CN108220306A - 具有三脂酰甘油合成功能的基因及其在理性调控产油微藻三脂酰甘油含量或饱和度中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域。本发明涉及一种具有三脂酰甘油(TAG)合成功能的基因及其利用该基因在提高TAG含量和理性调控微藻TAG饱和度中的应用。基因为SEQ ID NO 1所示的碱基序列、SEQ ID NO2所示的碱基序列或具有SEQ ID NO3所示的碱基序列；以及，分别与SEQ ID NO 1所示碱基序列、SEQ ID NO 2所示碱基序列或SEQ ID NO 3所示碱基序列具有95％以上同源性、且编码相同生物学功能蛋白质的DNA序列。本发明所述基因是从微拟球藻(Nannochloropsis)中分离出来的3个二酰甘油酰基转移酶DGAT基因。利用获得基因可理性调控TAG的含量和饱和度，鉴于生物柴油、保健品及药品等对于胞内三脂酰甘油的饱和度具有不同程度的需求。

Description

具有三脂酰甘油合成功能的基因及其在理性调控产油微藻三 脂酰甘油含量或饱和度中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域。本发明涉及一种具有三脂酰甘油(TAG)合成功能的基因及其利用该基因在提高TAG含量和理性调控微藻TAG饱和度中的应用。
背景技术
在当今节能、减排、低碳等理念的引导下，开发可再生能源成为重要的研究方向。目前大多数可再生能源都是以发电的形式提供能量，但是由于绝大多数运输工具仍以液体燃料作为能源，因此电能无法直接解决目前运输工具的动力问题。生物燃料是目前惟一可以作为液体燃料的可再生能源，因此在可再生能源的发展中占据着重要地位。其中，生物柴油最适合目前的内燃机系统，意味着从石油到生物柴油基本不会影响当前运输网络的运行。况且生物柴油还拥有许多优于石油的特点，如降低一氧化碳排放以及提高燃烧效率等等(Demirbas,2007)。生物柴油主要来源于植物中的储存脂质，例如油料作物中的三脂酰甘油(triacylglycerols,TAG)。理论上，如果大规模生产油料作物，必定能够满足当前的能源需求，然而这一举措也会产生诸多问题，包括油料作物与人争粮争地，以及提高净碳排放等等。
在这种情况下，产油微藻成为生物柴油行业的重要关注对象。大多数微藻的油脂单位产量高于陆生植物，据报道，某些微藻的含油量占干重的75％以上(Chisti,2008)。此外，微藻培养不占用耕地，且具有水上培养的潜在可能，海生微藻更避免了与人争夺淡水的隐患，因此微藻产油具有十分乐观的前景。然而，目前微藻产油也面临诸多瓶颈，例如油脂产率不高，且油脂饱和度尚未达到应用标准，等等。
TAG是绝大多数微藻中最重要的储存油脂，也是微藻生物柴油最重要的来源。在形成TAG的通路中，最后一步反应是该通路惟一的限速步骤，该反应以DAG作为酰基受体，主要由二酰甘油酰基转移酶(diacylglycerol acyltransferases,DGAT)进行催化。DGAT存在于所有已研究过的真核细胞中，与Kennedy Pathway中的其他酰基转移酶相似，DGAT以脂酰辅酶A作为酰基供体。目前已发现至少2类主要的DGAT家族，分别被命名为I型和II型DGAT，其中，II型DGAT(DGAT2)在微藻中常常有多个拷贝，其起源与功能的分化是目前业界的研究热点之一(Wang，2014；Liu，2016)。
微拟球藻作为工业产油微藻中的杰出代表，含有目前已知生物中最多的11个DGAT2拷贝，因而是研究DGAT2功能的理想物种。前期研究发现，微拟球藻的三个DGAT2基因(NoDGAT2A，2C，2D)可以使TAG合成缺陷的酵母株H1246产生饱和度具有显著差异的TAG，表明上述三个NoDGAT2具有提高工业微藻产油量以及理性调节油脂饱和度的应用潜力。此外，微拟球藻的基因工程工具已有多篇报道(Kang，2015；Wang，2016)，为新型工业藻株的开发奠定了客观基础。
发明内容
本发明目的在于提供一种具有三脂酰甘油(TAG)合成功能的基因及其利用该基因在提高TAG含量和理性调控微藻TAG饱和度中的应用。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种具有三脂酰甘油(TAG)合成功能的基因，基因为SEQ ID NO 1所示的碱基序列、SEQ ID NO2所示的碱基序列或具有SEQ ID NO3所示的碱基序列；
以及，分别与SEQ ID NO 1所示碱基序列、SEQ ID NO 2所示碱基序列或SEQ ID NO3所示碱基序列具有95％以上同源性、且编码相同生物学功能蛋白质的DNA序列。
