WO2015170795A1 - 자가포식 활성제 또는 억제제를 스크리닝하는 방법 - Google Patents

자가포식 활성제 또는 억제제를 스크리닝하는 방법 Download PDF

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Definitions

  • the present invention is made by the task number E0131601 under the support of the Ministry of Science, ICT and Future Planning, the research management specialized organization of the project is the Korea Food Research Institute, the research project name is “Korea Food Research Institute main business”, the research title is “traditional food phytochemi cal s Research on the analysis of in vivo dynamics ", the lead institution is Korea Food Research Institute.
  • the research period is from January 01, 2013 to December 31, 2013.
  • the present invention relates to a method for screening autophagy activators or inhibitors.
  • autophagy The general function of autophagy is that inside cells lacking nutrients, the cells are surrounded by plasmids (membrane vacuole, autophagosome), which are composed of lipid 2-layers of their unnecessary proteins and aging organelles. It is a system that replenishes intracellular nutrients by inducing degradation of substances and plays an important role in maintaining homeostasis of cells. It is known that autophagy plays an important role in regulating various human physiological and pathological conditions such as cell growth, differentiation, metabolism regulation, cancer brain disease, immunity, etc. Autophagy is divided into macroautophagy, mi croautophagy, and Chaperone Medi ated Autophagy (CMA), depending on the mechanism and function. While being induced differently in individual forms.
  • CMA Chaperone Medi ated Autophagy
  • autophagy occurs in normal cell conditions, but in two cases such as nutrient deficiency, giant autophagy is rapidly induced and 6-8 hours. When stress is maintained, giant autophagy gradually decreases and CMA induction occurs in 12-24 hours.
  • Autophagy is classified according to the type of cargo that is broken down, including mi tophagy, which protects cells from damage by selectively removing damaged mitochondria, ribosomes, and endop lasmi c. According to the process of decomposing ret i culum and peroxi somes (ri bophagy), reticle phage (ret iculphagy) and perxophagy (pexophagy), respectively.
  • macrophages are also introduced to macrolipid autophagy (macrol ipophagy) that is involved in the direct degradation of intracellular fat cells (l ipid droplet) produced by fatty acids.
  • macrolipid autophagy macrolipid autophagy
  • l ipid droplet intracellular fat cells
  • EP 2383294 discloses a technique for treating or diagnosing neurodegenerative diseases using Thrll9 phosphorylation-specific antibody of Becl inl
  • US 6432914 is Becl inl
  • a technique for treating cancer using itself as a protein drug is disclosed
  • US 5858669 discloses a technique for diagnosing cancer using a mutation of Bec l inl.
  • the present inventors sought to develop a method capable of screening autophagy activators or inhibitors capable of regulating autophagy, which play a critical role in maintaining homeostasis of cells.
  • phosphorylation of the 30 th ser ine amino acid residue of the Becl inl protein was completed by identifying the extent to which autophagy activators or inhibitors can be screened by analyzing the extent.
  • Another object of the invention is that the 30 th serine amino acid residue is phosphorylated
  • the invention provides a method for screening an autophagy activator or inhibitor comprising the following steps:
  • test substance is determined to be an autophagy activator, and when phosphorylation of the Beclinl protein is down-regulated.
  • the test substance is determined as an autophagy inhibitor.
  • the present inventors sought to develop a method capable of screening autophagy activators or inhibitors capable of regulating autophagy, which plays an important role in maintaining homeostasis of cells. As a result, the phosphorylation of the 30th serine amino acid residue of Beclinl protein was analyzed to identify autophagy activators or inhibitors.
  • the cells surround their unnecessary proteins, aged organelles, and the like by incorporating the lysosone into a vesicle composed of lipid bilayers to induce intracellular nutrients to decompose the enclosed internal substances.
  • Resupply system in the environment in which nutrients are lacking, the cells surround their unnecessary proteins, aged organelles, and the like by incorporating the lysosone into a vesicle composed of lipid bilayers to induce intracellular nutrients to decompose the enclosed internal substances.
  • test substance to be analyzed is contacted with a cell containing Beclinl protein.
  • the cell containing the Beclinl protein may use any animal cell in the art, for example, 293T cells, HEK293T cells, MEF touse Embryonic Fibroblasts) or HeLa cells.
  • the medium that can be used for culturing the animal cells may be any medium commonly used for culturing animal cells, for example, Eagles' MEM (Eagle's minimum essential medium, Eagle, H. Science 130: 432 (1959)), a-MEM (Stanner, CP. Et al., Nat. New Biol. 230: 52 (1971)), Iscove's MEM (Iscove, N. et al., J. Exp. Med. 147: 923 (1978)), 199 medium (Morgan et al., Proc. Soc. Exp. Bio. Med., 73: 1 (1950)), CMRL 1066, PMI 1640 (Moore et al., J. Amer. Med. Assoc.
  • the test substance to be analyzed is first contacted with a cell containing the Beclinl protein.
  • test material refers to the 30th By serine means an unknown substance used in screening to examine whether it affects the phosphorylation of amino acid residues.
  • the test substance includes, but is not limited to, chemicals, peptides and natural extracts.
  • the test substance analyzed by the screening method of the present invention is a single compound or a combination of compounds (eg, a natural extract or cell or tissue culture). Test substances can be obtained from libraries of synthetic or natural compounds. Methods of obtaining libraries of such compounds are known in the art. Synthetic compound libraries are described in Maybridge Chemical Co.
  • Test substances can be obtained by various combination library methods known in the art, for example, biological libraries, spatially addressable parallel solid phase or so kit ion phase libraries, decon Synthetic library methods requiring bolsion, "1-bead 1-compound” library methods, and synthetic library methods using affinity chromatography screening. Methods of synthesizing molecular libraries are described in DeWitt et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6909, 1993; Erb et al. Proc.
  • the degree of phosphorylation of the 30 th serine amino acid residue of the Beclinl protein is analyzed.
  • the test substance is determined to be an autophagy activator, and the phosphorylation of the Beclinl protein is down-regulated. If regulated, the test substance is determined to be an autophagy inhibitor.
  • the autophagy actives can be used as pharmaceutical compositions for diagnosing or treating cancer or neurodegenerative diseases (see EP 2383294).
  • up-regulation refers to the degree of phosphorylation of the 30th serine amino acid residue of the Beclinl protein relative to the test substance when autophagy signaling is not activated (e.g., normal state of animal cells). In the case of an increased pattern compared to the untreated control, it was determined that phosphorylation of Beclinl protein was up-regulated.
  • down-regulation refers to known autophagy-inducing activators Amidarone hydrochloride, Prefeldin A, Carbamazepine, Dexamethasone ) Dolsomorphin dihydrochloride, EB 1089 (vitamin D receptor agonist), GF 109203X (protein kinase C inhibitor), L-690,330 (inosyl monophosphate inhibitor), NF 449 (P2X1 antagonist), Niclosamide, Nimodipine, Nitridi3 ⁇ 4 (1: ⁇ 11 1), PI 103 Hydrochloride (Inhibitors of PI 3-kinase, mTOR and DNA-PK), Pipisrin- ⁇ Hydrobromide (1 " 111- (1 hydrobromide), Rapamycin, Rotlerin, SMER 28, Temozolomide, Thapsigargin, Torin, Tunicamycin (Tunicamycin), effervescent (Valproi c)) and the degree of phosphorylation of the 30th
  • Phosphorylation degree of the 30 th serine amino acid residue of the Beclinl protein can be analyzed using any phosphorylation assay in the art.
  • Western blotting (Burnette WN. (1981). 'Western blotting': electrophoret ic transfer of proteins from sodium dodecyl sul f at e-polyacryl amide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detect ion with antibody and radioiodinated protein A ".Analytical Biochemistry 112 (2): 195-203), EL ISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, Lequin R (2005).” Enzyme immunoassay (EIA) / enzyme-1 inked immunosorbent assay (ELISA) ".
  • the analysis of the degree of phosphorylation of the 30 th serine amino acid residues of the Beclinl protein is carried out using an antibody that specifically binds the 30 th serine amino acid residues to the phosphorylated Beclinl protein.
  • the antibody that specifically binds to the phosphorylated Beclinl protein at the 30th serine amino acid residue is an antibody that binds to an epitope consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
  • the present invention provides a method for measuring autophagy activity, comprising contacting a sample with an antibody that specifically binds the Beclinl protein to which the 30th serine amino acid residue is phosphorylated.
  • sample refers to a cultured cell, animal or human brain, eye, heart, intest ine, kidney, liver. ), Tissue, blood, plasma, serum, urine, saliva obtained from lungs, lung, muscle, spleen, or testis body fluids, such as saliva, sweat, or mucus.
  • a diagnostic kit for autophagy-related disease comprising an antibody that specifically binds the Beclinl protein to which the 30th serine amino acid residue is phosphorylated. ..
