung zur Hospitalisierung des Patienten.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft das erfindungsgemäße Verfahren daher die Therapiesteuerung von Krebserkrankungen .
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform betrifft die Erfindung die Diagnose und / oder Risikostratifizierung zur Prognose, zur differentialdiagnostischen Früherkennung und Erkennung, zur Beurteilung des Schweregrades und zur therapiebegleitenden Verlaufsbeurteilung einer Krebserkrankung, wobei mittels der erfindungsgemäßen erfolgten Profilierung schnell und
zuverlässig ggfs. unter Verwendung einer Datenbank die
Diagnose, Prognose, Stratifizierung und / oder Erkennung durchgeführt werden kann.
Die Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung eines Kits aufweisend eine erfindungsgemäße Mikrofluidik zur Durchführung des Verfahrens nach einem der vorstehenden Ausführungsformen, ggfs. samt weiteren üblichen Hilfsmitteln.
Desweiteren betrifft die Erfindung ein Kit aufweisend eine erfindungsgemäße Mikrofluidik zur Durchführung des Verfahrens samt Mittel zur computergestützten Auslesung der Mikrofluidik, insbesondere einem Mikroskop kombiniert mit einer Kamera (so genannte Mikroskop-Kamera) und einer Zelldetektionssoftware samt üblichem Computer (IT-Hardware) und Datenbank.
Zur allgemeinen Literatur der anwendungsgemäßen Mikrofluidik für Krebszellen sei auf das folgende Schrifttum verwiesen: Microfluidic approaches for Cancer cell detection,
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Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren, wobei in einem ersten Schritt aus einer Körperprobe Krebszellen angereichert werden, und anschließend erst die Retentionszeiten
erfindungsgemäß bestimmt werden. Dies kann beispielsweise mit einem Zellsortierer oder Separator erfolgen. Besonders
bevorzugt ist jedoch die DEP (Di-electrophoresis )
Anreicherung/Sortierung von CTC: An integrated
dielectrophoretic chip for continuous bioparticle filtering, focusing, sorting, trapping, and detecting, Biomicrofluidics . 2007 May 10 ; 1 (2 ) : 21503 , Cheng IF, Chang HC, Hou D, Chang HC; Microelectromechanical Systems, Journal of (Volume: 16 , Issue: 4 ) , A Programmable Biochip for the Applications of Trapping and Adaptive Multisorting Using Dielectrophoresis Array, Ting- Chen Shih; Nat . Tsing Hua Univ., Hsinchu, Kuang-han Chu ;
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Romani, A., Medoro, G., Altomare, L.
Die Probenvorbereitung kann aus Körperflüssigkeiten,
insbesondere Blut, Serum, Plasma, Urin eines Probanden/Patienten erfolgen, wie beispielsweise für CTC in EP 2 706 357 oder supra beschrieben. Das erfindungsgemäße
Verfahren wird ex-vivo/ in-vitro durchgeführt.
Beispiele und Figuren:
Diese Beispiele dienen ausschließlich zur Erläuterung der Erfindung, ohne die Erfindung auf diese Beispiele zu
beschränken .
Beispiele :
Beispiel 1
Mikrofluidik ("Chip")
Straight Channel Chips aus PMMA von Microfluidic ChipShop, Interface Olive, Silikonschlauch ID = ca. 1mm, OD = ca.
0.75mm. Der Silikonschlauch wird vollständig mit
sterilfiltriertem PBS gefüllt. Ein Ende wird über die Olive an den Chip angeschlossen, das andere Ende ist in einem 50ml Tube mit ca. 25ml PBS eingetaucht und befestigt Die Steuerung der Zellen erfolgt durch die Schwerkraft über Anheben und Absenken des 50ml Tubes (dadurch ist eine exakte Steuerung der Zelle möglich) Das 50ml Tube wird auf Stativklemmen aufgesetzt, um immer dieselbe Fließge-schwindigkeit zu erreichen.
Beispiel 2
Herstellung von Profilen:
Jurkat-Zellen wurden in RPMI-Medium (5% C02, 37 Grad C) gezüchtet (RPMI Medium mit Penicillin, Streptomycin und L- Glutamine und 25mM Hepes (Bestellnummer Lonza: 09-774F, 10ml lOOmM Na-Pyruvat (Bestellnr. Lonza BE13-115E) , 50ml FBS
(Bestellnummer VWR: BCHRS 0615) ) .
