WO2015180993A1 - Hefestamm zur produktion von carotinoiden - Google Patents

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WO2015180993A1
WO2015180993A1 PCT/EP2015/060924 EP2015060924W WO2015180993A1 WO 2015180993 A1 WO2015180993 A1 WO 2015180993A1 EP 2015060924 W EP2015060924 W EP 2015060924W WO 2015180993 A1 WO2015180993 A1 WO 2015180993A1
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WO
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gene
yeast strain
yeast
phytoene
carotenoids
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PCT/EP2015/060924
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English (en)
French (fr)
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Simone Mitterweger
Andreas Raab
Michael Schilling
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Wacker Chemie AG
Original Assignee
Wacker Chemie AG
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P23/00—Preparation of compounds containing a cyclohexene ring having an unsaturated side chain containing at least ten carbon atoms bound by conjugated double bonds, e.g. carotenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • C07K14/39—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts
    • C07K14/395—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts from Saccharomyces

Definitions

  • the invention relates to a yeast strain for the production of carotenoids, processes for its preparation and its use for the production of carotenoids.
  • carotenoid refers to a structurally diverse class of pigments derived from the isoprenoid biosynthetic pathway.
  • the first important step in carotenoid biosynthesis is the formation of phytoene from geranylgeranyl pyrophosphate.
  • Carotenoids can be cyclic or
  • carotenoids includes both carotenes and xanthophylls.
  • carotenoids are hydrocarbon compounds that have a conjugated polyene carbon backbone that is formed from isopentenyl pyrosophosphate phosphate. Included herein are triterpenes and tetraterpenes, as well as their oxygenated derivatives and other compounds of lengths of e.g. C35, C50, C60, C70, C80. Many carotenoids have strong ones
  • light-absorbing properties and may be greater in length C200.
  • C30 diapocarotenoids are typically composed of six isoprene units connected so that the arrangement of the
  • Carotenoids may have originated from an acyclic C30H42 structure that has a long central chain
  • conjugated double bonds e.g. by hydrogenation, dehydrogenation, cyclization, oxidation, esterification,
  • C40 carotenoids typically consist of eight isoprene
  • Such C40 carotenoids may have arisen from an acyclic C40H42 structure that has a long central chain of conjugated double bonds, eg, through
  • the class of C40 carotenoids also contains certain compounds that result from rearrangement of the carbon skeleton or removal of parts thereof
  • Carotenoids include, among others:
  • Peridinin phytoene, rhodopin, rhodopin glucoside, 4-ketorubixanthin, siphonaxanthin, spheroidene, spheroidene,
  • carotenoids contain derivatives of these molecules which may contain hydroxy, methoxy, oxo, epoxy, carboxy, or aldehyde groups.
  • esters e.g., glycoside
  • Esters fatty acid esters
  • sulfate derivatives eg, esterified xanthophylls
  • They serve as antioxidants for membrane protection by trapping oxygen and peroxide radicals. Their antioxidant properties are attributable to their structure.
  • Carotenoids are one of the most important ingredients in food. They are natural dyes, such as yellow or red, which has a major impact on the acceptance of many foods. In addition, are Some carotenoids precursors of vitamin A. Carotenoids often have a health-promoting effect by being able to prevent diseases such as cancer, cardiovascular diseases, macular degeneration or cataracts.
  • carotenoids The interest in carotenoids has increased significantly in recent years, mainly due to their health benefits, but also due to the growth of different markets or sectors. These include agriculture, especially aquaculture and the poultry industry, the food supplement industry, the food industry, where carotenoids are used as colorants for sausages, soft drinks or baked goods, as well as the pharmaceutical or cosmetics industry. Carotenoids are synthesized from isoprene precursors, some of which are also involved in the production of steroids or
  • IPP Isopentenyl pyrophosphate
  • Geranylgeranyl pyrophosphate formed. Enzymes involved in carotenoid biosynthesis include GGPP synthase (CrtE), phytoene synthase (CrtB), phytoene -or
  • the yeast Saccharomyces cerevisiae is a robust, industrially well-established production organism that has good growth characteristics, a broad substrate spectrum and exceptional salt and osmotolerance. It is therefore responsible for biotechnological production on an industrial scale. especially suitable.
  • S. cerevisiae is fully sequenced, well characterized and all tools for genetic optimization are established.
  • S. cerevisiae offers a great advantage because it is able to deposit large quantities of lipidic components in an inert form intracellularly in lipid particles, whereby the physiology of the yeast cell remains largely unaffected.
  • S. cerevisiae offers a great advantage because it is able to deposit large quantities of lipidic components in an inert form intracellularly in lipid particles, whereby the physiology of the yeast cell remains largely unaffected.
  • cerevisiae has no native carotenoid biosynthetic pathways, but produces via the mevalonate biosynthetic pathway all the terpenes which are the basic building blocks of the carotenoids, such as isopentenyl diphosphate, dimethylallyl diphosphate, geranyl diphosphate and farnesyl diphosphate (see FIG. 1).
  • yeast S. cerevisiae is, in principle, capable of carotenoids synthesize when genes (or enzymes) of the carotenoid biosynthetic pathway are heterologously introduced.
  • the enzymes GGPP synthase and phytoene synthase must be introduced, for which the corresponding genes are called crtE and crtB.
  • beta-carotene requires the expression of additional genes called crtl and crtY, which encode the enzymes phytoene desaturase and lycopene cyclase (Ukibe, K. et al, Applied and Environmental Microbiology, 2009, 75 (22) Verwaal, R. et al., Applied and Environmental Microbiology., 2007, 73 (13), pp. 4342-4,350).
  • crtl and crtY encode the enzymes phytoene desaturase and lycopene cyclase
  • the literature also discloses a bifunctional enzyme which catalyzes two enzymatic steps. This is the phytoene synthase / lycopene cyclase from Xanthophyllomyces dendrorhous, which is encoded by the gene crtYB.
  • This enzyme combines the activities of the genes crtY and crtß, so that in addition to the gene crtYB only the genes crtE and crtJ have to be expressed for the synthesis of beta-carotene.
  • crtYB the genes crtE and crtJ have to be expressed for the synthesis of beta-carotene.
  • Cryptoxanthin additionally requires the expression of the gene crtz.
  • the synthesis of astaxanthin is achieved by the additional expression of the gene crtW (see FIG. 4).
  • these genes were introduced from the basidiomycete yeast Xanthophyllomyces dendrorhous into 3. cerevisiae, which led to the synthesis of ß-carotene, zeaxanthin, astaxanthin, and other carotenoids, albeit at levels that were too low for industrial production appear.
  • PDR1 encodes the zinc finger transcription factor Pdrlp, which regulates "yeast pleitropic drug responses.”
  • Pdrlp serves as a transcriptional activator and repressor by binding to Pleitropic drug response (PDRE) elements found in the promoter regions of target genes is.
  • PDRE Pleitropic drug response
  • the object of the present invention was to provide a yeast strain which produces carotenoids in larger quantities than known yeast strains and stores them intracellularly.
  • the object is achieved by a yeast strain of the genus Saccharomyces with an established carotenoid biosynthesis pathway, characterized in that it can overexpress a PDR1 gene or PDRI homologue.
  • the PDR1 gene is preferably characterized by the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 6 and the PDR1 gene product Pdrlp, preferably by the amino acid sequence SEQ ID NO: 7.
  • PDR1 homologs those genes are to be encoded which code for proteins with Pdrlp function which, when analyzed with the algorithm BLAST 2.2.1 (Altschul, Stephen; Gish, Warren; Miller, Webb; Eugene; Lipman, David (1990). "Basic local alignment search tool." Journal of
  • PDR1 homologues are also allelic variants of the PDR1 gene, in particular functional variants which are derived by deletion, insertion or substitution of nucleotides from SEQ ID NO: 6, but the Pdrlp activity of the respective gene product is retained.
  • the activity of the PDR1 homologs, as well as the activity of the PDR1 gene, is determined by determining the increase in carotenoid biosynthesis in strains in which carotenoid biosynthesis has been established.
  • the PDR1 gene or the PDR1 homologs to the yeast codon optimized gene PDR1 (SEQ ID NO: 6).
  • a gene is considered to be overexpressed if the level of protein activity of the encoded gene product is increased by at least 5% compared to a yeast strain of the same genetic background that has not been genetically modified to express the protein. ren.
  • the increased activity of the gene product is evident from a correspondingly increased carotenoid production compared to a strain which is unmodified in its PDR1 expression.
  • the carotenoid content is preferably increased by at least 2-fold compared to a carotenoid-producing yeast strain that does not overexpress the PDR1 gene.
  • the carotenoid biosynthesis pathway is preferably established in the yeast strain according to the invention by expressing the genes crtYB, crtE and crtl.
  • yeast codon optimized gene crtE SEQ ID NO: 3
  • the yeast codon optimized gene crtYB SEQ ID NO: 4
  • the yeast codon optimized gene ertJ SEQ ID NO: 5
  • the yeast strain of the invention is a strain of the species Saccharomyces cerevisiae.
  • it is preferably a strain of the species S. cerevisiae of the enzymes present in the carotenoid
  • Biosynthesis are expressed and at least one PDR1 gene or PDR1 homologue overexpressed.
  • Particular preference is given to a strain of the species Saccharomyces which expresses the genes GGPP synthase and phytoene synthase, and / or phytoene desaturase and / or lycopene cyclase and overexpresses at least one PDR1 gene or PDRI homologue.
  • the strain AH22th3ura8 which additionally overexpresses at least one PDR1 gene or PDRI homologue.
  • the GGPP synthases are preferably an enzyme having one of the following Genbank ACCESSION # AAT92871, XP_447025, NP_984623, XP_390273, XP_404791, XP_368486, Q92236, AA085432, XP_572774, XP_502923, AAK11525, XP_326920, CAF32032, BAD29965, XP_384767, BAD29970 , CAB89115, CAG09545, CAI13753, AAH69913, AAH67768, XP_455003, P56966, NP_001007, AAT65717,
  • NP_440010 AAL17614, NP_520343, AAL76349, AAM21638, AAM21639, NP_622916, AAM48650, NP_659794, AAM64496, AA 65107, NP_680811, ZP_000474, ZP_001252, NP_698760, E84566, F85434, AC1245,
  • BAC42571 NP_785195, NP__790546, AA063392, AA093113, NP_833891, AAP59037, ZP_001374, NP_864766, NP_875521, NP_881399,
  • NP_884694 NP_888456, NP_893187, NP_894940, NP__896835,
  • NP_896835 AAQ65086, NP_945877, NP_946867, NP_952815, AAR37805, AAR37858, AAR98495, AAR99082, NP_965349, NP_980544, EAA96348, EAB36506, EAB36642, EAC39208, EAD26007, EAE43084, EAE70061, EAF70308, EAG88494, EAH52060, EAH78354, EAH84117, EAI11762, EAI49391, EAI54846, EAI68356, EAI68713, EAI69401, EAI73873,
  • phytoene dehydrogenases are preferably enzymes having one of the following Genbank accession numbers:
  • AAA24820 AAA34001, AAA50313, AAA64981, AAA91161, AAA99519,
  • BAC77668 BAC77671, BAD07279, BAD07280, BAD07287, BAD07288,
  • EAE06978 EAE70773, EAF04985, EAF51354, EAF62819, EAF75453,
  • EAG39845 EAG56100, EAG63013, EAG68633, EAG71574, EAG89835,
  • the synthases and lycopene cyclases are preferably enzymes having one of the following genebank accession numbers: 1613414C, A49558, AAA19428, AAA32836, AAA64982, AAB87738,
  • AAK07734 AAK07735, AAK15621, AAL02001, AAL76346, AAL82578,
  • EAE31084 EAE35665, EAE44717, EAE46627, EAE47846, EAE72264,
  • NP_443763 NP_624523, NP_630832, NP_662273, NP_682350,
  • NP_924690 NP_931516, NP_946861, NP_949079, NP__962005,
  • the carotenoid ketolases are preferably enzymes with one of the following Genbank accession numbers:
  • AAA99932 AAB48668, AAC25611, AAF78203, AAH16427, AAN03484,
  • AAN85497 AAN86030, AA064399, AAQ23139, AAT35222, AAT35555, AAV41372 AB2307, AF2204, BAB54999, BAB58879, BAC98366,
  • CAA60478 CAB56059, D87673, EAA79304, EAA80363, EAA81403,
  • NP_895643 NP_896386, NP_897461, NP_924674, NP_ _927525,
  • the carotenoid hydroxylases are preferably
  • AAC44852 AAC49443, AAD54243, AAG10430, AAG10793, AAG33636,
  • Syntheses are preferably enzymes having one of the following Genbank accession numbers: AAM56288, XP_571276, EAL20013, XP_401804, XP_397817, XP_399595, XP_403279,
  • the lycopene cyclases, beta and epsilon subunits are preferably enzymes having one of the following genebank accession numbers: AAK07431, ABB52073, Q38932,
  • Saccharomyces strains in particular S. cerevisiae strains are available from the Leibniz Institute DSMZ - German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH, Inhoffen No 7B, 38124 Braunschweig.
