WO2015137449A1 - トリアシルグリセロール高生産性藻類の作製法 - Google Patents

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雅子 岩井
啓之 太田
美恵 下嶋
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    • C12P7/6463—Glycerides obtained from glyceride producing microorganisms, e.g. single cell oil
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    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12Y203/01085—Fatty-acid synthase (2.3.1.85)

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing triacylglycerol (hereinafter referred to as “TAG”) high productivity algae, a TAG high productivity algae, and a method for producing TAG using the algae.
  • TAG triacylglycerol
  • Non-Patent Document 1 Non-Patent Document 1
  • Non-Patent Document 1 discloses a method in which DGAT2 gene added with psaD, which is a strong expression promoter, is introduced into C. reinhardtii, cultured under nitrogen or sulfur deficient conditions, and TAG is accumulated in the cells. Are listed. Patent Document 1 also describes C. reinhardtii into which DGAT2 gene added with psaD is introduced, as in Non-Patent Document 1.
  • the algae belonging to the genus Nannochloropsis has attracted attention for the production of TAG. Since this algae can be cultured at a density about 100 times that of C. reinhardtii, it is considered to be more suitable for TAG production than C. reinhardtii.
  • Non-Patent Document 1 describes that there was no statistically significant difference in the accumulated amount of TAG between the DGAT2 gene-introduced strain and the wild strain under either nitrogen deficiency or sulfur deficiency conditions. (Fig. 5 etc.).
  • the object of the present invention is to provide a means for efficiently accumulating TAG in algal cells under such a background.
  • the present inventor first thought that there was a cause in the promoter that a sufficient amount of TAG was not accumulated in the conventional method. That is, although TAG is accumulated at the time of nutrient deficiency, we thought that a strong expression promoter such as psaD may not function sufficiently at the time of nutrient deficiency. Therefore, the idea of using a nutrient deficiency responsive promoter instead of a strong expression promoter was obtained.
  • the present inventor examined the accumulation amount of TAG and the fatty acid composition of TAG under nitrogen deficient condition and phosphorus deficient condition. As a result, 1) When proliferating cells are transplanted, the amount of TAG accumulated is higher in phosphorus deficient conditions than in nitrogen deficient conditions.
  • the present inventor succeeded in producing a C. reinhardtii strain having high TAG production ability by introducing the DGTT4 gene to which the promoter of the SQD2a gene was added into C. reinhardtii.
  • a patent application was filed for the sex C. reinhardtii strain (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2014-68638, which was not published at the time of filing of Japanese Patent Application No. 2014-049651, which is the basis of the priority of the present application).
  • the present inventor has further advanced this research and succeeded in obtaining an algal strain having a high TAG production ability for algae belonging to the genus Nannochloropsis, which is an algae more suitable for TAG production than C. reinhardtii.
  • a TAG high productivity strain can be efficiently produced.
  • the present invention has been completed based on the above findings.
  • a method for producing a triacylglycerol highly productive algae characterized by introducing a construct containing the following (1) to (3) into algae: (1) triacylglycerol synthase gene, (2) a phosphorus deficiency responsive promoter placed upstream of the triacylglycerol synthase gene, (3) A 3 ′ untranslated region of a gene that is located downstream of a triacylglycerol synthase gene and is derived from an algae of the same type as the alga to which the construct is to be introduced.
  • the algae is a genus Nannochloropsis, Chlamydomonas, Pseudocollistis, Feodactylum, Osterococcus, Cyanidiosizon, Klebsolmidium, Chlorochibus, Spirogyra, Kara, Choreokete
  • the method for producing a triacylglycerol high-producing alga according to any one of [1] to [4], which is an algae belonging to the genus Genus, Chlorella or Fisturifera.
  • a triacylglycerol highly productive algae wherein a construct containing the following (1) to (3) is introduced: (1) triacylglycerol synthase gene, (2) a phosphorus deficiency responsive promoter placed upstream of the triacylglycerol synthase gene, (3) A 3 ′ untranslated region of a gene that is located downstream of a triacylglycerol synthase gene and is derived from an algae of the same type as the alga to which the construct is to be introduced.
  • the algae is selected from the group consisting of Nannochloropsis, Chlamydomonas, Pseudocollistis, Feodactylum, Osterococcus, Cyanidiozone, Klebsolmidium, Chlorochibus, Spirogyra, Kara, Choreokete
  • the triacylglycerol high-producing alga according to any one of [7] to [10], which is an algae belonging to the genus, Chlorella, or Fisturifera.
  • the triacylglycerol high-producing alga according to any one of [7] to [12] is cultured under phosphorus-deficient conditions, triacylglycerol is accumulated in the algal cells, and the accumulated triacylglycerol is collected. And a method for producing triacylglycerol.
  • a method for producing a triacylglycerol highly productive algae characterized by introducing a construct containing the following (1) and (2) into algae: (1) triacylglycerol synthase gene, (2) A phosphorus deficiency responsive promoter placed upstream of the triacylglycerol synthase gene.
  • the algae is selected from the group consisting of Nannochloropsis, Chlamydomonas, Pseudocollistis, Feodactylum, Osterococcus, Cyanidiosion, Klebsolmidium, Chlorochibus, Spirogyra, Kara, Choreokete
  • the method for producing a triacylglycerol high-producing alga according to any one of [14] to [17], which is an algae belonging to the genus, Chlorella, or Fisturifera.
  • the highly productive algae of the present invention have the following effects, for example.
  • Accumulated fatty acids in TAG are not derived from already synthesized lipids (such as chloroplast lipids), but are newly synthesized, so they are also useful for the production of useful special fatty acids. It is.
  • f / 2 represents the case of f / 2 medium
  • N represents the nitrogen-deficient f / 2 medium
  • P represents the case of the phosphorous-deficient f / 2 medium.
  • f / 2 represents the case of f / 2 medium
  • N represents the nitrogen-deficient f / 2 medium
  • P represents the case of the phosphorous-deficient f / 2 medium.
  • f / 2 is f / 2 medium
  • -N is nitrogen-deficient f / 2 medium
  • -P is phosphorus-deficient f / 2 medium
  • TAP is TAP medium
  • TAP-N is nitrogen-deficient TAP medium
  • TAP-P is The cases where the cells were cultured in a phosphorus-deficient TAP medium are shown.
  • the figure which represented the structure of the construct for strengthening TAG production system typically.
  • P4d and P7d in the figure indicate the amount of TAG on the 4th day and 7th day of culture, respectively.
  • Each bar graph shows the amount of TAG of wild strain, control strain, # 18, # 3, # 8, # 9, # 19, and # 21 from the left. The TAG amount on the seventh day of # 19 is not measured.
  • P4d and P7d in the figure indicate the amount of TAG on the 4th day and 7th day of culture, respectively.
  • Each bar graph shows the amount of TAG of wild strain, control strain, # 18, # 3, # 8, # 9, # 19, and # 21 from the left.
  • the TAG amount on the seventh day of # 19 is not measured.
  • Each bar graph shows the amount of TAG of wild strain, control strain, # 18, # 3, # 8, # 9, # 19, and # 21 from the left.
  • Each bar graph shows the amount of TAG of wild strain, control strain, # 18, # 3, # 8, # 9, # 19, and # 21 from the left.
  • F2N represents a case where the cells are cultured in an F2N50% SW medium
  • P represents a phosphorus-deficient F2N50% SW medium
  • N represents a nitrogen-deficient F2N50% SW medium.
  • the vertical axis of the graph represents a relative value with respect to the expression level of actin.
  • F2N represents a case where the cells are cultured in an F2N50% SW medium
  • P represents a phosphorus-deficient F2N50% SW medium
  • N represents a nitrogen-deficient F2N50% SW medium.
  • the vertical axis of the graph represents a relative value with respect to the expression level of actin.
  • the left figure shows the results on day 4 of nutritional deficiency
  • the right figure shows the results on day 6 of nutritional deficiency.
  • the figure which shows the TAG amount [pg] per cell (upper figure), and the TAG amount [mg] per culture solution (lower figure).
  • the method for producing a TAG highly productive algae of the present invention comprises: (1) a TAG synthase gene, (2) a phosphorus deficiency responsive promoter placed upstream of the TAG synthase gene, and (3) a TAG synthase gene.
  • a construct that is arranged downstream and includes a 3 ′ untranslated region of a gene derived from the algae of the same species as the alga to which the construct is to be introduced is introduced.
  • DGAT diacylglycerol acyltransferase
  • DGAT1 has two isozymes, DGAT1 and DGAT2. Any of them can be used in the present invention, but DGAT2 is preferably used. Since DGAT2 and the gene encoding it have been reported in many papers (for example, Jay M. Shockey et al., The Plant Cell, Vol. 18 September 2006, 2294-2313, Miller et al., Plant Physiology, vol.154 2010, 1737-1752), those skilled in the art can understand what the DGAT2 gene is. Specific examples of the DGAT2 gene include the DGTT4 gene of C.
  • the DGAT2A gene of Nannochloropsis sp. (Its base sequence is shown in SEQ ID NO: 28), and the DGAT2B gene (its base sequence is shown in SEQ ID NO: 29).
  • DGAT2C gene (its base sequence is shown in SEQ ID NO: 30)
  • DGAT2D gene (its base sequence is shown in SEQ ID NO: 31)
  • DGAT2E gene (its base sequence is shown in SEQ ID NO: 32)
  • DGAT2F gene Its base sequence is shown in SEQ ID NO: 33
  • DGAT2G gene (its base sequence is shown in SEQ ID NO: 34)
  • DGAT2H gene (its base sequence is shown in SEQ ID NO: 35), DGAT2I gene (its base sequence is shown)
  • DGAT2J gene (its base sequence is shown in SEQ ID NO: 37), DGAT2K gene (its base sequence is shown in SEQ ID NO: 38), and the like.
  • the DGTT4 gene can be used as the DGAT2 gene.
  • DGTT4 is a protein belonging to the DGAT2 family contained in C. reinhardtii, and this protein and the gene encoding it have been reported in many papers (for example, Boyle et al. The Journal of biological chemistry, 287 (2012), pp. 15811-15825, Chen JE Smith AG, J Biotechnol. 2012 Jun 29), those skilled in the art can understand what the DGTT4 gene is.
  • the amino acid sequence of DGTT4 and the base sequence of the gene encoding it are as shown in SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 2, respectively.
  • the DGTT4 gene in the present invention includes not only the DGTT4 gene of C.
  • DGreinhardtii (Cre03.g205050) but also a gene (such as a homolog) corresponding to this gene in other organisms.
  • Specific examples of the DGTT4 gene in organisms other than C. reinhardtii include Volvox carteri f. Nagariensis DGAT2 (JGI protein ID77655) gene, Ostreococcus tauri's DGAT2 (JGI protein ID 21937) gene and the like.
  • the base sequence of the DGTT4 gene As the base sequence of the DGTT4 gene, the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 can be exemplified. Further, the base sequence of the DGTT4 gene is a base sequence having high identity with the base sequence shown in SEQ ID NO: 2, and may be a base sequence encoding a protein having activity (such as diacylglycerol acyltransferase activity). Good. “High identity” here means usually 90% or more identity, preferably 95 or more identity, more preferably 97% or more identity, and even more preferably 99% or more identity. The value of “identity” in the present specification can be calculated using a homology search program known to those skilled in the art. For example, the calculation can be performed by using default (initial setting) parameters in NCBI homology algorithm BLAST (Basic local alignment search tool).
  • NCBI homology algorithm BLAST Basic local alignment search tool
  • the base sequence of the DGTT4 gene consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, and an active protein (such as diacylglycerol acyltransferase activity). You may code.
  • the “one or several” herein is usually 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3, and still more preferably 1.
  • “deletion, substitution or addition” includes not only artificial mutations but also naturally occurring mutations (mutants and variants) such as cases based on individual differences, species or genus differences.
  • an enzyme gene other than the DGTT4 gene may be used.
  • a TAG synthase gene that preferentially incorporates polyunsaturated fatty acids into the TAG may be used.
