WO2015137406A1 - 肺扁平上皮癌と肺腺癌の鑑別評価方法 - Google Patents

肺扁平上皮癌と肺腺癌の鑑別評価方法 Download PDF

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squamous cell
cell carcinoma
dna
adenocarcinoma
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一矢 高持
鈴木　健司
齋藤　剛
貴恵子 原
恵子 三谷
薫 茂櫛
林崎　良英
昌可 伊藤
英哉 川路
寛子 大宮
康成 山中
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Juntendo Educational Foundation
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/5752—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer of the lungs
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    • C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to a novel marker that makes it possible to easily distinguish lung cancer tissue types even in micro-tissue specimens such as biopsy specimens, and more specifically, a technique for differentially evaluating squamous cell carcinoma and adenocarcinoma at the molecular level About.
  • Lung cancer which causes 70,000 deaths annually in Japan, is broadly divided into small cell cancer and non-small cell lung cancer.
  • Non-small cell lung cancer is further divided into adenocarcinoma, squamous cell carcinoma, large cell cancer and other cancers. It is classified as a rare tissue type.
  • anticancer agents pemetrexed
  • molecular targeted therapeutic agents bevacizumab
  • squamous cell carcinoma and other non-small cell lung cancer non-squamous cell carcinoma
  • the histological basis of lung squamous cell carcinoma is the presence of intercellular bridges or keratinization in the cancer tissue.
  • the degree of differentiation of lung squamous cell carcinoma is determined by the degree of intercellular bridge or keratinization.
  • Squamous cell carcinoma with low differentiation (poorly differentiated squamous cell carcinoma) has a degree of intercellular bridge and keratinization in a small area of the entire cancer tissue.
  • lung adenocarcinoma is roughly classified into those containing a component of Bronchioloalveolar type (BAC) and those not containing.
  • BAC Bronchioloalveolar type
  • Adenocarcinoma containing the BAC component is morphologically easy to diagnose, but if not included, it may be difficult to differentiate from poorly differentiated squamous cell carcinoma. So far, P40, CK5, CK6, DSG3, TTF-1, and Napsin A have been used as markers for immunohistochemical staining for differentiation between squamous cell carcinoma and adenocarcinoma, but the accuracy is not always sufficient and the accuracy is higher. Currently, there is a need for markers. In addition, differential diagnosis may greatly depend on the pathologist's subjectivity, and an objective and universal determination method is required.
  • RNA-seq Non-Patent Document 1
  • CAGE Cap Analysis Gene Expression: Non-Patent Document 2
  • the CAGE method has a feature that the activity of the transcription start site can be comprehensively quantified by selecting a long capped RNA such as mRNA and sequencing the 5 'end randomly and in large quantities.
  • the present invention relates to providing a method for objectively and rapidly distinguishing and evaluating lung squamous cell carcinoma and lung adenocarcinoma with high accuracy.
  • the present inventors extracted RNA from lesions of patients with lung squamous cell carcinoma and lung adenocarcinoma and covered the expression state in the vicinity of the transcription start region (Transcript Start Site; TSS) as sequence information using the CAGE analysis method. As a result, it was found that the expression level of DNA containing a specific transcription initiation region is significantly different between the two, and that this can be used as an index to distinguish between the squamous cell carcinoma and adenocarcinoma.
  • TSS Transcript Start Site
  • the present invention relates to the following 1 to 4).
  • 1) Whether the lesion is squamous cell carcinoma, comprising a step of measuring the expression level of one or more expression products of DNA including a transcription initiation region for a biological sample collected from a lesion of a lung cancer patient A method for differentially evaluating whether or not it is an adenocarcinoma, wherein the DNA comprises a base at an arbitrary position in the transcription initiation region in the base sequence represented by SEQ ID NOs: 1 to 213 and one or more bases continuous downstream thereof And The evaluation method, wherein the transcription start region is a region whose both ends are defined by the first base of the base sequence represented by SEQ ID NOs: 1 to 213 and the 101st base from the 3 ′ end.
  • the DNA comprises a base at an arbitrary position in the transcription initiation region and one or more bases continuous downstream thereof, Use of the expression product, wherein the transcription initiation region is a region defined at both ends by the first base of the base sequence represented by SEQ ID NOs: 1 to 213 and the 101st base from the 3 ′ end.
  • the present invention it is discriminated whether the cancer lesion of a lung cancer patient is squamous cell carcinoma or adenocarcinoma, furthermore, whether it is poorly differentiated squamous cell carcinoma or adenocarcinoma, and further, poorly differentiated squamous It is possible to distinguish between epithelial cancer and adenocarcinoma that does not contain a BAC component, thereby enabling rapid diagnosis.
  • squamous cell carcinoma pulmonary squamous cell carcinoma
  • squamous cell carcinoma means a cancer that develops from the bronchial squamous epithelium (squamous cell metaplasia).
  • Adenocarcinoma pulmonary adenocarcinoma refers to cancer that originates in lung glandular cells (bronchial columnar epithelium, alveolar epithelium, bronchial exocrine gland, etc.), and bronchioloalveolar type: BAC) is broadly divided into those that contain and those that do not.
  • evaluation means differential evaluation or measurement of whether a cancer lesion derived from a lung cancer patient is squamous cell carcinoma or adenocarcinoma.
  • Examples of biological samples used in the present invention include biopsy specimens and excised specimens collected from lesions of lung cancer patients to be evaluated.
  • an RNA extract is prepared, and when it is subjected to measurement at the protein level, a protein extract is prepared.
  • Any known method can be used as a method for extracting RNA from a biological sample. Specific examples include Ambion RiboPure kit manufactured by Life Technologies, miRNeasy manufactured by Qiagen, and RNeasy manufactured by Qiagen. Among these, the miRNeasy kit manufactured by Qiagen is preferably used.
  • nucleic acid or “polynucleotide” means DNA or RNA.
  • DNA includes not only double-stranded DNA but also single-stranded DNAs comprising a sense strand and an antisense strand constituting the DNA. Accordingly, the DNA includes double-stranded genomic DNA, single-stranded cDNA, single-stranded DNA having a sequence complementary to the DNA, and the like.
  • RNA includes any of total RNA, mRNA, rRNA, and synthetic RNA.
  • a transcription product of DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 213 is a squamous cell carcinoma (low For specimens that are differentiated lung squamous cell carcinoma) and specimens that are adenocarcinomas (lung adenocarcinomas that do not contain a BAC component), using a CAGE (Cap Analysis Gene Expression) analysis method, downstream including the transcription start region on the genome 100
  • CAGE Cap Analysis Gene Expression
  • RNA RNA-derived profile group obtained from “squamous cell carcinoma” and a clinical specimen-derived profile group obtained from “adenocarcinoma” is performed in the R / Bioconductor edgeR package. (Bioinformatics. 2010 Jan 1; 26 (1): 139-40), and FDR (false discovery rate) 1% is set as a threshold value and extracted.
  • a DNA consisting of a base at an arbitrary position (transcription start point) in the transcription start region and one or more bases continuous downstream thereof (hereinafter referred to as “sequence numbers 1 to 213
  • An expression product (referred to as “the expression product of the present invention”) (referred to as “the expression product of the present invention”) (referred to as “DNA containing a transcription start point”) is a biomarker for differential evaluation of lung squamous cell carcinoma and lung adenocarcinoma Specifically, for lung cancer, whether it is squamous cell carcinoma or adenocarcinoma, further poorly differentiated squamous cell carcinoma or adenocarcinoma, further poorly differentiated squamous cell carcinoma or BAC component It can be a biomarker for differential evaluation of adenocarcinoma that does not contain.
  • the DNA expression product containing the transcription start point in SEQ ID NOs: 1 to 5 is a marker whose expression level increases in lung adenocarcinoma
  • the DNA expression product containing the transcription start point in SEQ ID NOs: 6 to 213 is lung adenocarcinoma It is a marker that decreases the expression level.
  • the “transfer start region” refers to a region including a transfer start point.
  • the transcription start point from a specific promoter is not limited to a single base, and may be a base present at a plurality of positions downstream of the promoter on the genome.
  • a region including a plurality of these transfer start points is referred to as a transfer start region in this specification. More specifically, the transfer start area is an area between the transfer start point located on the most 5 ′ side and the transfer start point located on the most 3 ′ side among the plurality of transfer start points.
  • each of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 213 has a 5 ′ end corresponding to a region defined at both ends by the base at position 1 (5 ′ end) and the 101st base from the 3 ′ end. This is a base region to be formed.
  • each of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 213 shows a transcription start region and 100 bases following the transcription start point located on the most 3 ′ side in the transcription start region.
  • such a transcription start region is also referred to as “a transcription start region shown in SEQ ID NOs: 1 to 213”.
  • the position of the transcription start region shown in SEQ ID NOs: 1 to 213 on the genome and the gene information related thereto are as shown in Tables 1-1 to 1-9 described later.
  • the DNA whose expression level of the expression product is measured is a base sequence at any position (transcription start point) in the transcription start region in the base sequence represented by SEQ ID NOs: 1 to 213 and 1 downstream thereof. It is DNA consisting of a base sequence of bases or more.
  • the number of bases in the downstream base sequence may be any number that can identify the expression product. Examples of the number of bases include 1 base or more, 5 bases or more, 10 bases or more, 15 bases or more, 20 bases or more, 25 bases or more, 30 bases or more, 40 bases or more, 50 bases or more.
  • the said base number 10 bases or less, 15 bases or less, 20 bases or less, 25 bases or less, 30 bases or less, 40 bases or less, 50 bases or less, 100 bases or less are mentioned, for example.