  • the autophagy-related diseases are neurodegenerative diseases, autoimmune diseases, cardiovascular diseases, metabolic diseases, hyperplastic syndromes, hereditary muscle diseases, muscle diseases or cancer.
  • the present invention provides an antibody in which the 30 th serine amino acid residue specifically binds to phosphorylated Beclinl protein.
  • antibody refers to a specific antibody against a Beclinl protein to which the 30 th serine amino acid residue is phosphorylated, including the complete antibody form as well as the antigen binding fragment of the antibody molecule.
  • a complete antibody is a structure having two full length light chains and two full length heavy chains, each of which is linked by heavy and disulfide bonds.
  • the heavy chain constant region has gamma mu ( ⁇ ), alpha ( ⁇ ), delta ( ⁇ ) and epsilon ( ⁇ ) types and subclasses gamma Kyi), gamma 2 ( ⁇ 2), gamma 3 3), gamma 4 ( ⁇ 4). ), Alpha 1 1) and alpha 2 2).
  • the constant region of the light chain has kappa ( ⁇ ) and lambda ( ⁇ ) types (Cellular and Molecular Immunology, Wonsiewicz, M. J., Ed., Chapter 45, pp. 41-50, WB Saunders Co. Philadelphia, PA (1991); Nisonof f, A., Introduction to Molecular Immunology, 2nd Ed., Chapter 4, pp. 45-65, sinauer Associates Inc., Sunderland, MA ( 1984)).
  • the term "antigen binding fragment” refers to a fragment having antigen binding function and includes Fab, F (ab '), F (ab') 2, Fv and the like.
  • Fab in the antibody fragment has a structure having the variable region of the light and heavy chains, the constant region of the light chain and the first constant region (CH1) of the heavy chain, and has one antigen binding site.
  • F (ab ') 2 antibodies are produced by disulfide bonds of cysteine residues in the hinge region of Fab'.
  • the double-chain Fv (two- chain Fv) is non-covalently bonded to the heavy chain variable region and light chain variable region is attached and short-chain "Fv (single-chain Fv) is generally via a peptide linker and the variable region of the heavy chain variable region of the single-chain Covalently linked or directly linked at the end of C ⁇ can lead to a dimer-like structure such as double-chain FV
  • These antibody fragments can be obtained using proteolytic enzymes. (Eg, restriction digestion of the entire antibody with papain yields Fab and cleavage with pepsin yields F (ab ') 2 fragments), or genes . It can be produced through recombinant technology.
  • the antibody is preferably in the form of Fab or in the form of a complete antibody.
  • the heavy chain constant region may be selected from any one isotype of gamma), mu ( ⁇ ), alpha ( ⁇ ), delta ( ⁇ ) or epsilon ( ⁇ ).
  • the constant regions are gamma l (IgGl), gamma 3 (IgG3) and gamma 4 (IgG4), most preferably the gamma l (IgGl) isotype.
  • the light chain constant region may be kappa or lambda type, preferably kappa type.
  • preferred antibodies of the present invention are in Fab form or IgGl form with kappa ( ⁇ ) light chain and gamma 1 ( ⁇ 1) heavy chain.
  • variable region domain VH comprising an amino acid sequence having sufficient variable region sequence to confer specificity to an antigen and a full length heavy chain comprising three constant region domains CHI, CH2 and CH3 It means all fragments.
  • light chain herein also refers to both the full-length light chain and fragments thereof comprising the variable region domain VL and the constant region domain CL comprising the amino acid sequence with the fragmented variable region sequence for conferring specificity to the antigen. .
  • Beclinl protein antibodies or antigen-binding fragments thereof, wherein the 30th serine amino acid residue is phosphorylated the amino acid sequence described in the attached sequence list within the range that the 30th serine amino acid residue may be specifically phosphorylated. It may comprise a variant of.
  • changes can be made to the amino acid sequence of the antibody to improve the binding affinity and / or other biological properties of the antibody. Such modifications include, for example, deletions, insertions and / or substitutions of amino acid sequence residues of the antibody.
  • amino acid variations are made based on the relative similarity of amino acid chain substituents, such as hydrophobicity, hydrophilicity, charge, size, and the like.
  • amino acid chain substituents such as hydrophobicity, hydrophilicity, charge, size, and the like.
  • arginine, lysine and histidine are all positively charged residues; Alanine, glycine and serine have similar sizes; It can be seen that phenylalanine, tryptophan and tyrosine have a similar shape.
  • arginine, lysine and histidine Alanine, glycine and serine
  • Phenylalanine, tryptophan and tyrosine are biologically equivalent functions.
  • hydropathic idex of amino acids can be considered.
  • Each amino acid is assigned a hydrophobicity index depending on its hydrophobicity and charge: isoleucine (+4.5); Valine (+4.2); Leucine (+3.8); Phenylalanine (+2.8); Cysteine / cysteine (+2.5); Methionine (+1.9); alanine (+1.8); glycine (-0.4); threonine (-0.7); serine (-0.8); tryptophan (-0.9); Tyrosine (-1.3); Plin (X1.6); histidine (-3.2); Glutamate (-3.5); Glutamine (-3.5); Aspartate (—3.5); Asparagine (-3.5); Lysine (-3.9); And arginine (-4.5).
  • Hydrophobic amino acid indexes are very important in contributing to the interactive biological function of proteins. It is known that substitution with amino acids having similar hydrophobicity indexes can retain similar biological activity. Reference to hydrophobic index, the case of introducing a mutation, preferably a substitution between ⁇ within 2, more preferably within ⁇ 1, and more preferably, ⁇ 0, indicating the hydrophobic amino acid index difference of less than 5.
  • hydrophilicity value When introducing a mutation with reference to a hydrophilicity value, Preferably it is less than or equal to 2, More preferably, is less than or equal to 1, More preferably, ⁇ . Substitutions are made between amino acids that exhibit a difference in hydrophilicity within 0.5. Amino acid exchange in proteins that do not alter the activity of the molecule as a whole is known in the art (H. Neurath, RL Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979).
  • the most commonly occurring exchanges are amino acid residues Ala / Ser, Val / Ile, Asp / Glu, Thr / Ser, Ala / Gly, Ala / Thr, Ser / Asn, Ala / Val, Ser / Gly, Thy / Phe, Ala / Pro, Lys / Arg, Asp / Asn, Leu / I le Leu / Val, Ala / Glu, Asp / Gly.
  • an antibody of the present invention or a nucleic acid molecule encoding the same is interpreted to include a sequence that exhibits substantial identity with the sequences listed in the Sequence Listing.
  • the substantial identity is at least 61% when the sequence of the present invention and any other sequence are aligned as best as possible and the aligned sequence is analyzed using algorithms commonly used in the art.
  • homology more preferably homology of 7 OT, even more preferably 80% homology, most preferably 90% homology.
  • Alignment methods for sequence comparison are known in the art. Various methods and algorithms for alignment are described in Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981); Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio.
  • the antibody is an antibody characterized in that the antibody binds to an epitope consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 sequence. It provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of autophagy-related diseases comprising the autophagy active agent of the present invention as an active ingredient.
  • the composition of the present invention comprises ( a ) a pharmaceutically effective amount of the autophagy active agent of the present invention as described above; And (b) a pharmaceutically acceptable carrier.
  • pharmaceutically effective amount as used herein means an amount sufficient to achieve the efficacy or activity of the autophagy actives described above.
  • the pharmaceutical composition of the present invention includes a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Pharmaceutically acceptable carriers included in the pharmaceutical composition of the present invention are those commonly used in the preparation of lactose, dextrose, sucrose, sorbbi, manny, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, Gelatin silicate microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil Or not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a humectant, a sweetener, a flavoring agent, an emulsifier, a suspending agent, a preservative, and the like.
  • a lubricant e.g., talc, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, a kaolin, sorbidextr, and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally, and preferably applied in an oral non-administrative manner.
  • Suitable dosages of the pharmaceutical compositions of the present invention may be prescribed in various ways depending on factors such as formulation method, mode of administration, age of patient, weight, sex, morbidity, food, time of administration, route of administration, rate of excretion and reaction response. Can be. Typical dosages of the pharmaceutical compositions of the invention are in the range of 0.001-100 mg / kg on an adult basis.
  • the pharmaceutical compositions of the present invention may be prepared in unit dosage form by formulating with a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to methods which can be easily carried out by those skilled in the art. Or may be prepared by incorporation into a multi-dose container.
  • the formulation may be in the form of solutions, suspensions, syrups or emulsions in oils or aqueous media, or in the form of extracts, powders, powders, granules, tablets or accelerators, and may further comprise dispersants or stabilizers.
  • Autophagy-related diseases which can be prevented or treated with the pharmaceutical compositions of the present invention are neurodegenerative diseases, autoimmune diseases, cardiovascular diseases, metabolic diseases, hyperplastic syndromes, hereditary muscle diseases, muscle diseases or cancer.
