WO2015167029A1 - 오리엔티아 쯔쯔가무시 균에 대한 백신 조성물 - Google Patents

오리엔티아 쯔쯔가무시 균에 대한 백신 조성물 Download PDF

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isolated
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최명식
김익상
조남혁
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Definitions

  • the present invention is Orientia tsutsugamushi ).
  • Tsutsugamushi disease (scrub typhus) is caused by the human infection of Orientia tsutsugamushi (hereinafter referred to as "tsutsugamushi bacteria"), which is mediated by tick larvae. It is a type of acute febrile infection that occurs mainly in the Asia- Pacific region, including the Russian coast, Japan, China, Malaysia, Thailand, Vietnam, and India, with a potential population of one billion people.
  • Tsutsugamus bacteria are classified as a single species, but there are many serotypes with different major membrane antigen structures.To date, more than 20 Tsutsugamus serotypes have been distinguished according to the difference of these antigens. Are classified as Gilliam, Karp and Kato (Eisemann ans Osterman 1985, Am J Trop Med Hyg. Nov; 34 (6): 1173-8; Akira Tamura and Akiyoshi Kawamura 1991, J Feb. 1991, Vol. 29, No. 2; WOO-HYUN CHANG et al. 1993, J. CLIN. MICROBIOL. Mar. 1993, p. 598-605).
  • Tsutsugamushi disease vaccine is based on the treatment of formalin or gamma-irradiation with killed vaccine (Killed-vaccine), 56KDa (56-kDa Type-Specific Antigen Gene (TSA56) protein, and 47KDa envelope protein (Subunit vaccine).
  • killed vaccine Killed-vaccine
  • 56KDa 56-kDa Type-Specific Antigen Gene (TSA56) protein
  • TSA56 Type-Specific Antigen Gene
  • Subunit vaccine 47KDa envelope protein
  • these vaccines have been studied only against serotype strains injected, they have not been commercialized due to their short-term defensive immunity or short duration of defensive immunity (Buckland and Dudgeon, 1945; Lancet 2, 734-737; Kawamura et al. 37, 269-270; Seong et al., 1997. Infect. Immun. 65, 1541-1545; Yu et al., 2005. Am. J. Trop. Med. Hyg. 72 , 4
  • Sca proteins of Tsutsugamu were expressed on the outer membrane of the bacteria as self-transporting proteins. These Sca proteins are divided into five subtypes: ScaA, ScaB, ScaC, ScaD, and ScaE. The amino acid sequences of the proteins, except ScaB, found only in Boryeong strains, were found to be relatively homologous between serotypes (ScaA: 65.8). ⁇ 81.8%, ScaC: 77.4-97.5%, ScaD: 69.7-93.8%, ScaE: 62.8-85.3%) (Ha et al., 2011 Infect Immun 79: 1718-27).
  • the present invention confirms that ScaA and ScaC induce antibody responses in patients with Tsutsugamus disease, and this is completed by confirming that ScaA can function as a vaccine.
  • the inventors have isolated the genomic DNA of the Tsutsugashimi Boryeong serotype as confirmed in the following example, and produced a primer based on the genetic information (GeneBank acession number AM494475.1) of the Boryeong serotype. Amplify a portion of the passenger domain region of ScaA and ScaC proteins (see [Table 1] of FIG. 1) and (a structural schematic diagram of ScaA and ScaC of [FIG. 1], and amplified sequences of [FIGS. 2 and 3]). (Underlined) and the corresponding amino acid sequence (underlined)), amplified DNA fragments were inserted into the pET28a vector to transform into E.
  • the present inventors further divided a portion of the passenger domain region of the ScaA and ScaC protein produced and isolated from Escherichia coli to confirm that a portion of the passenger domain region of the ScaA and ScaC proteins functions as a vaccine.
  • the Tsutsugamu strain (Born serotype) was infected with PBS, and the survival rate was calculated. All the ScaC-inoculated test groups died within 12 days of vaccination. However, in the test group inoculated with ScaA, one animal died on the 13th day of inoculation, and the other four animals survived (survival rate 80%).
  • TSA56 used as a positive control survived (100% survival), and PBS used as a negative control all died within 11 days of inoculation with Boryeong strain (0% survival).
  • the ScaA showed a vaccine effect when infected with not only serotypes but also Kato and Kafe serotypes, and showed better vaccine effect when used in combination with TSA56.
  • the vaccine composition against Tsutsugamus bacterium of the present invention comprises: an isolated full-length ScaA protein, a passenger domain region of an isolated ScaA protein, or a passenger domain region of an isolated ScaA protein It is characterized by including a substantial part of the active ingredient.
  • a “vaccine” refers to the prevention of infection or reinfection of a pathogen, reduction in the severity of the symptoms caused by the pathogen, or removal of the symptoms, by inducing an immune response against that pathogen in a host person. It is meant to include the substantial or complete elimination of the disease. Therefore, the vaccine composition of the present invention may be administered prophylactically to a person before infection of the pathogen or therapeutically to a person after infection of the pathogen.
  • the "immune response” means a humoral immune response, a cellular immune response or both.
  • isolated means that the substance of interest is isolated from the original organism (ie, in the present invention Tsutsugamushi bacteria) or from the transformed organism when produced by the genetic recombination method.
  • the active ingredient means a component capable of inducing an immune response alone or with a carrier which cannot induce an immune response by itself. Therefore, the active ingredient does not necessarily need to be immunogenic (the ability to induce an immune response) by itself.
  • the active ingredient is not essential but is preferably purified.
  • purified means a state in which the original organism (i.e., Tsutsugamu bacteria) or the cellular component of the transformed organism or its complement component (i.e. contaminant) in which the target substance is present is substantially reduced or removed.
  • a substantially reduced or removed contaminant means a purity of at least 50%, preferably at least 90%, more preferably at least 99%. Purity can be assessed through methods known in the art, such as chromatography, gel electrophoresis, immunological analysis, and purification methods are also well known in the art.
  • the "ScaA” refers to ScaA, which is one of five types of Sca protein of Tsutsugamu bacteria.
  • the Sca protein interacts with fibronectin of the host cell and is involved in invasion into the host cell.
  • the Sca protein has an autotransporter domain at the C-terminus and a signal peptide at the N-terminus. In the middle, it has a passenger domain, which is a region that is expressed outside the outer wall, and is divided into five types of Sca protein of Tsutsugamus bacteria, namely ScaA, ScaB, ScaC, ScaD and ScaE.
  • Sca proteins showed relatively high homology between serotypes except for ScaB, which is found only in Boryeong strains (ScaA: 65.8 ⁇ 81.8%, ScaC: 77.4 ⁇ 97.5%, ScaD: 69.7 ⁇ 93.8%). , ScaE: 62.8-85.3%) (Ha et al., 2011 Infect Immun 79: 1718-27).
  • the "ScaA” is preferably a full-length sequence of GenBank accession no. Refers to the protein identified in CAM79168.1 or SEQ ID NO: 1. The gene sequence of this ScaA protein is also shown in GenBank accession no. CAM79168.1 or SEQ ID NO.
  • a substantial portion of the passenger domain region of an isolated ScaA protein refers to a polypeptide consisting of at least 80% contiguous amino acid sequence in the passenger domain region of the ScaA protein, preferably GenBank accession no. CAM79168.1 or polypeptide consisting of at least 80% contiguous amino acid sequence in the passenger domain region of the ScaA protein from amino acid 26 to amino acids 1186 in SEQ ID NO: 1.
  • the inventors prepared a polypeptide consisting of a total of 971 amino acid sequences from the 30th to 1000th amino acid sequence of the passenger domain region of the ScaA protein consisting of a total of 1161 amino acid sequences.
  • the polypeptide was composed of a contiguous amino acid sequence corresponding to 83.6% of the passenger domain region of the ScaA protein.
  • Tsutsugamu bacterium refers to the Orientia Tsutsuga mushi, and subclasses Gilliam serotype, Karp serotype, Kato serotype, and Boryoung serotype. It is meant to include.
  • the ScaA protein or the passenger domain region thereof may be prepared by a method known in the art for DNA recombination technology. This method comprises (i) preparing an expression vector comprising the gene encoding the molecule, (ii) transforming the expression vector into a host cell, (iii) culturing the transformed host cell, and finally (iv) Separating and purifying the desired molecules from the culture.
  • the gene encoding the molecule can be obtained from the Tsutsugamushi bacteria using the gene sequence.
  • the genomic DNA of the bacterium can be obtained and then amplified with a primer prepared based on the gene sequence.
  • the expression vector may be derived from a plasmid or a virus, and may be produced directly or used by a biotechnology company such as Novagen, Takarashujo, Qiagen, Stratagene, or Pro. Commercially available from Promega, Roche Diagnositics, Invitrogen, Genetics Institute, and the like.
  • the expression vector comprises a gene encoding a desired molecule (hereinafter referred to as "target protein", such as ScaA or a passenger domain thereof), and consists of a sequence which induces the expression of the target gene.
  • target protein such as ScaA or a passenger domain thereof
  • sequence inducing the expression of the gene of interest refers to a promoter sequence, a polyadenylation sequence and the like.
  • the promoter is a sequence capable of inducing transcription of a gene of interest, an immediate early promoter of cytomegalovirus, a promoter of SV40 (SV 40 late promoter and SV 40 early promoter), a tk promoter of herpes simplex virus (HSV), adenovirus Adeno 2 major late promoter PAdml, adenovirus 2 early promoter (PAdE2) and the like can also be exemplified, where the polyadenylation sequence is a transcriptase hormone terminator (Gimmi, ER, et al. ., Nucleic Acids Res.