  • the strain according to the invention additionally comprises a transcriptionally-deregulated HMG-CoA reductase.
  • the HMG-CoA reductase is preferably deregulated in such a way that the enzyme formed no longer has an N-terminal membrane domain but only the catalytic subunit.
  • the strain of the invention is AH22tH3ura8 -G4 -GK6.
  • a yeast strain according to the invention is prepared, for example, by the mentioned genes in Saccharomyces, preferably in S. cerevisiae, preferably the heterologous genes GGPP synthase and phytoene synthase, and / or phytoene desaturase
  • yeast codon optimized variants of the genes are preferably used, as they have been mentioned, for example, above.
  • the expression or overexpression of said genes can take place both episomally and chromosomally.
  • the transformation of the yeast cells with the genes mentioned is preferably carried out in a customary manner, as for example in Schiestl R.H., et al. , Curr Genet. Dec, 16 (5-6): 339-346
  • promoters which are not subject to catabolite repression and do not require a specific carbon source for induction.
  • the skilled worker is aware of such promoters.
  • PGK glucose-6-phosphate isomerase promoter
  • TEFI ribosomal protein-encoding gene promoter
  • LAC4 the alcohol dehydrogenase promoter (ADH1), preferably an altered (constitutive) version of the ADH1 promoter (SEQ ID NO: 8), ADH4 and the like), the enolase promoter (ENOL) and the hexose (glucose) transporter promoter ( HXT7).
  • ADH1 alcohol dehydrogenase promoter
  • ENOL enolase promoter
  • HXT7 hexose transporter promoter
  • Enhancer or upstream activating sequences are known in the art.
  • Suitable terminator sequences are e.g. available from the cytochrome c1 (CYC1) gene or the enolase 1 (ENOL) gene.
  • Preferred promoters are the TEFI promoter, TDH3 promoter, constitutive version of the ADH1 promoter, ENOL promoter
  • the heterologous genes more preferably the genes GGPP synthase and phytoene synthase, and / or phytoene desaturase and / or lycopene cyclase are introduced by chromosomal integration, for example in the form of a gene cassette in S. cerevisiae.
  • the gene PDR1 or a PDR1 homolog is preferably also introduced in the form of a gene cassette. Such a method is described in the examples.
  • PDR1 encodes a yeast transcription factor. Its gene sequence is known from the databases of the National Center for Biotechnology Information (NCBI).
  • the yeast strain according to the invention can preferably be prepared by incorporating into a S. cerevisiae strain which can produce carotenoids, since it contains the heterologous genes coding for the enzymes phytoene synthase / lycopene cyclase, GGPP synthase and phytoene desaturase from X. dendrorhous, and in which the HMG-CoA reductase gene is deregulated, the PDR1 gene or a homolog of the PDR1 gene is introduced and overexpressed.
  • a yeast strain according to the invention can be prepared by using a yeast strain with a deregulated terpene biosynthesis pathway as starting strain.
  • the preparation of such strains is described, for example, in O2011023298.
  • Such strains show a strong overproduction of the triterpene squalene and all precursors which are relevant for carotenoid production (see FIG. 1).
  • a strong overproduction is preferably to be understood as meaning that after 72 hours of cultivation under standard conditions in a shaking flask> 10% of the dry biomass is squalene or one of the precursors mentioned.
  • an invented According to the invention strain produce a carotenoid selected from the group phytoene, beta-carotene, beta-cryptoxanthin, zeaxanthin.
  • the deregulation of the terpene biosynthetic pathway is preferably achieved by deregulation of the HMG-CoA reductase and removal of the negative regulation at the protein level.
  • HMG-CoA reductase is the key enzyme for terpene overproduction because it is known as a pacemaker enzyme in the sterol biosynthetic pathway and is a "bottleneck" in the biosynthetic pathway from acetyl-CoA to squalene (see Figure 1).
  • a PDR1 gene is introduced in a manner known per se. The strain must express at least the two enzymes GGPP synthase and phytoene synthase and may optionally express any number of other carotenoid synthesis genes.
  • yeast strains are cultured in a manner known per se and the carotene isolated after cell disruption.
  • the production of carotenoids with yeasts of the genus Saccharomyces is described, for example, in Ukibe, K., Hashida, K., Yoshida, N.
  • the invention thus also relates to a process for the production of carotenoids in which a yeast strain is fermented in a manner known per se and the carotenoids are isolated after cell disruption, characterized in that the yeast strain is a yeast strain according to the invention.
  • intracellular carotenoids there is a significantly increased amount of intracellular carotenoids after 120 to 144 hours cultivation of the strain in the shake flask.
  • the content of intracellular Ca Rotinoids were determined by cell disruption by HPLC and compared to the value of a control strain which expresses only the carotenoid synthesis genes and does not overexpress the PDR1 gene.
  • FIG. 1 shows by way of example the biosynthesis pathway of squalene in the yeast Saccharomyces cerevisiae.
  • FIG. 2 shows the gene cassette 4 which is produced and used in example 3.
  • FIG. 3 shows the gene cassette 6 which is shown in Example 4
  • FIG. 4 shows by way of example the carotenoid biosynthesis pathway in the yeast Saccharomyces cerevisiae
  • the standard culture for the strains of the yeast Saccharomyces cerevisiae was as follows:
  • Preculture 20 ml of WMVIII medium was inoculated in a 100 ml shake flask with 20 .mu.l of the corresponding glycerol culture and shaken for 48 h at 30.degree. C. and 150 rpm on an incubation shaker.
  • AH22tH3ura8 -GK4 Genetically-linked strains of AH22tH3ura8 -GK4 (see Figure 2 and 3 for the preparation) are auxotrophic for leucine. Therefore, the medium was supplemented with leucine (400 mg / L) Genetically AH22ura3 or AH22tH3ura8 strains are auxotrophic for leucine and uracil. Therefore, the medium was supple- mented with leucine (400 mg / L) and uracil (100 mg / L)).
  • MVIII medium 50 g sucrose, 250 mg NH 4 H 2 PO 4 , 2.8 NH 4 Cl, 250 mg MgCl 2 ⁇ 6H 2 O, 100 mg CaCl 2 ⁇ 2H 2 0, 2 g KH 2 P0 4 , 550 mg MgS0 x 7H 2 0, 75 mg meso-inositol and 10 g Na-glutamate.
  • the described substances were weighed and made up with 1 L of distilled water. After autoclaving, sterile-filtered (0.22 ⁇ ) trace elements, vitamins and amino acids were added: 1 ml 1000 x trace elements, 4 ml 250 x vitamin solution (stock solutions).
  • Trace elements 1000 times concentrated, for one liter: 1.75 g ZnS0 4 x 7H 2 0; 0.5 g of Fe 2 S0 4 x 7 H 2 O; 0.1 g CuSO 4 ⁇ 5 H 2 O; 0.1 g MnCl 2 ⁇ 4 H 2 O; 0.1 g NaMo0 4 x 2 H 2 0.
  • Vitamin solution concentrated 250 times, for one liter: 2.5 g nicotinic acid; 6.25 g of pyridoxine; 2.5 g of thiamine; 0.625 g of biotin; 12.5 g of Ca-pantothenic acid.
  • Amino acid stock solutions were prepared at a concentration of 20 mg / ml and sterile filtered.
  • the DNA sequence of t-HMG1 was synthesized by PCR from genomic DNA of Saccharomyces cerevisiae S288C available from the American Type Culture Collection (ATCC 204508 ) using standard methods (Mortimer and Johnston (Genetics 113 (1986), 35-43).
  • the primers used in this case were the DNA oligomer tH G-5 '(SEQ ID NO: 1) and tHMG-3 1 (SEQ ID NO: 2).
  • the DNA fragment which was obtained was introduced after Klenow treatment into the cloning vector pUC19, available from New England Bicolabs Inc., USA, Ipswich and led to the vector pUC19-tHMG.
  • the plasmid pPT2b-tHMG thus prepared contains the truncated ADH1 promoter (Bennetzen and Hall (Yeast 7 (1982), 475-477) and TRP1 terminator (Tschumper G, Carbon J.
  • a DNA region was prepared from the vector pPT2b-tHMG with the This region carries the so-called medium-length ADH1 promoter, the t-HMGl gene and the TRP1 terminator
  • This DNA piece was introduced into the yeast vector YEpl3 available from the American Type Culture Collection (ATCC 37115) (Fischhoff et a (Gene 27 (1984), 239-251)) treated with the endonucleases SphI and a DNA polymerase.
  • the resulting plasmid YEpl3-tHMG was introduced into S. cerevisiae AH22URA3 (Polakowski et al 1999, ⁇ 22 is commercially available, preparation of AH22ura3 is described).
  • the vector YEpH2 (US2004235088 Al) was treated with the endonucleases EcoRV and Nrul. This produced a DNA fragment with the following regions: a transcriptional activating region of the tetracycline resistance gene (Sidhu and Bollon (10 (1990) 157-166)), the medium length ADH1 promoter, the t-HMG1 and TRP1 terminator (expression cassette).
  • This DNA fragment was introduced into the vector YDpU (Berben et al 1991 Berben G., Dumont J., Gilliquet V, Bolle PA and Hilger F. (1991), Yeast 7, 475-477) which was treated with StuI has been.
  • the vector YDpUH2 / 12 produced therewith was treated with the endonucleases SmaI and ligated to a DNA sequence encoding Kanamycin Resistant (Webster, T.D., Dickson, R.C. (1983), Gene 26: 243-252).
  • the construct that was prepared (YDpUHK3) was treated with EcoRV.
  • the yeast strain Saccharomyces cerevisiae AH22 (ATCC 38626, ATCC Manassas, Virginia) was transformed with this construct.
  • the transformation of the yeast with the linearized vector results in the chromosomal integration of the entire vector in the URA3 gene locus.
  • the transformed yeasts were subjected to selection pressure by FOA selection (Boeke et al. (Methods in Enzymology 154 (1987), 164-175)), which favor uracil auxotrophy in yeast.
  • AH22tH3ura8 (Polakowski 1998) and has integrated the t-HMGl expression cassette chromosomally into the URA3 gene.
  • the three genes were arranged as in Figure 2 with the URA3 marker gene for selection in yeast (URA3 coding region including 400 bp upstream and 200 bg downstream, see Sequence
  • the gene PDR1 (optimized for yeast codon, SEQ ID NO: 6) was in GeneArt (GeneArt, Regensburg, Germany) in a cluster (gene cassette 6, GK6) with the LEU2 marker for the selection of positive transformants (the LEU2 coding region incl 400 bp upstream and 200 bp downstream, sequence see
  • the ENO1 promoter and ENOI terminator was used (600 bp upstream and 300 bp downstream of the ENOI coding region;
  • the dry matter (BTS) and the concentration of the carotenoids produced were determined for the thus prepared inventive strain AH22tH3ura8 -GK -GK6 and for the known from the prior art starting strain AH22tH3ura8 -GK4 according to the prior art, after the strains each for 120th h in shake flasks in WMVIII medium at 28 ° C on an incubation shaker were cultivated.