  • DGAT2 gene possessed by Thalassiosira pseudonana Japanese Patent Publication No. 2011-507513
  • SQD2 is an enzyme involved in the synthesis of sulfoquinovosyl diacylglycerol (SQDG), and this enzyme and the gene encoding it have been reported in many papers (eg, Yu B, Xu C, Benning C ., Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 Apr; 99 (8): 5732-7.) Since the amino acid sequence of this enzyme is also published on the database (for example, SQD2 (SQD2a of C. reinhardtii) ) Is described in GenBank Accession No.
  • SQD2 gene As the promoter of the SQD2 gene, the promoter of the SQD2a gene of C. reinhardtii (its base sequence is shown in SEQ ID NO: 1), the promoter of the SQD2A gene of Nannochloropsis sp. (Its base sequence is shown in SEQ ID NO: 45), Nannochloropsis. A promoter of the SQD2B gene of sp. (its base sequence is shown in SEQ ID NO: 15) and the like can be used.
  • the base sequence of the promoter of the SQD2 gene As the base sequence of the promoter of the SQD2 gene, the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO: 45, or the base sequence showing high identity with the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO: 45 Thus, examples include base sequences that maintain promoter activity. “High identity” here means usually 90% or more identity, preferably 95 or more identity, more preferably 97% or more identity, and even more preferably 99% or more identity.
  • the promoter sequence of the SQD2 gene is a nucleotide sequence in which one or several bases are deleted, substituted or added in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO: 45. It may be a base sequence that maintains
  • the “one or several” herein is usually 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3, and still more preferably 1. Further, “deletion, substitution or addition” includes not only artificial mutations but also naturally occurring mutations (mutants and variants) such as cases based on individual differences, species or genus differences.
  • a promoter other than the promoter of the SQD2 gene may be used.
  • a promoter of the LDSP gene (its base sequence is shown in SEQ ID NO: 46)
  • a promoter of the LPAT-Y gene its base sequence is shown in SEQ ID NO: 44
  • the phosphorus deficiency responsive promoter is placed upstream of the TAG synthase gene in the construct to be introduced into algae.
  • the phosphorus deficiency responsive promoter may be directly connected to the TAG synthase gene or may be connected via a linker or the like.
  • the 3 ′ untranslated region uses a 3 ′ untranslated region of a gene derived from the algae of the same kind as the algae to which the construct is to be introduced.
  • the 3 'untranslated region of VCP (violaxanthin / chlorophyll a-binding protein) 1 is used, but the 3' untranslated region of a gene derived from the same algae as the alga to which the construct is to be introduced. Anything is acceptable.
  • Examples of the 3 ′ untranslated region of genes other than the VCP1 gene include the 3 ′ untranslated region of T35S of cauliflower mosaic virus, the 3 ′ untranslated region of Rubisco small subunit RBCS2 of alga belonging to the genus Nannochloropsis (Genome , Functional Gene Annotation, and Nuclear Transformation of the Heterokont Oleaginous Alga Nannochloropsis oceanica CCMP1779, PLoS Genet. 2012 Nov; 8 (11). Epub 2012 Nov 15.).
  • the length of the 3 ′ untranslated region is not particularly limited, but is preferably 500 to 1500 bases, and more preferably 500 to 700 bases.
  • the 3 ′ untranslated region is located downstream of the TAG synthase gene in the construct to be introduced into algae.
  • the 3 ′ untranslated region may be directly connected to the TAG synthase gene or may be connected via a linker or the like.
  • the construct may contain, in addition to the above-described TAG synthase gene, promoter, and 3 ′ untranslated region, other genes such as an antibiotic resistance gene and a promoter for expressing it.
  • algae belonging to the genus Nannochloropsis is preferable, but other algae such as the genus Chlamydomonas, the genus Pseudochoricystis, the genus Phaeodactylum (Phaeodactylum) , Genus Ostreococcus, genus Cyanidioschyzon, genus Klebsormidium, genus Chlorokybus, genus Spirogyra, genus Chara, genus Coleochaete And algae belonging to the genus Chlorella, or the genus Fistulifera.
  • algae belonging to the genus Nannochloropsis is preferable, but other algae such as the genus Chlamydomonas, the genus Pseudochoricystis, the genus Phaeodactylum (Phaeodactylum) , Genus Ostreococcus, genus Cyanidioschyzon, genus Kleb
  • Examples of the algae of the genus Nannochloropsis include Nannochloropsis oculata, Nannochloropsis salina, Nannochloropsis gaditana, etc., and the algae of the genus Chlamydomonas Examples include Chlamydomonas reinhardtii, and algae of the genus Pseudocollistis can be exemplified by Pseudochoricystis ellipsoidea, and algae of the genus Phaeodactylum An example of a tricornutum (Phaeodactylum tricornutum), an example of an algae of the genus Osterococcus is an example of Ostreococcus tauri, and an example of an algae of the genus Cyanidiosis is cyanidiosizone.
  • Examples of the algae of the genus Nannochloropsis include Nannochloropsis oculata, Nannochloropsis salina, Nannoch
  • melora an example of an algae of the genus Klebsormidium flaccidum, an example of an algae of the genus Cala fragilis
  • examples of the algae of the genus Coreocate include Coleochaete scutata
  • the algae of the genus Chlorella can include, for example, Chlorella vulgaris
  • the algae of the genus Fisturifera include fistula fera.
  • Examples include Solaris (Fistulifera solaris).
  • the 3 ′ untranslated region needs to be derived from the algae of the same type as the algae to which the construct is to be introduced, but the TAG synthase gene and the phosphorus deficiency responsive promoter are to introduce the construct. It may be derived from any algae of the same or different type.
  • the construction of the construct and the operation of introducing it into algae can be performed according to conventional methods.
  • the TAG highly productive algae produced by the above-described method can be cultured in the same manner as normal algae culture except that the TAG is accumulated under phosphorus-deficient conditions at the time of TAG accumulation.
  • an f / 2 medium or the like can be used as the medium
  • the culture temperature can be about 20 to 25 ° C.
  • light during the culture can be used.
  • the strength can be 10-40 ⁇ E / m 2 / sec.
  • TAP medium can be used as the medium, and the culture temperature should be about 23-25 ° C.
  • the light intensity during culture can be 10-40 ⁇ E / m 2 / sec.
  • TAG When TAG is accumulated in TAG highly productive algae, it is cultured under phosphorus-deficient conditions.
  • Culture under phosphorus-deficient conditions is, for example, a method in which cells in the logarithmic growth phase are removed from the medium used at the time of growth by removing the phosphorus component (for example, K 2 HPO 4 , KH 2 PO 4, etc.) It can be performed by transferring to a medium having a concentration of 33 ⁇ M or less and culturing. Usually, a sufficient amount of TAG is accumulated in the cells after culturing for about 8 to 13 days.
  • the phosphorus component for example, K 2 HPO 4 , KH 2 PO 4, etc.
  • high density culture For algae that can be cultured at high density, such as algae belonging to the genus Nannochloropsis, by culturing for a certain period of time under high-density conditions in a medium used during growth without transferring to a medium that does not contain phosphorus components. Can also accumulate TAG. This is thought to be due to natural phosphorus deficiency conditions after long-term culture. In this high-density culture method, a sufficient amount of TAG is usually accumulated in the cells after culturing for about 7 to 20 days.
  • the term “high density culture” as used herein generally means a culture having a cell density of 1 ⁇ 10 8 cells / ml or more.
  • TAG can be collected from cells that have accumulated TAG according to conventional methods.
  • Example 1 [Experimental material] (1) Algal strain The true eye-point alga Nannochloropsis NIES-2145 (hereinafter N. 2145) was used. This algal strain is available from the National Institute for Environmental Studies (http://www.nies.go.jp/).
  • the green alga Chlamydomonas reinhardtii C9 strain (CC-408 mt-) was used. This algal strain is available from the Chlamydomonas Center (http://chlamycollection.org/).
  • (2) Gene name and protein ID The gene name and protein ID (JGI Chlamydomonas reinhardtii 4.0) are as follows. DGTT4: PID190539 SQD2a: PID116277 CBLP: PID164254 (3) Gene sequence The sequence of the SQD2a promoter (pCrSQD2a) derived from C. reinhardtii is as shown in SEQ ID NO: 1.
  • C. reinhardtii The sequence of the DGTT4 gene (CrDGTT4) derived from C. reinhardtii is as shown in SEQ ID NO: 2.
  • the sequence of the sh ble gene is as shown in SEQ ID NO: 4.
  • the sequence of the promoter (NannoVCP2gene-promoter) derived from Nannochloropsis is as shown in SEQ ID NO: 5.
  • NannoVCP1 (VCP1) 3′UTR) of the VCP1 gene derived from Nannochloropsis is as shown in SEQ ID NO: 6.
  • TAP medium was used as a medium for normal culture, and swirl culture was performed at 20-30 ⁇ E / m 2 / sec, 23 ° C.
  • K 2 HPO 4 and KH 2 PO 4 were removed from the TAP medium, and in the nitrogen-deficient medium, NH 4 Cl was removed.
  • f / 2 medium or F2N50% SW medium was used as the medium for normal culture.
  • the f / 2 medium was prepared as follows. Na 2 EDTA ⁇ 2H 2 O 440 mg, FeCl 3 ⁇ 6H 2 O 316 mg, CoSO 4 ⁇ 7H 2 O 1.2 mg, ZnSO 4 ⁇ 7H 2 O 2.1 mg, MnCl 2 ⁇ 4H 2 O 18 mg, CuSO 4 ⁇ 5H 0.7 mg of 2 O and 0.7 mg of Na 2 MoO 4 ⁇ 2H 2 O were dissolved in 100 mL of ion-exchanged water and stored at 4 ° C. as f / 2 metal.
  • f / 2 medium was used as the medium for normal culture, and swirling culture was performed at 20 to 30 ⁇ E / m 2 / sec at 23 ° C.
  • NaH 2 PO 4 was removed from the f / 2 medium, and in the nitrogen-deficient medium, NaNO 3 was removed.
  • the F2N50% SW medium was prepared by making the artificial seawater contained in the F2N medium (PNAS, 2011, vol. 108 (no. 52) 21265-21269) into a 50% concentration and was prepared as follows. Tris (hydroxymethyl) aminomethane (12.11 g) was dissolved in ion-exchanged water (100 mL) and adjusted to pH 7.6 with HCl to obtain 1 M Tris (pH 7.6).
  • the frozen cells were thawed, 1 ml of chloroform and 2 ml of methanol were added, and the mixture was kept at room temperature for 1 hour while being suspended every 10 minutes. Centrifugation was performed with a swing rotor at 800 ⁇ g for 5 minutes, and 4 ⁇ mL of the supernatant was recovered. Add 1% (W / V) KCl (0.8 mL), chloroform (1 mL), and methanol (2 mL) to the precipitate. After suspension, centrifuge at 800 x g for 5 minutes with a swing rotor, and add 3.8 mL of the supernatant to the previous supernatant. And recovered.
  • RNA extraction Three times or more of the RNA extract and 3 times or more of the acidic phenol were added to the frozen cells, and ultrasonication (15 seconds of ultrasonic waves, 30 seconds of ice cooling) was performed 4 times while frozen. Centrifugation was performed at 20000 ⁇ g for 5 minutes at 4 ° C., and 400 to 500 ⁇ L of the supernatant was recovered. 300 ⁇ L of acidic phenol and 300 ⁇ L of chloroform were added to the supernatant and suspended, and then centrifuged at 14 k rpm for 5 minutes at 4 ° C. to recover 400 to 500 ⁇ L of the supernatant, and this operation was repeated 5 times.
  • the supernatant was added with 1/10 volume of 3 M sodium acetate and 1 volume of isopropanol, suspended, and centrifuged at 20000 ⁇ g for 5 minutes at 4 ° C. 1 mL of 70% ethanol was added to the precipitate and centrifuged at 20000 ⁇ g for 5 minutes at 4 ° C. This operation was repeated twice, and then the precipitate was dried. The dried precipitate was dissolved in 400 ⁇ L of sterilized ion-exchanged water, and it was confirmed that the nucleic acid had a concentration of 1 ⁇ g / ⁇ L or higher.
