WO2015177394A1

WO2015177394A1 - Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico de hepatocarcinoma en pacientes alcohólicos con hepatitis c

Info

Publication number: WO2015177394A1
Application number: PCT/ES2015/070402
Authority: WO
Inventors: Gustavo FERRÍN SÁNCHEZ; Manuel DE LA MATA GARCÍA; Manuel Luis RODRÍGUEZ PERÁLVAREZ
Original assignee: FUNDACION PARA LA INVESTIGACION BIOMEDICA DE CORDOBA; Servicio Andaluz de Salud; Centro de Investigacion Biomedica en Red CIBER
Current assignee: FUNDACION PARA LA INVESTIGACION BIOMEDICA DE CORDOBA; Servicio Andaluz de Salud; Centro de Investigacion Biomedica en Red CIBER
Priority date: 2014-05-22
Filing date: 2015-05-22
Publication date: 2015-11-26
Anticipated expiration: 2016-11-22

Abstract

Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico de hepatocarcinoma en individuos alcohólicos con hepatitis Ca partir de muestras biológicas, kit y usos.

Description

Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico de hepatocarcinoma en pacientes alcohólicos con hepatitis C

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se encuentra dentro del campo de la biomedicina y la biotecnología, y específicamente se refiere a un método de obtención de datos útiles para diagnosticar el hepatocarcinoma en pacientes alcohólicos que presentan hepatitis C.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La infección crónica por el virus de la hepatitis C (VHC) es la mayor causa de enfermedad hepática, cirrosis y carcinoma hepatocelular (HCC) en pacientes alcohólicos (Schiff et al., 2003. Alcohol Res. Health 27(3), 232-239). La infección crónica por VHC y el consumo de alcohol persistente son dos factores de riesgo significativos e independientes para el desarrollo de la enfermedad hepática terminal y la progresión del HCC, ambos actúan sinérgicamente para acelerar el daño hepático. Por lo tanto, los pacientes alcohólicos infectados por el VHC tienen una ocurrencia más rápida y frecuente de fibrosis y cirrosis, en comparación con los pacientes no alcohólicos. Algunos de los mecanismos principales que se postulan como responsables de la progresión de la enfermedad son: las altas tasas de apoptosis, la peroxidación de lípidos, la generación de radicales libres y de especies reactivas del oxígeno con la reducción de la capacidad antioxidante del hígado (Siu et ai, 2009. Semin. Liver Dis. 29(2), 188-199).

Muchos de los HCC son identificados en etapas muy avanzadas y su prognosis es muy pobre. Las terapias están dirigidas fundamentalmente para los tumores tempranos, la mayoría de ellos asintomáticos (McKillop et al., 2009. Sem/>7. Liver Dis. 29(2), 222-232). Además, los marcadores séricos analizados para la detección del HCC (des-gamma-carboxi-protrombina y alfa fetoproteína) no se utilizan rutinariamente debido a que poseen una sensibilidad y especificidad insuficientes (Lok et al., 2010. Gastroenterology 138(2), 493-502; EASL-EORTC, 2012. J. Hepatol. 56(4), 908-943). La identificación de biomarcadores para la detección precoz del HCC es esencial para mejorar la supervivencia de los pacientes.

La electroforesis en gel bidimensional de diferencia de fluorescencia (2-DIGE) para el análisis de muestras clínicas ha sido utilizada para identificar biomarcadores potenciales para la detección temprana y el diagnóstico de cáncer humano, así como para entender los mecanismos implicados en el proceso de carcinogénesis (Na et al., 2012. Methods Mol. Biol. 854, 223-237). Determinadas estrategias de reducción han demostrado su efectividad para eliminar la abundancia de proteínas y la mejora de la detección de proteínas poco abundantes en suero/plasma (Liang et al., 2012. Methods Mol. Biol. 854, 181-191).

Con el objetivo principal de evitar las dificultades que se presentan en el diagnóstico temprano del HCC, que se genera mayoritariamente en pacientes con factores de riesgo como la infección crónica por el VHC y el alcoholismo, la presente invención se refiere a un método para asistir al facultativo en la diagnosis del HCC en pacientes con infección por VHC y alcohólicos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Un primer aspecto de la invención se refiere al uso de al menos uno de los genes C4A, CP, PON1, o cualquiera de sus combinaciones, para la obtención de datos útiles para el diagnóstico del hepatocarcinoma en un individuo con hepatitis C. Preferiblemente, los genes C4A, CP, PON1 se usan de manera simultánea.

En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el individuo es alcohólico.

Un segundo aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de datos útiles para el diagnóstico del hepatocarcinoma en un individuo con hepatitis C, de ahora en adelante primer método de la invención, que comprende: i) obtener una muestra biológica aislada de un individuo ii) cuantificar la cantidad de producto de expresión de los genes que se seleccionan de la lista: C4A, CP, PON1, o cualquiera de sus combinaciones. Preferiblemente, en el paso (ii) se determina la cantidad de producto de expresión de todos los genes C4A, CP, PON1. En una realización preferida de este aspecto de la invención, el método además comprende: iii) hallar un valor de diagnóstico (VD) derivado con los valores obtenidos en ii), mediante la fórmula: VD = {C4A x CP) I PON1 (ng/mg de proteína plasmática)

Un tercer aspecto de la invención se refiere a un método de diagnóstico del hepatocarcinoma en un individuo con hepatitis C, de ahora en adelante segundo método de la invención, que comprende los pasos (i)-(iii) del primer método de la invención, y además comprende clasificar a los individuos que presentan un VD > 3,60 ng/mg, preferiblemente VD > 3,70 ng/mg, más preferiblemente VD > 3,80 ng/mg, y aún más preferiblemente VD > 3,87 ng/mg, en el grupo de individuos con hepatocarcinoma. En una realización preferida de este aspecto de la invención, la muestra biológica aislada i) es una muestra de sangre, preferiblemente suero.

Otro aspecto de la invención se refiere a un método de diagnóstico del hepatocarcinoma en un individuo con hepatitis C, que comprende los pasos (i)-(ii) del primer método de la invención, o los pasos (i)-(iii) del segundo método de la invención, y que además comprende: asignar los individuos del paso (i) al grupo de individuos con hepatocarcinoma uninodular cuando presentan un valor de C4A < 2,00 ng/mg, y más preferiblemente C4A < 2,07 ng/mg, o asignar a los individuos del paso (i) al grupo de individuos con hepatocarcinoma multinodular cuando presentan un valor de C4A > 2,00 ng/mg, y más preferiblemente un valor de C4A > 2,07 ng/mg.

En una realización preferida de este aspecto de la invención, la muestra biológica aislada i) es una muestra de sangre, preferiblemente suero.

En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la detección de la cantidad de expresión de cualquiera de los genes C4A, CP y PON1 se realiza mediante un inmunoensayo.

En otra realización preferida, el inmunoensayo es un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas o ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay).

Un cuarto aspecto de la invención se refiere a un kit o dispositivo que comprende los elementos necesarios para cuantificar la cantidad de expresión de los genes que se seleccionan de entre C4A, CP y PON1.

En una realización preferida de este aspecto de la invención, el kit o dispositivo comprende los anticuerpos que se seleccionan de la lista que consiste en anticuerpos: anti-C4A, anti-CP y anti- PON1.

En otra realización preferida el kit o dispositivo comprende las sondas SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 y/o SEQ ID NO: 8.

Un quinto aspecto de la invención se refiere al uso del kit o dispositivo para obtener datos útiles para el diagnóstico del hepatocarcinoma en un individuo.

Adicionalmente, los inventores han comprobado como la determinación o cuantificación del producto de expresión del gen FAG en combinación con la determinación o cuantificación del producto de expresión de los genes C4A, CP y PON1 resulta especialmente útil en el diagnóstico del hepatocarcinoma en un individuo con hepatitis C Por lo tanto, un sexto aspecto de la invención se refiere al uso, preferiblemente in vitro, de los genes que se seleccionan de la lista C4A, FGA, CP, PON1, o de los productos de expresión de dichos genes, o cualquiera de sus combinaciones, para la obtención de datos útiles para el diagnóstico del hepatocarcinoma en un individuo con hepatitis C. En una realización preferida de este aspecto de la invención, el uso de los genes C4A, FGA, CP, PON1, o de los productos de expresión de dichos genes, es simultáneo.

Un séptimo aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de datos útiles para el diagnóstico del hepatocarcinoma en un individuo con hepatitis C, de ahora en adelante primer método de la invención, que comprende: i) obtener una muestra biológica aislada de un individuo ii) cuantificar la cantidad de producto de expresión de los genes que se seleccionan de la lista: C4A, FGA, CP, PON1, o cualquiera de sus combinaciones.

En una realización preferida de este aspecto de la invención, se cuantifica simultáneamente la cantidad de producto de expresión de los genes C4A, FGA, CP y PON1. En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el método además comprende: iii) hallar un valor de diagnóstico (VD) derivado con los valores obtenidos en ii), mediante la fórmula:

VD = (C4A x FGA x CP) I PON1

Un octavo aspecto de la invención se refiere a un método de diagnóstico del hepatocarcinoma en un individuo con hepatitis C, de ahora en adelante método de la invención FGA, que comprende los pasos (i)-(iii) del método del séptimo aspecto de la invención, y además comprende clasificar a los individuos que presentan un VD > 95, preferiblemente un VD > 105, más preferiblemente un VD > 116, y aún más preferiblemente un VD > 120, en el grupo de individuos con hepatocarcinoma. Un noveno aspecto de la invención se refiere a un método de diagnóstico del hepatocarcinoma en un individuo con hepatitis C, que comprende los pasos (i)-(ii) del método del séptimo aspecto de la invención, y que además comprende: asignar los individuos del paso (i) al grupo de individuos con hepatocarcinoma uninodular cuando presentan un valor de producto de expresión del gen C4A < 2,00 ng/mg, y más preferiblemente un valor de producto de expresión del gen C4A < 2,07 ng/mg, o asignar a los individuos del paso (i) al grupo de individuos con hepatocarcinoma multinodular cuando presentan un valor de producto de expresión del gen C4A > 2,00 ng/mg, y más preferiblemente un valor de producto de expresión del gen C4A > 2,07 ng/mg. En una realización preferida de este aspecto de la invención, la muestra biológica aislada i) es una muestra de sangre, preferiblemente plasma sanguíneo.

En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la detección de la cantidad de expresión de cualquiera de los genes C4A, FGA, CP y PON1 se realiza mediante un inmunoensayo.

Un décimo aspecto de la invención se refiere a un kit o dispositivo que comprende los elementos necesarios para cuantificar la cantidad de los productos expresión de los genes que se seleccionan de entre C4A, FGA, CP y PON1 , o cualquiera de sus combinaciones.

Aún más preferiblemente, el kit de este aspecto de la invención comprende anticuerpos o fragmentos de los mismos específicos frente a cualquiera de las secuencias SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 11 o frente a secuencias aminoacídicas que presenten un grado de identidad con dichas secuencias aminoacídicas de al menos del 85%, típicamente de, al menos del 90%, preferiblemente de, al menos del 95%, más preferiblemente de, al menos del 98%, aún más preferiblemente de, al menos del 99%. En otra realización preferida, el kit de la invención comprende anticuerpos secundarios o controles positivos y/o negativos. El kit además puede incluir, sin ningún tipo de limitación, tampones, soluciones de extracción de proteínas, agentes para prevenir la contaminación, inhibidores de la degradación de las proteínas, etc.

Por otro lado el kit puede incluir todos los soportes y recipientes necesarios para su puesta en marcha y optimización. Preferiblemente, el kit comprende además las instrucciones para llevar a cabo los métodos de la invención. En otra realización preferida, el kit de este aspecto de la invención es adecuado para amplificar secuencias nucleótidicas, que comprende sondas y/o cebadores diseñados a partir de las secuencias SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 y/o SEQ ID NO: 12 así como opcionalmente todos aquellos elementos necesarios para llevar a cabo un procedimiento PCR. En una realización preferida, el kit de este aspecto de la invención comprende la asignación de un valor de diagnóstico y clasificación de los individuos, de manera que: si los individuos presentan un VD > 120 se clasifican en el grupo de individuos con hepatocarcinoma. Un undécimo aspecto de la invención se refiere a un soporte sólido, o chip de proteínas, que comprende al menos uno de los anticuerpos o fragmentos de los mismos específicos frente a cualquiera de las secuencias SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 11 o frente a secuencias aminoacídicas que presenten un grado de identidad con dichas secuencias aminoacídicas de al menos del 85%, típicamente de, al menos del 90%, preferiblemente de, al menos del 95%, más preferiblemente de, al menos del 98%, aún más preferiblemente de, al menos del 99%, o cualquiera de sus combinaciones o cualquiera de sus combinaciones, para llevar a cabo el cualquiera de los métodos de la invención.

Un duodécimo aspecto de la invención se refiere a un soporte sólido, o chip de ADN, que comprende oligonucleotidos o microarreglos de canal único diseñados a partir de una secuencia conocida o un ARNm de al menos uno de los genes C4A, FGA, CP y PON1. Preferiblemente, comprende los oligonucleotidos capaces de detectar el ARNm de todos los genes C4A, FGA, CP y PON1.

Un décimo tercer aspecto de la invención se refiere al uso del kit o dispositivo de la invención, en la obtención de datos útiles para el diagnóstico del hepatocarcinoma en un individuo con hepatitis C, preferiblemente alcohólico.

Un décimo cuarto aspecto de la invención se refiere a un medio de almacenamiento legible por un ordenador que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos de cualquiera de los métodos de la invención.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Imágenes del gel. (a) Superposición maestra del gel que contiene proteínas etiquetadas Cy2, Cy3 y Cy5 de las muestras de plasma, (b) SYPRO ® Ruby (BioRad) teñidas de imagen del gel preparativa. Están marcadas las manchas de proteínas identificadas expresadas diferencialmente.

Figura 2. Confirmación de los resultados DIGE por western-blot. Detección y cuantificación de (A) carboxipeptidasa-N (CPN), (B) paraoxonasa sérica/arilesterasa 1 (PON1), y (C) ceruloplasmina (CP) en muestras de plasma humano analizados previamente por DIGE. La densidad de banda de proteína se calculó con QuantityOne 4.4.0 software (BioRad). Los resultados se muestran como unidades arbitrarias (AU), (D) proteínas transferidas a la membrana de nitrocelulosa se detectaron mediante tinción de Ponceau S como control de carga western-blot.

Figura 3. Validación de biomarcadores candidatos seleccionados para el desarrollo de HCC en una población de pacientes mayor. La cuantificación de la concentración plasmática de (A) CPN (pg/mg de proteína de plasma), PON 1 y CP ^g/mg de proteína de plasma), y C4A (pg/mg de proteína de plasma) se realizó por test de ELISA. El tamaño de la muestra fue de 24 en el grupo de control y 22 en el grupo de tumores. La significación estadística se determinó mediante la prueba T de Student (p <0,05). Los datos se expresan como media ± desviación estándar; curvas (C) ROC muestran que la mejor capacidad predictiva para identificar a los pacientes con HCC pertenece a la combinación de C4A, PC y PON1.

Figura 4. Validación de biomarcadores candidatos seleccionados para el desarrollo de HCC en una población de pacientes mayor. (A) La cuantificación de la concentración plasmática de CPN (pg/mg de proteína de plasma), CP, IgM, PON 1 ^g/mg de proteína de plasma), C4A (ng/mg de proteína de plasma) y FGA ^g/mg de proteína de plasma) se realizó por test de ELISA. El tamaño de la muestra fue de 24 en el grupo de control y 22 en el grupo de tumores. La significación estadística se determinó mediante la prueba T de Student (p <0,05). Los datos se expresan como media ± error estándar; (B) Las curvas ROC muestran que la mejor capacidad predictiva para identificar a los pacientes con HCC pertenece a la combinación de C4A, FGA, CP y PONl

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Los autores de la presente invención han analizado la expresión de los genes C4A, FGA, CP y PON 1 en individuos alcohólicos con hepatitis C y han generado un método para la obtención de datos útiles para el diagnóstico del hepatocarcinoma

La presente invención se refiere a un método y a un kit o dispositivo para su uso, preferiblemente in vitro, en el diagnósticos del hepatocarcinoma en individuos alcohólicos con hepatitis C.

Por tanto, un aspecto que denominaremos A de la invención se refiere al uso de al menos uno de los genes que se seleccionan de la lista C4A, FGA, CP, PON 1 , o de los productos de expresión de dichos genes, o cualquiera de sus combinaciones, para la obtención de datos útiles para el diagnóstico del hepatocarcinoma en un individuo con hepatitis C.

En una realización preferida de este aspecto de la invención, el uso de los genes C4A, FGA, CP, PON 1 , o de los productos de expresión de dichos genes, es secuencial o simultáneo. El producto de expresión de cada uno de dichos genes se puede determinar de forma simultánea o secuencial en cualquier orden.

En una realización preferida, por producto de expresión del gen C4A, se entiende las secuencia aminoácidica que presente un grado de identidad con la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 de, al menos del 85%, típicamente de, al menos del 90%, preferiblemente de, al menos del 95%, más preferiblemente de, al menos del 98%, aún más preferiblemente de, al menos del 99% o una secuencia nucleotídica que codifique para cualquiera de dichas secuencia aminoacídicas.

En una realización preferida, por producto de expresión del gen FGA, se entiende las secuencia aminoácidica que presente un grado de identidad con la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6 de, al menos del 85%, típicamente de, al menos del 90%, preferiblemente de, al menos del 95%, más preferiblemente de, al menos del 98%, aún más preferiblemente de, al menos del 99% o una secuencia nucleotídica que codifique para cualquiera de dichas secuencia aminoacídicas. En una realización preferida, por producto de expresión del gen CP, se entiende las secuencia aminoácidica que presente un grado de identidad con la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 9 de, al menos del 85%, típicamente de, al menos del 90%, preferiblemente de, al menos del 95%, más preferiblemente de, al menos del 98%, aún más preferiblemente de, al menos del 99% o una secuencia nucleotídica que codifique para cualquiera de dichas secuencia aminoacídicas. En una realización preferida, por producto de expresión del gen PON1 , se entiende las secuencia aminoácidica que presente un grado de identidad con la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 11 de, al menos del 85%, típicamente de, al menos del 90%, preferiblemente de, al menos del 95%, más preferiblemente de, al menos del 98%, aún más preferiblemente de, al menos del 99% o una secuencia nucleotídica que codifique para cualquiera de dichas secuencia aminoacídicas. En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el individuo es alcohólico.

