WO2015115661A1 - アゾール誘導体骨格を有するペプチドの製造方法 - Google Patents

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WO2015115661A1
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group
skeleton
library
azoline
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裕明 菅
佑樹 後藤
保治 加藤
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国立大学法人東京大学
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    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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    • C12Y102/01054—Gamma-guanidinobutyraldehyde dehydrogenase (1.2.1.54)
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6845—Methods of identifying protein-protein interactions in protein mixtures

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a peptide having an azole derivative skeleton.
  • the patellamide produced by the ascidian symbiotic alga Prochloron didemni is a low-molecular cyclic peptide thought to have various physiological activities, and is biosynthesized by a unique pathway by the products of the pat gene group consisting of patA to G.
  • An outline of the pat gene group and this biosynthetic pathway is shown in FIG.
  • the precursor in this biosynthesis is the PatE peptide of the patE gene product. Since the patE gene has a hypervariable region (cassette region), its product constructs a natural combinatorial library.
  • the PatE peptide has a recognition sequence by a post-translational modification enzyme on both sides of the cassette region. It is PatA, PatD and PatG that act as post-translational modification enzymes. PatD introduces an azoline skeleton into Cys, Ser, and Thr in the PatE cassette, and converts Cys into a thiazoline skeleton and Ser and Thr into an oxazoline skeleton. PatA cleaves the recognition sequence on the N-terminal side of the cassette region of PatE. PatG consists of two domains, and the N-terminal oxidase domain converts the thiazoline skeleton introduced by PatD into a thiazole skeleton. The C-terminal peptidase domain undergoes macrocyclization while cleaving the recognition sequence on the C-terminal side of the PatE cassette region.
  • PatE cassette region of PatE is changed to various sequences different from the natural one, it is modified by PatD, and using PatD, it is far more than the natural PatE product. It was confirmed that a highly diverse azoline skeleton-containing peptide library could be produced (Patent Document 1).
  • peptides having an azole skeleton are also highly resistant to peptidases compared to amide bonds, and are converted to aromatics with a ⁇ -electron system that have excellent target binding ability due to the structure being immobilized. Since the amide bond hydrogen atoms that serve as hydrogen bond donors are eliminated, properties such as high membrane permeability are expected.
  • patellamide D having an activity to suppress multidrug resistance of leukemia cell lines, Telomestatin having a telomerase inhibitory activity, and the like are known as natural physiologically active peptides having an azole in the main chain skeleton. Therefore, if a library having a variety of azole skeletons can be obtained, the possibility of selecting peptides having binding ability and physiological activity to various target substances can be increased.
  • the object of the present invention is to develop an artificial synthesis system of various peptides having an azole derivative skeleton and to develop a library of such peptides.
  • PatG has a substrate specificity that converts only Cys-derived thiazoline into thiazole as its essential catalytic function, so the azoline skeleton derived from Ser and Thr cannot be converted into an azole skeleton, and lacks versatility. There is.
  • the present inventors introduced various azoline derivatives of peptides by introducing an azoline derivative skeleton with PatD into a substrate peptide having a cassette region containing a predetermined unnatural amino acid and then performing a chemical skeleton conversion reaction. It was confirmed that the skeleton was converted to an azole derivative skeleton, and the present invention was completed.
  • a method for producing a peptide having an azole derivative skeleton in the main chain comprising: Synthesizing a substrate peptide of an azoline skeleton-introducing enzyme comprising at least one of the following amino acids in the modified region:
  • X 1 represents a group selected from the group consisting of SH, OH, NH 2 , SR 1 , OR 1 , NHR 1 , and N 3 (R 1 represents a protecting group)
  • X 2 represents a group that is easy to leave
  • X 3 represents hydrogen or an optionally substituted alkyl group or aryl group having 1 to 10 carbon atoms.
  • X 2 is Cl, Br, I, OTs, OMs, and N + R 2 3
  • R 2 is hydrogen or an optionally substituted alkyl group having 1 to 10 carbon atoms and A method selected from the group consisting of an aryl group and a group selected from the group consisting of: [3]
  • a method for producing a peptide library having an azole derivative skeleton comprising: A substrate peptide library containing two or more substrate peptides of azoline skeleton-introducing enzymes with different modified region sequences, each substrate peptide encoding at least one of
  • azoline skeleton derived from Cys not only the azoline skeleton derived from Cys but also various azoline derivative skeletons can be converted into azole derivative skeletons. Therefore, it is possible to obtain a diverse azole peptide library, and screening using this library has improved peptidase resistance, excellent target binding ability, high affinity for metals and nucleic acids, and biological membranes. The possibility of obtaining an azole peptide with improved permeability can be greatly increased.
  • FIG. 1 shows an outline of the production process of Cl-Thr-DBE, Br-Thr-DBE, and I-Thr-DBE.
  • FIG. 2 shows the results of measuring the mass of PatD substrate peptide by MALDI-TOF-MS.
  • FIG. 3 shows the results of measuring the mass of a substrate peptide after reacting with PatD and introducing an azoline derivative skeleton by MALDI-TOF-MS.
  • FIG. 4 shows the results of measuring the mass of a peptide after introduction of an azoline derivative skeleton at 95 ° C. for 1 hour at pH 11 by MALDI-TOF-MS.
  • FIG. 1 shows an outline of the production process of Cl-Thr-DBE, Br-Thr-DBE, and I-Thr-DBE.
  • FIG. 2 shows the results of measuring the mass of PatD substrate peptide by MALDI-TOF-MS.
  • FIG. 3 shows the results of measuring the mass of a substrate peptide after reacting with PatD and introducing an azo
  • FIG. 5 shows the result of MALDI-TOF-MS measurement of mass after reacting the peptide after introduction of the azoline derivative skeleton at 95 ° C. for 1 hour at pH 9 or pH 11.
  • FIG. 6 shows the results of MALDI-TOF-MS measurement of the mass after reacting the peptide after introduction of the azoline derivative skeleton at pH 11 at 60 ° C. for 10 minutes, 30 minutes or 1 hour.
  • FIG. 7 shows the result of MALDI-TOF-MS measurement of the mass after reacting the peptide after introduction of the azoline derivative skeleton at 95 ° C. for 30 minutes in the presence of DBU (10 mM, 100 ⁇ M, or 1 ⁇ M).
  • DBU 10 mM, 100 ⁇ M, or 1 ⁇ M
  • FIG. 8 shows the result of MALDI-TOF-MS measurement of the mass after reacting the peptide after introduction of the azoline derivative skeleton at pH 7.5, 9, or 10 in the presence of Ag + at 95 ° C. for 30 minutes. Indicates.
  • FIG. 9 shows the result of MALDI-TOF-MS measurement of the mass after reacting the peptide after introduction of the azoline derivative skeleton with PatG.
  • FIG. 10 shows an outline of the pat gene group and its biosynthetic pathway.
  • the present invention provides a method for producing a peptide having an azole derivative skeleton.
  • the peptide having an azole derivative skeleton according to the present invention (sometimes referred to as “azole peptide”) is at least one main chain skeleton of any of the following azole skeleton and derivatives (I) to (III) thereof: Refers to the peptide possessed by In the formula, X represents S, O, or NH.
  • the method for producing an azole peptide according to the present invention comprises a step of synthesizing a peptide comprising at least one of the following amino acids (I) to (IV) in a modified region of a substrate peptide of an azoline skeleton-introducing enzyme: including.
  • X 1 represents a group selected from the group consisting of SH, OH, NH 2 , SR 1 , OR 1 , NHR 1 , and N 3 (R 1 represents a protecting group);
  • X 2 represents a group that is easy to leave, X 3 represents hydrogen or an optionally substituted alkyl group or aryl group having 1 to 10 carbon atoms.
  • azoline skeleton-introducing enzyme refers to an enzyme that introduces the azoline derivative skeleton described above into a Cys residue, a Ser residue, a Thr residue, or a derivative thereof of a peptide serving as a substrate. And an enzyme having homology thereto.
  • the enzyme having homology with PatD for example, those included in the report of Lee et al. (Lee, S. W. et al., PNAS vol.105, No.15, 5879-5884, 2008) may be used. Although it can, it is not limited to these.
  • the azoline skeleton-introducing enzyme may be a mutant thereof as long as it has an activity of introducing an azoline derivative skeleton.
  • the “substrate peptide of the azoline skeleton-introducing enzyme” refers to a peptide that can be a substrate of the azoline skeleton-introducing enzyme and into which any azoline derivative skeleton is introduced.
  • the “modified region” of the substrate peptide of the azoline skeleton-introducing enzyme according to the present invention is also referred to as a cassette region and corresponds to the hypervariable region of the natural PatE peptide.
  • Any sequence of The number of amino acids in the modified region can be, for example, 2 or more, and can be 10 or less, 12 or less, 14 or less, 16 or less, 18 or less, 20 or less, 30 or less, or 40 or less.
  • the substrate peptide of the azoline skeleton-introducing enzyme contains at least one of the amino acids (I) to (IV) in the modified region.
  • the modified region may contain two or more amino acids (I) to (IV). When two or more are included, they may be the same amino acid or different amino acids, and may be adjacent or separated.
  • amino acids (I) to (IV) are also located at any position in the modified region. There may be.
  • amino acids (I) to (IV) may be arranged at even numbers from the N-terminus of the modified region.
  • hydrophilic amino acids (Asp, Glu, Arg, Lys, Asn, Gln, or hydrophilic derivatives thereof) may be arranged not adjacent to the N-terminal side of amino acids (I) to (IV).
  • X 1 represents a group selected from the group consisting of SH, OH, NH 2 , SR 1 , OR 1 , NHR 1 , and N 3 .
  • R 1 represents a protecting group.
  • the protecting group can be appropriately selected from those known to those skilled in the art. Examples of the protecting group for the hydroxy group include a methyl group, a benzyl group, a p-methoxybenzyl group, a tert-butyl group, and a trimethylsilyl group.
  • Protecting groups for amino groups such as trialkylsilyl group, methoxymethyl group, tetrahydropyranyl group, o-nitrobenzyl group, t-butoxycarbonyl group (Boc), benzyloxycarbonyl group (Cbz), fluorenylmethyl
  • protecting groups for thiol groups such as oxycarbonyl group (Fmoc), o-nitrobenzoyl group, pentenoyl group, disulfide protecting groups such as t-butyl group and hydroxyethyl sulfide group, and triphenylmethyl group. It is not limited to.
  • the amino acids (I) to (IV) contain R 1
  • the amino acid (I) to (IV) is deprotected before reacting the substrate peptide with the azoline skeleton transductase. Deprotection can be appropriately carried out by those skilled in the art depending on the type of protecting group.
  • X 2 is not particularly limited as long as it is a group that can be easily removed by appropriate chemical treatment, and can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • Examples of X 2 include Cl, Br, I, F, tosyl groups (OTs), mesyl groups (OMs), diazonium groups (N 2 + ), trifluoromethanesulfone groups (OSO 2 CF 3 ), and N + R 2 3 is mentioned.
  • Three R 2 of N + R 2 3 is hydrogen or an alkyl group and an aryl group which has ⁇ 1 carbon atoms which may 10 have a substituent, are each independently selected. The number of carbon atoms may be any of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, and 10.
  • substituents include, but are not limited to, a halogen atom, a cyano group, a hydroxy group, a nitro group, an amino group, an alkyl group, an aryl group, an alkene group, an alkyne group, and an azide group.
  • X 3 is independently selected from hydrogen or an optionally substituted alkyl group having 1 to 10 carbon atoms and an aryl group.
  • the number of carbon atoms may be any of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, and 10.
  • substituents include, but are not limited to, a halogen atom, a cyano group, a hydroxy group, a nitro group, an amino group, an alkyl group, an aryl group, an alkene group, an alkyne group, and an azide group.
  • amino acids (I) to (IV) include halothreonine in which, in amino acid (I), X 1 is OH and X 2 is Cl, Br, or I.
  • the substrate peptide of the azoline skeleton-introducing enzyme can be a peptide comprising a leader sequence, a recognition sequence 1, a modified region, and a recognition sequence 2 in this order from the N-terminus in the same manner as natural PatE.
  • the leader sequence has the following amino acid sequence in natural PatE. MNKKNILPQQGQPVIRLTAGQLSSQLAELSEEALGDA (SEQ ID NO: 1)
  • this sequence may be used as a leader sequence.
