WO2015174694A1 - 루신 지퍼 쌍을 이용한 암 진단 및 치료용 조성물 - Google Patents

루신 지퍼 쌍을 이용한 암 진단 및 치료용 조성물 Download PDF

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WO2015174694A1
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cancer
peptide
treatment
composition
fusion protein
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정주연
정봉현
김혜란
배판기
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한국생명공학연구원
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    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions

Definitions

  • the present invention relates to a composition for diagnosing and treating cancer using a Leucine zipper pair (ZR / ZE), and more particularly, to a cancer diagnostic fusion protein in which an antibody and a ZR peptide are fused to a cancer cell surface receptor; And a nano-emulsion for treating cancer, wherein the ZE peptide is fixed to the surface and contains a gene or drug for treating cancer therein, wherein the ZE peptide is capable of selectively treating the cancer after cancer diagnosis.
  • ZR / ZE Leucine zipper pair
  • the present invention was completed with the support of the following national research and development projects.
  • antibodies or antibody fragments can be conjugated to radioisotopes, drugs or toxins in order to apply diagnostic or therapeutic principles to a tumor or lesion site.
  • the biggest obstacle in using this method has been the difficulty in loading a sufficient amount of therapeutic or diagnostic agent into the antibody.
  • Another problem is that overloading a therapeutic or diagnostic agent to an antibody may cause the human body to reject and destroy the antibody conjugate.
  • cytotoxic agents Conjugation of cytotoxic agents to antibodies to achieve therapeutic results by targeting is a known technique, for example, it is known that methotrexate (MTX) can be conjugated to antibodies and some selective cytotoxicity is observed. . It is desirable to enhance the cytotoxicity of such conjugates by increasing the amount of loading cytotoxic agents. However, multiple conjugation of individual drug molecules to antibodies ultimately reduces their immunoreactivity, and this effect is observed when loading at least about 10 molecules.
  • MTX methotrexate
  • therapeutic therapies that can simultaneously diagnose and treat are being developed. They usually consist of small sized materials, usually fluorescent dyes, radioactive molecules, etc. are carried on the inside of liposomes, polymers and nanoparticles, and drugs or diagnostic markers are introduced outside.
  • therapeutic contrast materials consisting of lipid structures with excellent biocompatibility.
  • microbubble ultrasound agent a micrometer-sized bubble ultrasound contrast medium composed of lipid structures , MB
  • MB micrometer-sized bubble ultrasound contrast medium composed of lipid structures
  • microbubbles based on known lipid structures
  • the superior biocompatibility of the microbubbles can be used for the treatment as well as the diagnosis through the image analysis of vascular or cancerous tissues in various in vivo or in vitro studies.
  • Genes or drugs can be delivered to treat cancer (Katherine F. et al. , Annual Review of Biomedical Engineering , 9: 415, 2007).
  • ultrasonography analysis using microbubbles is insufficient for accurate diagnosis of cancer due to low resolution and target nonspecific properties.
  • research is being conducted to develop multiple imaging mediums using fluorescence and ultrasound to confirm detailed distribution through fluorescence image analysis (Bart G. et al., Journal of Controlled Releas , 152: 249, 2011).
  • leucine zipper is a kind of high-order structure common to a specific DNA binding protein, the protein C / EBP, cells that bind to the base sequence CAAT box on the gene transcribed by RNA polymerase II, cells stimulate the cAMP It is known as a characteristic structure of proteins such as protein CREB, yeast transcription factor GCN4, nuclear gene product localized in the nucleus, Myc, Fos, Jun, etc. when it is received (Vinson et al. , Science , 246). : 9111 989; Dmitry Krylov and Charles R Vinson, Encyclopedia of Life Sciences, 1, 2001). Near the C terminus of these proteins, leucine residues are present every seven amino acids.
  • This region forms an alpha helical structure, and leucine is arranged on one side every two revolutions of the alpha spiral structure. Therefore, when two such proteins are present, leucine residues arranged on the side are combined with each other like a zipper by hydrophobic bonds to form a dimer.
  • leucine residues arranged on the side are combined with each other like a zipper by hydrophobic bonds to form a dimer.
  • the ZE / ZR heterodimeric leucine zipper pair is derived from the B-Zip homodimer of the vitellogenin-binding protein (VBP), a precursor of egg yolk protein present in female blood. , Among the seven parts of the ZE / ZR leucine zipper pair, all residues located in the first four parts e and g were changed to glutamic acid or arginine, respectively, to acidic peptide ZE and basic peptides, respectively. Basic peptide ZRs can be prepared (Moll, JR et al. , Protein Sci. , 10: 649, 2001).
  • the present inventors have made diligent efforts to improve the problems of the drug delivery system for treating cancer and to develop a cancer diagnosis and cancer cell specific treatment system using a ZE / ZR leucine zipper pair.
  • a composition for diagnosis and treatment of cancer comprising a nanoemulsion in which a specific antibody, a ZR peptide fusion protein, and a ZE peptide that binds to a ZR peptide is immobilized, it is possible to effectively target a cancer cell to deliver a therapeutic substance only to a specific cancer cell. It confirmed and completed this invention.
  • An object of the present invention is to provide a composition for diagnosing and treating cancer that can specifically treat cancer cells diagnosed and diagnosed by using ZR / ZE leucine zipper pair binding.
  • the present invention is a cancer diagnostic fusion protein fusion antibody and ZR peptide specific to the cancer cell surface receptor; And a nano-emulsion for treating cancer, wherein the ZE peptide is immobilized on the surface and contains a gene or drug for treating cancer therein, and the cancer diagnosis and treatment composition can be selectively treated after cancer diagnosis. do.
  • the composition for diagnosing and treating cancer of the present invention can detect only specific cancer cells by using a cancer diagnostic fusion protein in which an antibody specific to a cancer cell surface receptor and a ZR peptide are fused, and the fusion protein and the ZE peptide are immobilized on the surface.
  • ZR / ZE leucine zipper pair binding of nanoemulsions for cancer treatment has the advantage that it is possible to deliver therapeutic substances only to certain cancer cells.
  • cancer such as breast cancer, liver cancer, pancreatic cancer, brain cancer, stomach cancer, lung cancer, esophageal cancer, colon cancer, prostate cancer, kidney cancer, ovarian cancer It can be useful to develop effective diagnosis and treatment.
  • FIG. 1 is a cancer diagnosis and treatment using a leucine zipper pair of the present invention, cancer diagnostic fusion protein and ZR peptide fused to the cancer cell surface receptor specific cancer cancer nanoemulsion for fixation on the surface fixed ZE peptide It is a schematic diagram about.
  • FIG. 2 is a schematic representation of ZR / ZE leucine zipper pair binding.
  • 3A shows the SDS-PAGE results confirming the expression level of ZR-Herceptin Fab protein, a cancer diagnostic fusion protein in which an antibody specific to a cancer cell surface receptor and a ZR peptide are fused (lane 1: marker, number 2)
  • B shows Western blot results confirming the expression level of ZR-Herceptin Fab protein, a cancer diagnostic fusion protein fused with a ZR peptide and an antibody specific for a cancer cell surface receptor (lane 1)
  • ⁇ 3 fraction containing the 4D5Fab antibody-ZR fusion protein 1 ⁇ 3).
  • Figure 4 is a data quantifying the characteristics of ZE-Rhodamin-PFCE wavelength analysis (A), cytotoxicity (B) and ZE-Rhodamin-PFCE is a nano-emulsion for cancer treatment in which the ZE peptide is immobilized on the surface (C).
  • 7 is an amino acid sequence of a 4D5 antibody.
  • the present invention provides a cancer diagnostic fusion protein in which an antibody and a ZR peptide are fused to a cancer cell surface receptor; And a nano-emulsion for treating cancer, wherein the ZE peptide is fixed to the surface and contains a gene or drug for treating cancer therein, wherein the ZE peptide is capable of selectively treating the cancer after cancer diagnosis.
  • the cancer diagnosis and treatment composition of the present invention specifically binds to a receptor (antigen) on a target cell surface of a cancer diagnostic fusion protein in which an antibody specific to a cancer cell surface receptor and a ZR peptide are fused. Therefore, the target cells can be detected, and the ZE peptide is fixed on the surface, and the cancer therapeutic nanoemulsion containing gene or drug for cancer treatment therein is formed of ZR peptide and ZE of the target cell-fusion protein complex. / ZR leucine zipper pair binding allows selective delivery of therapeutics only to target cells.
  • the ZR peptide may be represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (LEI RAAFLRR RNTALRT RVAELRQ RVQRLRN IVSQYET RYGPL), and the ZE peptide may be represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 (LEI EAAFLEQ ENTALET EVAELEQ EVQRLEN IVSQYET RYGPL).
  • the nanoemulsion may contain a therapeutic agent containing a gene or drug for the treatment of cancer therein.
  • the cancer may be selected from the group consisting of breast cancer, liver cancer, pancreatic cancer, brain cancer, stomach cancer, lung cancer, esophageal cancer, colon cancer, prostate cancer, kidney cancer, ovarian cancer, preferably in the present invention target breast cancer It was made.
  • the cancer cell surface receptor is HER2 (Human Epidermal growth factor Receptor 2 protein).
  • HER2 Human Epidermal growth factor Receptor 2 protein
  • the target of breast cancer is not limited to the diagnosis of breast cancer. It is apparent to those skilled in the art that a peptide for fusion can use cancer diagnostic fusion proteins.