  • Said neurodegenerative disease is selected from the group consisting of Alzheimer's disease (Al zhe imer's di sease), Parkinson's disease (Parkinson's di sease), Huntington's disease (Huntington's di sease) and Amyotrophic lateral sclerosis Is a neurodegenerative disease.
  • the autoimmune diseases include alopec ia great a, ankylosing spondylitis, antiphospholipid syndrome, autoimmune Addison disease, adrenal autoimmune diseases, autoimmune hemolytic anemia, autoimmune hepatitis, autoimmune ovarian infection and testicles, Autoimmune thrombocytopenia, Behcet's disease, bullous swelling, cardiomyopathy, celiac sprue-dermat itis, chronic fatigue disorders, chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy, Churg-St rauss syndrome , Scar pulmonary swelling, CREST syndrome, cold-cold disease, Crohn's disease, disc lupus, febrile complex globulinemia, fibromyalgia -fibromyositis, glomerulonephritis, Graves' disease, Zulrain Barre syndrome, Hashimoto's thyroiditis, idiopathic pulmonary fibrosis , Idiopathic thrombocytopenic purpura, IgA neu
  • the cardiovascular disease is composed of photoarterial heart disease, cardiomyopathy, hypertensive heart disease, heart failure, pulmonary heart, heart rhythm disorders, endocarditis, inflammatory cardiac hypertrophy, myocarditis, heart valve disease, cerebrovascular disorder, lower limb artery disease, congenital heart disease and cardiac rheumatism It is a cardiovascular disease selected from the group.
  • the metabolic disease is a metabolic disease selected from the group consisting of obesity, diabetes, dyslipidemia, fatty liver, hypertension, arteriosclerosis, hyperlipidemia and hyperinsulinemia.
  • the cancer includes pituitary adenoma, glioma, brain tumor, glandular cancer, laryngeal cancer, thymoma, mesothelioma, breast cancer, lung cancer, gastric cancer, esophageal cancer, colon cancer, liver cancer, pancreatic cancer, pancreatic endocrine tumor, gallbladder cancer, penile cancer, ureter cancer, renal cell carcinoma And cancer selected from the group consisting of prostate cancer, bladder cancer, non-Hodgkin's lymphoma, myelodysplastic syndrome, multiple myeloma, plasmacytoma, leukemia, childhood cancer skin cancer, ovarian cancer, and cervical cancer.
  • the present invention provides a method for screening autophagy activators or inhibitors.
  • the present invention first identifies the mechanism by which ULK1 phosphorylates the 30 th serine amino acid residue of Becl inl.
  • the present invention provides an antibody in which the 30 th serine amino acid residue specifically binds to phosphorylated Becl inl protein.
  • La and lb show the results of confirming the phosphorylation of Becl inl by ULK1.
  • FIG. 2 shows the results of confirming the direct phosphorylation of Bec l inl by ULK1.
  • Figure 3 shows the results confirming Ser30 phosphorylation of Beclinl by ULK1.
  • Figure 4 shows the results confirming Ser30 phosphorylation of Beclinl in starvation.
  • Figure 5 shows the results confirming Ser30 phosphorylation of Beclinl by treatment with rapamycin (rapamycin).
  • Figure 6 shows the results confirming Ser30 phosphorylation of Beclinl by treatment with torin (torin).
  • Anti-ULKl (sc-10900) and Bee 1 in Ksc-11427 and sc-10086) antibodies were purchased from Santa Cruz Biotech.
  • Anti-Atgl4L antibodies were obtained from MBUPD026) and Abgent (AP1832a).
  • Anti-myc 9E10 is EMD
  • HE 293T, HeLa and MEF cells were incubated under 5 37 ° C / 5 C02 conditions in DMEMGnvitrogen, USA, containing 10% FBS (Fetal Bovine Serum), penicillin and streptomycin.
  • FBS Fetal Bovine Serum
  • a lentiviral vector pLKO.l encoding shRNA targeting 0 Atgl4L or scrambled sequence was introduced into HEK293T using FuGENE 6 along with Rectivirus packaging shark pHR'8.2AR and pCMY-VSV-G.
  • Virus was obtained 60 hours after transfection and the virus obtained under polybrene treatment was infected with HeLa.
  • Transfected cells were selected by treatment with puromycin5.
  • Target sequences for AtgML shRNA are 5'-CCATAGMCTTGGTCATGTTT-3 'and 5' 'CCACmCTTTCTATGGGATT-3', which are located at 3'-UTR.
  • -Atgl4L does not work. 0 immunostaining HeLa or MEF cells were fixed with 4% formaldehyde (in PBS) for 15 minutes and treated with 0.3% Triton X-100 for 30 minutes at room temperature to give permeability. Permeable cells were reacted for 30 minutes in PBS containing ⁇ BSA (Bovine Serum Albumin) and then antibody reacted overnight at 4 ° C. Endogenous LC3 and Atgl4L were stained with anti-IX IX antibodies (Novus, cat # NB100-2220 and Nanotools, cat # 5F10) and anti-Atgl4L antibodies (MBL, PD026).
  • Recombinant myc and HA-tagged proteins were monitored using anti-myc antibodies and anti-HA antibodies (Covance, AFC-101P) conjugated with Alexa647 fluorescent dye (Cell Signaling, cat # 2233). After primary antibody binding, cells were incubated with Alexa Flour 488-conjugated anti-mouse IgG (Invitrogen, A-11001) and / or Alexa Flour 647-conjugated antirabbit IgG (Invitrogen, A-21443). It was. Nuclear staining was performed with DAP I (4′-6-D i am idi ⁇ -2-pheny 1 i ndo 1 e, Invitrogen, D-1306).
  • myc-tagged UL 1 wild type and kinase-dead mutations were transiently expressed in HEK293T cells. After 2 days of transfection, 0.1 mCi [32P] orthophosphate (MPBiomedicals). The reaction was allowed to react for 4 hours in phosphate-free medium containing 10% dilution of FBS before adding and reacting for 1 hour. For immunoprecipitation, myc-tagged ULK1 was isolated using anti-myc antibody. The separated protein was subjected to SDS-PAGE, transferred to PVDF, and autoradiogram was obtained. Experiment result
  • Anti-myc antibodies were used to isolate myc-tagged ULK1 wild type and KE M92) mutants overexpressed from HEK293T cells by immunoprecipitation (IP).
  • IP immunoprecipitation
  • Recombinant Beclinl was isolated from E. coli strain and used as substrate. Anti-reflected with ULKL wild type or KD mutants isolated by Beclinl and immunoprecipitation at 37 ° C in the presence of 32P-ATP. The integration of 32P into Beclinl and UL 1 was analyzed by autoradiogram. The levels of Myc-ULKl and Beclinl were also analyzed by Western blot (FIG. 2).
  • the ULK1 wild type oxidized Beclinl, whereas the Beclinl with KD mutation did not phosphorylate. In other words, the kinase activity of ULK1 is important for the phosphorylation of Beclinl.
  • HA-tagged Beclinl and myc-tagged ULK1 wild type or KD mutants were expressed and immunoprecipitation was performed using HA antibodies.
  • SDS-PAGE Each band was extracted and analyzed for sites phosphorylated by ULK1 through LOMS analysis. The analysis showed that Beclinl's Ser30 was a likely site.
  • the epitope of the antibody was synthesized as follows to develop an antibody that specifically binds to a phosphorylated Beclinl protein with serine amino acid residues. The following synthetic peptide is in the phosphorylated serine, the fifth amino acid.
  • N-terminal cysteine (cys) was optionally added for conjugation to the carrier protein.
  • the epitope was synthesized to produce an antibody against Ser30 phosphorylation of Beclinl (Abfront ier commissioned, Republic of Korea; http: //www.abfront ier, com / cs / ant i bodyPo 1 y. Do).
  • ULK1 + / + MEF and ULK1-/-MEF were incubated for 2 hours in HBSS medium. Endogenous Beclinl was isolated by immunoprecipitation. Phosphorylation of Ser30 was analyzed using the antibodies developed by the inventors (FIG. 3). ULK1 was expected to increase kinase activity in HBSS medium, where activated ULK1 was expected to phosphorylate Beclinl serine residues 30th. As a result, self-developed Beclinl Ser30 antibody selectively reacted with the phosphorylation site of Beclinl phosphorylated by ULK1. Beclinl Ser30 Phosphorylation in Starvation
  • HEK293T cells were treated with rapamycin for designated times (0, 15, 30, 60 and 120 minutes). Endogenous Beclinl was isolated by immunoprecipitation. The phosphorylation of Ser30 was analyzed with a rabbit antibody developed in the present invention. It was confirmed that ser30 of Beclinl was phosphorylated by rapamycin treatment (FIG. 5). Rapamycin increases the activity of ULK1. Beclinl Ser30 Phosphorylation by torin
  • HEK293T cells were treated with torin for designated times (0, 15, 30, 60 and 120 minutes). Endogenous Beclinl was isolated by immunoprecipitation. The phosphorylation of Ser30 was analyzed with a rabbit antibody developed in the present invention. It was confirmed that serlin of Beclinl was phosphorylated by torin treatment (FIG. 6). Activating autophagy
  • Beclinl wild type or S30A mutations were transiently expressed.