  • RNA having a concentration of 1 ⁇ g / ⁇ L or more 150 ⁇ L of 70% ethanol was added to the precipitate, and centrifuged at 20000 ⁇ g for 10 minutes at 4 ° C. This operation was repeated twice, and then the precipitate was dried. The dried precipitate was dissolved in 50 ⁇ L of sterilized ion-exchanged water and confirmed to be RNA having a concentration of 1 ⁇ g / ⁇ L or more.
  • Quantitative RT-PCR method 2 ⁇ SYBR Green (TAKARA) 12.5 ⁇ L, 10 ⁇ M primer_F 1 ⁇ L, 10 ⁇ M primer_R 1 ⁇ L, 5-fold diluted cDNA 2 ⁇ L, sterile ion-exchanged water 8.5 ⁇ L are suspended in the reaction. Using.
  • Nanno_realRT_TUBf AGCATGGCATTGACTCCACC SEQ ID NO: 7
  • Nanno_realRT_TUBr AACGGCCTCGTTGTAGTACACG SEQ ID NO: 8
  • CrDGTT4_realRT_F GTTCGTGCAGTTCAGTGTGG
  • CrDGTT4_realRT_R CGGGCAGAATCCGAACA
  • PCR reaction conditions were performed in the following 3 steps. step1 94 °C for 2 minutes step2 40 cycles of 94 °C 45 seconds, 55 °C 30 seconds, 71 °C 1 minute 30 seconds step3 71 ° C for 5 minutes The following primers were used.
  • SQD2a_F2 CGGGATAGTTGTAGCTGTAG SEQ ID NO: 11
  • SQD2a_R2 CGAAGAGTTGAGGTGTGTGTGTTC SEQ ID NO: 12
  • PCR reaction conditions were performed in the following 3 steps. step1 94 °C 3 minutes step2 94 ° C for 30 seconds, 54 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 1 minute for 41 cycles step3 72 ° C for 3 minutes The following primers were used.
  • DGTT4_F2 ATGCCGCTCGCAAAGCTGCG SEQ ID NO: 13
  • DGTT4_R2 CTACATTATGACCAGCTCCTC SEQ ID NO: 14
  • the cell suspension was placed in an electroporation cuvette (2 mm width), and a voltage was applied once at 11 kV / cm and a time constant of 12 msec.
  • 1 mL of normal medium was added to the cuvette to suspend the cells, and then transferred to a 15 mL tube. Furthermore, 4 mL of normal medium was added to make the total volume 5 mL.
  • the culture was swirled at 10 ⁇ E / m 2 / sec, 23 ° C. for 48 hours, added with 0.4 mL of INA Agar / f / 2 5 mL, and plated on a plate added with 2 ⁇ g / ⁇ L zeocin. It was allowed to stand at 20 to 30 ⁇ E / m 2 / sec at 23 ° C., and colonies that grew after 14 to 20 days were planted on a new zeocin-containing plate as transformants.
  • the present inventor has also found that the amount of TAG accumulated under the phosphorus deficiency condition of N. 2145 exceeds C. reinhardtii.
  • the amount of TAG accumulated per liter of culture medium in the first week of culturing under phosphorus-deficient conditions was 12 mg / L, twice that of C. reinhardtii cultured during the same period.
  • N. 2145 can be cultured at a high density up to 1 ⁇ 10 9 cells / mL in a normal medium and 2 ⁇ 10 8 cells / mL in a phosphorus-deficient medium. This is 100 times the cell density of C. reinhardtii. It is expected that 1g or more of TAG can be obtained per liter of culture solution if planted in a phosphorus-deficient medium with high-density culture.
  • DGAT Diacylglycerol acyltransferase
  • DGAT is an enzyme that catalyzes the final step of TAG biosynthesis.
  • DGAT is an enzyme widely present in animals and plants, and two types of DGAT1 and DGAT2 have been reported.
  • C. reinhardtii is known to have one type of DGAT1 and five types of DGAT2 (DGTT1-5).
  • DGTT1 shows changes in mRNA levels under nitrogen-deficient conditions
  • DGTT2 and Regarding DGTT3 it has been reported that the amount of mRNA changes little under nitrogen-deficient conditions, and that DGTT5 is not expressed (Plant Physiol. 2010, Vol. 154, 1737-1752).
  • the present inventor found a promoter pSQD2a that induces strong expression under phosphorus-deficient conditions, and has developed a method for promoting TAG accumulation by ligation to the DGTT4 gene (Japanese Patent Laid-Open No. 2014-049651).
  • the present inventor amplified the promoter region pCrSQD2a of SQD2a by PCR using the genome of C. reinhardtii as a template.
  • the sequence of CrDGTT4 gene was obtained from the cDNA of C. reinhardtii at the time of phosphorus deficiency.
  • pCrSQD2a was connected upstream of the CrDGTT4 gene to obtain pCrSQD2aCrDGTT4.
  • a zeocin gene resistance gene S. hindustanus-derived ble was connected upstream for selection of mutant strains to obtain shblepCrSQD2aCrDGTT4. Referring to Kilian et al.
  • a construct (control) in which only shble was inserted between the promoter of VCP2 of N.2145 and VCP1 3′UTR of N.2145 was used.
  • a construct (R) in which pCrSQD2aCrDGTT4 was inserted in the reverse direction was also prepared (FIG. 5).
  • the fatty acid composition of TAG under the phosphorus deficiency condition on the 4th day increased the ratio of C18: 1 in the strain in which CrDGTT4 gene expression was increased as compared with the wild strain and the control strain.
  • CrDGTT4 has been reported to prefer C18: 1 as a substrate (Plant Cell 2013 2013 Feb; 25 (2): 677-93).
  • This suggests that the combination of promoter pCrSQD2a and 3'UTR derived from N.2145 is suitable for greatly modifying the fatty acid composition of TAG from fatty acids contained in membrane lipids.
  • the timing of fat accumulation can be controlled. It is suitable for the synthesis of novel fatty acids because it allows fat and oil accumulation while allowing cells to grow under phosphorus-deficient conditions. This is an effective method for accumulating useful special fatty acids.
  • Example 2 In order to search for a promoter candidate derived from N. 2145 that responds to phosphorus deficiency, RNA was collected from cells on the 4th and 6th days of nutrient deficiency conditions, and quantitative RT-PCR was performed. In C. reinhardtii, increased expression of SQD2a was observed under phosphorus-deficient conditions, so the gene expression of N. 2145 homologous genes SQD2A, SQD2B, and SQD2C was examined. In addition, from a previous paper (Plant Physiology, April 2012, Vol. 158, pp.
  • LDSP lipid droplet surface protein
  • LPAT lipid droplet surface protein
  • NannoACTf 5-ACCTTCTACAACGAGCTGC-3 (SEQ ID NO: 16)
  • NannoACTr 5-GAACGTCTCAAACATAATCTGG-3 (SEQ ID NO: 17)
  • NannoSQD2A_realRT_F 5-TCCCTTGCTTACTGCTCTGG-3 (SEQ ID NO: 18)
  • NannoSQD2A_realRT_R 5-GATTCGCGTAGCCGCTTA-3 (SEQ ID NO: 19)
  • NannoSQD2B_realRT_F 5-CTTAATACGACCACACACGTCCTC-3 (SEQ ID NO: 20)
  • NannoSQD2B_realRT_R 5-TGATACGCCTCCGCACTTT-3 (SEQ ID NO: 21)
  • NannoSQD2C_realRT_F 5-CCACGACTGCCGAATGA-3 (SEQ ID NO: 22)
  • NannoSQD2C_realRT_R 5-TGCTAGTGGACCCTTGTTGG-3 (SEQ ID NO: 23) q
  • LPAT-Y, SQD2-A, and SQD2-B increased in expression under phosphorus deficiency
  • LDSP increased in expression under phosphorus deficiency and nitrogen deficiency
  • 11 types of DGAT2 DGAT2A to DGAT2K
  • 2 types of DGAT1 of N. 2145 was also examined, but no increase in expression was observed as in the above 4 genes. Therefore, about 1 kb of the promoter region of the above 4 genes was designated as promoters pNLPATY, pNSQD2A, pNSQD2B, pNLDSP derived from N. 2145 that induces strong expression under phosphorus-deficient conditions.
  • the present inventors amplified the LPAT-Y and SQD2-B promoter regions pNLPATY and pNSQD2B, whose expression was elevated under phosphorus-deficient conditions, by PCR using the N.2145 genome as a template.
  • pNLPATY and pNSQD2B were connected upstream of the CrDGTT4 gene instead of pCrSQD2a to obtain pNLPATYCrDGTT4 and pNSQD2BCrDGTT4 (FIG. 13).
  • FIG. 13 The construct of FIG.
  • NannoACTf 5-ACCTTCTACAACGAGCTGC-3 (SEQ ID NO: 47)
  • NannoACTr 5-GAACGTCTCAAACATAATCTGG-3 (SEQ ID NO: 48)
  • CrDGTT4_realRT_F 5-GTTCGTGCAGTTCAGTGTGG-3 (SEQ ID NO: 49)
  • CrDGTT4_realRT_R 5-CGGGCAGAATCCGAACA-3 (SEQ ID NO: 50)
  • CrDGTT4 gene expression was not confirmed in wild and control strains, and expression of CrDGTT4 was confirmed in transformants pLPATY-1, pLPATY-2, pLPATY-3, pSQD2B-1, pSQD2B-2, and pSQD2B-3 (Fig. 14).
  • the cells were cultured in a phosphorus-deficient medium (200 ⁇ l), and the cells were collected on the fourth day of phosphorus deficiency, and the amount of accumulated TAG was examined (FIG. 15). From FIG. 15, it was found that TAG was accumulated in the transformants pLPATY-3 and pSQD2B-1 in which CrDGTT4 gene expression was elevated under the phosphorus deficient condition than in the wild type. From this, it can be said that this method using the promoter region of a gene that responds to phosphorus deficiency conditions for gene expression for TAG production is a method that can accumulate lipid efficiently in a short period of time.
  • the sequences of genes and the like used in this example are as follows.
  • the sequence of the DGAT2A gene derived from N. 2145 is as shown in SEQ ID NO: 28.
  • the sequence of the DGAT2B gene derived from N. 2145 is as shown in SEQ ID NO: 29.
  • the sequence of the DGAT2C gene derived from N. 2145 is as shown in SEQ ID NO: 30.
  • the sequence of the DGAT2D gene derived from N. 2145 is as shown in SEQ ID NO: 31.
  • the sequence of the DGAT2E gene derived from N. 2145 is as shown in SEQ ID NO: 32.
  • the sequence of the DGAT2F gene derived from N. 2145 is as shown in SEQ ID NO: 33.
  • the sequence of the DGAT2G gene derived from N. 2145 is as shown in SEQ ID NO: 34.
  • the sequence of the DGAT2H gene derived from N. 2145 is as shown in SEQ ID NO: 35.
  • the sequence of the DGAT2I gene derived from N. 2145 is as shown in SEQ ID NO: 36.
  • the sequence of the DGAT2J gene derived from N. 2145 is as shown in SEQ ID NO: 37.
  • the sequence of the DGAT2K gene derived from N. 2145 is as shown in SEQ ID NO: 38.
  • the sequence of the SQD2A gene derived from N. 2145 is as shown in SEQ ID NO: 39.
  • SEQ ID NO: 40 The sequence of the SQD2C gene derived from N. 2145 is as shown in SEQ ID NO: 41.
  • the sequence of the LPAT-Y gene derived from N. 2145 is as shown in SEQ ID NO: 42.
  • the sequence of the LDSP gene derived from N.2145 is as shown in SEQ ID NO: 43.
  • the sequence of the promoter of the LPAT-Y gene derived from N. 2145 is as shown in SEQ ID NO: 44.