  • the number of bases on the downstream side is not particularly necessary in the case of measurement by the CAGE method, but in the case of measurement by hybridization or PCR, any part up to about 100 bases downstream is targeted in order to ensure the accuracy.
  • the DNA consisting of the transcription initiation region and 100 bases downstream thereof if it has a length of at least 20 bases, there is a high probability that it can be identified even in an experimental system targeting the entire genome.
  • the DNA also includes DNA having a base sequence substantially identical to the base sequence of the DNA as long as the expression product can be a biomarker for discriminating lung squamous cell carcinoma and lung adenocarcinoma.
  • Such an expression product of the present invention can be distinguished from lung squamous cell carcinoma and lung adenocarcinoma by grasping the expression level by combining one or two or more of them.
  • SEQ ID NO: 2 The DNA expression products containing the transcription start sites in SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 7 can be classified with a specificity of 100% and a sensitivity of 100% when the threshold values shown in Table 2 are set. That is, these can be surely discriminated only by one expression level.
  • the number and content of the combination can be selected as appropriate.
  • expression products of arbitrary plural DNAs may be combined, and further within the range that can contribute to the evaluation of the present invention, transcription initiation in SEQ ID NOs: 1 to 213
  • the expression product of the present invention includes a transcription product and a translation product expressed from the DNA.
  • the transcription product include RNA generated by transcription from the DNA, preferably mRNA.
  • Specific examples of the translation product include a protein encoded by the RNA.
  • ST6GALNAC1 alpha-N-acetyl-neuraminyl-2,3-beta-galactosyl-1,3) -N-acetylgalactosaminide alpha-2,6- UniProtKB / Swiss-Prot: SIA7A_HUMAN, Q9NSC7
  • SPATS2 spermatogenesis associated, serine-rich 2; UniProtKB / Swiss-Prot: SPAS2_HUMAN , Q86XZ4
  • the transcription product of the DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 is specifically expressed in adenocarcinoma
  • the transcription of the DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 7 Since the product is specifically expressed in squamous cell carcinoma, ST6GALNAC1 is an adenocarcinoma marker and SPATS2 is a squamous cell carcinoma marker. When both are combined, the differentiation between adenocarcinoma and squamous cell carcinoma is extremely high. Useful.
  • protein markers such as P40, CK5, CK6, DSG3 (Desmoglein-3), TTF-1 (Thyroid transcription factor-1), and Napsin A, which have been conventionally used for differentiation from squamous cell carcinoma and adenocarcinoma.
  • P40, CK5, CK6, DSG3 (Desmoglein-3), TTF-1 (Thyroid transcription factor-1), and Napsin A which have been conventionally used for differentiation from squamous cell carcinoma and adenocarcinoma.
  • suitable combinations include TTF-1 / ST6GALNAC1, CK5 / ST6GALNAC1, DSG3 / ST6GALNAC1, CK5 / SPATS2, DSG3 / SPATS2, p40 / ST6GALNAC1, ST6GALNAC1 / SPATS2, Napsin A / ST6GALNAS1p2 Combination, more preferably a combination of two markers TTF-1 / ST6GALNAC1, more preferably ST6GALNAC1 / TTF-1 / CK5, ST6GALNAC1 / TTF-1 / DSG3, ST6GALNAC1 / TTF-1 / p40, ST6GALNAC1 / SPATS2 / DSG3, ST6GALNAC1 / SPATS2 / CK5, and ST6GALNAC1 / SPA
  • the target of the measurement or detection of the expression product is cDNA artificially synthesized from the RNA, DNA encoding the RNA, protein encoded from the RNA, molecule interacting with the protein, and interaction with the RNA. Also included are molecules that act or molecules that interact with the DNA.
  • molecules that interact with RNA, DNA or protein DNA, RNA, protein, polysaccharide, oligosaccharide, monosaccharide, lipid, fatty acid, and their phosphates, alkylated products, sugar adducts, and the like, and Any of the above-mentioned complexes can be mentioned.
  • the expression level comprehensively means the expression level and activity of the expression product.
  • RNA, cDNA or DNA is targeted as a method for measuring the expression level, nucleic acid amplification represented by PCR method, real-time RT-PCR method, SmartAmp method, LAMP method, etc., using DNA hybridizing therewith as a primer Methods, hybridization methods using nucleic acids that hybridize to these as probes (DNA chips, DNA microarrays, dot blot hybridizations, slot blot hybridizations, northern blot hybridizations, etc.), methods for determining base sequences, or combinations thereof You can choose from different methods.
  • the probe or primer used for the measurement that is, the primer for specifically recognizing and amplifying the expression product (transcription product) of the present invention or the nucleic acid derived therefrom, or the RNA or the nucleic acid derived therefrom is specific.
  • “specifically recognize” means that, for example, in the Northern blot method, substantially only the expression product (transcription product) of the present invention or a nucleic acid derived therefrom can be detected. This means that the detected product or product can be determined to be the transcript or the nucleic acid derived therefrom so that only the nucleic acid is produced.
  • an oligonucleotide containing a certain number of nucleotides complementary to DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NOs: 1 to 213 or its complementary strand can be used.
  • the “complementary strand” refers to the other strand with respect to one strand of double-stranded DNA comprising A: T (U in the case of RNA) and G: C base pairs.
  • “complementary” is not limited to the case where the certain number of consecutive nucleotide regions are completely complementary sequences, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and still more preferably 95% or more. What is necessary is just to have the identity on arrangement
  • the identity of the base sequence can be determined by the algorithm such as BLAST.
  • BLAST a nucleotide sequence
  • it only needs to be capable of specific annealing and chain extension, and is usually 10 bases or more, preferably 15 bases or more, more preferably 20 bases or more, and for example 100 bases or less.
  • Those having a chain length of preferably 50 bases or less, more preferably 35 bases or less are mentioned.
  • the DNA sequence when used as a probe, it only needs to be capable of specific hybridization, and has at least a part or all of the DNA sequence (or its complementary strand) consisting of the base sequence represented by SEQ ID NOs: 1 to 213, for example, A chain length of 10 bases or more, preferably 15 bases or more and, for example, 100 bases or less, preferably 50 bases or less, more preferably 25 bases or less is used.
  • the “oligonucleotide” may be DNA or RNA, and may be synthesized or natural.
  • the probe used for hybridization is usually labeled.
  • the probe DNA is first labeled with a radioisotope, a fluorescent substance, etc., and then the obtained labeled DNA is transferred to a nylon membrane or the like according to a conventional method. Hybridize with RNA. Thereafter, a signal derived from the label can be detected and measured using the formed duplex of the labeled DNA and RNA.
  • cDNA is prepared from RNA derived from a biological sample according to a conventional method so that the target expression product of the present invention (in this case, transcription product) can be amplified.
  • a pair of prepared primers (a normal strand that binds to the cDNA ( ⁇ strand) and a reverse strand that binds to the + strand) are hybridized therewith.
  • PCR is performed according to a conventional method, and the obtained amplified double-stranded DNA is detected.
  • detection of the amplified double-stranded DNA use a method of detecting the labeled double-stranded DNA produced by performing the above PCR using a primer previously labeled with RI, a fluorescent substance, etc. Can do.
  • nucleic acid derived from the expression product of the present invention (in this case, a transcription product) is immobilized on a support.
  • a nucleic acid derived from the expression product of the present invention (in this case, a transcription product) is immobilized on a support.
  • labeled cDNA or cRNA prepared from mRNA is bound on the microarray, and the label on the microarray is detected, whereby the mRNA expression level can be measured.
  • the nucleic acid immobilized on the array may be any nucleic acid that hybridizes specifically (ie, substantially only to the target nucleic acid) under stringent conditions.
  • the expression product of the present invention transcription
  • the product may be a nucleic acid having the entire sequence or a partial sequence.
  • the “partial sequence” includes a nucleic acid consisting of at least 15 to 25 bases.
  • stringent conditions can usually include washing conditions of about “1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, 37 ° C.”, and more stringent hybridization conditions include “0.5 ⁇ SSC, 0.1%.
  • a more stringent hybridization condition a condition of “0.1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, 65 ° C.” can be mentioned.
  • Hybridization conditions are described in J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Thrd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001) and the like.
  • Examples of the method for determining the base sequence include the CAGE method, the TSS-seq method, the RNA-seq method, the DGE method, and the SAGE method, and the CAGE method is preferable.
  • the expression level is measured using the CAGE method, it can be carried out in accordance with the method described in Examples below.
  • a protein translation product encoded by DNA containing the transcription start site in SEQ ID NOs: 1 to 213, a molecule that interacts with the protein, a molecule that interacts with RNA, or a molecule that interacts with DNA Protein chip analysis
  • immunoassay eg, immunohistochemical analysis (immunohistochemical staining), ELISA, etc.
  • 1-hybrid method PNAS 100, 12271-12276 (2003)
  • 2-hybrid method Biol Reprod. 58, 302-311 (1998)
  • an antibody against the expression product of the present invention in this case, a translation product
  • a biological sample an antibody against the expression product of the present invention
  • the polypeptide in the sample bound to the antibody is detected, and the level is detected.
  • This is done by measuring.
  • an antibody that binds to a primary antibody labeled with a radioisotope, a fluorescent substance, an enzyme, or the like as a secondary antibody is used. Labeling is performed, and signals derived from these labeling substances are measured with a radiation measuring instrument, a fluorescence detector or the like.