  • the cancer diagnostic fusion protein and the ZE peptide is fixed to the surface of the nano-emulsion for cancer treatment, the fluorescent material is further bound, the fluorescent material is fluorescein (fluorescein), fluorescein chlorotriazinyl (fluorescein chlorotriazinyl), rhodamine green, rhodamine red, tetramethylrhodamine, FITC, Oregon green, Alexa Fluor, FAM, JOE, It may be at least one selected from the group consisting of ROX, HEX, Texas Red, TET, TRITC, TAMRA, Cyanine-based dyes and thiadicarbocyanine dyes.
  • the present invention is not limited thereto, and fluorescent materials known in the art may be used without limitation, and in the present invention, preferably, Cyanine-based dye Cy5, Fluorescein isothiocyanate (FITC), and rhodamine Red was used.
  • Cyanine-based dye Cy5 Cyanine-based dye Cy5
  • Fluorescein isothiocyanate (FITC) Fluorescein isothiocyanate (FITC)
  • rhodamine Red was used.
  • ZE / ZR Leucine zipper pair means that the ZE peptide and ZR peptide form a heterodimer (Fig. 2), the ZE / ZR heterodimer leucine zipper pair (heterodimeric leucine The zipper pair was derived from the B-Zip homodimer of vitellogenin-binding protein (VBP), a precursor of yolk protein present in female blood.
  • VBP vitellogenin-binding protein
  • the ZE / ZR leucine zipper system has a heterozygote affinity of 10-15M similar to the streptavidin / biotin system while the affinity of the heterozygotes is in the micromolar range (Moll, JR et al., Protein Sci., 10: 649, 2001).
  • HER2 of the present invention is epidermal growth factor receptor 2 (erbB-2, HER2, Neu, CD340, p185), a 185 kDa type 1 transmembrane receptor tyrosine kinase (type 1 transmembrane receptor tyrosine kinase) Is known to promote differentiation and proliferation of mammalian cells.
  • HER2 / neu is abnormally activated in the adult is known to be involved in the development of cancer.
  • 20-30% of breast or ovarian cancer patients are overexpressing HER2 / neu, which is associated with poor prognosis of breast, ovarian or gastric cancer.
  • Herceptin or Trastuzumab
  • Herceptin an antibody specific for HER2
  • breast cancer treatment which is a highly effective treatment for both early-stage and metastatic HER2-positive breast cancers and is the standard for these patients. Used as a treatment.
  • a 4D5 antibody in the form of a Fab fragment, a Herceptin antibody, and a ZR peptide are fused to diagnose and treat breast cancer using a composition for diagnosing and treating cancer.
  • the protein was prepared (FIG. 3), and the fluorescent substance Cy5 or Fluorescein isothiocyanate (FITC) was added to target breast cancer cell lines to confirm cell surface receptor binding and to effectively detect cancer cells later. Used to combine.
  • a cancer cell surface specific antibody and a ZR peptide are fused to target a cancer cell, but a target material such as a molecule, a ligand, or a receptor on a target cell surface is selectively recognized
  • a target material such as a molecule, a ligand, or a receptor on a target cell surface is selectively recognized
  • Any material capable of recognition / binding can be used, for example nucleic acid molecules (DNA or RNA), proteins, antibodies, antigens, aptamers (RNA, DNA and peptide aptamers), receptors, Hormones, streptavidin, avidin, biotin, lectins, ligands, agonists, antagonists, enzymes, coenzymes, inorganic ions, enzyme cofactors, sugars, lipids, enzyme substrates, hapten, neutravidin, protein A , Protein G, selectin, calcium sulfate and gas binders (e.g.
  • the target material means a material in a sample to be separated (or isolated and detected, or isolated, detected and quantified), and specifically, a nucleic acid molecule (DNA or RNA), a protein, a peptide, an antigen, a sugar, a lipid, a bacterium.
  • DNA or RNA nucleic acid molecule
  • the sample includes a biological sample, a chemical sample and an environmental sample
  • the biological sample includes, for example, blood, plasma, serum, virus, bacteria, tissue, cells, lymph, bone marrow fluid, saliva, milk, urine, feces, eyeballs. Fluids, semen, brain extracts, spinal fluid, joint fluids, thymic fluids, ascites, amniotic fluids, cell tissue fluids and cell culture fluids.
  • Nanoemulsions can be used for multiple image analysis as well as therapeutics.
  • the method for preparing a nano-emulsion for treating cancer in which the ZE peptide is immobilized on the surface is specifically (a) phosphatidylcholine, cholesterol, DSPE-mPEG2000 (1,2-distearoyl- sn -glycero-3-phosphoethanolamine-N- [ methoxy (polyethylene glycol), DPPE-rhodamine (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine- N- (lissaminerhodamine B sulphonyl), DSPE-PEG3400-NH 2 (N- (aminopropylpolyethyleneglycol) carbamyl-distearoylphosphatidyl ethanolamine) Dissolving in chloroform and then evaporating chloroform to form a thin lipid membrane (b) treating distilled water on the lipid membrane and dispersing by ultrasonication to prepare a liposome suspension; (c) emulsifier
  • a nanoemulsion was prepared by dissolving in chloroform, and in order to bind the ZE peptide to the nanoemulsion prepared in step (d), a 10 mM EDC (1-ethyl-3- [3-dimethylaminopropyl] car
  • the nanoemulsion prepared above can be used without limitation the materials used for preparing nanoemulsions or nanoliposomes known in the art, the production method may also use methods known in the art. In addition, it can be adjusted to 100nm to 10 ⁇ m size according to the type and concentration of the material used, the size can be adjusted by the cancer treatment agent added according to the purpose.
  • the nanoemulsion may include a film forming material, a phospholipid, a negatively charged compound, a compound having an amine group and a compound having a disulfide group, and the film forming material may be DPPC (1,2-dipalmitory-sn-glycero-3-phosphatidylcholine), DDPC (1,2-didecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DEPC (1,2-didecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DLOPC (1,2-dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) , DLPC (1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DMPC (1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine ) Or DSPC (1,2-distea
  • the negatively charged compounds include DCP (dicetyl phosphate), DEPA (1,2-dierucoyl-sn-glycero-3-phosphate), DLPA (1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphate), and DMPA (1,2 -dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphate) or DOPA (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphate) or the like, and a compound having an amine group, such as DPPE (1,2-dipalmitory-sn-glycero-3) -phosphoethanolamine), DEPE (1,2-dierucoylsn-glycero-3-phosphoethanolamine), DLPE (1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DMPE (1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine) or DOPE (1,2-dioleoyl-sn-s
  • the particle size of the dispersion system is not uniform,
  • the emission wavelength peak of the immobilized nanoemulsion was 592 nm, the diameter was 123.1 ⁇ 26.9 nm, the polydispersity was 0.087, and it was confirmed that the ZE peptide had a value similar to that of the unimmobilized nanoemulsion.
  • the nano-emulsions were treated to SKBR3 and MDF7, the breast cancer cell lines, and MCF10A, the common breast cells by concentration, the cell survival rate was 100%, indicating no toxicity (FIG. 4).
  • HER2 of the 4D5Fab antibody-ZR fusion protein prepared in the present invention targets overexpressed cells (SKBR3), and adds ZE-Rhodamin-PFCE to the target cell-4D5Fab-ZR fusion protein complex to selectively select leucine zipper pairs. Binding (ZR-ZE) was confirmed through flow cytometry (FACS) experiments.
  • ZR-ZE flow cytometry
  • a control of the fusion protein a fusion protein in which ZE peptides were fused with Fab fragments other than HER2-specific antibodies was used.
  • MCF7 a breast cancer cell line in which HER2 was hardly expressed, was used.
  • 4D5Fab-ZR fusion protein (FITC labeling) selectively binds only to SKBR3 cell line overexpressing Her2, and ZE-Rhodamin-PFCE forms a zipper pair with ZR peptide to bind to target cell-4D5Fab-ZR fusion protein complex It was confirmed that (Fig. 5).
  • composition for diagnosing and treating cancer using the leucine zipper pair of the present invention was confirmed that only target cancer cells can be specifically detected, and the ZE peptide is immobilized on the surface through ZR / ZE leucine zipper pair binding.
  • Cancer treatment nanoemulsions (including therapeutic agents) confirmed that the delivery of therapeutic substances to specific cancer cells only.
  • the method comprises the steps of: (a) detecting cancer cells using a cancer diagnostic fusion protein in which an antibody specific to a cancer cell surface receptor and a ZR peptide are fused; And (b) adding a nano-emulsion for treating cancer, wherein the ZE peptide is immobilized on the surface, and delivering cancer-specific therapeutic agent detected through ZR / ZR leucine zipper pair binding with the fusion protein to treat cancer.
  • a cancer diagnostic fusion protein in which an antibody specific to a cancer cell surface receptor and a ZR peptide are fused
  • a nano-emulsion for treating cancer wherein the ZE peptide is immobilized on the surface, and delivering cancer-specific therapeutic agent detected through ZR / ZR leucine zipper pair binding with the fusion protein to treat cancer.
  • Can also be used for cancer diagnosis and treatment methods comprising the.
  • composition for diagnosing and treating cancer of the present invention may be usefully used for targeting and diagnosing cancer cells or cancer tissues, and may be formulated in oral or parenteral dosage forms for diagnosing or treating cancer.
  • cancer treatment it may be administered in a pharmaceutically effective amount to treat cancer cells or their metastases, or to inhibit the growth of cancer. It may vary depending on various factors such as the type of cancer, the age, weight of the patient, the nature and extent of symptoms, the type of current treatment, the number of treatments, the dosage form and the route, and can be easily determined by those skilled in the art.