  • the expression vector may optionally be a reporter (e.g., luciferase, ⁇ -glucuronidase) gene or a selection marker gene, such as neomycin, carbenicillin, kanamycin, spectinomycin, hygromycin, or the like. ) Resistance genes and the like, and may also optionally include an enhancer molecule to improve expression efficiency.
  • a reporter e.g., luciferase, ⁇ -glucuronidase
  • selection marker gene such as neomycin, carbenicillin, kanamycin, spectinomycin, hygromycin, or the like.
  • Resistance genes and the like may also optionally include an enhancer molecule to improve expression efficiency.
  • Host cells that can be transformed include prokaryotic cells such as bacteria (e.g., E. coli, Bacillus subtilis), and yeast (e.g., Saccharomyces cerevisiae )), insect cells (eg Sf cells), mammalian cells (eg COS, CHO, BHK) and the like.
  • prokaryotic cells such as bacteria (e.g., E. coli, Bacillus subtilis), and yeast (e.g., Saccharomyces cerevisiae )), insect cells (eg Sf cells), mammalian cells (eg COS, CHO, BHK) and the like.
  • Transformation methods can use any method known in the art, such as micro-injection (Capecchi, MR, Cell, 22: 479 (1980)), calcium phosphate precipitation (Graham, FL et al., Virology, 52: 456 (1973)), electroporation (Neumann, E. et al., EMBO J., 1: 841 (1982)), liposome-mediated transfection (Wong, TK et al., Gene, 10:87 (1980)), DEAE-dextran treatment (Gopal, Mol. Cell Biol., 5: 1188-1190 (1985)), gene balm (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. , 87: 9568-9572 (1990)) and the lithium acetate-DMSO method (Hill et al., Nucleic Acid Res., 19, 5791 (1991)).
  • micro-injection Capecchi, MR, Cell, 22: 479 (1980)
  • calcium phosphate precipitation
  • Cultivation of transformed host cells can also employ any method known in the art.
  • both a natural medium and a synthetic medium can be used as long as they contain a carbon source, a nitrogen source, an inorganic salt, etc. which can be efficiently used by the transformed host cell.
  • animal cells for example Eagles' MEM (Eagle's minimum essential medium, Eagle, H. Science 130: 432 (1959)), ⁇ -MEM (Stanner, CP et al., Nat. New Biol. 230: 52 (1971)), Iscove's MEM (Iscove, N. et al., J. Exp. Med. 147: 923 (1978)), DMEM (Dulbecco's modification of Eagle's medium, Dulbecco, R. et al., Virology 8: 396 (1959)) and the like may be desirable. Specific examples of the medium are described in R. Ian Freshney, Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique, Alan R. Liss, Inc., New York.
  • Methods of separating and purifying the desired protein are also known in the art, and any known method can be used. For example, methods such as ultrafiltration, gel filtration, ion exchange chromatography, affinity chromatography (when a labeled peptide is bound), HPLC, hydrophobic chromatography, isoelectric point chromatography, or a combination thereof can be used.
  • the ScaA antigen is more effective as a vaccine when used with the TSA56 (56-kDa Type-Specific Antigen, 56 kDa) antigen.
  • the vaccine composition of the present invention may further include TSA56 in addition to ScaA as an active ingredient.
  • TSA56 Recombinant protein vaccines using TSA56 have been known to show deficiency immunity only against serotype strains injected or have a short duration of protective immunity (Seong et al., 1997. Infect. Immun. 65, 1541-1545; Yu). et al., 2005. Am. J. Trop. Med. Hyg. 72, 458-46).
  • the "TSA56” refers to a cell membrane protein of Tsutsugashimi bacteria having a function of interacting with fibronectin, which is an extracellular matrix glycoprotein of host cells, to help bacterial infection of host cells (Lee et al., J Infect Dis. 2008; 198: 250-257; Cho BA et al., Infect Immun. 2010 May; 78 (5): 1915-23.).
  • the full-length sequence is GenBank accession no. Refers to the protein identified in CAM79668.1 or SEQ ID NO: 2.
  • the gene sequence of the TSA56 protein disclosed in SEQ ID NO: 2 can also be found in GenBank accession no CAM79668.1 or SEQ ID NO: 4.
  • TSA56 which may be included with ScaA as an active ingredient in the vaccine composition of the present invention, may be not only its full-length protein but also its antigenic domain and may be a substantial part of its antigenic domain.
  • the antigenic region refers to a region consisting of contiguous amino acid sequences from domains AD I to AD IV in the schematic diagram of [FIG. 1], and in SEQ ID NO: 2 refers to a sequence from the 19th amino acid to the 432th amino acid. These domains are known as domains with high antibody production (Infect Immun. 1999 67 (11): 6194-6197).
  • substantially part of the antigenic region refers to a polypeptide consisting of 80% or more contiguous amino acid sequences in a region consisting of contiguous amino acid sequences from domains AD I to AD IV, preferably the 19th amino acid of SEQ ID NO: 2 To polypeptides consisting of at least 80% contiguous amino acid sequence in the antigenic region of the TSA56 protein from amino acid to 432 th amino acid.
  • a polypeptide consisting of a total of 336 amino acids from 85 to 420 amino acids of the antigenic region of the TSA56 protein consisting of a total of 414 amino acids of SEQ ID NO: 2 was prepared and the polypeptide was sufficiently prepared as a vaccine.
  • polypeptides consisted of a contiguous amino acid sequence corresponding to 81.1% of the antigenic region of the TSA56 protein. These experimental results suggest that a polypeptide consisting of 80% or more contiguous amino acid sequences can also function sufficiently as a vaccine.
  • the vaccine composition of the present invention may be prepared in any suitable, pharmaceutically acceptable formulation.
  • it may be in the form of an immediate dosage solution or suspension, concentrated stock solution suitable for dilution prior to administration, or in reconstitutable form such as lyophilized, freeze-dried, or frozen formulation.
  • the vaccine composition of the present invention may be formulated to include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Pharmaceutically acceptable carriers that can be used for the formulation of vaccine compositions are listed and prescribed in the Pharmacopoeia of the Republic of Korea or Pharmacopoeia of the Excluded countries, in particular of the United States, Japan, and Europe.
  • Such carriers will typically include diluents, excipients, stabilizers, preservatives and the like.
  • Suitable diluents include, but are not limited to, non-aqueous solvents such as propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, peanut oil, saline (preferably 0.8% saline), water with buffer medium (preferably 0.05M phosphate buffer), and the like.
  • aqueous solvents include starch, glucose, lactose, sucrose, gelatin, malt, rice, flour, chalk, silica gel, sodium stearate, glycerol monostearate, talc, sodium chloride, and skim milk.
  • glycerol, propylene, glycol, water, ethanol, and the like, and suitable stabilizers include carbohydrates such as sorbitol, mannitol, starch, sucrose, dextran, glutamate, and glucose, and animal and vegetable products such as milk powder, serum albumin, and casein. Or proteins such as microbial proteins.
  • suitable preservatives include thimerosal, merthiolate, gentamicin, neomycin, nystatin, amphotericin B, tetracycline, penicillin, streptomycin, polymyxin B and the like.
  • the vaccine composition of the present invention may further comprise an adjuvant.
  • the antigen adjuvant may be comprised of one or more substances that enhance an immune response to the antigen.
  • Adjuvants can function as tissue reservoirs that slowly release antigens and / or as lymphatic system activators that nonspecifically enhance immune responses (Hood et al., Immunology, Second Ed., 1984, benjamin / Cummings: Menlo Park , California, p. 384).
  • Antigen adjuvant such as complete Freund, incomplete Freund, saponin, gel adjuvant, surface active substance (e.g. lysorecithin, fluoron glycol, polyanion, peptide, oil or hydrocarbon emulsion, etc.), vegetable oil (Cotton oil, peanut oil, corn oil, etc.), vitamin E acetate, and the like.
  • aluminum adjuvant which is used as a gel of aluminum salts such as aluminum phosphate, Potassium aluminum sulfate and aluminum hydroxide. have. These aluminum adjuvants are generally known to elicit a Th2-type immune response and enhance the vaccine effect (Sokolovska A et al., Vaccine. 2007 Jun 6; 25 (23): 4575-85; O'Hagan DT AND Rappuoli R., Pharm Res. 2004 Sep; 21 (9): 1519-30.)
  • Alhydrogel® from Invivogen used in the examples of the present invention, is a colloidal gel form of aluminum hydroxide. Such aluminum adjuvants are known in the art (R. Bomford.
  • Vaccine compositions of the invention can be prepared in arbitrary unit doses.
  • a unit dose refers to the amount of active ingredient and pharmaceutically acceptable carrier contained in an individual product packaged for one or more administration to a human, and an appropriate amount of such active ingredient and carrier may be determined by the vaccine composition of the present invention.
  • Such amounts which can function as vaccines when inoculated one or more times, can be determined non-clinically and clinically within the usual capacity of those skilled in the art.
  • the vaccine composition of the present invention may preferably be administered parenterally, such as via rectal, transdermal, intravenous injection, intraarterial injection, intramuscular injection, intradermal injection, subcutaneous injection, intraperitoneal injection, intraventricular injection, and the like. .
  • Vaccine compositions of the invention can be administered in a controlled release system.
  • controlled release systems include, for example, liposomes, implantable osmotic pumps, transdermal patches, and the like. It is preferred to deliver the active ingredient in a liposome manner.
  • delivery of the active ingredient by liposome mode Langer, Science 249: 1527-1533 (1990), Treat at al., In Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (des.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989), and the like.
  • mode of delivery of other active ingredients see Langer, supra; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng.
  • the dosage of the vaccine composition of the present invention may be determined by a medical person in consideration of patient characteristics such as age, weight, sex, symptoms, complications, and the presence of other diseases.
  • time interval and frequency of administration may be determined in consideration of the half-life of the formulation or active ingredient used.