  • PatD can introduce an azoline skeleton into a substrate peptide even when a sequence different from the leader sequence of PatE known as a conventional leader sequence is used.
  • a sequence different from the leader sequence of PatE known as a conventional leader sequence is used.
  • MKEQNSFNLLQEVTESELDLILGA SEQ ID NO: 2 derived from another peptide (Lacticin481 precursor), MILALSTFQQMWISKQEYDEAGDA (SEQ ID NO: 3) derived from human actin, and MELQLRPSGLEKKQAPISELNIAQTQGGDSQALQNAQTQGGDSQALQNAQTQGGDSQ ) And the like.
  • the leader sequence is not particularly limited as long as the azoline derivative skeleton is introduced into the substrate peptide, but these sequences may be used.
  • the leader sequence may be composed of a sequence of 4 or more amino acids, 5 or more amino acids, or 6 or more amino acids in each of the above-described sequences.
  • the leader sequence may not be included in the substrate peptide. Therefore, in one embodiment, the substrate peptide of the azoline skeleton-introducing enzyme can be a peptide comprising a recognition sequence 1, a modified region, and a recognition sequence 2 in this order from the N-terminus. In this case, when the substrate peptide and the azoline skeleton-introducing enzyme are reacted, a peptide having a leader sequence may be added as an independent peptide.
  • a leader sequence may be bound to an azoline skeleton-introducing enzyme. In this case, the leader sequence may be bound to any position of the azoline skeleton-introducing enzyme, but is desirably bound to the N-terminus.
  • the azoline skeleton-introducing enzyme to which the leader sequence is bound can be prepared by a known method or a method analogous thereto. For example, it can be obtained by synthesizing a nucleic acid encoding it and expressing it in E. coli as a fusion peptide.
  • Recognition sequences 1 and 2 are recognition sequences by an azoline skeleton-introducing enzyme consisting of 0 to 10 amino acids, and may be any sequences as long as the azoline skeleton-introducing enzyme recognizes this and introduces an azoline derivative skeleton.
  • the recognition sequence 1 include G (A / L / V) (G / E / D) (A / P) (S / T / C) (SEQ ID NO: 5).
  • GLEAS SEQ ID NO: 6
  • recognition sequence 2 by the azoline skeleton-introducing enzyme one containing (A / S) Y (D / E) G (A / L / V) (SEQ ID NO: 7) can be used.
  • it may be AYDGVEPS (SEQ ID NO: 8), AYDGV (SEQ ID NO: 9), AYDGVGSGSGS (SEQ ID NO: 10), AYDGVGGGGGG (SEQ ID NO: 11), AYDGVEGSGSGS (SEQ ID NO: 12), or GGGGG (SEQ ID NO: 12). 13), QQQQQ (SEQ ID NO: 14), LLLLL (SEQ ID NO: 15), PPPPP (SEQ ID NO: 16), and other sequences may be used.
  • recognition substrate 1 and / or 2 can be used as a substrate for an azoline skeleton-introducing enzyme, recognition sequences 1 and 2 are optional components of the substrate peptide.
  • the substrate peptide of the azoline skeleton-introducing enzyme includes a linker sequence between the leader sequence and the recognition sequence 1, between the recognition sequence 1 and the modified region, and between the modified region and the recognition sequence 2. You may go out.
  • the substrate peptide of the azoline skeleton-introducing enzyme may contain two or more modified regions.
  • the substrate peptide can be, for example, a leader sequence, a recognition sequence 1, a modified region 1, a recognition sequence 2, a modified region 2, and a recognition sequence 3 from the N-terminus.
  • amino acid is used in its broadest sense, and includes derivatives and artificial amino acids in addition to natural amino acids.
  • amino acids include naturally occurring proteinaceous L-amino acids; unnatural amino acids; chemically synthesized compounds having characteristics known in the art that are characteristic of amino acids.
  • non-natural amino acids include ⁇ , ⁇ -disubstituted amino acids (such as ⁇ -methylalanine), N-alkyl- ⁇ -amino acids, D-amino acids, ⁇ -amino acids, ⁇ - Hydroxy acids, amino acids whose side chain structure is different from the natural type (norleucine, homohistidine, etc.), amino acids with extra methylene in the side chain (such as “homo” amino acids, homophenylalanine, homohistidine, etc.), and carvone in the side chain Examples include, but are not limited to, amino acids in which the acid functional amino acid is substituted with a sulfonic acid group (such as cysteic acid).
  • amino acids may be represented by conventional one-letter code or three-letter code. Amino acids represented by one-letter code or three-letter code may include respective mutants and derivatives.
  • the substrate peptide may further contain a non-protein amino acid in the modified region or a region other than the modified region.
  • non-protein amino acids include, but are not limited to:
  • the method for synthesizing the above-mentioned “substrate peptide of azoline skeleton-introducing enzyme” is not particularly limited, and is a liquid phase method, a solid phase method, a chemical synthesis method such as a hybrid method combining a liquid phase method and a solid phase method, a gene recombination method, A known method such as synthesis using a cell-free translation system or a method analogous thereto can be used.
  • the substrate peptide can be obtained by preparing a nucleic acid encoding the substrate peptide and translating and synthesizing the nucleic acid in a cell-free translation system.
  • a nucleic acid encoding a substrate peptide can be appropriately designed by a person skilled in the art using the genetic code used in a biological translation system, the reprogrammed genetic code, or a combination thereof.
  • the “nucleic acid” may be DNA or RNA.
  • the genetic code consisting of a triplet of mRNA encodes an amino acid different from that of a biological translation system.
  • a cell-free translation system and an artificial aminoacylated RNA-catalyzed flexizyme (Flexizyme) developed by the present inventors, the genetic code consisting of a triplet of mRNA encodes an amino acid different from that of a biological translation system.
  • unnatural amino acids (I) to (IV) can also be incorporated into peptides by translation. This will be described in detail below.
  • Flexizyme is an artificial RNA catalyst (RNA catalyst having acyl-tRNA synthetase-like activity) that can link (acylate) any amino acid or hydroxy acid to any tRNA.
  • RNA catalyst having acyl-tRNA synthetase-like activity
  • the desired amino acid or hydroxy acid which is different from the natural genetic code, can correspond to any codon. Can be made.
  • Flexizyme is also known by the name of the original flexizyme (Fx) and dinitrobenzyl flexizyme modified from this (dFx), enhanced flexizyme (eFx), amino flexizyme (aFx) and the like.
  • the method for linking an arbitrary amino acid to an arbitrary tRNA is not limited to the method using flexizyme, and other methods are applicable to the present invention.
  • a translation system can be used in which the components of the translation system are freely removed according to the purpose and only the necessary components are reconfigured.
  • the codon corresponding to the amino acid becomes an empty codon. Therefore, using flexizyme or the like, any amino acid is linked to a tRNA having an anticodon complementary to the vacant codon, and this is added to perform translation.
  • the arbitrary amino acid is encoded by the empty codon, and the peptide into which the arbitrary amino acid is introduced instead of the removed amino acid is translated.
  • the amino acids (I) to (IV) and functional groups 1 and 2 for macrocyclization described later can be assigned to arbitrary codons and introduced into the peptide by translation.
  • Escherichia coli extract or wheat germ extract can be used.
  • a rabbit erythrocyte extract or an insect cell extract may be used.
  • purified ribosomal protein, aminoacyl tRNA synthetase (ARS), ribosomal RNA, amino acid, rRNA, GTP, ATP, translation initiation factor (IF) elongation factor (EF), termination factor (RF), and ribosome regeneration factor ( RRF) and other cell-free translation systems constructed by reconstructing other factors necessary for translation may be used.
  • a system containing RNA polymerase may be used.
  • RTS-100 registered trademark of Roche Diagnostics
  • PURESYSTEM registered trademark of PGI or New England
  • a wheat germ extract such as BioLabs' PURExpress® In Vitro Protein Synthesis Kit
  • those from Zoigene or Cell Free Science can be used.
  • E. coli ribosome for example, the technique described in the following literature is known: HF Kung et al., 1977. The Journal of Biological Chemistry Vol. 252, No.
  • the expression product can be obtained in a highly purified form without purification.
  • the method for producing an azole peptide according to the present invention includes a step of reacting a substrate peptide with an azoline skeleton-introducing enzyme to obtain a peptide having an azoline derivative skeleton.
  • a peptide having an azoline derivative skeleton (sometimes referred to as “azoline peptide”) refers to a peptide having at least one of the following azoline skeletons or derivatives thereof in the main chain skeleton.
  • X represents S, O, or NH.
  • the azoline skeleton-introducing enzyme used in this step may be extracted and purified from a microorganism that produces the enzyme, or may be expressed by a gene recombination method. Further, as long as the azoline derivative skeleton is introduced, the mutant may be used.
  • the reaction between the substrate peptide and the azoline skeleton-introducing enzyme may be carried out in the same container in which the above-mentioned substrate peptide is expressed, that is, in one pot, with the azoline skeleton-introducing enzyme added without purifying the substrate peptide.
  • the substrate peptide may be purified in a separate container and then reacted with the azoline skeleton-introducing enzyme.
  • the reaction between the substrate peptide and the azoline skeleton-introducing enzyme is, for example, when the azoline skeleton-introducing enzyme is PatD, in a final concentration range of 0.1 ⁇ M to 50 ⁇ M, a reaction temperature of 4 ° C. to 45 ° C., a reaction time of 5 minutes to 100 hours, etc. Those skilled in the art can select and perform conditions appropriately.
  • the substrate peptide When the substrate peptide does not contain a leader sequence, the substrate peptide may be reacted with an azoline skeleton-introducing enzyme to which the leader sequence is bound. When the substrate peptide does not contain a leader sequence and the leader sequence is not bound to the azoline skeleton-introducing enzyme, the leader sequence may be added to the reaction system as an independent peptide in this step.
  • the reaction of the azoline skeleton-introducing enzyme introduces an azoline skeleton into amino acid (I) to (IV) residues of the substrate peptide. Confirmation that the azoline derivative skeleton has been introduced can be carried out, for example, by measuring mass change using MALDI-TOF-MS.
  • the method for producing an azole peptide according to the present invention includes a step of converting an azoline derivative skeleton into an azole derivative skeleton by inducing a X 2 group elimination reaction in a peptide having an azoline derivative skeleton.
  • Basic conditions can be adjusted, for example, by adding a basic solution (for example, KOH) or a basic buffer.
  • the temperature during the elimination reaction is not particularly limited as long as the azoline derivative skeleton is converted into the azole derivative skeleton.
  • the temperature is about 60 ° C. or higher, about 65 ° C. or higher, about 70 ° C. or higher, about 75 ° C. or higher, about 80 ° C. Or higher, about 85 ° C or higher, about 90 ° C or higher, about 95 ° C or higher, about 98 ° C or higher.
  • the reaction time can also be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the reaction time can be 10 minutes or more, 20 minutes or more, 30 minutes or more, 40 minutes or more, 50 minutes or more, 60 minutes or more, 70 minutes or more, etc. .
  • the elimination reaction of X 2 via isomerization of the double bond produced by elimination, the amino acid (I) ⁇ (IV) sites, azole derivative skeleton is formed.
  • the conversion to the azole derivative skeleton is not limited to Cys-derived thiazole, and various azole peptides can be obtained. it can.
  • Confirmation that it has been converted to an azole ring can be performed, for example, by measuring mass change using MALDI-TOF-MS.
  • the method for producing an azole peptide according to the present invention may further include a step of macrocyclizing the azole peptide.
  • the method of macrocyclization is not particularly limited, and can be performed, for example, by introducing an amino acid having the following functional group 1 and an amino acid having the corresponding functional group 2 into the azole peptide.
  • Either functional group 1 or functional group 2 may be on the N-terminal side.
  • an azole peptide in which the azole derivative skeleton is contained in the macrocyclic portion can be obtained.
  • X 1 is Cl, Br or I
  • Ar is an aromatic ring which may have a substituent.
  • a chloroacetylated amino acid for example, a chloroacetylated amino acid can be used.
  • the chloroacetylated amino acids include N-chloroacetyl-L-alanine, N-chloroacetyl-L-phenylalanine, N-chloroacetyl-L-tyrosine, N-chloroacetyl-L-tryptophan, N-3- (2-chloroacetamido) benzoyl- L-phenylalanine, N-3- (2-chloroacetamido) benzoyl-L-tyrosine, N-3- (2-chloroacetamido) benzoyl-L-tryptophane, ⁇ -N-chloroacetyl-L-diaminopropanoic acid, ⁇ -N-chloroacetyl -L-diaminobutyric acid, ⁇ -N-chloroacetyl