  • the antibody against the translation product may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. These antibodies can be produced according to a known method. Specifically, the polyclonal antibody is used to immunize non-human animals such as rabbits by using a protein expressed and purified in E. coli or the like according to a conventional method, or by synthesizing a partial polypeptide of the protein according to a conventional method, It can be obtained from the serum of the immunized animal according to a conventional method.
  • a monoclonal antibody is obtained by immunizing a non-human animal such as a mouse with a protein expressed and purified in Escherichia coli according to a conventional method or a partial polypeptide of the protein, and fusing the obtained spleen cells with myeloma cells. It can be obtained from the prepared hybridoma cells.
  • a biological sample isolated from a patient is fixed in formalin by a conventional method, embedded in paraffin, sliced into tissue pieces, and pasted on a slide glass. It is preferably used as a section sample.
  • an enzyme-labeled antibody such as alkaline phosphatase or peroxidase can be used, but it is preferable to perform highly sensitive detection using the ABC method of Vector or the EnVision detection system of DAKO.
  • the expression level of the expression product of the present invention in a biological sample collected from a cancer lesion of a lung cancer patient is measured, and based on the expression level, the lesion is a squamous cell carcinoma or an adenocarcinoma. It is identified whether there is.
  • the expression level of the detected expression product of the present invention is evaluated by comparing it with a control level.
  • the “control level” means, for example, the expression level of the expression product in a diseased tissue isolated from an adenocarcinoma patient or a normal tissue isolated from a lung cancer patient, or the expression in a group of healthy people who do not develop lung cancer. The expression level of the product.
  • the expression level of the expression product in the lesion of the target patient is close to the expression level in a diseased tissue, normal tissue or tissue derived from a healthy person isolated from an adenocarcinoma patient, or belongs to the range of the expression level, or If the expression level is significantly higher (or lower) than the expression level, it can be evaluated that the lung cancer lesion of the patient is unlikely to be squamous cell carcinoma.
  • the evaluation of the lesion of lung cancer in the present invention can also be performed by increasing / decreasing the expression level of the expression product of the present invention.
  • a control level a standard value (threshold level) is set based on the expression level of the expression product derived from a normal tissue, a diseased tissue isolated from an adenocarcinoma patient, or a healthy human tissue, for example.
  • the expression level of the expression product in the biological sample is compared with a standard value (for example, a range of ⁇ 2SD is set as an allowable range). For example, when the expression level of the expression product in a patient-derived biological sample is higher or lower than a threshold level, it can be evaluated that the patient's lesion is unlikely to be squamous cell carcinoma.
  • the tissue type of lung cancer can be easily evaluated even with a micro sample such as a biopsy sample.
  • a molecular-targeted therapeutic agent that has been shown to have an added therapeutic effect when administered with a low-toxic anticancer drug (pemetrexed) or in combination with an anticancer drug Administration of (bevacizumab) or the like can be performed as a first line treatment.
  • pemetrexed low-toxic anticancer drug
  • bevacizumab anticancer drug Administration of
  • the test kit for evaluating a lesion of the lung cancer of the present invention contains a test reagent for measuring the expression level of the expression product of the present invention in a biological sample separated from a patient.
  • a test reagent for nucleic acid amplification or hybridization containing an oligonucleotide that specifically binds (hybridizes) to the expression product (transcription product) or the like of the present invention, or the expression product (translation product) of the present invention.
  • a reagent for immunological measurement including an antibody that recognizes Oligonucleotides, antibodies and the like included in the kit can be obtained by known methods as described above.
  • the test kit can contain a labeling reagent, a buffer solution, a chromogenic substrate, a secondary antibody, a blocking agent, instruments and controls necessary for the test, and the like.
  • Example 1 Extraction and verification of transcription initiation region enabling differentiation between adenocarcinoma and squamous cell carcinoma (1) Obtaining a specimen sample A specimen (sample) is obtained from a lung cancer lesion by surgical resection or needle biopsy. did. The samples used were 15 specimens (including 3 specimens of adenocarcinoma (adenocarcinoma not containing BAC component) and 12 specimens of poorly differentiated squamous cell carcinoma) as samples for extracting the transcription start region, and 20 specimens (of which: Adenocarcinoma (adenocarcinoma not containing BAC component) is 10 specimens, and poorly differentiated squamous cell carcinoma is 10 specimens).
  • tissue pieces were appropriately frozen and stored at -80 ° C.
  • the preserved tissue piece is placed in a 2 mL microtube so that the tissue piece is 50 mg or less, QIAzol manufactured by Qiagen is added, and one zirconia bead is sealed and crushed by osmosis treatment using TissueLyser manufactured by Qiagen. did.
  • RNA was prepared for RNA according to the attached protocol using miRNeasy mini kit manufactured by Qiagen.
  • the prepared RNA was measured for ultraviolet absorption (230, 260, 280 nm) with a spectrophotometer to calculate 260/230, 260/280 ratios, and the quality of the RNA was tested.
  • electrophoresis was performed using BioAnalyzer RNA nano chip manufactured by Agilent, and the RIN value indicating the degree of RNA degradation was calculated to test the degree of RNA degradation.
  • CAGE library preparation 5 ⁇ g of purified RNA was prepared, and unamplified untagged CAGE method (“Cell Engineering, separate volume, Advanced Method for Next-Generation Sequencer Purpose”, Juno Kanno, Satoshi Suzuki, Gakken Medical Shujunsha, 2012 (Published on September 19), CAGE library was prepared by Chapter 3 3, “Exhaustive promoter analysis (non-amplified CAGE method using Illumina sequencer)”).
  • CAGE library was prepared by Chapter 3 3, “Exhaustive promoter analysis (non-amplified CAGE method using Illumina sequencer)”.
  • the purified RNA was subjected to reverse transcription reaction and purified, and then aldehyde was formed by participation of a ribose diol with sodium periodate, and biotin hydrazide was added to add biotin to the aldehyde group.
  • RNA / cDNA double strand biotinylated with avidin magnetic beads was bound to the bead surface, and the cDNA was released and recovered by RNase H digestion and heat treatment.
  • sequencing was performed using HiSeq 2500 manufactured by Illumina.
  • the standard conditions of AMPure XP (manufactured by Beckman Coulter) used for purification, buffer replacement, etc. in this step are conditions for recovering nucleic acids having a length of 100 bases or more in the case of double strands.
  • the CAGE library produced by this process using this is composed of double-stranded DNA having a chain length of 100 bases or more.
  • Example 2 Differentiation of Adenocarcinoma and Squamous Cell Carcinoma Using Protein Expression as an Index (1) Specimen Forty-five surgical specimens were used for lung adenocarcinoma, including bronchioloalveolar carcinoma (BAC)> There were 7 cases, 22 cases of lung adenocarcinoma ⁇ Adenocarcinoma with BAC> with alveolar epithelial replacement component, and 16 cases of lung adenocarcinoma ⁇ Adenocarcinoma without BAC> without alveolar epithelial replacement component.
  • BAC bronchioloalveolar carcinoma
  • Antibody 1 Anti-TTF-1 antibody (DAKO) 2) Anti-Napsin A antibody (Leica Biosystem, “NCL-L-Napsin A”) 3) Anti-p40 antibody (Millipore Co., “PC373”) 4) Anti-CK5 antibody (Leica Biosystem, “NCL-CK5”) 5) Anti-CK6 antibody (Gene Tex, “GTX73556”) 6) Anti-Desmoglein 3 antibody (BIO CARE Medical, “ACR419A, C”) 7) Anti-ST6GALNAC1 antibody (SIGMA Life science, “HPA014975” 8) Anti-SPAT2 antibody (SIGMA Life science, “HPA038643”
  • ST6GALNAC1 is high in both sensitivity and specificity, and that the sensitivity of Napsin A and TTF-1 is low, but it may be positive in the specimen that becomes ST6GALNAC1 ( ⁇ ).
  • CK5 / DSG3 / p40 has high sensitivity and specificity, but the behavior is similar, and therefore a tendency to become negative in some squamous cell carcinomas was recognized.
  • the sensitivity of SPATS2 was not so high, it was found that even squamous cell carcinoma in which CK5 / DSG3 / p40 is negative may be positive.
  • CK6 may also be positive in squamous cell carcinoma in which CK5 / DSG3 / p40 is negative, but tends to be positive in adenocarcinoma and tends to have low specificity. From these results, it was suggested that more accurate discrimination could be performed by using a plurality of markers in combination with complementary information rather than a single marker.
  • TTF-1 and p40 are a combination of markers often used in pathological diagnosis.
  • the combination of TTF-1 and p40 is the 13th position.
  • the combination using either ST6GALNAC1 or SPATS2 occupies the 1st to 9th positions, and it is shown that these two proteins are essential for high-precision discrimination that cannot be realized by the combination of conventional markers. It was.
  • TTF-1 and ST6GALNAC1 were able to correctly distinguish all 45 cases of adenocarcinoma and 28 of 29 cases of squamous cell carcinoma.
  • ST6GALNAC1 / TTF-1 / CK5 2) ST6GALNAC1 / TTF-1 / DSG3 3) ST6GALNAC1 / TTF-1 / p40 4) ST6GALNAC1 / SPATS2 / DSG3 5) ST6GALNAC1 / SPATS2 / CK5 6) ST6GALNAC1 / SPATS2 / p40 This result suggests that ST6GALNAC1 is useful for complete discrimination.