  • compositions of the present invention may be administered together or sequentially with the pharmacological or physiological components described above, and may also be administered in combination with additional conventional therapeutic agents and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents. Such administration may be single or multiple administration. Taking all of the above factors into consideration, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect in a minimum amount without side effects, and can be easily determined by those skilled in the art.
  • 'administration' means introducing a predetermined substance into an individual by any suitable method so that the route of administration of the composition comprising the antibody of the present invention can be administered through any general route as long as it can reach the target tissue.
  • the protein is digested, so the oral composition is preferably formulated to coat the active agent or to protect it from degradation in the stomach.
  • the pharmaceutical composition may be administered by any device in which the active agent may migrate to the target cell.
  • a fusion protein of cancer cell-specific antibody and ZR peptide in order to prepare a fusion protein of cancer cell-specific antibody and ZR peptide, HER2 specific antibody known to be overexpressed in breast cancer cells was used, and the 4D5 antibody and ZR peptide (Herceptin antibody) Fab fragment form A fusion protein was prepared in which LEI RAAFLRR RNTALRT RVAELRQ RVQRLRN IVSQYET RYGPL (SEQ ID NO: 2-Bionia, Korea) was fused.
  • the 4D5Fab antibody-ZR peptide gene and the pKB-Fab100 vector were purified after treatment at 37 ° C. for 1 hour and 30 minutes using Not (NEB cat No. r0189s), and the purified pKB-Fab100 vector and ZR peptide were mole / 2.
  • ligase. DaKaRa cat No. 2011B 10 x ligase
  • T4 DNA ligase 10 ⁇ l
  • sterile distilled water a total volume of 200 ⁇ l.
  • the reaction was ligation overnight at ° C to prepare a pKB-Fab100 vector containing the ZR peptide gene.
  • TG1 cells having the ability to produce 4D5Fab antibody-ZR fusion protein were treated with 2YT medium containing ampicillin (ampicilline, 100 ⁇ g / ml) (Bactotryptone 16 g, yeast extract 10 g, NaCl aqueous solution (NaCl 5 g in Single colony was selected by incubating at 1 liter H 2 O, pH 7.0), and the selected colonies were selected at 37 ° C. so that the OD 600 value was 0.6-0.7 in 4 L of 2YT ampicillin medium. And cultured at 200 rpm at OD 600 , and then incubated for 16 hours at 200 ° C. at 26 ° C.
  • TES buffer 0.2M Tris-HCl, PH8.0; 0.5mM EDTA; 0.5M sucrose.
  • Lysozyme (10 mg / ml in TES buffer, SIGMA-ADRICH L6876) in suspended cells 2.5 ml of lysozyme was added, followed by 250 ml of TES buffer diluted 1: 2 with cold distilled water (about 1 to 4 ° C.) and osmotic shock on ice for 30 minutes. And centrifuged at 12000 g for 10 minutes (hanil. Supra 22k).
  • a nanoemulsion was prepared in which the ZE peptide (LEI EAAFLEQ ENTALET EVAELEQ EVQRLEN IVSQYET RYGPL; SEQ ID NO: 3) of the present invention was immobilized, and a basic dye, Rhodamin, was combined to confirm the degree of binding to a fusion protein for diagnosis of cancer. .
  • phosphatidylcholine phosphatidylcholine; Egg PC, Avanti Polar Lipids Inc., USA
  • 20 mol% cholesterol Sigma-Aldrich Co., USA
  • 3 mol% DSPE-mPEG2000 (1,2-distearoyl-sn -glycero-3-phosphoethanolamine-N- [methoxy (polyethylene glycol) 2000; Avanti Polar Lipids Inc., USA)
  • 1 mol% DPPE-rhodamine 1,2-dioleoyl- sn -glycero-3-phosphoethanolamine- N- ( lissamine rhodamine B sulphonyl; Avanti Polar Lipids Inc., USA
  • 2.6 mol% DSPE-PEG3400- ° C NH 2 N- (aminopropylpolyethyleneglycol) carbamyl-distearoylphosphatidyl ethanolamine
  • tertiary distilled water was added to the membrane and dispersed for 10 minutes with ultrasonic waves to prepare a liposome suspension, and 2.0% w / v emulsifier sap solution and 40% v / v perfluorocarbon were added to the prepared suspension. Thereafter, the mixture was mixed with a homogenizer (fisher scientific, USA) for 4 minutes. The mixed solution was suspended at 20000 psi for 4 minutes using a microfluidizer (M-110s Microfluidizer, microfluidics Co., USA), and then the prepared nanoemulsion was prepared using a desalting column (GE Healthcare, UK). The residue was removed and refrigerated at 4 ° C.
  • Example 2 In order to confirm the properties of the ZE-Rhodamin-PFCE prepared in Example 2, the emission peak, diameter and polydispersity of the particles forming the dispersion system were measured. As a control, a nanoemulsion in which ZE peptide was not immobilized was used.
  • UV-vis and fluorescence spectra were measured to investigate the fluorescence properties of nanoemulsions.
  • UV-vis spectra (Beckman Coulter, USA) were measured in the region of 400 to 700 nm, and fluorescence spectrum (LS55 Fluorescence spectrometer, PerkinElmer, USA) was measured in the region of 500 to 800 nm. nm, the light emission wavelength was confirmed to have the highest intensity at 600 nm.
  • the diameter and polydispersity of the nanoemulsion were measured using DLS (Dynamic Light Scattering, Otsuka, Japan).
  • the diameter of the nanoemulsion was 80-180 nm, and the polydispersity was 0.087. It was confirmed that the ZE peptide had a value similar to that of the unimmobilized nanoemulsion (FIGS. 4A and C).
  • the emission wavelength peak of the nanoemulsion in which the ZE peptide was immobilized was 592 nm, the diameter was 123.1 ⁇ 26.9 nm, and the polydispersity was 0.087. It was confirmed that the ZE peptide had a value similar to that of the unimmobilized nanoemulsion. (FIGS. 4A and C).
  • nanoemulsion in concentrations (0.032 ⁇ L / mL, 0.16 ⁇ L / mL, 0.8) in breast cancer cell lines SKBR3 and MDF7 and MCF10A which is a common breast cell ⁇ L / mL, 4 ⁇ L / mL, 20 ⁇ L / mL and 100 ⁇ L / mL), respectively, and then cell viability was measured by MTT assay.
  • each cell was propagated in a 96-well plate.
  • dilute samples to respective concentrations in serum-free cultures add 100 ⁇ L to each cell proliferation well, and incubate for 24 and 48 hours in a 37 ° C, 5% CO 2 incubator.
  • MTT 3- (4,5-dimethylthiazol-2yl) -2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide
  • the MTT screening method shows that mitochondrial dehydrogenase in surviving cells reduces the yellowish MTT to formazan with a purple color, and the product is dissolved in an organic solvent to measure absorbance to determine the number of living and dead cells. Relatively compared.
  • the nanoemulsion of SKBR3, MDF7 and MCF10A all showed a survival rate of about 100% regardless of the concentration, it was confirmed that the nanoemulsion of the present invention is not toxic to the cells (Figs. 4B and C).
  • a fusion protein fused with Fab fragments (SIGMA, IgG Fab) and ZE peptides other than HER2 specific antibodies was prepared and used in the same manner as in Example 1, and HER2 was almost expressed as a control of the cells.
  • Untreated breast cancer cell line MCF7 was used.
  • 4D5Fab-ZR fusion protein (FITC labeling) selectively binds only to SKBR3 cell line overexpressing Her2, and ZE-Rhodamin-PFCE forms a zipper pair with ZR peptide to bind to target cell-4D5Fab-ZR fusion protein complex It was confirmed that (Fig. 5).
  • MCF10A and SKBR3 cells which are normal breast cells, were cultured and treated with 4D5Fab antibody-ZR fusion protein and ZE-Rhodamin-PFCE, followed by confocal microscopy.
  • each cell was dispensed in 8-well plates at a concentration of 2 * 10 4 cells / well, and 10 ug / ml 4D5Fab antibody-ZR fusion protein for 1 hour. Treatment After washing, 10 ug / ml ZE-Rhodamin-PFCE was treated for 1 hour, and cells were washed and fixed to measure fluorescence imaging.
  • the present invention can detect only certain cancer cells by using a cancer diagnostic fusion protein in which an antibody specific to a cancer cell surface receptor and a ZR peptide are fused, and ZR of a nanoemulsion for cancer treatment in which a fusion protein and a ZE peptide are immobilized on a surface thereof.
  • a cancer diagnostic fusion protein in which an antibody specific to a cancer cell surface receptor and a ZR peptide are fused
  • ZR of a nanoemulsion for cancer treatment in which a fusion protein and a ZE peptide are immobilized on a surface thereof.
  • / ZE leucine zipper pairing allows delivery of therapeutics to specific cancer cells only.