Es wurden Kapillare der Firma Chipshop (20 pm breit, 20 pm tief, 5,7cm lang) verwendet und mit einem Polystreptavidin R Coating kit (Biotez, Berlin, Produkt-Nr: BTCK-MC0020 ) nach Anleitung beschichtet. Diese Beschichtung wird in 5 Schritten hergestellt: Pre-Coating, 8 Grad C, über Nacht inkubieren, 5x Waschen mit 0,9% NaCl Lösung, Polystreptavidin R 50ug/mL, 8 Grad C, über Nacht inkubieren, 5x Waschen mit dd-Wasser,
Trocknen der Beschichtung über 2h bei Raumtemperatur.
Fixieren des Aptamer SGC8 (5'-Cy5, 3 '-Biotin) (Aptamers evolved from live cells as effective molecular probes for Cancer study, Proc Natl Acad Sei U S A. 2006 Aug
8; 103 (32) : 11838-43. Epub 2006 Jul 27, Shangguan Dl, Li Y, Tang Z, Cao ZC, Chen HW, Mallikaratchy P, Sefah K, Yang CJ, Tan W) an der Kapillarwand durch Biotin / Streptavidin-Bindung .
SGC8 ist ein spezifisches Aptamer gegen Jurkat CEM Zellen mit Faltung bei 95 Grad C, 5min und 95C -> 20 Grad C, 2 Grad C/min. Schritte :
Fixieren der rückgefalteten Aptameren erfolgt mittels 1 ml Spritze und zwar bis zur Hälfte der Kapillarlänge, 10 min Inkubation bei 20 Grad C, 5x Waschen mit PBS, 1 mL Jurkat- Zellkulturen bei 500g für 5 min zentrifugieren, Überstand entfernen, 2x Waschen mit 1 mL PBS, Zellkonzentration wird mit Mikroskop bestimmt, 100 Zellen werden in Kapillaranschluss injiziert mittels Insulinspritze, Kapillaranschluss an
Spritzpumpe anschließen mit einem Durchfluss von 0,5 μΐ/min, Geschwindigkeit der einzelnen Zelle wird mittels Inverted Mikroskopie messen (Zeituhr) , wobei Abschnitte mit Beschichtung erfindungsgemäß die Zellen verlangsamen nachstehend gezeigt:
Durchflussrate 3 μΐ/min ohne
Beschichtung
Messung Retentionszeit [s] Strecke [mm] Geschwindigkeit [μιη/s]
1. 80 10 125
2. 76 10 132
3. 68 10 147
4. 65 10 154
5. 62 10 161
Durchschnitt 70,2 10 142 mit Beschichtung
Messung Retentionszeit [s] Strecke [mm] Geschwindigkeit [pm/s]
1. 77 10 130
2. 80 10 125
3. 79 10 127
4. 80 10 125
5. 90 10 111
6. 77 10 130
Durchschnitt 80,5 10 124
Durchflussrate 2 μΐ/min ohne
Beschichtung
Messung Retentionszeit [s] Strecke [mm] Geschwindigkeit [μιη/s]
1. 110 10 90,909
2. 103 10 97,087
3. 100 10 100,000
4. 97 10 103,093
5. 94 10 106,383
Durchschnitt 100,8 10 99,206 mit Beschichtung
Messung Retentionszeit [s] Strecke [mm] Geschwindigkeit [μιη/s]
1. 126 10 79,365
2. 126 10 79,365 3. 124 10 80,645
4. 123 10 81,301
5. 115 10 86,957
Durchschnitt 122,8 10 81,433
Die dargelegten Ergebnisse stellen ein erfindungsgemäßes Profil oder Fingerprint dar.
Beispiel 3
Beschreibung der Zelldetektion mittels computergestützter Auslesung und zwar einem Mikroskop in Kombination mit einer Kamera (Mikroskop-Kamera) unter Verwendung einer
ZelldetektionsSoftware .
Der Einsatz der Zelldetektionssoftware medea AV Multimedia und Software GmbH, Erlangen, Germany (medeaLAB Tracking) erlaubt die spezielle Bewegungsanalyse als auch das Zählen von Zellen und deren Auswertung.
Kamera: Basler acA2040-90um USB 3.0-Kamera mit dem CMOSIS CMV4000 CMOS-Sensor
90 Bilder pro Sekunde (fps-frames per second) , 4 MP
(Megapixel) , monochromatischen Auflösung von 2048 x 2048 Pixeln (px) (Pixelgröße: 5,5 μιη x 5,5 μιη)
Einstellungen bei Durchlicht: Gain: 0, Gamma: 1.0,
Exposure Time: 42.0, Bildrate: 30 fps
Tracking options: Match factor: 2.5, Runtime: flexibel anpassbar, Image raster: 1, Realtime [on/off]:
Search positions: 10.000 Z.B. Messung einer 800χ20μιη Mikrofluidik halbbeschichtet mit „ST_A_10" [lOOpmol], hierbei handelt es sich um ein Biotin- Aptamer, welches mit lOOpmol in der stationären Phase vorliegt, gegen Jurkat Zellen in der mobilen Phase (PBS- Puffer) .