  • the pathohistological type of lung cancer of a patient is distinguished from an adenocarcinomas that are difficult to distinguish pathologically and histologically, particularly squamous cell carcinoma or adenocarcinoma, and low Differentiating squamous cell carcinoma or adenocarcinoma, or poorly differentiated squamous cell carcinoma or adenocarcinoma that does not contain BAC components, such as a trained pathologist or clinical laboratory technician Even if it is not based on the subjectivity of an expert, it can be performed objectively and quickly. In other words, it can be suitably used for tests (POCT: Point of ⁇ Care Testing) performed by a medical worker from the patient's sample collection to analysis.
  • POCT Point of ⁇ Care Testing

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Abstract

　肺癌の病変部の組織型を高い精度で、客観的かつ迅速に鑑別する手法の提供。　肺癌患者の病変部から採取された生体試料について、転写開始領域を含むＤＮＡの１種又は２種以上の発現産物の発現レベルを測定する工程を含む、当該病変部が扁平上皮癌であるか腺癌であるかを鑑別評価する方法であって、該ＤＮＡが配列番号１～２１３で示される塩基配列における、転写開始領域の任意の位置の塩基とその下流に連続する少なくとも１塩基以上からなるＤＮＡであり、　該転写開始領域が、配列番号１～２１３で示される塩基配列の１番目の塩基と３'末端から１０１番目の塩基によって両端が規定される領域である、評価方法。

Description

肺扁平上皮癌と肺腺癌の鑑別評価方法
（関連出願及び参照による援用）
　本出願は、２０１４年３月１２日に出願した日本国特願２０１４－０４９１８６及び２０１４年９月９日に出願した日本国特願２０１４－１８３４１８の優先権を主張するものであり、その全内容は本明細書において参照として援用される。
　また、本明細書に引用される全ての文献は、あらゆる目的から全体として参照により援用される。いずれの文献の引用も、それが本発明に関する先行技術であることを認めるものと解釈されてはならない。
　本発明は、肺癌の組織型を生検検体等の微小組織検体においても、容易に鑑別可能にする新規マーカーに関し、より具体的には、扁平上皮癌と腺癌を分子レベルで鑑別評価する手法に関する。
　日本で年間7万人の死亡原因となっている肺癌は、小細胞癌と非小細胞肺癌に大別され、さらに非小細胞肺癌は、腺癌、扁平上皮癌、大細胞癌とそれ以外の稀な組織型に分類される。
　近年、扁平上皮癌とそれ以外の非小細胞肺癌（非扁平上皮癌）で治療効果や副作用が大きく異なる抗癌剤（ペメトレキセド）や分子標的治療薬（ベバシズマブ）が登場し、治療方針決定にこれらを正確に鑑別することが必須になっている。ところが両者の鑑別は、生検検体などの微小検体では、病理組織学的に鑑別困難な場合がある。現在、病理組織診断の際には、細胞や組織形態のみではなく、扁平上皮癌や腺癌に特異的なマーカーを用いた免疫組織染色を用いて総合的に診断を行っているが、それでも微小検体では鑑別が難しい症例は多数存在し、特に分化度の低い癌の場合には鑑別が難しい。
　肺扁平上皮癌の組織学的な診断根拠は、癌組織内に細胞間橋もしくは角化が存在することである。肺扁平上皮癌の分化度は細胞間橋もしくは角化の多寡によって決定される。分化度の低い扁平上皮癌（低分化扁平上皮癌）は、細胞間橋と角化が癌組織全体のわずかな領域に認められる程度にとどまる。一方、肺腺癌は肺胞上皮置換型（Bronchioloalveolar　type:ＢＡＣ）の成分を含むものと含まないものに大別される。ＢＡＣ成分を含む腺癌は形態学的にも診断が容易であるが、含まない場合には、低分化扁平上皮癌との鑑別が困難な場合がある。これまで、扁平上皮癌と腺癌の鑑別にはＰ４０、ＣＫ５、ＣＫ６、ＤＳＧ３、ＴＴＦ－１、Ｎａｐｓｉｎ　Ａが免疫組織染色のマーカーとして用いられてきたが、精度等必ずしも十分ではなく、より高精度のマーカーが求められているのが現状である。
　また、鑑別診断は病理医の主観に大きく依存することもあり、客観的かつ普遍的な判定方法が必要とされている。
　一方、近年、遺伝子の発現状態の比較によって、ある状態にある細胞で発現している遺伝子を網羅的に解析し、その種類や発現レベルを細胞間で比較する、遺伝子の発現解析(expression analysis)のための手法が開発されている。例えば、転写開始部位の遺伝子の発現状態をシーケンス情報として網羅的に解析するＲＮＡ－ｓｅｑ（非特許文献１）やＣＡＧＥ（Cap Analysis Gene Expression：非特許文献２）等が知られている。このうち、ＣＡＧＥ法は、ｍＲＮＡ等の長いキャップ付ＲＮＡを選択し、その５’末端を無作為かつ大量に配列決定することで転写開始点の活性を網羅的に定量できるという特徴を有する。
　しかしながら、ヒトゲノムにおける転写開始領域の発現レベルと特定の疾患との関係についてはこれまでに全く報告されていない。
Nature Reviews Genetics 10 (1): 57-63 Genome Res. 2011 Jul;21(7):1150-9
　本発明は、肺扁平上皮癌と肺腺癌を高い精度で、客観的かつ迅速に鑑別評価する手法を提供することに関する。
　本発明者らは、肺扁平上皮癌と肺腺癌の患者の病変部からＲＮＡを抽出し、ＣＡＧＥ解析法を用いて転写開始領域（Transcript Start Site；ＴＳＳ）付近の発現状態をシーケンス情報として網羅的に解析した結果、特定の転写開始領域を含むＤＮＡの発現レベルが両者の間で有意に異なり、これを指標として、当該扁平上皮癌と腺癌を判別できることを見出した。
　すなわち、本発明は、以下の１～４）に係るものである。
　１）肺癌患者の病変部から採取された生体試料について、転写開始領域を含むＤＮＡの１種又は２種以上の発現産物の発現レベルを測定する工程を含む、当該病変が扁平上皮癌であるか腺癌であるかを鑑別評価する方法であって、該ＤＮＡが配列番号１～２１３で示される塩基配列における、転写開始領域の任意の位置の塩基とその下流に連続する１塩基以上からなるＤＮＡであり、
　該転写開始領域が、配列番号１～２１３で示される塩基配列の１番目の塩基と３’末端から１０１番目の塩基によって両端が規定される領域である、評価方法。
　２）前記ＤＮＡの転写産物と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、又は前記ＤＮＡの翻訳産物を認識する抗体を含有する１）の方法に用いる、扁平上皮癌であるか腺癌であるかを鑑別評価するための検査用キット。
　３）転写開始領域を含むＤＮＡの１種又は２種以上の発現産物の、肺癌患者の病変が扁平上皮癌であるか腺癌であるかを鑑別評価するためのマーカーとしての使用であって、該ＤＮＡが配列番号１～２１３で示される塩基配列における、転写開始領域の任意の位置の塩基とその下流に連続する１塩基以上からなるＤＮＡであり、
　該転写開始領域が、配列番号１～２１３で示される塩基配列の１番目の塩基と３’末端から１０１番目の塩基によって両端が規定される領域である、前記発現産物の使用。
　４）肺癌患者の病変部から採取された生体試料について、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ１及び／又はＳＰＡＴＳ２のタンパク質の発現レベルを測定する工程を含む、当該病変が扁平上皮癌であるか腺癌であるかを鑑別評価する方法。
　本発明によれば、肺癌患者の癌病変が、扁平上皮癌であるか腺癌であるかを鑑別すること、更には低分化扁平上皮癌であるか腺癌であるか、更には低分化扁平上皮癌であるかＢＡＣ成分を含まない腺癌であるかを鑑別することができ、これによって迅速な診断が可能となる。また、本発明を用いることで、扁平上皮癌と腺癌との鑑別をトレーニングを積んだ病理医や臨床検査技師のような専門家の主観によらなくても、同程度あるいはそれ以上の鑑別を客観的に行うことが可能になり、患者検体の採取から解析まで患者の傍らで医療従事者が行う検査（POCT：Point of Care Testing）にも好適に利用できる。
　本発明において、「扁平上皮癌（肺扁平上皮癌）」とは、気管支の扁平上皮（扁平上皮化生した細胞）から発生する癌を意味する。
　また、腺癌（肺腺癌）とは、肺の腺細胞（気管支の線毛円柱上皮、肺胞上皮、気管支の外分泌腺など）から発生する癌を意味し、肺胞上皮置換型（Bronchioloalveolar type:BAC）の成分を含むものと含まないものに大別される。
　本発明において、評価とは、肺癌患者由来の癌病変が扁平上皮癌であるか腺癌であるかを鑑別評価又は測定することを意味する。
　本発明において用いられる生体試料としては、評価対象となる肺癌患者の病変部から採取された生検検体、切除検体などが挙げられる。当該生体試料は、核酸レベルでの測定に供する場合はＲＮＡ抽出液が調製され、タンパク質レベルでの測定に供する場合はタンパク質抽出液が調製される。
　生体試料からＲＮＡを抽出する方法は、公知の任意の方法を用いることができる。具体的には、ライフテクノロジーズ社製Ａｍｂｉｏｎ　ＲｉｂｏＰｕｒｅキット、キアゲン社製ｍｉＲＮｅａｓｙ、同社製ＲＮｅａｓｙが例示できるが、これらのうちキアゲン社製ｍｉＲＮｅａｓｙキットが好適に用いられる。
　本明細書において、「核酸」又は「ポリヌクレオチド」と云う用語は、ＤＮＡ又はＲＮＡを意味する。また、「ＤＮＡ」とは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖及びアンチセンス鎖という各１本鎖ＤＮＡを包含する。従って、ＤＮＡには、２本鎖のゲノムＤＮＡ、１本鎖のｃＤＮＡや該ＤＮＡと相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ等が包含される。また、「ＲＮＡ」には、ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ及び合成のＲＮＡのいずれもが含まれる。