El término "alcohólico", tal y como se utiliza en la descripción, se refiere a individuos con un consumo diario regular de etanol superior a 40g en hombres y a 20g en mujeres. El consumo de riesgo es un nivel o patrón de consumo de alcohol que puede causar daños en la salud si el hábito del consumo persiste, y es descrito por la Organización Mundial de la Salud (OMS) como consumo medio regular de 20 a 40g de alcohol diarios en mujeres, y de 40 a 60g diarios en hombres. La dependencia del alcohol es un conjunto de fenómenos conductuales, cognitivos y fisiológicos en los cuales el uso del alcohol se transforma en prioritario para el individuo, en contraposición con otras conductas que en algún momento tuvieron mayor valor para él. El consumo lleva a un estado de intoxicación y el alcoholismo lleva asociado un conjunto de alteraciones digestivas (gastritis, cirrosis que es causa de insuficiencia hepática, hemorragias o encefalopatía de pronóstico grave), favorece el desarrollo de cáncer de esófago, produce atrofia cerebral, neuritis de nervios periféricos, neuritis óptica y, en casos avanzados, conduce a la pérdida de reflejos, disminución de la sensibilidad, trastornos tróficos incluso parálisis y ceguera total. Un aspecto B de la invención se refiere a un método de obtención de datos útiles para el diagnóstico del hepatocarcinoma en un individuo con hepatitis C, de ahora en adelante primer método de la invención, que comprende: i) obtener una muestra biológica aislada de un individuo; ii) cuantificar la cantidad de producto de expresión de los genes que se seleccionan de la lista: C4A, CP, PON1, o cualquiera de sus combinaciones a partir de la muestra biológica del individuo del paso i).

En una realización preferida de este aspecto de la invención, se cuantifica simultáneamente la cantidad de producto de expresión de los genes C4A, CP y PON1. En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el método además comprende: iii) hallar un valor de diagnóstico (VD) derivado con los valores obtenidos en ii), mediante la fórmula:

VD = {C4A x CP) I PON1 (ng/mg de proteína plasmática)

En una realización preferida de este aspecto de la invención, la muestra biológica aislada i) es una muestra de sangre, y más preferiblemente es suero.

Un aspecto C de la invención se refiere a un método de diagnóstico del hepatocarcinoma en un individuo con hepatitis C, de ahora en adelante segundo método de la invención, que comprende los pasos (i)-(iii) del primer método de la invención, y además comprende clasificar a los individuos que presentan un VD > 3,87 ng/mg en el grupo de individuos con hepatocarcinoma.

Otro aspecto de la invención se refiere a un método de diagnóstico del hepatocarcinoma en un individuo con hepatitis C, que comprende los pasos (i)-(ii) del primer método de la invención o los pasos (i)-(iii) del segundo método de la invención, y que además comprende: asignar los individuos del paso (i) al grupo de individuos con hepatocarcinoma uninodular cuando presentan un valor de C4A<2,07 ng/mg, o asignar a los individuos del paso (i) al grupo de individuos con hepatocarcinoma multinodular cuando presentan un valor de C4A>2,07 ng/mg. En una realización preferida de este aspecto de la invención, la muestra biológica aislada i) es una muestra de sangre, preferiblemente suero. En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el individuo es alcohólico.

Un aspecto D de la invención se refiere a un método de obtención de datos útiles para el diagnóstico del hepatocarcinoma en un individuo con hepatitis C, de ahora en adelante tercer método de la invención, que comprende: i) obtener una muestra biológica aislada de un individuo ii) cuantificar la cantidad de producto de expresión de los genes que se seleccionan de la lista: C4A, FGA, CP, PON1 , o cualquiera de sus combinaciones.

VD = (C4A x FGA x CP)/PON 1

En una realización preferida de este aspecto de la invención, la muestra biológica aislada i) es una muestra de sangre, y más preferiblemente es plasma, preferiblemente sanguíneo.

Un aspecto E de la invención se refiere a un método de diagnóstico del hepatocarcinoma en un individuo con hepatitis C, de ahora en adelante cuarto método de la invención, que comprende los pasos (i)-(iii) del tercer método de la invención, y además comprende clasificar a los individuos que presentan un VD > 95, preferiblemente un VD > 105, más preferiblemente un VD > 116, y aún más preferiblemente un VD > 120, en el grupo de individuos con hepatocarcinoma.

En una realización preferida de este aspecto de la invención, la cantidad del producto de expresión de los genes se mide: en ng/mg para el gen C4A y en μg/mg para los genes FGA, CP, PON1. En una realización preferida de este aspecto de la invención, la muestra biológica aislada i) es una muestra de sangre, preferiblemente plasma sanguíneo.

Un aspecto F de la invención se refiere a un método de diagnóstico del hepatocarcinoma en un individuo con hepatitis C, que comprende los pasos (i)-(ii) del tercer método de la invención, y que además comprende: asignar los individuos del paso (i) al grupo de individuos con hepatocarcinoma uninodular cuando presentan un valor de producto de expresión del gen C4A < 2,00 ng/mg, y más preferiblemente un valor de producto de expresión del gen C4A < 2,07 ng/mg, o asignar a los individuos del paso (i) al grupo de individuos con hepatocarcinoma multinodular cuando presentan un valor de producto de expresión del gen C4A > 2,00 ng/mg, y más preferiblemente un valor de producto de expresión del gen C4A > 2,07 ng/mg.

En una realización preferida de este aspecto de la invención, el método comprende los pasos (i)- (iii) del tercer método de la invención.

En una realización preferida de este aspecto de la invención, la muestra biológica aislada i) es una muestra de sangre, preferiblemente plasma sanguíneo. En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el individuo es alcohólico.

Los pasos (ii) y/o (iii) de cualquiera de los métodos descritos anteriormente pueden ser total o parcialmente automatizados, por ejemplo, por medio de un equipo robótico sensor para la detección de la cantidad en el paso (ii) o la comparación computarizada en el paso (iii).

Una "muestra biológica aislada" incluye, pero sin limitarnos a, células, tejidos y/o fluidos biológicos de un organismo, obtenidos mediante cualquier método conocido por un experto en la materia. Preferiblemente, la muestra biológica aislada es una muestra de sangre, y más preferiblemente es plasma sanguíneo.

En esta memoria se entiende por "plasma sanguíneo" a la fracción líquida y acelular de la sangre obtenida al dejarla desprovista de células. Normalmente, está compuesto por un 90 % de agua, un 7 % de proteínas, y el 3 % restante por grasa, glucosa, vitaminas, hormonas, oxígeno, gas carbónico y nitrógeno, además de productos de desecho del metabolismo como el ácido úrico. A estos se les pueden añadir otros compuestos como las sales y la urea. El plasma sanguíneo representa aproximadamente el 55% del volumen sanguíneo total, mientras que el 45 % restante corresponde a los elementos formes. Las principales proteínas plasmáticas se clasifican en: albúminas, globulinas y fibrinógeno.

El término "individuo", tal y como se utiliza en la descripción, se refiere a animales, preferiblemente mamíferos, y más preferiblemente, humanos. El término "individuo" no pretende ser limitativo en ningún aspecto, pudiendo ser éste de cualquier edad, sexo y condición física.

La detección la cantidad de producto de expresión de C4A, FGA, CP y PON1 puede realizarse por cualquier medio conocido en el estado de la técnica. Los autores de la presente invención han demostrado que la detección de la cantidad o la concentración de anticuerpos frente a estas proteínas de manera semi-cuantitativa o cuantitativa permiten la obtención de datos útiles para el diagnóstico del hepatocarcinoma en individuos con hepatitis C. Los niveles de expresión de los genes van a dar un determinado perfil de expresión génica. El término "nivel de expresión", también denominado "cantidad producto génico" o "cantidad de producto de expresión" se refiere al material bioquímico, ya sea ARN o proteína, resultado de la expresión de un gen. Algunas veces se usa una medida de la cantidad de producto génico para inferir qué tan activo es un gen. Se entiende por "perfil de expresión génica" el perfil génico obtenido tras la cuantificación del ARNm y/o de proteína producida por los genes de interés o biomarcadores, es decir, por los genes C4A, FGA, CP y PON

La medida de la cantidad o la concentración de producto de expresión de estos genes, preferiblemente de manera semi-cuantitativa o cuantitativa, puede ser llevada a cabo de manera directa o indirecta. La medida directa se refiere a la medida de la cantidad o la concentración del producto de expresión de los genes, basada en una señal que se obtiene directamente de los transcritos de dichos genes, o de las proteínas, y que está correlacionada directamente con el número de moléculas de ARN o de proteínas producidas por los genes. Dicha señal (a la que también podemos referirnos como señal de intensidad) puede obtenerse, por ejemplo, midiendo un valor de intensidad de una propiedad química o física de dichos productos. La medida indirecta incluye la medida obtenida de un componente secundario o un sistema de medida biológica (por ejemplo la medida de respuestas celulares, ligandos, "etiqueta" o productos de reacción enzimática).

El término "cantidad", tal y como se utiliza en la descripción, se refiere pero no se limita, a la cantidad absoluta o relativa de los productos de expresión de los genes o a la cantidad de las proteínas, así como a cualquier otro valor o parámetro relacionado con los mismos o que pueda derivarse de éstos. Dichos valores o parámetros comprenden valores de intensidad de la señal obtenidos a partir de cualquiera de las propiedades físicas o químicas de dichos productos de expresión obtenidos mediante medida directa. Adicionalmente, dichos valores o parámetros incluyen todos aquellos obtenidos mediante medida indirecta, por ejemplo, cualquiera de los sistemas de medida descritos en otra parte del presente documento.

El término "comparación", tal y como se utiliza en la descripción, se refiere pero no se limita, a la comparación de la cantidad de los productos de expresión de los genes o de la cantidad de anticuerpos frente a C4A, FGA, CP y PON1 y de la muestra biológica a analizar, también llamada muestra biológica problema, con una cantidad de los productos de expresión de los genes o con una cantidad de anticuerpos frente a C4A, FGA, CP y PON 1 de una o varias muestras de referencia deseable. La muestra de referencia puede ser analizada, por ejemplo, simultánea o consecutivamente, junto con la muestra biológica problema. El cálculo descrito en el apartado (iii) del método de la presente invención puede ser realizado manualmente o asistido por ordenador. En la siguiente tabla se describen los genes usados en la invención según la base de datos PubMed del NCBI (National Center of Biotechnolgy Information):

A continuación se describen las características de los genes y de los productos de expresión o proteínas que son objeto del estudio:

C4A: este gen codifica para la forma ácida del factor de complemento 4, parte de la ruta de activación clásica. La proteína se expresa como un único precursor de cadena simple que se escinde proteolíticamente en un trímero de cadenas alfa, beta y gamma antes de la secreción. El trímero proporciona una superficie de interacción entre el complejo antígeno-anticuerpo y otros componentes del complemento. La cadena alfa se puede escindir para liberar anafilatoxina C4, que actúa como mediador de la inflamación local. La deficiencia de esta proteína se asocia con lupus eritematoso sistémico y diabetes mellitus tipo I (Lhotta et al., 1996. Diabetes Care 19(1), 53- 55). Este gen se localiza en la región del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase III del cromosoma 6. Existen diferentes haplotipos de este grupo de genes, de tal manera que los individuos pueden tener 1 , 2 ó 3 copias de este gen. Para este gen se han encontrado dos variantes de transcripción que codifican diferentes isoformas (PubMed Gene ID: 720).

En el contexto de la presente invención, C4A se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótidos, que constituye la secuencia codificante de la proteína recogida en la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, y que comprendería diversas variantes procedentes de: a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 , b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína C4A. Entre dichas moléculas de ácido nucleico se encuentra la recogida en la secuencia SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4.

FGA: la proteína codificada por este gen es el componente alfa del fibrinógeno, una glicoproteína transmitida por la sangre que está compuesta de tres pares de cadenas polipeptídicas no idénticas. Después de una lesión vascular, el fibrinógeno se escinde por la trombina para formar fibrina, que es el componente más abundante de coágulos de sangre. Además, varios productos de escisión de fibrinógeno y fibrina regulan la adhesión celular y la difusión, la vasoconstricción y actividades quimiotácticas, y son mitógenos para varios tipos de células. Las mutaciones en este gen conducen a varios trastornos, incluyendo disfibrinogenemia, hipofibrinogenemia, afibrinogenemia y amiloidosis renal. Del splicing alternativo resultan dos isoformas que varían en el extremo carboxi-terminal (PubMed Gene ID: 2243). En el contexto de la presente invención, FGA se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótidos, que constituye la secuencia codificante de la proteína recogida en la SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6, y que comprendería diversas variantes procedentes de: a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína FGA. Entre dichas moléculas de ácido nucleico se encuentra la recogida en la secuencia SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8.

CP (o también conocida como ferroxidasa): la proteína codificada por este gen es una metaloproteína que une la mayor parte del cobre en el plasma y está implicada en la peroxidación de la transferrina Fe(ll) a transferrina Fe(lll). Fue descrita por primera vez en 1948 y es la principal proteína transportadora de cobre en la sangre. Las mutaciones en esta proteína causan aceruloplasminemua, caracterizada por la sobrecarga de cobre en el cerebro, páncreas y retina.

En el contexto de la presente invención, CP se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótidos, que constituye la secuencia codificante de la proteína recogida en la SEQ ID NO: 9, y que comprendería diversas variantes procedentes de: a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 9, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 9, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína CP. Entre dichas moléculas de ácido nucleico se encuentra la recogida en la secuencia SEQ ID NO: 10.

PON 1 : La enzima codificada por este gen es una arilesterasa que hidroliza paroxon para producir p-nitrofenol. Los polimorfismos en este gen son un factor de riesgo en enfermedades de arterias coronarias. En humanos, este gen se encuentra en un cluster de genes relacionados con la paraxonasa en la localización cromosómica 7q21.3. La enzima PON 1 (arildialquilfosfatasa, E.C.3.1.8.1), descrita en 1946 por A. Mazur (Mazur A. 1946. J. Biol. Chem. 164, 271-89) es dependiente de calcio con actividades de esterasa y lactonasa. Aún sin conocerse su papel fisiológico, se la describió por su capacidad de hidrolizar derivados de compuestos organofosfato; los mismos que inhiben la acción de la acetil colinesterasa, causando síndrome colinérgico y polineuropatía crónica (Lotti M. 1991. Crit. Rev. Toxicol. 21 ,465-87). Los sustratos de paraoxonasa-1 (PON1) son tri-ésteres del ácido fosfórico como paraoxón y diazoxón, metabolitos de los insecticidas altamente tóxicos para tión y diazinón, respectivamente. Esta enzima hidroliza también los agentes nerviosos sarín y somán y ésteres aromáticos como fenilacetato y naftil acetato. Se ha sugerido que la enzima podría ser capaz de impedir o limitar la oxidación de las LDL (Mackness et al., 1991 FEBS Lett 286, 152-4). Ese fue el primer informe que le adjudicó a la PON 1 capacidad antioxidante, tornándose en un punto nodal para entender la importancia clínica de esta enzima, dada la relación entre el estrés oxidativo, la oxidación del LDL y la arteriesclerosis. En el contexto de la presente invención, PON 1 se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótidos, que constituye la secuencia codificante de la proteína recogida en la SEQ ID NO: 11 , y que comprendería diversas variantes procedentes de: a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 11 , b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 9, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína PON1. Entre dichas moléculas de ácido nucleico se encuentra la recogida en la secuencia SEQ ID NO: 12.

A continuación se detallan cada una de las secuencias mencionadas. SEQ ID NO:1 :

MRLLWGLIWASSFFTLSLQKPRLLLFSPSWHLGVPLSVGVQLQDVPRGQWKGSVFLRNPSRNN VPCSPKVDFTLSSERDFALLSLQVPLKDAKSCGLHQLLRGPEVQLVAHSPWLKDSLSRTTNIQGIN LLFSSRRGHLFLQTDQPIYNPGQRVRYRVFALDQKMRPSTDTITVMVENSHGLRVRKKEVYMPSSI FQDDFVIPDISEPGTWKISARFSDGLESNSSTQFEVKKYVLPNFEVKITPGKPYILTVPGHLDEMQL DIQARYIYGKPVQGVAYVRFGLLDEDGKKTFFRGLESQTKLVNGQSHISLSKAEFQDALEKLNMGIT DLQGLRLYVAAAIIESPGGEMEEAELTSWYFVSSPFSLDLSKTKRHLVPGAPFLLQALVREMSGSPA SGI PVKVSATVSSPGSVPEVQDIQQNTDGSGQVSI Pl 11 PQTISELQLSVSAGSPH PAI ARLTVAAPPS GGPGFLSIERPDSRPPRVGDTLNLNLRAVGSGATFSHYYYMILSRGQIVFMNREPKRTLTSVSVFV DHHLAPSFYFVAFYYHGDHPVANSLRVDVQAGACEGKLELSVDGAKQYRNGESVKLHLETDSLAL VALGALDTALYAAGSKSHKPLNMGKVFEAMNSYDLGCGPGGGDSALQVFQAAGLAFSDGDQWTL SRKRLSCPKEKTTRKKRNVNFQKAINEKLGQYASPTAKRCCQDGVTRLPMMRSCEQRAARVQQP DCREPFLSCCQFAESLRKKSRDKGQAGLQRALEILQEEDLIDEDDIPVRSFFPENWLWRVETVDRF QILTLWLPDSLTTWEIHGLSLSKTKGLCVATPVQLRVFREFHLHLRLPMSVRRFEQLELRPVLYNYL DKNLTVSVHVSPVEGLCLAGGGGLAQQVLVPAGSARPVAFSWPTAAAAVSLKWARGSFEFPVG DAVSKVLQIEKEGAIHREELVYELNPLDHRGRTLEIPGNSDPNMIPDGDFNSYVRVTASDPLDTLGS EGALSPGGVASLLRLPRGCGEQTMIYLAPTLAASRYLDKTEQWSTLPPETKDHAVDLIQKGYMRIQ QFRKADGSYAAWLSRDSSTWLTAFVLKVLSLAQEQVGGSPEKLQETSNWLLSQQQADGSFQDPC PVLDRSMQGGLVGNDETVALTAFVTIALHHGLAVFQDEGAEPLKQRVEASISKANSFLGEKASAGL LGAHAAAITAYALTLTKAPVDLLGVAHNNLMAMAQETGDNLYWGSVTGSQSNAVSPTPAPRNPSD PMPQAPALWIETTAYALLHLLLHEGKAEMADQASAWLTRQGSFQGGFRSTQDTVIALDALSAYWIA SHTTEERGLNVTLSSTGRNGFKSHALQLNNRQIRGLEEELQFSLGSKINVKVGGNSKGTLKVLRTY NVLDMKNTTCQDLQIEVTVKGHVEYTMEANEDYEDYEYDELPAKDDPDAPLQPVTPLQLFEGRRN RRRREAPKVVEEQESRVHYTVCIWRNGKVGLSGMAIADVTLLSGFHALRADLEKLTSLSDRYVSH FETEGPHVLLYFDSVPTSRECVGFEAVQEVPVGLVQPASATLYDYYNPERRCSVFYGAPSKSRLLA TLCSAEVCQCAEGKCPRQRRALERGLQDEDGYRMKFACYYPRVEYGFQVKVLREDSRAAFRLFE TKITQVLHFTKDVKAAANQMRNFLVRASCRLRLEPGKEYLIMGLDGATYDLEGHPQYLLDSNSWIE EMPSERLCRSTRQRAACAQLNDFLQEYGTQGCQV SEQ ID N0:2:

MRLLWGLIWASSFFTLSLQKPRLLLFSPSWHLGVPLSVGVQLQDVPRGQVVKGSVFLRNPSRNN VPCSPKVDFTLSSERDFALLSLQVPLKDAKSCGLHQLLRGPEVQLVAHSPWLKDSLSRTTNIQGIN LLFSSRRGHLFLQTDQPIYNPGQRVRYRVFALDQKMRPSTDTITVMVENSHGLRVRKKEVYMPSSI FQDDFVIPDISEPGTWKISARFSDGLESNSSTQFEVKKYVLPNFEVKITPGKPYILTVPGHLDEMQL DIQARYIYGKPVQGVAYVRFGLLDEDGKKTFFRGLESQTKLVNGQSHISLSKAEFQDALEKLNMGIT DLQGLRLYVAAAIIESPGGEMEEAELTSWYFVSSPFSLDLSKTKRHLVPGAPFLLQALVREMSGSPA SGI PVKVSATVSSPGSVPEVQDIQQNTDGSGQVSI Pl 11 PQTISELQLSVSAGSPH PAI ARLTVAAPPS GGPGFLSIERPDSRPPRVGDTLNLNLRAVGSGATFSHYYYMILSRGQIVFMNREPKRTLTSVSVFV DHHLAPSFYFVAFYYHGDHPVANSLRVDVQAGACEGKLELSVDGAKQYRNGESVKLHLETDSLAL VALGALDTALYAAGSKSHKPLNMGKVFEAMNSYDLGCGPGGGDSALQVFQAAGLAFSDGDQWTL SRKRLSCPKEKTTRKKRNVNFQKAINEKLGQYASPTAKRCCQDGVTRLPMMRSCEQRAARVQQP DCREPFLSCCQFAESLRKKSRDKGQAGLQRALEILQEEDLIDEDDIPVRSFFPENWLWRVETVDRF QILTLWLPDSLTTWEIHGLSLSKTKGLCVATPVQLRVFREFHLHLRLPMSVRRFEQLELRPVLYNYL DKNLTVSVHVSPVEGLCLAGGGGLAQQVLVPAGSARPVAFSWPTAAAAVSLKWARGSFEFPVG DAVSKVLQIEKEGAIHREELVYELNPLDHRGRTLEIPGNSDPNMIPDGDFNSYVRVTASDPLDTLGS EGALSPGGVASLLRLPRGCGEQTMIYLAPTLAASRYLDKTEQWSTLPPETKDHAVDLIQKGYMRIQ QFRKADGSYAAWLSRDSSTWLTAFVLKVLSLAQEQVGGSPEKLQETSNWLLSQQQADGSFQDPC PVLDRSMQGGLVGNDETVALTAFVTIALHHGLAVFQDEGAEPLKQRVEASISKANSFLGEKASAGL LGAHAAAITAYALTLTKAPVDLLGVAHNNLMAMAQETGDNLYWGSVTGSQSNAVSPTPAPRNPSD PMPQAPALWIETTAYALLHLLLHEGKAEMADQASAWLTRQGSFQGGFRSTQDTVIALDALSAYWIA SHTTEERGLNVTLSSTGRNGFKSHALQLNNRQIRGLEEELQFSLGSKINVKVGGNSKGTLKVLRTY NVLDMKNTTCQDLQIEVTVKGHVEYTMEANEDYEDYEYDELPAKDDPDAPLQPVTPLQLFEGRRN RRRREAPKLTSLSDRYVSHFETEGPHVLLYFDSVPTSRECVGFEAVQEVPVGLVQPASATLYDYYN PERRCSVFYGAPSKSRLLATLCSAEVCQCAEGKCPRQRRALERGLQDEDGYRMKFACYYPRVEY GFQVKVLREDSRAAFRLFETKITQVLHFTKDVKAAANQMRNFLVRASCRLRLEPGKEYLIMGLDGA TYDLEGHPQYLLDSNSWIEEMPSERLCRSTRQRAACAQLNDFLQEYGTQGCQV

SEQ ID N0:3:

AGAAGGTAGCAGACAGACAGACGGATCTAACCTCTCTTGGATCCTCCAGCCATGAGGCTGCTC TGGGGGCTGATCTGGGCATCCAGCTTCTTCACCTTATCTCTGCAGAAGCCCAGGTTGCTCTTG TTCTCTCCTTCTGTGGTTCATCTGGGGGTCCCCCTATCGGTGGGGGTGCAGCTCCAGGATGT GCCCCGAGGACAGGTAGTGAAAGGATCAGTGTTCCTGAGAAACCCATCTCGTAATAATGTCCC CTGCTCCCCAAAGGTGGACTTCACCCTTAGCTCAGAAAGAGACTTCGCACTCCTCAGTCTCCA GGTGCCCTTGAAAGATGCGAAGAGCTGTGGCCTCCATCAACTCCTCAGAGGCCCTGAGGTCC AGCTGGTGGCCCATTCGCCATGGCTAAAGGACTCTCTGTCCAGAACGACAAACATCCAGGGTA TCAACCTGCTCTTCTCCTCTCGCCGGGGGCACCTCTTTTTGCAGACGGACCAGCCCATTTACA ACCCTGGCCAGCGGGTTCGGTACCGGGTCTTTGCTCTGGATCAGAAGATGCGCCCGAGCACT GACACCATCACAGTCATGGTGGAGAACTCTCACGGCCTCCGCGTGCGGAAGAAGGAGGTGTA CATGCCCTCGTCCATCTTCCAGGATGACTTTGTGATCCCAGACATCTCAGAGCCAGGGACCTG GAAGATCTCAGCCCGATTCTCAGATGGCCTGGAATCCAACAGCAGCACCCAGTTTGAGGTGAA GAAATATGTCCTTCCCAACTTTGAGGTGAAGATCACCCCTGGAAAGCCCTACATCCTGACGGT GCCAGGCCATCTTGATGAAATGCAGTTAGACATCCAGGCCAGGTACATCTATGGGAAGCCAGT GCAGGGGGTGGCATATGTGCGCTTTGGGCTCCTAGATGAGGATGGTAAGAAGACTTTCTTTCG GGGGCTGGAGAGTCAGACCAAGCTGGTGAATGGACAGAGCCACATTTCCCTCTCAAAGGCAG AGTTCCAGGACGCCCTGGAGAAGCTGAATATGGGCATTACTGACCTCCAGGGGCTGCGCCTC TACGTTGCTGCAGCCATCATTGAGTCTCCAGGTGGGGAGATGGAGGAGGCAGAGCTCACATC CTGGTATTTTGTGTCATCTCCCTTCTCCTTGGATCTTAGCAAGACCAAGCGACACCTTGTGCCT GGGGCCCCCTTCCTGCTGCAGGCCTTGGTCCGTGAGATGTCAGGCTCCCCAGCTTCTGGCAT TCCTGTCAAAGTTTCTGCCACGGTGTCTTCTCCTGGGTCTGTTCCTGAAGTCCAGGACATTCA GCAAAACACAGACGGGAGCGGCCAAGTCAGCATTCCAATAATTATCCCTCAGACCATCTCAGA GCTGCAGCTCTCAGTATCTGCAGGCTCCCCACATCCAGCGATAGCCAGGCTCACTGTGGCAG CCCCACCTTCAGGAGGCCCCGGGTTTCTGTCTATTGAGCGGCCGGATTCTCGACCTCCTCGT GTTGGGGACACTCTGAACCTGAACTTGCGAGCCGTGGGCAGTGGGGCCACCTTTTCTCATTA CTACTACATGATCCTATCCCGAGGGCAGATCGTGTTCATGAATCGAGAGCCCAAGAGGACCCT GACCTCGGTCTCGGTGTTTGTGGACCATCACCTGGCACCCTCCTTCTACTTTGTGGCCTTCTA CTACCATGGAGACCACCCAGTGGCCAACTCCCTGCGAGTGGATGTCCAGGCTGGGGCCTGC GAGGGCAAGCTGGAGCTCAGCGTGGACGGTGCCAAGCAGTACCGGAACGGGGAGTCCGTG AAGCTCCACTTAGAAACCGACTCCCTAGCCCTGGTGGCGCTGGGAGCCTTGGACACAGCTCT GTATGCTGCAGGCAGCAAGTCCCACAAGCCCCTCAACATGGGCAAGGTCTTTGAAGCTATGAA CAGCTATGACCTCGGCTGTGGTCCTGGGGGTGGGGACAGTGCCCTTCAGGTGTTCCAGGCA GCGGGCCTGGCCTTTTCTGATGGAGACCAGTGGACCTTATCCAGAAAGAGACTAAGCTGTCC CAAGGAGAAGACAACCCGGAAAAAGAGAAACGTGAACTTCCAAAAGGCGATTAATGAGAAATT GGGTCAGTATGCTTCCCCGACAGCCAAGCGCTGCTGCCAGGATGGGGTGACACGTCTGCCCA TGATGCGTTCCTGCGAGCAGCGGGCAGCCCGCGTGCAGCAGCCGGACTGCCGGGAGCCCT TCCTGTCCTGCTGCCAATTTGCTGAGAGTCTGCGCAAGAAGAGCAGGGACAAGGGCCAGGC GGGCCTCCAACGAGCCCTGGAGATCCTGCAGGAGGAGGACCTGATTGATGAGGATGACATTC CCGTGCGCAGCTTCTTCCCAGAGAACTGGCTCTGGAGAGTGGAAACAGTGGACCGCTTTCAA ATATTGACACTGTGGCTCCCCGACTCTCTGACCACGTGGGAGATCCATGGCCTGAGCCTGTCC AAAACCAAAGGCCTATGTGTGGCCACCCCAGTCCAGCTCCGGGTGTTCCGCGAGTTCCACCT GCACCTCCGCCTGCCCATGTCTGTCCGCCGCTTTGAGCAGCTGGAGCTGCGGCCTGTCCTCT ATAACTACCTGGATAAAAACCTGACTGTGAGCGTCCACGTGTCCCCAGTGGAGGGGCTGTGC CTGGCTGGGGGCGGAGGGCTGGCCCAGCAGGTGCTGGTGCCTGCGGGCTCTGCCCGGCCT GTTGCCTTCTCTGTGGTGCCCACGGCAGCCGCCGCTGTGTCTCTGAAGGTGGTGGCTCGAG GGTCCTTCGAATTCCCTGTGGGAGATGCGGTGTCCAAGGTTCTGCAGATTGAGAAGGAAGGG GCCATCCATAGAGAGGAGCTGGTCTATGAACTCAACCCCTTGGACCACCGAGGCCGGACCTT GGAAATACCTGGCAACTCTGATCCCAATATGATCCCTGATGGGGACTTTAACAGCTACGTCAGG GTTACAGCCTCAGATCCATTGGACACTTTAGGCTCTGAGGGGGCCTTGTCACCAGGAGGCGT GGCCTCCCTCTTGAGGCTTCCTCGAGGCTGTGGGGAGCAAACCATGATCTACTTGGCTCCGA CACTGGCTGCTTCCCGCTACCTGGACAAGACAGAGCAGTGGAGCACACTGCCTCCCGAGAC CAAGGACCACGCCGTGGATCTGATCCAGAAAGGCTACATGCGGATCCAGCAGTTTCGGAAGG CGGATGGTTCCTATGCGGCTTGGTTGTCACGGGACAGCAGCACCTGGCTCACAGCCTTTGTG TTGAAGGTCCTGAGTTTGGCCCAGGAGCAGGTAGGAGGCTCGCCTGAGAAACTGCAGGAGA CATCTAACTGGCTTCTGTCCCAGCAGCAGGCTGACGGCTCGTTCCAGGACCCCTGTCCAGTG TTAGACAGGAGCATGCAGGGGGGTTTGGTGGGCAATGATGAGACTGTGGCACTCACAGCCTT TGTGACCATCGCCCTTCATCATGGGCTGGCCGTCTTCCAGGATGAGGGTGCAGAGCCATTGA AGCAGAGAGTGGAAGCCTCCATCTCAAAGGCAAACTCATTTTTGGGGGAGAAAGCAAGTGCT GGGCTCCTGGGTGCCCACGCAGCTGCCATCACGGCCTATGCCCTGACACTGACCAAGGCGC CTGTGGACCTGCTCGGTGTTGCCCACAACAACCTCATGGCAATGGCCCAGGAGACTGGAGAT AACCTGTACTGGGGCTCAGTCACTGGTTCTCAGAGCAATGCCGTGTCGCCCACCCCGGCTCC TCGCAACCCATCCGACCCCATGCCCCAGGCCCCAGCCCTGTGGATTGAAACCACAGCCTACG CCCTGCTGCACCTCCTGCTTCACGAGGGCAAAGCAGAGATGGCAGACCAGGCTTCGGCCTG GCTCACCCGTCAGGGCAGCTTCCAAGGGGGATTCCGCAGTACCCAAGACACGGTGATTGCCC TGGATGCCCTGTCTGCCTACTGGATTGCCTCCCACACCACTGAGGAGAGGGGTCTCAATGTG ACTCTCAGCTCCACAGGCCGGAATGGGTTCAAGTCCCACGCGCTGCAGCTGAACAACCGCCA GATTCGCGGCCTGGAGGAGGAGCTGCAGTTTTCCTTGGGCAGCAAGATCAATGTGAAGGTGG GAGGAAACAGCAAAGGAACCCTGAAGGTCCTTCGTACCTACAATGTCCTGGACATGAAGAACA CGACCTGCCAGGACCTACAGATAGAAGTGACAGTCAAAGGCCACGTCGAGTACACGATGGAA GCAAACGAGGACTATGAGGACTATGAGTACGATGAGCTTCCAGCCAAGGATGACCCAGATGCC CCTCTGCAGCCCGTGACACCCCTGCAGCTGTTTGAGGGTCGGAGGAACCGCCGCAGGAGGG AGGCGCCCAAGGTGGTGGAGGAGCAGGAGTCCAGGGTGCACTACACCGTGTGCATCTGGCG GAACGGCAAGGTGGGGCTGTCTGGCATGGCCATCGCGGACGTCACCCTCCTGAGTGGATTC CACGCCCTGCGTGCTGACCTGGAGAAGCTGACCTCCCTCTCTGACCGTTACGTGAGTCACTT TGAGACCGAGGGGCCCCACGTCCTGCTGTATTTTGACTCGGTCCCCACCTCCCGGGAGTGCG TGGGCTTTGAGGCTGTGCAGGAAGTGCCGGTGGGGCTGGTGCAGCCGGCCAGCGCAACCC TGTACGACTACTACAACCCCGAGCGCAGATGTTCTGTGTTTTACGGGGCACCAAGTAAGAGCA GACTCTTGGCCACCTTGTGTTCTGCTGAAGTCTGCCAGTGTGCTGAGGGGAAGTGCCCTCGC CAGCGTCGCGCCCTGGAGCGGGGTCTGCAGGACGAGGATGGCTACAGGATGAAGTTTGCCT GCTACTACCCCCGTGTGGAGTACGGCTTCCAGGTTAAGGTTCTCCGAGAAGACAGCAGAGCT GCTTTCCGCCTCTTTGAGACCAAGATCACCCAAGTCCTGCACTTCACCAAGGATGTCAAGGCC GCTGCTAATCAGATGCGCAACTTCCTGGTTCGAGCCTCCTGCCGCCTTCGCTTGGAACCTGG GAAAGAATATTTGATCATGGGTCTGGATGGGGCCACCTATGACCTCGAGGGACACCCCCAGTA CCTGCTGGACTCGAATAGCTGGATCGAGGAGATGCCCTCTGAACGCCTGTGCCGGAGCACCC GCCAGCGGGCAGCCTGTGCCCAGCTCAACGACTTCCTCCAGGAGTATGGCACTCAGGGGTG CCAGGTGTGAGGGCTGCCCTCCCACCTCCGCTGGGAGGAACCTGAACCTGGGAACCATGAA GCTGGAAGCACTGCTGTGTCCGCTTTCATGAACACAGCCTGGGACCAGGGCATATTAAAGGCT TTTGGCAGCAAAGTGTCAGTGTTGGC

SEQ ID N0:4:

AGAAGGTAGCAGACAGACAGACGGATCTAACCTCTCTTGGATCCTCCAGCCATGAGGCTGCTC TGGGGGCTGATCTGGGCATCCAGCTTCTTCACCTTATCTCTGCAGAAGCCCAGGTTGCTCTTG TTCTCTCCTTCTGTGGTTCATCTGGGGGTCCCCCTATCGGTGGGGGTGCAGCTCCAGGATGT GCCCCGAGGACAGGTAGTGAAAGGATCAGTGTTCCTGAGAAACCCATCTCGTAATAATGTCCC CTGCTCCCCAAAGGTGGACTTCACCCTTAGCTCAGAAAGAGACTTCGCACTCCTCAGTCTCCA GGTGCCCTTGAAAGATGCGAAGAGCTGTGGCCTCCATCAACTCCTCAGAGGCCCTGAGGTCC AGCTGGTGGCCCATTCGCCATGGCTAAAGGACTCTCTGTCCAGAACGACAAACATCCAGGGTA TCAACCTGCTCTTCTCCTCTCGCCGGGGGCACCTCTTTTTGCAGACGGACCAGCCCATTTACA ACCCTGGCCAGCGGGTTCGGTACCGGGTCTTTGCTCTGGATCAGAAGATGCGCCCGAGCACT GACACCATCACAGTCATGGTGGAGAACTCTCACGGCCTCCGCGTGCGGAAGAAGGAGGTGTA CATGCCCTCGTCCATCTTCCAGGATGACTTTGTGATCCCAGACATCTCAGAGCCAGGGACCTG GAAGATCTCAGCCCGATTCTCAGATGGCCTGGAATCCAACAGCAGCACCCAGTTTGAGGTGAA GAAATATGTCCTTCCCAACTTTGAGGTGAAGATCACCCCTGGAAAGCCCTACATCCTGACGGT GCCAGGCCATCTTGATGAAATGCAGTTAGACATCCAGGCCAGGTACATCTATGGGAAGCCAGT GCAGGGGGTGGCATATGTGCGCTTTGGGCTCCTAGATGAGGATGGTAAGAAGACTTTCTTTCG GGGGCTGGAGAGTCAGACCAAGCTGGTGAATGGACAGAGCCACATTTCCCTCTCAAAGGCAG AGTTCCAGGACGCCCTGGAGAAGCTGAATATGGGCATTACTGACCTCCAGGGGCTGCGCCTC TACGTTGCTGCAGCCATCATTGAGTCTCCAGGTGGGGAGATGGAGGAGGCAGAGCTCACATC CTGGTATTTTGTGTCATCTCCCTTCTCCTTGGATCTTAGCAAGACCAAGCGACACCTTGTGCCT GGGGCCCCCTTCCTGCTGCAGGCCTTGGTCCGTGAGATGTCAGGCTCCCCAGCTTCTGGCAT TCCTGTCAAAGTTTCTGCCACGGTGTCTTCTCCTGGGTCTGTTCCTGAAGTCCAGGACATTCA GCAAAACACAGACGGGAGCGGCCAAGTCAGCATTCCAATAATTATCCCTCAGACCATCTCAGA GCTGCAGCTCTCAGTATCTGCAGGCTCCCCACATCCAGCGATAGCCAGGCTCACTGTGGCAG CCCCACCTTCAGGAGGCCCCGGGTTTCTGTCTATTGAGCGGCCGGATTCTCGACCTCCTCGT GTTGGGGACACTCTGAACCTGAACTTGCGAGCCGTGGGCAGTGGGGCCACCTTTTCTCATTA CTACTACATGATCCTATCCCGAGGGCAGATCGTGTTCATGAATCGAGAGCCCAAGAGGACCCT GACCTCGGTCTCGGTGTTTGTGGACCATCACCTGGCACCCTCCTTCTACTTTGTGGCCTTCTA CTACCATGGAGACCACCCAGTGGCCAACTCCCTGCGAGTGGATGTCCAGGCTGGGGCCTGC GAGGGCAAGCTGGAGCTCAGCGTGGACGGTGCCAAGCAGTACCGGAACGGGGAGTCCGTG AAGCTCCACTTAGAAACCGACTCCCTAGCCCTGGTGGCGCTGGGAGCCTTGGACACAGCTCT GTATGCTGCAGGCAGCAAGTCCCACAAGCCCCTCAACATGGGCAAGGTCTTTGAAGCTATGAA CAGCTATGACCTCGGCTGTGGTCCTGGGGGTGGGGACAGTGCCCTTCAGGTGTTCCAGGCA GCGGGCCTGGCCTTTTCTGATGGAGACCAGTGGACCTTATCCAGAAAGAGACTAAGCTGTCC CAAGGAGAAGACAACCCGGAAAAAGAGAAACGTGAACTTCCAAAAGGCGATTAATGAGAAATT GGGTCAGTATGCTTCCCCGACAGCCAAGCGCTGCTGCCAGGATGGGGTGACACGTCTGCCCA TGATGCGTTCCTGCGAGCAGCGGGCAGCCCGCGTGCAGCAGCCGGACTGCCGGGAGCCCT TCCTGTCCTGCTGCCAATTTGCTGAGAGTCTGCGCAAGAAGAGCAGGGACAAGGGCCAGGC GGGCCTCCAACGAGCCCTGGAGATCCTGCAGGAGGAGGACCTGATTGATGAGGATGACATTC CCGTGCGCAGCTTCTTCCCAGAGAACTGGCTCTGGAGAGTGGAAACAGTGGACCGCTTTCAA ATATTGACACTGTGGCTCCCCGACTCTCTGACCACGTGGGAGATCCATGGCCTGAGCCTGTCC AAAACCAAAGGCCTATGTGTGGCCACCCCAGTCCAGCTCCGGGTGTTCCGCGAGTTCCACCT GCACCTCCGCCTGCCCATGTCTGTCCGCCGCTTTGAGCAGCTGGAGCTGCGGCCTGTCCTCT ATAACTACCTGGATAAAAACCTGACTGTGAGCGTCCACGTGTCCCCAGTGGAGGGGCTGTGC CTGGCTGGGGGCGGAGGGCTGGCCCAGCAGGTGCTGGTGCCTGCGGGCTCTGCCCGGCCT GTTGCCTTCTCTGTGGTGCCCACGGCAGCCGCCGCTGTGTCTCTGAAGGTGGTGGCTCGAG GGTCCTTCGAATTCCCTGTGGGAGATGCGGTGTCCAAGGTTCTGCAGATTGAGAAGGAAGGG GCCATCCATAGAGAGGAGCTGGTCTATGAACTCAACCCCTTGGACCACCGAGGCCGGACCTT GGAAATACCTGGCAACTCTGATCCCAATATGATCCCTGATGGGGACTTTAACAGCTACGTCAGG GTTACAGCCTCAGATCCATTGGACACTTTAGGCTCTGAGGGGGCCTTGTCACCAGGAGGCGT GGCCTCCCTCTTGAGGCTTCCTCGAGGCTGTGGGGAGCAAACCATGATCTACTTGGCTCCGA CACTGGCTGCTTCCCGCTACCTGGACAAGACAGAGCAGTGGAGCACACTGCCTCCCGAGAC CAAGGACCACGCCGTGGATCTGATCCAGAAAGGCTACATGCGGATCCAGCAGTTTCGGAAGG CGGATGGTTCCTATGCGGCTTGGTTGTCACGGGACAGCAGCACCTGGCTCACAGCCTTTGTG TTGAAGGTCCTGAGTTTGGCCCAGGAGCAGGTAGGAGGCTCGCCTGAGAAACTGCAGGAGA CATCTAACTGGCTTCTGTCCCAGCAGCAGGCTGACGGCTCGTTCCAGGACCCCTGTCCAGTG TTAGACAGGAGCATGCAGGGGGGTTTGGTGGGCAATGATGAGACTGTGGCACTCACAGCCTT TGTGACCATCGCCCTTCATCATGGGCTGGCCGTCTTCCAGGATGAGGGTGCAGAGCCATTGA AGCAGAGAGTGGAAGCCTCCATCTCAAAGGCAAACTCATTTTTGGGGGAGAAAGCAAGTGCT GGGCTCCTGGGTGCCCACGCAGCTGCCATCACGGCCTATGCCCTGACACTGACCAAGGCGC CTGTGGACCTGCTCGGTGTTGCCCACAACAACCTCATGGCAATGGCCCAGGAGACTGGAGAT AACCTGTACTGGGGCTCAGTCACTGGTTCTCAGAGCAATGCCGTGTCGCCCACCCCGGCTCC TCGCAACCCATCCGACCCCATGCCCCAGGCCCCAGCCCTGTGGATTGAAACCACAGCCTACG CCCTGCTGCACCTCCTGCTTCACGAGGGCAAAGCAGAGATGGCAGACCAGGCTTCGGCCTG GCTCACCCGTCAGGGCAGCTTCCAAGGGGGATTCCGCAGTACCCAAGACACGGTGATTGCCC TGGATGCCCTGTCTGCCTACTGGATTGCCTCCCACACCACTGAGGAGAGGGGTCTCAATGTG ACTCTCAGCTCCACAGGCCGGAATGGGTTCAAGTCCCACGCGCTGCAGCTGAACAACCGCCA GATTCGCGGCCTGGAGGAGGAGCTGCAGTTTTCCTTGGGCAGCAAGATCAATGTGAAGGTGG GAGGAAACAGCAAAGGAACCCTGAAGGTCCTTCGTACCTACAATGTCCTGGACATGAAGAACA CGACCTGCCAGGACCTACAGATAGAAGTGACAGTCAAAGGCCACGTCGAGTACACGATGGAA GCAAACGAGGACTATGAGGACTATGAGTACGATGAGCTTCCAGCCAAGGATGACCCAGATGCC CCTCTGCAGCCCGTGACACCCCTGCAGCTGTTTGAGGGTCGGAGGAACCGCCGCAGGAGGG AGGCGCCCAAGCTGACCTCCCTCTCTGACCGTTACGTGAGTCACTTTGAGACCGAGGGGCCC CACGTCCTGCTGTATTTTGACTCGGTCCCCACCTCCCGGGAGTGCGTGGGCTTTGAGGCTGT GCAGGAAGTGCCGGTGGGGCTGGTGCAGCCGGCCAGCGCAACCCTGTACGACTACTACAAC CCCGAGCGCAGATGTTCTGTGTTTTACGGGGCACCAAGTAAGAGCAGACTCTTGGCCACCTT GTGTTCTGCTGAAGTCTGCCAGTGTGCTGAGGGGAAGTGCCCTCGCCAGCGTCGCGCCCTG GAGCGGGGTCTGCAGGACGAGGATGGCTACAGGATGAAGTTTGCCTGCTACTACCCCCGTGT GGAGTACGGCTTCCAGGTTAAGGTTCTCCGAGAAGACAGCAGAGCTGCTTTCCGCCTCTTTG AGACCAAGATCACCCAAGTCCTGCACTTCACCAAGGATGTCAAGGCCGCTGCTAATCAGATGC GCAACTTCCTGGTTCGAGCCTCCTGCCGCCTTCGCTTGGAACCTGGGAAAGAATATTTGATCA TGGGTCTGGATGGGGCCACCTATGACCTCGAGGGACACCCCCAGTACCTGCTGGACTCGAAT AGCTGGATCGAGGAGATGCCCTCTGAACGCCTGTGCCGGAGCACCCGCCAGCGGGCAGCCT GTGCCCAGCTCAACGACTTCCTCCAGGAGTATGGCACTCAGGGGTGCCAGGTGTGAGGGCT GCCCTCCCACCTCCGCTGGGAGGAACCTGAACCTGGGAACCATGAAGCTGGAAGCACTGCT GTGTCCGCTTTCATGAACACAGCCTGGGACCAGGGCATATTAAAGGCTTTTGGCAGCAAAGTG TCAGTGTTGGC

SEQ ID N0:5: MFSMRIVCLVLSVVGTAWTADSGEGDFLAEGGGVRGPRWERHQSACKDSDWPFCSDEDWNYK CPSGCRMKGLIDEVNQDFTNRINKLKNSLFEYQKNNKDSHSLTTNIMEILRGDFSSANNRDNTYNR VSEDLRSRIEVLKRKVIEKVQHIQLLQKNVRAQLVDMKRLEVDIDIKIRSCRGSCSRALAREVDLKD YEDQQKQLEQVIAKDLLPSRDRQHLPLIKM KPVPDLVPGNFKSQLQKVPPEWKALTDMPQMRMEL ERPGGNEITRGGSTSYGTGSETESPRNPSSAGSWNSGSSGPGSTGNRNPGSSGTGGTATWKP GSSGPGSTGSWNSGSSGTGSTGNQNPGSPRPGSTGTWNPGSSERGSAGHWTSESSVSGSTG QWHSESGSFRPDSPGSGNARPNNPDWGTFEEVSGNVSPGTRREYHTEKLVTSKGDKELRTGKE KVTSGSTTTTRRSCSKTVTKTVIGPDGHKEVTKEVVTSEDGSDCPEAMDLGTLSGIGTLDGFRHR HPDEAAFFDTASTGKTFPGFFSPMLGEFVSETESRGSESGIFTNTKESSSHHPGIAEFPSRGKSSS YSKQFTSSTSYNRGDSTFESKSYKMADEAGSEADHEGTHSTKRGHAKSRPVRDCDDVLQTHPS GTQSGIFNIKLPGSSKIFSVYCDQETSLGGWLLIQQRMDGSLNFNRTWQDYKRGFGSLNDEGEGE FWLGNDYLHLLTQRGSVLRVELEDWAGNEAYAEYHFRVGSEAEGYALQVSSYEGTAGDALIEGSV EEGAEYTSHNNMQFSTFDRDADQWEENCAEVYGGGWWYNNCQAANLNGIYYPGGSYDPRNNS PYEI ENGVVWVSFRGADYSLRAVRM KIRPLVTQ SEQ ID N0:6:

MFSMRIVCLVLSWGTAWTADSGEGDFLAEGGGVRGPRWERHQSACKDSDWPFCSDEDWNYK CPSGCRMKGLIDEVNQDFTNRINKLKNSLFEYQKNNKDSHSLTTNIMEILRGDFSSANNRDNTYNR VSEDLRSRIEVLKRKVIEKVQHIQLLQKNVRAQLVDMKRLEVDIDIKIRSCRGSCSRALAREVDLKD YEDQQKQLEQVIAKDLLPSRDRQHLPLIKM KPVPDLVPGNFKSQLQKVPPEWKALTDMPQMRMEL ERPGGNEITRGGSTSYGTGSETESPRNPSSAGSWNSGSSGPGSTGNRNPGSSGTGGTATWKP GSSGPGSTGSWNSGSSGTGSTGNQNPGSPRPGSTGTWNPGSSERGSAGHWTSESSVSGSTG QWHSESGSFRPDSPGSGNARPNNPDWGTFEEVSGNVSPGTRREYHTEKLVTSKGDKELRTGKE KVTSGSTTTTRRSCSKTVTKTVIGPDGHKEVTKEVVTSEDGSDCPEAMDLGTLSGIGTLDGFRHR HPDEAAFFDTASTGKTFPGFFSPMLGEFVSETESRGSESGIFTNTKESSSHHPGIAEFPSRGKSSS YSKQFTSSTSYNRGDSTFESKSYKMADEAGSEADHEGTHSTKRGHAKSRPVRGIHTSPLGKPSL SP

SEQ ID N0:7:

AGCAATCCTTTCTTTCAGCTGGAGTGCTCCTCAGGAGCCAGCCCCACCCTTAGAAAAGATGTT TTCCATGAGGATCGTCTGCCTGGTCCTAAGTGTGGTGGGCACAGCATGGACTGCAGATAGTG GTGAAGGTGACTTTCTAGCTGAAGGAGGAGGCGTGCGTGGCCCAAGGGTTGTGGAAAGACAT CAATCTGCCTGCAAAGATTCAGACTGGCCCTTCTGCTCTGATGAAGACTGGAACTACAAATGC CCTTCTGGCTGCAGGATGAAAGGGTTGATTGATGAAGTCAATCAAGATTTTACAAACAGAATAA ATAAGCTCAAAAATTCACTATTTGAATATCAGAAGAACAATAAGGATTCTCATTCGTTGACCACTA ATATAATGGAAATTTTGAGAGGCGATTTTTCCTCAGCCAATAACCGTGATAATACCTACAACCGA GTGTCAGAGGATCTGAGAAGCAGAATTGAAGTCCTGAAGCGCAAAGTCATAGAAAAAGTACAG CATATCCAGCTTCTGCAGAAAAATGTTAGAGCTCAGTTGGTTGATATGAAACGACTGGAGGTGG ACATTGATATTAAGATCCGATCTTGTCGAGGGTCATGCAGTAGGGCTTTAGCTCGTGAAGTAGA TCTGAAGGACTATGAAGATCAGCAGAAGCAACTTGAACAGGTCATTGCCAAAGACTTACTTCCC TCTAGAGATAGGCAACACTTACCACTGATAAAAATGAAACCAGTTCCAGACTTGGTTCCCGGAA ATTTTAAGAGCCAGCTTCAGAAGGTACCCCCAGAGTGGAAGGCATTAACAGACATGCCGCAGA TGAGAATGGAGTTAGAGAGACCTGGTGGAAATGAGATTACTCGAGGAGGCTCCACCTCTTATG GAACCGGATCAGAGACGGAAAGCCCCAGGAACCCTAGCAGTGCTGGAAGCTGGAACTCTGG GAGCTCTGGACCTGGAAGTACTGGAAACCGAAACCCTGGGAGCTCTGGGACTGGAGGGACT GCAACCTGGAAACCTGGGAGCTCTGGACCTGGAAGTACTGGAAGCTGGAACTCTGGGAGCT CTGGAACTGGAAGTACTGGAAACCAAAACCCTGGGAGCCCTAGACCTGGTAGTACCGGAACC TGGAATCCTGGCAGCTCTGAACGCGGAAGTGCTGGGCACTGGACCTCTGAGAGCTCTGTATC TGGTAGTACTGGACAATGGCACTCTGAATCTGGAAGTTTTAGGCCAGATAGCCCAGGCTCTGG GAACGCGAGGCCTAACAACCCAGACTGGGGCACATTTGAAGAGGTGTCAGGAAATGTAAGTC CAGGGACAAGGAGAGAGTACCACACAGAAAAACTGGTCACTTCTAAAGGAGATAAAGAGCTCA GGACTGGTAAAGAGAAGGTCACCTCTGGTAGCACAACCACCACGCGTCGTTCATGCTCTAAAA CCGTTACTAAGACTGTTATTGGTCCTGATGGTCACAAAGAAGTTACCAAAGAAGTGGTGACCTC CGAAGATGGTTCTGACTGTCCCGAGGCAATGGATTTAGGCACATTGTCTGGCATAGGTACTCT GGATGGGTTCCGCCATAGGCACCCTGATGAAGCTGCCTTCTTCGACACTGCCTCAACTGGAAA AACATTCCCAGGTTTCTTCTCACCTATGTTAGGAGAGTTTGTCAGTGAGACTGAGTCTAGGGGC TCAGAATCTGGCATCTTCACAAATACAAAGGAATCCAGTTCTCATCACCCTGGGATAGCTGAAT TCCCTTCCCGTGGTAAATCTTCAAGTTACAGCAAACAATTTACTAGTAGCACGAGTTACAACAGA GGAGACTCCACATTTGAAAGCAAGAGCTATAAAATGGCAGATGAGGCCGGAAGTGAAGCCGAT CATGAAGGAACACATAGCACCAAGAGAGGCCATGCTAAATCTCGCCCTGTCAGAGACTGTGAT GATGTCCTCCAAACACATCCTTCAGGTACCCAAAGTGGCATTTTCAATATCAAGCTACCGGGAT CCAGTAAGATTTTTTCTGTTTATTGCGATCAAGAGACCAGTTTGGGAGGATGGCTTTTGATCCA GCAAAGAATGGATGGATCACTGAATTTTAACCGGACCTGGCAAGACTACAAGAGAGGTTTCGG CAGCCTGAATGACGAGGGGGAAGGAGAATTCTGGCTAGGCAATGACTACCTCCACTTACTAAC CCAAAGGGGCTCTGTTCTTAGGGTTGAATTAGAGGACTGGGCTGGGAATGAAGCTTATGCAGA ATATCACTTCCGGGTAGGCTCTGAGGCTGAAGGCTATGCCCTCCAAGTCTCCTCCTATGAAGG CACTGCGGGTGATGCTCTGATTGAGGGTTCCGTAGAGGAAGGGGCAGAGTACACCTCTCACA ACAACATGCAGTTCAGCACCTTTGACAGGGATGCAGACCAGTGGGAAGAGAACTGTGCAGAA GTCTATGGGGGAGGCTGGTGGTATAATAACTGCCAAGCAGCCAATCTCAATGGAATCTACTACC CTGGGGGCTCCTATGACCCAAGGAATAACAGTCCTTATGAGATTGAGAATGGAGTGGTCTGGG TTTCCTTTAGAGGGGCAGATTATTCCCTCAGGGCTGTTCGCATGAAAATTAGGCCCCTTGTGAC CCAATAGGCTGAAGAAGTGGGAATGGGAGCACTCTGTCTTCTTTGCTAGAGAAGTGGAGAGAA AATACAAAAGGTAAAGCAGTTGAGATTCTCTACAACCTAAAAAATTCCTAGGTGCTATTTTCTTAT CCTTTGTACTGTAGCTAAATGTACCTGAGACATATTAGTCTTTGAAAAATAAAGTTATGTAAGGTT TTTTTTATCTTTAAATAGCTCTGTGGGTTTTAACATTTTTATAAAGATATACCAAGGGCCATTCAGT ACATCAGGAAAGTGGCAGACAGAAGCTTCTCTCTGCAACCTTGAAGACTATTGGTTTGAGAAC TTCTCTTCCCATACCACCCAAAATCATAATGCCATTGGAAAGCAAAAAGTTGTTTTATCCATTTGA TTTGAATTGTTTTAAGCCAATATTTTAAGGTAAAACTCACTGAATCTAACCATAGCTGACCTTTGT AGTAGAATTTACAACTTATAATTACAATGCACAATTTATAATTACAATATGTATTTATGTCTTTTGCTA TGGAGCAAATCCAGGAAGGCAAGAGAAACATTCTTTCCTAAATATAAATGAAAATCTATCCTTTA AACTCTTCCACTAGACGTTGTAATGCACACTTATTTTTTTCCCAAGGAGTAACCAATTTCTTTCTA AAACACATTTAAAATTTTAAAACTATTTATGAATATTAAAAAAAGACATAATTCACACATTAATAAAC AATCTCCCAAGTATTGATTTAACTTCATTTTTCTAATAATCATAAACTATATTCTGTGACATGCTAAT TATTATTAAATGTAAGTCGTTAGTTCGAAAGCCTCTCACTAAGTATGATCTATGCTATATTCAAAAT TCAACCCATTTACTTTGGTCAATATTTGATCTAAGTTGCATCTTTAATCCTGGTGGTCTTGCCTTC TGATTTTTAATTTGTATCCTTTTCTATTAAGATATATTTGTCATTTTCTCTTGAATATGTATTAAAATA TCCCAAGC