  • the sequence of the promoter of the SQD2A gene derived from N.2145 is as shown in SEQ ID NO: 45.
  • the sequence of the promoter of the SQD2B gene derived from N. 2145 is as shown in SEQ ID NO: 15.
  • the sequence of the promoter of the LDSP gene derived from N.2145 is as shown in SEQ ID NO: 46.
  • the present invention can be used in various industrial fields related to TAG production.

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Abstract

　藻類の細胞中にトリアシルグリセロールを効率的に蓄積させることを目的として、トリアシルグリセロール合成酵素遺伝子とリン欠乏応答プロモーターと3'非翻訳領域を藻類に導入する方法を提供する。

Description

トリアシルグリセロール高生産性藻類の作製法
　本発明は、トリアシルグリセロール（以下、「TAG」という）高生産性藻類の作製法、及びTAG高生産性藻類、並びに前記藻類を用いたTAGの製造方法に関する。
　クラミドモナス・レインハーディ（Chlamydomonas reinhardtii、以下「C. reinhardtii」という場合がある。）などの藻類にTAG合成酵素遺伝子を導入し、それにより細胞中にTAG蓄積させることは従来行われてきた（特許文献１、非特許文献１）。
　例えば、非特許文献１には、C. reinhardtiiに、強発現プロモーターであるpsaDを付加したDGAT2遺伝子を導入し、これを窒素又は硫黄欠乏条件下で培養し、TAGを細胞中に蓄積させる方法が記載されている。特許文献１にも、非特許文献１と同様に、psaDを付加したDGAT2遺伝子を導入したC. reinhardtiiが記載されている。
　TAGの生産に関しては、C. reinhardtii以外にも、ナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属の藻類も注目されている。この藻類は、C. reinhardtiiの100倍程の高密度で培養することが可能であることから、C. reinhardtiiよりもTAGの生産に適していると考えられる。
国際公開WO 2011/156520
M. La Russa et al., J. Biotechnol. 2012 Nov 30; 162(1):13-20
　上述したようにTAG合成酵素遺伝子を藻類に導入することにより、細胞中にTAGを蓄積させる方法は既に知られているが、それらの方法では十分な量のTAGを蓄積させることができなかった。例えば、非特許文献１には、窒素欠乏、硫黄欠乏のいずれの条件においても、DGAT2遺伝子導入株と野生株との間にTAGの蓄積量に統計的に意味のある差異はなかったと記載されている（Fig. 5など）。
　本発明は、このような背景の下、藻類の細胞中にTAGを効率的に蓄積させる手段を提供することを目的とする。
　本発明者は、まず、従来の方法において十分な量のTAGが蓄積しないのはプロモーターに原因があるのではないかと考えた。即ち、TAGは栄養欠乏時に蓄積されるが、栄養欠乏時には、psaDのような強発現プロモーターは十分機能していないのではないかと考えた。そこで、強発現プロモーターに代えて、栄養欠乏応答プロモーターを使用するという発想を得た。また、本発明者は、窒素欠乏条件とリン欠乏条件におけるTAGの蓄積量とTAGの脂肪酸組成を調べた。その結果、１）増殖の盛んな細胞を植え継いだ場合、窒素欠乏条件よりリン欠乏条件の方がTAGの蓄積量が多いこと、２）窒素欠乏条件では、葉緑体の膜脂質由来の脂肪酸を含むTAGが多く、新しく合成された脂肪酸は少ないこと、３）窒素欠乏、リン欠乏のいずれの条件でも細胞の増殖は阻害されるが、リン欠乏条件では、窒素欠乏条件ほど、細胞の増殖は阻害されないことなどがわかった。これらの知見から、TAG高生産性藻類としては、窒素欠乏応答性のものよりも、リン欠乏応答性のものの方が好ましいという発想を得た。更に、本発明者は、リン欠乏応答プロモーターとしては、C. reinhardtiiのSQD2a遺伝子のプロモーターが好適であり、TAG合成酵素遺伝子としては、C. reinhardtiiのDGTT4遺伝子が好適であるという知見も得た。
　以上の知見に基づき、本発明者は、SQD2a遺伝子のプロモーターを付加したDGTT4遺伝子をC. reinhardtiiに導入することにより、高いTAG生産能を持つC. reinhardtii株の作製に成功し、このTAG高生産性C. reinhardtii株に関する特許出願を行った（特開2014-68638、この出願は、本願の優先権の基礎である特願2014‐049651の出願時点においては出願公開されていなかった。）。
　本発明者は、この研究を更に進め、C. reinhardtiiよりもTAGの生産に適した藻類であるナンノクロロプシス属の藻類についても、高いTAG生産能を持つ藻類株を得ることに成功した。また、DGTT4遺伝子をSQD2a遺伝子のプロモーターとナンノクロロプシス属の藻類由来の遺伝子の3'非翻訳領域で挟み込むような構造のコンストラクトを作製し、これをナンノクロロプシス属の藻類の細胞に導入することにより、効率的にTAG高生産性株を作製できるという知見を得た。
　本発明は、以上の知見に基づき完成されたものである。
　即ち、本発明は、以下の〔１〕～〔１９〕を提供するものである。
〔１〕　藻類に以下の（１）～（３）を含むコンストラクトを導入することを特徴とするトリアシルグリセロール高生産性藻類の作製法、
（１）トリアシルグリセロール合成酵素遺伝子、
（２）トリアシルグリセロール合成酵素遺伝子の上流に配置されるリン欠乏応答プロモーター、
（３）トリアシルグリセロール合成酵素遺伝子の下流に配置され、コンストラクトを導入しようとする藻類と同種の藻類に由来する遺伝子の3'非翻訳領域。
〔２〕リン欠乏応答プロモーターが、SQD2遺伝子のプロモーターであることを特徴とする〔１〕に記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類の作製法。
〔３〕トリアシルグリセロール合成酵素遺伝子が、DGAT2遺伝子であることを特徴とする〔１〕又は〔２〕に記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類の作製法。
〔４〕トリアシルグリセロール合成酵素遺伝子が、DGTT4遺伝子であることを特徴とする〔１〕又は〔２〕に記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類の作製法。
〔５〕藻類が、ナンノクロロプシス属、クラミドモナス属、シュードコリシスチス属、フェオダクチラム属、オステレオコックス属、シアニディオシゾン属、クレブソルミディウム属、クロロキブス属、スピロギラ属、カラ属、コレオケーテ属、クロレラ属、又はフィスチュリフェラ属に属する藻類であることを特徴とする〔１〕乃至〔４〕のいずれかに記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類の作製法。
〔６〕藻類が、ナンノクロロプシス属に属する藻類であることを特徴とする〔１〕乃至〔４〕のいずれかに記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類の作製法。
〔７〕以下の（１）～（３）を含むコンストラクトが導入されていることを特徴とするトリアシルグリセロール高生産性藻類、
（１）トリアシルグリセロール合成酵素遺伝子、
（２）トリアシルグリセロール合成酵素遺伝子の上流に配置されるリン欠乏応答プロモーター、
（３）トリアシルグリセロール合成酵素遺伝子の下流に配置され、コンストラクトを導入しようとする藻類と同種の藻類に由来する遺伝子の3'非翻訳領域。
〔８〕リン欠乏応答プロモーターが、SQD2遺伝子のプロモーターであることを特徴とする〔７〕に記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類。
〔９〕トリアシルグリセロール合成酵素遺伝子が、DGAT2遺伝子であることを特徴とする〔７〕又は〔８〕に記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類。
〔１０〕トリアシルグリセロール合成酵素遺伝子が、DGTT4遺伝子であることを特徴とする〔７〕又は〔８〕に記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類。
〔１１〕藻類が、ナンノクロロプシス属、クラミドモナス属、シュードコリシスチス属、フェオダクチラム属、オステレオコックス属、シアニディオシゾン属、クレブソルミディウム属、クロロキブス属、スピロギラ属、カラ属、コレオケーテ属、クロレラ属、又はフィスチュリフェラ属に属する藻類であることを特徴とする〔７〕乃至〔１０〕のいずれかに記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類。
〔１２〕藻類が、ナンノクロロプシス属に属する藻類であることを特徴とする〔７〕乃至〔１０〕のいずれかに記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類。
〔１３〕〔７〕乃至〔１２〕のいずれかに記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類をリン欠乏条件下で培養し、藻類細胞中にトリアシルグリセロールを蓄積させ、蓄積したトリアシルグリセロールを採取することを特徴とするトリアシルグリセロールの製造方法。
〔１４〕藻類に以下の（１）及び（２）を含むコンストラクトを導入することを特徴とするトリアシルグリセロール高生産性藻類の作製法、
（１）トリアシルグリセロール合成酵素遺伝子、
（２）トリアシルグリセロール合成酵素遺伝子の上流に配置されるリン欠乏応答プロモーター。
〔１５〕リン欠乏応答プロモーターが、SQD2遺伝子のプロモーターであることを特徴とする〔１４〕に記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類の作製法。
〔１６〕トリアシルグリセロール合成酵素遺伝子が、DGAT2遺伝子であることを特徴とする〔１４〕又は〔１５〕に記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類の作製法。
〔１７〕トリアシルグリセロール合成酵素遺伝子が、DGTT4遺伝子であることを特徴とする〔１４〕又は〔１５〕に記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類の作製法。
〔１８〕藻類が、ナンノクロロプシス属、クラミドモナス属、シュードコリシスチス属、フェオダクチラム属、オステレオコックス属、シアニディオシゾン属、クレブソルミディウム属、クロロキブス属、スピロギラ属、カラ属、コレオケーテ属、クロレラ属、又はフィスチュリフェラ属に属する藻類であることを特徴とする〔１４〕乃至〔１７〕のいずれかに記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類の作製法。
〔１９〕藻類が、ナンノクロロプシス属に属する藻類であることを特徴とする〔１４〕乃至〔１７〕のいずれかに記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類の作製法。
　本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願2014‐049651の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
　本発明の高生産性藻類は、例えば、以下のような効果を有する。
（１）従来知られている藻類よりも、多くのTAGを蓄積する。
（２）TAG合成酵素遺伝子はリン欠乏応答プロモーターの制御下にあるので、通常培養時にこの遺伝子は強発現しない。このため、TAG蓄積のタイミングをコントロールすることができる。
（３）通常条件に比べて増殖効率は低下するものの、リン欠乏条件下でもある程度の細胞増殖は可能なので、細胞を増殖させながら、TAGを蓄積させることも可能である。
（４）蓄積されるTAG中の脂肪酸は、既に合成されている脂質（葉緑体の脂質など）に由来するものではなく、新たに合成されたものなので、有用な特殊脂肪酸の生産にも有用である。