  • HA BeclinK green

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Abstract

본 발명은 (a) Beclin1 단백질을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시험 물질을 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 Beclin1 단백질의 30번째 세린(serine) 아미노산 잔기의 인산화(phosphorylation) 정도를 분석하는 단계를 포함하는 자가포식(autophagy) 활성제 또는 억제제를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 상기 Beclin1 단백질의 인산화가 상향-조절(up-regulation)되는 경우에, 상기 시험물질은 자가포식 활성제(activator)로 판정하고, 상기 Beclin1 단백질의 인산화가 하향-조절(down-regulation)되는 경우에, 상기 시험물질은 자가포식 억제제(inhibitor)로 판정한다. 본 발명은 ULK1이 Beclin1의 30번째 세린 아미노산 잔기가 인산화하는 기작을 최초로 규명한다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
자가포식 활성제 또는 억제제를 스크리닝하는 방법 .【기술 분야]
본 발명은 대한민국 미래창조과학부의 지원 하에서 과제번호 E0131601에 의해 이루어진 것으로서， 상기 과제의 연구관리전문기관은 한국식품연구원, 연구사업명은 "한국식품연구원 주요사업" ， 연구과제명은 "전통식품 phytochemi cal s의 체내동태 해석 연구" , 주관기관은 한국식품연구원， 연구기간은 2013. 01. 01 ~ 2013. 12. 31 이다.
본 특허출원은 2014년 05월 08일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제 10-2014-0054973 호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 특허출원의 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명은 자가포식 (autophagy) 활성제 또는 억제제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
【배경 기술】
자가포식 (Autophagy)의 일반적인 기능은 세포내 영양분이 부족한 환경에서 세포가 자신의 불필요한 단백질， 노화된 소기관 등을 지질 2 증층으로 구성된 자식포 (membrane vacuole , autophagosome)가 둘러싼 후 라이소좀과 합쳐져 둘러싸인 내부 물질을 분해하도록 유도함으로써 세포내 영양분을 재공급하는 시스템으로 세포의 항상성 유지에 중요한 역할을 한다. 이러한 자가포식이 세포성장, 분화， 신진대사 조절， 암 뇌 질환， 면역 등 다양한 인간의 생리적 및 병리적 상태를 조절하는데 중요한 역할을 담당한다는 사실이 속속 밝혀지고 있어 전 세계적으로 많은 관심을 갖고 있다. 자가포식은 작동기작과 기능에 따라 거대 자가포식 (macroautophagy) , 미세 자가포식 (mi croautophagy) 및 샤페론 매개 자가포식 (Chaperone Medi ated Autophagy ; CMA)로 나누어 지는데， 이들 세 종류의 자가포식은 세포내에 공존하면서 개별적인 형태로 서로 다르게 유도된다. 예를 들면， 정상세포 조건에서도 자가포식은 일어나고 있지만， 영양소 결핍 같은 2:건에서는 거대 자가포식이 빠르게 유도되고 6-8 시간 스트레스가 유지되면 거대 자가포식은 점차적으로 줄어들며 12- 24 시간에서는 CMA 유도가 이루어진다. 자가포식은 분해되는 카고 (cargo) 타입에 따라 다양하게 분류되는데, 손상된 미토콘드리아를 선택적으로 제거함으로써 세포의 손상을 보호하는 미토파지 (mi tophagy)가 있고 , 리보솜 (r ibosomes)， 소포체 (endop lasmi c ret i culum) 및 퍼옥시좀 (peroxi somes)을 분해하는 과정에 따라 리보파지 (r i bophagy)， 레티클파지 (ret iculphagy) 및 퍼옥소파지 (pexophagy)로 각각 분류된다. 또한 최근 거대 자가포식이 지방산에 의해 생성되는 세포내 지방구 ( l ipid droplet )의 직접적인 분해에도 관여하는 거대지질 자가포식 (macrol ipophagy)를 소개하고 있다. 비록 다양한 질환 모델에서 자가포식의 기능이 밝혀지고 있으며 많은 관심을 갖고 있음에도 불구하고 아직까지 정확한 메커니즘과 관여하는 분자의 기능에 대해서 많이 알려져 있지는 않다.
한편, 자가포식 메커니즘에 관여하는 Becl inl 관련 특허로, EP 2383294 는 Becl inl 의 Thrll9 인산화 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 신경퇴행성 질환을 치료 또는 진단하는 기술을 개시하고 있고， US 6432914 는 Becl inl 자체를 단백질 의약품으로 이용하여 암을 치료하는 기술을 개시하고 있으며， US 5858669 는 Bec l inl 의 돌연변이를 이용하여 암을 진단하는 기술에 대하여 개시하고 있다. 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
【발명의 내용】 '
【해결하려는 과제】
본 발명자들은 세포의 항상성 유지에 증요한 역할을 하는 자가포식 (autophagy)을 조절할 수 있는 자가포식 활성제 또는 억제제를 스크리닝 할 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과， Becl inl 단백질의 30 번째 세린 (ser ine) 아미노산 잔기의 인산화 (phosphorylat ion) 정도를 분석하여 자가포식 활성제 또는 억제제를 스크리닝 할 수 있음을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서， 본 발명의 목적은 자가포식 활성제를 스크리닝 하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 30 번째 세린 아미노산 잔기가 인산화된
Beclinl 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하는 데 있다. 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명， 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
【과제의 해결 수단】
본 발명의 일 양태에 따르면， 본 발명은 다음 단계를 포함하는 자가포식 (autophagy) 활성제 또는 억제제를 스크리닝 하는 방법을 제공한다:
(a) Beclinl 단백질을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시험 물질을 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 Beclinl 단백질의 30 번째 세린 (serine) 아미노산 잔기의 인산화 (phosphorylation) 정도를 분석하는 단계; 상기 Beclinl 단백질의 인산화가 상향 -조절 (up-regulation)되는 경우에， 상기 시험물질은 자가포식 활성제 (activator)로 판정하고, 상기 Beclinl 단백질의 인산화가 하향一 조절 (down-regulation)되는 경우에， 상기 시험물질은 자가포식 억제제 (inhibitor)로 판정한다. 본 발명자들은 세포의 항상성 유지에 중요한 역할을 하는 자가포식 (autophagy)을 조절할 수 있는 자가포식 활성제 또는 억제제를 스크리닝 할 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과， Beclinl 단백질의 30 번째 세린 (serine) 아미노산 잔기의 인산화 (phosphorylat ion) 정토를 분석하여 자가포식 활성제 또는 억제제를 스크리닝 할 수 있음올 규명하였다. 본 발명의 상기 자가포식은 세포내 영양분이 부족한 환경에서 세포가 자신의 불필요한 단백질, 노화된 소기관 등을 지질 이중층으로 구성된 자식포로 둘러싼 후 라이소존과 합쳐져 둘러싸인 내부 물질을 분해하도록 유도함으로써 세포내 영양분을 재공급하는 시스템이다.
본 발명의 자가포식 활성제를 스크리닝하는 방법을 단계별로 상세히 설명한다 단계 (a): 시험 물질의 접촉
먼저， Beclinl 단백질을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시험 물질을 접촉한다.
상기 Beclinl 단백질을 포함하는 세포는 당업계의 어떠한 동물 세포도 이용할 수 있으며， 예컨대， 293T 세포， HEK293T 세포， MEF touse Embryonic Fibroblasts) 또는 HeLa 세포를 이용할 수 있다.