SEQ ID N0:8: AGCAATCCTTTCTTTCAGCTGGAGTGCTCCTCAGGAGCCAGCCCCACCCTTAGAAAAGATGTT TTCCATGAGGATCGTCTGCCTGGTCCTAAGTGTGGTGGGCACAGCATGGACTGCAGATAGTG GTGAAGGTGACTTTCTAGCTGAAGGAGGAGGCGTGCGTGGCCCAAGGGTTGTGGAAAGACAT CAATCTGCCTGCAAAGATTCAGACTGGCCCTTCTGCTCTGATGAAGACTGGAACTACAAATGC CCTTCTGGCTGCAGGATGAAAGGGTTGATTGATGAAGTCAATCAAGATTTTACAAACAGAATAA ATAAGCTCAAAAATTCACTATTTGAATATCAGAAGAACAATAAGGATTCTCATTCGTTGACCACTA ATATAATGGAAATTTTGAGAGGCGATTTTTCCTCAGCCAATAACCGTGATAATACCTACAACCGA GTGTCAGAGGATCTGAGAAGCAGAATTGAAGTCCTGAAGCGCAAAGTCATAGAAAAAGTACAG CATATCCAGCTTCTGCAGAAAAATGTTAGAGCTCAGTTGGTTGATATGAAACGACTGGAGGTGG ACATTGATATTAAGATCCGATCTTGTCGAGGGTCATGCAGTAGGGCTTTAGCTCGTGAAGTAGA TCTGAAGGACTATGAAGATCAGCAGAAGCAACTTGAACAGGTCATTGCCAAAGACTTACTTCCC TCTAGAGATAGGCAACACTTACCACTGATAAAAATGAAACCAGTTCCAGACTTGGTTCCCGGAA ATTTTAAGAGCCAGCTTCAGAAGGTACCCCCAGAGTGGAAGGCATTAACAGACATGCCGCAGA TGAGAATGGAGTTAGAGAGACCTGGTGGAAATGAGATTACTCGAGGAGGCTCCACCTCTTATG GAACCGGATCAGAGACGGAAAGCCCCAGGAACCCTAGCAGTGCTGGAAGCTGGAACTCTGG GAGCTCTGGACCTGGAAGTACTGGAAACCGAAACCCTGGGAGCTCTGGGACTGGAGGGACT GCAACCTGGAAACCTGGGAGCTCTGGACCTGGAAGTACTGGAAGCTGGAACTCTGGGAGCT CTGGAACTGGAAGTACTGGAAACCAAAACCCTGGGAGCCCTAGACCTGGTAGTACCGGAACC TGGAATCCTGGCAGCTCTGAACGCGGAAGTGCTGGGCACTGGACCTCTGAGAGCTCTGTATC TGGTAGTACTGGACAATGGCACTCTGAATCTGGAAGTTTTAGGCCAGATAGCCCAGGCTCTGG GAACGCGAGGCCTAACAACCCAGACTGGGGCACATTTGAAGAGGTGTCAGGAAATGTAAGTC CAGGGACAAGGAGAGAGTACCACACAGAAAAACTGGTCACTTCTAAAGGAGATAAAGAGCTCA GGACTGGTAAAGAGAAGGTCACCTCTGGTAGCACAACCACCACGCGTCGTTCATGCTCTAAAA CCGTTACTAAGACTGTTATTGGTCCTGATGGTCACAAAGAAGTTACCAAAGAAGTGGTGACCTC CGAAGATGGTTCTGACTGTCCCGAGGCAATGGATTTAGGCACATTGTCTGGCATAGGTACTCT GGATGGGTTCCGCCATAGGCACCCTGATGAAGCTGCCTTCTTCGACACTGCCTCAACTGGAAA AACATTCCCAGGTTTCTTCTCACCTATGTTAGGAGAGTTTGTCAGTGAGACTGAGTCTAGGGGC TCAGAATCTGGCATCTTCACAAATACAAAGGAATCCAGTTCTCATCACCCTGGGATAGCTGAAT TCCCTTCCCGTGGTAAATCTTCAAGTTACAGCAAACAATTTACTAGTAGCACGAGTTACAACAGA GGAGACTCCACATTTGAAAGCAAGAGCTATAAAATGGCAGATGAGGCCGGAAGTGAAGCCGAT CATGAAGGAACACATAGCACCAAGAGAGGCCATGCTAAATCTCGCCCTGTCAGAGGTATCCAC ACTTCTCCTTTGGGGAAGCCTTCCCTGTCCCCCTAGACTAAGTTAAATATTTCTGCACAGTGTT CCCATGGCCCCTTGCATTTCCTTCTTAACTCTCTGTTACACGTCATTGAAACTACACTTTTTTGG TCTGTTTTTGTGCTAGACTGTAAGTTCCTTGGGGGCAGGGCCTTTGTCTGTCTCATCTCTGTAT TCCCAAATGCCTAACAGTACAGAGCCATGACTCAATAAATACATGTTAAATGGATGAATG

SEQ ID N0:9: MKILILGIFLFLCSTPAWAKEKHYYIGIIETTWDYASDHGEKKLISVDTEHSNIYLQNGPDRIGRLYKK ALYLQYTDETFRTTIEKPVWLGFLGPIIKAETGDKVYVHLKNLASRPYTFHSHGITYYKEHEGAIYPD NTTDFQRADDKVYPGEQYTYMLLATEEQSPGEGDGNCVTRIYHSHIDAPKDIASGLIGPLIICKKDS LDKEKEKHIDREFWMFSWDENFSWYLEDNIKTYCSEPEKVDKDNEDFQESNRMYSVNGYTFGS LPGLSMCAEDRVKWYLFGMGNEVDVHAAFFHGQALTNKNYRIDTINLFPATLFDAYMVAQNPGEW MLSCQNLNHLKAGLQAFFQVQECNKSSSKDNIRGKHVRHYYIAAEEIIWNYAPSGIDIFTKENLTAP GSDSAVFFEQGTTRIGGSYKKLVYREYTDASFTNRKERGPEEEHLGILGPVIWAEVGDTIRVTFHN KGAYPLSIEPIGVRFNKNNEGTYYSPNYNPQSRSVPPSASHVAPTETFTYEWTVPKEVGPTNADP VCLAKMYYSAVDPTKDIFTGLIGPMKICKKGSLHANGRQKDVDKEFYLFPTVFDENESLLLEDNIRM FTTAPDQVDKEDEDFQESNKMHSMNGFMYGNQPGLTMCKGDSWWYLFSAGNEADVHGIYFSG NTYLWRGERRDTANLFPQTSLTLHMWPDTEGTFNVECLTTDHYTGGMKQKYTVNQCRRQSEDS TFYLGERTYYIAAVEVEWDYSPQREWEKELHHLQEQNVSNAFLDKGEFYIGSKYKKWYRQYTDS TFRVPVERKAEEEHLGILGPQLHADVGDKVKIIFKNMATRPYSIHAHGVQTESSTVTPTLPGETLTY VWKIPERSGAGTEDSACIPWAYYSTVDQVKDLYSGLIGPLIVCRRPYLKVFNPRRKLEFALLFLVFD ENESWYLDDNIKTYSDHPEKVNKDDEEFIESNKMHAINGRMFGNLQGLTMHVGDEVNWYLMGM GN El DLHTVH FHGHSFQYKH RGVYSSDVFDI FPGTYQTLEM FPRTPGI WLLHCHVTDH I HAGM ETT YTVLQNEDTKSG

SEQ ID NO:10:

ACACCCTAATGCCTCCAACAATAACTGTTGACTTTTTATTTTCAGTCAGAGAAGCCTGGCAACC AAGAACTGTTTTTTTGGTGGTTTACGAGAACTTAACTGAATTGGAAAATATTTGCTTTAATGAAAC AATTTACTCTTGTGCAACACTAAATTGTGTCAATCAAGCAAATAAGGAAGAAAGTCTTATTTATAA AATTGCCTGCTCCTGATTTTACTTCATTTCTTCTCAGGCTCCAAGAAGGGGAAAAAAATGAAGA TTTTGATACTTGGTATTTTTCTGTTTTTATGTAGTACCCCAGCCTGGGCGAAAGAAAAGCATTATT ACATTGGAATTATTGAAACGACTTGGGATTATGCCTCTGACCATGGGGAAAAGAAACTTATTTCT GTTGACACGGAACATTCCAATATCTATCTTCAAAATGGCCCAGATAGAATTGGGAGACTATATAA GAAGGCCCTTTATCTTCAGTACACAGATGAAACCTTTAGGACAACTATAGAAAAACCGGTCTGG CTTGGGTTTTTAGGCCCTATTATCAAAGCTGAAACTGGAGATAAAGTTTATGTACACTTAAAAAA CCTTGCCTCTAGGCCCTACACCTTTCATTCACATGGAATAACTTACTATAAGGAACATGAGGGG GCCATCTACCCTGATAACACCACAGATTTTCAAAGAGCAGATGACAAAGTATATCCAGGAGAGC AGTATACATACATGTTGCTTGCCACTGAAGAACAAAGTCCTGGGGAAGGAGATGGCAATTGTGT GACTAGGATTTACCATTCCCACATTGATGCTCCAAAAGATATTGCCTCAGGACTCATCGGACCT TTAATAATCTGTAAAAAAGATTCTCTAGATAAAGAAAAAGAAAAACATATTGACCGAGAATTTGTG GTGATGTTTTCTGTGGTGGATGAAAATTTCAGCTGGTACCTAGAAGACAACATTAAAACCTACT GCTCAGAACCAGAGAAAGTTGACAAAGACAACGAAGACTTCCAGGAGAGTAACAGAATGTATT CTGTGAATGGATACACTTTTGGAAGTCTCCCAGGACTCTCCATGTGTGCTGAAGACAGAGTAA AATGGTACCTTTTTGGTATGGGTAATGAAGTTGATGTGCACGCAGCTTTCTTTCACGGGCAAGC ACTGACTAACAAGAACTACCGTATTGACACAATCAACCTCTTTCCTGCTACCCTGTTTGATGCTT ATATGGTGGCCCAGAACCCTGGAGAATGGATGCTCAGCTGTCAGAATCTAAACCATCTGAAAG CCGGTTTGCAAGCCTTTTTCCAGGTCCAGGAGTGTAACAAGTCTTCATCAAAGGATAATATCCG TGGGAAGCATGTTAGACACTACTACATTGCCGCTGAGGAAATCATCTGGAACTATGCTCCCTCT GGTATAGACATCTTCACTAAAGAAAACTTAACAGCACCTGGAAGTGACTCAGCGGTGTTTTTTG AACAAGGTACCACAAGAATTGGAGGCTCTTATAAAAAGCTGGTTTATCGTGAGTACACAGATGC CTCCTTCACAAATCGAAAGGAGAGAGGCCCTGAAGAAGAGCATCTTGGCATCCTGGGTCCTG TCATTTGGGCAGAGGTGGGAGACACCATCAGAGTAACCTTCCATAACAAAGGAGCATATCCCC TCAGTATTGAGCCGATTGGGGTGAGATTCAATAAGAACAACGAGGGCACATACTATTCCCCAAA TTACAACCCCCAGAGCAGAAGTGTGCCTCCTTCAGCCTCCCATGTGGCACCCACAGAAACATT CACCTATGAATGGACTGTCCCCAAAGAAGTAGGACCCACTAATGCAGATCCTGTGTGTCTAGCT AAGATGTATTATTCTGCTGTGGATCCCACTAAAGATATATTCACTGGGCTTATTGGGCCAATGAA AATATGCAAGAAAGGAAGTTTACATGCAAATGGGAGACAGAAAGATGTAGACAAGGAATTCTAT TTGTTTCCTACAGTATTTGATGAGAATGAGAGTTTACTCCTGGAAGATAATATTAGAATGTTTACA ACTGCACCTGATCAGGTGGATAAGGAAGATGAAGACTTTCAGGAATCTAATAAAATGCACTCCA TGAATGGATTCATGTATGGGAATCAGCCGGGTCTCACTATGTGCAAAGGAGATTCGGTCGTGT GGTACTTATTCAGCGCCGGAAATGAGGCCGATGTACATGGAATATACTTTTCAGGAAACACATAT CTGTGGAGAGGAGAACGGAGAGACACAGCAAACCTCTTCCCTCAAACAAGTCTTACGCTCCA CATGTGGCCTGACACAGAGGGGACTTTTAATGTTGAATGCCTTACAACTGATCATTACACAGGC GGCATGAAGCAAAAATATACTGTGAACCAATGCAGGCGGCAGTCTGAGGATTCCACCTTCTAC CTGGGAGAGAGGACATACTATATCGCAGCAGTGGAGGTGGAATGGGATTATTCCCCACAAAGG GAGTGGGAAAAGGAGCTGCATCATTTACAAGAGCAGAATGTTTCAAATGCATTTTTAGATAAGG GAGAGTTTTACATAGGCTCAAAGTACAAGAAAGTTGTGTATCGGCAGTATACTGATAGCACATTC CGTGTTCCAGTGGAGAGAAAAGCTGAAGAAGAACATCTGGGAATTCTAGGTCCACAACTTCAT GCAGATGTTGGAGACAAAGTCAAAATTATCTTTAAAAACATGGCCACAAGGCCCTACTCAATAC ATGCCCATGGGGTACAAACAGAGAGTTCTACAGTTACTCCAACATTACCAGGTGAAACTCTCAC TTACGTATGGAAAATCCCAGAAAGATCTGGAGCTGGAACAGAGGATTCTGCTTGTATTCCATGG GCTTATTATTCAACTGTGGATCAAGTTAAGGACCTCTACAGTGGATTAATTGGCCCCCTGATTGT TTGTCGAAGACCTTACTTGAAAGTATTCAATCCCAGAAGGAAACTGGAATTTGCCCTTCTGTTT CTAGTTTTTGATGAGAATGAATCTTGGTACTTAGATGACAACATCAAAACATACTCTGATCACCC CGAGAAAGTAAACAAAGATGATGAGGAATTCATAGAAAGCAATAAAATGCATGCTATTAATGGAA GAATGTTTGGAAACCTACAAGGCCTCACAATGCACGTGGGAGATGAAGTCAACTGGTATCTGA TGGGAATGGGCAATGAAATAGACTTACACACTGTACATTTTCACGGCCATAGCTTCCAATACAA GCACAGGGGAGTTTATAGTTCTGATGTCTTTGACATTTTCCCTGGAACATACCAAACCCTAGAA ATGTTTCCAAGAACACCTGGAATTTGGTTACTCCACTGCCATGTGACCGACCACATTCATGCTG GAATGGAAACCACTTACACCGTTCTACAAAATGAAGACACCAAATCTGGCTGAATGAAATAAATT GGTGATAAGTGGAAAAAAGAGAAAAACCAATGATTCATAACAATGTATGTGAAAGTGTAAAATAG AATGTTACTTTGGAATGACTATAAACATTAAAAGAAGACTGGAAGCATACAACTTTGTACATTTGT GGGGGAAAACTATTAATTTTTTGCAAATGGAAAGATCAACAGACTATATAATGATACATGACTGAC ACTTGTACACTAGGTAATAAAACTGATTCATACAGTCTAATGATATCACCGCTGTTAGGGTTTTAT AAAACTGCATTTAAAAAAAGATCTATGACCAGATATTCTCCTGGGTGCTCCTCAAAGGAACACTA TTAAGGTTCATTGAAATGTTTTCAATCATTGCCTTCCCATTGATCCTTCTAACATGCTGTTGACAT CACACCTAATATTCAGAGGGAATGGGCAAGGTATGAGGGAAGGAAATAAAAAATAAAATAAATAA AATAGAATGACACAAATTTGAGTTTTGTGAACCCCTGAACAGATGGTCTTAAGGACGTTATCTG GAACTGGAGAAAAGCAGAGTTGAGAGACAATTCTATAGATTAAATCCTGGTAAGGACAAACATT GCCATTAGAAGAAAAGCTTCAAAATAGACCTGTGGCAGATGTCACATGAGTAGAATTTCTGCCC AGCCTTAACTGCATTCAGAGGATAATATCAATGAACTAAACTTGAACTAAAAATTTTTTAAACAAA AAGTTATAAATGAAGACACATGGTTGTGAATACAATGATGTATTTCTTTATTTTCACATACACTCTA GCTAAAAGAGCAAGAGTACACATCAACAAAAATGGAAACAAGGCTTTGGCTGAAAAAAACATG CATTTGACAAATCATGTTAATAGCTAGACAAGAAGAAAGTTAGCTTTGTAAACTTCTACTTCATTT GATTCAGAGAAACAGAGCATGAGTTTTCTTAAAAGTAACAAGAAAAGGAACAAAAAAAATGAGG TTTGAAATCTTTTACCATGGCAAAACATTAACATCTTTCTCAAAAACATAGAGAAATCTGGAAAAA TCAAGAAGATAAAATTCTGGACCAGTTAGTGACATTCTTTCAAGCATACTTGTAAAATGTTTCCTT AAAGTGTTCTTGGGATGAAAATGATTGTCATGTCTCCAACAACAGTGAACTGATGTTGTTCCTT GGAATAAAAGTCAATCCCCACCTTAAAAAAAAAAAAAA