栄養欠乏条件下での増殖曲線を示す図。図中のf/2はf/2培地、Nは窒素欠乏f/2培地、Pはリン欠乏f/2培地で培養した場合をそれぞれ示す。 培養開始から0日、5日、8日、及び13日後の培養液の状態を示す写真。図中のf/2はf/2培地、Nは窒素欠乏f/2培地、Pはリン欠乏f/2培地で培養した場合をそれぞれ示す。 栄養欠乏時の細胞の蛍光顕微鏡写真。図中のf/2はf/2培地、-Nは窒素欠乏f/2培地、-Pはリン欠乏f/2培地、TAPはTAP培地、TAP-Nは窒素欠乏TAP培地、TAP-Pはリン欠乏TAP培地で培養した場合をそれぞれ示す。 培養液1L当たりのTAG量を示す図。 TAG生産系強化のためのコンストラクトの構造を模式的に表した図。 定量PCRによるCrDGTT4遺伝子の発現確認実験の結果を示す図。 細胞当たりのTAG量を示す図。図中のP4d及びP7dはそれぞれ培養4日目及び7日目のTAG量を示す。各棒グラフは、左から野生株、コントロール株、#18、#3、#8、#9、#19、#21のTAG量を示す。なお、#19の7日目のTAG量は測定していない。 培養液1L当たりのTAG量を示す図。図中のP4d及びP7dはそれぞれ培養4日目及び7日目のTAG量を示す。各棒グラフは、左から野生株、コントロール株、#18、#3、#8、#9、#19、#21のTAG量を示す。なお、#19の7日目のTAG量は測定していない。 培養4日目のTAG脂肪酸組成を示す図。各棒グラフは、左から野生株、コントロール株、#18、#3、#8、#9、#19、#21のTAG量を示す。 培養7日目のTAG脂肪酸組成を示す図。各棒グラフは、左から野生株、コントロール株、#18、#3、#8、#9、#19、#21のTAG量を示す。 N. 2145を栄養欠乏下で育てたときの遺伝子発現の変化を示す図（栄養欠乏4日目）。図中のF2NはF2N50%SW培地、Pはリン欠乏F2N50%SW培地、Nは窒素欠乏F2N50%SW培地で培養した場合をそれぞれ示す。グラフの縦軸は、アクチンの発現量に対する相対値を示す。 N. 2145を栄養欠乏下で育てたときの遺伝子発現の変化を示す図（栄養欠乏6日目）。図中のF2NはF2N50%SW培地、Pはリン欠乏F2N50%SW培地、Nは窒素欠乏F2N50%SW培地で培養した場合をそれぞれ示す。グラフの縦軸は、アクチンの発現量に対する相対値を示す。 N. 2145由来のプロモーターを用いたコンストラクトの構造を模式的に表した図。 定量PCRによるCrDGTT4遺伝子の発現確認実験の結果を示す図。左図は栄養欠乏４日目の結果を示し、右図は栄養欠乏６日目の結果を示す。 細胞当たりのTAG量[pg]（上図）と培養液当たりのTAG量[mg]（下図）を示す図。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明のTAG高生産性藻類の作製法は、藻類に（１）TAG合成酵素遺伝子、（２）TAG合成酵素遺伝子の上流に配置されるリン欠乏応答プロモーター、及び（３）TAG合成酵素遺伝子の下流に配置され、コンストラクトを導入しようとする藻類と同種の藻類に由来する遺伝子の3'非翻訳領域を含むコンストラクトを導入することを特徴とするものである。
　TAG合成酵素遺伝子としては、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ(DGAT)遺伝子を使用することができる。DGATには、DGAT1とDGAT2という２種類のアイソザイムが存在する。本発明においてはいずれも使用できるが、DGAT2を使用するのが好ましい。DGAT2やそれをコードする遺伝子については、多くの論文において報告されているので（例えば、Jay M. Shockey et al., The Plant Cell, Vol. 18 September 2006, 2294-2313、Miller et al., Plant Physiology, vol.154 2010, 1737-1752）、当業者はDGAT2遺伝子がどのようなものであるか理解することができる。DGAT2遺伝子の具体例としては、後述するC. reinhardtiiのDGTT4遺伝子のほか、Nannochloropsis sp.のDGAT2A遺伝子（その塩基配列を配列番号２８に示す。）、DGAT2B遺伝子（その塩基配列を配列番号２９に示す。）、DGAT2C遺伝子（その塩基配列を配列番号３０に示す。）、DGAT2D遺伝子（その塩基配列を配列番号３１に示す。）、DGAT2E遺伝子（その塩基配列を配列番号３２に示す。）、DGAT2F遺伝子（その塩基配列を配列番号３３に示す。）、DGAT2G遺伝子（その塩基配列を配列番号３４に示す。）、DGAT2H遺伝子（その塩基配列を配列番号３５に示す。）、DGAT2I遺伝子（その塩基配列を配列番号３６に示す。）、DGAT2J遺伝子（その塩基配列を配列番号３７に示す。）、DGAT2K遺伝子（その塩基配列を配列番号３８に示す。）などを挙げることができる。
　DGAT2遺伝子としては、例えば、DGTT4遺伝子を使用することができる。DGTT4は、C. reinhardtiiに含まれるDGAT2ファミリーに属するタンパク質であり、このタンパク質やそれをコードする遺伝子については、多くの論文において報告されているので（例えば、Boyle et al. The Journal of biological chemistry, 287 (2012), pp. 15811-15825、 Chen JE and Smith AG, J Biotechnol. 2012 Jun 29）、当業者はDGTT4遺伝子がどのようなものであるか理解することができる。DGTT4のアミノ酸配列及びそれをコードする遺伝子の塩基配列は、それぞれ配列番号３及び配列番号２に示すとおりである。本発明におけるDGTT4遺伝子には、C. reinhardtiiのDGTT4遺伝子(Cre03.g205050)だけでなく、他の生物におけるこの遺伝子に相当する遺伝子（ホモログなど）も含まれる。このようなC. reinhardtii以外の生物におけるDGTT4遺伝子の具体例としては、Volvox carteri f. nagariensisのDGAT2 (JGI protein ID77655)遺伝子、Ostreococcus tauriのDGAT2 (JGI protein ID 21937)遺伝子などを挙げることができる。
　DGTT4遺伝子の塩基配列としては、配列番号２に示す塩基配列を例示できる。また、DGTT4遺伝子の塩基配列は、配列番号２示す塩基配列と高い同一性を示す塩基配列であって、活性（ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性など）のあるタンパク質をコードしている塩基配列であってもよい。ここでいう「高い同一性」とは、通常９０％以上の同一性、好ましくは９５以上の同一性、より好ましくは９７％以上の同一性、更に好ましくは９９％以上の同一性を意味する。なお、本明細書における「同一性」の値は、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出することができる。例えば、NCBIの相同性アルゴリズムBLAST（Basic local alignment search tool）においてデフォルト（初期設定）のパラメーターを用いることにより、算出することができる。
　また、DGTT4遺伝子の塩基配列は、配列番号３に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、活性（ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性など）のあるタンパク質をコードするものであってもよい。ここでいう「１若しくは数個」とは、通常は、１～１０個であり、好ましくは、１～５個であり、より好ましくは１～３個であり、更に好ましくは１個である。また、「欠失、置換若しくは付加」には、人為的な変異のほか、個体差、種や属の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutantやvariant）も含まれる。
　TAG合成酵素遺伝子としては、DGTT4遺伝子以外の酵素遺伝子を使ってもよい。例えば、多価不飽和脂肪酸を多く含むTAGを藻類に生産させたい場合は、多価不飽和脂肪酸を優先的にTAG内に取り込むTAG合成酵素遺伝子を使えばよい。このような遺伝子としては、例えば、タラシオシラ・シュードナナ（Thalassiosira pseudonana）の持つDGAT2遺伝子（特表2011-507513号公報）など挙げることができる。
　リン欠乏応答プロモーターとしては、例えば、SQD2遺伝子のプロモーターを使用することができる。SQD2はスルホキノボシルジアシルグリセロール（SQDG）の合成に関与する酵素であり、この酵素やそれをコードする遺伝子については、多くの論文において報告されており（例えば、 Yu B, Xu C, Benning C., Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 Apr;99(8):5732-7.）、また、この酵素のアミノ酸配列もデータベース上で公表されているので（例えば、C. reinhardtiiのSQD2(SQD2a)のアミノ酸配列はGenBank Accession No. XP_001689662に記載されている。）、当業者はSQD2遺伝子がどのようなものであるか理解することができる。SQD2遺伝子のプロモーターとしては、C. reinhardtiiのSQD2a遺伝子のプロモーター（その塩基配列を配列番号１に示す。）、Nannochloropsis sp.のSQD2A遺伝子のプロモーター（その塩基配列を配列番号４５に示す。）、Nannochloropsis sp.のSQD2B遺伝子のプロモーター（その塩基配列を配列番号１５に示す。）などを使用することができる。
　SQD2遺伝子のプロモーターの塩基配列としては、配列番号１、配列番号１５若しくは配列番号４５に示す塩基配列、又は配列番号１、配列番号１５若しくは配列番号４５に示す塩基配列と高い同一性を示す塩基配列であって、プロモーター活性を維持している塩基配列などを例示できる。ここでいう「高い同一性」とは、通常９０％以上の同一性、好ましくは９５以上の同一性、より好ましくは９７％以上の同一性、更に好ましくは９９％以上の同一性を意味する。
　また、SQD2遺伝子のプロモーターの塩基配列は、配列番号１、配列番号１５若しくは配列番号４５に示す塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列であって、プロモーター活性を維持している塩基配列であってもよい。ここでいう「１若しくは数個」とは、通常は、１～１０個であり、好ましくは、１～５個であり、より好ましくは１～３個であり、更に好ましくは１個である。また、「欠失、置換若しくは付加」には、人為的な変異のほか、個体差、種や属の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutantやvariant）も含まれる。
　リン欠乏応答プロモーターとしては、SQD2遺伝子のプロモーター以外のプロモーターを使ってもよい。例えば、LDSP遺伝子のプロモーター（その塩基配列を配列番号４６に示す。）、LPAT-Y遺伝子のプロモーター（その塩基配列を配列番号４４に示す。）なども使うことができる。
　リン欠乏応答プロモーターは、藻類に導入するコンストラクトにおいて、TAG合成酵素遺伝子の上流に配置される。リン欠乏応答プロモーターは、TAG合成酵素遺伝子に直接接続していてもよいし、リンカーなどを介して接続していてもよい。
　3'非翻訳領域は、コンストラクトを導入しようとする藻類と同種の藻類に由来する遺伝子の3'非翻訳領域を使用する。実施例では、VCP(violaxanthin/chlorophyll a-binding protein)1の3'非翻訳領域を使用しているが、コンストラクトを導入しようとする藻類と同種の藻類に由来する遺伝子の3'非翻訳領域であればどのようなものでもよい。VCP1遺伝子以外の遺伝子の3'非翻訳領域としては、カリフラワーモザイクウィルスのT35Sの3'非翻訳領域、ナンノクロロプシス属の藻類のRubisco小サブユニットRBCS2の3'非翻訳領域などを例示できる(Genome, Functional Gene Annotation, and Nuclear Transformation of the Heterokont Oleaginous Alga Nannochloropsis oceanica CCMP1779, PLoS Genet. 2012 Nov;8(11). Epub 2012 Nov 15.)。3'非翻訳領域の長さは特に限定されないが、500～1500塩基とするのが好ましく、500～700塩基とするのが更に好ましい。コンストラクト中にTAG合成酵素遺伝子とプロモーターのほかに、この3'非翻訳領域を含めることにより、効率的にTAG高生産性藻類を作製できるようになる。
　3'非翻訳領域は、藻類に導入するコンストラクトにおいて、TAG合成酵素遺伝子の下流に配置される。3'非翻訳領域は、TAG合成酵素遺伝子に直接接続していてもよいし、リンカーなどを介して接続していてもよい。
　コンストラクトは、上述したTAG合成酵素遺伝子、プロモーター、及び3'非翻訳領域のほかに、他の遺伝子等、例えば、抗生物質耐性遺伝子やそれを発現させるためのプロモーターなどを含んでいてもよい。