  • the dosage and time interval or frequency of administration will depend on the judgment of the practitioner and should be determined by the individual.However, a typical suitable dosage will be determined within the range of about 0.1 to 10 mg / kg of individual body weight per day and the interval between doses 3 to 10 days, frequency of administration will be determined within the range of 1 to 5 times.
  • the active ingredient ScaA protein or its passenger domain region may be used with other antigens, such as TSA56, as needed to induce a more effective immune response, and an additional antigen adjuvant may be used.
  • Figure 1 shows the structural schematic of the ScaA and TSA56 protein and amino acid position corresponding to the amplified sequence. Antigen regions used in the vaccine are underlined.
  • FIG. 5 shows the results of electrophoresis of purified Tsutsuga mucin antigens (TSA56, ScaA, ScaC) and coomasie blue staining and immunoblot using Tsutsugamus disease patient serum to confirm its reactivity.
  • FIG. 6 shows ELISA results showing antigen-specific antibody responses generated by antigen inoculation.
  • Tsutsugamus disease antigens TSA56, ScaA, ScaC
  • ScaA, ScaC and TSA56 antigen genes to be used in the experiment were obtained from the Orientia Boryeong serotype (GenBank accession number AM494475.1).
  • L929 cells mouse fibroblast line; ATCC NTCT929
  • ATCC NTCT929 human fibroblast line
  • the cells were precipitated by centrifugation at 600 ⁇ g for 20 minutes and suspended in 6.5 ml of Tris-sucrose (TS) buffer (33mMTris-Cl [pH 7.4] and 0.25 M sucrose).
  • TS Tris-sucrose
  • the suspended cells were homogenized using a Polytron homogenizer (Wheaton Inc. Millville, NJ) and centrifuged at 200 x g for 5 minutes.
  • GeneAmp PCR system 9700 thermal cycler (Applied Biosystems, Co., Ltd.) using a primer designed as shown in [Table 1] based on the Tsutsugamushi bacillus serotype information (GeneBank acession number AM494475.1) and the genomic DNA isolated above. USA).
  • the conditions for performing PCR are as follows.
  • TSA56 After pre-heating at 95 ° C. (5 mins), 95 ° C. (30s) -50 ° C. (30s) -68 ° C. (90s) was further reacted at 72 ° C. (5 mins) after 30 cycles.
  • the amplified regions of the ScaA and ScaC genes are passenger domain regions represented by a blue line (base sequence) and a red line (amino acid sequence) in FIG. 1 showing the structural schematic of the Sca protein, wherein the sequence position Notation was based on age serotypes.
  • the amplified region of the TSA56 gene is also shown in [FIG. 1]. Similarly, the blue line indicates the nucleotide sequence and the red line indicates the amino acid sequence.
  • SP indicates signal peptide
  • TM indicates transmembrane
  • AT indicates autotransporter domain
  • AA indicates amino acid
  • Amplified DNA fragments were cloned into the pET28a vector and confirmed gene insertion through sequencing (see [FIG. 2] to [FIG. 4]).
  • each gene amplified with the primers in Table 1 was inserted into the pET28a vector, and the vector was transferred to Escherichia. coli It was introduced into BL21 (DE3) (Novagen, Darmstadt, Germany) and then cultured in LB broth containing kanamycin (30 ⁇ g / ml). 0.1 mM isopropyl ⁇ -D-thiogalactoside (IPTG; Duchefa, Zwijndrecht, Netherlands) was incubated at 16 ° C. for 18 hours to induce the expression of proteins.
  • IPTG isopropyl ⁇ -D-thiogalactoside
  • a binding buffer containing lysozyme 300 mMNaCl, 50 mM sodium phosphate buffer, 10mM imidazole
  • lysozyme 300 mMNaCl, 50 mM sodium phosphate buffer, 10mM imidazole
  • the resulting lysate was centrifuged for 20 minutes at 4 °C at a speed of 1,600xg.
  • the supernatant was collected and applied to Ni-nitrilotriacetic acid (NTA) His-binding resin (Qiagen) previously equilibrated with binding buffer, followed by elution buffer (300 mM NaCl, 50 mM sodium phosphate buffer, 250 mM imidazole) to obtain the protein. Paid.
  • NTA Ni-nitrilotriacetic acid
  • the mouse used in the present invention is a C57BL / 6 strain and 5 weeks old females were used in all experiments.
  • the vaccine formulation was inoculated subcutaneously (Subcutaneous) of the Dorsal part of the mouse using a 1 ml dose of insulin syringe.
  • Five C57BL / 6 strain 5-week-old female mice were used as test groups, and the test group was configured as shown in Table 2 below.
  • PBS phosphate buffer alone
  • ScaA recombinant protein alone Mice inoculated with ScaC recombinant protein alone, Alhydrogel and ScaA recombinant protein mixtures, Alhydrogel and ScaC recombinant protein mixtures, Alhydrogel and 56KDa recombinant protein mixtures, Alhydrogel and equivalent amounts of ScaA and 56KDa (TSA56) recombinant protein mixtures were used. 2]).
  • mice Five mice were immunized in each test group, and a total of three inoculations were given at two-week intervals. One week after each inoculation, 50 ⁇ l of each mouse was collected through orbital blood collection, and plasma was separated by centrifugation at 2500 ⁇ g for 5 minutes. Isolated plasma was used for specific antibody measurement against proteins such as Sca. Antibody titers were also determined based on the absorbance measured in the negative control group that did not immunize the antigen.
  • Each ScaA, ScaC, and TSA56 antigen was added to immunoassay plates (96-well plates; Nunc, Rochester, NY) at 0.05 ⁇ g bicarbonate buffer (pH 9.5) at a concentration of 1 ⁇ g / ml, then aliquoted at 100 ⁇ l / well. Coating at 18 ° C. for 18 hours. Thereafter, the antigen solution was removed using a washing solution (0.05% Phosphatate Buffered Sakine Tween-20, PBST) and blocked with 3% BSA (Bovine serum albumin) at room temperature for 2 hours.
  • BSA Bovine serum albumin
  • mice The plasma of the prepared mice was diluted 100-fold and serial dilution of each of them was added at 100 ⁇ l / well and reacted at room temperature for 1 hour. Each well was washed three times with PBST and horseradish peroxidase (HRP) -conjugated Rat-IgM or Horseradish peroxidase (HRP) -conjugated Rat-IgG antibody capable of recognizing mouse IgM, IgG 1 or IgG 2a for 1 hour at room temperature. After reacting for 3 hours, the mixture was washed three times with PBST.
  • HRP horseradish peroxidase
  • HRP Horseradish peroxidase
  • reaction was performed at room temperature for 10 minutes using a color developing agent, TMB solution (KPL), and 50 ⁇ l of 1N H 2 SO 4 , a reaction stopper, was added to each well. Absorbance was measured at 450 nm using a microplate reader.
  • KPL color developing agent
  • 1N H 2 SO 4 a reaction stopper
  • mice were treated with 10-fold and 100-fold strains of Tsutsugamushi bacteria in a half-hour (Lethal Dose 50). After diluting to 200 ⁇ l in PBS, mice were injected intraperitoneally and the survival rate was confirmed.
  • mice were diluted with 200 ⁇ l of cap and kato strains in PBS, in addition to 10-fold and 100-fold Tsutsugamushi strains of L. chinensis (Lethal Dose 50). , Mice were injected intraperitoneally and the survival rate was confirmed.
  • the antigen-specific IgG 1 and IgG 2a antibody was measured for each isotype. Why the measurement of the IgG 1 and IgG 2a antibody is because known to the IgG 1 and IgG 2a antibody reflects the activity of TH 2 and TH 1 response, respectively. It is known that TH 1 immune response mainly promotes cell mediated immune response, and TH 2 immune response mainly stimulates humoral immune response, and the effective immune response against Tsutsuga mucin is known to be TH 1 response.
  • SEQ ID NO: 3 shows a base sequence of ScaA protein
  • SEQ ID NO: 4 base sequence of the TSA56 protein

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Abstract

본 발명은 오리엔티아 쯔쯔가무시 균에 대한 백신 조성물을 개시한다. 구체적으로 본 발명은 활성성분으로서 자가수송단백질인 ScaA나 그 패신저 도메인 영역을 이용한 백신 조성물을 개시한다.

Description

오리엔티아 쯔쯔가무시 균에 대한 백신 조성물
본 발명은 오리엔티아 쯔쯔가무시 균(Orientia tsutsugamushi)에 대한 백신 조성물에 관한 것이다.
쯔쯔가무시병(scrub typhus)은 진드기 유충을 매개로 한 오리엔티아 쯔쯔가무시균(Orientia tsutsugamushi, 이하 "쯔쯔가무시균")의 인체감염으로 인하여 일어난다. 주로 러시아 연해주, 일본, 중국, 말레이시아, 태국, 베트남, 인도 등의 아시아-태평양 지역에서 발병하는 급성 열성 감염병의 한 종류이며 10억 명에 달하는 인구가 이 병에 잠재적으로 노출되어 있다.
매해 약 백만 명 정도의 환자가 발생하는 것으로 추정되고 있으며, 1-2주간의 잠복기를 거쳐 발열, 오한, 발진, 가피 생성, 근육통, 림프절 종대 등의 증상이 나타난다. 대부분 감기와 유사한 증상에서 끝나기도 하지만, 적절한 항생제 치료를 받지 않을 경우, 30% 이상의 사망률이 보고되었다. 초기 진단을 통해 독시사이클린, 클로람페니콜 등의 적절한 항생제 처리로 쉽게 치료될 수 있으나, 여러 종류의 혈청형들에 의한 재감염 위험이 높고, 항생제가 잘 듣지 않는 경우가 종종 보고되고 있다. 그리고 아직까지 상용화된 백신은 없다.