  • For the extraction of the carotenoids 1.8 ml of culture were added to an Eppendorf tube. The cells were pelleted and washed twice with 1 ml H 2 O. After the second wash, the resuspended cells were placed in a pre-weighed vessel, into which a hole had been pushed into the lid.
  • the cells were lyophilized overnight. After complete drying, the vessel was weighed again to calculate the cell dry weight. 0.25 ml of the same culture was added to a 2 ml vessel for carotenoid extraction. The cells were pelleted and the supernatant was removed. The pelleted cells were frozen at -80 ° C and stored.
  • the cell debris was again extracted at least three times without the addition of zirconia beads. All supernatants were pooled in a 16 ml glass vial. After extraction, the glass vials were centrifuged at 4 ° C for 5 minutes at 2000 rpm in a Sorvall benchtop centrifuge and the supernatant transferred to a new 16 ml glass vial. The supernatants were concentrated with a Speed Vac (room temperature in the dark) and the samples were stored at -20 ° C. or -80 ° C. until just before the HPLC analysis. Throughout the implementation, care was taken to avoid contact with oxygen, light, heat and acid. For carotenoid analysis, the samples were resuspended in ice-cold extraction solvent. An Alliance HPLC 2795 (Waters) equipped with a Waters XBridge C18 column (3.5 ⁇ , 2.1x50 mm) and a Thermo Basic 8 guard column (2.1 x 10 mm) was used.
  • HPLC 2795 Water
  • Astaxanthin, zeaxanthin, ⁇ -apo-8'-carotenal, lycopene and ⁇ -carotene were detected at 475 nm, phytoene at 286 nm.
  • Table 2 Carotenoid production of the S. cerevisiae strain AH22tH3ura8-GK4 with and without additional expression of the PDR1 gene (on GK6).
  • BTS bio dry substance

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Abstract

Hefestamm der Gattung Saccharomyces mit etabliertem Carotinoidbiosyntheseweg, dadurch gekennzeichnet, dass er ein PDR1 Gen oder PDR1-Homolog überexprimieren kann.

Description

Hefestamm zur Produktion von Carotinoiden
Die Erfindung betrifft einen Hefestamm zur Produktion von Carotinoiden, Verfahren zu seiner Herstellung sowie seine Verwen- dung zur Herstellung von Carotinoiden.
Der Begriff "Carotinoid" bezieht sich auf eine strukturell diverse Klasse von Pigmenten, die vom Isoprenoid Biosynthese Weg abstammen. Der erste wichtige Schritt bei der Carotinoid Biosynthese ist die Entstehung von Phytoen aus Geranyl- geranyl-Pyrophosphat . Carotinoide können cyclisch oder
azyklisch sein und können oder können keinen Sauerstoff
enthalten, so dass der Begriff Carotinoide sowohl Carotene als auch Xanthophylle einschliesst .
Im Allgemeinen sind Carotinoide Kohlenwasserstoff Verbindungen, die ein konjugiertes Polyen Kohlenstoff Gerüst haben, das aus Isopentenylpyrosphat Phosphat entstanden ist. Hier enthalten sind Triterpene und Tetraterpene , sowie deren oxigenierten Derivate und andere Verbindungen mit Längen von z.B. C35, C50, C60, C70, C80. Viele Carotinoide haben starke
lichtabsorbierende Eigenschaften und können in der Länge größer C200 sein.
C30 Diapocarotinoide bestehen typischerweise aus sechs Isopren Einheiten, die so verbunden sind, dass die Anordung der
Isopreneinheiten in der Mitte des Moleküls invertiert ist und dass die zwei zentralen Methylgruppen in einem 1 , 6-positionalen Verhältnis und die verbleibenden nicht-terminalen Methylgruppen in einem 1 , 5-positionalen Verhältnis stehen. Solche C30
Carotinoide können aus einer azyklischen C30H42 Struktur hervorgegangen sein, die eine lange zentrale Kette aus
konjugierten Doppelbindungen haben, z.B. durch Hydrogenierung, Dehydrogenierung, Cyclisierung, Oxidation, Veresterung,
Glykosilierung oder eine Kombination dieser Prozesse.
C40 Carotinoide bestehen typischerweise aus acht Isopren
Einheiten die auf solche Weise verbunden sind, dass die
Anordung der Isopreneinheiten in der Mitte des Moleküls
invertiert ist und dass die zwei zentralen Methylgruppen in einem 1 , 6 -positionalen Verhältnis und die verbleibenden nichtterminalen Methylgruppen in einem 1 , 5 -positionalen Verhältnis stehen. Solche C40 Carotinoide können aus einer azyklischen C40H42 Struktur hervorgegangen sein, die eine lange zentrale kette aus konjugierten Doppelbindungen haben, z.B. durch
Hydrogenierung, Dehydrogenierung, Cyclisierung, Oxidation, Veresterung, Glykosilierung oder eine Kombination dieser
Prozesse. Die Klasse der C40 Carotinoide enthält auch bestimmte Verbindungen, die aus einer Umlagerung des Kohlenstoffgerüsts hervorgehen oder aus einem Entfernen von Teilen dieser
Struktur. Mehr als 600 verschiedene Carotinoide wurden in der Natur identifiziert; Carotinoide beinhalten unter anderem:
Antheraxanthin, Adonirubin, Adonixanthin, Astaxanthin,
Canthaxanthin, Capsorubrin, [beta] -Cryptoxanthin, [alpha] - Carotin, [beta] -Carotin, [beta] , [psi] - Carotin, [delta] -
Carotin, [epsilon] -Carotin, Echinenon, 3 -Hydroxyechinenon, 3'- Hydroxyechinenon, [gamma] - Carotin, [psi] -Carotin, 4-keto- [gamma] -Carotin, [zeta] -Carotin, [alpha] -Cryptoxanthin,
Deoxyflexixanthin, Diatoxanthin, 7 , 8 -Didehydroastaxanthin, Didehydrolycopene, Fucoxanthin, Fucoxanthinol , Isorenieratene ,
[beta] -Isorenieratene, Lactucaxanthin, Lutein, Lycopin,
Myxobacton, Neoxanthin, Neurosporen, Hydroxyneurosporen,
Peridinin, Phytoen, Rhodopin, Rhodopin glucoside, 4- Keto- rubixanthin, Siphonaxanthin, Spheroidene, Spheroidenone ,
Spirilloxanthin, Torulene, 4- Keto-torulene, 3 -Hydroxy-4 -keto- torulene, Uriolide, Uriolide acetat, Violaxanthin, Zeaxanthin- [beta] -diglucosid, Zeaxanthin und C30 Carotinoide.
Zusätzlich enthalten Carotinoide Derivate von diesen Molekülen, die Hydroxy- , Methoxy- , Oxo-, Epoxy- , Carboxy- , oder Aldehyd Gruppen enthalten können. Des weiteren sind Ester (z.B. Glykosid
Ester, Fettsäureester) und Sulfat Derivate eingeschlossen (z.B. veresterte Xanthophylle) . Sie dienen als Antioxidantien für den Membranschutz, indem sie Sauerstoff- und Peroxid Radikale abfangen. Ihre antioxidative Eigenschaft ist ihrer Struktur zuzu- schreiben. Carotinoide gehören zu einem der wichtigsten Bestandteile in Lebensmitteln. Sie sind natürliche Farbstoffe, wie z.B. Gelb oder Rot, wodurch sie einen großen Einfluss auf die Akzeptanz vieler Lebensmittel haben. Darüber hinaus sind einige Carotinoide Vorstufen von Vitamin A. Carotinoide weisen häufig eine gesundheitsfördernde Wirkung auf, indem sie gegen Krankheiten wie Krebs, Herzkreislauf-Erkrankungen, Makula- Degeneration oder Grauen Star vorbeugen können.
Das Interesse an Carotinoiden hat in den letzten Jahren deutlich zugenommen, vorwiegend aufgrund ihres gesundheitlichen Nutzens, aber auch aufgrund des Wachsens von verschiedenen Märkten oder Bereichen. Dazu gehört die Landwirtschaft, vor al- lern die Aquakultur und Geflügelindustrie, die Nahrungsergän- zungsmittelindustrie, die Lebensmittelindustrie, bei der Carotinoide als Farbstoffe für Wurst, Softdrinks oder Backwaren eingesetzt werden, sowie die Pharma oder Kosmetik Branche. Carotinoide werden aus Isopren Vorstufen synthetisiert, von denen auch einige bei der Produktion von Steroiden oder
Sterolen beteiligt sind. Der bekannteste Isopren Biosynthese Weg ist der sogenannte „Mevalonat Weg" . Acetyl-CoA wird über Hydroxymethylglutaryl-CoA (HMG-CoA) in Mevalonat umgewandelt. Mevalonat wird dann phosphoriliert und in
Isopentenylpyrophosphat (IPP) umgewandelt. Nach der
Isomerisierung von IPP in Dirnethyl-allylpyrophosphat (DMAPP) , wird nach drei aufeinanderfolgenden Isomerisierungsreaktionen mit IPP das 10 -Kohlenstoff Molekül Geranyl Pyrophosphat (GPP) , gefolgt von dem 15-Kohlenstoff Molekül Parneylpyrophosphat (FPP) und schliesslich dem 20 -Kohlenstoff Molekül
Geranylgeranyl Pyrophosphat (GGPP) gebildet. Enzyme, die in der Carotinoid Biosynthese beteiligt sind, sind unter anderem GGPP- Synthase (CrtE) , Phytoen Synthase (CrtB) , Phytoen -oder
Desaturase (CrtI) , Lycopene cyclase (crtY) , Carotinoid ketolase (crtw) , Carotinoid hydroxylase (CrtZ) , Astaxanthin synthase (CrtS) .
Die Hefe Saccharomyces cerevisiae ist ein robuster, industriell bestens etablierter Produktionsorganismus, der gute Wachstumseigenschaften, ein breites Substratspektrum und eine außerordentliche Salz- und Osmotoleranz aufweist. Sie ist deshalb für eine biotechnologische Produktion im industriellen Maßstab be- sonders geeignet. S. cerevisiae ist vollständig sequenziert, gut charakterisiert und sämtliche Werkzeuge zur genetischen Optimierung sind etabliert. Bei der Produktion von Lipiden bietet S. cerevisiae einen großen Vorteil weil sie in der Lage ist große Mengen an lipidischen Komponenten in inerter Form intrazellulär in Lipidpartikeln abzulegen, wodurch die Physiologie der Hefezelle weitestgehend unbeeinflusst bleibt. S. cerevisiae weist keine nativen Carotinoid-Biosynthesewege auf, produziert jedoch über den Mevalonatbiosyntheseweg sämtliche Terpene, wel- che die Grundbausteine der Carotinoide sind, wie Isopentenyl- Diphosphat, Dimethylallyl-Diphosphat , Geranyl-Diphosphat und Farnesyl-Diphosphat (siehe Figur 1) .