  • amino acid (A-2) for example, cysteine, homocysteine, mercaptonorvaline, mercaptonorleucine, 2-amino-7-mercaptoheptanoic acid, 2-amino-8-mercaptooctanoic acid, and the SH group of these amino acids are temporarily protected. And amino acids whose protective groups have been deprotected, and D-amino acid derivatives corresponding to these amino acids. Cyclization methods are described, for example, by Kawakami, T. et al., Nature Chemical Biology 5, 888-890 (2009); Yamagishi, Y. et al., ChemBioChem 10, 1469-1472 (2009); Sako, Y. et.
  • amino acid (B-1) for example, propargylglycine, homopropargylglycine, 2-amino-6-heptynoic acid, 2-amino-7-octynoic acid, and 2-amino-8-nonynoic acid can be used. Further, 4-pentynoylated or 5-hexynoylated amino acids can also be used.
  • 4-pentynoylated amino acids include N- (4-pentenoyl) -L-alanine, N- (4-pentenoyl) -L-phenylalanine, N- (4-pentenoyl) -L-tyrosine, N- (4-pentenoyl ) -L-tryptophan, N-3- (4-pentynoylamido) benzoyl-L-phenylalanine, N-3- (4-pentynoylamido) benzoyl-L-tyrosine, N-3- (4-pentynoylamido) benzoyl-L-tryptophane , ⁇ -N- (4-pentenoyl) -L-diaminopropanoic acid, ⁇ -N- (4-pentenoyl) -L-diaminobutyric acid, ⁇ -N- (4-pentenoyl) -L-ornithine, ⁇ -
  • amino acid (B-2) for example, azidoalanine, 2-amino-4-azidobutanoic acid, azidoptonorvaline, azidonorleucine, 2-amino-7-azidoheptanoic acid, and 2-amino-8-azidooctanoic acid can be used.
  • azidoacetylated or 3-azidopentanoylated amino acids can also be used.
  • Azidoacetylated amino acids include N-azidoacetyl-L-alanine, N-azidoacetyl-L-phenylalanine, N-azidoacetyl-L-tyrosine, N-azidoacetyl-L-tryptophan, N-3- (4-pentynoylamido) benzoyl-L -phenylalanine, N-3- (4-pentynoylamido) benzoyl-L-tyrosine, N-3- (4-pentynoylamido) benzoyl-L-tryptophane, ⁇ -N-azidoacetyl-L-diaminopropanoic acid, ⁇ -N-azidoacetyl- Examples include L-diaminobutyric acid, ⁇ -N-azidoacetyl-L-ornithine, ⁇ -N-azido
  • Examples of the amino acid (C-2) include 5-hydroxytryptophan (W OH ).
  • the cyclization method can be performed, for example, according to the method described in Yamagishi, Y. et al., ChemBioChem 10, 1469-1472 (2009), WO2008 / 117833.
  • amino acid (D-1) examples include 2-amino-6-chloro-hexynoic acid, 2-amino-7-chloro-heptynoic acid, 2-amino-8-chloro-octynoic acid, and the like.
  • amino acid (D-2) for example, cysteine, homocysteine, mercaptonorvaline, mercaptonorleucine, 2-amino-7-mercaptoheptanoic acid, 2-amino-8-mercaptooctanoic acid, and the SH group of these amino acids are temporarily protected. And amino acids whose protective groups have been deprotected, and D-amino acid derivatives corresponding to these amino acids.
  • the cyclization method can be performed, for example, according to the method described in WO2012 / 074129.
  • amino acids (E-1) examples include N-3-chloromethylbenzoyl-L-phenylalanine, N-3-chloromethylbenzoyl-L-tyrosine, N-3-chloromethylbenzoyl-L-tryptophane, and the corresponding D-amino acids Derivatives and the like.
  • amino acid (E-2) for example, cysteine, homocysteine, mercaptonorvaline, mercaptonorleucine, 2-amino-7-mercaptoheptanoic acid, 2-amino-8-mercaptooctanoic acid, and the SH group of these amino acids are temporarily protected. And amino acids whose protective groups have been deprotected, and D-amino acid derivatives corresponding to these amino acids.
  • the macrocyclization step is typically performed after converting the azoline derivative skeleton to the azole derivative skeleton, but may be performed at any stage after the step of synthesizing the substrate peptide of the azoline skeleton-introducing enzyme.
  • a step of cleaving the leader sequence may be performed. Thereby, an excess part is removed from an azole peptide, and it may become easy to couple
  • the leader sequence can also be cleaved, for example, by adding peptidase in the same container in which the reaction of the azoline skeleton-introducing enzyme was carried out.
  • Cleavage of the leader sequence may be performed by cleaving any of the leader sequence, the recognition sequence 1, between the leader sequence and the recognition sequence 1, or between the recognition sequence 1 and the modified region, depending on the sequence of the site to be cleaved.
  • a peptidase is selected.
  • Peptidases include trypsin, Glu-C, Lys-C, Asp-N, Lys-N, Arg-C, thrombin, Factor Xa, prescission protease, TEV protease, enterokinase, HRV 3C Protease, etc. It is not limited.
  • the substrate peptide when the substrate peptide contains GLEAS as the recognition sequence 1, it can be cleaved between Glu and Ala using endoproteinase Glu-C. Cleavage with Glu-C can be performed according to a known method.
  • the leader sequence is typically cleaved after the step of converting the azoline derivative skeleton to the azole derivative skeleton.
  • the leader sequence may be cleaved before macrocyclization.
  • the present invention also includes a method for producing a library of azole peptides.
  • an azole peptide library refers to a library containing azole peptides having different sequences of modified regions.
  • a library of substrate peptides for an azoline skeleton-introducing enzyme is produced.
  • the modified regions of each substrate peptide are different from each other, and each modified region contains at least one amino acid (I) to (IV).
  • the step of producing the substrate peptide library includes the step of producing an mRNA library encoding the substrate peptide library and the step of translating the mRNA library with a cell-free translation system to obtain the substrate peptide library.
  • Such an mRNA library can be prepared by a person skilled in the art according to a known method (for example, Patent Document 1).
  • ATG encoding it becomes a vacant codon, and any one of amino acids (I) to (IV) can be assigned to the vacant codon.
  • the part which codes a to-be-modified region among mRNA which codes a substrate peptide is NNN, NNK, NNT, or NNG (N represents A, C, G, or T; K represents G or T).
  • WST (W represents A or T, S represents C or G) is used as a codon for amino acids (I) to (IV), and the portion of the mRNA that encodes the substrate peptide that encodes the modified region Is composed of NNN, NNK, NNT, or NNG and WST, so that four kinds of unnatural amino acids are randomly introduced into the modified region, and other amino acids in the modified region are random sequences. can do.
  • sequences of the mRNA library can be designed in consideration of the arrangement of the leader sequence, recognition sequence, protease recognition site for cleaving the leader sequence, functional groups 1 and 2 for macrocyclization, and the like.
  • the method for producing an azole peptide library of the present invention comprises puromycin binding to the 3 ′ end of each mRNA in the mRNA library prior to the translation step after the step of producing the mRNA library encoding the substrate peptide library.
  • the method for binding puromycin to mRNA is not particularly limited.
  • a puromycin linker in which puromycin is bound to DNA that can hybridize to the sequence at the 3 ′ end of each mRNA can be used.
  • azole peptides can be expressed by mRNA display (Nemoto, N. et al., FEBS Lett. 1997, 405-408; Roberts, RW and Szostak, JW Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94, 12297- 12302).
  • the present invention also includes a screening method for identifying an azole peptide that binds to a target substance using an azole peptide library.
  • the screening method of the present invention includes a step of bringing a target substance into contact with an azole peptide library produced by the method of the present invention and incubating the library.
  • the “target substance” is not particularly limited, and may be a low molecular compound, a high molecular compound, a nucleic acid, a peptide, a protein, a sugar, a lipid, or the like.
  • the library of the present invention can be used even when the target substance is a protein having protease activity.
  • the target substance may be immobilized on a solid phase carrier and contacted with the library of the present invention.
  • the “solid phase carrier” is not particularly limited as long as it is a carrier capable of immobilizing a target substance, and is made of a microtiter plate made of glass, metal, resin, etc., substrate, beads, nitrocellulose membrane, nylon membrane , PVDF membranes and the like, and the target substance can be fixed to these solid phase carriers according to a known method.
  • the target substance and the library are brought into contact with each other in an appropriately selected buffer, and the pH, temperature, time, etc. are adjusted to interact with each other.
  • the screening method of the present invention further includes a step of selecting an azole peptide bound to the target substance.
  • the target substance for example, a compound that is labeled according to a known method for detectably labeling the peptide, and after the incubation step, the surface of the solid phase carrier is washed with a buffer solution, and bound to the target substance. To detect.
  • Detectable labels include enzymes such as peroxidase and alkaline phosphatase, radioactive materials such as 125 I, 131 I, 35 S, and 3 H, fluorescein isothiocyanate, rhodamine, dansyl chloride, phycoerythrin, tetramethylrhodamine isothiocyanate, near red Examples include fluorescent materials such as outer fluorescent materials, luminescent materials such as luciferase, luciferin, and aequorin, and nanoparticles such as gold colloids and quantum dots.
  • an enzyme substrate can be added to cause color development and detection. It can also be detected by binding biotin to the peptide and binding avidin or streptavidin labeled with an enzyme or the like.
  • the mRNA-azole peptide complex library screening can be performed by applying the mRNA display method.
  • the mRNA-azole peptide complex library is brought into contact with the target substance immobilized on the solid phase alone.
  • the mRNA-bound azole peptide bound to the target substance is recovered, and a cDNA group is obtained from the mRNA portion by a reverse transcription reaction.
  • the cDNA group is appropriately amplified and purified by binding puromycin to the 3 ′ end of each cDNA, an mRNA-azole peptide complex library can be obtained again.
  • This library contains mRNA-azole peptide complexes with higher affinity for the target substance. Therefore, by repeating this step, azole peptides having high affinity for the target substance can be concentrated.
  • a reverse transcription reaction is performed on the mRNA-azole peptide complex library, and then the library is brought into contact with a target substance immobilized on a solid phase alone.
  • the complex that binds to the target substance is recovered, and this DNA is amplified by PCR.
  • the mRNA-azole peptide complex library prepared again using this DNA contains mRNA-azole peptide complexes with higher affinity for the target substance. Therefore, by repeating this step, azole peptides having high affinity for the target substance can be concentrated.
  • the base sequence of the cDNA can be determined by a conventional method, so that the sequence of the azole peptide that binds to the target substance can be easily known. .
  • the present invention also provides a kit for screening an azole peptide library.
  • One aspect of the screening kit of the present invention includes an azole peptide library produced by the production method according to the present invention.
  • the screening kit of the present invention may contain reagents and devices necessary for detecting the binding between the target substance and the azole peptide. Examples of such reagents and devices include, but are not limited to, solid phase carriers, buffers, labeling reagents, enzymes, enzyme reaction stop solutions, and microplate readers.
  • reagents and devices include, but are not limited to, solid phase carriers, buffers, labeling reagents, enzymes, enzyme reaction stop solutions, and microplate readers.
  • PatD ATP, and DTT are added to the reaction solution (5 ⁇ L) after translation of the PatD enzyme reaction so that the final concentrations are 6 ⁇ M, 0.5 mM, and 7.5 mM, respectively, to a total volume of 10 ⁇ L, and reacted at 25 ° C. for 16 hours. It was.
  • the result of measuring the mass by the above-described method is shown in FIG. A decrease in molecular weight corresponding to the dehydration of one molecule was observed, confirming the introduction of an azoline derivative skeleton.
  • PatG enzyme reaction instead, an enzymatic reaction with the PatG mutant was performed.
  • PatD reaction PatG was added, and final concentrations of PatD and PatG were changed from 1 ⁇ M and 2.9 ⁇ M to 5.3 ⁇ M, respectively, and reacted at 25 ° C. for 16 hours.
  • trifluoroacetic acid was added to a final concentration of 1%, and the reaction was carried out at 95 ° C. for 5 minutes.
  • the result of measuring the mass by the above method is shown in FIG. There was no decrease in molecular weight due to PatG reaction or a peak resistant to hydrolysis conditions with trifluoroacetic acid (data not shown), and formation of an azole ring was not observed.
  • SEQ ID NOs: 1 to 4 show the amino acid sequences of leader sequences in the substrate peptide of the azoline skeleton-introducing enzyme.
  • SEQ ID NOs: 5 and 6 show the amino acid sequences of recognition sequence 1 in the substrate peptide of the azoline skeleton-introducing enzyme.
  • SEQ ID NOs: 7 to 16 show the amino acid sequences of recognition sequence 2 in the substrate peptide of the azoline skeleton-introducing enzyme.
  • SEQ ID NO: 17 shows the amino acid sequence of the substrate peptide used in the examples.
  • SEQ ID NOs: 18 and 19 show the amino acid sequences of the sense strand and the antisense strand used for translation of the substrate peptide.