쯔쯔가무시균은 하나의 종으로 분류되고 있으나, 주요 막항원구조가 다른 혈청형이 다수 존재하며, 이러한 항원의 차이에 따라 현재까지는 20가지 이상의 쯔쯔가무시균 혈청형이 구별되고 있는데, 원형(prototype) 혈청형은 길리암(Gilliam), 카프(Karp) 및 카토(Kato)로 분류된다(Eisemann ans Osterman 1985, Am J Trop Med Hyg. Nov;34(6):1173-8; Akira Tamura and Akiyoshi Kawamura 1991, J.CLIN.MICROBIOL. Feb.1991, Vol.29,No.2; WOO-HYUN CHANG et al. 1993, J.CLIN.MICROBIOL. Mar.1993,p.598-605). 한국에서는 보령, 길리암 및 카프 혈청형 감염이 주로 발생하고 있으며, 이중 보령 혈청형 감염이 가장 빈번하다(Chang WH et al. 1995. J Korean Med Sci 10:227-38 ;227-38 ; Lee et al. 2010, J.Trop Med Hyg 83(4):930-5 Yang et al 2011, PLoS ONE 6(8):e22731).
사람에서의 쯔쯔가무시병에 대한 면역은 한 가지 혈청형에 특이적이기 때문에 병에 걸린 후 생기는 방어 면역 능력은 같은 혈청형에 대해서는 2-3년간 지속되나, 다른 혈청형에 대해서는 방어 능력을 보이지 않는다(No Cross-immunity). 예를 들면, 4개월 동안 관찰한 쯔쯔가무시병 환자 중에서 처음에 길리엄(Gilliam) 혈청형에 감염되고 2달 후에 카프(Karp) 혈청형에 재감염 된 예가 증명된 바 있다. 또한 최근에는 동남아시아, 인도 등지에서 항생제 저항균의 보고 되고 있으므로 다수의 혈청형 균주에 대해 근본적으로 예방을 할 수 있는 백신의 개발이 필요한 상황이다(Watt G,　Parola P.2003. Curr Opin Infect Dis. Oct;16(5):429-36 ; Strickman　D et al. 1995. Lancet.　1996 Jul 13;348(9020):86-9.).
기존의 쯔쯔가무시병 백신의 개발은 포르말린 처리나 감마선 조사를 통한 사백신(Killed-vaccine), 56KDa(56-kDa Type-Specific Antigen Gene, TSA56)단백 및 47KDa의 외막단백질을 이용한 재조합단백질 백신(Subunit vaccine) 등이 연구되어 왔으나, 이들 백신들은 주입한 혈청형 균주에 대해서만 방어면역을 보이거나 방어면역능의 지속기간이 짧아 실용화하지 못하였다(Buckland and Dudgeon, 1945; Lancet 2, 734~737; Kawamura et al., 1940. Trop.Dis.Bull. 37, 269~270; Seong et al., 1997. Infect.Immun. 65, 1541~1545; Yu et al., 2005. Am.J.Trop.Med.Hyg. 72, 458~46).
따라서 다양한 혈청형 균주들에 대해 공통적으로 방어 면역을 유도할 수 있는 항원물질이 필요한 상황이다. 최근 논문에서 쯔쯔가무시균의 Sca 단백질들은 자가수송단백으로 균의 외막에 발현하고 있는 것이 확인되었다. 이들 Sca 단백질은 ScaA, ScaB, ScaC, ScaD, ScaE의 5가지 아형으로 나누어지는데, 보령균주에서만 확인되는 ScaB을 제외한 나머지 단백들의 아미노산 서열은 혈청형간에 상동성이 비교적 높은 것으로 확인 되었다(ScaA: 65.8~81.8%, ScaC: 77.4~97.5%, ScaD:69.7~93.8%, ScaE: 62.8~85.3%) (Ha et al., 2011 Infect Immun 79:1718-27).
본 발명은 ScaA와 ScaC가 쯔쯔가무시병 환자에서 항체 반응을 유도하는 것을 확인하였으며, 이 중 ScaA가 백신으로서 기능할 수 있음을 확인함으로써 완성된 것이다.
본 발명의 목적은 쯔쯔가무시 균에 대한 백신 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적이나 구체적인 목적은 이하에서 제시될 것이다.
본 발명자들은 아래의 실시예에서 확인되는 바와 같이, 쯔쯔가무시 균 보령(Boryoung) 혈청형의 유전체 DNA를 분리하여, 보령 혈청형의 유전 정보(GeneBank acession numberAM494475.1)를 기초로 하여 제작된 프라이머(아래의 [표 1] 참조)로 ScaA 및 ScaC 단백질의 패신저 도메인 영역의 일부를 증폭하고([도 1]의 ScaA 및 ScaC의 구조적 모식도, 그리고 [도 2] 및 [도 3]의 증폭된 염기서열(밑줄 부분임) 및 이에 상응하는 아미노산 서열(밑줄 부분임) 참조), 증폭된 DNA 단편들을 pET28a 백터에 삽입하여 대장균에 형질전환시켜 생산 분리한 다음에, 이들 단백질을 백신 항원으로 사용하여 면역 보강제 Alhydrogel®(Invivogen Inc. (San Diego, USA))와 함께 접종하고 1 주일 뒤 특이적 항체 생성을 확인한 결과 ScaA에 대해서 특이적인 IgM, IgG1, IgG2a 항체가 효과적으로 생성된 것을 확인할 수 있었다.
본 발명자들은 나아가 ScaA 및 ScaC 단백질의 패신저 도메인 영역의 일부가 백신으로서 기능을 하는지 확인하기 위하여 대장균에서 생산 분리된 상기 ScaA 및 ScaC 단백질의 패신저 도메인 영역의 일부를 면역 보강제 Alhydrogel(Invivogen Inc. (San Diego, USA))와 함께 생쥐에 접종 후 1 주일 뒤 쯔쯔가무시 균주(보령 혈청형)를 PBS로 희식시켜 감염시키고 생존율을 계산하였는데, ScaC를 접종한 시험군의 경우 보령 균주 접종 12일 이내에 모두 사망하였으나, ScaA를 접종한 시험군의 경우 보령 균주 접종 13일째 1마리가 사망하고 나머지 4마리는 모두 생존함을 확인하였다(생존율 80%). 양성대조군으로 사용한 TSA56의 경우 모두 생존하였으며(생존율 100%), 음성대조군으로 사용한 PBS의 경우는 보령 균주 접종 11일 이내에 모두 사망하였다(생존율 0%). 또한 이러한 ScaA는 보령 혈청형뿐만 아니라 카토 및 카프 혈청형에 감염된 경우에도 백신 효과를 보였으며 기존 사용되던 TSA56과 혼합 사용할 경우 더 뛰어난 백신 효과를 보였다.
전술한 바의 실험 결과는 ScaA 단백질이 쯔쯔가무시 균에 대한 백신의 활성성분으로서 유용함을 보여주는 결과라 할 수 있다.
본 발명은 이러한 실험 결과에 기초하여 제공되는 것으로서, 본 발명의 쯔쯔가무시 균에 대한 백신 조성물은 단리된 전장의 ScaA 단백질, 단리된 ScaA 단백질의 패신저 도메인 영역, 또는 단리된 ScaA 단백질의 패신저 도메인 영역의 실질적 일부를 활성성분으로 포함함을 특징으로 한다.
본 명세서에서, "백신"은 숙주인 사람에게서 해당 병원체에 대한 면역 반응을 유도함으로써 해당 병원체의 감염 또는 재감염의 예방, 해당 병원체에 의한 증상의 중증도 감소 또는 증상의 제거, 또는 해당 병원체나 그 병원체 의한 질환의 실질적 또는 완전한 제거를 포함하는 의미이다. 따라서 본 발명의 백신 조성물은 해당 병원체의 감염 전에 예방적으로 사람에게 투여되거나 해당 병원체의 감염 후에 치료적으로 사람에게 투여될 수 있다. 여기서 상기 "면역 반응"은 체액성 면역 반응, 세포성 면역 반응 또는 이들을 모두 포함하는 의미이다.
또 본 명세서에서, "단리된"은 그 대상 물질이 원래의 유기체(즉 본 발명에서는 쯔쯔가무시 균)에서 분리되었거나 유전자 재조합 방법에 의하여 제조될 경우 형질전환된 유기체로부터 분리되었음을 의미한다.
또 본 명세서에서, "활성성분"은 단독으로 면역 반응을 유도하거나 또는 그 자체로는 면역 반응을 유도할 수 없는 담체와 함께 면역 반응을 유도할 수 있는 성분을 의미한다. 따라서 활성성분은 스스로가 반드시 면역원성(면역 반응을 유도할 수 있는 능력)일 필요는 없다. 본 발명에서 상기 활성성분은 필수적이지는 않지만 정제된 것이 바람직하다. 여기서 "정제된"은 그 대상 물질이 존재하는 원래의 유기체(즉 본 발명에서는 쯔쯔가무시 균)나 형질전환된 유기체의 세포 성분 또는 그 배상액 성분(즉 오염물)이 실질적으로 감소되었거나 제거된 상태를 의미한다. 오염물이 실질적으로 감소되었거나 제거된 상태는 순도가 50% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더 바람직하게는 99% 이상을 의미한다. 순도는 크로마토그래피, 겔 전기영동, 면역학적 분석 등 당업계에 공지된 방법을 통하여 평가될 수 있으며, 정제 방법도 당업계에 잘 공지되어 있다.