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Abstract

본 발명은 루신 지퍼 쌍(Leucine zipper pair; ZR/ZE)을 이용한 암 진단 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 암 세포 표면 수용체에 특이적인 항체와 ZR 펩타이드가 융합된 암 진단용 융합단백질; 및 ZE 펩타이드가 표면에 고정되어 있고, 그 내부에 암 치료를 위한 유전자 또는 약물을 함유하는 암 치료용 나노에멀젼을 포함하는, 암 진단 후에 선택적으로 암을 치료할 수 있는 암 진단 및 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 암 진단 및 치료용 조성물은 암 세포 표면 수용체에 특이적인 항체와 ZR 펩타이드가 융합된 암 진단용 융합단백질을 이용하여 특정 암 세포만을 검출할 수 있으며, 융합단백질과 ZE 펩타이드가 표면에 고정된 암 치료용 나노에멀젼의 ZR/ZR 루신 지퍼 쌍 결합을 통해 특정 암세포에만 치료물질 전달이 가능한 장점이 있다. 또한, 융합단백질 또는 나노에멀젼에 형광물질을 고정시켜 다중 영상 분석이 가능하므로, 유방암, 간암, 췌장암, 뇌암, 위암, 폐암, 식도암, 대장암, 전립선암, 신장암, 난소암 등의 암 질환의 효과적인 진단 및 치료제 개발에 유용하게 활용될 수 있다.

Description

루신 지퍼 쌍을 이용한 암 진단 및 치료용 조성물
본 발명은 루신 지퍼 쌍(Leucine zipper pair; ZR/ZE)을 이용한 암 진단 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 암 세포 표면 수용체에 특이적인 항체와 ZR 펩타이드가 융합된 암 진단용 융합단백질; 및 ZE 펩타이드가 표면에 고정되어 있고, 그 내부에 암 치료를 위한 유전자 또는 약물을 함유하는 암 치료용 나노에멀젼을 포함하는, 암 진단 후에 선택적으로 암을 치료할 수 있는 암 진단 및 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 하기 국가연구개발사업의 지원을 받아 완성되었다.
(과제 1)
[과제고유번호] 2014060507
[부처명] 미래창조과학부
[연구관리전문기관] 한국연구재단
[연구사업명] 원천기술개발사업(글로벌프론티어)
[연구과제명] 약물 저항성 바이오 유해물질 신속 검출을 위한 바이오
컨텐츠 설계 및 활용기술 개발
[주관기관] 한국생명공학연구원
[연구기간] 2014.09.01 ~ 2015.08.31
(과제 2)
[과제고유번호] 2014003797
[부처명] 미래창조과학부
[연구관리전문기관] 한국연구재단
[연구사업명] 원천기술개발사업(미래유망)
[연구과제명] 원자현미경 적용을 위한 바이오컨텐츠 발굴, 생산 및
활용기술 개발
[주관기관] 한국생명공학연구원
[연구기간] 2014.03.01 ~ 2015.02.28
(과제 3)
[과제고유번호] KGM1121521
[부처명] 미래창조과학부
[연구관리전문기관] 국가과학기술연구회
[연구사업명] 주요사업(2015-2018)
[연구과제명] 나노바이오메디컬 융복합 기술개발사업
[주관기관] 한국생명공학연구원
[연구기간] 2015.01.01 ~ 2015.12.31
종양 또는 병변 부위에 진단 또는 치료 원리를 적용하기 위하여 항체 또는 항체 단편을 방사성 동위원소, 약제 또는 독소에 접합시킬 수 있다는 것이 주지되어 있다. 이러한 방법을 이용하는데 있어서 가장 큰 장애는 충분한 양의 치료제 또는 진단제를 항체에 로딩(loading)시키는 것이 어렵다는 것이었다. 그 외의 문제는 항체에 치료제 또는 진단제를 과로딩(overloading)하면 인체가 항체 접합체를 거부하고 파괴할 염려가 있다는 점이다.
타겟팅에 의한 치료 결과를 달성하기 위하여 항체에 세포독성 약제를 접합시키는 것은 공지된 기술로, 예를 들면, 메토트렉세이트(MTX)를 항체에 접합시킬 수 있다는 것이 알려져 있으며 어느 정도 선택적인 세포 독성이 관찰된다. 세포독성 약제를 로딩하는 양을 증가시킴으로써 이러한 접합체의 세포독성을 증강시키는 것이 바람직하다. 그러나, 개개의 약제 분자를 항체에 다중 접합시키면 궁극적으로 그의 면역반응성이 감소되며, 이러한 효과는 약 10개 이상의 분자를 로딩한 경우에 관찰된다.
또한, 약제를 중합체 담체에 접합시킨 후 이를 다시 항체에 접합시키는 기술도 연구되었으며, 상기 기술은 더 많은 수의 약제 분자를 목표 부위에 전달할 수 있다는 장점을 갖는다. Ryser 등 (Ryser et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 75:3867, 1978)은 중합체 담체로서 폴리리신을 사용하면 담체당 약 3MTX만을 로딩할 수 있다고 보고하였으나, 이 경우에는 면역 반응성이 저하된다는 문제점을 가지고 있다. 주로 전하를 띈 암모늄기의 형태인 중합체 내의 고함량의 아민은 접합체가 정상세포에 달라붙도록 하여 세포 독성 효과의 선택성을 저하시키게 된다.
최근에는 진단과 치료를 동시에 할 수 있는 치료용 조영물질(theragnostic agent)이 개발되고 있다. 이들은 보통 작은 크기의 물질로 이뤄져 있으며, 대개 형광 염료, 방사성 분자 등이 리포좀, 고분자 및 나노 입자 등의 내부에 담지되고 약물이나 진단용 마커가 외부에 도입된 형태를 갖는다. 최근에는 생체 적합성(biocompatibility)이 우수한 지질구조체(lipid structure)로 이루어진 치료용 조영 물질의 합성 연구가 주를 이루고 있으며, 특히 지질구조체로 이뤄진 마이크로미터 크기의 공기방울 초음파 조영제인 마이크로버블(Microbubble ultrasound agent, MB)을 이용한 생체 영상 분석 연구가 활발히 진행되고 있다 (David C., Eur J Radiol., 60:324, 2006). 이러한 연구들은 최근 '나노-바이오 분야(nano-bio field)'로 불리고 있는 나노물질의 생물관련 분야로의 응용을 위해 비독성, 고-수용성 또는 용이한 표면 변형 등의 특성을 부과하는데 주로 초점이 맞춰져 있다.
지금까지 공지된 지질구조체를 기반으로 하는 마이크로버블들을 살펴보면, 우수한 생체적합성을 통해 여러 생체 내(in vivo)또는 시험관 내(in vitro) 연구에서 혈관 또는 암조직의 영상 분석을 통한 진단 뿐 아니라 치료용 유전자나 약물을 전달하여 암을 치료할 수 있는 것으로 보고되고 있다 (Katherine F. et al., Annual Review of Biomedical Engineering, 9:415, 2007). 그러나 마이크로버블을 통한 초음파 조영 분석은 낮은 해상도와 표적 비특이성(nonspecific property)으로 인해 암의 정확한 진단에는 역부족이며, 따라서 초음파 조영뿐 아니라 형광 조영을 동시에 사용하여 초음파 분석을 통한 생체 조직의 형태 확인과 동시에 형광 영상 분석을 통한 세부적인 분포도를 확인할 수 있도록 하는 형광 및 초음파를 통한 다중 영상 조영 물질을 개발하기 위한 연구들이 이루어지고 있다 (Bart G. et al., Journal of Controlled Release, 152:249, 2011).
그러나 공지된 물질들 대부분이 여전히 표적 비특이적인 조영 효과에 그치고 있어 실질적으로 혈관, 림프관 등의 선형적인 조직 진단에만 활용가능하거나, 병변 세포에만 표적 특이적으로 치료 유전자나 약물을 전달하여 치료하는데 한계를 나타내고 있어 치료용 물질을 담지하기 위해 또 다른 구조체와의 혼성체를 형성시켜야 하는 구조적 어려움이 있어왔다 (Wang C. et al., Biomaterials, 33:1939, 2012).
한편, 루신 지퍼(leucine zipper)는 특정 DNA 결합 단백질에 공통으로 나타나는 고차구조물의 일종으로, RNA중합효소 Ⅱ로 전사되는 유전자상의 염기배열CAAT상자에 결합하는 단백질 C/EBP, 세포가 cAMP의 자극을 받았을 때에 DNA의 특정 영역과 결합하는 단백질 CREB, 효모의 전사인자 GCN4, 핵에 국재하는 암 유전자 산물, Myc, Fos, Jun 등의 단백질에 특징적인 구조로 알려져 있다 (Vinson et al., Science, 246:9111 989; Dmitry Krylov and Charles R Vinson, Encyclopedia of Life Sciences, 1, 2001). 이들 단백질의 C말단 근처에는 루신 잔기가 7개의 아미노산마다 반복하여 존재한다. 이 영역은 α나선구조를 형성하고 있어 α나선구조의 2회전마다 한쪽 측면에 루신이 배열된다. 따라서 이러한 단백질이 2개 존재하면 측면에 배열한 루신 잔기끼리 소수결합에 의해 서로 지퍼처럼 조합하여 2 합체를 형성한다. 기본적인 구조의 루신 지퍼의 N말단 측에는 염기성 아미노산이 풍부한 영역이 존재하여 2 합체 형성에 의해 이 영역이 DNA와 결합할 수 있는 배치가 된다 (B-Zip; basic-region leucine zipper).
그 중 ZE/ZR 헤테로다이머 루신 지퍼 쌍(heterodimeric leucine zipper pair)은 암컷 혈액 내에 존재하는 난황단백질의 전구체인 비텔로제닌 결합 단백질 (vitellogenin-binding protein; VBP)의 B-Zip 호모다이머에서 유래한 것으로, ZE/ZR 루신 지퍼 쌍의 7개 부분 중에서 처음 4 부분의 e 및 g에 위치해 있는 모든 잔기를 각각 글루탐산(glutamic acid) 또는 아르기닌(arginine)으로 변경하여 각각 산성 펩타이드 ZE(acidic peptide ZE) 및 염기성 펩타이드 ZR(basic peptide ZR)를 제조할 수 있다 (Moll, J. R. et al., Protein Sci., 10:649, 2001).