　本発明において、配列番号１～２１３で示される塩基配列からなるＤＮＡ（転写開始領域とその下流に連続する１００塩基からなるヒトゲノムＤＮＡ）の転写産物は、実施例に示すとおり、扁平上皮癌（低分化肺扁平上皮癌）である検体と腺癌（ＢＡＣ成分を含まない肺腺癌）である検体について、ＣＡＧＥ（Cap Analysis Gene Expression）解析法を用いて、ゲノム上の転写開始領域を含む下流１００ベース以上のＤＮＡの発現状態を網羅的に解析した結果、扁平上皮癌と腺癌では、その発現レベル（転写活性）に有意な差異が認められたものである。具体的には、ＲＮＡの転写活性について、「扁平上皮癌」から得られた臨床検体由来プロファイル群、「腺癌」から得られた臨床検体由来プロファイル群の間における差分解析をＲ／Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ　ｅｄｇｅＲパッケージ（Bioinformatics. 2010 Jan 1;26(1):139-40）を用い、閾値としてＦＤＲ（false discovery rate）１％を設定し、抽出されたものである。
　したがって、配列番号１～２１３で示される塩基配列における、転写開始領域の任意の位置（転写開始点）の塩基とその下流に連続する１塩基以上からなるＤＮＡ（以下、「配列番号１～２１３における転写開始点を含むＤＮＡ」と称する）の（又はそれによってコードされる）発現産物（「本発明の発現産物」と云う）は、肺扁平上皮癌と肺腺癌を鑑別評価するためのバイオマーカー、具体的には、肺癌についてそれが扁平上皮癌であるか腺癌であるか、更には低分化扁平上皮癌であるか腺癌であるか、更には低分化扁平上皮癌であるかＢＡＣ成分を含まない腺癌であるかを鑑別評価するためのバイオマーカーとなり得る。尚、配列番号１～５における転写開始点を含むＤＮＡの発現産物は、肺腺癌で発現レベルが上がるマーカーであり、配列番号６～２１３における転写開始点を含むＤＮＡの発現産物は肺腺癌で発現レベルが下がるマーカーである。
　本発明において、「転写開始領域」は、転写開始点を含む領域をいう。特定のプロモーターからの転写開始点は単一の塩基に限定されず、ゲノム上のプロモーターの下流の複数の位置に存在する塩基であり得る。これらの複数の転写開始点を含む領域を本明細書において転写開始領域と称する。より詳細には、転写開始領域は、複数の転写開始点のうち最も５’側に位置する転写開始点と最も３’側に位置する転写開始点との間の領域である。配列番号１～２１３で示される塩基配列の各々において転写開始領域は１位（５’末端）の塩基と３’末端から１０１番目の塩基とによって両端が規定される領域に相当する５’末端を形成する塩基領域である。換言すると、配列番号１～２１３で示される塩基配列の各々には、転写開始領域と、転写開始領域中の最も３’側に位置する転写開始点に続く１００個の塩基が示されている。本明細書においては、斯かる転写開始領域を「配列番号１～２１３において示される転写開始領域」とも称する。
　配列番号１～２１３において示される転写開始領域のゲノム上の位置、及びそれに関連する遺伝子情報等は後記表１－１～表１－９に示すとおりである。
　本発明において、発現産物の発現レベルが測定されるＤＮＡは、配列番号１～２１３で示される塩基配列における、上記転写開始領域中の任意の位置（転写開始点）の塩基とその下流に続く１塩基以上の塩基配列からなるＤＮＡである。
　ここで、下流に続く塩基配列の塩基数は、発現産物を特定できる数であればよい。当該塩基数としては、例えば１塩基以上、５塩基以上、１０塩基以上、１５塩基以上、２０塩基以上、２５塩基以上、３０塩基以上、４０塩基以上、５０塩基以上が挙げられる。また、当該塩基数としては、例えば１０塩基以下、１５塩基以下、２０塩基以下、２５塩基以下、３０塩基以下、４０塩基以下、５０塩基以下、１００塩基以下が挙げられる。
　下流側の塩基数としては、ＣＡＧＥ法による測定の場合には特に必要ないが、ハイブリダイゼーションやＰＣＲによる測定の際にはその精度を担保するために下流１００塩基程度までの何れかの部分を対象とすることができ、転写開始領域とその下流１００塩基からなるＤＮＡのうち、少なくとも２０塩基以上の長さのものであればゲノム全体を対象にした実験系であっても特定できる確率が高い。
　また、当該ＤＮＡには、その発現産物が肺扁平上皮癌と肺腺癌を判別するためのバイオマーカーとなり得る限り、当該ＤＮＡの塩基配列と実質的に同一の塩基配列を有するＤＮＡも包含される。ここで、実質的に同一の塩基配列とは、例えば、相同性計算アルゴリズムNCBI BLASTを用い、期待値＝１０；ギャップを許す；フィルタリング＝ＯＮ；マッチスコア＝１；ミスマッチスコア＝－３の条件にて検索をした場合、配列番号１～２１３に示される塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上の同一性があることを意味する。
　斯かる本発明の発現産物は、１種又は２種以上を組み合わせてその発現レベルを把握することにより、肺扁平上皮癌と肺腺癌の判別が可能であるが、このうち、配列番号２、配列番号３、配列番号５及び配列番号７における転写開始点を含むＤＮＡの発現産物は、表２に示す閾値を設定した場合に、特異度１００％・感度１００％で分類できるものである。すなわち、これらは、其々一つの発現レベルのみを以って確実な判別が可能なものである。
　また、複数の発現産物を組み合わせてその発現レベルを確認する場合、その数、組み合わせの内容は適宜選択できる。配列番号１～２１３における転写開始点を含むＤＮＡのうち、任意の複数のＤＮＡの発現産物を組み合わせてもよく、更には本発明の評価に寄与し得る範囲で、配列番号１～２１３における転写開始点を含む１種または２種以上のＤＮＡに、それ以外の任意の塩基配列からなるＤＮＡの発現産物を組み合わせてもよい。
　本発明の発現産物としては、当該ＤＮＡから発現される転写産物及び翻訳産物が挙げられる。転写産物としては、具体的には、当該ＤＮＡから転写されて生じるＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡが挙げられる。また、翻訳産物としては、具体的には、当該ＲＮＡによってコードされるタンパク質が挙げられる。例えば、一つの発現レベルのみを以って確実な判別が可能なものとして挙げた配列番号２、配列番号３、配列番号５及び配列番号７における転写開始点を含むＤＮＡの発現産物のうち、配列番号３における転写開始点を含むＤＮＡから発現されるタンパク質は、「ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ１」（alpha-N-acetyl-neuraminyl-2,3-beta-galactosyl-1,3)-N-acetylgalactosaminide alpha-2,6-sialyltransferase 1；UniProtKB/Swiss-Prot: SIA7A_HUMAN, Q9NSC7）、配列番号７における転写開始点を含むＤＮＡから発現されるタンパク質は、「ＳＰＡＴＳ２」（spermatogenesis associated, serine-rich 2；UniProtKB/Swiss-Prot: SPAS2_HUMAN, Q86XZ4）として同定されている。
　後記表１－１に示すとおり、配列番号３で示される塩基配列からなるＤＮＡの転写産物は腺癌で特定的に発現されるものであり、配列番号７で示される塩基配列からなるＤＮＡの転写産物は扁平上皮癌で特定的に発現されるものであることから、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ１は腺癌マーカー、ＳＰＡＴＳ２は扁平上皮癌マーカーとなり、両者を組み合わせた場合には、腺癌と扁平上皮癌の鑑別に極めて有用である。また、これらと従来から扁平上皮癌や腺癌の鑑別に用いられている、Ｐ４０、ＣＫ５、ＣＫ６、ＤＳＧ３（Desmoglein-3）、ＴＴＦ－１（Thyroid transcription factor-1）、Ｎａｐｓｉｎ　Ａ等のタンパク質マーカーを適宜組み合わせることにより、更にその鑑別精度の向上を図ることもできる。例えば、好適な組み合わせとして、ＴＴＦ－１／ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ１、ＣＫ５／ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ１、ＤＳＧ３／ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ１、ＣＫ５／ＳＰＡＴＳ２、ＤＳＧ３／ＳＰＡＴＳ２、ｐ４０／ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ１、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ１／ＳＰＡＴＳ２、Ｎａｐｓｉｎ Ａ／ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ１、ｐ４０／ＳＰＡＴＳ２の２つのマーカーの組み合わせ、より好適にはＴＴＦ－１／ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ１の２つのマーカーの組み合わせ、更に好適にはＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ１／ＴＴＦ－１／ＣＫ５、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ１／ＴＴＦ－１／ＤＳＧ３、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ１／ＴＴＦ－１／ｐ４０、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ１／ＳＰＡＴＳ２／ＤＳＧ３、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ１／ＳＰＡＴＳ２／ＣＫ５、及びＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ１／ＳＰＡＴＳ２／ｐ４０の３つのマーカーの組み合わせが挙げられる。