상기 동물세포를 배양하기 위해 이용될 수 있는 배지는 동물세포의 배양에 통상적으로 이용되는 어떠한 배지도 가능하며, 예를 들어， Eagles's MEM (Eagle ' s minimum essential medium, Eagle, H. Science 130:432(1959)), a -MEM (Stanner, CP. et al., Nat. New Biol. 230:52(1971))·, Iscove's MEM (Iscove, N. et al . , J. Exp. Med. 147:923(1978))， 199 배지 (Morgan et al. , Proc. Soc. Exp. Bio. Med., 73:1(1950))， CMRL 1066, PMI 1640 (Moore et al .， J. Amer . Med. Assoc. 199:519(1967)), F12 (Ham, Proc. Natl. Acad. Sci . USA 53:288(1965)), F10 (Ham, R.G. Exp. Cell Res. 29:515(1963))， DMEM (Dulbecco's modification of Eagle's medium, Dulbecco, R. et al . , Virology 8:396(1959)), DMEM 과 F12 의 흔합물 (Barnes, D. et al,. , Anal. Biochem. 102:255(1980))， Way-mouth's MB752/1 (Waymouth, C. J. Natl. Cancer Inst. 22:1003(1959)), McCoy's 5A (McCoy, T.A.， et al . , Proc, Soc. Exp. Biol. Med. 100:115(1959)) 및 MCDB 시리즈 (Ham, R.G. et al . , In Vitro 14:11(1978)) 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 방법에 따르면, 우선 Beclinl 단백질을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시험 물질을 접촉시킨다. 본 발명의 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어 "시험 물질" 은 Beclinl 단백질의 30 번째 세린 (serine) 아미노산 잔기의 인산화 (phosphorylat ion)에 영향을 미치는 지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시험 물질은 화학물질， 펩타이드 및 천연 추출물을 포함하나， 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 분석되는 시험 물질은 단일 화합물 또는 화합물들의 흔합물 (예컨대, 천연 추출물 또는 세포 또는 조직 배양물)이다. 시험 물질은 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리로부터 얻을 수 있다. 이러한 화합물의 라이브러리를 얻는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 합성 화합물 라이브러리는 Maybridge Chemical Co. (UK) , Comgenex(USA) , Brandon Associates(USA) , Microsource(USA) 및 Sigma-Aldr ich(USA)에서 상업적으로 구입 가능하며， 천연 화합물의 라이브러리는 Pan Laboratories(USA) 및 MycoSearch(USA)에서 상업적으로 구입 가능하다. 시험 물질은 당업계에 공지된 다양한 조합 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있으며, 예를 들어, 생물학적 라이브러리， 공간 어드레서블 패러럴 고상 또는 액상 라이브러리 (spatially addressable parallel sol id phase or so kit ion phase libraries) , 디컨볼투션이 요구되는 합성 라이브러리 방법 , "1-비드 1-화합물" 라이브러리 방법， 그리고 친화성 크로마토그래피 선별을 이용하는 합성 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있다. 분자 라이브러리의 합성 방법은， DeWitt et al. , Proc. Natl. Acad. Sci . U.S.A. 90, 6909, 1993； Erb et al . Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 11422， 1994； Zuckermann et al . , J . Med. Chem. 37, 2678, 1994； Cho et al . , Science 261， 1303, 1993； Care 11 et al . , Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33， 2059, 1994； Care 11 et al. , Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2061； Gallop et al., J. Med. Chem. 37, 1233, 1994 등에 개시되어 있다. 단계 (b): 인산화 (phosphorylat ion) 정도의 분석
다음, 상기 Beclinl 단백질의 30 번째 세린 (serine) 아미노산 잔기의 인산화 정도를 분석한다. 상기 Beclinl 단백질의 인산화가 상향 -조절 (up- regulation)되는 경우에， 상기 시험물질은 자가포식 활성제 (act ivator )로 판정하고， 상기 Beclinl 단백질의 인산화가 하향ᅳ조절 (down- regulation)되는 경우에， 상기 시험물질은 자가포식 억제제 (inhibitor)로 판정한다.
상기 자가포식 활성제는 암 또는 신경퇴행성 질환을 진단 또는 치료하기 위한 약제학적 조성물로 이용될 수 있다 (참조; EP 2383294).
본 명세서에서 사용되는 용어 "상향-조절" 은 자가포식 신호전달이 활성화되지 않은 때 [예컨대 동물 세포의 정상 (normal) 상태]를 기준으로 Beclinl 단백질의 30번째 세린 아미노산 잔기의 인산화 정도가 시험 물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 증가된 양상을 나타내는 경우에， 이를 Beclinl 단백질의 인산화가 상향-조절되었다고 판단한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "하향-조절" 은 공지된 자가포식 -유도 활성제인 아미다론 히드로클로라이드 (Amiodarone hydrochloride), 프리펠딘 A(Brefeldin A), 카르바마제핀 (Carbamazepine)， 텍사메타손 (Dexamethasone) 돌소몰핀 다이히드로클로라이드 (Dorsomorphin dihydrochlor ide) , EB 1089(비타민 D 수용체 아고니스트)， GF 109203X(프로테인 키나아제 C 억제제)， L-690,330(이노시를모노포스페이트 억제제)， NF 449(P2X1 안타고니스트), 니클로사마이드 (Niclosamide), 니모디핀 (Nimodipine)， 니트리디¾( 1:^11 1 )， PI 103 히드로클로라이드 (PI 3-키나아제, mTOR 및 DNA-PK 의 억제제), 피피스린 -α 히드로브로마이드( 1"111- (1 hydrobromide), 라파마이신 (Rapamycin)， 로트렐인 (Rott ler in)， SMER 28, 테모졸로마이드 (Temozolomide), 탑시가르긴 (Thapsigargin)， 토린 (Torin), 투니카마이신 (Tunicamycin), 발포산 (Valproic acid) 및 베라파밀 히드로클로라이드 (Verapamil hydrochloride)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 활성제를 처리하는 경우에 시험 물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 Beclinl 단백질의 30 번째 세린 아미노산 잔기의 인산화 정도가 감소된 양상을 나타내는 경우에， 이를 Beclinl 단백질의 인산화가 하향-조절되었다고 판단한다.
상기 Beclinl 단백질의 30 번째 세린 (serine) 아미노산 잔기의 인산화 정도 » 분석하기 위해서는 당업계의 어떠한 인산화 분석 방법도 이용할 수 있으며， 예컨대， 웨스턴 블럿 (Burnette WN. (1981). '"Western blotting': electrophoret ic transfer of proteins from sodium dodecyl sul f at e-polyacryl amide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detect ion with antibody and radioiodinated protein A" . Analytical Biochemistry 112 (2)： 195-203), EL ISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, Lequin R (2005) . "Enzyme immunoassay (EIA) /enzyme- 1 inked immunosorbent assay (ELISA)" . Clin. Chem. 51 (12)： 2415-8) 및 세포내 유동 세포분석법 (Intracellular Flow Cytometry, hUp://www. abeam. com/?pageconfig=resource& ^ 이용할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면， 상기 Beclinl 단백질의 30 번째 세린 아미노산 잔기의 인산화 정도의 분석은 상기 30 번째 세린 아미노산 잔기가 인산화된 Beclinl 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 실시한다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면， 상기 30 번째 세린 아미노산 잔기가 인산화된 Beclinl 단백질에 특이적으로 결합하는 항체는 서열목록 제 1서열에 기재된 아미노산 서열로 구성된 에피토프에 결합하는 항체이다. 본 발명의 다른 양태에 따르면， 본 발명은 상기 30 번째 세린 아미노산 잔기가 인산화된 Beclinl 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 시료에 접촉하는 단계를 포함하는 자가포식 (autophagy) 활성 측정하는 방법을 제공한다.
본 명세서에서， 용어 "시료" 는 배양된 세포 (cultured cell), 동물 또는 인간의 뇌 (brain), 눈 (eye), 심장 (heart), 장 (intest ine)， 신장 (kidney), 간 (liver), 허파 (lung), 근육 (muscle), 비장 (spleen), 또는 정소 (testis)로부터 얻은 조직 (tissue), 혈액 (blood), 혈장 (plasma), 혈청 (serum), 뇨액 (urine), 타액 (saliva), 땀 (sweat)ᅳ 정액 (semen) 또는 점액 (mucus) 등의 체액 (body fluid)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 또 다른 양태에 따르면， 본 발명은 상기 30 번째 세린 아미노산 잔기가 인산화된 Beclinl 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 자가포식 -관련 질환(autophagy-related disease)의 진단 키트를 제공한다..
상기 자가포식 -관련 질환은 신경퇴행성 질환， 자가면역 질환， 심혈관 질환， 대사 질환, 과오종 증후군， 유전성 근육 질환， 근 질환 또는 암이다. 본 발명의 다른 양태에 따르면， 본 발명은 30 번째 세린 아미노산 잔기가 인산화된 Beclinl 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 본 명세서에서, 용어 "항체 (antibody)" 는 30 번째 세린 아미노산 잔기가 인산화된 Beclinl 단백질에 대한 특이 항체로서， 완전한 항체 형태뿐만 아니라 항체 분자의 항원 결합 단편을 포함한다.
완전한 항체는 2 개의 전체 길이의 경쇄 및 2 개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변 영역은 감마 뮤 (μ), 알파 (α), 델타 (δ) 및 엡실론 (ε ) 타입을 가지고 서브클래스로 감마 Kyi), 감마 2(γ2), 감마 3 3), 감마 4(Υ4), 알파 1 1) 및 알파 2 2)를 가진다ᅳ 경쇄의 불변영역은 카파 (κ) 및 람다 (λ) 타입을 가진다 (Cellular and Molecular Immunology, Wonsiewicz, M. J . , Ed. , Chapter 45, pp. 41-50, W. B. Saunders Co. Philadelphia, PA(1991)； Nisonof f , A. , Introduction to Molecular Immunology, 2nd Ed. , Chapter 4, pp. 45-65, sinauer Associates Inc. , Sunderland, MA (1984)).