이에, 본 발명자들은 기존의 암 치료를 위한 약물 전달 시스템의 문제점을 개선하고, ZE/ZR 루신 지퍼 쌍을 이용하여 암 진단 및 암 세포 특이적 치료 시스템을 개발하고자 예의 노력한 결과, 암 세포 표면 수용체에 특이적인 항체와 ZR 펩타이드 융합단백질 및 ZR 펩타이드와 결합을 이루는 ZE 펩타이드가 고정된 나노에멀전을 포함하는 암 진단 및 치료용 조성물을 이용할 경우, 효과적으로 암 세포를 타겟팅하여 특정 암세포에만 치료물질이 전달 가능한 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 ZR/ZE 루신 지퍼 쌍 결합을 이용하여 암 세포를 진단 및 진단된 암 세포를 특이적으로 치료할 수 있는 암 진단 및 치료용 조성물을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 암 세포 표면 수용체에 특이적인 항체와 ZR 펩타이드가 융합된 암 진단용 융합단백질; 및 ZE 펩타이드가 표면에 고정되어 있고, 그 내부에 암 치료를 위한 유전자 또는 약물을 함유하는 암 치료용 나노에멀젼을 포함하는, 암 진단 후에 선택적으로 암을 치료할 수 있는 암 진단 및 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 암 진단 및 치료용 조성물은 암 세포 표면 수용체에 특이적인 항체와 ZR 펩타이드가 융합된 암 진단용 융합단백질을 이용하여 특정 암 세포만을 검출할 수 있으며, 융합단백질과 ZE 펩타이드가 표면에 고정된 암 치료용 나노에멀젼의 ZR/ZE 루신 지퍼 쌍 결합을 통해 특정 암세포에만 치료물질 전달이 가능한 장점이 있다. 또한, 융합단백질 또는 나노에멀젼에 형광물질을 고정시켜 다중 영상 분석이 가능하므로, 유방암, 간암, 췌장암, 뇌암, 위암, 폐암, 식도암, 대장암, 전립선암, 신장암, 난소암 등의 암 질환의 효과적인 진단 및 치료제 개발에 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 루신 지퍼 쌍을 이용한 암 진단 및 치료에 있어서, 암 세포 표면 수용체에 특이적인 항체와 ZR 펩타이드가 융합된 암 진단용 융합단백질 및 ZE 펩타이드가 표면에 고정된 암 치료용 나노에멀젼에 관한 모식도이다.
도 2는 ZR/ZE 루신 지퍼 쌍 결합에 대한 모식도이다.
도 3의 A는 암 세포 표면 수용체에 특이적인 항체와 ZR 펩타이드가 융합된 암 진단용 융합단백질인 ZR-Herceptin Fab 단백질의 발현량을 확인한 SDS-PAGE 결과를 나타낸 것이고(1번레인: 마커, 2번레인: 4D5Fab항체-ZR 융합단백질), B는 암 세포 표면 수용체에 특이적인 항체와 ZR 펩타이드가 융합된 암 진단용 융합단백질인 ZR-Herceptin Fab 단백질의 발현량을 확인한 웨스턴 블랏 결과를 나타낸 것이다 (레인 1~3 : 4D5Fab항체-ZR 융합단백질 함유분획 1~3) .
도 4는 ZE 펩타이드가 표면에 고정된 암 치료용 나노에멀젼인 ZE-Rhodamin-PFCE의 파장 분석(A), 세포 독성(B) 및 ZE-Rhodamin-PFCE의 특징을 수치화한(C) 데이타이다.
도 5는 항체-세포 및 ZR/ZE 루신 지퍼 쌍의 결합을 유세포분석기(FACS)로 확인한 데이타이다.
도 6은 항체-세포 및 ZR/ZE 루신 지퍼 쌍의 결합을 공초점 현미경을 통해 확인한 데이터이다.
도 7은 4D5 항체의 아미노산 서열이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 일 관점에서, 암 세포 표면 수용체에 특이적인 항체와 ZR 펩타이드가 융합된 암 진단용 융합단백질; 및 ZE 펩타이드가 표면에 고정되어 있고, 그 내부에 암 치료를 위한 유전자 또는 약물을 함유하는 암 치료용 나노에멀젼을 포함하는, 암 진단 후에 선택적으로 암을 치료할 수 있는 암 진단 및 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 암 진단 및 치료용 조성물은 도 1에 나타낸 바와 같이, 암 세포 표면 수용체에 특이적인 항체와 ZR 펩타이드가 융합된 암 진단용 융합단백질이 타겟 세포 표면의 수용체(항원)에 특이적으로 결합을 하므로, 타겟세포를 검출할 수 있으며, ZE 펩타이드가 표면에 고정되어 있고, 그 내부에 암 치료를 위한 유전자 또는 약물을 함유하는 암 치료용 나노에멀젼은 형성된 타켓세포-융합단백질 복합체의 ZR 펩타이드와 ZE/ZR 루신 지퍼 쌍 결합을 통해 타겟 세포만을 선택적으로 치료제를 전달할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 ZR 펩타이드는 서열번호 2의 아미노산 서열(LEI RAAFLRR RNTALRT RVAELRQ RVQRLRN IVSQYET RYGPL)로 표시되며, ZE 펩타이드는 서열번호 3의 아미노산 서열(LEI EAAFLEQ ENTALET EVAELEQ EVQRLEN IVSQYET RYGPL)로 표시될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 나노에멀젼은 내부에 암 치료를 위한 유전자 또는 약물를 포함하는 치료제를 함유할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 암은 유방암, 간암, 췌장암, 뇌암, 위암, 폐암, 식도암, 대장암, 전립선암, 신장암, 난소암으로 구성된 군에서 선택될 수 있으며, 본 발명에서는 바람직하게 유방암을 타겟으로 하였다. 상기 유방암을 타겟으로 하는 경우에, 암 세포 표면 수용체는 HER2(Human Epidermal growth factor Receptor 2 protein)인 것을 특징으로 한다. 본 발명에서는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는, 유방암 세포의 표면 수용체인 HER2에 특이적인 항체와 ZR 펩타이드가 융합된 암 진단용 융합단백질을 제조하여 사용하였다.
본 발명에서는 루신 지퍼 쌍을 이용하는 암 진단 및 치료 시스템에 대한 효과를 확인하기 위해 임의적으로 유방암을 타겟으로 한 것으로, 유방암 진단에 제한되는 것은 아니며, 다양한 종류의 암 세포 표면 수용체에 특이적인 항체와 ZR 펩타이드를 융합시킨 암 진단용 융합단백질을 이용할 수 있다는 것은 당업계에 기술자들에게 자명한 사항이다.
본 발명에 있어서, 상기 암 진단용 융합단백질 및 ZE 펩타이드가 표면에 고정된 암 치료용 나노에멀젼은 추가로 형광물질이 결합되어 있으며, 상기 형광물질은 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC, 오레곤 그린(Oregon green), 알렉사 플루오로(Alexa Fluor), FAM, JOE, ROX, HEX, 텍사스 레드(Texas Red), TET, TRITC, TAMRA, 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine) 염료로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다. 하지만, 이에 한정되지 않고 당업계에 공지된 형광물질은 제한없이 사용가능하며, 본 발명에서는 바람직하게 시아닌(Cyanine) 계열 염료인 Cy5, 플루오레세인이소티오시안산염(Fluorescein isothiocyanate; FITC) 및 로다민 레드를 사용하였다.
본 발명에서 "ZE/ZR 루신 지퍼 쌍(ZE/ZR Leucine zipper pair)"은 ZE 펩타이드와 ZR 펩타이드가 헤테로다이머를 형성하는 것을 의미하며(도 2), ZE/ZR 헤테로다이머 루신 지퍼 쌍(heterodimeric leucine zipper pair)은 암컷 혈액 내에 존재하는 난황단백질의 전구체인 비텔로제닌 결합 단백질 (vitellogenin-binding protein; VBP)의 B-Zip 호모다이머에서 유래하였다.
도 2의 ZE/ZR 루신 지퍼 쌍의 7개 부분 중에서 처음 4 부분의 e 및 g에 위치해 있는 모든 잔기를 각각 글루탐산(glutamic acid) 또는 아르기닌(arginine)으로 변경하여 산성 펩타이드 ZE(acidic peptide ZE) 및 염기성 펩타이드 ZR(basic peptide ZR)를 제조하는 것으로 알려져 있다. 기존의 ZE 및 ZR 호모다이머는 전기 반발력(electrostatic repulsions)의 4 쌍이 존재하는 것으로 알려져 있으나, 상기 잔기 변경으로 인해 ZE/ZR 헤테로다이머는 친화적 염다리(attractive salt bridge)가 4쌍이 존재하게 되어 결합력이 증가하게 된다. Moll 등은 이형접합체의 친화력이 마이크로 몰 범위에 있는 동안 ZE/ZR 루신 지퍼 시스템은 스트렙타비딘/바이오틴 시스템과 유사한 10 내지 15M의 이형접합체 친화력을 가지고 있다고 보고하고 있다 (Moll, J. R. et al., Protein Sci., 10:649, 2001).