SEQ ID N0:11 : MAKLIALTLLGMGLALFRNHQSSYQTRLNALREVQPVELPNCNLVKGIETGSEDLEILPNGLAFISS GLKYPGIKSFNPNSPGKILLMDLNEEDPTVLELGITGSKFDVSSFNPHGISTFTDEDNAMYLLWNH PDAKSTVELFKFQEEEKSLLHLKTIRHKLLPNLNDIVAVGPEHFYGTNDHYFLDPYLQSWEMYLGLA WSYVVYYSPSEVRWAEGFDFANGINISPDGKYVYIAELLAHKIHVYEKHANWTLTPLKSLDFNTLV DNISVDPETGDLWVGCHPNGMKIFFYDSENPPASEVLRIQNILTEEPKVTQVYAENGTVLQGSTVA SVYKGKLLIGTVFHKALYCEL SEQ ID NO:12:

AATCGGCGCTGCCCCAGCAGGGCTGCGGCTGCAGGCAGGCAGAGCCTCCTAGCCCGTCGGT GTCTGCGCCCATCGATCCCTTTGTCTATCCCCGACCATGGCGAAGCTGATTGCGCTCACCCTC TTGGGGATGGGACTGGCACTCTTCAGGAACCACCAGTCTTCTTACCAAACACGACTTAATGCT CTCCGAGAGGTACAACCCGTAGAACTTCCTAACTGTAATTTAGTTAAAGGAATCGAAACTGGCT CTGAAGACTTGGAGATACTGCCTAATGGACTGGCTTTCATTAGCTCTGGATTAAAGTATCCTGG AATAAAGAGCTTCAACCCCAACAGTCCTGGAAAAATACTTCTGATGGACCTGAATGAAGAAGAT CCAACAGTGTTGGAATTGGGGATCACTGGAAGTAAATTTGATGTATCTTCATTTAACCCTCATGG GATTAGCACATTCACAGATGAAGATAATGCCATGTACCTCCTGGTGGTGAACCATCCAGATGCC AAGTCCACAGTGGAGTTGTTTAAATTTCAAGAAGAAGAAAAATCGCTTTTGCATCTAAAAACCAT CAGACATAAACTTCTGCCTAATTTGAATGATATTGTTGCTGTGGGACCTGAGCACTTTTATGGCA CAAATGATCACTATTTTCTTGACCCCTACTTACAATCCTGGGAGATGTATTTGGGTTTAGCGTGG TCGTATGTTGTCTACTATAGTCCAAGTGAAGTTCGAGTGGTGGCAGAAGGATTTGATTTTGCTAA TGGAATCAACATTTCACCCGATGGCAAGTATGTCTATATAGCTGAGTTGCTGGCTCATAAGATTC ATGTGTATGAAAAGCATGCTAATTGGACTTTAACTCCATTGAAGTCCCTTGACTTTAATACCCTC GTGGATAACATATCTGTGGATCCTGAGACAGGAGACCTTTGGGTTGGATGCCATCCCAATGGC ATGAAAATCTTCTTCTATGACTCAGAGAATCCTCCTGCATCAGAGGTGCTTCGAATCCAGAACA TTCTAACAGAAGAACCTAAAGTGACACAGGTTTATGCAGAAAATGGCACAGTGTTGCAAGGCA GTACAGTTGCCTCTGTGTACAAAGGGAAACTGCTGATTGGCACAGTGTTTCACAAAGCTCTTTA CTGTGAGCTCTAACAGACCGATTTGCACCCATGCCATAGAAACTGAGGCCATTATTTCAACCGC TTGCCATATTCCGAGGACCCAGTGTTCTTAGCTGAACAATGAATGCTGACCCTAAATGTGGACA TCATGAAGCATCAAAGCACTGTTTAACTGGGAGTGATATGATGTGTAGGGCTTTTTTTTGAGAAT ACACTATCAAATCAGTCTTGGAATACTTGAAAACCTCATTTACCATAAAAATCCTTCTCACTAAAA TGGATAAATCAGTTATGTCAATTGTCAGATATTAAATAACAGTGTGTGACCCCAAAAGTACTTACC CTAAAACATGTGTTGCCTGGAAGCACATGTGTGTATCGCTGCCTTGCCATGTCTTGTTCAGAAG ACACAGGGGAGCAGGGTTAGCTCACGTGTCTTTAGAACTCCAGTACTCACCCAGGGACTCCA GTTCACAGGCCAGAAAACATATGCATTATGAAGTTCCCCTCTACTCCATGCACATAGTAAGTCTG ACTATGGCAGTCAGACTTACTTACTCCCATTTTCCCTTCGATATATGACTTTTTCTCAGTAAATATT AACCTGAATTATTCCAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la detección de la cantidad de expresión de cualquiera de los genes C4A, FGA, CP y PON1 se realiza mediante: i. un procedimiento de perfil genético, tal como una micromatriz y/o un procedimiento que comprende PCR, tal como una PCR en tiempo real, transferencia Northern y/o

Ni. un procedimiento inmunológico y/o inmunoensayo, ELISA y/o transferencia Western

En otra realización preferida, la detección de los niveles de expresión de los genes se realiza mediante Q-RT-PCR.

El término "inmunoensayo", tal y como se utiliza en la presente descripción se refiere a cualquier técnica analítica que se basa en la reacción de la conjugación de una anticuerpo con un antígeno. Ejemplos de inmunoensayos conocidos en el estado de la técnica son, por ejemplo, pero sin limitarse: inmunoblot, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), inmunoensayo lineal (LIA), radioinmunoensayo (RIA), inmunofluoresecencia, x-map o chips de proteína.

En otra realización preferida, el inmunoensayo es un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas o ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay). El ELISA se basa en la premisa de que un inmunorreactivo (antígeno o anticuerpo) puede ser inmovilizado en un soporte sólido, poniendo luego ese sistema en contacto con una fase fluida que contiene el reactivo complementario que puede unirse a un compuesto marcador. Existen diferentes tipos de ELISA: ELISA directo, ELISA indirecto o ELISA sándwich. El término "compuesto marcador", tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a un compuesto capaz de dar lugar a una señal cromogénica, fluorogénica, radiactiva y/o quimioluminiscente que permita la detección y cuantificación de la cantidad de anticuerpos frente a C4A, FGA, CP y PON El compuesto marcador se selecciona de la lista que comprende radioisótopos, enzimas, fluoroforos o cualquier molécula susceptible de ser conjugada con otra molécula o detectada y/o cuantificada de forma directa. Este compuesto marcador puede unirse al anticuerpo directamente, o a través de otro compuesto. Algunos ejemplos de compuestos marcadores que se unen directamente son, pero sin limitarse, enzimas como la fosfatasa alcalina o la peroxidasa, isótopos radiactivos como 32P o 35S, fluorocromos como fluoresceína o partículas metálicas, para su detección directa mediante colorimetría, auto-radiografía, fluorimetría, o metalografía respectivamente. Un aspecto G de la invención se refiere a un kit o dispositivo que comprende los elementos necesarios para cuantificar la cantidad de expresión de los genes que se seleccionan de entre C4A, CP y PON1, o cualquiera de sus combinaciones.

Aún más preferiblemente, el kit de este aspecto de la invención comprende los anticuerpos que se seleccionan de la lista que consiste en anticuerpos: anti-C4A, anti-CP y anti- PON1 , o cualquiera de sus combinaciones. Preferiblemente, el kit de la invención comprende simultáneamente al menos un anticuerpo de cada tipo: anti-C4A, anti-CP y anti-PON1.

En otra realización preferida, el kit de este aspecto de la invención comprende anticuerpos secundarios o controles positivos y/o negativos. El kit además puede incluir, sin ningún tipo de limitación, tampones, soluciones de extracción de proteínas, agentes para prevenir la contaminación, inhibidores de la degradación de las proteínas, etc.

Por otro lado el kit de este aspecto de la invención puede incluir todos los soportes y recipientes necesarios para su puesta en marcha y optimización. Preferiblemente, el kit comprende además las instrucciones para llevar a cabo los métodos de la invención. En una realización preferida, el kit de este aspecto de la invención comprende la asignación de un valor de diagnóstico y clasificación de los individuos, de manera que: si los individuos presentan un VD > 3,87 ng/mg se clasifican en el grupo de individuos con hepatocarcinoma.

Un aspecto H de la invención se refiere a un kit o dispositivo que comprende los elementos necesarios para cuantificar la cantidad de los productos expresión de los genes que se seleccionan de entre C4A, FGA, CP y PON1 , o cualquiera de sus combinaciones.

Aún más preferiblemente, el kit de este aspecto de la invención comprende anticuerpos o fragmentos de los mismos específicos frente a cualquiera de las secuencias SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 11 o frente a secuencias aminoacídicas que presenten un grado de identidad con dichas secuencias aminoacídicas de al menos del 85%, típicamente de, al menos del 90%, preferiblemente de, al menos del 95%, más preferiblemente de, al menos del 98%, aún más preferiblemente de, al menos del 99%. En otra realización preferida, el kit de este aspecto de la invención comprende anticuerpos secundarios o controles positivos y/o negativos. El kit además puede incluir, sin ningún tipo de limitación, tampones, soluciones de extracción de proteínas, agentes para prevenir la contaminación, inhibidores de la degradación de las proteínas, etc.

Por otro lado el kit puede incluir todos los soportes y recipientes necesarios para su puesta en marcha y optimización. Preferiblemente, el kit comprende además las instrucciones para llevar a cabo los métodos de la invención. En otra realización preferida, el kit de este aspecto de la invención es adecuado para amplificar secuencias nucleótidicas, que comprende sondas y/o cebadores diseñados a partir de las secuencias SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 y/o SEQ ID NO: 12 así como opcionalmente todos aquellos elementos necesarios para llevar a cabo un procedimiento PCR.

En una realización preferida, el kit de este aspecto de la invención comprende la asignación de un valor de diagnóstico y clasificación de los individuos, de manera que: si los individuos presentan un VD > 95, preferiblemente un VD > 105, más preferiblemente un VD > 116, y aún más preferiblemente un VD > 120se clasifican en el grupo de individuos con hepatocarcinoma. Un aspecto I de la invención se refiere a un soporte sólido, o chip de proteínas, que comprende al menos uno de los anticuerpos o fragmentos de los mismos específicos frente a cualquiera de las secuencias SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 11 o frente a secuencias aminoacídicas que presenten un grado de identidad con dichas secuencias aminoacídicas de al menos del 85%, típicamente de, al menos del 90%, preferiblemente de, al menos del 95%, más preferiblemente de, al menos del 98%, aún más preferiblemente de, al menos del 99%, o cualquiera de sus combinaciones o cualquiera de sus combinaciones, para llevar a cabo el cualquiera de los métodos de la invención.

Un aspecto J de la invención se refiere a un soporte sólido, o chip de ADN, que comprende oligonucleótidos o microarreglos de canal único diseñados a partir de una secuencia conocida o un ARNm de al menos uno de los genes C4A, FGA, CP y PON1. Preferiblemente, comprende los oligonucleótidos capaces de detectar el ARNm de todos los genes C4A, FGA, CP y PON

Así, por ejemplo, las secuencias de oligonucleótidos son construidas en la superficie del chip mediante el elongamiento secuencial de una cadena en crecimiento con un sólo nucleótido utilizando fotolitografía. Así, los oligonucleótidos son anclados por el extremo 3' mediante un método de activación selectiva de nucleótidos, protegidos por un reactivo fotolábil, mediante la incidencia selectiva de luz a través de una fotomáscara. La fotomáscara puede ser física o virtual.

Así, las sondas oligonucleótidos pueden ser de entre 10 y 100 nucleótidos, más preferiblemente, de entre 20 y 70 nucleótidos, y aún más preferiblemente, de entre 24 y 30 nucleótidos. Para la cuantificación de la expresión génica, preferiblemente se emplean aproximadamente unos 40 oligonucleótidos por gen.

Preferiblemente, los oligonucleótidos presentan modificaciones en alguno de sus nucleótidos, como por ejemplo, pero sin limitarnos, nucleótidos que tengan alguno de sus átomos con un isótopo radiactivo, normalmente 32P o tritio, nucleótidos marcados inmunológicamente, como por ejemplo con una molécula de digoxigenina, y/o inmovilizadas en una membrana. Varias posibilidades son conocidas en el estado de la técnica.

La síntesis in situ sobre un soporte sólido (por ejemplo, vidrio), podría hacerse mediante tecnología chorro de tinta (ink-jet), lo que requiere sondas más largas. Los soportes podrían ser, pero sin limitarse, filtros o membranas de NC o nylon (cargadas), silicio, o portas de vidrio para microscopios cubiertos con aminosilanos, polilisina, aldehidos o epoxy. La sonda es cada una de las muestras del chip. El target es la muestra a analizar: ARN mensajero, ARN total, un fragmento de PCR, etc.

En otra realización preferida de este aspecto de la invención comprende oligonucleótidos o microarreglos de canal único diseñados a partir de al menos una secuencia conocida o un ARNm comprendido cualquiera de las sondas de la invención.

Un aspecto K de la invención se refiere al uso de cualquiera de los kits o dispositivos de la presente invención, en la obtención de datos útiles para el diagnóstico del hepatocarcinoma en un individuo con hepatitis C, preferiblemente alcohólico. Un aspecto L de la invención se refiere a un medio de almacenamiento legible por un ordenador que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos de cualquiera de los métodos de la invención.

Otro aspecto de la invención se refiere a una señal transmisible que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos de cualquiera de los métodos de la invención.

Los términos "polinucleótido" y "ácido nucleico" se usan aquí de manera intercambiable, refiriéndose a formas poliméricas de nucleótidos de cualquier longitud, tanto ribonucleótidos (ARN) como desoxirribonucleótidos (ADN).

Los términos "secuencia aminoacídica", "péptido", "oligopéptido", "polipéptido" y "proteína" se usan aquí de manera intercambiable, y se refieren a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, que pueden ser codificantes o no codificantes, química o bioquímicamente modificados.

Una secuencia de ácido nucleico o polinucleótido puede comprender las cinco bases que aparecen biológicamente (adenina, guanina, timina, citosina y uracilo) y/o bases distintas de las cinco que aparecen biológicamente. Estas bases pueden servir para distintos propósitos, por ejemplo, para estabilizar o desestabilizar la hibridación; para estimular o inhibir la degradación de la sonda; o como puntos de unión para restos detectables o restos de apantallamiento. Por ejemplo, un polinucleótido de la invención puede contener uno o más restos de base modificados, no estándar, derivatizados, incluyendo, pero sin limitarse a, N6-metil-adenina, N6-terc-butil-bencil- adenina, imidazol, imidazoles sustituidos, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5- yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroximetil) uracilo, 5- carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo,beta-D- galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1- metilguanina, 1-metilinosina, 2,2- dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-metiladenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D- manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético, wybutoxosina, pesudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo (es decir, timina), éster metílico del ácido uracil- 5-oxiacético, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil) uracilo, (acp3)w, 2,6-diaminopurina, y 5-propinil pirimidina. Otros ejemplos de restos de bases modificados, no estándar, o derivatizados pueden encontrarse en las Patentes de EEUU Nos. 6.001.611 ; 5.955.589; 5.844.106; 5.789.562; 5.750.343; 5.728.525; y 5.679.785. Además, una secuencia de ácido nucleico o polinucleótido puede comprender uno o más restos de azúcares modificados incluyendo, pero sin limitarse a, arabinosa, 2-fluoroarabinosa, xilulosa, y una hexosa.

El término "identidad", tal y como se utiliza en esta memoria, hace referencia a la proporción de nucleótidos o aminoácidos idénticos entre dos secuencias nucleotídicas o aminoacídicas que se comparan. Los métodos de comparación de secuencias son conocidos en el estado de la técnica, e incluyen, aunque sin limitarse a ellos, el programa GAG, incluyendo GAP (Devereux et al., Nucleic Acids Research 12: 287 (1984) Genetics Computer Group University of Wisconsin, Madison, (Wl); BLAST, BLASTP o BLASTN, y FASTA (Altschul et al., 1999. J. Mol. Biol. 215: 403- 410.