所述具有三脂酰甘油(TAG)合成功能的基因所编码蛋白分别为SEQ ID NO 4所示的氨基酸序列、SEQ ID NO 5所示的氨基酸序列或具有SEQ ID NO 6所示的氨基酸序列；
以及，通过将SEQ ID NO 4的氨基酸序列、SEQ ID NO 5的氨基酸序列或SEQ IDNO6的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而产生的衍生蛋白质的氨基酸序列，该衍生蛋白质与SEQ ID NO 4的氨基酸序列、SEQ ID NO 5的氨基酸序列或SEQID NO6的氨基酸序列的蛋白具有相同的生物学功能片段。
一种构建所述具有三脂酰甘油(TAG)合成功能的基因的引物，构建SEQ ID NO 1所示的碱基序列引物为：
NoDGAT2A-for：
5’GGTACCACATAATGACGCCGCAAGCCGAC 3’；
NoDGAT2A-rev:
5’GAATTCTTACTCAATGGACAACGGGCGCGTCT 3’；
构建SEQ ID NO 2所示的碱基序列引物为：
NoDGAT2C-for：
5’GGTACCACATAATGACATCCTCCCCACC 3’；
NoDGAT2C-rev:
5’GAATTCTCACCTGACCACTAAGGTGGCC 3’；
构建SEQ ID NO 3所示的碱基序列引物为：
NoDGAT2D-for：
5’GGTACCACATAATGAAGAAAATCTTGCGC 3’；
NoDGAT2D-rev:
5’GAATTCCTAATAAAGCTCCAGCTCCCTGT 3’。
一种具有三脂酰甘油(TAG)合成功能的基因的构建方法，
1)从微拟球藻的cDNA中扩增DGAT基因；
2)回收扩增产物连接到测序载体上，通过测序获得微拟球藻DGAT基因的全长编码序列；分别命名为NoDGAT2A、NoDGAT2C、NoDGAT2D。
一种重组载体，所述重组载体含上述所述的基因序列。
一种宿主细胞，所述宿主细胞含有上述的重组载体。所述宿主细胞为微拟球藻。
一种具有三脂酰甘油(TAG)合成功能的基因在提高生物体TAG含量中的应用。
一种具有三脂酰甘油(TAG)合成功能的基因在调控生物体TAG饱和度中的应用。
本发明所具有的优点：
本发明所述基因是从微拟球藻(Nannochloropsis)中分离出来的3个二酰甘油酰基转移酶DGAT基因。利用获得基因可理性调控TAG的含量和饱和度，鉴于生物柴油、保健品及药品等对于胞内三脂酰甘油的饱和度具有不同程度的需求(例如生物柴油要求TAG含有更多的单不饱和脂肪酸，而保健品和药品常需要TAG含有更多的多不饱和脂肪酸)，因此，本发明在多个生产领域都具有重要的应用价值。
附图说明
图1为本发明所用三个NoDGAT的基因结构。
图2为本发明的微拟球藻内源过表达载体。其中图2A和2B为内源过表达载体骨架pXJ004和pXJ015，图2C、2D和2E分别为含有NoDGAT2A、2C和2D的过表达载体。
图3为本发明中过表达株与对照组NoDGAT基因表达量的比较结果。
图4为本发明中过表达株与对照组TAG含量的比较结果，星号表明t-test中p≤0.01。
图5为本发明中过表达株与对照组TAG中的脂肪酸链组成的比较结果，星号表明t-test中p≤0.01。
具体实施方法
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
本发明方法通过过表达位于微拟球藻工业藻株IMET1核基因组的一类二脂酰甘油酰基转移酶(DGAT)基因，来实现理性调控TAG含量及饱和度之目的。本发明分离出三个DGAT基因的全长cDNA序列，并利用微拟球藻的基因转化系统，对其分别进行过表达，实验证明，过表达上述三个基因均能显著提高微拟球藻的TAG含量，而且转化株TAG的不饱和度与对照组具有显著差异。所公开的全长基因及氨基酸序列为微拟球藻中的首次报道，丰富了DGAT基因家族的成员；过表达上述基因能够显著提高微拟球藻合成TAG之能力，证明了其在利用基因工程手段提高生物体生产TAG方面的应用价值；此外，过表达上述基因能够定向改变TAG的不饱和度，因此该方法还具有改良生物柴油品质和提高高附加值化合物产量的应用潜力。
下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，分子克隆(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd ed.)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例一：NoDGAT基因的克隆与分析