본 명세서에서, 상기 "ScaA"는 쯔쯔가무시균의 Sca 단백질 5가지 유형 중 하나인 ScaA를 가리킨다. Sca 단백질은 숙주세포의 피브로넥틴(fibronectin)과 상호작용하여 숙주세포에 침입에 관여하는 단백질로서 C-말단 부위에는 오토트랜스포터(autotransporter) 도메인을 지니고 N-말단 부위에 신호 서열(signal peptide)을 지니며 중간에는 외벽 밖으로 발현하는 부위인 패신저(passenger) 도메인을 지니는데, 쯔쯔가무시균의 Sca 단백질 5가지 유형 즉 ScaA, ScaB, ScaC, ScaD 및 ScaE로 나누어진다. 이들 Sca 단백질은 보령균주에서만 확인되는 ScaB을 제외한 나머지 단백들의 아미노산 서열은 혈청형간에 상동성이 비교적 높은 것으로 확인되었다(ScaA: 65.8~81.8%, ScaC: 77.4~97.5%, ScaD:69.7~93.8%, ScaE: 62.8~85.3%)(Ha et al., 2011 Infect Immun 79:1718-27). 본 명세서에서, 상기 "ScaA"는 바람직하게는 그 전장(full-length)의 서열이 GenBank accession no. CAM79168.1 또는 서열번호 1에서 확인되는 단백질을 말한다. 이 ScaA 단백질의 유전자 서열도 GenBank accession no. CAM79168.1 또는 서열번호 3에서 확인할 수 있다.
또 본 명세서에서, "단리된 ScaA 단백질의 패신저 도메인 영역의 실질적 일부"란 ScaA 단백질의 패신져 도메인 영역 중에서 80% 이상의 연속된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 말하며, 바람직하게는 GenBank accession no. CAM79168.1 또는 서열번호 1에서 26번째 아미노산에서부터 1186번째 아미노산까지의 ScaA 단백질의 패신저 도메인 영역 중에서 80% 이상의 연속된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 말한다. 아래의 실시예에서 본 발명자들은 총 1161 아미노산 서열로 이루어진 ScaA 단백질의 패신저 도메인 영역 중 30번째 아미노산 서열에서 1000번째 아미노산 서열까지 총 971개의 아미노산 서열로 이루어진 폴레펩티드를 제조하였을 때 이 폴리펩티드가 백신으로서 충분히 기능함을 확인한 바 있는데, 이 폴레펩티드는 ScaA 단백질의 패신저 도메인 영역 중에서 83.6%에 해당하는 연속된 아미노산 서열로 이루어진 것이다. 이러한 실험 결과는 80% 이상의 연속된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드도 백신으로서 충분히 기능할 수 있음을 시사하는 것이라 할 수 있다.
또 본 명세서에서, 상기 "쯔쯔가무시 균"은 오리엔티아 쯔쯔가무시를 의미하는 것으로 그 하위 분류인 길리엄(Gilliam) 혈청형, 카프(Karp) 혈청형, 카토(Kato) 혈청형 및 보령(Boryoung) 혈청형을 포함하는 의미이다.
본 발명에서 상기 ScaA 단백질이나 그 패신저 도메인 영역 등은 DNA 재조합 기술에 대해 당업계에 공지된 방법으로 제조할 수 있다. 이러한 방법은 (i) 상기 분자를 암호화하는 유전자를 포함하는 발현벡터를 제조하고 (ii) 이 발현벡터를 숙주세포에 형질전환시키고 (iii) 형질전환된 숙주세포를 배양하고, 마지막으로 (iv) 그 배양물로부터 원하는 분자를 분리·정제하는 단계를 포함한다.
상기 분자를 암호화하는 유전자는 그 유전자 서열을 이용하여 쯔쯔가무시 균으로부터 얻을 수 있다. 예컨대 그 균의 게놈 DNA를 확보한 후 그 유전자 서열에 기초하여 제작된 프라이머로 증폭하여 얻을 수 있다.
상기 발현벡터는 플라스미드 또는 바이러스로부터 유래된 것일 수 있으며, 직접 제작하여 사용하거나 생명공학 회사 예컨대 노바겐(Novagen) 사, 다까라슈죠 사, 키아겐(Qiagen) 사, 스트라타진(Stratagene) 사, 프로메가(Promega) 사, 로슈 다이아그노스틱스(Roche Diagnositics) 사, 인비트로겐(Invitrogen) 사, 제네틱스 인스티튜트(Genetics Institute) 사 등으로부터 상업적으로 입수하여 사용할 수 있다.
발현벡터는 원하는 분자(ScaA 또는 그 패신저 도메인 등, 이하 "목적 단백질")를 암호화하는 유전자(이하 "목적 유전자")를 포함하고 그 목적 유전자의 발현을 유도하는 서열을 포함하여 구성된다. 여기서 목적 유전자의 발현을 유도하는 서열은 프로모터 서열, 폴리아데닐화 서열 등을 말한다. 여기서 프로모터는 목적 유전자의 전사를 유도할 수 있는 서열로서, 사이토메갈로 바이러스의 즉시 초기형 프로모터, SV40의 프로모터(SV 40 후기형 프로모터 및 SV 40 초기형 프로모터), HSV(herpes simplex virus)의 tk 프로모터, 아데노바이러스 2 주요 후기형 프로모터(Adeno 2 major late promoter PAdml), 아데노 바이러스 2 초기형 프로모터(PAdE2) 등이 예시될 수 있으며, 또한 여기서 폴리아데닐화 서열은 전사 종결 서열로서 소성장 호르몬 터미네이터(Gimmi, E. R., et al., Nucleic Acids Res. 17:6983-6998(1989)), SV40 유래 폴리 아데닐화 서열(Schek, N, et al., Mol. Cell Biol. 12:5386-5393(1992)), HIV-1 polyA(Klasens, B. I. F., et al., Nucleic Acids Res. 26:1870-1876(1998)), β-글로빈 polyA(Gil, A., et al, Cell 49:399-406(1987)) 등이 예시될 수 있다.
또한 상기 발현벡터는 선택적으로 리포터(예: 루시퍼라아제, β-글루쿠로니다아제) 유전자나 선택 표지 유전자로서 항생제(예: 네오마이신, 카베니실린, 카나마이신, 스펙티노마이신, 하이그로마이신 등) 내성 유전자 등을 포함할 수 있으며, 또한 선택적으로 발현 효율을 향상시키기 위하여 인핸서 분자를 포함할 수 있다.
형질전환될 수 있는 숙주세포로는 세균 등의 원핵 세포(예를 들면 대장균, 고초균)나, 효모(예를 들면 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)), 곤충 세포(예를 들면 Sf 세포), 포유 동물 세포(예를 들면 COS, CHO, BHK) 등의 진핵 세포를 사용할 수 있다.
형질전환 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용할 수 있으며, 그러한 방법으로서 예컨대 미세 주입법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 침전법(Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기 천공법(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법(Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc.Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)), 초산-리튬 DMSO법(Hill et al., Nucleic Acid Res., 19, 5791(1991)) 등을 들 수 있다.
형질전환된 숙주세포의 배양도 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.
세포 배양에 사용되는 배지는 형질전환된 숙주세포가 효율적으로 이용할 수 있는 탄소원, 질소원, 무기염 등을 포함한다면 천연 배지와 합성 배지 모두를 사용할 수 있다. 만일 숙주세포로서 동물세포를 사용할 경우, 예컨대 Eagles's MEM (Eagle's minimum essential medium, Eagle, H. Science 130:432(1959)), α-MEM (Stanner, C.P. et al., Nat. New Biol. 230:52(1971)), Iscove's MEM (Iscove, N. et al., J. Exp.Med.147:923(1978)), DMEM (Dulbecco's modification of Eagle's medium, Dulbecco, R. et al., Virology 8:396(1959)) 등을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 배지에 대해서 구체적인 것은 문헌 [R. Ian Freshney, Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique, Alan R. Liss, Inc., New York]를 참조할 수 있다.
목적 단백질의 분리·정제 방법도 당업계에 공지되어 있으며, 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다. 예컨대 한외 여과, 겔 여과, 이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피(표지 펩티드가 결합된 경우), HPLC, 소수성 크로마토그래피, 등전점 크로마토그래피 등의 방법이나 이들을 조합하는 방법이 사용될 수 있다.
DNA 재조합 기술에 의한 본 발명의 목적 단백질의 생산에 대해서는 본 명세서의 기재 내용 이외에 문헌[Sambrook 등, Molecular Cloning A Laboratory Mannual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, US(1989)], 문헌[DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985)], 문헌[Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed. 1984)], 문헌[Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)], 문헌[Transcription And Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984)], 문헌[Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1986))], 문헌[Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, (1986)], 문헌[B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984)], 문헌[Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Jon Willey & Sons, US(1993)], 문헌[F.M. Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994)], 문헌[Sambrook, J. ＆ Russel, D., Molecular Cloning, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001년 1월 15일 발행의 제1권 7.42 내지 7.45, 제2권 8.9 내지 8.17] 등을 참조할 수 있다. 이들 문헌은 본 명세서의 일부로서 간주 된다.
한편 아래의 실시예는 ScaA 항원을 TSA56(56-kDa Type-Specific Antigen, 56kDa) 항원과 함께 사용할 경우 백신으로서의 효과가 더 뛰어남을 보여준다.
따라서 본 발명의 백신 조성물은 활성성분으로서 ScaA 이외에 TSA56을 추가로 포함할 수 있다. TSA56을 이용한 재조합 단백질 백신은 주입한 혈청형 균주에 대해서만 방어 면역을 보이거나 방어 면역능의 지속 기간이 짧은 문제점이 있다고 알려져 있다(Seong et al., 1997. Infect.Immun. 65, 1541-1545; Yu et al., 2005. Am.J.Trop.Med.Hyg. 72, 458-46).