En la presente invención se entiende por variante o fragmento biológicamente activo, aquellas variantes o fragmentos de los péptidos indicados que tienen un efecto fisiológico, metabólico o inmunológico igual, o presentan la misma utilidad que los descritos. Esto es, son funcionalmente equivalentes. Dichos efectos se pueden determinar mediante métodos convencionales.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención.

EJEMPLOS DE LA INVENCIÓN

Ejemplo 1. Análisis de la utilidad de las proteínas identificadas CNP, CP, C4A, y PON1 como biomarcadores candidatos para el desarrollo de HCC en pacientes.

Material y métodos Todos los pacientes incluidos en el estudio se trataron en el Hospital Universitario Reina Sofía de Córdoba, España. Cada paciente dio su consentimiento y el estudio se aprobó por el comité de ética local. Todos los pacientes mostraron fibrosis F4, determinada por biopsias del hígado o por elastometría transitoria (Fibroscan). El diagnóstico de HCC se confirmó por técnicas de imagen (tomografía axial computarizada o resonancia magnética) en base a criterios no invasivos (guías de práctica clínica EASL-EORTC. 2012. J.Hepatol. 56(4), 908-943).

Las muestras de sangre se recogieron antes de la cirugía en tubos estériles con anticoagulante K3-EDTA (9 mi K3E VACUETTE®, Greiner Bio-One, Austria), y se separé el plasma por centrifugación a 2900 g durante 5 min a 4 °C. Las alícuotas de plasma (500 μΙ) se tomaron y almacenaron a - 80 °C hasta su análisis.

En todos los 52 pacientes con ingesta abusiva de alcohol (definida como el consumo regular diario de etanol superior a 40 g) y VHC se incluyeron: 25 casos con HCC (grupo con tumor) 27 controles sin HCC (grupo control). Se seleccionaron al azar 3 pacientes de cada grupo para el análisis DIGE y los pacientes restantes sirvieron como cohorte de validación (mediante Western Blot y ELISA). Las características clínicas se resumen en las tablas 1 y 2.

Tabla 1. Información clínica de los pacientes incluidos en el análisis DIGE

AFP, alfa-fetoproteína; TACE, quimioembolización transarterial

Tabla 2. Información clínica de los pacientes incluidos en el análisis DIGE

Grupos de pacientes

Tumor (n=22) Sin tumor (n=24)

Media de edad 62,5 ± 1 1 ,7 50,0 ± 12,7

Género (masculino/femenino) 21/1 24/0 Clase Child-Pugh

A 9 4

B 5 6

C 4 10

n/a 4 4

AFP (ng/ml) 205,9 ± 416,1 4,5 ± 2,7

n/a 8 8

Eliminación de proteínas de alta abundancia de muestras de plasma

Las muestras de plasma se procesaron utilizando el kit de enriquecimiento proteico ProteoMinerTM (BioRad, Hercules, California, EE.UU.), que elimina las proteínas de alta abundancia y hace posible la detección de proteínas de mediana y bajo de abundancia. Este método utiliza una biblioteca combinada de hexapétidos unidos a perlas y construcciones de proteínas hasta alcanzar la saturación. Las muestras se procesaron de acuerdo a las recomendaciones del fabricante, utilizando una cantidad inicial de proteína de 10 mg en un volumen de 200 mi. Posteriormente, las muestras se limpiaron antes del mareaje utilizando un kit de 2-D Clean-Up (GE Healthcare, Piscataway, EE.UU.). Los pellets de proteínas se resuspendieron en tampón de lisis enfriado con hielo (30 mM de Tris, 2 M tiourea, 7 M urea, 4% w/v de CHAPS) y se ajustó el pH entre 8.5-9 con 0,5 M de NaOH. La cuantificacion de proteínas se realizó utilizando el kit de 2-D Quant (GE Healthcare). Etiquetado DIGE

Las muestras se marcaron con CyDye DIGE Fluors siguiendo las recomendaciones del fabricante (GE Healthcare). Muestras de 50 μg de proteína de plasma preparado anteriormente se marcó con 400 pmol de cualquiera de Cy3 o Cy5 para la comparación en el mismo gel 2-D. Las muestras de grupos de control y tumorales se marcaron alternativamente con Cy3 y Cy5. Las reacciones de etiquetado se realizaron en hielo y oscuridad durante 30 min y después se inactivo con un exceso molar de 50 veces lisina libre durante 10 min en hielo. También se preparó un conjunto de muestras, que se marcaron con Cy2 para ser utilizadas como estándar en todos los geles de coincidencia de imagen y en el análisis estadístico transversal. Las reacciones de etiquetado Cy3 y Cy5 (50 μg de cada uno) de cada lisado y una cantidad igual (50 μg) de Cy2 estándar, se mezclaron y se compusieron en el mismo gel 2-D.

Separación de proteínas por 2-D y gel de imágenes Tiras de 24 cm de un gradiente de pH inmovilizado (IPG; pH 3-10) se rehidrataron durante la noche en 450 μΙ de tampón de rehidratación (2 M Tiourea, 7 M Urea, 2% CHAPS, 0,2% DTT, Y 1 % de IPG Buffer 3-10 NL-GE Healthcare). El enfoque isoeléctrico se realizó usando un dispositivo IPGphor ( GE Healthcare ) y siguiendo los siguientes pasos : 2 h a 150 V , 3 h a 300 V , 3 h a 600 V (gradiente), 3 h a 1000 V (gradiente) , 3 h a 8000 V (gradiente) , y 4 horas a 8000 V, las tiras se equilibraron durante 15 min en Tris 50 mM , urea 6 M , 2 % de SDS , 30 % de glicerol , que contiene 1 % de DTT , y luego durante 15 min en la mismo tampón que contiene 2,5 % yodoacetamida .

Las tiras IPD equilibradas se transfirieron a geles de poliacrilamida 12% de 18x20 cm entre placas de vidrio de baja fluorescencia, y después se cubrieron con 0,5% de agarosa con bajo punto de fusión en tampón que contiene azul de bromofenol. Los geles se procesaron utilizando el dispositivo Ettan Dalt 6 (GE Healthcare) a 4W/gel durante 45 min, y posteriomente a 15W/gel y 10 °C hasta que el frente de colorante se había escapado de la parte inferior de los geles. Los canales de cada gel Cy2, Cy3 y Cy5 se fotografiaron con un Typhoon 9400 Variable Mode Imager (GE Healthcare). Las estadísticas y la cuantificación de la expresión de proteínas para la selección de punto se realizaron con el software DeCyder (GE Healthcare).

Digestión de manchas y análisis MS

La digestión de manchas y el análisis MALDI-TOF se realizaron en las instalaciones de proteómica UCO-SCAI (Córdoba, España) miembro de la Plataforma en red de proteómica Carlos III, ProteoRed-ISCII. Las manchas de proteínas seleccionadas se recogieron automáticamente a partir del gele en una estación de investigador ProPic (Digilab Genómica Solutions Ltd., Hutingdon, Reino Unido). Los fragmentos resultantes del gel con tripsina y se depositaron automáticamente en la placa de MALDI en una estación II PropPrep (Digilab). Las muestras se analizaron por MALDI-TOF/TOF MS con el fin de obtener el MS en el 4800 Proteomics Analyzer Spectrometer (Applied Biosystems Inc., California, U.S. A. La identificación de proteínas se realizó por combinación de los espectros de MS y su MS/MS con la base de datos NCBInr, usando MASCOT (MatrixScience) como motor de búsqueda. Los pasos y las condiciones se resumen en Ferrín et al., 2013 {Liver Int. Jul 22).

Análisis de Western blot 10 μg de proteínas de las muestras de plasma se separaron en geles de poliacrilamida al 12% y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Pall Life Sciences, Nueva York, EE.UU.). Estas membranas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente en Tris solución salina tamponada con Tween-20 (TTBS; 1 M de Tris-HCI, pH 7,6, NaCI 5 M, 0,1 % de Tween 20) que contenía 5% de leche desnatada. Los anticuerpos primarios utilizados fueron anti- carboxipeptidasa N de la subunidad catalítica (dilución 1 :200; sc-18966), anti-paraoxonasa 1 (dilución 1 :200; SC-133919) y anti-ceruloplasmina (dilución 1 :200; SC-365205), todos ellos de Santa Cruz Biotechnology, California, Estados Unidos. Los blots fueron incubados con anticuerpos primarios diluidos en TTBS que contenía 1 % de leche desnatada, durante la noche a 4 °C. Después del lavado con TTBS, los blots se incubaron con el anticuerpo secundario de cabra IgG- HRP (dilución 1 :25000, Santa Cruz Biotechnology) durante 1 hora a temperatura ambiente. La inmunodetección se realizó utilizando el ECL Advance (GE Healthcare) y el LAS-3000 Imager instrumento (Fujifilm).

Prueba ELISA

Se utilizaron las pruebas de ELISA para cuantificar la concentración de proteínas de las proteínas del PCN, CP, C4A y PON 1 en las muestras de plasma de los grupos control (24 casos) y de tumores (22 casos). Los ensayos se realizaron siguiendo las instrucciones del fabricante (USCN Life Science Inc., Wuhan, China), y los datos obtenidos se utilizaron para evaluar la sensibilidad y especificidad de los biomarcadores en el diagnóstico de CHC en pacientes alcohólicos infectados por el VHC con cirrosis. Análisis estadístico

Las variables se muestran en las tablas de frecuencia o expresadas como medias y desviaciones estándar, o como mediana y rango intercuartil (IQR) para aquellas con distribución asimétrica. La prueba de Chi-cuadrado se utilizó para las frecuencias, las pruebas de T de Student o ANOVA para las variables cuantitativas, y la U de Mann-Whitney o Kruskal-Wallis para distribuciones asimétricas. El valor de umbral óptimo de biomarcadores candidatos para la identificación de los pacientes con HCC se estableció por curvas de receptor característico de funcionamiento (ROC) que eligen el umbral más bajo posible con el mayor valor predictivo negativo. La regresión logística múltiple se utilizó para explorar si una combinación de múltiples biomarcadores mejoraría la exactitud predictiva. El valor de p menor de 0,05 se consideró estadísticamente significativo. Resultados

Análisis e identificación de proteínas diferencialmente expresadas.

Después del análisis 2-D DIGE, entre las manchas de proteínas coincidentes, 19 puntos se regularon diferencialmente en el grupo de HCC de una manera estadísticamente significativa. Fuera de los 19 puntos expresados diferencialmente detectado por análisis DIGE, 7 proteínas diferentes se identificaron por MALDI-TOF/TOF MS como carboxipeptidasa-N (CPN), ceruloplasmina (CP), componente del complemento 4A (C4A), fibrinógeno alfa (FBG-a), inmunoglobulina (Ig) región de la cadena mu C (IGHM), albúmina de suero (ALB), y suero paraoxonasa/arilesterasa 1 (PON1). Los puntos expresados diferencialmente y el cambio de expresión en HCC en comparación con las muestras de control se muestran en la figura 1 y la tabla 3.

Tabla 3. Proteínas identificadas diferencialmente expresadas en muestras de plasma de pacientes alcohólicos infectados por el VHC con HCC. * La significación estadística se determinó por f-test, donde los valores de p fueron≤ 0,05.

Confirmación de DIGE-resultados por Western-blot

Con el fin de verificar los resultados DIGE/MS, las muestras de control/tumorales utilizadas previamente se analizaron por Western-blot (figura 2). Se confirmó el cambio relativo del nivel plasmático de expresión de las proteínas identificadas CPN, CP, y PON1.

Validación de las proteínas identificadas como biomarcadores candidatos de desarrollo de HCC. Para evaluar la utilidad de las proteínas identificadas CPN, CP, C4A, y PON 1 como biomarcadores candidatos para el desarrollo de HCC en pacientes infectados por el VHC alcohólicos, se analizaron 46 muestras de plasma (24 del grupo control y 22 del grupo de tumores) por ELISA (Figura 3). A diferencia del análisis DIGE, las concentraciones plasmáticas de las proteínas identificadas CPN, CP, C4A, y PON1 no se expresaron diferencialmente entre el grupo control y con tumor. Por el contrario, la validación por ELISA confirmó la expresión diferencial de C4A en pacientes con HCC (2,4 ± 1 ng/mg de proteína de plasma) comparados con pacientes sin HCC(1 ,8 ± 0,6 ng/mg; p = 0,029). Aunque existieron concentraciones más altas de CP en los pacientes de HCC (21 ,8 μg/mg [IQR 14-27]) que en los controles (16, 1 μg/mg [IQR 11-24]), estas diferencias no fueron marginalmente significativas (p = 0,071). La concentración en suero de PON-1 fue de 8,3 μg/mg [IQR 6-13] en pacientes con HCC y 1 1 ,5 μg/mg [IQR 7-13] en los controles (p = 0,31). La concentración sérica de PCN fue similar en pacientes con HCC en comparación con los controles sin HCC (45,5 ± 16,5 ng/mg frente a 44,9 ± 20, 1 ng/mg, p = 0,91). En la regresión logística multivariante C4A se comportó como el único factor independiente predictivo de HCC con un OR = 2,44 (IC del 95%: 1 ,01-5,09; p = 0,049). Sin embargo, la capacidad de predicción mejoró con la combinación de C4A, CP y PON1 a través de la siguiente fórmula (I): (C4A*CP)/PON1.

C4A, CP y PON1 tal y como se usan en la fórmula arriba se refiere a los niveles de expresión en suero del paciente de cada uno de los productos de expresión de cada uno de dichos genes. El área bajo la curva ROC de esta combinación, según la fórmula (I), para identificar a los pacientes con HCC fue de 0,75. Este valor fue más alto que el área bajo la curva ROC de C4A sola (figura 3). Con un umbral de 3,87 para la combinación de C4A, ceruloplasmina y PON 1 tuvo una sensibilidad del 72% y una especificidad del 71 %.

La concentración sérica de C4A, fue significativamente superior en los pacientes con HCC multinodular (3,05 ± 1 , 17 ng / mi) en comparación con los pacientes con HCC uninodular (1 ,75 ± 0,74 ng / mi) (p = 0,004).

Los datos estadísticos mostraron que el mejor punto de corte de la concentración de C4A para discriminar entre HCC uninodular y multinodular fue de 2,07 ng/mg de proteína plasmática, con una sensibilidad del 91 %, y una especificidad del 88%. Este resultado quiere decir que un paciente con un nivel de C4A superior a 2,07 ng/mg hace altamente probable la existencia en el paciente de un HCC multinodular.

Los biomarcadores restantes, incluyendo la combinación de C4A, PC y PON 1 a través de la fórmula propuesta, no estaban relacionados con el número de nodulos de HCC. Ninguno de ellos (C4a incluido) estuvo correlacionado con el tamaño los de nodulos. La presencia de un mayor número de nodulos de HCC se relaciona con un estadio más avanzado del HCC. Por tanto, una mayor concentración de C4A en plasma de pacientes con HCC se asocia con un estadio tumoral más avanzado relacionado con el HCV y el alcohol, y por consiguiente, con un peor pronóstico y opciones de tratamiento más restringidas.

Ejemplo 2. Análisis de la utilidad de las proteínas identificadas CPN, CP, C4A, FGA, IgM y PON1 como biomarcadores candidatos para el desarrollo de HCC en pacientes

Materiales y métodos

A partir de una base de datos de pacientes con enfermedad hepática en fase terminal, recogida en el Hospital Reina Sofía Universidad de Córdoba (España) de forma prospectiva desde 2005-2013, se seleccionaron 52 pacientes con ingesta abusiva de alcohol (definido como consumo de etanol diario regular superior a 40 g) e infección por VHC. Entre los pacientes, 25 tenían HCC (grupo con tumor) y 27 estaban libres de HCC (grupo control). Se seleccionaron al azar 3 pacientes de cada grupo emparejados por edad, sexo y clasificación Child-pugh para el análisis DIGE y los pacientes restantes sirvieron como cohorte de validación (mediante Western Blot y ELISA). No existieron criterios de exclusión para el presente estudio. Se incluyeron pacientes con diferentes características del tumor con el fin de identificar biomarcadores de HCC independientemente de la progresión del tumor.

Todos los pacientes mostraron fibrosis F4, ya sea por biopsia del hígado o elastometría transitoria (Fibroscan). El diagnóstico de HCC se confirmó por técnicas de imagen (tomografía axial computarizada o resonancia magnética) sobre la base de criterios no invasivos (guías de práctica clínica EASL-EORTC; EASL-EORTC clinical practice guidelines (2012): management of hepatocellular carcinoma. J. Hepatol. 56: 908-943). Las características básales de los pacientes incluidos se muestran en la Tabla 4. Tabla 4. Información clínica de los pacientes incluidos en los análisis DIGE y ELISA. Los datos se expresan como la media ± desviación estándar; Los valores-p del análisis univariante están incluidos en la corte de validación

Análisis DIGE Validación ELISA

GRUPO GRUPO GRUPO GRUPO

HCC CONTROL HCC CONTROL

VARIABLE (n=3) (n=3) (n=22) (n=24) P

Edad 48,3 ± 3,5 44,7 ± 4,0 62,5 ± 1 1 ,7 50,0 ± 12,7 0,001 Género; n (%)

Masculino 3 (100%) 3 (100%) 21 (95,5%) 24 (100%) 0,47

Femenino 0 (0%) 0 (0%) 1 (4,5%) 0 (0%)

Child-Pugh; n (%)

A 1 (33,3%) 1 (33,3%) 13 (59,1 %) 5 (20,8%) 0,008

B-C 2 (66,7%) 2 (66,7%) 9 (40,9%) 19 (79,2%)

MELD 12,3 ± 3,2 15,3 ± 4,0 12,3 ± 5,8 15,5 ± 5,9 0,072

AFP* (ng/ml) 17,0 ± 15,6 4,4 ± 3,8 32,9 (IQR 4,8 (IQR 0,050

5,3-258,6) 2, 1-8,4)

Números de 1 ,3 ± 0,6 1 ,77 ± 1

nodulos de HCC

Números de nodulos de HCC

Uninodular 2 (66,7%) - 1 1 (50%) - -

Multinodular 1 (33,3%) - 1 1 (50%) - -

Diámetro del nodulo 31 ,2 ± 14,7 37,7 ± 20

principal (mm)

Las muestras de sangre se recogieron de acuerdo con nuestro protocolo en tubos estériles con anticoagulante K3-EDTA (9 mi K3E VACUETTE®, Greiner Bio-One, Austria) y el plasma se separó mediante centrifugación a 2900 g durante 5 min a 4 °C. Las muestras de plasma se tomaron y se almacenaron inmediatamente a -80 °C hasta su análisis. Las muestras se transfirieron al Biobanco del Sistema Sanitario Público de Andalucía (BBSSPA) desde el Hospital Universitario Reina Sofía. Se obtuvo un consentimiento informado de cada paciente participante en el estudio y los procedimientos estuvieron supervisados por el comité de ética del Hospital Universitario Reina Sofía. Eliminación de proteínas de alta abundancia de muestras de plasma

Las muestras de plasma se procesaron utilizando el kit de enriquecimiento proteico ProteoMiner™ (BioRad, Hercules, California, EE.UU.), que elimina las proteínas de alta abundancia y hace posible la detección de proteínas de mediana y baja abundancia. Las muestras se procesaron de acuerdo a las recomendaciones del fabricante, utilizando una cantidad inicial de proteína de 10 mg en un volumen de 200 μΙ. Posteriormente, las muestras se limpiaron antes del mareaje utilizando un kit de 2-D Clean-Up (GE Healthcare, Piscataway, EE.UU.)- Los pellets de proteínas se resuspendieron en tampón de lisis enfriado con hielo (30 mM de Tris, 2 M tiourea, 7 M urea, 4% w/v de CHAPS) y se ajustó el pH entre 8.5-9 con 0,5 M de NaOH. La cuantificacion de proteínas se realizó utilizando el kit de 2-D Quant (GE Healthcare).