In Ukibe, K. et al, 2009, Appl Environ Microbiol 75:7205-11 oder Verwaal, R. et al, Yeast 27:983-98 wurde bereits gezeigt, dass die Hefe S. cerevisiae prinzipiell in der Lage ist, Carotinoide zu synthetisieren, wenn Gene (bzw. Enzyme) des Caro- tinoid-Biosyntheseweges heterolog eingeführt werden. Im Falle von Phytoen müssen die Enzyme GGPP-Synthase und Phy- toen-Synthase eingeführt werden, für welche die entsprechenden Gene als crtE und crtB bezeichnet werden. Für die Produktion von Beta-Carotin ist die Expression weiterer Gene mit den Bezeichnungen crtl und crtY notwendig, welche die Enzyme Phytoen- Desaturase und Lycopen-Cyclase kodieren (Ukibe, K. et al, Applied and Environmental Microbiology . 2009, 75 (22) , pp . 7205 - 7211; Verwaal, R. et al, Applied and Environmental Microbiology. 2007, 73 (13), pp. 4342 - 4350). Aus der Literatur ist auch ein bifunktionelles Enzym bekannt, welches zwei enzymatische Schritte katalysiert. Dies ist die Phytoen Synthase/Lycopene Cyclase aus Xanthophyllomyces dendrorhous, die durch das Gen crtYB kodiert ist. Dieses Enzym vereint die Aktivitäten der Gene crtY und crtß, so dass für die Synthese von Beta-Carotin neben dem Gen crtYB nur noch die Gene crtE und crtJ exprimiert werden müssen. Für die Synthese von Zeaxanthin und beta-
Cryptoxanthin ist zusätzlich noch die Expression des Gens crtz notwendig. Die Synthese von Astaxanthin wird durch die zusätzliche Expression des Gens crtW erreicht (siehe Fig. 4) . In den genannten Studien wurden diese Gene aus der Basidiomyce- ten-Hefe Xanthophyllomyces dendrorhous in 3. cerevisiae eingeführt, was zur Synthese von ß-Carotin, Zeaxanthin, Astaxanthin und weiteren Carotinoiden führte, allerdings noch in Mengen, die für die industrielle Produktion zu gering erscheinen.
Verwaal, R.et al, Yeast 27:983-98 zeigten, dass 3. cerevisiae in der Lage ist, Carotinoide zu sekretieren. Als hierfür ver- antwortlich wurden Transportproteine identifiziert, welche im „Pleiotropic Drug Resistance" (PDR) - Netzwerk involviert sind. Allerdings wurden PDR Gene und ihr Einfluss auf den Carotino- idgehalt der Zellen in dieser Studie nicht untersucht. „Multiple Drug Resistance", das in der Hefe dem „Pleiotropic drug response" entspricht, beschreibt das Phänomen, dass Zellen eine Resistenz gegenüber potentiell toxischen Molekülen aus der Umwelt haben bzw. entwickeln. Hierfür sind Transporter verantwortlich, die diese Substanzen wieder aus der Zelle hinaus- schleusen. Das PDR1 Gen kodiert für einen Transkriptionsfaktor, der den „Pleitropic drug Response" in der Hefe (yeastgeno- me.org) reguliert. PDR1 kodiert für den Zinkfinger Transkriptionsfaktor Pdrlp, der Regulator des „Pleitropic drug responses" in der Hefe ist. Pdrlp dient als transkriptioneller Aktivator und Repressor indem er an „Pleitropic drug response" Elemente (PDRE) bindet, die in den Promoterregionen von Zielgenen zu finden ist.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, einen Hefestamm zur Verfügung zu stellen, der Carotinoide in größeren Mengen produziert als bekannte Hefestämme und intrazellulär speichert.
Die Aufgabe wird gelöst, durch einen Hefestamm der Gattung Sac- charomyces mit einem etablierten Carotinoidbiosyntheseweg, dadurch gekennzeichnet, dass er ein PDR1 Gen oder PDRl-Homolog überexprimieren kann. Das PDRl-Gen ist vorzugsweise durch die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO: 6 und das PDR1 Genprodukt Pdrlp vorzugsweise durch die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 7 charakterisiert. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind als PDR1 -Homologe solche Gene auf- zufassen, die für Proteine mit Pdrlp Funktion kodieren, die bei einer Analyse mit dem Algorithmus BLAST 2.2.1 (Altschul, Stephen; Gish, Warren; Miller, Webb; Myers, Eugene; Lipman, David (1990). "Basic local alignment search tool" . Journal of
Molecular Biology 215 (3) : 403-410) eine Sequenzidentität von größer 80 % bevorzugt größer 90 % besonders bevorzugt größer 95 % zu SEQ ID NO: 7, aufweisen.
Somit sind als PDR1 -Homologe auch Allelvarianten des PDRl-Gens zu verstehen, insbesondere funktionelle Varianten, die sich durch Deletion, Insertion oder Substitution von Nukleotiden aus SEQ ID NO: 6 ableiten, wobei die Pdrlp Aktivität des jeweiligen Genprodukts jedoch erhalten bleibt. Die Aktivität der PDR1 Homologen wird, ebenso wie die Aktivität des PDRl-Gens bestimmt über die Bestimmung der Erhöhung der Carotinoid Biosynthese in Stämmen in denen die Carotinoid Biosynthese etabliert wurde.
Besonders bevorzugt handelt es sich bei dem PDR1 Gen bzw. dem PDR1 Homologen, um das für Hefe Kodon optimierte Gen PDR1 (SEQ ID NO: 6) .
Im Sinne der vorliegenden Erfindung wird ein Gen als überexpri- miert betrachtet, wenn der Level der Proteinaktivität des codierten Genproduktes um mindestens 5 % erhöht ist im Vergleich zu einem Hefestamm mit gleichem genetischen Hintergrund, der nicht genetisch modifiziert wurde, um das Protein zu exprimie- ren .
Die erhöhte Aktivität des Genproduktes ist erkennbar an einer entsprechend erhöhten Carotinoidproduktion verglichen mit einem Stamm, der in seiner PDR1 Expression nicht modifiziert ist.
Bevorzugt ist bei dem erfindungsgemäßen Hefestamm der Carotino- idgehalt mindestens um das 2- fache gesteigert im Vergleich zu einem Carotinoid produzierenden Hefestamm, der das PDR1 Gen nicht überexprimiert .
Vorzugsweise ist in dem erfindungsgemäßen Hefestamm der Caro- tinoidbiosyntheseweg dadurch etabliert, dass die Gene crtYB, crtE und crtl exprimiert werden.
Besonders bevorzugt handelt es sich um das für Hefe Kodon optimierte Gen crtE (SEQ ID NO: 3) , das für Hefe Kodon optimierte Gen crtYB, (SEQ ID NO: 4) und das für Hefe Kodon optimierte Gen ertJ (SEQ ID NO: 5) aus X. dendrorhous .
Vorzugsweise handelt es sich bei dem erfindungsgemäßen Hefestamm um einen Stamm der Spezies Saccharomyces cerevisiae . Da- bei handelt es sich wiederum bevorzugt um einen Stamm der Spezies S. cerevisiae der Enzyme, die in der Carotinoid
Biosynthese beteiligt sind exprimiert und mindestens ein PDR1 Gen oder PDR1- Homolog überexprimiert. Besonders bevorzugt handelt es sich um einen Stamm der Spezies Saccharomyces der die die Gene GGPP Synthase und Phytoen Syn- thase, und/oder Phytoen Desaturase und/oder Lycopen Cyclase exprimiert sowie mindestens ein PDR1 Gen oder PDRl-Homolog überexprimiert .
Insbesondere bevorzugt handelt es sich um den Stamm AH22th3ura8 der zusätzlich mindestens ein PDR1 Gen oder PDRl-Homolog überexprimiert . Bei den GGPP Synthasen handelt es sich vorzugsweise um ein Enzym mit einer der folgenden Genbank ACCESSION Nr: AAT92871, XP_447025, NP_984623, XP_390273, XP_404791, XP_368486, Q92236, AA085432, XP_572774, XP_502923, AAK11525, XP_326920, CAF32032, BAD29965, XP_384767, BAD29970, CAB89115, CAG09545, CAI13753, AAH69913, AAH67768, XP_455003, P56966, NP_001007, AAT65717,
NP_956329, BAA90525, XP_405729, AAK11531, XP__412280, AAC05273, NP_523958, XP_402074, EAL30191, XP_536340, XP_424685, AAH06798, AAP06018, XP 460338, AAC05595, EAK92197, XP_535573, AAH83212, XP_486466, CAH18006, CAA75568, XP_397455, XP_410947, XP_381914, XP_364478, XP_360889, XP_369218, XP_406544, XP_367595,
XP_363775, XP_368486, XP_390273, Q92236, AAK11525, CAF32032, XP_404791, AA085432, BAD29965, BAD29970, BAA90525, AAT65717, XP_384767, CAB89115, XP_572774, AAK11531, XP_502923, CAI13753, CAG09545, XP_412280, P56966, NP_001007, AAH69913, AAH67768, NP_956329, EAL30191, XP_424685, XP_536340, NP_523958, AAC05273, XP_405729, AAC05595, XP_402074, AAP06018, AAH06798, XP_535573, AAH83212, AAP21085, NP_984623, XP_447025, AAT92871, XP_486466, XP_410947, XP_397455, XP_455003, EAK92197, XP_381914,
XP_460338, CAH18006, XP_360889, XP_406544, XP_364478,
XP_363775, XP_367595, XP_369218, C39273, BAB79600, BAA14124, AAN85596, AAA32797, Q08291, S52584, S53722, AAC44848, BAA19583, S71230, BAA23157, AAC77874, CAB38744, BAA78047, BAA82613,
CAB56064, BAA86284, T11021, AAF78199, AAG10424, CAC10561,
T50879, BAB01343, Q42698, Q43133, P54976, BAB50600, BAB60678, BAB60820, NP_189589, NP_188651, NP_188069, NP_188073, AAL01997, AAL01998, NP_252732, NP_245470, NP_390308, NP_440010,
NP_440010, AAL17614, NP_520343, AAL76349, AAM21638, AAM21639, NP_622916, AAM48650, NP_659794, AAM64496, AA 65107, NP_680811, ZP_000474, ZP_001252, NP_698760, E84566, F85434, AC1245,
E83997, G84566, AH2910, D87505, A89932, F97685, AI3285,
BAC42571, NP_785195, NP__790546, AA063392, AA093113, NP_833891, AAP59037, ZP_001374, NP_864766, NP_875521, NP_881399,
NP_884694, NP_888456, NP_893187, NP_894940, NP__896835,
NP_896835, AAQ65086, NP_945877, NP_946867, NP_952815, AAR37805, AAR37858, AAR98495, AAR99082, NP_965349, NP_980544, EAA96348, EAB36506, EAB36642, EAC39208, EAD26007, EAE43084, EAE70061, EAF70308, EAG88494, EAH52060, EAH78354, EAH84117, EAI11762, EAI49391, EAI54846, EAI68356, EAI68713, EAI69401, EAI73873,