본 명세서에서， 용어 "항원 결합 단편" 은 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며， Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab 는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역 (CH1)을 가지는 구조로 1 개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역 (hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv 는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 FV 단편을 생성하는 재조합 기술은 PCT 국제 공개특허출원 W0 88/10649, W0 88/106630, W0 88/07085, W088/07086 및 W088/09344 에 개시되어 있다. 이중쇄 Fv( two— chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 " Fv( single-chain Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 단쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 Cᅳ말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 FV 와 같이 다이머와 같은 구조를 이를 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고 (예를 들어， 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab 를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다)， 또는 유전자. 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
본 발명에서 항체는 바람직하게는 Fab 형태이거나 완전한 항체 형태이다. 또한， 중쇄 불변 영역은 감마 ), 뮤 (μ), 알파 (α), 델타 ( δ ) 또는 엡실론 ( ε ) 중의 어느 한 이소타입으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는， 불변영역은 감마 l(IgGl), 감마 3(IgG3) 및 감마 4(IgG4)이이고， 가장 바람직하게는 감마 l(IgGl) 이소타입이다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 형일 수 있으며， 바람직하게는 카파형이다. 따라서, 본 발명의 바람직한 항체는 카파 (κ) 경쇄와 감마 1( γ 1) 중쇄를 가지는 Fab 형태 또는 IgGl 형태이다.
본 명세서에서， 용어 "중쇄" 는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VH 및 3 개의 불변 영역 도메인 CHI, CH2 및 CH3를 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다. 또한 본 명세서에서 용어 "경쇄" 는 항원에 특이성을 부여하기 위한 층분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VL 및 불변 영역 도메인 CL 올 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.
본 발명의 30 번째 세린 아미노산 잔기가 인산화된 Beclinl 단백질 항체 또는 그의 항원 결합 단편은， 30 번째 세린 아미노산 잔기가 인산화된 Beclinl 단백질을 특이적으로 인식할 수 있는 범위 내에서 첨부한 서열목록에 기재된 아미노산 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들면， 항체의 결합 친화도 및 /또는 기타 생물학적 특성을 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및 /또는 치환을 포함한다.
이러한 아미노산 변이는 아미노산 결사슬 치환체의 상대적 유사성， 예컨대， 소수성， 친수성 , 전하， 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 결사슬 치환체의 크기 , 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여， 아르기닌， 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고 ; 알라닌， 글라이신과 세린은 유사한 크기를 갖으며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여， 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌， 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인텍스 (hydropathic idex)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신 (+4.5); 발린 (+4.2); 루이신 (+3.8); 페닐알라닌 (+2.8); 시스테인 /시스타인 (+2.5); 메티오닌 (+1.9)； 알라닌 (+1.8)； 글라이신 (-0.4)； 쓰레오닌 (-0.7)； 세린 (-0.8)； 트립토판 (-0.9); 타이로신 (-1.3); 프를린 (ᅳ1.6)； 히스티딘 (-3.2); 글루타메이트 (-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스파르테이트 (—3.5); 아스파라긴 (-3.5); 라이신 (-3.9); 및 아르기닌 (-4.5).
단백질의 상호적인 생물학적 기능 (interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인텍스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우， 바람직하게는 士 2 이내, 보다 바람직하게는 土 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0,5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.
한편， 유사한 친수성 값 (hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제 4,554,101 호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌 (+3.0); 라이신 (+3.0); 아스팔테이트 (+3.0土 1); 글루타메이트 (+3.0士 1); 세린 (+0.3)； 아스파라긴 (+0.2); 글루타민 (+0.2); 글라이신 (0); 쓰레오닌 (- 0.4)； 프를린 (ᅳ0.5 士 1); 알라닌 (-0.5); 히스티딘 (-0.5); 시스테인 (- 1.0)； 메티오닌 (-1.3); 발린 (-1.5); 루이신 (—1.8); 아이소루이신 (- 1.8)； 타이로신 (-2.3)； 페닐알라닌 (-2.5)； 트립토판 (-3.4).
친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우， 바람직하게는 土 2 이내， 보다 바람직하게는 土 1 이내， 보다 더 바람직하게는 士 .0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다 (H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val , Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/I le Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면， 본 발명의 항체 또는 이를 코딩하는 핵산 분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성 (substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대웅되도록 얼라인하고， 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에， 최소 61%의 상동성， 보다 바람직하게는 7OT의 상동성， 보다 더 바람직하게는 80%의 상동성， 가장 바람직하게는 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24： 307- 31(1988)； Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Shar , CABIOS 5:151-3(1989)； Corpet et al . , Nuc. Acids Res. 16:10881- 90(1988)； Huang et al. , Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992) and Pearson et al. , Meth. Mol. Biol. 24 :30그 31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al. , J. Mol. Biol. 215:403-10(1990))은 NBC I (National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며， 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn and tblastx 와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT 는 http://www.ncbi .nlnunih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 - -프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 http://丽 w.ncbi .nlm.nih.gov/BLAST/blastJielp.htiTil에서 확인할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면， 상기 항체는 서열목록 제 1 서열에 기재된 아미노산 서열로 구성된 에피토프에 결합하는 항체인 것을 특징으로 하는 항체이다. 본 발명의 자가포식 활성제를 유효성분으로 포함하는 자가포식 -관련 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 본 발명의 조성물은 (a) 상술한 본 발명의 자가포식 활성제의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다. 본 명세서에서 용어 "약제학적 유효량 " 은 상술한 자가포식 활성제의 효능 또는 활성을 달성하는 데 층분한 양을 의미한다.
본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우， 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서， 락토스， 덱스트로스， 수크로스， 솔비를， 만니를, 전분， 아카시아 고무, 인산 칼슘， 알기네이트， 젤라틴 규산 칼슴 미세결정성 셀롤로스, 폴리비닐피롤리돈， 셀를로스， 물， 시럽， 메틸 셀를로스， 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트， 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나， 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제， 습윤제， 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제， 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington ' s Pharmaceut i cal Sc i ences ( 19th ed . , 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며， 바람직하게는 경구 비투여 방식으로 적용된다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법， 투여 방식, 환자의 연령， 체중， 성， 병적 상태， 음식， 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반웅 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 일반적인 투여량은 성인 기준으로 0.001—100 mg/kg 범위 내이다. 본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및 /또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제， 산제， 분말제， 과립제, 정제 또는 갑셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물로 예방 또는 치료할 수 있는 자가포식- 관련 질환은 신경퇴행성 질환， 자가면역 질환, 심혈관 질환， 대사 질환， 과오종 증후군， 유전성 근육 질환， 근 질환 또는 암이다.
상기 있어서， 상기 신경퇴행성 질환은 알츠하이머 질환 (Al zhe imer ' s di sease) , 파킨슨 질환 (Parkinson' s di sease) , 헌팅턴 질환 (Hunt ington ' s di sease) 및 근위축성 측색 경화증으로 구성된 군으로부터 선택되는 신경퇴행성 질환이다.
상기 자가면역 질환은 알로페시아 그레아타 (alopec i a great a ) , 강직성 척추염， 항인지질 증후군， 자가면역 아디슨 질환， 부신의 자가면역 질환， 자가면역 용혈성 빈혈， 자가면역 간염, 자가면역 난소염 및 고환염, 자가면역 혈소판감소증, 베체트병， 수포성 유천포창， 심근병증, 복강 스프루우-피부염 (ce l i ac sprue-dermat i t i s) , 만성 피로 면역이상 증후군, 만성염증성 탈수초 다발성 신경병증， Churg-St rauss 증후군， 반흔성유천포창， CREST 증후군， 한냉 웅집소 질환， 크론씨병， 원판성 낭창, 복태성복합한넁글로불린혈증， 섬유근통 -섬유근염， 사구체신염， 그레이브스 질환， 귈레인 바레 증후군， 하시모토 갑상선염， 특발성 폐섬유화증, 특발성 혈소판 감소성 자반증， IgA 신경염， 연소자성 관절염， 편평태선， 홍반성 루푸스， 메니에르병， 흔합성 연결 조직 질환， 다발성 경화증， 타입 I 또는 면역 -매개 당뇨병， 중증근무력증， 심상성 천포창, 악성 빈혈， 결정성 다발동맥염， 다발연골염, 자가면역성 다선 증후군， 류마티스 다발성근통， 다발성 근염과 피부근염， 일차성 무감마글로불린혈증， 일차성 담증성 간경변， 건선, 건선성 관절염， 레이노 현상， 라이터 증후군， 류마티스 관절염， 사르코이드증 , 공피증, 강직인간 증후군 전신성 흥반성 루푸스， 흥반성 루푸스， 다가야스 동맥염, 일시적 동맥염, 거대세포 동맥염， 궤양성 대장염， 포도막염, 백반증 및 베게너 육아종증로 구성된 군으로부터 선택되는 자가면역질환이다.