본 발명의 "HER2"는 표피 성장 수용체(Epidermal growth factor receptor 2, erbB-2, HER2, Neu, CD340, p185)로, 185 kDa 크기의 제1형 막통과 수용체 티로신 키나아제(type 1 transmembrane receptor tyrosine kinase)로서, 포유동물 세포의 분화 및 증식을 촉진한다고 알려져 있다. 한편, 성체에서 상기 HER2/neu가 비정상적으로 활성화되는 경우에는 암의 발생에 관여하는 것으로 알려져 있다. 특히, 유방암 또는 난소암 환자들의 20 내지 30%는 HER2/neu가 과발현되고 있으며, 이는 유방암, 난소암 또는 위암의 안 좋은 예후와 관련이 있다. 따라서, 유방암 치료 관련해서 HER2에 특이적인 항체인 허셉틴(Herceptin; 또는 Trastuzumab)이 개발되었으머, 상기 항체는 조기-단계와 전이성 HER2-양성 유방암 둘 다에 대한 고도로 효과적인 치료이며, 이들 환자에 대한 표준 치료로 사용된다.
본 발명의 양태에서는 암 진단 및 치료용 조성물을 이용하여 유방암을 진단 및 치료하기 위해, 허셉틴(Herceptin) 항체인 Fab 단편 형태인 4D5 항체와 ZR 펩타이드(LEI RAAFLRR RNTALRT RVAELRQ RVQRLRN IVSQYET RYGPL)가 융합된 융합단백질을 제조하였으며 (도 3), 유방암 세포주를 타켓팅하여 세포 표면 수용체의 결합여부 확인 및 추후 암 세포를 효과적으로 검출하기 위해 형광물질인 Cy5 또는 플루오레세인이소티오시안산염(Fluorescein isothiocyanate; FITC)를 추가로 결합시켜 사용하였다.
본 발명에서는 암 세포 타겟팅을 위해 암 세포 표면 특이적인 항체와 ZR 펩타이드를 융합시켜 사용하였으나, 표적세포 표면의 분자(molecule), 리간드(ligand) 또는 수용체(receptor) 등의 표적물질을 선택적으로 인식(recognition)/결합(binding)할 수 있는 물질이라면 어느 것이든 사용가능하며, 예를 들면 핵산분자(DNA 또는 RNA), 단백질, 항체, 항원, 앱타머(RNA, DNA 및 펩타이드 앱타머), 수용체, 호르몬, 스트렙타비딘, 아비딘, 바이오틴, 렉틴, 리간드, 아고니스트, 안타고니스트, 효소, 조효소, 무기이온, 효소보조인자, 당, 지질, 효소기질, 합텐(hapten), 뉴트라비딘(neutravidin), 프로테인 A, 프로테인 G, 셀렉틴 (selectin), 칼슘 설페이트 및 기체 결합제(예: Pt, Pd, Au, Ag, Nb, Ir, Rh 및 Ru) 등을, 바람직하게는 바이오틴, 스트렙타비딘, 아비딘, 항체, 앱타머, 폴리펩타이드, 펩타이드, 리간드, 수용체, 렉틴, 당, 지질, 당지질 또는 핵산 등을 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 표적물질은 분리(또는 분리와 검출, 또는 분리, 검출 및 정량)하고자 하는 시료 내 물질을 의미하며, 구체적으로 핵산분자(DNA 또는 RNA), 단백질, 펩타이드, 항원, 당, 지질, 세균, 바이러스, 세포, 유기 화합물, 무기화합물, 금속 및 무기이온을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 시료는 생물학적 시료, 화학적 시료 및 환경 시료를 포함하며, 상기 생물학적 시료 는 예컨대 혈액, 혈장, 혈청, 바이러스, 세균, 조직, 세포, 림프, 골수액, 타액, 우유, 소변, 분변, 안구액, 정액, 뇌 추출물, 척수액, 관절액, 흉선액, 복수, 양막액, 세포 조직액 및 세포 배양액을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서는 ZE 펩타이드가 표면에 고정된 암 치료용 나노에멀젼을 제조하는 과정에서 암 진단용 융합단백질과의 결합정도를 확인하기 위해 염기성 염료인 로다민(Rhodamin)을 결합시켰으며, 형광물질이 부착된 나노에멀젼은 치료뿐만 아니라 다중 영상 분석에도 사용할 수 있다.
ZE 펩타이드가 표면에 고정된 암 치료용 나노에멀젼의 제조방법은 구체적으로, (a) 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine), 콜레스테롤, DSPE-mPEG2000(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol), DPPE-rhodamine (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissaminerhodamine B sulphonyl), DSPE-PEG3400-NH2(N-(aminopropylpolyethyleneglycol)carbamyl-distearoylphosphatidyl ethanolamine)을 클로로포름에 용해시킨 다음, 클로로포름을 증발시켜 얇은 지질막을 형성시키는 단계; (b) 상기 지질막에 증류수를 처리한 다음, 초음파로 분산시켜 리포좀 현탁액을 제조하는 단계; (c) 상기 현탁액에 유화제 수액액 및 퍼플루오르카본을 혼합하여 나노에멀전을 제조하는 단계; 및 (d) 상기 제조된 나노에멀젼 표면에 ZE 펩타이드를 공유결합 시키는 단계를 포함하는 방법으로 제조될 수 있다.
본 발명의 양태에서는 73 mol% 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine), 20 mol% 콜레스테롤, 3 mol% DSPE-mPEG2000(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol), 1 mol% DPPE-로다민 (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulphonyl), 2.6 mol% DSPE-PEG3400-NH2(N-(aminopropylpolyethyleneglycol)carbamyl-distearoylphosphatidyl ethanolamine)을 클로로포름에 용해시켜 나노에멀젼을 제조하였으며, 상기 (d) 단계에서 제조된 나노에멀젼에 ZE 펩타이드를 결합시키기 위해, 10 mM EDC(1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride) 용액을 이용하여 카르복실기를 가지는 ZE 펩타이드를 활성화시킨 후, 제조된 나노에멀젼과 공유 결합시켜 ZE-Rhodamin-PFCE을 제조하였다.
상기에서 제조된 나노에멀전은 당업계에 공지된 나노에멀젼 또는 나노리포좀 제조에 사용하는 재료를 제한 없이 사용할 수 있으며, 제조방법 또한 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있다. 또한 사용 재료의 종류 및 농도에 따라 100nm 내지 10㎛크기로 조절할 수 있으며, 목적에 따라 첨가되는 암 치료제에 의해서도 크기가 조절될 수 있다.
나노에멀전은 필름형성물질, 인지질, 음전하 화합물, 아민기를 가지는 화합물 및 다이설파이드기를 가지는 화합물을 포함할 수 있으며, 필름형성물질로는 DPPC(1,2-dipalmitory-sn-glycero-3-phosphatidylcholine), DDPC (1,2-didecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DEPC(1,2-didecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DLOPC(1,2-dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DLPC(1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DMPC(1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DOPC(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) 또는 DSPC(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) 등으로 구성된 군에서 선택할 수 있으며, 인지질로는 콜레스테롤(cholesterol) 등을 사용할 수 있다. 또한 음전하 화합물로는 DCP(dicetyl phosphate), DEPA(1,2-dierucoyl-sn-glycero-3-phosphate), DLPA(1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphate), DMPA(1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphate) 또는 DOPA(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphate) 등을, 아민기를 갖는 화합물로는 DPPE(1,2-dipalmitory-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DEPE(1,2-dierucoylsn-glycero-3-phosphoethanolamine), DLPE (1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DMPE(1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine) 또는 DOPE(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine) 등을; 그리고 다이설파이드기를 갖는 화합물로는 DSPE-PEG-SPDP{1,2-distearoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-[PDP(polyethylene glycol)-2000]} 등이 사용될 수 있다.
본 발명에서 제조된 나노에멀젼의 특징을 파악하기 위해 방출 파장 피크(emission peak), 지름(diameter) 및 다분산성(polydispersity; 분산계를 이루는 입자의 크기가 균일하지 않은 성질)를 특정한 결과, ZE 펩타이드가 고정된 나노에멀전의 방출 파장 피크는 592nm, 지름은 123.1±26.9nm, 다분산성은 0.087의 값을 나타냈으며, ZE 펩타이드가 고정화되지 않은 나노에멀젼과 비슷한 값을 가지고 있는 것을 확인하였다. 또한, 유방암 세포주인 SKBR3 및 MDF7 및 일반적인 유방 세포인 MCF10A에 나노에멀젼을 농도별로 처리하였을 때 세포 생존율은 100%로 나타나 독성은 없는 것을 확인하였다 (도 4).
본 발명에서 제조한 4D5Fab항체-ZR 융합단백질의 HER2가 과발현된 세포(SKBR3)를 타켓팅하는지 확인하고, 상기 타겟세포-4D5Fab-ZR 융합단백질 복합체에 ZE-Rhodamin-PFCE를 첨가하여 루신 지퍼 쌍의 선택적 결합(ZR-ZE)을 유세포분석기 (FACS) 실험을 통하여 확인하였다. 융합단백질의 대조군은 HER2 특이적인 항체 이외의 다른 Fab 단편과 ZE 펩타이드가 융합된 융합단백질을 사용하였으며, 세포의 대조군으로는 HER2가 거의 발현되지 않은 유방암 세포주인 MCF7을 사용하였다. 그 결과, 4D5Fab-ZR 융합단백질은(FITC labeling) Her2를 과발현하는 SKBR3세포주에만 선택적으로 결합하고, ZE-Rhodamin-PFCE는 ZR 펩타이드와 지퍼 쌍을 형성하여 타겟세포-4D5Fab-ZR 융합단백질 복합체에 결합하는 것을 확인하였다 (도 5).