EAJ73634, EAJ77351, EAK70639, ZP_001751, AAS76253, ZP_001957, 1RTRB, ZP_001863, ZP_002002, ZP_001711, ZP_002073, ZP_002074, AAS82860, ZP_002108, YP_010568, BAD18313, ZP_002315, ZP_002335, AAT35222, ZP_002401, ZP_002435, ZP_002626, ZP_002702,
ZP_002705, ZP__002732, ZP_002914, ZP_003024, ZP_003129,
ZP_003177, ZP_003225, AAT51323, ZP_003301, YP_034222,
YP_040995, YP_043579, AAT71982, AAT90315, YP_066435, YP_075673, YP 085511, YP 092166, ZP_001298, YP 105136, YP 111769, ZP_003630, YP_129021, AAV74395, AAV74396, YP_148246, YP_156518, YP_162590, YP_171470, YP_175959, YP_186407, YP_190690,
AAW66658, YP_194187, YP_197469, YP_201938, YP_196510. Bei den Phytoen Dehydrogenasen handelt es sich vorzugsweise um Enzyme mit einer der folgenden Genbank Accession Nummern:
1613414B, 1613414F, 1904206A, 2121278A, A86203, A96612, A99470,
AAA24820, AAA34001, AAA50313, AAA64981, AAA91161, AAA99519,
AAC44798, AAC44850, AAC48983 , AAF78201, AAG10426, AAG14399,
AAG28700, AAG50743, AAH85048, AAK51545, AAK51557, AAK64299,
AAL02000, AAL15300, AAL38046, AAL73986, AAL80005, AAL91366,
AAM45380, AAM48646, AAM63349, AAM94364, AAN75037, AAN85599,
AA024235, AA046892, AA046894, AA053257, AA053258, AAO64750,
AA093135, AAP59036, AAP79175, AAQ04224, AAQ04225, AAQ65246,
AAQ65246, AAQ88931, AAR37797, AAR37802, AAR37850, AAR37855,
AAR86105, AAR98491, AAR9849 , AAR98733 , AAS17750, AAT01639,
AAT35222, AAT74579, AAT74580, AAT76050, AAT76434 , AAT90316,
AAU34019, AAW23161, AB2035, AB2064, AC2 446, AF1557, AF2029,
AG2103, AG2509, AH1 199, AI2185, AI2273, B55548, B84327, B90061,
BAA14127, BAA20276, BAA76534 , BAB10768 , BAB50520 , BAB51896,
BAB68552 , BAB79603, BAB82461, BAB82462 , BAB98016 , BAC75676,
BAC77668, BAC77671, BAD07279, BAD07280 , BAD07287 , BAD07288,
CAA52098, CAA60479, CAA66626, CAB38739 , CAB38743 , CAB40843,
CAB56041, CAB56062, CAB59726, CAB65434 , CAB94794 , CAC85667,
CAD19989, CAD27442, CAD55814, CAE00192 , CAE83576 , CAF19330,
CAF21094, CAF21337, CAH91165, E90061, EAA90383, EAA98598,
EAB09790, EAB14136, EAB18725, EAB29729 , EAB30992 , EAB41377,
EAB54727, EAB76679, EAB87028 , EAB92587 , EAB94459 , EAB96864,
EAC01884 , EAC38895, EAC60360, EAD05874 , EAD05999 , EAD20520,
EAE06978 , EAE70773 , EAF04985, EAF51354 , EAF62819 , EAF75453,
EAG09111, EAG19 12, EAG23070, EAG25053 , EAG25054 , EAG29279,
EAG39845, EAG56100, EAG63013, EAG68633 , EAG71574 , EAG89835,
EAH04928 , EAH04936, EAH08586, EAH22597 , EAH22853 , EAH31648,
EAH55579, EAH68071, EAH73302, EAH79041 , EAH86965 , EAH97108,
EAH99977, EAI01660, EAI03576, EAI06784 , EAI11087 , EAI15261,
EAI15547, EAI17521, EAI21398 , EAI29728 , EAI38468 , EAI43591,
EAI51589, EAI58453, EAI72974, EAI77885 , EAI78272 , EAI80262,
EAI83937, EAI86664, EAJ00517, EAJ05570 , EAJ08238 , EAJ15524, EAJ18144, EAJ20649, EAJ21683, EAJ24413, EAJ28774 ,
EAJ35157, EAJ37407, EAJ39929 , EAJ54356 , EAJ54959,
EAJ58447, EAJ59958, EAJ63347, EAJ66054 , EAJ67637,
EAJ74441, EAJ76472, EAJ76473, EAJ80355, EAJ80839,
EAJ86174, EAJ87600, EAJ88203, EAJ88682, EAJ92341,
EAJ97555, EAJ97958, ΕΑΚ07654, EAK08513, ΕΑΚ08529,
EAK10614, EAK12902, EAK13034, EAK15092, ΕΑΚ22483,
EAK24187, EAK2467 , ΕΑΚ28785, EAK34731, ΕΑΚ34742,
EAK37522, EAK42705, EAK43213 , ΕΑΚ52580 , ΕΑΚ53452,
EAK62665, EAK63558, F84187, F90272, G87635, G9041
Η84320, JC7723, ΝΡ 060220, ΝΡ 080435, ΝΡ 193157, ΝΡ 214383,
ΝΡ_ 276913, ΝΡ_ 293819, ΝΡ_ 294534, ΝΡ_ 294585, ΝΡ_ 295972,
ΝΡ_ 338490, ΝΡ_ 376437, ΝΡ_ 377056, ΝΡ_ 388895, ΝΡ_ 441167,
ΝΡ_ 441254, ΝΡ_ 442491, ΝΡ_ 442727, ΝΡ_ 562475, ΝΡ_ 568712,
ΝΡ_ 601630, ΝΡ_ 601630, ΝΡ_ 616426, ΝΡ_ 624522, ΝΡ_ 626360,
ΝΡ_ 630834, ΝΡ_ 643053, ΝΡ_ 647302, ΝΡ_ 659552, ΝΡ_ 661086,
ΝΡ_ 661546, ΝΡ_ 661701, ΝΡ_ 662300, ΝΡ_ 681023, ΝΡ_ 681127,
ΝΡ_ 682351, ΝΡ_ 693380, ΝΡ_ 693382, ΝΡ_ 737250, ΝΡ_ 763380,
ΝΡ_ 786524, ΝΡ_ 822198, ΝΡ_ 822828, ΝΡ_ 827278, ΝΡ_ 851528,
ΝΡ_ 857496, ΝΡ_ 868798, ΝΡ_ 869339, ΝΡ_ 870237, ΝΡ_ 874530,
ΝΡ_ 874561, ΝΡ_ 874977, ΝΡ_ 892236, ΝΡ_ 892265, ΝΡ_ 892458 ,
ΝΡ_ 893232, ΝΡ_ 894882, ΝΡ_ 895385, ΝΡ_ 895793, ΝΡ_ 895829,
ΝΡ_ 896854, ΝΡ_ 896994, ΝΡ_ 898304, ΝΡ_ 898346, ΝΡ_ 902647,
ΝΡ_ 923340, ΝΡ_ 923639, ΝΡ_ 923813, ΝΡ_ 925079, ΝΡ_ 931515,
ΝΡ_ 936379, ΝΡ_ 940208, ΝΡ_ 945754, ΝΡ_ 946860, ΝΡ_ 946866,
ΝΡ_ 948851, ΝΡ_ 962004, ΝΡ_ 968600, ΝΡ_ 974222, ΝΡ_ 974545, 049901,
P17059, P54971, Ρ54978, Ρ54979, P54981, Ρ54982, Ρ74306, Q01671, Q02861, Q38893, Q40406, Q9FV46, Q9SE20, Q9SMJ3, Q9ZTN9, Q9ZTP4, S29314, S32171, S49624, S52586, S65060, T10701, T31463, Τ46822, Τ48646, Τ50745, Τ50749, Τ50893, T50910, T51119, T51123,
ΧΡ_324732, ΧΡ_383241, ΧΡ_401825, ΧΡ_470568, ΧΡ_473486,
ΧΡ_477063, ΧΡ_525801, ΧΡ_540198, ΥΡ_006049, ΥΡ_013621,
ΥΡ_024310, ΥΡ_041986, ΥΡ_041988, ΥΡ_044561, ΥΡ_044564,
ΥΡ_062471, ΥΡ_117947, ΥΡ_120612, ΥΡ_135077, ΥΡ_136483,
ΥΡ_145331, ΥΡ_145348, ΥΡ_171014, ΥΡ_172823, ΥΡ_173078,
ΥΡ_173207, ΥΡ_184572, ΥΡ_187368, ΥΡ_187371, ΥΡ_187371,
ΥΡ_187371, ΖΡ_000490, ΖΡ_000509, ΖΡ__000518, ΖΡ_000566,
ΖΡ 000627, ΖΡ_000627, ΖΡ_001073, ΖΡ_001081, ΖΡ 001091, ZP_ 001116, ZP 001117, ZP_ 001119, ZP_ 001124, ZP_ 001510,
ZP_ 001591, ZP_ 001593, ZP_ 001602, ZP_ 001614 , ZP_ 001645,
ZP_ 001650, ZP_ 001722, ZP_ 001746, ZP_ 001752, ZP_ 001770,
ZP_ 001777, ZP_ 001787, ZP_ 001837, ZP_ 001867, ZP_ 002073 ,
ZP_ 002077, ZP_ 002339, ZP_ 002680, ZP_ 002705, ZP_ 002771,
ZP_ 002892, ZP_ 002916, ZP_ 002963, ZP_ 003022, ZP_ 003036,
ZP_ 003107, ZP_ 003202, ZP_ 003258, ZP_ 003268, ZP_ 003269,
ZP_ 003276, ZP_ 003283, ZP_ 003557, ZP_ 003559, ZP_ 003565,
ZP_ 003577, ZP 003593, ZP 003595, ZP 003685.
Bei den Synthasen and Lycopin Cyclasen_handelt es sich vorzugsweise um Enzyme mit einer der folgenden Genbank Accession Nummern: 1613414C, A49558, AAA19428, AAA32836, AAA64982, AAB87738,
AAC44849 , AAD38051 , AAF78202 , AAF82616 , AAG10427, AAG28701,
AAK07734 , AAK07735 , AAK15621 , AAL02001 , AAL76346, AAL82578,
AAM45379 , AAM48647 , AAM62787 , AAM94363 , AAN85600, AA024767,
AA039835 , AA046895 , AAO47570 , AA073816 , AAP22038, AAP55451,
AAP55453 , AAP55461 , AAP55471 , AAP55484 , AAP55486, AAP56083,
AAP56124 , AAP56127 , AAP56136 , AAP56148 , AAP56155, AAP56156,
AAP56157 , AAP56158 , AAP79176 , AAQ91837 , AAR08445, AAR31885,
AAR37803 , AAR37856 , AAR86104 , AAR87868 , AAR98492, AAS02284,
AAS17009 , AAS18307 , AAT28184 , AAT35222 , AAT38473, AAT46069,
AAT74581 , AAT90319 , AAV74394 , AAW23162 , AC2035, AC2035,
BAB18514 , BAB79604 , BAD07278 , BAD07286 , BAD62106, BAD62107,
C90061, CAA47625, CAA68575, CAB07958, 2AB38740, CAB51949,
CAB56063 , CAB86388 , CAB93661 , CAB94795 , CAC19567, CAC27383,
CAD19988 , CAD29284 , CAE76609 , E37802, E84320, EAA98758,
EAB01965 , EAB04170 , EAB07138 , EAB09791 , EAB19826, EAB35029,
EAB41375 , EAB78706 , EAB92586 , EAC06949 , EAC18360, EAC25793,
EAC29883 , EAC32813 , EAC33105 , EAC38 86 , EAC52233, EAC60029,
EAC68026 , EAC96197 , EAD08701 , EAD20866 , EAD32755, EAD38008,
EAD50152 , EAD50402 , EAD81123 EAD93882 , EAE12860, EAE16121,
EAE31084 , EAE35665 , EAE44717 , EAE46627 , EAE47846, EAE72264,
EAE76009 , EAE86335 EAE89581 EAF18881 , EAF64277, EAF67931,
EAF84745 , EAF94004 , EAG06083 , EAG21950 , EAG43625, EAG50171,
EAG57517 , EAG62787 EAG65580 EAG68110 , EAG72283, EAG78750,
EAG80445 , EAG93220 , EAH04927 EAH08972 , EAH10377, EAH22151,
EAH31461 EAH50033 EAH64480 EAH79040 , EAH99976, EAI02786, EAI02787, EAI03575, EAI05900, EAI61004, EAI70669, EAI83938, EAJ05110, EAJ05569, EAJ08876, EAJ35156, EAJ38900, EAJ49645, EAJ54357, EAJ60475, EAJ64125, EAJ67499, EAJ76471, EAJ76950, EAJ78637, EAJ78787, EAJ79616, EAJ80356, EAJ81914, EAJ87417, EAK08514, EAK08523, EAK12901, EAK22180, EAK24859, EAK28345, EAK34732, EAK34736, EAK37296, EAK37521, EAK56335, G84363, NP_274195, NP_284085, NP_294586, NP_388961, NP_441168,
NP_443763, NP_624523, NP_630832, NP_662273, NP_682350,
NP_693381, NP_786525, NP_822199, NP_822829, NP_851527,
NP_868799, NP_874560, NP_879992, NP_884101, NP_889809,
NP_892264, NP_895828, NP_898345, NP_902648, NP_902649,
NP_924690, NP_931516, NP_946861, NP_949079, NP__962005,
NP_968601, 007333, P08196, P21683, P37269, P37271, P37272, P53797, P54975, P54977, P65860, Q9SSU8 , Q9UUQ6 , S22474, S32170, S52587, S56668, S68307, T10702, T46594, T50746, T50895,
XP_ 324765, XP_ 383242, XP_ _403902, YP_ 006040, YP_ 103126,
YP_ 112342, YP_ 117945, YP_ _120611, YP_ 136628, YP_ 136629,
YP_ 145340, YP_ 145343, YP_ 160917, YP_ 160918, YP_ 162605,
YP_ 172822, YP_ 187369, YP_ 192648, ZP_ 000044, ZP_ 001091,
ZP_ 001591, ZP_ 001657, ZP_ 001690, ZP_ 001746, ZP_ 001837,
ZP_ 001867, ZP_ 002096, ZP_ 002248, ZP_ 002450, ZP_ 002680,
ZP_ 002710, ZP_ 002791, ZP_ 002892, ZP_ 002916, ZP_ 003036,
ZP_ 003269, ZP_ 003351, ZP_ 003487, ZP_ 003501, ZP_ 003591,
ZP 003628.