본 명세서에서, 상기 "TSA56"은 숙주세포의 세포 외 기질 당단백질인 피브로넥틴과 상호작용하여 균의 숙주세포 감염을 돕는 기능을 가지는 쯔쯔가무시 균의 세포막 단백질을 말한다(Lee et al.,J Infect Dis. 2008;198: 250-257; Cho BA et al., Infect Immun. 2010 May;78(5):1915-23.). 바람직하게는 그 전장(full-length)의 서열이 GenBank accession no. CAM79668.1 또는 서열번호 2에서 확인되는 단백질을 말한다. 서열번호 2에 개시된 TSA56 단백질의 유전자 서열도 GenBank accession no CAM79668.1 또는 서열번호 4에서 확인할 수 있다.
본 발명의 백신 조성물에 활성성분으로서 ScaA와 함께 포함될 수 있는 TSA56은 그 전장의 단백질뿐만 아니라 그것의 항원성 영역(antigenic domain)일 수 있으며 그 항원성 영역의 실질적 일부일 수 있다. 여기서 항원성 영역은 [도 1]의 모식도에 있어서 도메인 AD I에서부터 AD Ⅳ까지 연속적인 아미노산 서열로 이루어진 영역을 말하며, 서열번호 2에서는 19번째 아미노산에서 432번째 아미노산까지의 서열을 말한다. 이들 도메인은 항체 생성이 높은 도메인으로 알려져 있다(Infect Immun. 1999 67(11): 6194~6197).
또 상기에서 "항원성 영역의 실질적 일부"란 도메인 AD I에서부터 AD Ⅳ까지 연속적인 아미노산 서열로 이루어진 영역에서 80% 이상의 연속된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 말하며, 바람직하게는 서열번호 2에서 19번째 아미노산에서부터 432번째 아미노산까지의 TSA56 단백질의 항원성 영역 중에서 80% 이상의 연속된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 말한다. 아래의 실시예에서 서열번호 2의 총 414개의 아미노산으로 서열로 이루어진 TSA56 단백질의 항원성 영역 중 85번째 아미노산에서 420번째 아미노산까지의 총 336개의 아미노산으로 이루어진 폴레펩티드를 제조하고 그 폴리펩티드가 백신으로서 충분히 기능함을 확인한 바 있는데, 이 폴레펩티드는 TSA56 단백질의 항원성 영역 중에서 81.1%에 해당하는 연속된 아미노산 서열로 이루어진 것이다. 이러한 실험 결과는 80% 이상의 연속된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드도 백신으로서 충분히 기능할 수 있음을 시사하는 것이라 할 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 임의의 적절한, 약학적으로 허용되는 제제로 제조될 수 있다. 예컨대 즉석 투여 용액 또는 현탁액 형태이거나, 투여 전 희석에 적절한 농축된 원액이거나, 또는 재구성 가능한 형태 예컨대 동결건조, 냉동-건조, 또는 냉동 제제 형태로 제조될 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 포함하여 제제화될 수 있다. 백신 조성물의 제제화를 위하여 사용될 수 있는 약학적으로 허용되는 담체는 대한민국 약전이나 제외국의 약전 특히 미국, 일본, 유럽의 약전에 열거·규정되어 있다.
이러한 담체는 통상 희석제, 부형제, 안정화제, 방부제 등을 포함할 것이다. 적절한 희석제로서는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유, 땅콩유와 같은 식물성유 등의 비수성 용매나 염수(바람직하게는 0.8%의 염수), 완충 매질을 포함한 물(바람직하게는 0.05M의 인산염 완충액) 등의 수성 용매 등을 들 수 있고, 적절한 부형제로서는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카 겔, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 나트륨 클로라이드, 무수 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 들 수 있으며, 적절한 안정화제로서는 소르비톨, 만니톨, 전분, 수크로스, 덱스트란, 글루타메이트, 글루코스 등의 탄수화물이나 분유, 혈청 알부민, 카제인 등의 동물성, 식물성 또는 미생물성 단백질 등의 단백질을 들 수 있다. 적절한 방부제로서는 티메로살, 메르티올레이트, 젠타마이신, 네오마이신, 니스타틴, 암포테리신 B, 테트라사이클린, 페니실린, 스트렙토마이신, 폴리믹신 B 등을 들 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 항원 보조제(adjuvant)를 추가로 포함할 수 있다. 항원 보조제는 항원에 대한 면역 반응을 증강시키는 하나 이상의 물질로 이루어진 것일 수 있다. 보조제는 항원을 서서히 방출시키는 조직 저장소로서 및/또는 면역 반응을 비특이적으로 증강시키는 임파성 시스템 활성자로서 기능할 수 있다(Hood et al., Immunology, Second Ed., 1984, benjamin/Cummings: Menlo Park, California, p.384). 항원 보조제는 예컨대 완전 프로인트(Freund), 불완전 프로인트, 사포닌, 겔 성상의 알루미늄 보조제, 표면 활성 물질(예: 리소레시틴, 플루론 글리콜, 다중 음이온, 펩티드, 오일 또는 탄화수소 에멀젼 등), 식물성 오일(면실유, 땅콩유, 옥수수유 등), 비타민 E 아세테이트 등일 수 있다.
현재 인체에 적용 가능한 항원 보조제 중에서 가장 널리 사용되고 있는 것은 알루미늄 보조제이며, 이러한 알루미늄 보조제는 인산알루미늄(Aluminum phosphate), Potassium aluminum sulfate, 수산화 알루미늄(Aluminum hydroxide) 등 알루미늄 염(Aluminium salts)의 겔 성상으로 사용되고 있다. 이러한 알루미늄 보조제는 일반적으로 Th2-type의 면역반응을 이끌어내어 백신 효과를 증강시키는 것으로 알려져 있다(Sokolovska A et al., Vaccine. 2007 Jun 6;25(23):4575-85; O'Hagan DT AND Rappuoli R., Pharm Res. 2004 Sep;21(9):1519-30.) 본 발명의 실시예에서 사용한 Invivogen사의 Alhydrogel®은 수산화 알루미늄(Aluminium hydroxide)의 겔 형태 현탁액(colloidal)이다. 이러한 알루미늄 보조제는 그 제조 방법이 당업계에 공지되어 있어(R. Bomford. Immunological Adjuvants and Vaccines. NATO ASI Series 1989;179:35-41; Vogel FR AND Powell MF. Pharm Biotechnol. 1995;6:141-228.;Derek T. O'Hagan, Methods in Molecular Medicine. 2000; April 15; 42: 65-90) 직접 제조하여 사용하거나, 상업적으로 유통되는 제품을 구입하여 사용할 수도 있다. 상업적으로 유통되는 제품으로서는 아래의 실시예에서 사용된 Invivogen사의 Alhydrogel® 2% 제품을 비롯하여 Sigma사의 Aluminum hydroxide Gel 제품, BRENNTAG사의 Alhydrogel™ 제품 등을 들 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 임의적 단위 용량으로 제조될 수 있다. 단위 용량은 사람에 1회 이상 투여되기 위한 용도로 포장된 낱개의 제품에 포함된 활성성분과 약학적으로 허용되는 담체의 양을 말하는 것으로, 이러한 활성성분과 담체의 적절한 양은 본 발명의 백신 조성물이 1회 이상 접종될 때 백신으로서 기능할 수 있는 양으로 이러한 양은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 비임상적 및 임상적으로 결정될 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 바람직하게는 비경구적으로 예컨대 직장, 경피, 정맥 내 주사, 동맥 내 주사, 근육 내 주사, 피 내 주사, 피하 주사, 복막 내 주사, 심실 내 주사 등을 통해 투여될 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 조절 방출 시스템으로 투여될 수 있다. 예컨대 그러한 조절 방출 시스템으로서는 리포좀, 이식 삼투성 펌프, 경피 패치 등의 방식 등을 들 수 있다. 바람직하게는 리포좀 방식으로 활성성분을 전달하는 경우이다. 리포좀 방식에 의해 활성성분을 전달하는 것과 관련해서는 문헌[Langer, Science 249: 1527-1533 (1990)], 문헌[Treat at al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (des.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989)] 등을 참조할 수 있다. 여타의 활성성분의 전달 방식과 관련해서는 문헌 [Langer, supra; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987)], 문헌[Buchwald et al., Surgery 88: 507 (1980)], 문헌[Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321:574 (1989)], 문헌 [Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974)], 문헌[Controlled Drug Bioavailability. Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984)], 문헌[Ranger and Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61 (1983)], 문헌[During et al., Ann. Neurol. 25:351 (1989)], 문헌[Howard et al., J. Neurosurg. 71:105 (1989)] 등을 참조할 수 있다. 이들 문헌은 본 명세서의 일부로서 간주된다.
본 발명의 백신 조성물의 투여량은 의료인에 의해 나이, 체중, 성별, 증상, 합병증, 다른 질환의 이환 유무 등의 환자 특성을 고려하여 결정될 수 있다.
또한 투여의 시간적 간격과 횟수는 사용되는 제형이나 활성성분의 혈중 반감기 등을 고려하여 결정될 수 있다.
이처럼 투여량과 투여의 시간적 간격이나 횟수는 의료인의 판단에 따라 좌우되고 개인에 따라 결정되어야 하지만, 통상의 적절한 투여량은 1일 기준 개인 체중 1kg당 약 0.1 내지 10mg 범위 내에서 결정될 것이고 투여 간격은 3 내지 10일, 투여 횟수는 1 내지 5회 범위 내에서 결정될 것이다.
진술한 바와 같이, 본 발명에 따르면 ScaA 단백질이나 그 패신저 도메인 영역을 이용한 쯔즈가무시 균에 대한 백신 조성물을 제공할 수 있다. 활성성분인 ScaA 단백질이나 그 패신저 도메인 영역은 보다 효과적인 면역 반응을 유도하기 위하여 필요에 따라 TSA56 등 다른 항원과 함께 사용될 수 있으며 항원 보조제를 추가로 사용할 수 있다.