상기 심혈관질환은 광동맥성심장병， 심근증， 고혈압성심장질환， 심부전， 폐성심， 심율동장애， 심장 내막염， 염증성 심비대증, 심근염, 심장판막증， 뇌혈관장애， 하지동맥질환, 선천성 심질환 및 심장 류머티즘으로 구성된 군으로부터 선택되는 심혈관질환이다.
상기 대사질환은 비만, 당뇨， 이상지방혈증， 지방간， 고혈압, 동맥경화， 고지혈증 및 고인슐린혈증으로 구성된 군으로부터 선택되는 대사질환이다ᅳ
상기 암은 뇌하수체선종， 신경교종， 뇌종양， 상인두암， 후두암， 흉선종， 중피종， 유방암， 폐암， 위암， 식도암， 대장암, 간암， 췌장암, 췌내분비종양， 담낭암， 음경암ᅳ 요관암， 신세포암， 전립선암， 방광암， 비호지킨성림프종， 골수이형성증후군， 다발성골수종, 형질세포성종양， 백혈병， 소아암 피부암， 난소암， 및 자궁경부암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암이다.
【효과】
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 자가포식 (autophagy) 활성제 또는 억제제를 스크리닝하는 방법을 제공한다 .
(b) 본 발명은 ULK1 이 Becl inl 의 30 번째 세린 아미노산 잔기가 인산화하는 기작을 최초로 규명한다.
(c) 본 발명은 30 번째 세린 아미노산 잔기가 인산화된 Becl inl 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다.
【도면의 간단한 설명】
도 la 및 도 lb 는 ULK1 에 의한 Becl inl 의 인산화를 확인한 결과를 나타낸다. ᅳ 도 2 는 ULK1 에 의한 Bec l inl 의 직접 인산화를 확인한 결과를 나타낸다. 도 3 은 ULK1 에 의한 Beclinl 의 Ser30 인산화를 확인한 결과를 나타낸다.
도 4 는 기아 상태 (starvation)에서 Beclinl 의 Ser30 인산화를 확인한 결과는 나타낸다.
도 5 는 라파마이신 (rapamycin)을 처리하여 Beclinl 의 Ser30 인산화를 확인한 결과는 나타낸다.
도 6 은 토린 (torin)을 처리하여 Beclinl 의 Ser30 인산화를 확인한 결과는 나타낸다.
도 7 은 자가포식 (autophagy) 활성화에 대한 Beclinl 의 Ser30 인산화의 중요성을 보여준다.
【발명을 실시하기 위한 구체적인 내용】
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로， 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다. 실시예
실험재료 및 실험방법
시약 및 항체
항ᅳ ULKl(sc-10900) 및 Bee 1 in Ksc-11427 및 sc-10086) 항체는 Santa Cruz Biotech 로부터 구매하였다. 항 -Atgl4L 항체 는 MBUPD026) 및 Abgent(AP1832a)로부터 구하였다. 항 -myc 9E10 은 EMD
Biosciences(OPlO)로부터 구매하였고， 항— HA 항체 HA.11 은 Covance(AFCᅳ 101P)로부터 구매하였다. 플라스미드 제조 및 돌연변이 유발
- -인간 ULK1 및 Atgl"3' cDNA "클론을 Katzusa 연구소로부터 얻었다.
ULK1 및 M92A 의 키나아제 -데드 (kinase-dead) 돌연변이를 부위-특이적 돌연변이 유발 키트 (Stratagene, 미국)를 이용하여 제조하였다. 인간
Beclinl에 대한 cDNA는 Open Biosystems으로부터 구매하였다. 세포 배양 및 트렌스펙션
HE 293T, HeLa 및 MEF 세포를 10% FBS(Fetal Bovine Serum), 페니실린 및 스트렙토마이신을 포함하는 DMEMGnvitrogen, 미국)에서 5 37°C/5 C02 조건 하에 배양하였다. 일시적 발현을 위해,
FuGENETM(Rochedi agnostics)를 이용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 세포를 재조합 腿 로 트랜스펙션하였다. 동시ᅳ면역침전법을 실시하기 위해, 트랜스펙션 후 2일 후에 세포를 수득하였다. 0 동시 -면역침전법 및 웨스턴블럿
동시—면역침전법을 실시하기 위해 , 40 mM HEPES, H 7.4, 120 mM NaCl , 1 mM EDTA, 50 mM NaF, 1.5 inM Na3V04, 10 mM Mb-글리세로포스페이트 1% 트리톤 Xᅳ 100 및 프로테아제 억제제 (Roche)를 포함하는 완충액에 세포 추출물을 준비하였다. 면역침전된 단백질을 용해 완층액을 사용하여 45 차례 세척하고， 8% 트리스-글라이신 겔에 로딩하였다. 이를
PVDF(Polyvinylidene di fluoride) 막 (Bio— Rad, 미국)에 전송하여 웨스턴 블럿 검출 시약 (Perkin-Elmer, 미국)으로 검출하였다. 렌티바이러스 준비
0 Atgl4L 또는 스크램블 서열을 표적하는 shRNA 를 코딩하는 렌티바이러스 백터 pLKO.l 를 렉티바이러스 팩키징 백어 pHR'8.2AR 및 pCMY-VSV-G 와 함께 FuGENE 6 를 사용하여 HEK293T 에 도입하였다. 트랜스펙션 60 시간 후에 바이러스를 수득하고，폴리브린 (polybrene) 처리 하에 수득한 바이러스를 HeLa 에 감염시켰다. 퓨로마이신 (puromycin)을5 처리하여 트랜스펙션된 세포를 선별하였다. AtgML shRNA 에 대한 표적 서열은 5'-CCATAGMCTTGGTCATGTTT-3' 및 5 'ᅳ CCACmCTTTCTATGGGATT-3 '이며， 이는 3'-UTR 에 위치한다. 이러한 shRNA 는 3 JTR 이 결실된 재조합
- - Atgl4L은 표작하지 않는다. 0 면역염색법 HeLa 또는 MEF 세포를 4% 포름알데이드 (in PBS)로 15 분 동안 고정하고 0.3% 트리톤 X-100 으로 30 분 동안 실온에서 처리하여 투과성을 주었다. 투과성 세포를 \ BSA( Bovine Serum Albumin)을 포함하는 PBS 에서 30 분 동안 항은반응한 후， 4°C에서 밤새 항체반웅하였다. 항ᅳ IX 항체 (Novus, cat# NB100-2220 및 Nanotools, cat# 5F10) 및 항 -Atgl4L 항체 (MBL, PD026)을 이용하여 내인성 LC3 및 Atgl4L 를 염색하였다. 재조합 myc 및 HA-태깅된 단백질을 Alexa647 형광 염료 (Cell Signaling, cat# 2233)가 컨쥬게이션된 항—myc 항체 및 항 -HA 항체 (Covance, AFC- 101P)를 사용하여 모니터링하였다. 1 차 항체 결합 후에， 세포를 Alexa Flour 488-컨쥬게이션된 항-마우스 IgG( Invitrogen, A-11001) 및 /또는 Alexa Flour 647-컨쥬게이션된 항ᅳ래빗 IgG( Invitrogen, A-21443)과 항온반웅하였다. DAP I ( 4 ' -6-D i am i d i ηο-2-pheny 1 i ndo 1 e , Invitrogen, D- 1306)으로 핵 염색하였다. Deltavision PersonelDV 현미경 (Applied Precision)을 이용하여 염색된 세포의 이미지를 얻었다. WIPI-1 또는 LC3 의 Atgl4 야생형 또는 S419A 돌연변이와 같이 위치하는 것은 SigmaPlot 10.0 소프트웨어 (Systat Software, 미국)을 이용한 스튜던트 t— test 로 통계학적으로 분석하였다. 인비보 (in vivo) 라벨링
살아있는 세포에서 Beclinl 의 인산화를 결정하기 위해， myc-태깅된 UL 1 야생형 및 키나아제 -데드 돌연변이를 HEK293T 세포에서 일시적으로 발현하였다. 트랜스펙션 2 일 후에， 0.1 mCi[32P] 오르쏘포스페이트 (orthophosphate, MPBiomedicals)를. 첨가하여 1 시간동안 반웅하기 전에 10% 회석된 FBS 를 포함하는 포스페이트 -프리 배지에서 4 시간 동안 반웅하였다. 면역침전법을 위해， myc-태깅된 ULK1 은 항 -myc 항체를 이용하여 분리하였다. 분리한 단백질을 SDS-PAGE 를 실시하여 PVDF에 전송하고 오토라디오그램 (autoradiogram)을 구하였다. 실험 결과
ULK1의 Beclinl 인산화 유도 293T 세포에서 myc-태깅된 Beclinl 을 HA—태깅된 ULKl 야생형 또는 M92A KD(kinase dead) 돌연변이와 동시발현하였다. Myc-Beclinl 및 HA- ULK1 을 항 -HA 항체를 이용하여 면역침전 (i瞧 unoprecipitation; IP)하여 분리하고ᅳ SDS-PAGE 상의 이동 양상을 웨스턴 블럿하여 분석하였다. Beclinl 과 ULK1 또는 M92A KD 돌연변이가 결합하는 것을 확인하였다 (도 la). ULKl 야생형과 동시발현 한 Beclinl 이 밴드 이동 양상을 보인 반면， LLK1 M92A D 를 동시 발현한 Beclinl 은 밴드 이동 양상을 보이지 않았다. 이러한 결과는 ULK1 야생형이 Beclinl 의 인산화 가능성을 보여주고 있다. myc-태깅된 Beclinl 을 HA-태깅된 ULK1 야생형 또는 M92A D(kinase dead) 돌연변이와 동시발현하는 293T 에서 람다 포스파타제 (lambda phosphatase) 처리 /비처리 후 면역침전하여 분리한 후에 항 -HA 항체를 이용하여 C으 IP 를 수행하고 SDS-PAGE 상의 이동 양상을 웨스턴 블럿하여 분석하였다. UL 1 에 의해 shift-up 된 Beclinl 의 인산화가 포스파타제에 의해 유리됨을 보여줌으로써, ULK1 이 Beclinl 을 인산화 시키는 결정적 단서를 보여주고 있다 (도 lb).