Bei den Carotinoid Ketolasen handelt es sich vorzugsweise um Enzyme mit einer der folgenden Genbank Accession Nummern:
AAA99932, AAB48668, AAC25611, AAF78203, AAH16427, AAN03484,
AAN85497 AAN86030, AA064399, AAQ23139, AAT35222, AAT35555, AAV41372 AB2307, AF2204, BAB54999, BAB58879, BAC98366,
CAA60478 CAB56059, D87673, EAA79304, EAA80363, EAA81403,
EAA84711 EAB82380, EAB86624, EAC05755, EAD12219, EAD71182, EAD94927 EAF11582, EAF98072, EAG19345, EAG38273, EAG79800, EAG96474 EAH00349, EAH36448, EAH40683, EAH53180, EAH96648, EAI05260 EAI17468, EAI53009, EAI54054, EAI67818, EAI68153, EAI89684 EAJ27674, EAJ45589, EAJ45589, EAJ67118, EAJ74221, EAJ74653 EAJ88396, EAJ88887, EAK06069, EAK11467, EAK16824, EAK28828 EAK28828, EAK31112, EAK42591, NP 045063, NP 081575, NP_ 338204 , NP_ 440788, NP_441220, NP_682690, NP__770721,
NP_ 848964, NP_ 857223, NP_ 881760, NP_882469, NP_ _886657,
NP_ 895643, NP_ 896386, NP_ 897461, NP_924674 , NP_ _927525,
NP_ _947075, P54972, Q3 9982 , Q44261, T31123, χρ_: 330780,
XP_ 368852, XP_ 380194, XP_ 383758, XP_405100, XP_ 409222,
YP_ _102417, YP_ 108945, YP__ 132414, YP_154670, YP_ _166682,
YP_ 168846, YP_ 172377, ZP_ 001068, ZP_001112 , ZP_ _001607,
ZP_ 001757, ZP_ 001787, ZP_ 002218, ZP_002456, ZP_ _003028,
ZP_ 003107, ZP_ 003264, ZP__ 003458, ZP_003513.
Bei den Carotinoid Hydroxylasen handelt es sich vorzugsweise um
Enzyme mit einer der folgenden Genbank Accession Nummern:
AAC44852, AAC49443, AAD54243, AAG10430, AAG10793, AAG33636,
AAL80006, AA 44971, ΆΆΜ51300, AAM77007, AAN85601, AA053295, AAS48097, AAS55552, AAS88426, AAT48741, AAT84408 , AAV85452,
AAV85453, BAA14129, BAB79605, BAC77670, BAD07283 , BAD07291,
CAA70427, CAA70888, CAB55625, CAB55626, CAB56060, CAC06712,
CAC95130, EAB30128, EAC49462, EAC86129, EAD61089, EAD76156,
EAD88640, EAE27903, EAE28203, EAE78743, EAF12173 , EAH29370, EAH44202, EAI00766, EAI29017, EAJ30844, EAJ72524, EAK10611,
EAK53455, EAK63955, H90469, NP 745389, NP 922503, P54973,
Q44262, S52982, XP 473611, YP 024309, ZP 003055, ZP 003107.
Bei den Astaxanthin Synthasen und putativen Astaxanthin
Synthasen handelt es sich vorzugsweise um Enzyme mit einer der folgenden Genbank Accession Nummern: AAM56288, XP_571276, EAL20013, XP_401804, XP_397817, XP_399595, XP_403279,
XP_382294, XP_406021, XP_381224, XP_391479, XP_569261,
EAL22841, XP_359866.
Bei den Lycopene Cyclasen, beta and epsilon Untereinheiten handelt es sich vorzugsweise um Enzyme mit einer der folgenden Genbank Accession Nummern: AAK07431, ABB52073, Q38932,
AAB53336, AAG10428, AAK07434, AA 45382, 065837, AAL69394, BAE79549, XP_463351, AAS48096, AAX92679, AAL92114, AAK07433, AAL47019, AAT46065, BAD07293, BAD07285, BAD07277, EAJ62839, BAE43547, BAE43550, BAE43557, BAE43558, BAE43553, BAE43545, BAE43556, BAE43552, BAE43560, BAE43554, BAE43551, BAE43519, BAE43535, BAE43541, ΒΑΕ 3542, BAE43517, ΒΑΕ43534 , ΒΑΕ43537,
BAE43533 , BAD02774 , BAD02766, ΒΑΕ43540, BAE43514, ΒΑΕ4354 ,
BAE43538, ΒΑΕ43528, ΒΑΕ43546, ΒΑΕ43526, ΒΑΕ43543 , BAD02742,
BAD02770, ΒΑΕ43522, ΒΑΕ43559, ΒΑΕ43527, ΒΑΕ43548, AAF44700,
BAE43555, ΒΑΕ 3549, AAU141 4, ΑΑ 86060, AAR89632, AAM21152,
AAD38049, AAU05146, AAU05145, ΑΑΚ07430, ΑΒΒ72443, ΒΑΕ79544 ,
BAE78471, Q43415, AAF23013, ABB52071, AAW88382, AAG10429,
AAM45381, AAM14335, AA018661, AAA81880, Q43503, S66350, χρ_464409, CAD70565, Q43578, AAL92175, ΑΑΧ54906, S66349,
AAG21133, CAB92977, CAB93342, Q9SEA0, Q42435, ΑΑ064977, Q40424,
ΑΒΒ52072, AAQ02668, CAA54961, EAJ62838 , ΥΡ_401079, ΥΡ_172741,
ΖΡ_011 , ΕΑΚ50052, ΝΡ_892751, ΝΡ_875182, ΥΡ_382237 , ΥΡ_397130,
ΝΡ_896821, ΥΡ_397570, ΖΡ_010 , EAK17149, ΥΡ_291882 , ΝΡ_875528,
ΝΡ_893181, ΝΡ_895600, ΕΑΙ47456, ΥΡ_291268, ΖΡ_010 , AAF34191,
ΖΡ 010 , ΥΡ 376736, ΖΡ_003 , ΝΡ 894954, AAT76051, ΕΑΚ22047,
ΝΡ 294525.
Saccharomyces Stämme, insbesondere auch S. cerevisiae Stämme sind erhältlich beim Leibniz- Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstraße 7B, 38124 Braunschweig.
Besonders bevorzugt umfasst der erfindungsgemäße Stamm zusätzlich eine transkriptioneil deregulierte HMG-CoA Reduktase. Die HMG-CoA Reduktase ist dabei vorzugsweise derart dereguliert, dass das gebildete Enzym keine N-terminale Membrandomäne mehr besitzt, sondern nur noch die katalytische Untereinheit.
Dadurch erfolgt keine Feedback-Regulation mehr durch Intermedi- ate des Isoprenoid-Stoffwechseis .
Insbesondere bevorzugt handelt es sich bei dem erfindungsgemäßen Stamm um AH22tH3ura8 -G 4 -GK6.
Ein erfindungsgemäßer Hefestamm wird beispielsweise hergestellt, indem in Saccharomyces, vorzugsweise in S. cerevisiae die genannten Gene, vorzugsweise die heterologen Gene GGPP Syn thase und Phytoen Synthase, und/oder Phytoen Desaturase
und/oder Lycopen Cyclase eingebracht und exprimiert sowie das Gen PDRl überexprimiert oder ein PDRl-Homolog eingebracht und überexprimiert wird. Bevorzugt werden für Hefe Kodon optimierte Varianten der Gene verwendet, wie sie beispielsweise vorstehend genannt wurden. Die Expression bzw. Überexpression der genann- ten Gene kann sowohl episomal als auch chromosomal erfolgen.
Die Transformation der Hefezellen mit den genannten Genen erfolgt vorzugsweise in fachüblicher Weise, wie beispielsweise in Schiestl R.H., et al . , Curr Genet. Dec, 16(5-6) : 339-346
(1989), oder Manivasakam P., et al . , Nucleic Acids Res. Sep 11, 21(18) : 4414-4415 (1993), oder Morgan R.J., Experientia Suppl . , 46: 155-166 (1983) beschrieben.
Für die Expression der heterologen Gene bzw. die Überexpression nativer Gene werden vorzugsweise Promotoren verwendet, welche keiner Katabolit-Repression unterliegen und keine spezielle Kohlenstoffquelle für eine Induktion benötigen. Dem Fachmann sind solche Promotoren bekannt. Dazu zählen beispielsweise Promotoren der Gene Phosphofructokinase (PPK, Triose Phosphat Iso- merase (TPI) , Glyceraldehyd-3 -phosphate dehydrogenase (GPD , TDH3 oder GAPDH) , Pyruvat Kinase (PYK) , Phosphoglycerat Kinase
(PGK) , Glucose- 6 -phosphate Isomerase promoter (PGI1) . Weitere geeignete Promotoren können der Anmeldung WO 93/03159 entnommen werden. Geeignete Promotoren sind ferner ribosomale Proteine kodierende Gene Promotoren (TEFI) , der Laktase Gen Promotor
(LAC4), der Alkohol Dehydrogenase Promotor (ADH1) , vorzugsweise eine veränderte (konstitutive) Version des ADH1 Promotors (SEQ ID NO: 8), ADH4 und ähnliche), der Enolase Promotor (ENOl) und der Hexose (Glukose) Transporter Promotor (HXT7) . Aber auch an- dere Promotoren, sowohl konstitutiv als auch induzierbar und
Enhancer oder Upstream aktivierende Sequenzen sind dem Fachmann bekannt .
Geeignete Terminator Sequenzen sind z.B. erhältlich aus dem Cy- tochrom cl (CYC1) Gen oder dem Enolase 1 (ENOl) Gen.
Bevorzugte Promotoren sind der TEFI Promotor, TDH3 Promotor, konstitutive Version des ADH1 Promotors, ENOl Promotor Vorzugsweise werden die heterologen Gene, besonders bevorzugt die Gene GGPP Synthase und Phytoen Synthase, und/oder Phytoen Desaturase und/oder Lycopen Cyclase durch chromosomale Integra- tion beispielsweise in Form einer Genkassette in S. cerevisiae eingebracht. Das Gen PDR1 bzw ein PDR1 Homolog wird vorzugsweise ebenfalls in Form einer Genkassette eingebracht. Ein derartiges Verfahren ist in den Beispielen beschrieben. Die Sequenz der Gene Phytoen Synthase/Lycopene Cyclase, GGPP
Synthase und Phytoen Desaturase ist bekannt aus den Datenbanken des National Center for Biotechnology Information (NCBI) .