또한, 일반 유방 세포인 MCF10A와 SKBR3세포를 사용하여 상기 실험과 동일한 방법으로 공초첨 현미경을 통해 관찰한 결과, SKBR3 세포에만 4D5Fab-ZR 융합단백질이 결합하는 것을 확인하였으며, ZE-Rhodamin-PFCE 역시 ZR 펩타이드와 지퍼 쌍을 형성하여 타겟세포-4D5Fab-ZR 융합단백질 복합체에 결합하는 것을 확인하였다 (도 6).
즉, 본 발명의 루신 지퍼 쌍을 이용한 암 진단 및 치료용 조성물은 타겟으로 하는 암 세포만 특이적으로 검출할 수 있는 것을 확인하였으며, ZR/ZE 루신 지퍼 쌍 결합을 통해 ZE 펩타이드가 표면에 고정된 암 치료용 나노에멀젼(치료제 포함)에 의해 특정 암세포에만 치료물질이 전달가능한 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 암 진단 및 치료용 조성물을 사용하면, (a) 암 세포 표면 수용체에 특이적인 항체와 ZR 펩타이드가 융합된 암 진단용 융합단백질을 이용하여 암 세포를 검출하는 단계; 및 (b) ZE 펩타이드가 표면에 고정된 암 치료용 나노에멀젼을 첨가하고 상기 융합단백질과의 ZR/ZR 루신 지퍼 쌍 결합을 통해 검출된 암 세포 특이적으로 치료제를 전달하여 암을 치료하는 단계;를 포함하는 암 진단 및 치료방법에 사용할 수도 있다.
본 발명의 암 진단 및 치료용 조성물은 암세포 또는 암조직의 표적 및 진단에 유용하게 사용될 수 있으며, 암 진단 또는 치료를 위해 경구 또는 비경구 투여 형태로 제형화될 수 있다. 암 치료의 경우, 암세포 또는 그들의 전이를 치료하기 위하여, 또는 암의 성장을 억제하기 위하여 약학적으로 효과적인 양으로 투여될 수 있다. 암 종류, 환자의 연령, 체중, 증상의 특성 및 정도, 현재 치료법의 종류, 치료 회수, 투여 형태 및 경로 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 해당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 상기한 약리학적 또는 생리학적 성분을 함께 투여하거나 순차적으로 투여할 수 있으며, 또한 추가의 종래의 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 이러한 투여는 단일 또는 다중 투여일 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명에서, '투여'는 어떠한 적절한 방법으로 개체에 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하면 본 발명의 항체를 포함하는 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 그러나 경구 투여시, 단백질은 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 하는 것이 바람직하다. 또한, 제약 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
[실시예 1] 암 세포 특이적인 항체 및 ZR 펩타이드의 융합단백질 발현 및 정제
본 발명에서 암 세포 특이적인 항체 및 ZR 펩타이드의 융합단백질을 제조하기 위해 유방암 세포에서 과발현되는 것으로 알려진 HER2에 특이적인 항체를 사용하였으며, 허셉틴(Herceptin) 항체인 Fab 단편 형태인 4D5 항체와 ZR 펩타이드(LEI RAAFLRR RNTALRT RVAELRQ RVQRLRN IVSQYET RYGPL; 서열번호 2-바이오니아, 한국)가 융합된 융합단백질을 제조하였다.
4D5Fab항체-ZR 펩타이드 유전자와 pKB-Fab100 벡터는 Not (NEB cat No. r0189s)을 사용하여 37℃에서 1시간 30분 동안 처리한 후 정제하였으며, 정제된 pKB-Fab100 벡터와 ZR 펩타이드를 몰/2몰 비율로 사용하여 20㎕의 10 x 리가아제(ligase. DaKaRa cat No. 2011B) 완충용액, 10㎕의 T4 DNA 리가아제(ligase)와 살균 증류수를 넣어 총 부피가 200 ㎕가 되도록 한 후, 16℃에서 하룻밤 동안 반응시켜 라이게이션(ligation)시켜, ZR 펩타이드 유전자가 포함된 pKB-Fab100 벡터를 제조하였다.
그 후, 2.5 kV, 200 O, 25 D 조건으로 엘렉트로포레이션(BioRad Gene Pulser Xcell 이용) 하여, 대장균(E.coli)인 TG1 세포(ATCC 39078)에 형질전환(transfection)시켜, 4D5Fab항체-ZR 융합단백질 생산능을 가지는 재조합 미생물을 제조하였다.
상기 4D5Fab항체-ZR 융합단백질 생산능을 가지는 TG1 세포를 암피실린(ampicilline, 100 ㎍/㎖)을 함유하고 있는 2YT 배지(Bactotryptone 16 g, 효모 추출물(Yeast extract) 10 g, NaCl 수용액(NaCl 5 g in 1 liter H2O, pH 7.0)에 넣고 37℃에서 배양하여 단일콜로니(single colony)를 선별하였으며, 선별된 콜로니를 2YT 앰피실린(ampicillin) 배지 4ℓ에서 OD600값이 0.6 ~ 0.7이 되도록 37℃에서 200rpm으로 배양하였다. OD600값이 0.6 ~ 0.7이 되면, 100μM IPTG(isopropyl-βD-thiogalactopyranoside)를 첨가하여 26℃, 200rpm으로 16시간 동안 배양하였다. IPTG에 의해 인덕션(induction)된 세포를 4000rpm에서 15분 동안 원심분리한 다음, 상등액을 버리고 남아있는 세포펠렛(pellet)을 40㎖의 TES 버퍼(0.2M Tris-HCl, PH8.0; 0.5mM EDTA; 0.5M sucrose)로 현탁(suspention)시켰으며, 현탁된 세포에 라이소자임(lysozyme; 10㎎/㎖ in TES buffer, SIGMA-ADRICH L6876) 2.5㎖을 첨가하였다. 라이소자임을 첨가한 후, 차가운 증류수(약 1 ~ 4 ℃)로 1:2로 희석된 TES 버퍼를 250㎖ 첨가하여 30분 동안 얼음(ice)에서 삼투압 쇼크(osmotic shock)를 준 다음, 12000ｇ에서 10분 동안 원심분리(hanil. supra 22k)하였다.
4D5Fab항체-ZR 융합단백질를 정제하기 위해, 주변세포질 추출(periplasm extraction)(Bothmann H et.al., Nat Biotechnol., 16(4):376, 1998)을 이용하였으며, 도 3에 나타낸 바와 같이, 4D5Fab항체-ZR 융합단백질가 발현되는 것을 확인하였다.
[실시예 2] ZE 펩타이드가 고정된 나노에멀전 제조
본 발명의 ZE 펩타이드(LEI EAAFLEQ ENTALET EVAELEQ EVQRLEN IVSQYET RYGPL; 서열번호 3)가 고정된 나노에멀전을 제조하였으며, 암 진단용 융합단백질과의 결합정도를 확인하기 위해 염기성 염료인 로다민(Rhodamin)을 결합시켰다.
먼저, 73 mol% 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine;, Egg PC, Avanti Polar Lipids Inc., 미국), 20 mol% 콜레스테롤(Sigma-Aldrich Co., 미국), 3 mol% DSPE-mPEG2000(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)2000; Avanti Polar Lipids Inc., 미국), 1 mol% DPPE-rhodamine(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulphonyl; Avanti Polar LipidsInc., 미국), 2.6 mol% DSPE-PEG3400-℃NH2(N-(aminopropylpolyethyleneglycol)carbamyl-distearoylphosphatidyl ethanolamine)을 클로로포름에 용해시킨 후, 감압장치하에서 클로로포름을 증발시키고, 클로로포름이 증발된 상기 복합체를 50℃ 진공 오븐에서 하루동안 건조시켜 얇은 지질막을 형성시켰다.
그 다음, 상기 막에 멸균된 3차 증류수를 넣은 후 초음파로 10분간 분산시켜 리포좀 현탁액을 제조하였으며, 상기 제조된 현탁액에 2.0% w/v 유화제 수액액, 40% v/v 퍼플루오르카본을 넣은 후, 4분 동안 호모게나이져(homogenizer; Fisher Scientific, 미국)로 혼합하였다. 상기 혼합액을 미세유동화기 (M-110s Microfluidizer, microfluidics Co., USA)을 사용하여 20000psi로 저온에서 4분 동안 현탁시킨 다음, 제조된 나노에멀젼을 탈염 컬럼 (desalting column, GE Healthcare, UK)을 이용하여 잔여물을 제거하고 4℃에서 냉장보관하였다.
제조된 나노에멀젼에 ZE 펩타이드를 결합시키기 위해, 10 mM EDC(1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride) 용액을 이용하여 카르복실기를 가지는 ZE 펩타이드 (20 mg/ml)를 활성화시킨 후, 제조된 나노에멀젼과 혼합하여 실온에서 2 시간 동안 반응시켜 두 물질을 공유 결합시켰으며, 최종적으로 ZE 펩타이드가 표면에 고정된 나노에멀젼(ZE-Rhodamin-PFCE)을 제조하였다.