　コンストラクトの導入対象とする藻類としては、ナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属の藻類が好ましいが、これ以外の藻類、例えば、クラミドモナス（Chlamydomonas）属、シュードコリシスチス（Pseudochoricystis）属、フェオダクチラム（Phaeodactylum）属、オステレオコックス（Ostreococcus）属、シアニディオシゾン（Cyanidioschyzon）属、クレブソルミディウム（Klebsormidium）属、クロロキブス（Chlorokybus）属、スピロギラ（Spirogyra）属、カラ（Chara）属、コレオケーテ（Coleochaete）属、クロレラ（Chlorella）属、又はフィスチュリフェラ（Fistulifera）属に属する藻類などであってもよい。ナンノクロロプシス属の藻類としては、ナンノクロロプシス・オクラタ (Nannochloropsis oculata)、ナンノクロロプシス・サリナ（Nannochloropsis salina）、ナンノクロロプシス・ ガディタナ(Nannochloropsis gaditana)などを例示でき、クラミドモナス属の藻類としては、クラミドモナス・レインハーディ（Chlamydomonas reinhardtii）などを例示でき、シュードコリシスチス属の藻類としては、シュードコリシスチス・エリプソイディア（Pseudochoricystis ellipsoidea）などを例示でき、フェオダクチラム（Phaeodactylum）属の藻類としてはフェオダクチラム・トリコルヌーツム（Phaeodactylum tricornutum）を例示でき、オステレオコックス属の藻類としてはオステレオコックス・タウリ（Ostreococcus tauri）を例示でき、シアニディオシゾン属の藻類としてはシアニディオシゾン・メロラ（Cyanidioschyzon merolae）を例示でき、クレブソルミディウム属の藻類としてはクレブソルミディウム・フラチダム（Klebsormidium flaccidum）を例示でき、カラ属の藻類としては、カラ・フラギリス（Chara fragilis）を例示でき、コレオケーテ属の藻類としては、コレオケーテ・スクタータ（Coleochaete scutata）を例示でき、クロレラ属の藻類としては、クロレラ・ブルガリス（Chlorella vulgaris）などを例示でき、フィスチュリフェラ属の藻類としては、フィスチュリフェラ・ソラリス（Fistulifera solaris）などを例示できる。
　上述したように、3'非翻訳領域は、コンストラクトを導入しようとする藻類と同種の藻類に由来するものである必要があるが、TAG合成酵素遺伝子とリン欠乏応答プロモーターは、コンストラクトを導入しようとする藻類と同種、異種のいずれの藻類由来のものであってもよい。
　コンストラクトの構築やこれを藻類に導入する操作などは常法に従って行うことができる。
　上述した方法によって作製されたTAG高生産性藻類の培養は、TAG蓄積時にリン欠乏条件下で培養すること以外、通常の藻類の培養と同様に行うことができる。例えば、藻類として、ナンノクロロプシス属の藻類を培養する場合は、培地としては、f/2培地などを用いることができ、培養温度は20～25℃程度とすることができ、培養時の光強度は10～40μE/m2/secとすることができ、クラミドモナス属の藻類を培養する場合は、培地としては、TAP培地などを用いることができ、培養温度は23～25℃程度とすることができ、培養時の光強度は10～40μE/m2/secとすることができる。
　TAG高生産性藻類にTAGを蓄積させる場合は、リン欠乏条件下で培養する。リン欠乏条件下での培養は、例えば、対数増殖期の細胞を、増殖時に用いていた培地からリン成分（例えば、K2HPO4、KH2PO4など）を除いた培地、あるいはリン成分の濃度を33μM以下にした培地に移して培養することにより、行うことができる。通常、8～13日程度の培養で細胞中に十分な量のTAGが蓄積される。また、ナンノクロロプシス属の藻類など高密度培養が可能な藻類では、リン成分を除いた培地等に移すことなく、増殖時に用いていた培地で、高密度条件下で一定期間以上培養することによっても、TAGを蓄積させることができる。これは、長期間培養することにより、自然にリン欠乏条件になるためであると考えられる。この高密度培養法では、通常、7～20日程度の培養で細胞中に十分な量のTAGが蓄積される。なお、ここでいう「高密度培養」とは、通常、細胞密度が1x108cells/ml以上の培養をいう。
　TAGを蓄積した細胞からTAGの採取は常法に従って行うことができる。
　以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕
〔実験材料〕
（１）藻類株
　真正眼点藻 Nannochloropsis NIES-2145 (以後N. 2145)を使用した。この藻類株は独立行政法人国立環境研究所(http://www.nies.go.jp/)から入手可能である。
　緑藻Chlamydomonas reinhardtii C9株（CC-408 mt-）を使用した。この藻類株はChlamydomonas Center (http://chlamycollection.org/)から入手可能である。
（２）遺伝子名とprotein ID
　遺伝子名とprotein ID(JGI Chlamydomonas reinhardtii 4.0)は以下の通りである。
DGTT4: PID190539
SQD2a: PID116277
CBLP: PID164254
（３）遺伝子配列
　C. reinhardtii由来のSQD2aプロモーター（pCrSQD2a）の配列は、配列番号１に示す通りである。
　C. reinhardtii由来のDGTT4遺伝子（CrDGTT4）の配列は、配列番号２に示す通りである。
　sh ble遺伝子の配列は、配列番号４に示す通りである。
　ナンノクロロプシス由来のVCP2遺伝子のプロモーター（NannoVCP2gene promoter）の配列は、配列番号５に示す通りである。
　ナンノクロロプシス由来のVCP1遺伝子の3'非翻訳領域（NannoVCP1(VCP1) 3'UTR）の配列は、配列番号６に示す通りである。
〔実験操作〕
（１）培養条件
　C. reinhardtiiの培養にはTAP培地を通常培養の培地として使用した。
　Na2EDTA ・ 2H2O 5 g, ZnSO4 ・ 7H2O 2.2 g, H3BO3 1.14 g, MnCl2 ・ 4H2O 506 mg, FeSO4 ・ 7H2O 499 mg, CoCl2 ・ 6H2O 161 mg, CuSO4・ 5H2O 157 mg, ( NH4 )6Mo7O24 ・ 4H2O 110 mg, KOH 1.6gをイオン交換水 1Lへ溶解し、 Hutner’s trace elementsとして4℃に保存しておいた。
　NH4Cl 400 mg , CaCl2 ・ 2H2O 51 mg,  MgSO4 ・ 7H2O 100 mg, K2HPO4 119 mg, KH2PO4 60.3 mg, Hutner’s trace elements 10 mL, 酢酸 1 mL, Tris ( hydroxymethyl ) aminomethane 2.42 gをイオン交換水 998 mLへ溶解し、オートクレーブ滅菌してから液体TAP培地として使用した。プレート培地として使用する場合はINA Agar 12 gをオートクレーブ前に添加した。
　TAP培地を通常培養の培地として使用し、20～30 μE/m2/sec, 23℃で旋回培養した。リン欠乏培地ではTAP培地から K2HPO4, KH2PO4をのぞき、窒素欠乏培地では NH4Clをのぞいた。
　N. 2145の培養にはf/2培地又はF2N50%SW培地を通常培養の培地として使用した。
　f/2培地は、以下のように調製した。
　Na2EDTA ・ 2H2O 440 mg, FeCl3 ・ 6H2O 316 mg, CoSO4 ・ 7H2O 1.2 mg, ZnSO4 ・ 7H2O 2.1 mg, MnCl2 ・ 4H2O 18 mg, CuSO4 ・ 5H2O 0.7 mg, Na2MoO4 ・ 2H2O 0.7 mgをイオン交換水 100 mLへ溶解し、f/2 metalとして4℃に保存しておいた。NaNO3 7.5 mg, NaH2PO4 ・ 2H2O 0.6 mg, Vitamin B12 0.05 μg, Biotin 0.05 μg, Thiamine HCl 10 μg, Na2SiO3 ・ 9H2O 1 mg, f/2 metal 0.1 mLを人工海水 99.9 mLへ溶解し、フィルター滅菌してから液体f/2培地として使用した。プレート培地として使用する場合は NaNO3 7.5 mg, NaH2PO4 ・ 2H2O 0.6 mg, Vitamin B12 0.05 μg, Biotin 0.05 μg, Thiamine HCl 10 μg, Na2SiO3 ・ 9H2O 1 mg, f/2 metal 0.1 mlを２倍濃度の人工海水 50 mLに溶解し、フィルター滅菌しておき、別のフラスコでINA Agar 8 gをイオン交換水 50 mLに加えてオートクレーブしてから、培地に加えた。
　野生型N. 2145を用いた実験（図１～４）では、f/2培地を通常培養の培地として使用し、20～30 μE/m2/sec, 23℃で旋回培養した。リン欠乏培地ではf/2培地からNaH2PO4をのぞき、窒素欠乏培地ではNaNO3をのぞいた。
　F2N50%SW培地は、F2N培地（PNAS, 2011, vol. 108 (no. 52) 21265-21269）に含まれる人工海水を50%濃度にしたものであり、以下のように調製した。
　Tris(hydroxymethyl)aminomethane 12.11gをイオン交換水 100 mLへ溶解し、HClでpH7.6にあわせたものを1 M Tris(pH7.6)とした。1 M Tris(pH7.6) 10 mL, NH4Cl 26.745 mg, NaNO3 7.5 mg, NaH2PO4・2H2O 3.0 mg, Vitamin B12 0.25 μg, Biotin 0.25 μg, Thiamine HCl 50 μg, Na2SiO3 ・ 9H2O 1 mg, f/2 metal 0.5 mLを50%濃度の人工海水へ溶解して全量100 mLとし、フィルター滅菌してから液体F2N50%SW培地として使用した。脂質合成遺伝子発現のコンストラクトを導入したN. 2145を用いた実験（図６～１５）では、F2N50%SW培地をコントロール培地、コントロール培地からNaH2PO4をのぞいたものをリン欠培地、コントロール培地からNaNO3、NH4Clをのぞいたものを窒素欠乏培地とした。
（２）脂質抽出
　培養液100～450 mLを800×g, 5分間遠心して、培養細胞を沈殿させ、イオン交換水1 mLに懸濁した後、-80℃に保存した。
　凍結細胞を解凍し、クロロホルム 1 mL, メタノール 2 mLを添加し、10分おきに懸濁しながら１時間室温に置いた。800 g, 5分間スイングローターで遠心し、上清 4 mLを回収した。沈殿に1%(W/V)KCl 0.8 mL, クロロホルム 1 mL, メタノール 2 mLを添加し、懸濁した後、800×g, 5分間スイングローターで遠心し、上清 3.8 mLを先ほどの上清とあわせて回収した。上清 7.8 mLにクロロホルム 2 mL, 1%(W/V)KCl 1.2 mLを添加し、懸濁した後、800×g, 5分間スイングローターで遠心し、下層の脂質抽出液を回収した。脂質抽出液を乾燥させ、60 mg/mLになるようにクロロホルム：メタノール＝2:1に溶解した後、-20℃に保存した。
（３）脂質分析
　脂質抽出液50 μLを薄層シリカプレートにスポットし、ヘキサン：ジエチルエーテル：酢酸＝160:40:4の展開液で45分間展開した。0.001%プリムリンを用いて、UV照射下でTAGを確認した。TAGがのっている部分のシリカを削り取り、1mM ペンタデカン酸 100 μL, 5% 塩酸/メタノールを500 μLを添加し、懸濁した後、85℃, 1時間静置した。ヘキサン 500 μLを添加し、懸濁した後、800×g, 5分間スイングローターで遠心し、上層のメチルエステル化した脂肪酸を回収した。下層に再びヘキサン500 μLを添加し、懸濁した後、800×g, 5分間スイングローターで遠心し、上層を回収した。メチルエステル化した脂肪酸を乾燥させた後、ヘキサン60 μLに溶解し、ガスクロマトグラフィサンプルとした。ガスクロマトグラフィはSHIMADZU GC-2014にHR-SS-10 25m (length) × 0.25mm (i.d.) (Shinwa Chemical Industries, Ltd., Japan)を取り付けて行った。
（４）RNA抽出