利用PCR技术从IMET1的gDNA和cDNA中分别克隆NoDGAT2A、2C和2D基因及其侧翼序列，所用引物依据本实验室前期的数据分析基础进行设计，并在3组引物对的两端分别引入需要的酶切位点，交由上海生工合成：
NoDGAT2A引物对为
1)NoDGAT2A-for：
5’GGTACCACATAATGACGCCGCAAGCCGAC 3’；
2)NoDGAT2A-rev:
5’GAATTCTTACTCAATGGACAACGGGCGCGTCT 3’；
3)NoDGAT2C引物对为NoDGAT2C-for：
5’GGTACCACATAATGACATCCTCCCCACC 3’；
4)NoDGAT2C-rev:
5’GAATTCTCACCTGACCACTAAGGTGGCC 3’；
NoDGAT2D引物对为
5)NoDGAT2D-for：
5’GGTACCACATAATGAAGAAAATCTTGCGC 3’；
6)NoDGAT2D-rev:
5’GAATTCCTAATAAAGCTCCAGCTCCCTGT 3’。
所用PCR仪为Eppendorf公司的MasterCycler，反应体系50μL，包括4μL dNTP(2.5mM each，TAKARA)，正反向引物各2μL(10μM)，5μL10×buffer(Mg2+plus，TAKARA)，0.4μL rTaq酶(5U/μL，TAKARA)，1μL DNA模板(50ng/μL，正、负对照分别加入等体积的相应质粒和野生型DNA)，以及超纯水35.6μL。反应体系如下：起始94℃预变性3min，然后94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1-2min，30个循环，最后72℃反应7min。
反应结束后，取5μL PCR产物与1μL 6×loading buffer(TAKARA)混匀，点入1％(w/v)的琼脂糖(BIOWEST)凝胶中，在北京六一仪器厂生产的电泳系统上以120V电泳25min后，使用UVP公司的UV凝胶成像仪BioChemiHR进行观察、拍照。用Omega公司的Cycle-PureKit或Gel Extraction Kit从PCR产物中纯化并回收目的片段，其操作完全按照说明书进行。
将得到的纯化片段连入TAKARA公司的pMD18-T载体中，并使用热激转化的方式将其转入全式金公司的大肠杆菌感受态细胞Trans 5α中，阳性克隆送至Invitrogen公司测序，分别得到了NoDGAT2A、NoDGAT2C和NoDGAT2D基因的全长编码区序列，依次对应序列表SEQ ID NO 1，SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3所示碱基序列。此外，通过与基因组序列的比对，得到了NoDGAT2A，2C，2D的基因结构，参见图1。
实施例二：NoDGAT在海洋微拟球藻IMET1中的过表达
(一)内源过表达载体的构建
参见图2。构建载体的具体方法如下：通过PCR方法，以微拟球藻IMET1的cDNA为模板，扩增获得NoDGAT的全长ORF片段。为了构建克隆的需要，借助引物引入法，在靶序列5’端加上酶切位点和保护碱基，并在其3’端加上酶切位点，引物对序列如下：
NoDGAT2A引物对为
1)NoDGAT2A-oe-for：
5’CCGCTCGAGATGACGCCGCAAG 3’；
2)NoDGAT2A-oe-rev:
5’GAATTCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCAATGGAC 3’；
3)NoDGAT2C引物对为NoDGAT2C-oe-for：
5’CCGCTCGAGATGACATCCTCCCC 3’；
4)NoDGAT2C-oe-rev:
5’GAATTCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCCTGACCACT 3’；
NoDGAT2D引物对为
5)NoDGAT2D-oe-for：
5’GACCTCTGAAGTTCCATGAAGAAAATCTTGC 3’；
6)NoDGAT2D-oe-rev:
5’GGATCCCCCGGGCTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGATAA 3’。
将PCR扩增得到产物利用酶切位点分别定向克隆至前期构建的内源过表达载体pXJ004(Wang et al,2016),再将包含β-tublin启动子、NoDGAT基因和psbA终止子的片段亚克隆至前期构建的内源过表达载体pXJ015(Wang et al,2016)中，分别得到内源过表达载体pXJ418(含有NoDGAT2A)、pXJ420(含有NoDGAT2C)和pXJ421(含有NoDGAT2D)。