Etiquetado DIGE, Separación de proteínas por 2-D y gel de imágenes

Las muestras se marcaron con CyDye DIGE Fluors (GE Healthcare). 50 μg de proteína de plasma de cada una de las muestras del grupo control y tumor se marcaron con Cy3 o Cy5 para su comparación en el mismo gel 2-D. También se preparó una mezcla del conjunto de muestras totales incluidas en el estudio, que se marcó con Cy2 para ser utilizada como estándar en todos los geles y servir como imagen de coincidencia y en el análisis estadístico transversal. Las reacciones de mareaje con Cy3 y Cy5 (50 μg de cada uno) de cada lisado y una cantidad igual (50 μg) de Cy2 estándar, se mezclaron y se cargaron en el mismo gel 2-D. Las condiciones del protocolo de isoelectroenfoque y electroforesis en 2-D se resumen en Ferrín et al., 2013. Liver International, doi: 10. 1111/liv. 12277. Los canales de cada gel Cy2, Cy3 y Cy5 se fotografiaron con un Typhoon 9400 Variable Mode Imager (GE Healthcare). La estadística y la cuantificacion de la expresión de proteínas para la selección se realizó con el software DeCyder (GE Healthcare).

Digestión de proteínas y análisis MS La digestión de proteínas y el análisis MALDI-TOF se realizaron en las instalaciones de proteómica UCO-SCAI (Córdoba, España) miembro de la Plataforma en red de proteómica Carlos III, ProteoRed-ISCII. Las manchas de proteínas seleccionadas se recogieron automáticamente a partir del gel y los fragmentos resultantes del gel fueron digeridos con tripsina y analizados por MALDI-TOF/TOF MS. La identificación de proteínas se realizó por combinación de los espectros de MS y su MS/MS con la base de datos NCBInr, usando MASCOT (MatrixScience) como motor de búsqueda. Los pasos y las condiciones se resumen en Ferrín et al., 2013. Liver International, doi: 10.1111/liv. 12277.

Análisis de Western blot

El análisis Western Blot sólo se realizó como un control de resultados DIGE e identificación MS. Se seleccionaron las proteínas expresadas diferencialmente carboxipeptidasa N (CPN), paraoxonasa 1 (PON1) y ceruloplasmina (CP). 10 μg de proteína de las muestras de plasma procesadas fueron separadas en un gel del 12% de SDS-PAGE, se transfirieron a membranas nitrocelulosa (Pall Life Sciences, NuevaYork.EE.UU.) y se incubaron con una dilución 1 :200 de anticuerpos primarios contra CPN (anticuerpo policlonal de cabra; sc-18966), PON 1 (conejo anticuerpo policlonal; sc-133919) y CP (anticuerpo monoclonal de ratón; sc-365205) (Santa Cruz Biotechnology, California, U.S. A.). La inmunodetección se visualizó por quimioluminiscencia, usando ECL Avance (GE Healthcare) y el instrumento Imager LAS-3000 (Fujifilm). Ensayo ELISA

Las pruebas de ELISA se utilizaron para cuantificar la concentración de las proteínas CPN, CP, C4A, FGA, PON 1 (USCN Life Science Inc., Wuhan, China) e inmunoglobulina M (IgM) (Abcam, Cambrige, UK) en las muestras de plasma de los grupos control (24 casos) y de tumores (22 casos). Los ensayos se realizaron siguiendo las instrucciones del fabricante, y los datos obtenidos se utilizaron para evaluar la sensibilidad y especificidad de los biomarcadores en el diagnóstico de HCC en pacientes alcohólicos infectados por el VHC con cirrosis.

Análisis estadístico

Las variables se muestran en las tablas de frecuencia o expresadas como medias y desviaciones estándar, o como mediana y rango intercuartil (IQR) para aquellas con distribución asimétrica. La prueba de Chi-cuadrado se utilizó para las frecuencias, las pruebas de T de Student o ANOVA para las variables cuantitativas, y la U de Mann-Whitney o Kruskal-Wallis para distribuciones asimétricas. El valor de umbral óptimo de biomarcadores candidatos para la identificación de los pacientes con HCC se estableció por curvas de receptor característico de funcionamiento (ROC) que eligen el umbral más bajo posible con el mayor valor predictivo negativo. La regresión logística múltiple se utilizó para explorar si una combinación de múltiples biomarcadores mejoraría la exactitud predictiva. El valor de p menor de 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Resultados

De los 52 pacientes incluidos, 3 pacientes con HCC y 3 pacientes sin HCC se seleccionaron al azar para el análisis DIGE. Las características de estos pacientes se describen en la tabla 1 (izquierda). El resto de pacientes sirvieron como cohorte validación incluyendo 22 de pacientes del grupo HCC, y 24 pacientes del grupo control (tabla 1 derecha). La cohorte de validación de los pacientes con HCC fue mayor y mostró mejor función hepática que los pacientes sin HCC. Así, 13 de los 22 pacientes con HCC (59,1 %), y sólo 5 de los 24 pacientes del grupo control (20,8%) fueron Child A (p=0,008). La puntuación MELD se redujo ligeramente en pacientes con HCC (12,3 ± 5,8 vs 15,5 ± 5,9; p=0,072). La media de edad de los paciente con HCC fue de 62,5 ± 11 ,7 frente a 50 ± 12,7 en los controles (p = 0,001). Así, tanto la edad como la función hepática se consideraron como posibles factores de confusión, y se controlaron en el análisis de regresión logística multivariante como se describe a continuación. En el grupo HCC el número medio de nodulos fue de 1 ,77 ± 1 , siendo el 50% de ellos pacientes con HCC uninodular. El diámetro del nodulo principal fue de 37,7 ± 20 mm.

Análisis e identificación de proteínas diferencialmente expresadas. Después del análisis 2-D DIGE, entre las manchas de proteínas coincidentes, 19 de ellas se encontraban diferencialmente expresadas en el grupo de HCC, de una manera estadísticamente significativa. De los 19 puntos expresados diferencialmente en el análisis DIGE, 7 proteínas diferentes fueron identificadas mediante MALDI-TOF/TOF MS como carboxipeptidasa-N (CPN), ceruloplasmina (CP), componente del complemento 4A (C4A), fibrinogeno alfa (FGA), inmunoglobulina (Ig) región de la cadena mu C (IGHM), albúmina de suero (ALB), y suero paraoxonasa/arilesterasa 1 (PON 1). Los puntos expresados diferencialmente y el cambio de expresión en HCC en comparación con las muestras de control se muestran en la figura 1 y la tabla 5.

Tabla 5. Proteínas identificadas diferencialmente expresadas en muestras de plasma. La significación estadística se determinó por f-test, donde los valores de p fueron≤ 0,05.

Confirmación de DIGE-resultados por Western-blot. Con el fin de verificar los resultados DIGE/MS, se eligieron aleatoriamente 3 proteínas previamente identificadas con MS. Se confirmó el cambio relativo del nivel plasmático de expresión de las proteínas identificadas CPN, CP, y P0N1 por Western-blot (figura 2).

Validación de las proteínas identificadas como biomarcadores candidatos de desarrollo de HCC. Para evaluar la utilidad de las proteínas identificadas CPN, CP, C4A, FGA, IgM y P0N 1 como biomarcadores candidatos para el desarrollo de HCC en pacientes alcohólicos infectados por el VHC, se analizaron 46 muestras de plasma (24 del grupo control y 22 del grupo de tumores) por ELISA (Figura 4A). El inmunoensayo confirmó la expresión diferencial de C4A en pacientes con HCC (2,4 ± 1 ng/mg de proteína de plasma) comparados con pacientes sin HCC (1 ,8 ± 0,6 ng/mg; p = 0,029). Las concentraciones medias de FGA se incrementaron en los pacientes con HCC (49,9 ± 28 vs 25 ± 12 mg / mg) (p <0,001). Aunque existieron concentraciones más altas de CP en los pacientes de HCC (21 ,8 μg/mg [IQR 14-27]) que en los controles (16, 1 μg/mg [IQR 1 1-24]), estas diferencias fueron no significativas marginalmente (p = 0,071). La concentración de PON-1 en plasma fue de 8,3 μg/mg [IQR 6-13] en pacientes con HCC y 11 ,5 μg/mg [IQR 7-13] en los controles (p = 0,31). La concentración plasmática de CPN fue similar en pacientes con HCC en comparación con los controles sin HCC (45,5 ± 16,5 ng/mg frente a 44,9 ± 20, 1 ng/mg, p = 0,91), como lo fue la concentración de IgM (36,7 ± 1 1 vs 40,5 ± 15,5; p = 0,34). En la regresión logística multivariante, C4A se comportó como el único factor independiente predictivo de HCC con un (OR = 2,15 IC del 95%=1 ,16-4, 10; p = 0,015), mientras que el fibrinógeno plasmático fue no significativo marginalmente (p=0,058) (Tabla 6).

El área bajo la curva ROC para C4A fue de 0,70. Un punto de corte de 1 ,77 ng de C4A/mg de proteína plasmática representó un valor apropiado para distinguir los pacientes cirróticos de pacientes con CHC, con una sensibilidad de 63% y una especificidad del 65%. Sin embargo la mejor capacidad predictiva se encontró con la combinación de C4A, FGA, CP y PON1 a través de la siguiente fórmula (II): (C4A*FGA*CP)/PON1

El área bajo la curva ROC de esta combinación, según la fórmula (II), para identificar a los pacientes con HCC fue de 0,81. Este valor fue más alto que el área bajo la curva ROC de C4A y FGA por separado (figura 4B). Con un umbral de 120 para la combinación de C4A, FGA, CP y PON 1 tuvo una sensibilidad del 73% y una especificidad del 79%.

La concentración sérica de C4A, fue significativamente superior en los pacientes con HCC multinodular (3,05 ± 1 , 17 ng / mi) en comparación con los pacientes con HCC uninodular (1 ,75 ± 0,74 ng / mi) (p = 0,004). Los biomarcadores restantes, incluyendo la combinación de C4A, FGA, CP y PON 1 a través de la fórmula propuesta, no estuvieron relacionados con el número de nodulos de HCC. Ninguno de ellos (C4A incluido) estuvo correlacionado con el tamaño del nodulo mayor.

Tabla 6. Análisis de regresión logística multivariante para los marcadores candidatos. El componente del complemento 4a fue el único predictor independiente de HCC después de controlar los posibles factores de confusión. VARIABLE OR IC 95% P

C4A* 2,15 1,16-4,10 0,015

VARIABLES ELIMINADAS DEL MODELO

CPN 1 0,92-1,10 0,86

PON-1 0,98 0,77-1,23 0,85

CP 1,03 0,97-1,10 0,23

FGA 1,05 0,99-1,13 0,058 igM 0,94 0,85-1,05 0,33

VARIABLES CONTROLADAS COMO POSIBLES FACTORES DE CONFUSION

Edad 1,1 1,02-1,17 0,01

CHILD (A vs. B-C) 0,14 0,15-1,39 0,09

MELD 1 0,85-1,18 0,95

*OR e intervalo de confianza para C4A se calculó como incremento de 0,5 ng/mg proteínas de plasma

C4A: componente del complemento 4A; CPN: carboxipeptidasa-N; PON1: Paraoxonasa/arilesterasa 1 de suero; CP: ceruloplasmina; FGA: fibrinógeno alfa; IgM región cadena mu inmunoglobulina C.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Uso en una muestra aislada de sangre o plasma sanguíneo de un individuo con hepatitis C, de los niveles de expresión de los genes C4A, FGA, CP y PON 1 o de la cuantificación de los productos de expresión de los genes C4A, FGA, CP y PON 1 , para la obtención de datos útiles para el diagnóstico del hepatocarcinoma, donde la cuantificación del producto de expresión de dichos genes o la determinación de los niveles de expresión de dichos genes se realiza de forma simultanea o secuencial en cualquier orden y donde por producto de expresión del gen C4A, se entiende las secuencia aminoácidica que presente un grado de identidad con la secuencia aminoacidica SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 de, al menos el 85%, o una secuencia nucleotídica que codifique para cualquiera de dichas secuencia aminoacídicas; donde por producto de expresión del gen FGA, se entiende las secuencia aminoácidica que presente un grado de identidad con la secuencia aminoacidica SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6 de, al menos el 85%, o una secuencia nucleotídica que codifique para cualquiera de dichas secuencia aminoacídicas; donde por producto de expresión del gen CP, se entiende las secuencia aminoácidica que presente un grado de identidad con la secuencia aminoacidica SEQ ID NO: 9 de, al menos el 85%, o una secuencia nucleotídica que codifique para cualquiera de dichas secuencia aminoacídicas; y donde por producto de expresión del gen PON1, se entiende las secuencia aminoácidica que presente un grado de identidad con la secuencia aminoacidica SEQ ID NO: 11 de, al menos el 85%, o una secuencia nucleotídica que codifique para cualquiera de dichas secuencia aminoacídicas.

2. Uso en una muestra aislada de sangre o plasma sanguíneo de un individuo con hepatitis C, de la cuantificación los productos de expresión de los genes C4A, FGA, CP y PON1 , para la obtención de datos útiles para el diagnóstico del hepatocarcinoma, donde el producto de expresión de dichos genes de determina de forma simultanea o secuencial en cualquier orden y donde los productos de expresión se definen en la reivindicación 1.

3. El uso de los genes C4A, FGA, CP y PON1 o de los productos de expresión de dichos genes según la reivindicación 1 o 2, donde el individuo es alcohólico.

4. Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico del hepatocarcinoma en un individuo con hepatitis C, que comprende: i) obtener una muestra biológica aislada de un individuo, preferiblemente sangre, más preferiblemente plasma sanguíneo; y ii) cuantificar la cantidad de los productos de expresión de los genes: C4A, FGA, CP y PON1, donde por productos de expresión se entienden las secuencias amino-acídicas definidas en la reivindicación 1.

5. El método según la reivindicación anterior, que además comprende: iii) hallar un valor de diagnóstico (VD) con los valores obtenidos en ii):

VD = (C4A x FGA x CP)/ PON 1 donde C4A, FGA, CP y PON1 representan concentraciones de los productos de expresión de cada uno de los genes frente a la proteína total, entiendo por producto de expresión las secuencias aminoacídicas definidas en la reivindicación 1 ; y donde la cantidad del producto de expresión de los genes se mide en ng/mg (ng del producto de expresión del gen por mg de proteína total) para el producto de expresión del gen C4A y en μg/mg fog del producto de expresión del gen por mg de proteína total) para los productos de expresión de los genes FGA, CP, PON1.

6. Un método de diagnóstico del hepatocarcinoma en un individuo con hepatitis C, que comprende los pasos (i)-(iii) según las reivindicaciones 4-5, y que además comprende clasificar a los individuos que presentan un VD > 120 en el grupo de individuos con hepatocarcinoma.

7. Un método de diagnóstico del hepatocarcinoma en un individuo con hepatitis C, que comprende los pasos (i)-(ii) según la reivindicación 4, y que además comprende: asignar los individuos del paso (i) al grupo de individuos con hepatocarcinoma uninodular cuando presentan un valor de producto de expresión del gen C4A < 2,07 ng/mg, o asignar a los individuos del paso (i) al grupo de individuos con hepatocarcinoma multinodular cuando presentan un valor de producto de expresión del gen C4A > 2,07 ng/mg; donde el producto de expresión se define de acuerdo a la reivindicación 5.

8. El método según las reivindicaciones 4-7, donde la muestra biológica es una muestra de sangre.

9. El método según las reivindicaciones 4-8, donde la muestra biológica es una muestra de plasma, preferiblemente sanguíneo.

10. El método según las reivindicaciones 4-9, donde el individuo es alcohólico.

1 1. El método según cualquiera de las reivindicaciones 4-10, donde la cuantificación del producto de expresión de los genes C4A, FGA, CP y PON1 se hace mediante un inmunoensayo.

12. El método según la reivindicación 11 , donde el inmunoensayo es un ELISA.

13. Kit o dispositivo, que comprende los elementos necesarios para cuantificar la concentración o cantidad de los productos de expresión de los genes C4A, FGA, CP y PON1, donde el producto de expresión se define de acuerdo a la reivindicación 1 , preferiblemente donde el producto de expresión se define de acuerdo a la reivindicación 5.

14. El kit o dispositivo según la reivindicación 13, donde dicho kit comprende anticuerpos o fragmentos de los mismos específicos frente a cualquiera de las secuencias SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 11 o frente a secuencias aminoacídicas que presenten un grado de identidad con dichas secuencias aminoacídicas de al menos el 85%.

15. El kit o dispositivo según la reivindicación 13 adecuado para amplificar secuencias nucleótidicas, que comprende sondas y/o cebadores diseñados a partir de las secuencias SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ I D NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 y/o SEQ ID NO: 12 así como opcionalmente todos aquellos elementos necesarios para llevar a cabo un procedimiento PCR.

16. Uso del kit o dispositivo tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 13-15, en la obtención de datos útiles para el diagnóstico del hepatocarcinoma en un individuo con hepatitis C, preferiblemente alcohólico.