　凍結細胞に３倍量以上のRNA抽出液と３倍量以上の酸性フェノールを加え、凍ったまま超音波破砕（超音波15秒、氷冷３０秒）を４回行った。20000×g, 5分間, 4℃で遠心し、上清400～500 μLを回収した。上清に酸性フェノール 300 μL, クロロホルム 300 μLを添加し、懸濁した後、14k rpm, 5分間, 4℃で遠心し、上清400～500 μLを回収し、この操作を５回繰り返した。上清の1/10倍量の3 M 酢酸ナトリウム、1倍量のイソプロパノールを添加し、懸濁した後、20000×g, 5分間, 4℃で遠心した。沈殿物に70% エタノールを1 mL加え、20000×g,５分間, 4℃で遠心し、この操作を２回繰り返した後、沈殿物を乾燥させた。乾燥した沈殿を滅菌イオン交換水 400 μLに溶解した後、1 μg/μL以上の濃度の核酸であることを確認した。核酸 40 μLに10×DNase I Buffer 5 μL, DNase I 0.5 μL, 滅菌イオン交換水 4.5 μLを加え、37℃, 30分間静置した。酸性フェノール 50 μL, クロロホルム 50 μLを添加し、懸濁した後、20000×g,10分間, 4℃で遠心し、上清 35 μLを回収した。上清の1/10倍量の3 M 酢酸ナトリウム、1倍量のイソプロパノールを添加し、懸濁した後、20000×g,10分間, 4℃で遠心した。沈殿物に70% エタノール 150 μL加え、20000×g,10分間, 4℃で遠心し、この操作を２回繰り返した後、沈殿物を乾燥させた。乾燥した沈殿を滅菌イオン交換水 50 μLに溶解した後、1 μg/μL以上の濃度のRNAであることを確認した。
（５）cDNAの調製
　RNA 1 μgに10 mM dNTP 0.5 μL, 100 mM oligo dT18 0.25 μL, 100 mM random 6mer 0.25 μL, RNase free waterを適量（0 ～ 5 μL）加えて全量を6 μLとし、65℃, 5分間処理した後、氷上に静置した。さらに5xcDNA Synthesis Buffer 2 μL, 0.1 M DTT 0.5 μL, RNase OUT 0.5μL, Thermo Script RT 0.5 μL, RNase free water 0.5 μLを添加し、50℃, ４０分間, 60℃, ２０分間, 85℃, ５分間 処理した。得られたcDNAは-20℃ に保管した。
（６）定量RT-PCR法
　2×SYBR Green (TAKARA) 12.5 μL, 10 μM primer_F 1 μL, 10 μM primer_R 1 μL, ５倍希釈したcDNA 2 μL, 滅菌イオン交換水 8.5 μLを懸濁し、反応に用いた。
　プライマーは以下のものを使用した。
Nanno_realRT_TUBf　AGCATGGCATTGACTCCACC（配列番号７）
Nanno_realRT_TUBr　AACGGCCTCGTTGTAGTACACG（配列番号８）
CrDGTT4_realRT_F　GTTCGTGCAGTTCAGTGTGG（配列番号９）
CrDGTT4_realRT_R　CGGGCAGAATCCGAACA（配列番号１０）
（７）プロモーター配列の獲得
　C. reinhardtii C9株のゲノムを鋳型にPCR反応を行い、プロモーター領域pCrSQD2aを得た。得られた約１kbの配列をpMD20-T vector(TAKARA)またはpZErO-2（Invitrogen）へ導入した。
　2x GC Buffer II 5 μL, 2.5 mM dNTP 1.6 μL, C9株のゲノム 1 μL, LA Taq 0.05 μL, 10 μM primer_F 1 μL, 10 μM primer_R 1 μL, 滅菌イオン交換水 1.35 μLを懸濁し、PCR反応に用いた。
　PCR反応条件は以下の3stepで行った。
step1 94℃ ２分間
step2 94℃ ４５秒間, 55℃ ３０秒間, 71℃ １分３０秒間を４０サイクル
step3 71℃ ５分間
　プライマーは以下のものを使用した。
SQD2a_F2　 CGGGATAGTTGTAGCTGTAG（配列番号１１）
SQD2a_R2　 CGAAGAGTTGAGGTGTGTGTTC（配列番号１２）
（８）CrDGTT4遺伝子の配列の獲得
　リン欠乏時のC. reinhardtiiのcDNAを鋳型にPCR反応を行い、DGTT4遺伝子の全長を得た。得られた約１kbの配列をpMD20-T vector(TAKARA)またはpZErO-2（Invitrogen）へ導入した。
　LA PCR x10 buffer 1.5 μL, 2.5 mM dNTP 1.2 μL, MgCl2 1.05 μL, LA Taq 0.075 μL, 5 M ベタイン 1.5 μL, DMSO 0.45 μL, 10 μM primer_F 1.5 μL, 10 μM primer_R 1.5 μL, cDNA 0.2 μL, 滅菌イオン交換水 6.1 μLを懸濁し、PCR反応に用いた。
　PCR反応条件は以下の3stepで行った。
step1 94℃ ３分間
step2 94℃ ３０秒間, 54℃ ３０秒間, 72℃ １分間を４１サイクル
step3 72℃ ３分間
　プライマーは以下のものを使用した。
DGTT4_F2　 ATGCCGCTCGCAAAGCTGCG（配列番号１３）
DGTT4_R2　 CTACATTATGACCAGCTCCTC（配列番号１４）
（９）N. 2145形質転換法
　通常培地で2～3×106 cells/mLになるまで培養したN. 2145株 500mLを4℃, 980×g, 10分間遠心し、細胞を沈殿させた。上清をのぞいた後、氷冷した375 mM Sorbitolで3回洗浄した。洗浄後の沈殿細胞を終濃度5×108 cells/mLになるように375 mM Sorbitolに懸濁した。濃縮細胞 200 μlに2～10 μgのコンストラクトDNA, 10 mg/mL キャリアssDNA（Salmon Sperm）2 μLを添加した。細胞懸濁液をエレクトロポレーション用キュベット（2 mm幅）に入れ、11kV/cm, 時定数 12 msecで１回電圧をかけた。通常培地 1 mLをキュベットへ添加し、細胞を懸濁した後、15 mLチューブへ移した。さらに通常培地を4 mL添加し、全量を5 mLとした。10 μE/m2/sec, 23℃, 48 時間旋回培養し、0.4% INA Agar/f/2 5 mLを添加し、2 μg/μLゼオシンを添加したプレートに蒔いた。20～30 μE/m2/sec, 23℃で静置し、14～20日後に生えて来たコロニーを形質転換株として新しいゼオシン入りプレートへ植えついだ。
〔実験結果〕
（１）TAG/膜脂質合成系の制御検討 
　モデル藻類C. reinhardtiiでの脂質蓄積に関する知見として、窒素欠乏条件下で脂質が蓄積すること、脂質の中では貯蔵脂質であるTAGが蓄積すること、飽和脂肪酸の割合が増えることが報告されている（BMC Biotechnol. 2011; 11: 7.）。本発明者は対数増殖期の細胞をリン欠乏条件下におくと脂質蓄積がおこることを見出した（特開2014-049651）。超微細藻類であり、オイル高生産能がある真正眼点藻N. 2145でも同様にリン欠条件下での脂質蓄積を調べた。
（２）栄養欠乏条件下でのTAG蓄積量の比較
　C. reinhardtiiでの脂質蓄積の結果をふまえ、増殖が盛んな対数増殖期 (1×107 cells/mL) のN. 2145を用いて窒素欠乏条件、リン欠乏条件の比較を行った。
　窒素欠乏条件へ植え継いだ場合、C. reinhardtiiと同様に細胞増殖が大きく阻害されることがわかった（図１～３）。リン欠乏条件へ植え継いだ場合、C. reinhardtiiと同様に窒素欠乏条件下ほど阻害されず、TAG蓄積が見られた（図１～４）。リン欠乏条件へ植え継いだ場合、増殖が窒素欠乏条件下ほど阻害されないこと、TAG蓄積量が多いことから、C. reinhardtiiと同様にTAGの脂肪酸組成を膜脂質に含まれる脂肪酸から大きく改変するのに向いていることを見出した。
　また、本発明者はN. 2145のリン欠乏条件でのTAG蓄積量はC. reinhardtiiを上回っていることを見いだした。リン欠乏条件で培養１週間目の培養液１ L当たりのTAG蓄積量は12 mg/Lであり、同期間培養したC. reinhardtiiの２倍であった。さらに、N. 2145は通常培地で1×109 cells/mL、リン欠乏培地で2×108 cells/mLまで高密度培養が可能である。これは C. reinhardtiiの１００倍の細胞密度である。高密度培養でリン欠乏培地に植え継げば、培養液１Lあたり１g以上のTAGが得られると期待される。
（３）C. reinhardtii由来脂質合成遺伝子発現のコンストラクト
　Diacylglycerol acyltransferase (DGAT)はTAG生合成の最終ステップを触媒する酵素である。DGATは動物、植物に広く存在する酵素であり、DGAT1, DGAT2の２種類が報告されている。
　C. reinhardtiiには、DGAT１が１種類、DGAT2が５種類（DGTT1-5）存在することがわかっており、これらのうちDGTT1については窒素欠乏条件下でmRNA量の変化がみられること、DGTT2およびDGTT3については窒素欠乏条件下でmRNA量の変化が少ないこと、DGTT5は発現していないことが報告されている（Plant Physiol. 2010, Vol.154, 1737-1752）。本発明者はリン欠条件下で強発現を誘導するプロモーターpSQD2aを見いだし、DGTT4遺伝子に連結することで、TAG蓄積を促進する方法を開発した（特開2014-049651）。
　今回、本発明者はC. reinhardtiiのゲノムを鋳型として、SQD2aのプロモーター領域pCrSQD2aをPCRにより増幅した。またC. reinhardtiiのリン欠乏時のcDNAからCrDGTT4遺伝子の配列を得た。pCrSQD2aをCrDGTT4遺伝子上流に接続し、pCrSQD2aCrDGTT4とした。変異株選抜用にゼオシン遺伝子耐性遺伝子（S. hindustanus由来 ble）を上流に接続し、shblepCrSQD2aCrDGTT4を得た。 Kilian et al. PNAS 2011を参考に、この配列の5’末端側と3’末端側にそれぞれ N.2145のVCP2のプロモーターと N.2145のVCP1 3'UTRを挿入したものをTAG生産系強化のためのコンストラクト(F)とした。コントロールにはN.2145のVCP2のプロモーターとN.2145のVCP1 3'UTRの間にshbleのみを挿入したコンストラクト(control)を用いた。さらにN.2145のVCP1 3'UTRをpCrSQD2aCrDGTT4の3’末端側につけることの有効性を確認するために、pCrSQD2aCrDGTT4を逆向きに挿入したコンストラクト(R)も作成した（図５）。
（４）N. 2145でのTAG増産
　図５のコンストラクトをN. 2145へ形質転換し、ゼオシンで選抜後、control株とF株については形質転換株を２０～３０株得た。R株は４株得られた。リン欠乏条件５日目の形質転換株から回収したRNAを用いて、定量RT-PCRを行い、CrDGTT4遺伝子の発現上昇が確認された株をさらに選抜した。野生株、control株、R株ではCrDGTT4遺伝子発現上昇は確認されなかった(図６)。このことから、プロモーターpCrSQD2aとN.2145由来の3'UTRの組み合わせは間に挟んだ遺伝子の発現上昇に有効であると考えられる。
　野生株、コントロール株と、F株のうち、CrDGTT4遺伝子発現上昇の見られた５株（#3, #8, #9, #19, #21）と上昇の見られなかった１株（#18）についてリン欠乏培地300 mLで培養し、リン欠乏４日目と７日目で細胞を回収し、TAG蓄積量を調べた(図７、図８)。
　図７、図８より、リン欠乏４日目ではCrDGTT4遺伝子発現上昇の見られなかった#18はコントロール株と同程度のTAG蓄積しかみられなかった。CrDGTT4遺伝子発現上昇の見られた５株（#3, #8, #9, #19, #21）ではリン欠乏条件下で野生株、コントロール株よりも２～３倍のTAGが蓄積していることを発見した。７日目ではCrDGTT4遺伝子発現上昇の見られた株と野生株との差は小さくなった。これはN. 2145細胞由来の１１種類のDGAT2遺伝子発現によると考えられる。本手法は、短期間で効率よく脂質を蓄積できる方法であり、植物よりもバイオマスの大きい、藻類におけるバイオディーゼル生産や有用脂質生産を効実現するために、極めて有用性の高い手法である。
　さらに、４日目のリン欠乏条件下でのTAGの脂肪酸組成は図９に示したように、 CrDGTT4遺伝子発現上昇の見られた株では野生株やコントロール株に比べてC18:1の割合が増加していた。７日目にはこの差は顕著ではなくなっていた。CrDGTT4はC18:1を基質として好むことが報告されている（Plant Cell 2013 Feb;25(2):677-93）。このことからプロモーターpCrSQD2aとN.2145由来の3'UTRの組み合わせはTAGの脂肪酸組成を膜脂質に含まれる脂肪酸から大きく改変するのに向いていると考えられる。
　今回の発明で使用したリン欠乏応答プロモーターpCrSQD2aとN.2145由来の3'UTRの組み合わせは通常培養時には発現を誘導しないので、油脂蓄積のタイミングをコントロールすることができる。リン欠乏条件下で細胞増殖させながら、油脂蓄積を行わせることができるので、新規脂肪酸合成に適している。これは有用な特殊脂肪酸を蓄積させるにも有効な方法である。