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Abstract

　本発明は、アゾール誘導体骨格を有する様々なペプチドの人工合成系を開発すること、さらにかかるペプチドのライブラリを開発すること等を課題とする。本発明は、主鎖にアゾール誘導体骨格を有するペプチドの製造方法であって、アゾリン骨格導入酵素の基質ペプチドであって、その被修飾領域に以下のいずれかのアミノ酸を少なくとも1つ含むペプチドを合成する工程と、〔いずれの化合物においても、　X1はSH、OH、NH2、SR1、OR1、NHR1、及びN3からなる群より選択される基を表し（R1は保護基を表す）、　X2は、脱離しやすい基を表し、　X3は、水素、又は置換基を有していてもよい炭素数1～10のアルキル基又はアリール基を表す。〕　前記基質ペプチドと、アゾリン骨格導入酵素とを反応させてアゾリン誘導体骨格を有するペプチドを得る工程と、　前記アゾリン誘導体骨格を有するペプチドを、X2基のHX2脱離反応を誘導することにより、アゾリン誘導体骨格をアゾール誘導体骨格に変換する工程と、を含む方法を提供する。

Description

アゾール誘導体骨格を有するペプチドの製造方法
　本発明は、アゾール誘導体骨格を有するペプチドの製造方法等に関する。
　近年、ペプチドが医薬品候補や研究用ツールとして注目されており、ペプチドライブラリを開発し、標的物質に対する親和性や生理活性を有するペプチドをスクリーニングしようとする様々な試みがなされている。
　ホヤの共生藻Prochloron didemniが産生するpatellamideは、種々の生理活性を有すると考えられる低分子環状ペプチドであり、patA～Gからなるpat遺伝子群の産物によるユニークな経路で生合成される。pat遺伝子群とこの生合成経路の概略を図１０に示す。
　この生合成において前駆体となるのは、patE遺伝子産物のPatEペプチドである。patE遺伝子は超可変領域（カセット領域）を有するため、その産物は天然のコンビナトリアルライブラリを構築する。
　PatEペプチドは、カセット領域の両側に、翻訳後修飾酵素による認識配列を有する。翻訳後修飾酵素として働くのは、PatA、PatD及びPatGである。PatDは、PatEのカセットにおけるCys、Ser、及びThrにアゾリン骨格を導入し、Cysをチアゾリン骨格に、Ser及びThrをオキサゾリン骨格に変換する。
　PatAは、PatEのカセット領域のN末端側の認識配列を切断する。
　PatGは、2つのドメインからなり、N末端のオキシダーゼドメインは、PatDにより導入されたチアゾリン骨格をチアゾール骨格に変換する。C末端側のペプチダーゼドメインは、PatEのカセット領域のC末端側の認識配列を切断しながら大環状化する。
　本発明者らは、これまでに、PatEのカセット領域を天然のものとは異なる多様な配列に変えても、PatDによって修飾を受けることを見出し、PatDを用いて、天然のPatE産物よりもはるかに多様性が大きいアゾリン骨格含有ペプチドライブラリを製造できることを確認した（特許文献１）。
　一方、アゾール骨格を有するペプチドも、アミド結合に比較してペプチダーゼ耐性が高い、構造が固定化されることにより標的結合能に優れる、π電子系を有する芳香族に変換されるため、金属や核酸に対する親和性が高く、また水素結合ドナーとなるアミド結合の水素原子がなくなるため高い膜透過性などの性質が期待される。実際、主鎖骨格にアゾールを有する天然の生理活性ペプチドとして、白血病細胞株の多剤耐性を抑制する活性を有するpatellamideDや、テロメラーゼ阻害活性を有するTelomestatinなどが知られている。
　したがって、アゾール骨格を有するペプチドについても、多様性のあるライブラリを得ることができれば、種々の標的物質に対する結合能や生理活性を有するペプチドを選択できる可能性を高めることができる。
国際公開第2012/121392号
　本発明は、アゾール誘導体骨格を有する様々なペプチドの人工合成系を開発すること、さらにかかるペプチドのライブラリを開発すること等を課題とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために、まず、特許文献１の方法でPatDによりペプチドにアゾリン骨格を導入し、その後、PatGによりアゾリン骨格をアゾール骨格に変換することを試みた。しかしながら、in vitroの系では、PatGによるアゾリン骨格からアゾール骨格への変換が確認できなかった。
　また、PatGは、その本質的な触媒機能として、Cys由来のチアゾリンのみをチアゾールに変換する基質特異性をもっているため、Ser及びThr由来のアゾリン骨格をアゾール骨格に変換できず、汎用性に欠ける短所がある。
　そこで、本発明者らは、所定の非天然アミノ酸を含むカセット領域を有する基質ペプチドにPatDでアゾリン誘導体骨格を導入し、その後、化学的な骨格変換反応を行うことにより、ペプチドの様々なアゾリン誘導体骨格がアゾール誘導体骨格に変換されることを確認し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、
〔１〕主鎖にアゾール誘導体骨格を有するペプチドの製造方法であって：
　アゾリン骨格導入酵素の基質ペプチドであって、その被修飾領域に以下のいずれかのアミノ酸を少なくとも1つ含むペプチドを合成する工程と
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
  