도 1은 ScaA 및 TSA56 단백질의 구조적 모식도와 증폭된 염기서열에 상응하는 아미노산 위치를 도시한 것이다. 백신에 사용된 항원 영역을 밑줄로 표시하였다.
도 2 내지 도 4는 각각 백신 항원으로 사용된 ScaA, ScaC 및 TSA56의 핵산 및 아미노산 서열을 나열한 것이다. 백신에 사용된 항원 영역을 밑줄로 표시하였다.
도 5는 정제된 쯔쯔가무시균 항원들(TSA56, ScaA, ScaC)을 전기영동 한 후 Coomasie blue 염색과 쯔쯔가무시병 환자 혈청을 이용한 immunoblot을 통하여 그 반응성을 확인한 결과이다.
도 6은 항원 접종에 의하여 생성된 항원 특이적 항체반응을 나타내는 ELISA 결과이다.
도 7은 각기 다른 쯔쯔가무시병 항원(TSA56, ScaA, ScaC)을 면역한 생쥐에 보령 균주를 감염시키고 그 생존율을 관찰한 결과이다.
도 8은 ScaA 및 TSA56 항원과 Alhydrogel을 혼합하여 면역한 생쥐에 쯔쯔가무시균 보령, 카프, 카토 혈청형 균주를 감염시키고 그 생존율을 관찰한 결과이다.
본 발명을 실시예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 쯔쯔가무시균의 genomic DNA 정제 및 백신 후보 항원 항원 유전자들의 증폭과 클로닝
실험에 사용할 ScaA, ScaC 및 TSA56 항원 유전자는 오리엔티아 보령 혈청형(GenBank accession number AM494475.1)으로부터 획득하였다.
Sca 항원 및 TSA56 항원을 제조하기 위하여 먼저 보령 균주를 L929 세포(마우스 섬유아세포주; ATCC NTCT929)에 감염시켜 증식 배양하였으며, 감염 3-4일 후 간접면역형광기술을 수행하여 감염률을 확인하고 감염률이 90% 이상이 되면 세포를 600 x g로 20분 동안 원심분리하여 침전시키고 6.5ml의 Tris-sucrose(TS) 완충액(33mMTris-Cl[pH 7.4] and 0.25 M sucrose)에 현탁시켰다. 현탁된 세포를 Polytron homogenizer(Wheaton Inc. Millville, NJ)를 이용하여 균질화한 후 5분 동안 200 x g로 원심분리 하였다. 원심분리 후 상층액을 TS 완충액에 들어있는 40% Percoll (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden)과 섞은 후 2500 x g에서 60분 동안 원심분리 하였다. 침전된 세균들을 모아 7700 x g로 30분 동안 원심분리하고, 얻어진 세균들에서 RBC Genomic DNA extraction kit(RBC Bioscience Co., Taipei City, Taiwan)를 이용하여 균의 유전체 DNA를 확보하였다.
쯔쯔가무시균 보령 혈청형의 정보(GeneBank acession numberAM494475.1)를 기초로 하여 ［표 1］과 같이 디자인된 프라이머와 상기에서 분리한 유전체 DNA을 이용하여 ScaA유전자를 GeneAmp PCR system 9700 thermal cycler (Applied Biosystems,USA)을 이용하여 증폭하였다. 여기서 PCR의 수행 조건은 다음과 같다
ScaA: 95℃(5mins)에서 pre-heating후 95℃(30s)-58℃(30s)-68℃(4min40s)을 30cycle반복 진행 후 68℃(5mins)의 추가 반응하였다.
ScaC: 95℃(5mins)에서 pre-heating후 95℃(30s)-60℃(30s)-72℃(60s)을 30cycle반복 진행 후 72℃(5mins)의 추가 반응하였다.
TSA56: 95℃(5mins)에서 pre-heating후 95℃(30s)-50℃(30s)-68℃(90s)을 30cycle반복 진행 후 72℃(5mins)의 추가 반응하였다.
그리고 ScaA 및 ScaC 유전자의 증폭된 영역은 Sca단백질의 구조적 모식도를 도시한 [도 1]에서 청색 라인(염기 서열)과 적색 라인(아미노산 서열)으로 표시된 패신저(passenger)도메인 영역이며, 여기서 서열 위치 표기는 보령 혈청형을 기준으로 하였다.
그리고 [도 1]에서 TSA56 유전자의 증폭된 영역도 함께 표시하였으며, 마찬가지로 청색 라인은 염기 서열을 표기한 것이고 적색 라인은 아미노산 서열을 표기한 것이며 보령 혈청형을 기준으로 하였다.
참고로 [도 1]에서 SP는 signal peptide, TM은 transmembrane, AT는 autotransporter domain, AA는 아미노산을 가리킨다.
증폭된 DNA 단편들은 pET28a vector에 클로닝하고 염기서열 분석을 통해 유전자 삽입을 확인하였다([도 2] 내지 [도 4] 참조).
표 1
Figure PCTKR2014003710-appb-T000001
< 실시예 2> 백신 후보 항원 재조합 단백질의 제조 및 정제
상기에 얻은 유전체 DNA를 이용하여 상기 [표 1]의 프라이머로 증폭한 각 유전자를 pET28a vector에 삽입하고 이 백터를 Escherichia coli BL21(DE3) (Novagen, Darmstadt, Germany)에 도입한 후 카나마이신(30㎍/ml)를 함유 한 LB broth에서 배양하였다. 0.1mM isopropyl β-D-thiogalactoside(IPTG; Duchefa, Zwijndrecht, Netherlands)를 16℃에서 18시간 동안 배양하여 단백질의 발현을 유도하였으며 이후 균을 10분 동안 1,000xg의 속도로 원심분리한 후 1mg/ml의 리소자임(lysozyme)을 포함하는 결합 완충액(300 mMNaCl, 50 mM sodium phosphate buffer, 10mM imidazole)에 현탁시켜 4℃에서 30분 동안 반응시켰다. 이후 얼음 위에서 5분간 음파처리를 하였으며 이를 통해 얻어진 용해물을 1,600xg의 속도로 4℃에서 20분간 원심분리하였다. 상층액을 수거하고 결합 완충액으로 미리 평형화시킨 Ni-nitrilotriacetic acid (NTA) His-결합 레진(Qiagen)에 적용한 후 용리 완충액 (300 mM NaCl, 50 mM sodium phosphate buffer, 250 mM imidazole)를 부어 단백질을 얻어냈다. 단백질의 정제 여부는 SDS-PAGE분석을 통해 확인하였다[도 3]. 자유 이미다졸을 제거하기 위하여 PBS용액(pH7.4)에 4℃/18시간 동안 투석(Dialysis)을 진행하였으며 정제된 단백질은 내독소(Endotoxin)을 제거하기 위해 Endotoxin removal resin(Pierce)을 사용하였으며, 이를 LAL(Limulus amebocyte lysate) assay kit(Lonza)을 이용하여 EU<0.05/dose 수준으로 제거되는 것을 확인한 후 면역 반응을 이용한 실험에 사용하였다.
순수 정제된 단백질들은 [도 5]에서와 같이 SDS PAGE와 Coomasie blue 염색, 쯔쯔가무시병 환자 혈청을 이용한 immunoblot으로 확인하였으며, 이 단백질 용액을 백신 항원으로 사용하였다.
< 실시예 3> 백신 후보 항원을 이용한 면역 활성화 실험
< 실시예 3-1> 실험 방법
마우스의 사용 및 관리
본 발명에서 사용된 마우스는 C57BL/6 strain이며 모든 실험에서 5주령의 암컷을 사용하였다.
본 동물실험은 서울대학교 동물실험위원회의 동물사용에 관한 규정에 따라 실시하였으며, 백신제제의 면역 및 균 감염실험은 Biosafety level 3 (BL3) 실험실 내에서 모두 진행하였다.
Sca 단백질 항원 백신 접종 및 혈액 내 항체 정량
Sca 등 단백질 항원 면역을 위해 정제된 재조합 Sca 등의 단백질 20㎍을 인산 완충액과 총량이 50㎕이 되게 섞어준 후, 2% Alhydrogel®(Invivogen. Vac-alu-50) 50㎕을 첨가하여 총량 혼합 비율(final volume ratio)이 1:1이 되게 하여 실온에서 15분간 반응시켜 주었다.
백신 제제는 1ml 용량의 인슐린 주사기를 이용하여 총량 100㎕을 마우스의 등(Dorsal part)의 피하(Subcutaneous)로 접종하였다. 각 시험군으로서 5 마리의 C57BL/6 strain 5주령의 암컷 마우스를 사용하였고, 시험군의 구성은 아래의 [표 2]와 같이 구성하였으며, 구체적으로 인산 완충액 단독(PBS), ScaA 재조합 단백질 단독, ScaC 재조합 단백질 단독, Alhydrogel과 ScaA 재조합단백질 혼합물, Alhydrogel과 ScaC 재조합단백질 혼합물, Alhydrogel과 56KDa 재조합단백질 혼합물, Alhydrogel과 동량의 ScaA, 56KDa(TSA56) 재조합단백질 혼합물을 접종한 마우스가 사용되었다(아래 [표 2] 참조).
표 2
Figure PCTKR2014003710-appb-T000002
각각의 시험군에서 생쥐 5마리씩 면역하였고, 2주 간격으로 총 3회 접종을 실시하였다. 매회 접종 1주일 후 안와 채혈을 통해 각 마우스에서 50 ㎕씩 채취하여 2500 x g로 5분간 원침하여 혈장을 분리하였다. 분리된 혈장을 Sca 등의 단백질에 대한 특이적인 항체 측정에 사용하였다. 또한 항원을 면역하지 않은 음성대조군에서 측정된 흡광도를 기준으로 항체 역가를 결정하였다.