(二)电穿孔法将载体pXJ418、pXJ420和pXJ421导入微拟球藻
在转化前1h，取浓度约为1-3×107cells/mL的对数生长期的微拟球藻藻液，4000g离心5min，弃上清，375mM山梨醇漂洗2次，用山梨醇调整细胞浓度到2×108cells/mL。将浓缩藻体分装为200μl的小份，同时选取pXJ015空载体作为对照组，每份加入3μg上述获得的线性化载体和1μl变性处理的鲑鱼精DNA(15μg/mL)，混匀后冰置10min。将混合物转移入2mm电击杯，以2200V(HV)，50μF进行电击，电击后立即将藻体转移入5mL新鲜f/2培养基。25℃摇床中100rpm，弱光复苏48h后，涂在含有5μg/mL zeocin的f/2平板上，以25℃，50μmol m-2s-1光照培养直至克隆长出。
(三)微拟球藻转化株的NoDGAT表达量分析
选取PCR鉴定为阳性的NoDGAT2A转化株OeDgat2a-2、NoDGAT2C转化株OeDgat2c-7和NoDGAT2D转化株OeDgat2d-9进行表达量分析，通过Trizol法从OD750值为4.0-5.0之间的转化株中提取总RNA，并使用Takara公司的反转录试剂盒获得cDNA。随后，使用Bio-Rad公司的CFX96TouchTM Real-Time PCR Detection System进行qRT-PCR分析，选取看家基因β-actin作为内参。所用引物如下：
1)NoDGAT2A-qpcr-for：
5’TCTTCAGGCTGTGGCGGGAC 3’；
2)NoDGAT2A-qpcr-rev:
5’TCTTCAGGCTGTGGCGGGAC 3’；
3)NoDGAT2C-qpcr-for：
5’GAGGCAAAGACATCGTGGTGGTA 3’；
4)NoDGAT2C-qpcr-rev:
5’AGGAAGGGGAGGAAGGGGAC 3’；
5)NoDGAT2D-qpcr-for：
5’CATCCGCACGGTCTCTTCA 3’；
6)NoDGAT2D-qpcr-rev:
5’AATGCGGCAGGCACATAAAC 3’；
7)NoACT-qpcr-for：
5’GACGGCACCAAGGTCAAAAT 3’；
8)NoACT-qpcr-rev:
5’ACGACGTGGAAGAGGAGGAA 3’；
每个反应含有5μL的iTaqTM UniversalGreen Supermix(Bio-Rad),20ng的cDNA模板和280nM引物，最终反应体系为10μL。反应体系如下：起始95℃预变性30sec，然后95℃变性5sec，60℃退火30sec，40个循环，最后65-95℃融合。结果分析公式为2Ct(NoAct)/2Ct(NoDGAT)。由图3可见，转化株的mRNA丰度相比对照组均有3.2-8.9倍的上调，应具有较好的过表达效果。
(四)微拟球藻转化株油脂中TAG的含量与组分分析
油脂提取参考Bligh和Dyer发明的氯仿-甲醇法。总脂的薄层层析分离参考Ghosal的方法。用Agilent气相色谱-四级杆质谱联用仪(GC-MS)分析TAG的流程如下：将TAG从上述载有TAG的硅胶板上刮下，用氯仿-甲醇溶解后，将下层氯仿溶液在氮吹仪下吹干后，加入1％硫酸-甲醇溶液(v/v)，并加入50uL正十九烷酸的甲醇溶液(2.25g/L)作为内标，充氮气后用封口膜密封，于70℃烘箱中反应60min进行甲酯化。待冷却后，用正己烷萃取甲酯化产物并用GC-MS分析。各脂肪酸链的量依据其与正十九烷酸的峰面积比值进行估定。由图4可见，过表达株产生的TAG含量显著高于对照组，这证明了微拟球藻DGAT在提高生物体的TAG含量方面具有重要的应用价值。
由图5可见，过表达株产生的TAG中，OeDgat2a-2的饱和脂肪酸(16:0和18:0)、OeDgat2d-9的单不饱和脂肪酸(16:1和18:1)以及OeDgat2c-7的多不饱和脂肪酸(18:2、18:3、20:4和20:5)含量均显著高于对照组，这证明了微拟球藻DGAT在脂肪酸底物的吸收上具有不同的偏好性，因此具有改良生物体产油品质的应用潜力。此外，鉴于多不饱和脂肪酸20:4(ARA)和20:5(EPA)是重要的高附加值化合物，因此本发明还具有提高生物体内高附加值化合物含量的应用潜力。
尽管本发明描述了具体的例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。
NoDGAT2A基因的全长编码区序列参见SEQ ID NO 1
1092
DNA
微拟球藻(Nannochloropsis oceanica IMET1)
NoDGAT2C基因的全长编码区序列SEQ ID NO 2