〔いずれの化合物においても、
　X1はSH、OH、NH2、SR1、OR1、NHR1、及びN3からなる群より選択される基を表し（R1は保護基を表す）、
　X2は、脱離しやすい基を表し、
　X3は、水素、又は置換基を有していてもよい炭素数1～10のアルキル基又はアリール基を表す。〕；
　前記基質ペプチドと、アゾリン骨格導入酵素とを反応させてアゾリン誘導体骨格を有するペプチドを得る工程と；
　前記アゾリン誘導体骨格を有するペプチドを、X2基のHX2脱離反応を誘導することで、アゾリン誘導体骨格をアゾール誘導体骨格に変換する工程と
を含む方法；
〔２〕前記X2は、Cl、Br、I、OTs、OMs、及びN+R2 3（R2は、水素、又は置換基を有していてもよい炭素数1～10のアルキル基及びアリール基から、それぞれ独立して選択される。）からなる群より選択される基である、上記〔１〕に記載の方法；
〔３〕前記アミノ酸が、下記式で表されるものである、上記〔１〕に記載の方法；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
  
〔式中、X1はOHであり、X2はCl、Br、又はIである。〕；
〔４〕前記脱離反応条件は、pH＞9である、上記〔１〕から〔３〕のいずれか１つに記載の方法；
〔５〕前記脱離反応は、80℃以上で行われる、上記〔１〕から〔４〕のいずれか１つに記載の方法；
〔６〕さらに、ペプチドを大環状化する工程を含む、上記〔１〕から〔５〕のいずれか１つに記載の方法；
〔７〕前記基質ペプチドが、リーダー配列を含まない、上記〔１〕から〔６〕のいずれか１つに記載の方法；
〔８〕前記基質ペプチドが、被修飾領域又は被修飾領域以外の領域に、少なくとも１つの非タンパク質性アミノ酸をさらに含む、上記〔１〕から〔７〕のいずれか１項に記載の方法；
〔９〕アゾール誘導体骨格を有するペプチドライブラリの製造方法であって：
　被修飾領域の配列が異なるアゾリン骨格導入酵素の基質ペプチドを2以上含む基質ペプチドライブラリであって、各基質ペプチドがその被修飾領域に以下のいずれかのアミノ酸を少なくとも1つ含む基質ペプチドライブラリをコードするmRNAライブラリを製造する工程と
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
  
〔いずれの化合物においても、
　X1はSH、OH、NH2、SR1、OR1、NHR1、及びN3からなる群より選択される基を表し（R1は保護基を表す）、
　X2は、脱離しやすい基を表し、
　X3は、水素、又は置換基を有していてもよい炭素数1～10のアルキル基又はアリール基を表す。〕；
　前記mRNAライブラリを無細胞翻訳系で翻訳し、基質ペプチドライブラリを得る工程と；
　前記基質ペプチドライブラリと、アゾリン骨格導入酵素とを反応させてアゾリン誘導体骨格を有するペプチドライブラリを得る工程と；
　前記アゾリン誘導体骨格を有するペプチドライブラリを、X2基の脱離反応を誘導することで、アゾリン誘導体骨格をアゾール誘導体骨格に変換してアゾール誘導体骨格を有するペプチドのライブラリを得る工程と
を含む方法；
〔１０〕前記X2は、Cl、Br、I、OTs、OMs、及びN+R2 3（R2は、水素、又は置換基を有していてもよい炭素数1～10のアルキル基及びアリール基から、それぞれ独立して選択される。）からなる群より選択される基である、上記〔９〕に記載の方法；
〔１１〕前記アミノ酸が、下記式で表されるものである、上記〔９〕に記載の方法；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
  
〔式中、X1はOHであり、X2はCl、Br、又はIである。〕；
〔１２〕前記脱離反応条件は、pH＞9である、上記〔９〕から〔１１〕のいずれか１つに記載の方法；
〔１３〕前記脱離反応は、80℃以上で行われる、上記〔９〕から〔１２〕のいずれか１つに記載の方法；
〔１４〕さらに、ペプチドを大環状化する工程を含む、上記〔９〕から〔１３〕のいずれか１つに記載の方法；
〔１５〕前記基質ペプチドが、リーダー配列を含まず、前記アゾリン骨格導入酵素にリーダー配列が結合している、上記〔９〕から〔１４〕のいずれか１つに記載の方法；
〔１６〕前記基質ペプチドが、被修飾領域又は被修飾領域以外の領域に、少なくとも１つの非タンパク質性アミノ酸をさらに含む、上記〔９〕から〔１５〕のいずれか１つに記載の方法；
〔１７〕前記mRNAライブラリを製造する工程において、前記mRNAライブラリの各mRNAの3'末端にピューロマイシンを結合させる工程を含み、
　前記基質ペプチドライブラリを得る工程で、mRNA結合基質ペプチドライブラリを得る、上記〔９〕から〔１６〕のいずれか１つに記載の方法；
〔１８〕標的物質に結合する、アゾール誘導体骨格を有するペプチドを同定するスクリーニング方法であって、
　上記〔９〕から〔１７〕のいずれか１つに記載の方法で製造されたアゾール誘導体骨格を有するペプチドライブラリと、標的物質とを接触させてインキュベートする工程と、
　前記標的物質に結合したアゾール誘導体骨格を有するペプチドを選択する工程と、を含む方法；
〔１９〕標的物質に結合する、アゾール誘導体骨格を有するペプチドを同定するスクリーニング方法であって、
　上記〔１７〕に記載の方法で製造されたアゾール誘導体骨格を有するmRNA結合ペプチドライブラリと、標的物質とを接触させてインキュベートする工程と、
　前記標的物質に結合したアゾール誘導体骨格を有するmRNA結合ペプチド群を回収する工程と、
　回収されたmRNA結合ペプチド群のmRNA部分から、逆転写反応によりcDNA群を得る工程と、
　前記cDNA群の3'末端にピューロマイシンを結合して翻訳し、mRNA結合ペプチドのライブラリを得る工程と、
を1回以上繰り返して、標的物質に結合する、アゾール誘導体骨格を有するペプチドを濃縮する工程と、を含む方法；及び
〔２０〕標的物質に結合する、アゾール誘導体骨格を有するペプチドを同定するスクリーニング方法であって、
　上記〔１７〕に記載の方法で製造されたアゾール誘導体骨格を有するmRNA結合ペプチドライブラリから、逆転写反応によりアゾール誘導体骨格を有するDNA結合ペプチドライブラリを得る工程と、
　前記アゾール誘導体骨格を有するDNA結合ペプチドライブラリと標的物質とを接触させてインキュベートする工程と、
　前記標的物質に結合したアゾール誘導体骨格を有するDNA結合ペプチド群を回収する工程し、DNA部分を増幅する工程と、
　前記増幅したDNA群の3'末端にピューロマイシンを結合して翻訳し、mRNA結合ペプチドのライブラリを得る工程と、
を1回以上繰り返して、標的物質に結合する、アゾール誘導体骨格を有するペプチドを濃縮する工程と、を含む方法
に関する。
　本発明に係る方法によれば、Cysに由来するアゾリン骨格に限らず、様々なアゾリン誘導体骨格をアゾール誘導体骨格に変換することができる。そのため、多様性の富んだアゾールペプチドライブラリを得ることが可能となるので、このライブラリを用いたスクリーニングにより、ペプチダーゼ耐性が向上し、標的結合能に優れ、金属や核酸に対する親和性が高く、生体膜透過性も向上したアゾールペプチドを得られる可能性を飛躍的に高めることができる。
図１は、Cl-Thr-DBE、Br-Thr-DBE、及びI-Thr-DBEの製造工程の概略を示す。 図２は、PatDの基質ペプチドの質量をMALDI-TOF-MSで測定した結果を示す。 図３は、基質ペプチドをPatDと反応させてアゾリン誘導体骨格を導入した後の質量をMALDI-TOF-MSで測定した結果を示す。 図４は、アゾリン誘導体骨格導入後のペプチドを、pH11で、95℃で1時間反応させた後の質量をMALDI-TOF-MSで測定した結果を示す。 図５は、アゾリン誘導体骨格導入後のペプチドを、pH9又はpH11で、95℃で1時間反応させた後の質量をMALDI-TOF-MSで測定した結果を示す。 図６は、アゾリン誘導体骨格導入後のペプチドを、pH11で、60℃で10分、30分又は1時間反応させた後の質量をMALDI-TOF-MSで測定した結果を示す。 図７は、アゾリン誘導体骨格導入後のペプチドを、DBU存在下（10mM、100μM、又は1μM）で、95℃で30分反応させた後の質量をMALDI-TOF-MSで測定した結果を示す。 図８は、アゾリン誘導体骨格導入後のペプチドを、Ag+存在下で、pH7.5、9、又は10とし、95℃で30分反応させた後の質量をMALDI-TOF-MSで測定した結果を示す。 図９は、アゾリン誘導体骨格導入後のペプチドを、PatGと反応させた後の質量をMALDI-TOF-MSで測定した結果を示す。 図１０は、pat遺伝子群と、その生合成経路の概略を示す。
　本発明はアゾール誘導体骨格を有するペプチドの製造方法を提供する。本発明に係る、アゾール誘導体骨格を有するペプチド（「アゾールペプチド」と呼ぶ場合もある。）とは、以下のアゾール骨格及びその誘導体(I)～(III)のいずれかを少なくとも1つ主鎖骨格に有するペプチドをいう。式中、Xは、S、O、又はNHを表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
  
（アゾリン骨格導入酵素の基質ペプチドの合成）
　本発明に係るアゾールペプチドの製造方法は、アゾリン骨格導入酵素の基質ペプチドであって、その被修飾領域に以下のアミノ酸(I)～(IV)のいずれかを少なくとも1つ含むペプチドを合成する工程を含む。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
  