Beclinl의 인산화
항 -myc 항체를 이용하여 HEK293T 세포로부터 과발현된 myc-태깅된 ULK1 야생형 및 KE M92) 돌연변이를 면역침전 (i隱 unoprecipitation; IP)하여 분리하였다. E.coli 균주에서 재조합 Beclinl을 분리하여 기질로 사용하였다. 32P-ATP 존재 하에 37°C에서 Beclinl과 면역침전법으로 분리한 ULKL야생형 또는 KD 돌연변이와 항은반옹하였다. 32P 가 Beclinl 및 UL 1 으로 통합되는 것을 오토라디오그램으로 분석하였다. Myc-ULKl 및 Beclinl 의 수준도 웨스턴 블럿으로 분석하였다 (도 2). ULK1 야생형이 Beclinl 을 민산화시키는 반면, KD 돌연변이가 첨가된 Beclinl 인 경우는 인산화가 이루어지지 않았다. 즉， ULK1 의 키나아제 활성이 Beclinl 의 인산화에 중요하다는 결과를 보여주고 있다.
Beclinl Ser30 에피토프
HA-태깅된 Beclinl 과 myc-태깅된 ULK1 야생형 또는 KD 돌연변이를 발현시켜 HA 항체를 이용하여 면역침전법을 실시하였다. SDS-PAGE 상에서 나오는 밴드를 각각 추출하여 LOMS 분석을 통하여 ULK1 이 인산화시키는 사이트를 분석하였다. 분석결과 Beclinl 의 Ser30 이 가능성 높은 사이트로 분석되었다. 세린 아미노산 잔기가 인산화된 Beclinl 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 개발하기 위해 아래와 같이 항체의 에피토프를 합성하였다. 하기 합성 펩타이드는 5 번째 아미노산인 세린이 인산화된 형태이다.
C-KLDTS FKILDR (26-36, aa) 12-mer
N-말단의 시스테인 (cys)은 운반 단백질 (carrier protein)에 결합 (conjugation)하기 위해 임의로 첨가하였다. 상기 에피토프를 합성하여 Beclinl 의 Ser30 인산화에 대한 항체를 제작하였다 (Abfront ier 의뢰， 대한민국; http: //www. abfront ier , com/cs/ant i bodyPo 1 y . do ) .
Beclinl Ser30 인산화
HBSS 배지에서 2 시간 동안 ULK1+/+ MEF 및 ULK1-/- MEF 를 배양하였다. 내인성 Beclinl 을 면역침전법으로 분리하였다. 발명자들이 개발한 항체를 이용하여 Ser30 의 인산화를 분석하였다 (도 3). ULK1 은 HBSS 배지에서 키나아제 활성이 증가하게 되며， 이때 활성화된 ULK1 이 Beclinl 세린 잔기 30 번째를 인산화 시킬 것으로 예상하였다. 실험 결과, 자체 개발한 Beclinl Ser30 항체가 ULK1 에 의해 인산화된 Beclinl 의 인산화 사이트에 선택적으로 반웅을 하였다. 기아상태 (starvation)에서의 Beclinl Ser30 인산화
MEF 를 HBSS 에서 지정 시간 (0， 2, 4 및 6 시간) 동안 배양하였다. 내인성 Beclinl 을 면역침전법으로 분리하였다. 본 발명에서 개발한 래빗 항체로 Ser30 의 인산화를 분석하였다. 기아상태에서 Beclinl 의 ser30 이 인산화되는 것을 확인하였다 (도 4). 라파마이신 (rapamyciii)에 의한 Beclinl Ser30 인산화
HEK293T 세포에 지정 시간 (0, 15, 30, 60 및 120 분) 동안 라파마이신을 처리하였다. 내인성 Beclinl을 면역침전법으로 분리하였다. 본 발명에서 개발한 래빗 항체로 Ser30 의 인산화를 분석하였다. 라파마이신 처리에 의해 Beclinl 의 ser30 이 인산화되는 것을 확인하였다 (도 5). 라파마이신은 ULK1의 활성을 증가시킨다. 토린 (torin)에 의한 Beclinl Ser30 인산화
HEK293T 세포에 지정 시간 (0, 15, 30, 60 및 120 분) 동안 토린을 처리하였다. 내인성 Beclinl 을 면역침전법으로 분리하였다. 본 발명에서 개발한 래빗 항체로 Ser30의 인산화를 분석하였다. 토린 처리에 의해 Beclinl의 ser30이 인산화되는 것을 확인하였다 (도 6). 자가포식 활성화
Beclinl-침묵 HeLa 세포에 myc-태깅된 WIPI-1 과 함께 HA-태깅된
Beclinl 야생형 또는 S30A 돌연변이를 일시적으로 발현하였다. 라파마이신을 1 시간 동안 처리한 후에 HAᅳ BeclinK녹색) 및 myc-
WIPI1(적색)에 대한 면역염색을 실시하였다. DAPI 로 핵 (청색)을 염색하였다. Beclinl 부점 (puncta) 및 WIPI-1 동시위치하는 것을 분석하였다 (도 7).
Beclinl 의 세린잔기 30 번째가 돌연변이가 되면 자가포식 활성이 감소하는 것을 확인하였다. 이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바， 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며， 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

【특허청구범위】
【청구항 1】
다음 단계를 포함하는 자가포식 (autophagy) 활성제 또는 억제제를 스크리닝하는 방법 :
(a) Beclinl 단백질을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시험 물질을 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 Beclinl 단백질의 30 번째 세린 (serine) 아미노산 잔기의 인산화 (phosphorylation) 정도를 분석하는 단계; 상기 Beclinl 단백질의 인산화가 상향 -조절 (up-regulation)되는 경우에, 상기 시험물질은 자가포식 활성제 (activator)로 판정하고， 상기 Beclinl 단백질의 인산화가 하향- 조절 (down-regulation)되는 경우에， 상기 시험물질은 자가포식 억제제 (inhibitor)로 판정한다.
【청구항 2】
제 1 항에 있어서， 상기 Beclinl 단백질의 30 번째 세린 아미노산 잔기의 인산화 정도의 분석은 상기 30 번째 세린 아미노산 잔기가 인산화된 Beclinl 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 실시하는 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 3】
제 2 항에 있어서， 상기 30 번째 세린 아미노산 잔기가 인산화된 Beclinl 단백질에 특이적으로 결합하는 항체는 서열목록 제 1 서열에 기재된 아미노산 서열로 구성된 에피토프에 결합하는 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 4】
상기 30 번째 세린 아미노산 잔기가 인산화된 Beclinl 단백질에 - -특이적으로 ■ 결합하는 - 항체를 시료에 접촉하는 " 단계를 포함하는 자가포식 (autophagy) 활성 측정하는 방법.
【청구항 5】 상기 30 번째 세린 아미노산 잔기가 인산화된 Beclinl 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 자가포식 -관련 질환 (autophagy- related disease)의 진단 키트.
【청구항 6】
30 번째 세린 아미노산 잔기가 인산화된 Beclinl 단백질에 특이적으로 결합하는 항체.
【청구항 7]
제 5 항에 있어서， 상기 항체는 서열목록 제 1 서열에 기재된 아미노산 서열로 구성된 에피토프에 결합하는 항체인 것을 특징으로 하는 항체ᅳ
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