1026
DNA
微拟球藻(Nannochloropsis oceanica IMET1)
NoDGAT2D基因的全长编码区序列参加SEQ ID NO 3
1176
DNA
微拟球藻(Nannochloropsis oceanica IMET1)
3
NoDGAT2A基因的全长编码区序列对应的编码蛋白参见SEQ ID NO 4
363
PRT
微拟球藻(Nannochloropsis oceanica IMET1)
4
NoDGAT2C基因的全长编码区序列对应的编码蛋白参见SEQ ID NO 5
341
PRT
微拟球藻(Nannochloropsis oceanica IMET1)
NoDGAT2D基因的全长编码区序列对应的编码蛋白参见SEQ ID NO 6
391
PRT
微拟球藻(Nannochloropsis oceanica IMET1)
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院青岛生物能源与过程研究所<120> 具有三脂酰甘油合成功能的基因及其在理性调控产油微藻三脂酰甘油含量或饱和度中的应用
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 1092
<212> DNA
<213> 微拟球藻 (Nannochloropsis oceanica IMET1)
<220>
<221> gene
<222> (1)..(1092)
<223>
<400> 1
atgacgccgc aagccgacat caccagcaag acgacaccca acctcaagac ggctgcgtca 60
tccccctcca agacctcgcc cgccccctcc gttcaataca aggcggcgaa tggcaaggtg 120
atcacggtgg ccatggccga gcaagacgac gggaacatgg gcattttccg cgagtgtttt 180
gcaatggtga caatgggcat aattatgtcg tggtattaca tcgtcgtcat tctctccctc 240
ctctgcttgg tggggatctg catcttccct gcctggcggg cggtagcggc cacggttttt 300
atgcttatgt ggagtgcggc gctattgccg cttgactacc agggatggga tgctttctgc 360
aactccttta tcttcaggct gtggcgggac tacttccact atgaatacgt cctggaggag 420
atgatcgacc caaacaagcg ctacctcttt gctgagatgc ctcacggtat cttcccctgg 480
ggagaggtga tttccatttc gatcaccaaa cagctttttc ccgggagccg cgtaggctcc 540
atcggtgcga gtgtcatctt cctccttccc ggtctcaggc acttcttcgc ttggatcggg 600
tgtcggcccg cgagcccaga gaacatcaaa aagatttttg aggatgggca ggactgtgcc 660
gtgacggtgg ggggggtcgc cgagatgttt ctagtcggag gagacaagga acgactgtac 720
ctgaagaagc acaagggttt cgttcgagaa gccatgaaga atggggcgga cctggttcct 780
gtcttctgct tcggcaacag caaactgttc aatgtggtgg gggagagcag tcgggtttct 840
atgggcctga tgaagcgcct ctcaaggagg attaaggcca gcgtcctcat ctcttacggc 900
cgtctcttcc tgcccattcc gattcgacac ccgctcttgt tcgtggtggg gaagcccctg 960
ccggtcgtgc acaaggcaga accgaccaag gaggagatcg cggcaacgca cgcactcttt 1020
tgcgagaagg tcgaggagct ttactacaaa tacaggccgg agtgggagac gcgcccgttg 1080
tccattgagt aa 1092
<210> 2
<211> 1026
<212> DNA
<213> 微拟球藻 (Nannochloropsis oceanica IMET1)