〔いずれの化合物においても、
　X1はSH、OH、NH2、SR1、OR1、NHR1、及びN3からなる群より選択される基を表し（R1は保護基を表す。）、
　X2は、脱離しやすい基を表し、
　X3は、水素、又は置換基を有していてもよい炭素数1～10のアルキル基又はアリール基を表す。〕
　本明細書において「アゾリン骨格導入酵素」とは、基質となるペプチドのCys残基、Ser残基、Thr残基、又はこれらの誘導体等に、上述したアゾリン誘導体骨格を導入する酵素をいい、PatD及びこれと相同性を有する酵素を含む。PatDと相同性を有する酵素としては、例えば、Leeらの報告（Lee, S. W. et al., PNAS vol.105, No.15, 5879-5884, 2008）に含まれるものを用いることができるが、これらに限定されない。また、アゾリン骨格導入酵素は、アゾリン誘導体骨格を導入する活性を有する限り、その変異体であってもよい。
　本明細書において「アゾリン骨格導入酵素の基質ペプチド」とは、アゾリン骨格導入酵素の基質となることができ、そのいずれかのアミノ酸残基にアゾリン誘導体骨格が導入されるペプチドをいう。
　本発明に係るアゾリン骨格導入酵素の基質ペプチドの「被修飾領域」は、カセット領域とも呼ばれ、天然のPatEペプチドの超可変領域に相当するが、特許文献１に示されるとおり、2～40アミノ酸の任意の配列とすることができる。被修飾領域のアミノ酸の数は、例えば、2以上とすることができ、10以下、12以下、14以下、16以下、18以下、20以下、30以下、又は40以下とすることができる。
　アゾリン骨格導入酵素の基質ペプチドは、被修飾領域に上記アミノ酸(I)～(IV)を少なくとも1つ含む。被修飾領域には、アミノ酸(I)～(IV)が2以上含まれていてもよい。2以上含まれている場合、同一のアミノ酸であっても異なるアミノ酸であってもよく、隣接していても、離れていてもよい。
　特許文献１に示されるとおり、アゾリン骨格導入酵素で修飾されるアミノ酸残基は、被修飾領域のどこに含まれていてもよいから、アミノ酸(I)～(IV)も被修飾領域のどの位置にあってもよい。例えば、アミノ酸(I)～(IV)は、被修飾領域のN末端から偶数番目に配置してもよい。また、アミノ酸(I)～(IV)のN末端側に、親水性アミノ酸（Asp、Glu、Arg、Lys、Asn、Gln、又はこれらの親水性誘導体）が隣接しないように配置してもよい。
　アミノ酸(I)～(IV)において、X1は、SH、OH、NH2、SR1、OR1、NHR1、及びN3からなる群より選択される基を表す。R1は保護基を示す。保護基は、当業者が公知のものから適宜選択することができるが、例えば、ヒドロキシ基の保護基としては、メチル基、ベンジル基、p-メトキシベンジル基、tert-ブチル基、トリメチルシリル基などのトリアルキルシリル基、メトキシメチル基、テトラヒドロピラニル基、o-ニトロベンジル基等、アミノ基の保護基としては、t-ブトキシカルボニル基（Boc）、ベンジルオキシカルボニル基（Cbz）、フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Fmoc）、o-ニトロベンゾイル基、ペンテノイル基等、チオール基の保護基としては、t-ブチル基、ヒドロキシエチルスルフィド基などのジスルフィド保護基、トリフェニルメチル基等が挙げられるがこれらに限定されない。アミノ酸(I)～(IV)がR1を含む場合、基質ペプチドを合成する工程の後、基質ペプチドとアゾリン骨格導入酵素とを反応させる前に脱保護する。脱保護は、保護基の種類に応じて、当業者が適宜行うことができる。
　アミノ酸(I)～(IV)において、X2は、適切な化学処理により脱離しやすい基である限り特に限定されず、当業者が適宜選択することができる。X2の例としては、Cl、Br、I、F、トシル基（OTs）、メシル基（OMs）、ジアゾニウム基（N2 +）、トリフルオロメタンスルホン基（OSO2CF3）、及びN+R2 3が挙げられる。N+R2 3の3つのR2は、水素もしくは、置換基を有していてもよい炭素数1～10のアルキル基及びアリール基から、それぞれ独立に選択される。炭素数は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10のいずれであってもよい。置換基としては、ハロゲン原子、シアノ基、ヒドロキシ基、ニトロ基、アミノ基、アルキル基、アリール基、アルケン基、アルキン基、アジド基などが挙げられるがこれらに限定されない。
　アミノ酸(I)～(IV)において、X3は、水素、又は置換基を有していてもよい炭素数1～10のアルキル基及びアリール基から、それぞれ独立に選択される。炭素数は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10のいずれであってもよい。置換基としては、ハロゲン原子、シアノ基、ヒドロキシ基、ニトロ基、アミノ基、アルキル基、アリール基、アルケン基、アルキン基、アジド基などが挙げられるがこれらに限定されない。
　アミノ酸(I)～(IV)の具体例としては、アミノ酸(I)において、X1がOHであり、X2がCl、Br、又はIであるハロスレオニンが挙げられる。
　一態様において、アゾリン骨格導入酵素の基質ペプチドは、天然のPatE同様に、N末端から順に、リーダー配列、認識配列1、被修飾領域、認識配列2を含むペプチドとすることができる。
　リーダー配列は、天然のPatEにおいては、以下のアミノ酸配列を有する。
　MNKKNILPQQGQPVIRLTAGQLSSQLAELSEEALGDA（配列番号：１）
　本発明におけるアゾリン骨格導入酵素の基質ペプチドにおいても、リーダー配列としてこの配列を用いてもよい。
　また、特許文献１に示すとおり、PatDは、従来リーダー配列として知られるPatEのリーダー配列とは異なる配列を用いても、基質ペプチドにアゾリン骨格を導入しうる。このような配列としては、別のペプチド由来（Lacticin481前駆体）のMKEQNSFNLLQEVTESELDLILGA（配列番号：２）、ヒトアクチン由来のMILASLSTFQQMWISKQEYDEAGDA（配列番号：３）、PatEのリーダー配列をシャッフルしたMELQLRPSGLEKKQAPISELNIAQTQGGDSQVLALNA（配列番号：４）などが挙げられる。
　本発明におけるアゾリン骨格導入酵素の基質ペプチドにおいても、リーダー配列は、基質ペプチドにアゾリン誘導体骨格が導入される限り特に限定されないが、これらの配列を用いてもよい。
　リーダー配列としては、上述の各配列のうち、連続した4アミノ酸以上、5アミノ酸以上、または6アミノ酸以上の部分からなるものであってもよい。
　特許文献１に示すとおり、リーダー配列は基質ペプチドに含まれていなくてもよい。したがって、一態様において、アゾリン骨格導入酵素の基質ペプチドは、N末端から順に、認識配列1、被修飾領域、認識配列2を含むペプチドとすることができる。
　この場合、基質ペプチドとアゾリン骨格導入酵素とを反応させるときに、リーダー配列を有するペプチドを独立したペプチドとして加えてもよい。また、リーダー配列を、アゾリン骨格導入酵素に結合させておいてもよい。この場合、リーダー配列は、アゾリン骨格導入酵素のどこに結合していてもよいが、N末端に結合させることが望ましい。リーダー配列が結合したアゾリン骨格導入酵素は、公知の方法又はそれに準ずる方法で作製することができる。例えば、これをコードする核酸を合成し、融合ペプチドとして大腸菌等で発現させて得ることができる。
　認識配列1及び2は、0～10アミノ酸からなるアゾリン骨格導入酵素による認識配列をいい、アゾリン骨格導入酵素がこれを認識してアゾリン誘導体骨格を導入する限り、どのような配列であってもよい。アゾリン骨格導入酵素がPatDである場合、認識配列1としては、例えば、G（A/L/V）（G/E/D）（A/P）（S/T/C）（配列番号：５）を用いることができ、例えば、GLEAS（配列番号：６）としてもよい。アゾリン骨格導入酵素による認識配列2としては、（A/S）Y（D/E）G（A/L/V）（配列番号：７）含むものを用いることができる。例えば、AYDGVEPS（配列番号：８）、AYDGV（配列番号：９）、AYDGVGSGSGS（配列番号：１０）、AYDGVGGGGGG（配列番号：１１）、AYDGVEGSGSGS（配列番号：１２）としてもよく、GGGGG（配列番号：１３）やQQQQQ（配列番号：１４）やLLLLL（配列番号：１５）やPPPPP（配列番号：１６）などの配列を用いてもよい。
　特許文献１に示すとおり、認識配列1及び／又は2がなくてもアゾリン骨格導入酵素の基質となりうるので、認識配列1及び2は、基質ペプチドの任意の構成要素である。
　一態様において、アゾリン骨格導入酵素の基質ペプチドは、リーダー配列と認識配列1の間、認識配列1と被修飾領域との間、被修飾領域と認識配列2のそれぞれの間に、リンカー配列を含んでいてもよい。
　一態様において、アゾリン骨格導入酵素の基質ペプチドは、被修飾領域を2以上含んでいてもよい。被修飾領域が2つの場合、基質ペプチドは、例えば、N末端からリーダー配列、認識配列1、被修飾領域1、認識配列2、被修飾領域2、認識配列3とすることができる。
　本明細書において「アミノ酸」は、その最も広い意味で用いられ、天然アミノ酸に加え、その誘導体や人工のアミノ酸を含む。本明細書においてアミノ酸としては、天然タンパク性L-アミノ酸；非天然アミノ酸；アミノ酸の特徴である当業界で公知の特性を有する化学的に合成された化合物などが挙げられる。非天然アミノ酸の例として、主鎖の構造が天然型と異なる、α,α-二置換アミノ酸（α-メチルアラニンなど）、N-アルキル-α-アミノ酸、D-アミノ酸、β-アミノ酸、α-ヒドロキシ酸や、側鎖の構造が天然型と異なるアミノ酸（ノルロイシン、ホモヒスチジンなど）、側鎖に余分のメチレンを有するアミノ酸（「ホモ」アミノ酸、ホモフェニルアラニン、ホモヒスチジンなど）及び側鎖中のカルボン酸官能基アミノ酸がスルホン酸基で置換されるアミノ酸（システイン酸など）が挙げられるがこれに限定しない。
　本明細書においてアミノ酸は、慣用的な一文字表記又は三文字表記で示される場合もある。一文字表記又は三文字表記で表されたアミノ酸は、それぞれの変異体や誘導体を含む場合もある。
　基質ペプチドには、その被修飾領域又は被修飾領域以外の領域に、非タンパク質性アミノ酸をさらに含んでいてもよい。かかる非タンパク質性アミノ酸としては、以下のものが挙げられるがこれらに限定されない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000029
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000030
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000031
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000032
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000033
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000034
  