〔実施例２〕
　リン欠乏に応答するN. 2145由来のプロモーター候補を探すために、栄養欠乏条件４日目、６日目の細胞からRNAを回収し、定量RT-PCR法を行った。C. reinhardtiiではリン欠乏条件下でSQD2aの発現上昇が見られたので、N. 2145の相同遺伝子であるSQD2A,SQD2B,SQD2Cの遺伝子発現を調べた。また、先行論文（Plant Physiology, April 2012, Vol. 158, pp. 1562-1569）から、LDSP（lipid droplet surface protein)の高発現が予想され、LPATについても本発明者の所属する研究室の先行研究より高発現が予想されたので、遺伝子発現を調べた。このとき、アクチンの発現をコントロールとした。
　使用したプライマー配列は以下の通りである。
NannoACTf: 5-ACCTTCTACAACGAGCTGC-3（配列番号１６）
NannoACTr: 5-GAACGTCTCAAACATAATCTGG-3（配列番号１７）
NannoSQD2A_realRT_F:5-TCCCTTGCTTACTGCTCTGG-3（配列番号１８）
NannoSQD2A_realRT_R:5-GATTCGCGTAGCCGCTTA-3（配列番号１９）
NannoSQD2B_realRT_F:5-CTTAATACGACCACACACGTCCTC-3（配列番号２０）
NannoSQD2B_realRT_R:5-TGATACGCCTCCGCACTTT-3（配列番号２１）
NannoSQD2C_realRT_F:5-CCACGACTGCCGAATGA-3（配列番号２２）
NannoSQD2C_realRT_R:5-TGCTAGTGGACCCTTGTTGG-3（配列番号２３）
qRT_LPATY_L:5-gcttgtcgagtacccattcat-3（配列番号２４）
qRT_LPATY_:5-cagcagcccaaagaggttc-3（配列番号２５）
qRT_LDSP_L:5-gtgcctttcgacctctcg-3（配列番号２６）
qRT_LDSP_R:5-ggcacaaaaagatcctagcaa-3（配列番号２７）
　LPAT-Y, SQD2-A, SQD2-Bがリン欠乏条件で発現上昇し、LDSPがリン欠乏および窒素欠乏条件で発現上昇した（図１１及び図１２）。N. 2145の11種類のDGAT2(DGAT2AからDGAT2K)と２種類のDGAT1についても発現を調べたが、上記４遺伝子ほどの発現上昇は見られなかった。そこで上記４遺伝子のプロモーター領域約１kbをリン欠条件下で強発現を誘導するN. 2145由来のプロモーターpNLPATY, pNSQD2A, pNSQD2B, pNLDSPとした。
　本発明者はリン欠乏条件で発現上昇の見られたLPAT-Y、SQD2-Bのプロモーター領域pNLPATY、pNSQD2BをN. 2145のゲノムを鋳型としてPCRにより増幅した。pNLPATY、pNSQD2BをpCrSQD2aのかわりにCrDGTT4遺伝子上流に接続し、pNLPATYCrDGTT4、pNSQD2BCrDGTT4とした（図１３）。図１３のコンストラクトをN. 2145へ形質転換し、pCrSQD2aCrDGTT4の場合と同様に、ゼオシンで選抜後、リン欠乏条件４日目、６日目の形質転換株から回収したRNAを用いて、定量RT-PCRを行った。定量RT-PCRには以下のプライマーを使用した。
NannoACTf: 5-ACCTTCTACAACGAGCTGC-3（配列番号４７）
NannoACTr: 5-GAACGTCTCAAACATAATCTGG-3（配列番号４８）
CrDGTT4_realRT_F:5-GTTCGTGCAGTTCAGTGTGG-3（配列番号４９）
CrDGTT4_realRT_R:5-CGGGCAGAATCCGAACA-3（配列番号５０）
　野生株、control株ではCrDGTT4遺伝子発現は確認されず、形質転換体pLPATY-1、pLPATY-2、pLPATY-3、pSQD2B-1、pSQD2B-2、pSQD2B-3ではCrDGTT4の発現が確認された（図１４）。リン欠乏培地200 mlで培養し、リン欠乏４日目で細胞を回収し、TAG蓄積量を調べた(図１５)。図１５より、CrDGTT4遺伝子発現上昇の見られた形質転換体pLPATY-3、pSQD2B-1ではリン欠乏条件下で野生株よりもTAGが蓄積していることを発見した。このことからリン欠乏条件に応答する遺伝子のプロモーター領域をTAG増産のための遺伝子発現に用いる本手法は短期間で効率よく脂質を蓄積できる方法であるといえる。
　なお、本実施例で使用した遺伝子等の配列は以下の通りである。
　N. 2145由来のDGAT2A遺伝子の配列は、配列番号２８に示す通りである。
　N. 2145由来のDGAT2B遺伝子の配列は、配列番号２９に示す通りである。
　N. 2145由来のDGAT2C遺伝子の配列は、配列番号３０に示す通りである。
　N. 2145由来のDGAT2D遺伝子の配列は、配列番号３１に示す通りである。
　N. 2145由来のDGAT2E遺伝子の配列は、配列番号３２に示す通りである。
　N. 2145由来のDGAT2F遺伝子の配列は、配列番号３３に示す通りである。
　N. 2145由来のDGAT2G遺伝子の配列は、配列番号３４に示す通りである。
　N. 2145由来のDGAT2H遺伝子の配列は、配列番号３５に示す通りである。
　N. 2145由来のDGAT2I遺伝子の配列は、配列番号３６に示す通りである。
　N. 2145由来のDGAT2J遺伝子の配列は、配列番号３７に示す通りである。
　N. 2145由来のDGAT2K遺伝子の配列は、配列番号３８に示す通りである。
　N. 2145由来のSQD2A遺伝子の配列は、配列番号３９に示す通りである。
　N. 2145由来のSQD2B遺伝子の配列は、配列番号４０に示す通りである。
　N. 2145由来のSQD2C遺伝子の配列は、配列番号４１に示す通りである。
　N. 2145由来のLPAT-Y遺伝子の配列は、配列番号４２に示す通りである。
　N. 2145由来のLDSP遺伝子の配列は、配列番号４３に示す通りである。
　N. 2145由来のLPAT-Y遺伝子のプロモーターの配列は、配列番号４４に示す通りである。
　N. 2145由来のSQD2A遺伝子のプロモーターの配列は、配列番号４５に示す通りである。
　N. 2145由来のSQD2B遺伝子のプロモーターの配列は、配列番号１５に示す通りである。
　N. 2145由来のLDSP遺伝子のプロモーターの配列は、配列番号４６に示す通りである。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
　本発明は、TAG生産に関連する各種産業分野において利用可能である。

Claims (19)

  1. 　藻類に以下の（１）～（３）を含むコンストラクトを導入することを特徴とするトリアシルグリセロール高生産性藻類の作製法、
    （１）トリアシルグリセロール合成酵素遺伝子、
    （２）トリアシルグリセロール合成酵素遺伝子の上流に配置されるリン欠乏応答プロモーター、
    （３）トリアシルグリセロール合成酵素遺伝子の下流に配置され、コンストラクトを導入しようとする藻類と同種の藻類に由来する遺伝子の3'非翻訳領域。
  2. 　リン欠乏応答プロモーターが、SQD2遺伝子のプロモーターであることを特徴とする請求項１に記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類の作製法。
  3. 　トリアシルグリセロール合成酵素遺伝子が、DGAT2遺伝子であることを特徴とする請求項１又は２に記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類の作製法。
  4. 　トリアシルグリセロール合成酵素遺伝子が、DGTT4遺伝子であることを特徴とする請求項１又は２に記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類の作製法。
  5. 　藻類が、ナンノクロロプシス属、クラミドモナス属、シュードコリシスチス属、フェオダクチラム属、オステレオコックス属、シアニディオシゾン属、クレブソルミディウム属、クロロキブス属、スピロギラ属、カラ属、コレオケーテ属、クロレラ属、又はフィスチュリフェラ属に属する藻類であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類の作製法。
  6. 　藻類が、ナンノクロロプシス属に属する藻類であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類の作製法。
  7. 　以下の（１）～（３）を含むコンストラクトが導入されていることを特徴とするトリアシルグリセロール高生産性藻類、
    （１）トリアシルグリセロール合成酵素遺伝子、
    （２）トリアシルグリセロール合成酵素遺伝子の上流に配置されるリン欠乏応答プロモーター、
    （３）トリアシルグリセロール合成酵素遺伝子の下流に配置され、コンストラクトを導入しようとする藻類と同種の藻類に由来する遺伝子の3'非翻訳領域。
  8. 　リン欠乏応答プロモーターが、SQD2遺伝子のプロモーターであることを特徴とする請求項７に記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類。
  9. 　トリアシルグリセロール合成酵素遺伝子が、DGAT2遺伝子であることを特徴とする請求項７又は８に記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類。
  10. 　トリアシルグリセロール合成酵素遺伝子が、DGTT4遺伝子であることを特徴とする請求項７又は８に記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類。
  11. 　藻類が、ナンノクロロプシス属、クラミドモナス属、シュードコリシスチス属、フェオダクチラム属、オステレオコックス属、シアニディオシゾン属、クレブソルミディウム属、クロロキブス属、スピロギラ属、カラ属、コレオケーテ属、クロレラ属、又はフィスチュリフェラ属に属する藻類であることを特徴とする請求項７乃至１０のいずれか一項に記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類。
  12. 　藻類が、ナンノクロロプシス属に属する藻類であることを特徴とする請求項７乃至１０のいずれか一項に記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類。
  13. 　請求項７乃至１２のいずれか一項に記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類をリン欠乏条件下で培養し、藻類細胞中にトリアシルグリセロールを蓄積させ、蓄積したトリアシルグリセロールを採取することを特徴とするトリアシルグリセロールの製造方法。
  14. 　藻類に以下の（１）及び（２）を含むコンストラクトを導入することを特徴とするトリアシルグリセロール高生産性藻類の作製法、
    （１）トリアシルグリセロール合成酵素遺伝子、
    （２）トリアシルグリセロール合成酵素遺伝子の上流に配置されるリン欠乏応答プロモーター。
  15. 　リン欠乏応答プロモーターが、SQD2遺伝子のプロモーターであることを特徴とする請求項１４に記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類の作製法。
  16. 　トリアシルグリセロール合成酵素遺伝子が、DGAT2遺伝子であることを特徴とする請求項１４又は１５に記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類の作製法。
  17. 　トリアシルグリセロール合成酵素遺伝子が、DGTT4遺伝子であることを特徴とする請求項１４又は１５に記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類の作製法。
  18. 　藻類が、ナンノクロロプシス属、クラミドモナス属、シュードコリシスチス属、フェオダクチラム属、オステレオコックス属、シアニディオシゾン属、クレブソルミディウム属、クロロキブス属、スピロギラ属、カラ属、コレオケーテ属、クロレラ属、又はフィスチュリフェラ属に属する藻類であることを特徴とする請求項１４乃至１７のいずれか一項に記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類の作製法。
  19. 　藻類が、ナンノクロロプシス属に属する藻類であることを特徴とする請求項１４乃至１７のいずれか一項に記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類の作製法。
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