<220>
<221> gene
<222> (1)..(1026)
<223>
<400> 2
atgacatcct ccccaccagc ctcaccatct gcacctgaga atccctataa cctattgcca 60
cctaagcggc caaatccgca gtactggcgg tatgcaagcc tgaccgcttt cattctcatt 120
tgcttccaag ccccttcaag tgactcgtgg ggcaccgccc tccgccgcgc ctgctgggcg 180
gcgtactgga tgacctacct ggacacaagc tataaggatg gctcacgggc ctggccctgg 240
tttcagcgct taaggatctg gcgtttgtac tgcggctatt tacagggcaa agtaatttgt 300
acggtgccct tggacccggc acagcaattc atcttcgcag ctcatcccca cggcattggc 360
acctggaatc atttcctaac catgactgac ggctgtcgct tcctctcctc atcctacccc 420
cgcccgcggc tcgacctggg tgcgacggta cttttcttca tccccttcct aaaggaaatt 480
ctgctctggc tgggctgtgt ggacgctgga gcgtccacgg ctcacgcaat cttggcgcgg 540
ggctactcat ccctcattta cattggtgga gaaaaggagc agattttaac gcagcgaggc 600
aaagacatcg tggtggtacg tccccgcaag ggtttttgca agctggccct gcaacatgac 660
tgccccatcg tacccgtcta cgcgtttggg gagaacgatc tctatcgcac attcaaccac 720
ctgaaggact tccaactgtg ggtggccagc acctttaagc tggcttttcc tccttgttgg 780
ggcgtcccct tcctcccctt cctccctctg ccagtccccg tcacggtggt gatgggcgaa 840
cccttgcggc ccagaacagg agaaggaaag gagggaaggg ctggtggaga aaaaggagtg 900
aagcccacaa gggaggaggt ggacgagctg cacacccggt acgtggaggc cctgcagagg 960
ttgttcgacg cacacaaggg caggcacggg gggaggagcg aagaggccac cttagtggtc 1020
aggtga 1026
<210> 3
<211> 1176
<212> DNA
<213> 微拟球藻 (Nannochloropsis oceanica IMET1)
<400> 3
atgaagaaaa tcttgcgcat cccggagtcg cccatctcgg acgacaccct ggtgaagaat 60
ggaggcaagg agaccgagct ctccacgccg gtcaccgctc ctacgtcgga ccgcacgcgc 120
atctacagtg atggctattc gacccccaag tcctacacat tggaagtcga tccaaaattt 180
tacaagcgag tatgtgatgc tgacgatgtg tggacacgca cacagggggc ctttgctctc 240
ctcatgctct ggggcgtttg gcttgccggg tccttttctg tgttttggtg gccctattta 300
gtaatgaagg ggtactacac tgcagccctt gtcatggcag tgatcatggc atatccgtat 360
gttgtcaagg tcaagcaaag cccggcattt attcggttca tcttgagcgg cgcgggttgg 420
tttaagggcg ggacttgttt gtatttggag gagtcgatga agcagatcga caccagcgag 480
tctgtcctcc tctgccagca tccgcacggt ctcttcacct acggcttcat tcagaacggg 540
tccgccgccc gcatcgatgc ccgcaaacca gaggtttatg tgcctgccgc atttcgtcac 600