　上述した「アゾリン骨格導入酵素の基質ペプチド」の合成方法は特に限定されず、液相法、固相法、液相法と固相法を組み合わせたハイブリッド法等の化学合成法、遺伝子組み換え法、無細胞翻訳系による合成等、公知の方法又はそれに準ずる方法を用いることができる。
　例えば、基質ペプチドは、基質ペプチドをコードする核酸を調製し、当該核酸を無細胞翻訳系で翻訳合成する方法で得ることができる。基質ペプチドをコードする核酸は、生体の翻訳系で用いられる遺伝暗号、リプログラミングした遺伝暗号、又はこれらの組み合わせを用いて、当業者が適宜設計することができる。なお、本明細書において「核酸」は、DNAであってもRNAであってもよい。
　ここで、無細胞翻訳系と本発明者らが開発した人工アミノアシル化RNA触媒フレキシザイム（Flexizyme）を利用することで、mRNAのトリプレットからなる遺伝暗号が、生体の翻訳系とは異なるアミノ酸をコードするように、リプログラミングすることができる（WO2008/059823）ので、非天然のアミノ酸(I)～(IV)も翻訳によってペプチドに取り込むことが出来る。以下に詳細に説明する。
　フレキシザイム（Flexizyme）は、任意のtRNAに任意のアミノ酸またはヒドロキシ酸を連結（アシル化）することのできる人工RNA触媒（アシルtRNA合成酵素様活性を持つRNA触媒）である。再構成型の翻訳系において、天然のアミノアシルtRNA合成酵素に合成されるアミノアシルtRNAに代えて、フレキシザイムを用いれば、天然の遺伝暗号とは異なる、所望のアミノ酸又はヒドロキシ酸を任意のコドンと対応させることができる。
　フレキシザイムとしては、例えば、以下の文献に記載されたものが公知である：H. Murakami, H. Saito, and H. Suga, (2003), Chemistry & Biology, Vol. 10, 655-662； H. Murakami, D. Kourouklis, and H. Suga, (2003), Chemistry & Biology, Vol. 10, 1077-1084； H. Murakami, A. Ohta, H. Ashigai, H. Suga (2006) Nature Methods 3, 357-359；N. Niwa, Y. Yamagishi, H. Murakami, H. Suga (2009) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 19, 3892-3894；及びWO2007/066627「多目的化アシル化触媒とその用途」）。フレキシザイムは、原型のフレキシザイム（Fx）、及び、これから改変されたジニトロベンジルフレキシザイム（dFx）、エンハンスドフレキシザイム（eFx）、アミノフレキシザイム（aFx）等の呼称でも知られる。
　なお、任意のtRNAに任意のアミノ酸を連結する方法は、フレキシザイムを用いる方法に限られず、その他の方法も本発明に適用可能である。
　遺伝暗号のリプログラミングには、翻訳系の構成因子を目的に合わせて自由に取り除き、必要な成分だけを再構成してできる翻訳系を利用できる。例えば、特定のアミノ酸を除去した翻訳系を再構成すると、当該アミノ酸に対応するコドンが空きコドンになる。そこで、フレキシザイム等を利用して、当該空きコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAに任意のアミノ酸を連結し、これを加えて翻訳を行う。これによって、当該任意のアミノ酸が当該空きコドンでコードされることになり、除去したアミノ酸の代わりに当該任意のアミノ酸が導入されたペプチドが翻訳される。
　この方法により、上記アミノ酸(I)～(IV)や、後述する大環状化のための官能基1及び2を、任意のコドンに割り当て、翻訳によってペプチドに導入することができる。
　無細胞翻訳系としては、大腸菌抽出液や小麦胚芽抽出液を用いることができる。他に、ウサギ赤血球抽出液や昆虫細胞抽出液を用いてもよい。また、それぞれ精製したリボソームタンパク質、アミノアシルtRNA合成酵素（ARS）、リボソームRNA、アミノ酸、rRNA、GTP、ATP、翻訳開始因子（IF）伸長因子（EF）、終結因子（RF）、およびリボソーム再生因子（RRF）、ならびに翻訳に必要なその他の因子を再構成することで構築した、再構成型の無細胞翻訳系を用いても良い。
　DNAからの転写を併せて行うためにRNAポリメラーゼを含む系としてもよい。市販されている無細胞翻訳系として、大腸菌由来の系としてはロシュ・ダイアグノスティックス社のRTS-100（登録商標）、再構成型翻訳系としてはPGI社のPURESYSTEM（登録商標）やNew England BioLabs社のPURExpressR In Vitro Protein Synthesis Kit等、小麦胚芽抽出液を用いた系としてはゾイジーン社やセルフリーサイエンス社のもの等を使用できる。
　また、大腸菌のリボソームを用いる系として、例えば次の文献に記載された技術が公知である：H. F. Kung et al., 1977. The Journal of Biological Chemistry Vol. 252, No. 19, 6889-6894; M. C. Gonza et al., 1985, Proceeding of National Academy of Sciences of the United States of America Vol. 82, 1648-1652; M. Y. Pavlov and M. Ehrenberg, 1996, Archives of Biochemistry and Biophysics Vol. 328, No. 1, 9-16; Y. Shimizu et al., 2001, Nature Biotechnology Vol. 19, No. 8, 751-755; H. Ohashi et al., 2007, Biochemical and Biophysical Research Communications Vol. 352, No. 1, 270-276。
　無細胞翻訳系によれば、発現産物を精製することなく純度の高い形で得ることができる。
（基質ペプチドと、アゾリン骨格導入酵素との反応）
　本発明に係るアゾールペプチドの製造方法は、次に、基質ペプチドと、アゾリン骨格導入酵素とを反応させて、アゾリン誘導体骨格を有するペプチドを得る工程を含む。
　本明細書において、アゾリン誘導体骨格を有するペプチド（「アゾリンペプチド」と呼ぶ場合もある。）とは、以下のアゾリン骨格もしくはその誘導体のいずれかを少なくとも1つ主鎖骨格に有するペプチドをいう。式中、Xは、S、O、又はNHを表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
  
　この工程で使用するアゾリン骨格導入酵素は、当該酵素を産生する微生物から抽出・精製したものであってもよいし、遺伝子組換え法によって発現させたものであってもよい。また、アゾリン誘導体骨格を導入する限り、その変異体であってもよい。
　基質ペプチドとアゾリン骨格導入酵素との反応は、上述した基質ペプチドを発現させたのと同じ容器内で、即ちone potで、基質ペプチドを精製することなくアゾリン骨格導入酵素を添加して行ってもよいし、別の容器で基質ペプチドを精製してからアゾリン骨格導入酵素と反応させてもよい。
　基質ペプチドと、アゾリン骨格導入酵素との反応は、例えば、アゾリン骨格導入酵素がPatDの場合、終濃度0.1μM～50μM、反応温度4℃～45℃、反応時間5分～100時間等の範囲において、当業者が適宜条件を選択して行うことができる。
　基質ペプチドにリーダー配列が含まれていない場合、リーダー配列を結合したアゾリン骨格導入酵素と、基質ペプチドとを反応させてもよい。また、基質ペプチドにリーダー配列が含まれておらず、且つアゾリン骨格導入酵素にリーダー配列が結合していない場合、この工程で、反応系にリーダー配列を独立したペプチドとして加えてもよい。
　アゾリン骨格導入酵素の反応により、基質ペプチドのアミノ酸(I)～(IV)残基に、アゾリン骨格が導入される。アゾリン誘導体骨格が導入されたことの確認は、例えば、MALDI-TOF-MSを用いて質量変化を測定することにより行うことができる。
（アゾリン誘導体骨格のアゾール環への変換）
　本発明に係るアゾールペプチドの製造方法は、次に、アゾリン誘導体骨格を有するペプチドにおいてX2基の脱離反応を誘導することで、アゾリン誘導体骨格をアゾール誘導体骨格に変換する工程を含む。
　本明細書において、脱離反応条件は、アゾリン誘導体骨格がアゾール誘導体骨格に変換される限り特に限定されないが、例えば、pH＞9としてもよく、pH＝約9.5以上、pH＝約10以上、pH＝約10.5以上、pH＝約11以上、pH＝約11.5以上、の条件が挙げられる。
　塩基性条件は、例えば、塩基性溶液（例えば、KOH）や塩基性緩衝液を加えることによって調整することができる。
　脱離反応の際の温度も、アゾリン誘導体骨格がアゾール誘導体骨格に変換される限り特に限定されないが、例えば、約60℃以上、約65℃以上、約70℃以上、約75℃以上、約80℃以上、約85℃以上、約90℃以上、約95℃以上、約98℃以上等とすることができる。
　反応時間も、当業者が適宜選択することができるが、例えば、10分以上、20分以上、30分以上、40分以上、50分以上、60分以上、70分以上等とすることができる。
　X2の脱離反応により、脱離によって生じた二重結合の異性化を経て、アミノ酸(I)～(IV)部位に、アゾール誘導体骨格が形成される。本発明の方法によれば、このように非酵素的な方法でアゾール誘導体骨格を導入することから、アゾール誘導体骨格への変換がCys由来のチアゾールに限定されず、多様なアゾールペプチドを得ることができる。
　アゾール環に変換されたことの確認は、例えば、MALDI-TOF-MSを用いて質量変化を測定することにより行うことができる。
（大環状化）
　本発明に係るアゾールペプチドの製造方法では、さらに、アゾールペプチドを大環状化する工程を含んでいてもよい。
　大環状化の方法は特に限定されないが、例えば、アゾールペプチドに、以下の官能基1を有するアミノ酸と、対応する官能基2を有するアミノ酸を導入することにより行うことができる。官能基1と官能基2は、どちらがN末端側にきてもよい。例えば、アゾールペプチドにおける被修飾領域のN末端側に官能基1を配置し、C末端側に官能基2を配置することにより、アゾール誘導体骨格が大環状部分に含まれるアゾールペプチドを得ることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000037
  