　発現産物の測定又は検出の対象には、そのＲＮＡから人工的に合成されたｃＤＮＡ、そのＲＮＡをエンコードするＤＮＡ、そのＲＮＡからコードされるタンパク質、該タンパク質と相互作用をする分子、そのＲＮＡと相互作用する分子、またはそのＤＮＡと相互作用する分子等も包含される。ここで、ＲＮＡ、ＤＮＡ又はタンパク質と相互作用する分子としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、多糖、オリゴ糖、単糖、脂質、脂肪酸、及びこれらのリン酸化物、アルキル化物、糖付加物等、及び上記いずれかの複合体が挙げられる。
　また、発現レベルとは、当該発現産物の発現量や活性を包括的に意味する。
　発現レベルを測定する方法は、ＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはＤＮＡを対象とする場合、これらにハイブリダイズするＤＮＡをプライマーとしたＰＣＲ法、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法、ＳｍａｒｔＡｍｐ法、ＬＡＭＰ法等に代表される核酸増幅法、これらにハイブリダイズする核酸をプローブとしたハイブリダイゼーション法（ＤＮＡチップ、ＤＮＡマイクロアレイ、ドットブロットハイブリダイゼーション、スロットブロットハイブリダイゼーション、ノーザンブロットハイブリダイゼーション等）、塩基配列を決定する方法、またはこれらを組み合わせた方法から選ぶことができる。
　ここで、測定に用いられるプローブ又はプライマー、すなわち、本発明の発現産物（転写産物）又はそれに由来する核酸を特異的に認識し増幅するためのプライマー、又は該ＲＮＡ又はそれに由来する核酸を特異的に検出するためのプローブがこれに該当するが、これらは、配列番号１～２１３で示される塩基配列に基づいて設計することができる。ここで「特異的に認識する」とは、例えばノーザンブロット法において、実質的に本発明の発現産物（転写産物）又はそれに由来する核酸のみを検出できること、また例えばＲＴ－ＰＣＲ法において、実質的に当該核酸のみが生成される如く、当該検出物又は生成物が当該転写産物又はそれに由来する核酸であると判断できることを意味する。
　具体的には、配列番号１～２１３で示される塩基配列からなるＤＮＡ又はその相補鎖に相補的な一定数のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを利用することができる。ここで「相補鎖」とは、Ａ：Ｔ（ＲＮＡの場合はＵ）、Ｇ：Ｃの塩基対からなる２本鎖ＤＮＡの一方の鎖に対する他方の鎖を指す。また、「相補的」とは、当該一定数の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の塩基配列上の同一性を有すればよい。塩基配列の同一性は、前記ＢＬＡＳＴ等のアルゴリズムにより決定することができる。
　斯かるオリゴヌクレオチドは、プライマーとして用いる場合には、特異的なアニーリング及び鎖伸長ができればよく、通常、例えば１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上、より好ましくは２０塩基以上、かつ例えば１００塩基以下、好ましくは５０塩基以下、より好ましくは３５塩基以下の鎖長を有するものが挙げられる。また、プローブとして用いる場合には、特異的なハイブリダイゼーションができればよく、配列番号１～２１３で示される塩基配列からなるＤＮＡ（又はその相補鎖）の少なくとも一部若しくは全部の配列を有し、例えば１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上、かつ例えば１００塩基以下、好ましくは５０塩基以下、より好ましくは２５塩基以下の鎖長のものが用いられる。
　なお、ここで、「オリゴヌクレオチド」は、ＤＮＡあるいはＲＮＡであることができ、合成されたものでも天然のものでもよい。また、ハイブリダイゼーションに用いるプローブは、通常標識したものが用いられる。
　例えば、ノーザンブロットハイブリダイゼーション法を利用する場合は、まずプローブＤＮＡを放射性同位元素、蛍光物質等で標識し、次いで、得られた標識ＤＮＡを、常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーした生体試料由来のＲＮＡとハイブリダイズさせる。その後、形成された標識ＤＮＡとＲＮＡとの二重鎖を用いて、標識物に由来するシグナルを検出、測定することができる。
　また、ＲＴ－ＰＣＲ法を利用する場合は、まず生体試料由来のＲＮＡから常法に従ってｃＤＮＡを調製し、これを鋳型として標的の本発明の発現産物（この場合、転写産物）が増幅できるように調製した一対のプライマー（上記ｃＤＮＡ（－鎖）に結合する正鎖、＋鎖に結合する逆鎖）をこれとハイブリダイズさせる。その後、常法に従ってＰＣＲ法を行い、得られた増幅二本鎖ＤＮＡを検出する。増幅された二本鎖ＤＮＡの検出には、予めＲＩ、蛍光物質等で標識しておいたプライマーを用いて上記ＰＣＲを行うことによって産生される標識二本鎖ＤＮＡを検出する方法等を用いることができる。
　また、ＤＮＡマイクロアレイを用いて検体中のｍＲＮＡの発現量を測定する場合、支持体に本発明の発現産物（この場合、転写産物）由来の核酸（ｃＤＮＡ又はＤＮＡ）の少なくとも１種を固定化したアレイを用い、ｍＲＮＡから調製した標識化ｃＤＮＡまたはｃＲＮＡをマイクロアレイ上に結合させ、マイクロアレイ上の標識を検出することによって、ｍＲＮＡ発現量を測定することができる。
　前記アレイに固定化される核酸としては、ストリンジェントな条件下に特異的（すなわち、実質的に目的の核酸のみに）にハイブリダイズする核酸であればよく、例えば、本発明の発現産物（転写産物）の全配列を有する核酸であってもよく、部分配列からなる核酸であってもよい。ここで、「部分配列」とは、少なくとも１５～２５塩基からなる核酸が挙げられる。
　ここでストリンジェントな条件は、通常「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」程度の洗浄条件を挙げることができ、より厳しいハイブリダイズ条件としては「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」程度、さらに厳しいハイブリダイズ条件としては「０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」程度の条件を挙げることができる。ハイブリダイズ条件は、J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Thrd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)等に記載されている。
　また、塩基配列を決定する方法としては、ＣＡＧＥ法、ＴＳＳ－ｓｅｑ法、ＲＮＡ－ｓｅｑ法、ＤＧＥ法、ＳＡＧＥ法等が挙げられるが、ＣＡＧＥ法が好適である。
　ＣＡＧＥ法を用いて、発現レベルを測定する場合、後記実施例に記載した方法に準じて実施することができる。
　また、配列番号１～２１３における転写開始点を含むＤＮＡからコードされるタンパク質（翻訳産物）、当該タンパク質と相互作用する分子、ＲＮＡと相互作用する分子、またはＤＮＡと相互作用する分子を測定する場合は、プロテインチップ解析、免疫測定法（例えば、免疫組織化学分析法（免疫組織染色法）、ＥＬＩＳＡ等）、１－ハイブリッド法（PNAS 100, 12271-12276(2003)）や２－ハイブリッド法（Biol. Reprod. 58, 302-311 (1998)）のような方法を用いることができ、対象に応じて適宜選択できる。
　例えば、測定対象としてタンパク質が用いられる場合は、本発明の発現産物（この場合、翻訳産物）に対する抗体を生体試料と接触させ、当該抗体に結合した試料中のポリペプチドを検出し、そのレベルを測定することによって実施される。例えば、ウェスタンブロット法によれば、一次抗体として上記の抗体を用いた後、二次抗体として放射性同位元素、蛍光物質又は酵素等で標識した一次抗体に結合する抗体を用いて、その一次抗体を標識し、これら標識物質由来のシグナルを放射線測定器、蛍光検出器等で測定することが行われる。
　尚、上記翻訳産物に対する抗体は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよい。これらの抗体は、公知の方法に従って製造することができる。具体的には、ポリクローナル抗体は、常法に従って大腸菌等で発現し精製したタンパク質を用いて、あるいは常法に従って当該タンパク質の部分ポリペプチドを合成して、家兎等の非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。
　一方、モノクローナル抗体は、常法に従って大腸菌等で発現し精製したタンパク質又は該タンパク質の部分ポリペプチドをマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞から得ることができる。
　また、免疫組織化学分析法を行う場合には、患者から分離した生体試料を常法によりホルマリン固定をした後、パラフィンに包埋して組織片に薄切し、スライドガラスに貼り付けたものを切片試料として使用するのが好ましい。二次抗体としては、アルカリホスファターゼやペルオキシダーゼ等の酵素標識抗体を用いることができるが、Ｖｅｃｔｏｒ社のＡＢＣ法やＤＡＫＯ社のＥｎＶｉｓｉｏｎ検出システム等を用いて高感度な検出を行うのが好ましい。
　斯くして、肺癌患者の癌病変部から採取された生体試料中の本発明の発現産物の発現レベルが測定され、当該発現レベルに基づいて、当該病変部が扁平上皮癌であるか腺癌であるかが鑑別される。具体的には、検出された本発明の発現産物の発現レベルを対照レベルと比較することによって評価される。
　ここで、「対照レベル」とは、例えば、腺癌患者から分離された病変組織若しくは肺癌患者から分離された正常組織における当該発現産物の発現レベル、又は肺癌を発症していない健常人群における当該発現産物の発現レベルが挙げられる。
　例えば、対象患者の病変部の当該発現産物の発現レベルが、腺癌患者から分離された病変組織、正常組織或いは健常人由来の組織における発現レベルに近い、当該発現レベルの範囲内に属する、或いは当該発現レベルより有意に高い（又は低い）場合には、当該患者の肺癌の病変は扁平上皮癌である可能性は低いと評価できる。
　また、本発明における肺癌の病変の評価は、本発明の発現産物の発現レベルの上昇／減少により行うこともできる。この場合は、対照レベルとして、例えば正常組織、腺癌患者から分離された病変組織或いは健常人の組織由来の当該発現産物の発現レベルに基いて、標準値（閾値レベル）を設定し、患者由来の生体試料における当該発現産物の発現レベルを標準値と比較する（例えば±２Ｓ．Ｄ．の範囲を許容範囲とする）ことにより行うことができる。例えば、患者由来の生体試料における当該発現産物の発現レベルが閾値レベルより高い又は低い場合に、当該患者の病変は扁平上皮癌である可能性は低いと評価できる。