Sca 등의 항원 특이 항체 정량을 위한 ELISA
ELISA 방법을 이용하여 면역 후 생성된 ScaA, ScaC 및 TSA56 항원에 대한 특이 항체 정량을 수행하였다.
Immunoassay plates(96-well plates; Nunc, Rochester, NY)에 각 ScaA, ScaC 및 TSA56 항원을 0.05M bicarbonate buffer (pH 9.5)에 1㎍/㎖의 농도로 첨가한 뒤 100㎕/well로 분주하여 4℃에서 18시간 동안 코팅하였다. 이후 세척액(0.05% Phosphatate Buffered Sakine Tween-20, PBST)을 이용해 항원 용액을 제거하고 3% BSA(Bovine serum albumin)로 실온에서 2시간 동안 Blocking을 실시하였다. 준비된 생쥐의 혈장을 100배 희석하고 이를 1/2 씩 단계희석(serial dilution)하여 100㎕/well로 첨가하여 실온에서 1시간 동안 반응시켜 주었다. 각 well을 PBST로 3회 세척하고 생쥐의 IgM, IgG1 또는 IgG2a을 인식 할 수 있는 Horseradish peroxidase(HRP)-conjugated Rat-IgM 또는 Horseradish peroxidase(HRP)-conjugated Rat-IgG 항체를 실온에서 1시간 동안 반응시켜 준 뒤 다시 PBST로 3회 세척하였다. 발색약인 TMB 용액(KPL)사용하여 상온에서 10분간 반응시키고, 반응 정지액인 1N H2SO4를 50㎕씩 각 well에 첨가하였다. Microplate reader을 이용해 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
면역한 마우스의 쯔쯔가무시균 감염실험
쯔쯔가무시균의 Sca 재조합 단백질 백신 제제를 접종하였을 경우 보호면역 반응이 유발되는지 확인하기 위해 인산 완충액 단독, ScaA(20㎍) 재조합 단백질 단독, ScaC(20㎍) 재조합 단백질 단독, Alhydrogel과 ScaA(20㎍) 재조합 단백질 혼합물, Alhydrogel과 ScaC(20㎍) 재조합 단백질 혼합물, Alhydrogel과 TSA56(20㎍) 재조합단백질 혼합물의 실험군으로 나누어 1차 실험을 진행하였다.
2주일 간격으로 총 3회 면역을 실시하였으며, 동종 혈청형(Homologous serotype)에 대한 반응을 살펴보기 위해 일주일 뒤 마우스에 반 수치량(Lethal Dose 50)의 10배, 100 배의 쯔쯔가무시균 보령 균주를 PBS에 200㎕ 용량으로 희석시킨 후, 마우스의 복강내로 주입하였으며 생존율을 확인하였다.
1차 동물실험을 수행한 후 Sca 등의 재조합 단백질이 이종 혈청형(Heterologous serotype)에 대한 보호 면역 효과를 보이는지 확인하기 위한 2차 실험을 진행하였다. Alhydrogel 단독, Alhydrogel과 ScaA 재조합단백질 혼합물, Alhydrogel과 TSA56 재조합단백질 혼합물, Alhydrogel과 동량의 ScaA, TSA56 재조합단백질 혼합물 투여 실험군으로 나누어 실험을 수행하였다.
2주일 간격으로 총 3회의 면역을 실시하였으며, 일주일 뒤 마우스에 반 수치량(Lethal Dose 50)의 10배, 100 배의 쯔쯔가무시균 보령 균주 이외에 카프, 카토 균주를 PBS에 200㎕ 용량으로 희석시킨 후, 마우스의 복강내로 주입하였으며 생존율을 확인하였다.
<실시예 3-2> 실험결과
Sca 특이적 항체 생성 결과
상기 실험 방법에 제시된 대로, 항원특이적인 IgG1과 IgG2a항체의 isotype별로 측정을 실시하였다. IgG1과 IgG2a항체를 측정한 이유는 IgG1와 IgG2a 항체가 각각 TH2 및 TH1 반응의 활성을 반영하는 것으로 알려져 있기 때문이다. TH1 면역반응은 주로 세포 매개 면역반응을 촉진하고 TH2 면역반응은 주로 체액 면역 반응을 촉진하는 것으로 알려져 있으며, 쯔쯔가무시균에 대한 효과적인 면역반응은 TH1 반응인 것으로 알려져 있다.
[도 6]에 ScaA, ScaC, TSA56 단백질 항원을 접종한 후 생성된 각각의 항원에 대한 항체 역가를 측정 결과를 나타내었다. IgG1과 IgG2a항체 뿐 아니라 초기 면역 반응에 관여하는 IgM의 수치도 확인하였다.
[도 6]의 결과를 참조하여 보면, Alhydrogel과 ScaA 재조합 단백질 혼합물 및 Alhydrogel과 동량의 ScaA, TSA56 재조합단백질 혼합물을 면역한 마우스그룹에서 ScaA 특이적인 IgM, IgG1, IgG2a 항체가 모두 효과적으로 생성되었으며 이를 통해 강력한 체액성 면역 반응을 유발되었다는 것을 알 수 있다.
면역한 마우스의 쯔쯔가무시균 감염실험 결과
상기 실험 방법에 제시된 대로, 상기 [표 2]의 백신 후보 물질을 3회 접종 후 1주일 뒤 반수치량(Lethal Dose 50)의 10배, 100 배의 쯔쯔가무시균 보령, 카프, 카토 균주를 PBS에 200㎕ 용량으로 희석시킨 후, 마우스의 복강 내로 주입하고 마우스의 생존율(Survival rate)을 관찰한 결과를 [도 7] 및 [도 8]에 나타내었다.
[도 7]은 반수치량(Lethal Dose 50)의 10배, 100 배의 보령 혈청형 감염에 대한 생존율을 확인한 1차 실험 결과이며, [도 8]은 보령 혈청형, 카프 혈청형 및 카토 혈청형 감염에 대한 생존율을 추가적으로 확인한 2차 실험 결과이다.
[도 7]의 결과에서 나타나듯이, ScaC를 면역한 시험군(ScaC 및 Alum+ScaC)은 항원을 면역하지 않은 음성대조군(PBS)과 비슷하게 감염 12일과 13일 이내에 모두 사망하였으나, ScaA를 면역한 시험군에서는 항원보조제인 Alhydrogel과 혼합 투여할 경우(Alum+ScaA) 보령 혈청형의 주입량을 불문하고 1마리만 사망하고 나머지 생쥐들은 모두 생존하여 80%의 생존율을 보였다. 기존에 알려진 대로, 보령 균주에서 유래한 TSA56 단백질로 면역한 시험군(TSA56/Alum)은 모두 생존하였다. 따라서 ScaA는 ScaC에 비하여 더 효과적으로 방어 면역능을 유도할 수 있는 것으로 확인되었으며, 그 효능은 기존에 알려진 TSA56 단백질과 거의 유사한 것으로 확인되었다.
또한 [도 8]을 참조할 때, 감염시킨 혈청형과 그 주입량을 불문하고 대체로 TSA56와 ScaA의 혼합 백신 제제, ScaA 백신 제제 및 TSA56 백신 제제 순으로 효과가 높음을 알 수 있다. 특히 TSA56와 ScaA의 혼합 백신 제제는 보령 혈청형 및 카프 혈청에 대해서 실험 기간인 30일까지 100% 생존율을 보였다.
서열번호 1: ScaA 단백질의 아미노산서열
서열번호 2: TSA56 단백질의 아미노산서열
서열번호 3: ScaA 단백질의 염기서열
서열번호 4: TSA56 단백질의 염기서열

Claims (10)

  1. 단리된 전장의 ScaA 단백질, 단리된 ScaA 단백질의 패신저 도메인 영역, 또는 단리된 ScaA 단백질의 패신저 도메인 영역의 실질적 일부를 활성성분으로 포함하는 오리엔티아 쯔쯔가무시 균에 대한 백신 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 단리된 ScaA 단백질의 패신저 도메인 영역의 실질적 일부는 서열번호 1에서 26번째 아미노산에서부터 1186번째 아미노산까지의 ScaA 단백질의 패신저 도메인 영역 중에서 80% 이상의 연속된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 오리엔티아 쯔쯔가무시 균에 대한 백신 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 단리된 ScaA 단백질의 패신저 도메인 영역의 실질적 일부는 서열번호 1에서 30번째 아미노산 서열에서 1000번째 아미노산 서열까지 총 971개의 아미노산 서열로 이루어진 폴레펩티드인 것을 특징으로 하는 오리엔티아 쯔쯔가무시 균에 대한 백신 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 오리엔티아 쯔쯔가무시 균은 카프 혈청형, 카토 혈청형, 길리엄 혈청형 및 보령 혈청형에서 선택된 혈청형인 것을 특징을 하는 오리엔티아 쯔쯔가무시 균에 대한 백신 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 오리엔티아 쯔쯔가무시 균은 보령 혈청형, 카프 혈청형 및 카토 혈청형에서 선택된 혈청형인 것을 특징을 하는 오리엔티아 쯔쯔가무시 균에 대한 백신 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 오리엔티아 쯔쯔가무시 균에 대한 백신 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 약학적으로 허용되는 담체는 희석제, 부형제, 안정화제 및 방부제로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 오리엔티아 쯔쯔가무시 균에 대한 백신 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 단리된 TSA56 단백질 또는 그것의 단리된 항원성 영역을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 오리엔티아 쯔쯔가무시 균에 대한 백신 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항에 있어서,
    상기 조성물은 항원 보조제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 오리엔티아 쯔쯔가무시 균에 대한 백신 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 항원 보조제는 겔 상의 알루미늄염인 것을 특징으로 하는 오리엔티아 쯔쯔가무시 균에 대한 백신 조성물.
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