atgaaaccca acgccaaggc cttcgtggag cccttgcttt tcaaaatccc gctcatccgt 660
cacttcatta ccgccttcgg caatgccgct ccggcgacaa agaaagaaat gcaccggctc 720
atgtccacca aaattcccct ggggcttcta cccggtgggt cggaagagat catactaagc 780
caccacggcc atgagcgggc ctacatactt aaacggaaag gcttcctcaa gtacgcatta 840
caacatggct acacgatttg cattggatac acgttcgggg agtccgactc gtaccgcacc 900
ttggactggg gcgtgaagtt tcgtatgtgg tatctgaaaa ccttccgtgt tccacttttc 960
gcgtgctggg ggatttggtg gtgtcccctc ttgccgcggg ggcaggtggc gcttgagaca 1020
gtcgttggga acccgtttcg gttgcccaag atctcagatc cgagccagga ggatattgac 1080
aagtggcatg cggtgtatgt gcaaaaactt gtggatctgt ttgatcggaa caaagccaag 1140
ttcgggtatg gggacaggga gctggagctt tattag 1176

Claims (9)

1.一种具有三脂酰甘油(TAG)合成功能的基因，其特征在于：
基因为SEQ ID NO 1所示的碱基序列、SEQ ID NO2所示的碱基序列或具有SEQ ID NO3所示的碱基序列；
以及，分别与SEQ ID NO 1所示碱基序列、SEQ ID NO 2所示碱基序列或SEQ ID NO 3所示碱基序列具有95％以上同源性、且编码相同生物学功能蛋白质的DNA序列。
2.按权利要求1所述具有三脂酰甘油(TAG)合成功能的基因，其特征在于：所述具有三脂酰甘油(TAG)合成功能的基因所编码蛋白分别为SEQ ID NO 4所示的氨基酸序列、SEQ IDNO 5所示的氨基酸序列或具有SEQ ID NO 6所示的氨基酸序列；
以及，通过将SEQ ID NO 4的氨基酸序列、SEQ ID NO 5的氨基酸序列或SEQ ID NO6的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而产生的衍生蛋白质的氨基酸序列，该衍生蛋白质与SEQ ID NO 4的氨基酸序列、SEQ ID NO 5的氨基酸序列或SEQ IDNO6的氨基酸序列的蛋白具有相同的生物学功能片段。
3.一种构建权利要求1所述具有三脂酰甘油(TAG)合成功能的基因的引物，其特征在于：
构建SEQ ID NO 1所示的碱基序列引物为：
NoDGAT2A-for：
5’GGTACCACATAATGACGCCGCAAGCCGAC 3’；
NoDGAT2A-rev:
5’GAATTCTTACTCAATGGACAACGGGCGCGTCT 3’；
构建SEQ ID NO 2所示的碱基序列引物为：
NoDGAT2C-for：
5’GGTACCACATAATGACATCCTCCCCACC 3’；
NoDGAT2C-rev:
5’GAATTCTCACCTGACCACTAAGGTGGCC 3’；
构建SEQ ID NO 3所示的碱基序列引物为：
NoDGAT2D-for：
5’GGTACCACATAATGAAGAAAATCTTGCGC 3’；
NoDGAT2D-rev:
5’GAATTCCTAATAAAGCTCCAGCTCCCTGT 3’。
4.一种权利要求1所述的具有三脂酰甘油(TAG)合成功能的基因的构建方法，其特征在于：
1)从微拟球藻的cDNA中扩增DGAT基因；
2)回收扩增产物连接到测序载体上，通过测序获得微拟球藻DGAT基因的全长编码序列。
5.一种重组载体，所述重组载体含有权利要求1所述的基因序列。
6.一种宿主细胞，所述宿主细胞含有上述的重组载体。
7.按权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞为微拟球藻。
8.一种权利要求1所述具有三脂酰甘油(TAG)合成功能的基因在提高生物体TAG含量中的应用。
9.一种权利要求1所述具有三脂酰甘油(TAG)合成功能的基因在调控生物体TAG饱和度中的应用。
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