　本発明の方法に従い、生検検体などの微小検体でも肺癌の組織型が容易に評価される。病変が非扁平上皮癌である可能性があると判断された場合には、毒性の低い抗癌剤（ペメトレキセド）の投与や、抗癌剤との併用で治療効果の上乗せが明らかになっている分子標的治療薬（ベバシズマブ）などの投与を第一選択の治療として行うことができる。扁平上皮癌と診断された場合には、ペメトレキセドやベバシズマブ以外の抗癌剤治療を行ったり、扁平上皮癌を対象にした抗体治療や分子標的治療の臨床試験の対象になる。
　本発明の肺癌の病変を評価するための検査用キットは、患者から分離した生体試料における本発明の発現産物の発現レベルを測定するための検査試薬を含有するものである。具体的には、本発明の発現産物（転写産物）等と特異的に結合（ハイブリダイズ）するオリゴヌクレオチドを含む、核酸増幅、ハイブリダイゼーションのための試薬、或いは、本発明の発現産物（翻訳産物）を認識する抗体を含む免疫学的測定のための試薬等が挙げられる。当該キットに包含されるオリゴヌクレオチド、抗体等は、上述したとおり公知の方法により得ることができる。
　また、当該検査用キットには、上記抗体や核酸の他、標識試薬、緩衝液、発色基質、二次抗体、ブロッキング剤や、試験に必要な器具やコントロール等を含むことができる。
実施例１　腺癌と扁平上皮癌の鑑別を可能にする転写開始領域の抽出と検証
（１）検体試料の入手
　検体（サンプル）は、肺癌病変部より、外科的切除や針生検法などによって入手した。使用したサンプルは、転写開始領域抽出用サンプルとして１５検体（うち、腺癌（ＢＡＣ成分を含まない腺癌）が３検体、低分化扁平上皮癌が１２検体）、検証用サンプルとして２０検体（うち、腺癌（ＢＡＣ成分を含まない腺癌）が１０検体、低分化扁平上皮癌が１０検体）である。
（２）試料の保存・調製
　摘出された組織片は、適宜冷凍処理されて－８０℃で保存した。保存組織片は、２ｍＬマイクロチューブに組織片を５０ｍｇ以下になるように入れてキアゲン社製ＱＩＡｚｏｌを添加して、ジルコニアビーズを１個入れて密閉し、キアゲン社製ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒを用いて浸透処理により破砕した。
（３）ＲＮＡの調製
　破砕・抽出処理を行った試料は、キアゲン社製ｍｉＲＮｅａｓｙ　ｍｉｎｉ　ｋｉｔにより、添付されたプロトコルに従ってＲＮＡ調製を行った。調製後のＲＮＡは、分光高度計による紫外吸収（２３０、２６０、２８０ｎｍ）を測定して、２６０／２３０、２６０／２８０比を算出し、そのＲＮＡの質を検定した。また、アジレント社製ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ　ＲＮＡ　ｎａｎｏ　ｃｈｉｐにより電気泳動を行い、ＲＮＡ分解度を示すＲＩＮ値を算出して、ＲＮＡの分解度合いを検定した。
（４）ＣＡＧＥライブラリー調製
　精製ＲＮＡを５μｇ用意し、非増幅非タグ化ＣＡＧＥ法（「細胞工学別冊　次世代シークエンサー目的別アドバンストメソッド」、菅野純夫、鈴木穣監修、学研メディカル秀潤社、2012年09月19日発行）内、第３章３、“網羅的プロモーター解析（イルミナシーケンサーを用いた非増幅ＣＡＧＥ法）”参照）により、ＣＡＧＥライブラリーを調製した。具体的には、精製ＲＮＡを逆転写反応に供して精製後、過ヨウ素酸ナトリウムによりリボースのジオールを参加してアルデヒド化し、ビオチンヒドラジドを添加してアルデヒド基にビオチンを付加した。ＲＮａｓｅＩにより一本鎖ＲＮＡ部分を消化・精製後、アビジン磁気ビーズによりビオチン化されたＲＮＡ／ｃＤＮＡ二本鎖のみをビーズ表面に結合させ、ＲＮａｓｅＨ消化及び熱処理によりｃＤＮＡを遊離させて回収した。回収したｃＤＮＡの両端にシーケンスに必要なアダプターを連結させた後、イルミナ社製ＨｉＳｅｑ２５００によりシーケンスを行った。なお、本工程において精製・緩衝液置換等に用いるＡＭＰｕｒｅ ＸＰ（ベックマン・コールター社製）の標準的な条件では、二本鎖の場合で１００塩基以上の長さの核酸が回収される条件であり、これを採用した本工程により生産されるＣＡＧＥライブラリーは１００塩基以上の鎖長をもつ二本鎖ＤＮＡからなる。
（５）ＲＮＡ発現解析
　ｉ）リファレンス転写開始領域の準備
　ヒトの初代培養細胞や細胞株、さらに組織等を含め合計約１０００ものヒトサンプルについて転写開始点の活性がゲノムワイドに測定されたプロファイルするプロジェクトである「ＦＡＮＴＯＭ５」（論文投稿中）において同定された転写開始領域のうち、ヒトリファレンスゲノムｈｇ１９上に定義された約１８万の転写開始領域をリファレンス転写開始領域とした。
　ｉｉ）転写活性の定量
　シーケンシングにより得られたリードとヒトのリファレンスゲノム（ｈｇ１９）のアラインメントをｂｗａ(Bioinformatics. 2009 Jul 15;25(14):1754-60)を用いて行った。マッピングクオリティが２０以上、かつアラインメントの開始位置が、リファレンス転写開始領域内に位置するようなアラインメントだけを選択し、各転写開始領域のリード数を数え上げた。各ライブラリーの総リード数と、ＲＬＥ(Genome Biol. 2010;11(10):R106)法により推定されたライブラリサイズを用いて、カウントを１００万あたりのリード数(counts per million)に変換する。
（６）結果
（Ａ）活性の異なる転写開始領域の抽出
　上記で定量された、転写開始領域抽出用各サンプルでの転写活性について、「腺癌（ＢＡＣ成分を含まない腺癌）」から得られた臨床検体由来プロファイル群、「低分化扁平上皮癌」から得られた臨床検体由来プロファイル群の間における差分解析をＲ／Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ　ｅｄｇｅＲパッケージ（Bioinformatics. 2010 Jan 1;26(1):139-40）を用いて行った。すなわち、二群間で発現量の平均が異なるかどうか（発現量の平均が等しいことを帰無仮説とし、この帰無仮説が真であることを仮定した場合、測定結果が偶然に起きる確率を計算する）を統計的に検定するものである。閾値としてＦＤＲ（ｆａｌｓｅ　ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ　ｒａｔｅ）１％を設定したところ、これよりも小さな転写開始領域を含むＤＮＡを２１３個同定した（表１－１～表１－９）。この基準は、該当する閾値により抽出される候補のうち９９％は有意に発現差があると統計的に推定されたものであり、通常広く使われるＰ値（発現差が無いことを仮定した場合に偶然起きる確率）を５％とする場合よりも厳しい基準である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
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Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
（Ｂ）高精度の予測を行う転写開始領域の選択
　上記（Ａ）で同定された転写開始領域のうち、一つの発現レベルのみを用いて腺癌（ＢＡＣ成分を含まない腺癌）か扁平上皮癌（低分化肺扁平上皮癌）かを分類できるかどうかを考える。それぞれについて、何らかの閾値を設定することで、転写開始領域抽出用サンプル、検証用サンプル共に特異度１００％・感度１００％で分類できることを確認した。表２に、その閾値の例を示す（ある群における最大値の方が、その他の群における最小値よりも小さい場合、これらの平均を表２に示している）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
実施例２　タンパク質発現を指標とする腺癌と扁平上皮癌の鑑別
（１）検体
　肺腺癌には手術検体４５例を用い、その内訳は細気管支肺胞上皮癌＜bronchioloalveolar carcinoma (BAC)＞が７例、肺胞上皮置換性増殖成分を伴う肺腺癌＜Adenocarcinoma with BAC＞が２２例、肺胞上皮置換性増殖成分を伴わない肺腺癌＜Adenocarcinoma without BAC＞が１６例であった。一方、肺扁平上皮癌として手術検体２９例を用い、その内訳は高分化及び中分化扁平上皮癌＜well and moderately differentiated squamous cell carcinoma (SCC)＞が１８例、低分化扁平上皮癌＜poorly differentiated SCC＞が１１例であった。
（２）免疫染色によるタンパク質の検出
　肺腺癌および肺扁平上皮癌の合計７９例を対象に、腺癌マーカーとして、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ１、Ｎａｐｓｉｎ及びＴＴＦ－１、扁平上皮癌マーカーとしてＣＫ５、ＣＫ６、Ｄｅｓｍｏｇｌｅｉｎ ３（ＤＳＧ３）、ｐ４０、及びＳＰＡＴＳ２の抗体を用いて免疫染色により各タンパクの発現を評価した。
　ｉ）抗体
　　１）抗ＴＴＦ－１抗体（DAKO社）
　　２）抗Ｎａｐｓｉｎ　Ａ抗体（Leica Biosystem社、「NCL-L-Napsin A」）
　　３）抗ｐ４０抗体（Millipore Co.社、「PC373」）
　　４）抗ＣＫ５抗体（Leica Biosystem社、「NCL-CK5」）
　　５）抗ＣＫ６抗体（Gene Tex社、「GTX73556」）
　　６）抗Ｄｅｓｍｏｇｌｅｉｎ　３抗体（BIO CARE Medical社、「ACR419A, C」）
　　７）抗ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ１抗体（SIGMA Life science社、「HPA014975」
　　８）抗ＳＰＡＴＳ２抗体（SIGMA Life science社、「HPA038643」
　ｉｉ）免疫染色法
　患者から分離した生体試料を常法によりホルマリン固定をした後、パラフィンに包埋して組織片に薄切し、スライドガラスに貼り付けたものを切片試料とした。次いで切片試料を、以下に示す条件で熱処理して抗原を賦活化した。次いで、各マーカータンパク質に対する抗体（一次抗体）を以下の条件で添加して反応させ、緩衝液にて十分な洗浄後、二次抗体としてEnvisionを用いて以下の条件で反応させ、緩衝液にて十分な洗浄後ＤＡＢを用いて発色させた。その標本を光学顕微鏡下で陽性・陰性を観察した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　ｉｉｉ）判定