Tabelle :
Figure imgf000018_0001
Zeit in s / Retentionszeit
Links: Fenster 1, Rechts: Fenster 2 Beschreibung der Figuren:
Figur 1 beschreibt das Prinzip der Erfindung (Begriffe: No or low, high interaction = keine oder niedrige, hohe
Wechselwirkung, Flow = Fluß, Single Cell Detector =
Einzelzelldetektor, time = Zeit) .
Figur 2 beschreibt eine Mikrofluidik mit mehreren Bereichen von verschiedenen Rezeptoren für Tumormarker zur
Charakterisierung von Krebszellen, bzw. Diagnose von Krebs.
Figur 3 zeigt ein erfindungsgemäßes Profil oder Fingerprint.
Figur 4 zeigt die Reproduzierbarkeit der Retentionszeiten bzw. Geschwindigkeiten des Biotin-Aptamers ST A 10 gegen Jurkat- Zellen anhand einer Mikrofluidik gemäß Beispiel 1.
Figur 5 zeigt die Abhängigkeit des Geschwindigkeitsverhältnis (Beschichtung/ohne Beschichtung) des Biotin-Aptamers gegen Jurkat-Zellen . Ohne Beschichtung liegt das Verhältnis bei 1, bei 10 pmol Beschichtung bei 0,85, bei 50 pmol Beschichtung bei 0,65, bei 100 pmol Beschichtung bei 0,54 mit Annäherung an einer Geraden (= Asymptote) .

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Diagnose oder Risikostratifizierung von Krebs oder Charakterisierung von Krebszellen, wobei die Retentionszeiten von Krebszellen bestimmt werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Krebszellen CTCs sind .
3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Patentansprüche, wobei die Bestimmung der Retentionszeit mittels einer Mikrofluidik, insbesondere mittels eines Mikrokanals erfolgt .
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Patentansprüche, wobei die Mikrofluidik oder der Mikrokanal mindestens einen Rezeptor für einen Tumormarker aufweist,
insbesondere polyklonale oder monoklonale Antikörper, Aptamere, Peptide, Proteine.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Patentansprüche, wobei die Mikrofluidik oder der Mikrokanal mehrere
Bereiche von verschiedenen Rezeptoren für Tumormarker aufweist .
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Patentansprüche, wobei die Bestimmung der Retentionszeit mittels einer Zelldetektion, insbesondere mittels optischer
Zelldetektion erfolgt, beispielsweise mit einem Mikroskop oder einem Fluoreszenzmikroskop.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Patentansprüche, wobei die Bestimmung der Retentionszeit mittels einer Zelldetektion erfolgt, insbesondere mittels
computergestützter Auslesung und zwar einem Mikroskop kombiniert mit einer Kamera unter Verwendung einer
Zelldetektionssoftware erfolgt.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Patentansprüche, wobei eine Profilierung einzelner Krebszellen unter
Erhalt eines Profils oder Fingerprint erfolgt.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Patentansprüche, wobei einzelne Profile in einer Datenbank abgelegt werden und miteinander verglichen werden.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Patentansprüche, zur Diagnose und / oder Risikostratifizierung als auch Identifizierung von Patienten mit erhöhtem Risiko
oder/und einer ungünstigen Prognose von
Krebserkrankungen, insbesondere bei symptomatischen und / oder asymptomatischen Patienten, zur Durchführung von klinischen Entscheidungen, wie weiterführende Behandlung und Therapie mittels Arzneimitteln, insbesondere in der zeitlich kritischen Intensivmedizin oder Notfallmedizin, einschließlich der Entscheidung zur Hospitalisierung des Patienten .
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Patentansprüche, zur Prognose, zur differentialdiagnostischen
Früherkennung und Erkennung, zur Beurteilung des
Schweregrades und zur therapiebegleitenden
Verlaufsbeurteilung einer Krebserkrankung.
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Patentansprüche, wobei in einem ersten Schritt aus einer Körperprobe
Krebszellen angereichert werden, und anschließend die Retentionszeiten bestimmt werden. Verwendung eines Kits aufweisend eine Mikrofluidik nach einem der vorstehenden Ansprüche zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 12.
Verwendung eines Kits aufweisend eine Mikrofluidik nach einem der vorstehenden Ansprüche zur Durchführung eines Verfahrens nach Anspruch 13 enthaltend Mittel zur computergestützten Auslesung der Mikrofluidik,
insbesondere ein Mikroskop kombiniert mit einer Kamera und einer Zelldetektionssoftware .
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