[실시예 3] ZE 펩타이드가 표면에 고정된 나노에멀젼 특성 확인 및 세포독성 확인
3-1 : 특성 확인
실시예 2에서 제조한 ZE-Rhodamin-PFCE의 특성을 확인하기 위해, 방출 파장 피크(emission peak), 지름(diameter) 및 다분산성(polydispersity; 분산계를 이루는 입자의 크기가 균일하지 않은 성질)을 측정하였으며, 대조군으로는 ZE 펩타이드를 고정시키지 않은 나노에멀전을 사용하였다.
나노에멀젼의 형광특성을 조사하기 위하여 UV-vis 및 형광스펙트럼을 측정하였다. UV-vis 스펙트럼 (Beckman Coulter, USA)은 400 ~ 700 nm의 영역에서 측정하였고 형광스펙트럼 (LS55 Fluorescence spectrometer, PerkinElmer, USA)은 500 ~ 800 nm의 영역에서 측정한 결과 제조된 나노에멀젼이 흡수 파장 570 nm, 발광 파장 600 nm에서 최고의 세기를 가지는 것을 확인하였다.
나노에멀젼의 지름과 다분산성은 DLS (Dynamic Light Scattering, Otsuka, Japan)을 이용하여 측정한 결과, 나노에멀젼의 직경이 80 ~ 180 nm임을 확인 할 수 있었고, 다분산성은 0.087의 값을 나타냈으며, ZE 펩타이드가 고정화되지 않은 나노에멀젼과 비슷한 값을 가지고 있는 것을 확인하였다 (도 4A 및 C).
그 결과, ZE 펩타이드가 고정된 나노에멀전의 방출 파장 피크는 592nm, 지름은 123.1±26.9nm, 다분산성은 0.087의 값을 나타냈으며, ZE 펩타이드가 고정화되지 않은 나노에멀젼과 비슷한 값을 가지고 있는 것을 확인하였다 (도 4A 및 C).
3-2 : 세포독성 확인
실시예 2에서 제조한 ZE-Rhodamin-PFCE의 세포독성 여부를 확인하기 위해, 유방암 세포주인 SKBR3 및 MDF7 및 일반적인 유방 세포인 MCF10A에 나노에멀젼을 농도별(0.032μL/mL, 0.16 μL/mL , 0.8 μL/mL, 4 μL/mL, 20 μL/mL 및 100 μL/mL) 로 각각 처리한 후, 세포 생존율을 MTT 어세이로 측정하였다.
제조된 나노에멀젼의 세포독성을 조사하기 위해 96-웰 플레이트 (96-well plate)에 각각의 세포를 증식시켰다. 세포 증식을 중지시키기 위해 혈청이 제거된 배양액에 시료들을 각 농도로 희석한 후, 세포증식 된 각 웰 (well)에 100 μL 씩 첨가하고 37˚C, 5% CO2 배양기에서 24, 48 시간 배양한 다음 MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) 검색법으로 시료가 첨가된 각 웰의 살아남은 수를 시료가 첨가되지 않은 세포 대조군 (control well)과 비교하여 80%의 세포가 살아남은 시료의 농도를 CC80 (80% Cytotoxic Concentration)으로 결정하였다. MTT 검색법은 살아남은 세포의 미토콘드리아 탈수소효소 (mitochondrial dehydrogenase)가 노란색을 띤 MTT를 보라색을 지닌 포르마잔 (formazan)으로 환원시키고, 이 생성물을 유기용매로 녹여 흡광를 측정하여 살아있는 세포와 죽은 세포의 수를 상대적으로 비교하였다.
그 결과, 나노에멀젼을 농도에 상관없이 SKBR3, MDF7 및 MCF10A 모두 약 100%의 생존율을 보이는 것을 확인하였으며, 본 발명의 나노에멀젼의 세포에 대한 독성이 없는 것을 확인하였다 (도 4B 및 C).
[실시예 4] 암 세포 표면 수용체에 특이적인 항체와 ZR 펩타이드가 융합된 암 진단용 융합단백질 및 ZE 펩타이드가 표면에 고정된 암 치료용 나노에멀젼의 효능 측정
본 발명에서 제조한 4D5Fab항체-ZR 융합단백질의 HER2가 과발현된 세포(SKBR3)를 타켓팅하는지 확인하고, 상기 타겟세포-4D5Fab-ZR 융합단백질 복합체에 ZE-Rhodamin-PFCE를 첨가하여 루신 지퍼 쌍의 선택적 결합(ZR-ZE)을 유세포분석기 (FACS) 실험을 통하여 확인하였다.
융합단백질의 대조군은 HER2 특이적인 항체 이외의 다른 Fab 단편(SIGMA, IgG Fab)과 ZE 펩타이드가 융합된 융합단백질을 실시예 1과 같은 방법으로 제조하여 사용하였으며, 세포의 대조군으로는 HER2가 거의 발현되지 않은 유방암 세포주인 MCF7을 사용하였다.
그 결과, 4D5Fab-ZR 융합단백질은(FITC labeling) Her2를 과발현하는 SKBR3세포주에만 선택적으로 결합하고, ZE-Rhodamin-PFCE는 ZR 펩타이드와 지퍼 쌍을 형성하여 타겟세포-4D5Fab-ZR 융합단백질 복합체에 결합하는 것을 확인하였다 (도 5).
또한, 일반 유방 세포인 MCF10A와 SKBR3세포를 배양하여 4D5Fab항체-ZR 융합단백질 및 ZE-Rhodamin-PFCE 처리한 다음, 공초점 현미경을 통해 관찰하였다.
4D5Fab항체-ZR 융합단백질 및 ZE-Rhodamin-PFCE 이미징을 위하여 각각의 세포들을 8웰 플레이트에 2*104세포/웰의 농도로 분주하고, 10 ug/ml 4D5Fab항체-ZR 융합단백질을 1시간동안 처리 세척한 후 10 ug/ml ZE-Rhodamin-PFCE를 1시간 처리하고 세포를 세척, 고정하여 형광이미징을 측정하였다.
그 결과, SKBR3 세포에만 4D5Fab-ZR 융합단백질이 결합하는 것을 확인하였으며, ZE-Rhodamin-PFCE 역시 ZR 펩타이드와 지퍼 쌍을 형성하여 타겟세포-4D5Fab-ZR 융합단백질 복합체에 결합하는 것을 확인하였다 (도 6).
이상으로, 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명은 암 세포 표면 수용체에 특이적인 항체와 ZR 펩타이드가 융합된 암 진단용 융합단백질을 이용하여 특정 암 세포만을 검출할 수 있으며, 융합단백질과 ZE 펩타이드가 표면에 고정된 암 치료용 나노에멀젼의 ZR/ZE 루신 지퍼 쌍 결합을 통해 특정 암세포에만 치료물질 전달이 가능하다.

Claims (9)

  1. 암 세포 표면 수용체에 특이적인 항체와 ZR 펩타이드가 융합된 암 진단용 융합단백질; 및 ZE 펩타이드가 표면에 고정되어 있고, 그 내부에 암 치료를 위한 유전자 또는 약물을 함유하는 암 치료용 나노에멀젼을 포함하는, 암 진단 후에 선택적으로 암을 치료할 수 있는 암 진단 및 치료용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 ZR 펩타이드는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되며, ZE 펩타이드는 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 것을 암 진단 및 치료용 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 암은 유방암, 간암, 췌장암, 뇌암, 위암, 폐암, 식도암, 대장암, 전립선암, 신장암, 난소암으로 구성된 군에서 선택되는 암 진단 및 치료용 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 세포 표면 수용체는 HER2(Human Epidermal growth factor Receptor 2)인 암 진단 및 치료용 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 암 진단용 융합단백질 또는 암 치료용 나노에멀젼은 추가로 형광물질이 결합되어 있는 암 진단 및 치료용 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 형광물질은 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC, 오레곤 그린(Oregon green), 알렉사 플루오로(Alexa Fluor), FAM, JOE, ROX, HEX, 텍사스 레드(Texas Red), TET, TRITC, TAMRA, 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine) 염료로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상인 암 진단 및 치료용 조성물.
  7. (a) 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine), 콜레스테롤, DSPE-mPEG2000(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)], DPPE-rhodamine (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissaminerhodamineBsulphonyl), 및 DSPE-PEG3400-NH2(N-(aminopropylpolyethyleneglycol)carbamyl-distearoylphosphatidylethanolamine)을 클로로포름에 용해시킨 다음, 클로로포름을 증발시켜 얇은 지질막을 형성시키는 단계;
    (b) 상기 지질막에 증류수를 처리한 다음, 초음파로 분산시켜 리포좀 현탁액을 제조하는 단계;
    (c) 상기 현탁액에 유화제 수액액 및 퍼플루오르카본을 혼합하여 나노에멀전을 제조하는 단계; 및
    (d) 상기 제조된 나노에멀젼 표면에 ZE 펩타이드를 공유결합 시키는 단계를 포함하는, ZE 펩타이드가 표면에 고정된 나노에멀젼을 제조하는 방법.
  8. (a) 대상체에 암 세포 표면 수용체에 특이적인 항체와 ZR 펩타이드가 융합된 암 진단용 융합단백질을 투여하는 단계; 및
    (b) 상기 대상체가 암 환자인 것으로 확인되는 경우, 상기 대상체에 ZE 펩타이드가 표면에 고정되어 있고 그 내부에 암 치료를 위한 유전자 또는 약물을 함유하는 암 치료용 나노에멀젼을 투여하는 단계를 포함하는, 암 진단 후에 선택적으로 암을 치료하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 세포 표면 수용체는 HER2(Human Epidermal growth factor Receptor 2)이고, 상기 암은 유방암인 방법.
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