　癌細胞の核もしくは細胞質に中等度以上の染色強度で染色性を認めた場合を陽性とした。各症例の代表切片において、陽性を示す癌細胞が認められない場合をＳｃｏｒｅ　０、５０％未満の癌細胞に陽性像を認める場合をＳｃｏｒｅ　１、５０％以上の癌細胞に陽性像を認める場合をＳｃｏｒｅ　２とし、Ｓｃｏｒｅ　０、１を陰性、Ｓｃｏｒｅ　２を陽性と判定した。これらの評価は２人の病理医により行った。
（３）腺癌および扁平上皮癌のマーカーとしての有用性の評価
　（ａ）各マーカーの腺癌および扁平上皮癌のマーカーとしての有用性を評価した。すなわち、腺癌マーカーに対する感度・特異度を腺癌の鑑別に対して求め、同様に扁平上皮癌マーカーに対する感度・特異度を扁平上皮癌の鑑別能力に対して評価した。またp値はFisherの正確検定により算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　その結果、腺癌マーカーについては、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ１は感度・特異度ともに高く、Ｎａｐｓｉｎ　ＡとＴＴＦ－１の感度は低いがＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ１（－）となる検体で陽性になることがあることが分かった。一方、扁平上皮癌マーカーでは、ＣＫ５／ＤＳＧ３／ｐ４０は感度・特異度ともに高いが、挙動が似ているため、一部の扁平上皮癌で共通して陰性となる傾向が認められた。また、ＳＰＡＴＳ２の感度は然程高くはないが、ＣＫ５／ＤＳＧ３／ｐ４０が陰性となる扁平上皮癌でも陽性になる場合があることが分かった。ＣＫ６も、ＣＫ５／ＤＳＧ３／ｐ４０が陰性となる扁平上皮癌で陽性になることがあるが、腺癌で陽性になりやすく特異度が低い傾向が見られた。これらの結果により、単独マーカーよりも複数のマーカーを組み合わせて相補的な情報を用いることで、より高精度な鑑別ができる可能性が示唆された。
（４）２つのマーカーを組み合わせた場合の評価
　上記の腺癌３マーカー、扁平上皮癌５マーカーから任意の２つを組み合わせた２４通りに対して、腺癌と扁平上皮癌の鑑別能力を検討した。その結果を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　表中、ＴＴＦ－１とｐ４０は病理診断の場でしばしば用いられるマーカーの組み合わせである。Ｆｉｓｈｅｒの正確検定により得られたｐ値を比較した場合、ＴＴＦ－１とｐ４０の組み合わせは１３位である。一方、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ１もしくはＳＰＡＴＳ２のいずれかを用いた組み合わせは１位から９位までを占めており、従来のマーカーの組み合わせでは実現できない高精度な鑑別に、これら２つのタンパク質が必須であることが示された。特にＴＴＦ－１とＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ１は、腺癌の４５例すべて、扁平上皮癌の２９例中２８例を正しく鑑別することが可能であった。
（５）３つのマーカーを組み合わせた場合の評価
　上記の腺癌３マーカー、扁平上皮癌５マーカーから任意の３つを組み合わせた場合には、全５６通りが存在する。その中でも、以下の６通りについては腺癌と扁平上皮癌を完全に鑑別可能であった。
　１）ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ１／ＴＴＦ－１／ＣＫ５
　２）ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ１／ＴＴＦ－１／ＤＳＧ３
　３）ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ１／ＴＴＦ－１／ｐ４０
　４）ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ１／ＳＰＡＴＳ２／ＤＳＧ３
　５）ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ１／ＳＰＡＴＳ２／ＣＫ５
　６）ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ１／ＳＰＡＴＳ２／ｐ４０
　この結果より、完全な鑑別にはＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ１が有用であることが示唆される。
　本発明によれば、患者の肺癌の病理組織型について、病理学的および組織学的に識別が困難な腺癌、とりわけ扁平上皮癌であるか腺癌であるかを鑑別すること、更には低分化扁平上皮癌であるか腺癌であるか、更には低分化扁平上皮癌であるかＢＡＣ成分を含まない腺癌であるかの鑑別を、トレーニングを積んだ病理医や臨床検査技師のような専門家の主観によらなくても、客観的かつ迅速に行うことができる。すなわち、患者検体の採取から解析まで、患者の傍らで医療従事者が行う検査（POCT：Point of Care Testing）に、好適に利用できる。

Claims (14)

  1. 　肺癌患者の病変部から採取された生体試料について、転写開始領域を含むＤＮＡの１種又は２種以上の発現産物の発現レベルを測定する工程を含む、当該病変が扁平上皮癌であるか腺癌であるかを鑑別評価する方法であって、該ＤＮＡが配列番号１～２１３で示される塩基配列における、転写開始領域の任意の位置の塩基とその下流に連続する少なくとも１塩基以上からなるＤＮＡであり、該転写開始領域が、配列番号１～２１３で示される塩基配列の１番目の塩基と３’末端から１０１番目の塩基によって両端が規定される領域である、評価方法。
  2. 　扁平上皮癌が低分化扁平上皮癌である、請求項１記載の方法。
  3. 　腺癌がＢＡＣ成分を含まない腺癌である、請求項１又は２記載の方法。
  4. 　配列番号１～２１３で示される塩基配列が、配列番号２、配列番号３、配列番号５及び配列番号７で示される塩基配列である、請求項１～３のいずれか１記載の方法。
  5. 　さらに、前記ＤＮＡの発現産物の発現レベルを対照レベルと比較する工程を含む、請求項１～４のいずれか１項記載の方法。
  6. 　さらに、前記ＤＮＡの発現産物の発現レベルを閾値レベルと比較する工程を含む、請求項１～４のいずれか１項記載の方法。
  7. 　発現産物の発現レベルの測定が、転写産物の量又は翻訳産物の量を測定することによって行われる、請求項１～６のいずれか１項記載の方法。
  8. 　前記ＤＮＡの転写産物と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、又は前記ＤＮＡの翻訳産物を認識する抗体を含有する請求項１～７のいずれか１項記載の方法に用いる扁平上皮癌であるか腺癌であるかを鑑別評価するための検査用キット。
  9. 　転写開始領域を含むＤＮＡの１種又は２種以上の発現産物の、肺癌患者の病変が扁平上皮癌であるか腺癌であるかを鑑別評価するためのマーカーとしての使用であって、該ＤＮＡが配列番号１～２１３で示される塩基配列における、転写開始領域の任意の位置の塩基とその下流に連続する１塩基以上からなるＤＮＡであり、
    　該転写開始領域が、配列番号１～２１３で示される塩基配列の１番目の塩基と３’末端から１０１番目の塩基によって両端が規定される領域である、前記発現産物の使用。
  10. 　肺癌患者の病変部から採取された生体試料について、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ１及び／又はＳＰＡＴＳ２のタンパク質の発現レベルを測定する工程を含む、当該病変が扁平上皮癌であるか腺癌であるかを鑑別評価する方法。
  11. 　更にＰ４０、ＣＫ５、ＣＫ６、ＤＳＧ３、ＴＴＦ－１及びＮａｐｓｉｎ　Ａから選ばれる１種以上のタンパク質の発現レベルを測定する工程を含む、請求項１０記載の方法。
  12. 　下記１）～９）で示される２種のタンパク質の発現レベルを測定する工程を含む、請求項１１記載の方法。
    　１）ＴＴＦ－１／ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ１
    　２）ＣＫ５／ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ１
    　３）ＤＳＧ３／ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ１
    　４）ＣＫ５／ＳＰＡＴＳ２
    　５）ＤＳＧ３／ＳＰＡＴＳ２
    　６）ｐ４０／ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ１
    　７）ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ１／ＳＰＡＴＳ２
    　８）Ｎａｐｓｉｎ　Ａ／ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ１
    　９）ｐ４０／ＳＰＡＴＳ２
  13. 　下記１）～６）で示される３種のタンパク質の発現レベルを測定する工程を含む、請求項１１記載の方法。
    　１）ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ１／ＴＴＦ－１／ＣＫ５
    　２）ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ１／ＴＴＦ－１／ＤＳＧ３
    　３）ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ１／ＴＴＦ－１／ｐ４０
    　４）ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ１／ＳＰＡＴＳ２／ＤＳＧ３
    　５）ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ１／ＳＰＡＴＳ２／ＣＫ５
    　６）ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ１／ＳＰＡＴＳ２／ｐ４０
  14. 　免疫組織化学分析法によりタンパク質の発現レベルを測定する、請求項１０～１３のいずれか１項記載の方法。
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