PDR1 kodiert für einen Transkriptionsfaktor der Hefe. Seine Gensequenz ist bekannt aus den Datenbanken des National Center for Biotechnology Information (NCBI) .
Bevorzugt kann der erfindungsgemäße Hefestamm dadurch hergestellt werden, dass in einen S. cerevisiae Stamm, der Carotino- ide herstellen kann, da er die heterologen Gene kodierend für die Enzyme Phytoen Synthase/Lycopene Cyclase, GGPP Synthase und Phytoen Desaturase von X. dendrorhous enthält, und bei dem das HMG-CoA Reductase Gen dereguliert ist, das PDR1 Gen oder ein Homolog des PDR1 Gens eingebracht und überexprimiert wird.
Vorzugsweise lässt sich ein erfindungsgemäßer Hefestamm herstellen, indem ein Hefestamm mit einem deregulierten Terpenbio- syntheseweg als Ausgangsstamm verwendet wird. Die Herstellung derartiger Stämme ist beispielsweise in O2011023298 beschrie- ben.
Derartige Stämme weisen eine starke Überproduktion des Triter- pens Squalen und sämtlicher Vorstufen, welche für die Carotino- idproduktion relevant sind auf (siehe Figur 1) . Unter einer starken Überproduktion ist dabei vorzugsweise zu verstehen, dass nach 72 h Kultivierung unter Standardbedingungen im Schüttelkolben >10% der Biotrockenmasse Squalen oder eine der genannten Vorstufen ist. Vorzugsweise lässt sich mit einem erfin- dungsgemäßen Stamm ein Carotinoid ausgewählt aus der Gruppe Phytoen, beta-Carotin, beta-Cryptoxanthin, Zeaxanthin produzieren . Die Deregulation des Terpenbiosyntheseweges wird vorzugsweise dadurch erreicht, dass die HMG-CoA-Reduktase transkriptioneil dereguliert sowie der negativen Regulation auf Proteinebene entzogen wurde. Die HMG-CoA-Reduktase ist das Schlüsselenzym für die Terpen-Überproduktion, da es als Schrittmacherenzym im Sterol -Biosyntheseweg bekannt ist und einen "Flaschenhals" im Biosyntheseweg von Acetyl-CoA bis Squalen darstellt (siehe Figur 1) . In diese Stämme wird ein PDR1 Gen in an sich bekannter Art und Weise eingebracht. Der Stamm muss mind. die beiden Enzyme GGPP-Synthase und Phytoen Synthase exprimieren und kann ggf. beliebig viele weitere Carotinoidsynthesegene exprimieren.
Diese Hefestämme werden in an sich bekannter Art und Weise kultiviert und das Carotin nach Zellaufschluss isoliert. Die Produktion von Carotinoiden mit Hefen der Gattung Saccharomyces, ist beispielsweise in Ukibe, K. , Hashida, K. , Yoshida, N. ,
Takagi, H. , Applied and Environmental Microbiology . 2009, 75 (22), pp. 7205 - 7211; Verwaal , R. , Jiang, Y., Wang, J. , Yeast . 2010, 27 (12), pp. 983-998; Verwaal, R., Wang, J., Meijnen, J.- P., Applied and Environmental Microbiology. 2007, 73 (13), pp . 4342 - 4350; Misawa, N. , Shimada, H., Journal of Biotechnology . 1997, 59 (3), pp. 169-181 oder Schmidt-Dannert , C, Curr Opin Biotechnol. 2000, 11 (39), pp. 255-61 beschrieben. Die Erfindung betrifft somit auch ein Verfahren zur Herstellung von Carotinoiden bei dem ein Hefestamm in an sich bekannter Art und Weise fermentiert wird und die Carotinoide nach Zellaufschluss isoliert dadurch gekennzeichnet, dass der Hefestamm ein erfindungsgemäßer Hefestamm ist.
Überraschenderweise findet sich nach 120 bis 144 h Kultivierung des Stammes im Schüttelkolben eine signifikant erhöhte Menge an intrazellulärem Carotinoiden. Der Gehalt an intrazellulären Ca- rotinoiden wurde nach einem Zellaufschluss per HPLC bestimmt und mit dem Wert eines Kontrollstammes verglichen, welcher nur die Carotinoidsynthesegene exprimiert und nicht das PDRl Gen überexprimiert .
Figur 1 zeigt exemplarisch den Biosyntheseweg von Squalen in der Hefe Saccharomyces cerevisiae .
Figur 2 zeigt die Genkasette 4, die in Beispiel 3 hergestellt und verwendet wird.
Figur 3 zeigt zeigt die Genkasette 6, die in Beispiel 4
hergestellt und verwendet wird. Figur 4 zeigt exemplarisch den Carotinoid-Biosyntheseweg in der Hefe Saccharomyces cerevisiae
Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.
Beispiel 1: Kultivierung für die Stammevaluierung (Wachstum und Produktivität)
Die Standard Kultivierung für die Stämme der Hefe Saccharomyces cerevisiae war folgende:
1) Vorkultur: 20 ml WMVIII Medium wurde in einem 100 ml Schüttelkolben mit 20 μΐ der entsprechenden Glycerinkultur angeimpft und für 48 h bei 30 °C und 150 rpm auf einem InkubationsSchüttler geschüttelt.
2) Hauptkultur: 20 ml WMVIII Medium wurde in einem 100 ml
Schüttelkolben mit 1 % (v/v) der Vorkultur angeimpft und für
120 h bei 30 °C und 150 rpm auf einem Inkubationsschüttler geschüttelt .
Stämme mit genetischem Hintergrund von AH22tH3ura8 -GK4 (Her- Stellung siehe Beispiel 2 und 3) sind auxotroph für Leucin. Daher wurde das Medium mit Leucin supplementiert (400 mg/L) Stämme mit genetischem Hintergrund von AH22ura3 oder AH22tH3ura8 sind auxotroph für Leucin und Uracil. Daher wurde das Medium mit Leucin (400 mg/L) und Uracil (100 mg/L) supple- mentiert) .
Zusammensetzung des MVIII Mediums (I L) : 50 g Saccharose, 250 mg NH4H2PO4, 2,8 g NH4C1, 250 mg MgCl2 x 6H20, 100 mg CaCl2 x 2H20, 2 g KH2P04, 550 mg MgS0 x 7H20, 75 mg meso-Inositol und 10 g Na-glutamat.
Die beschriebenen Substanzen wurden abgewogen und mit 1 L destilliertem Wasser aufgefüllt. Nach dem Autoklavieren wurden sterilfiltrierte (0,22 μν) Spurenelemente, Vitamine und Aminosäuren zugesetzt: 1 ml 1000 x Spurenelemente, 4 ml 250 x Vitamin Lösung (Stocklösungen) .
Spurenelemente: 1000 fach konzentriert, für einen Liter: 1,75 g ZnS04 x 7H20; 0,5 g Fe2S04 x 7 H20; 0,1 g CuS04 x 5 H20; 0,1 g MnCl2 x 4 H20; 0,1 g NaMo04 x 2 H20. Vitamin Lösung: 250 fach konzentriert, für einen Liter: 2,5 g Nikotinsäure; 6,25 g Pyridoxin; 2,5 g Thiamin; 0,625 g Biotin; 12,5 g Ca-Pantothensäure .
Beide Lösungen wurden sterilfiltriert (0,22 μπι) . Leucin wurde Supplementiert, falls erforderlich (400 mg/1) .
Aminosäure Stocklösungen wurden in einer Konzentration von 20 mg/ml hergestellt und sterilfiltriert.
Beispiel 2: Konstruktion des Stammes AH22tH3ura8
Die DNA Sequenz von t-HMGl (Basson et al . (Mol. Cell. Biol . 8 (1988) , 3793-3808) wurde mit PCR aus genomischer DNA von Sac- charomyces cerevisiae S288C erhältlich bei der American Type Culture Collection (ATCC 204508) unter Verwendung von Standardmethoden amplifiziert (Mortimer and Johnston (Genetics 113 (1986) , 35-43) . Die Primer, die in diesem Falle verwendet wurden waren das DNA Oligomer tH G-5' (SEQ ID NO: 1) und tHMG-31 (SEQ ID NO: 2) . Das DNA Fragment, das erhalten wurde, wurde nach Klenow Behandlung in den Klonierungsvektor pUC19, erhältlich bei New England Bi- olabs Inc., USA, Ipswich eingebracht und führte zum Vektor pUC19-tHMG.
Nach Plasmidisolierung und Restriktion von pUC19-tHMG mit den Endonukleasen EcoRI und BamHI wurde das erhaltene Fragment in den Hefe Expressionsvektor pPT2b (Lang and Looman (Appl . Micro- biol. Biotechnol. 44 (1995) , 147-156) eingebracht, der auch mit EcoRI und BamHI behandelt wurde. Das Plasmid pPT2b- tHMG das so hergestellt wurde, beinhaltet den verkürzten ADH1- Promotor (Bennetzen and Hall (Yeast 7 (1982), 475-477) und TRP1- Terminator (Tschumper G, Carbon J. Sequence of a yeast DNA fragment containing a chromosomal replicator and the TRP1 gene . Gene. 1980 Jul; 10 (2) : 157-166) zwischen denen das tHMGl -DNA Fragment gefunden werden kann. Ein DNA Bereich wurde aus dem Vektor pPT2b- tHMG mit den Endonukleasen EcoRV und Nrul isoliert. Dieser Bereich trägt den sogenannten mittellangen ADH1 -Promotor, das t-HMGl Gen und den TRP1- Terminator. Dieses DNA Stück wurde in den Hefe Vektor YEpl3 erhältlich bei der American Type Culture Collection (ATCC 37115) eingebracht (Fischhoff et al . (Gene 27 (1984) , 239-251)) , der mit der Endonukleasen SphI und einer DNA Polymerase behandelt worden war. Das resultierende Plasmid YEpl3 - tHMG wurde in S. cerevisiae AH22URA3 (Polakowski et al 1999; ΆΗ22 ist kommerziell erhältlich; Herstellung von AH22ura3 ist beschrieben) eingebracht .
Chromosomale Integration von t-HMGl in AH22ura3 unter Verwendung des chromosomalen integrativen Plasmids YDpUHK3
Der Vektor YEpH2 (US2004235088 AI) wurde behandelt mit den En- donucleasen EcoRV and Nrul. Dadurch wurde ein DNA Fragment mit folgenden Bereichen produziert: eine transkriptions- aktivierende Region des Tetracyclin Resistenz Gens (Sidhu and Bollon (10 (1990) 157-166)), der mittellange ADH1-Promotor, der t-HMGl und TRP1 Terminator (Expressionskassette) .
Dieses DNA Fragment wurde eingebracht in den Vektor YDpU (Ber- ben et al . 1991 Berben G. , Dumont J., Gilliquet V, Bolle P-A. und Hilger F. (1991), Yeast 7, 475-477) der mit StuI behandelt wurde. Der Vektor YDpUH2/12, der damit produziert wurde, wurde mit den Endonukleasen Smal behandelt und mit einer DNA Sequenz ligiert, die für Kanamycin Resistent codiert (Webster, T. D., Dickson, R. C. (1983), Gene 26: 243-252).
Das Konstrukt, das damit hergestellt wurde (YDpUHK3) wurde mit EcoRV behandelt. Der Hefe Stamm Saccharomyces cerevisiae AH22 (ATCC 38626; ATCC Manassas, Virginia) wurde mit diesem Konstrukt transformiert.
Die Transformation der Hefe mit dem linearisierten Vektor resultiert in der chromosomalen Integration des gesamten Vektors im URA3 Genlokus . Um die Bereiche des integrierten Vektors zu eliminieren, die nicht Bestandteil der Expressionskassette sind (E. coli origin, E. coli-ampicillin Resistenz Gen, TEF-promotor und Kanamycin Resistenz Gene) , wurden die transformierten Hefen einem Selektionsdruck durch FOA Selektion unterzogen (Boeke et al. (Methods in Enzymology 154 (1987), 164-175)), das die Ura- cil-Auxotrophie in Hefe begünstigt.
Der so erhaltene Uracil-auxotrophe Stamm trägt den Namen
AH22tH3ura8 (Polakowski 1998) und hat die t-HMGl Expressions- kassette chromosomal im URA3 Gen integriert.
Beispiel 3 :
Konstruktion des Stamme AH22tH3ura8 -GK4
Die Gene crtE (für Hefe Kodon optimiert, SEQ ID NO: 3), crtYB (für Hefe Kodon optimiert, SEQ ID NO: 4) und crtJ (für Hefe Kodon optimiert SEQ ID NO: 5) von X. dendrorhous wurden bei Gene- Art (GenArt Regensburg) in einem Cluster (Genkassette 4, GK4) synthetisiert . Die drei Gene wurden angeordnet wie in Figur 2 mit dem URA3 Marker Gen für Selektion in Hefe (URA3 kodierende Region inkl . 400 bp upstream und 200 bg downstream; Sequenz siehe
http : //www . yeastgenome . org/cgi - bin/getSeq?query=YEL021W&flankl=400&flankr=200&format=fasta ) und flankierenden Regionen, die homolog zu dem nativen HO Lokus sind (die ersten und letzten 40 bp der HO kodierenden Region. Sequenz siehe http : //www . yeastgenome . org/cgi - bin/getSeq?query=YDL227C&seqtype=ORF%20Genomic%2 ODNA&format=fas ta ) für die genomische Integration der Genkassette in den HO Lokus .
Für die Expression der crtE Gene wird eine modifizierte (konstitutive) Version des ADH1 Promotors (SEQ ID NO: 8) und TRP1 Terminators verwendet (300 bp downstream von der TRP1 kodierenden Region; Sequenz siehe http : //www. yeastgenome . org/cgi- bin/getSeq?query=YDR007W&flankl=1000&flankr=10OO&format=fasta) , während für das crtYB Gen der ENOl Promotor und ENOl Terminator verwendet werden (600 bp upstream und 300 bp downstream der ENOl kodierenden Region; Sequenz siehe
http : //www. yeastgenome . org/cgi- bin/getSeq?query=YGR254W&flankl=60O&flankr=3 OO&format^fasta) und für das crtl Gen der TDH3 Promotor und TDH3 Terminator verwendet werden (600 bp upstream und 300 bp downstream der TDH3 kodierenden Region, Sequenz siehe
http : //www . yeastgenome . org/cgi - bin/getSeq?query=YGR192C&flankl=6OO&flankr=3 OO&format=fasta) . Der Stamm AH22tH3ura8 aus Beispiel 2 wird für die Transformation mit dieser Genkassette verwendet (Figur 2) . Nach Transformation des entsprechenden Hefe Stammes mit der Genkassette via der Lithium Acetat Methode (Gietz et al . , 1992) wurde er auf WMVIII(Lang and Looman, 1995) Agar Platten ohne Uracil für die Selektion auf Uracil prototrophe Kolonien kultiviert (Transformanten, die die Expressionskassette anstatt der HO kodierenden Region im Genom tragen) . Es wurde der Stamm AH22tH3ura8 -GK4 erhalten . Beispiel 4; Überexpression des S. cerevisiae PDR1 Gens
Das Gen PDR1 (für Hefe Kodon optimiert, SEQ ID NO : 6) wurde bei GeneArt (GeneArt, Regensburg, Deutschland) in einem Cluster (Genkassette 6, GK6) mit dem LEU2 Marker für die Selektion von positiven Transformanten (die LEU2 kodierende Region inkl. 400 bp upstream und 200 bp downstream; Sequenz siehe
http : //www . yeastgenome . org/cgibin/getSeq?query=YCL018W&flankl=4 OO&flankr=200&format=fasta) und mit flankierenden Regionen, die homolog zu dem nativen YHRCA14 Lokus sind (die ersten und letzten 40 bp der YHRCA14 kodierenden Region, Sequenz siehe
http : //www. yeastgenome . org/cgibin/getSeq?query=YHRCdeltal4&seqt ype=ORF%20Genomic%20DNA&format=fasta ) synthetisiert .
Für die Expression des PDR1 Gens wurde der ENOl Promotor und ENOl Terminator verwendet ( 600 bp upstream and 300 bp downstream der ENOl kodierenden Region; Sequenz siehe
http : //www. yeastgenome . org/cgi- bin/getSeq?query=YGR254W&flankl=6OO&flankr=3 OO&format=fasta) Der Stamm AH22tH3ura8 -GK4 aus Beispiel 3 (der crtE, crtYB and crtl exprimiert) wurde mit dieser Genkassette transformiert. Die Transformation erfolgte mit der Lithium Acetat Methode (Gietz et al . , 1992) . Der Stamm wurde auf WMVIII (Lang and Loo- man, 1995) Agar Platten ohne Uracil und Leucin für die Selekti- on auf Uracil und Leucin prototrophe Kolonien kultiviert.
Die Biotrockensubstanz (BTS) sowie die Konzentration der produzierten Carotinoide wurde für den so hergestellten erfindungs- gemäßen Stamm AH22tH3ura8 -GK -GK6 sowie für den aus dem Stand der Technik bekannten Ausgangsstamm AH22tH3ura8 -GK4 gemäß Stand der Technik bestimmt, nachdem die Stämme jeweils für 120 h in Schüttelkolben in WMVIII Medium bei 28 °C auf einem Inkubationsschüttler kultiviert wurden. Für die Extraktion der Carotinoide wurden 1,8 ml Kultur in ein Eppendorf Gefäß gegeben. Die Zellen wurden pelletiert und zweimal mit 1 ml H20 gewaschen. Nach dem zweiten Waschen wurden die resuspendierten Zellen in ein vorher abgewogenes Gefäß gegeben, in das ein Loch in den Deckel gestoßen war. Die Zellen wurden über Nacht lyophilisiert. Nach vollständigem Trocknen wurde das Gefäß erneut gewogen, um die Zelltrockenmasse zu errechnen. 0,25 ml der gleichen Kultur wurden in ein 2 ml Gefäß gegeben zur Carotinoid Extraktion. Die Zellen wurden pelletiert und der Überstand wurde abgenommen. Die pelletierten Zellen wurden bei -80 °C eingefroren und gelagert.
Das gleiche Volumen an kubischen Zirkonia Beads wurde zu den Zellpellets gegeben, zusammen mit 1 ml eiskalter Extraktionslösung (eine 50/50 v/v Mischung von Hexan und Ethylacetat, die 0.01% Butylhydroxytoluol (BHT) enthält). Die Mischung wurde geschüttelt (Mini-BeadBeater-8 , BioSpec Products, Inc.) auf höchster Stufe für 5 Minuten bei 4 °C. Die Mischung wurde an- schließend für eine Minute zentrifugiert (max. Geschwindigkeit) und der Überstand wurde gesammelt und in ein gekühltes 16 ml Glass Fläschchen gegeben.
Die Zellüberbleibsel wurden nochmals mindestens dreimal extrahiert ohne die Zugabe von Zirkonia Beads. Alle Überstände wur- den in einem 16 ml Glas Fläschchen gepoolt. Nach der Extraktion wurden die Glas Fläschchen bei 4 °C für 5 Minuten bei 2000 rpm in einer Sorvall Tischzentrifuge zentrifugiert und der Überstand in ein neues 16 ml Glas Fläschchen transferiert. Mit einer Speed Vac wurden die Überstände konzentriert (Raumtempera- tur im Dunkeln) und die Proben wurden bei -20 °C oder -80 °C gelagert bis kurz vor der HPLC Analyse. Während der gesamten Durchführung wurde darauf Acht gegeben, dass Kontakt mit Sauerstoff, Licht, Hitze und Säure vermieden wird. Für die Carotinoid Analyse wurden die Proben resuspendiert in eiskaltem Extraktionslösemittel. Eine Alliance-HPLC 2795 (Waters) , die mit einer Waters XBridge C18 Säule (3,5 μηη, 2,1x50 mm) ausgestattet war und einer Thermo Basic 8 Vorsäule (2,1 x 10 mm), wurde verwendet.
Verlässliche Carotinoid Proben wurden als Standards verwendet. Die mobilen Phasen und Fließgeschwindigkeiten sind unten gezeigt (Lösemittel A=Ethyl Acetate; Lösemittel B=Water; Lösemittel C=Methanol; Lösemittel D=Acetonitrile) . Das Injektionsvolumen war 10 μΐ . Der Detektor war ein Waters 996 Photodioden Array Detektor. Die Retentionszeiten für lipo- phile Moleküle sind: Astaxanthin (1.159 min), Zeaxanthin
(1.335), ß-Apo-8 ' -carotenal (2.86 min), Ergosterol (3.11 min), Lycopin (3.69 min), ß-Carotin (4.02 min) und Phytoen (4.13 min). Astaxanthin, Zeaxanthin, ß-Apo-8 ' -carotenal, Lycopin and ß-Carotin wurden bei 475 nm detektiert, Phytoen bei 286 nm.
Tabelle 1: Retentionszeiten für Lipophile Moleküle
Figure imgf000026_0001
The Ergebnisse sind in Tab. 2 wiedergegeben.
Tabelle 2: Carotinoid-Produktion des S. cerevisiae Stammes AH22tH3ura8-GK4 mit und ohne zusätzliche Expression des PDRl Gens (auf GK6) .
Figure imgf000026_0002
BTS : Biotrockensubstanz
Es zeigte sich, dass der erfindungsgemäße Stamm, welcher das PDRl Gen trägt (Zeile 1 von Tab. 2) , deutlich höhere Mengen an Carotinoiden produziert als der Stamm gemäß Stand der Technik.

Claims

Patentansprüche
1. Hefestamm der Gattung Saccharomyces mit etabliertem Caro- tinoidbiosyntheseweg, dadurch gekennzeichnet, dass er ein
PDRl Gen oder PDRl-Homolog überexprimieren kann.
2. Hefestamm gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem PDRl bzw. dem PDRl Homologen, um das für He- fe Kodon optimierte Gen PDRl mit SEQ ID NO: 6 handelt.
3. Hefestamm gemäß Anspruch 1 oder 2 dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einen Stamm der Spezies Saccharomyces ce- revisiae handelt.
4. Hefestamm gemäß Anspruch 1, 2 oder 3 dadurch gekennzeichnet, dass er die Gene GGPP Synthase und Phytoen Synthase, und/oder Phytoen Desaturase und/oder Lycopen Cyclase exprimiert sowie mindestens ein PDRl Gen oder PDRl-Homolog überexprimiert.
5. Hefestamm gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 dadurch gekennzeichnet, dass er eine transkriptioneil deregulierte HMG-CoA Reduktase umfasst.
6. Verfahren zur Herstellung eines Hefestammes gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 dadurch gekennzeichnet, dass in Saccharomyces die Gene GGPP Synthase und Phytoen Synthase, und/oder Phytoen Desaturase und/oder Lycopen Cyclase ein- gebracht und exprimiert sowie das Gen PDRl überexprimiert oder ein PDRl-Homolog eingebracht und überexprimiert wird.
7. Verfahren zur Herstellung von Carotinoiden bei dem ein Hefestamm in an sich bekannter Art und Weise fermentiert wird und das Carotin nach Zellaufschluss isoliert wird, dadurch gekennzeichnet, dass der Hefestamm ein Hefestamm gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 ist. Verfahren gemäß Anspruch 7 , dadurch gekennzeichnet, das ein Carotinoid ausgewählt aus der Gruppe Phytoen, beta- Carotin, beta-Cryptoxanthin, Zeaxanthin produziert wird
PCT/EP2015/060924 2014-05-30 2015-05-19 Hefestamm zur produktion von carotinoiden Ceased WO2015180993A1 (de)

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