　式中、X1はCl、Br又はIであり、Arは置換基を有していてもよい芳香環である。
　（A－1）のアミノ酸としては、例えば、クロロアセチル化したアミノ酸を用いることができる。クロロアセチル化アミノ酸としては、N-chloroacetyl-L-alanine、N-chloroacetyl-L-phenylalanine、N-chloroacetyl-L-tyrosine、N-chloroacetyl-L-tryptophan、N-3-(2-chloroacetamido)benzoyl-L-phenylalanine、N-3-(2-chloroacetamido)benzoyl-L-tyrosine、N-3-(2-chloroacetamido)benzoyl-L-tryptophane、β-N-chloroacetyl-L-diaminopropanoic acid、γ-N-chloroacetyl-L-diaminobutyric acid、σ-N-chloroacetyl-L-ornithine、ε-N-chloroacetyl-L-lysine、およびこれらに対応するD-アミノ酸誘導体などが挙げられる。
　（A－2）のアミノ酸としては、例えばcysteine、homocysteine、mercaptonorvaline、mercaptonorleucine、2-amino-7-mercaptoheptanoic acid、2-amino-8- mercaptooctanoic acid、およびこれらのアミノ酸のSH基をいったん保護しておいた後に保護基を脱保護したアミノ酸、およびこれらに対応するD-アミノ酸誘導体などが挙げられる。
　環状化方法は、例えば、Kawakami, T. et al., Nature Chemical Biology 5, 888-890 (2009)；Yamagishi, Y. et al., ChemBioChem 10, 1469-1472 (2009)；Sako, Y. et al., Journal of American Chemical Society 130, 7932-7934 (2008)；Goto, Y. et al., ACS Chemical Biology 3, 120-129 (2008)；Kawakami T. et al, Chemistry & Biology 15, 32-42 (2008)、WO2008/117833に記載された方法に従って行うことができる。
　（B－1）のアミノ酸としては、例えば、propargylglycine、homopropargylglycine、2-amino-6-heptynoic acid、2-amino-7-octynoic acid、2-amino-8-nonynoic acidを用いることができる。また、4-pentynoyl化や5-hexynoyl化したアミノ酸を用いることもできる。4-pentynoyl化アミノ酸としては、N-(4-pentenoyl)-L-alanine、N-(4-pentenoyl)-L-phenylalanine、N-(4-pentenoyl)-L-tyrosine、N-(4-pentenoyl)-L-tryptophan、N-3-(4-pentynoylamido)benzoyl-L-phenylalanine、N-3-(4-pentynoylamido)benzoyl-L-tyrosine、N-3-(4-pentynoylamido)benzoyl-L-tryptophane、β-N-(4-pentenoyl)-L-diaminopropanoic acid、γ-N-(4-pentenoyl)-L-diaminobutyric acid、σ-N-(4-pentenoyl)-L-ornithine、ε-N-(4-pentenoyl)-L-lysine、およびこれらに対応するD-アミノ酸誘導体などが挙げられる。
　（B－2）のアミノ酸としては、例えば、azidoalanine、2-amino-4-azidobutanoic acid、azidoptonorvaline、 azidonorleucine、2-amino-7-azidoheptanoic acid、2-amino-8-azidooctanoic acidを用いることができる。また、azidoacetyl化や3-azidopentanoyl化したアミノ酸を用いることもできる。azidoacetyl化アミノ酸としては、N-azidoacetyl-L-alanine、N-azidoacetyl-L-phenylalanine、N-azidoacetyl-L-tyrosine、N-azidoacetyl-L-tryptophan、N-3-(4-pentynoylamido)benzoyl-L-phenylalanine、N-3-(4-pentynoylamido)benzoyl-L-tyrosine、N-3-(4-pentynoylamido)benzoyl-L-tryptophane、β-N-azidoacetyl-L-diaminopropanoic acid、γ-N-azidoacetyl-L-diaminobutyric acid、σ-N-azidoacetyl-L-ornithine、ε-N-azidoacetyl-L-lysine、およびこれらに対応するD-アミノ酸誘導体などが挙げられる。
　環状化方法は、例えば、Sako, Y. et al., Journal of American Chemical Society 130, 7932-7934 (2008)、WO2008/117833に記載された方法に従って行うことができる。
　（C－1）のアミノ酸としては、N-(4-aminomethyl-benzoyl)-phenylalanine (AMBF)、4-3-aminomethyltyrosineなどが挙げられる。
　（C－2）のアミノ酸としては、5-hydroxytryptophan (WOH) などが挙げられる。
　環状化方法は、例えば、Yamagishi, Y. et al., ChemBioChem 10, 1469-1472 (2009)、WO2008/117833に記載された方法に従って行うことができる。
　（D－1）のアミノ酸としては、例えば、2-amino-6-chloro-hexynoic acid、2-amino-7-chloro-heptynoic acid、2-amino-8-chloro-octynoic acid、などが挙げられる。
　（D－2）のアミノ酸としては、例えばcysteine、homocysteine、mercaptonorvaline、mercaptonorleucine、2-amino-7-mercaptoheptanoic acid、2-amino-8- mercaptooctanoic acid、およびこれらのアミノ酸のSH基をいったん保護しておいた後に保護基を脱保護したアミノ酸、およびこれらに対応するD-アミノ酸誘導体などが挙げられる。
　環状化方法は、例えば、WO2012/074129に記載された方法に従って行うことができる。
　（E－1）のアミノ酸としては、例えば、N-3-chloromethylbenzoyl-L-phenylalanine、N-3-chloromethylbenzoyl-L-tyrosine、N-3-chloromethylbenzoyl-L-tryptophane、およびこれらに対応するD-アミノ酸誘導体などが挙げられる。
　（E－2）のアミノ酸としては、例えばcysteine、homocysteine、mercaptonorvaline、mercaptonorleucine、2-amino-7-mercaptoheptanoic acid、2-amino-8- mercaptooctanoic acid、およびこれらのアミノ酸のSH基をいったん保護しておいた後に保護基を脱保護したアミノ酸、およびこれらに対応するD-アミノ酸誘導体などが挙げられる。
　大環状化工程は、典型的には、アゾリン誘導体骨格をアゾール誘導体骨格に変換した後に行われるが、アゾリン骨格導入酵素の基質ペプチドを合成する工程の後、どの段階で行ってもよい。
（リーダー配列の切断）
　本発明に係るアゾールペプチドの製造方法では、基質ペプチドにリーダー配列が含まれている場合、リーダー配列を切断する工程を行ってもよい。これにより、アゾールペプチドから余分な部分が除去され、標的物質と結合しやすくなることがある。
　リーダー配列の切断も、例えば、アゾリン骨格導入酵素の反応を行ったのと同じ容器内に、ペプチダーゼを加えることによって行うことができる。
　リーダー配列の切断は、リーダー配列、認識配列1、リーダー配列と認識配列1の間、認識配列1と被修飾領域の間のいずれを切断して行ってもよく、切断する部位の配列に応じてペプチダーゼが選択される。ペプチダーゼとしては、トリプシン、Glu-C、Lys-C、Asp-N、Lys-N、Arg-C、トロンビン、Factor Xa、prescission protease、TEV protease、エンテロキナーゼ、HRV 3C Protease等が挙げられるがこれらに限定されない。
　一例として、基質ペプチドが認識配列1としてGLEASを含む場合、エンドプロテイナーゼGlu-Cを用いて、GluとAlaの間で切断することが可能である。Glu-Cによる切断は、公知の方法に従って行うことができる。
　リーダー配列の切断は、典型的には、アゾリン誘導体骨格をアゾール誘導体骨格に変換する工程の後で行われる。例えば、アゾリン誘導体骨格をアゾール誘導体骨格に変換する工程の後、リーダー配列を切断してから大環状化を行ってもよい。
（アゾールペプチドライブラリの製造方法）
　本発明は、アゾールペプチドのライブラリの製造方法も包含する。
　本明細書において、アゾールペプチドのライブラリとは、被修飾領域の配列が異なるアゾールペプチドを含むライブラリをいう。
　本発明に係るアゾールペプチドライブラリの製造方法では、まず、アゾリン骨格導入酵素の基質ペプチドのライブラリを製造する。各基質ペプチドの被修飾領域は互いに異なり、また、各被修飾領域には少なくとも1つのアミノ酸(I)～(IV)が含まれている。基質ペプチドライブラリを製造する工程は、基質ペプチドライブラリをコードするmRNAライブラリを製造する工程と、mRNAライブラリを無細胞翻訳系で翻訳し、基質ペプチドライブラリを得る工程と、を含む。
　かかるmRNAライブラリは、当業者が公知の方法に従って作製することができる（例えば、特許文献１）。
　例えば、再構成翻訳系からMetを除くと、これをコードするATGが空きコドンとなるので、当該空きコドンにアミノ酸(I)～(IV)のいずれかを割り当てることができる。そして、基質ペプチドをコードするmRNAのうち、被修飾領域をコードする部分を、NNN、NNK、NNT、又はNNG（NはA、C、G、又はT；KはG又はTを表す。）と、ATGとで構成することにより、被修飾領域がランダムな配列であって、必ずアミノ酸(I)～(IV)のいずれかを含む基質ペプチドを合成することができる。
　あるいは、WST（WはA又はT、SはC又はGを表す。）をアミノ酸(I)～(IV)のためのコドンとして、基質ペプチドをコードするmRNAのうち、被修飾領域をコードする部分を、NNN、NNK、NNT、又はNNGと、WSTとで構成することにより、4種類の非天然アミノ酸を被修飾領域にランダムに導入し、且つ、被修飾領域のその他のアミノ酸をランダムな配列とすることができる。
　mRNAライブラリのその他の配列は、リーダー配列、認識配列、リーダー配列を切断するためのプロテアーゼ認識部位、大環状化のための官能基1及び2等の配置を考慮して設計することができる。
　mRNAライブラリを無細胞翻訳系で翻訳し、基質ペプチドライブラリを得る工程、基質ペプチドライブラリと、アゾリン骨格導入酵素とを反応させてアゾリン誘導体骨格を有するペプチドライブラリを得る工程、アゾリン誘導体骨格を有するペプチドライブラリを、X2基の脱離反応を誘導することで、アゾリン誘導体骨格をアゾール誘導体骨格に変換してアゾール誘導体骨格を有するペプチドのライブラリを得る工程は、上述したアゾールペプチドの製造方法に準じて行うことができる。
　一態様において、本発明のアゾールペプチドライブラリの製造方法は、基質ペプチドライブラリをコードするmRNAライブラリを製造する工程の後、翻訳工程に先立って、mRNAライブラリの各mRNAの3'末端にピューロマイシンを結合させる。ピューロマイシンをmRNAに結合させる方法は特に限定されないが、例えば、各mRNAの3'末端の配列にハイブリダイズできるDNAにピューロマイシンを結合させたピューロマイシンリンカーを用いることができる。
　これにより、mRNAライブラリを翻訳すると、mRNAと基質ペプチドが結合したmRNA－基質ペプチド複合体ライブラリが得られ、さらに、これをアゾリン骨格導入酵素と反応させ、塩基性条件下で加熱することにより、mRNAとアゾールペプチドが結合したmRNA－アゾールペプチド複合体ライブラリが得られる。
　この方法で、アゾールペプチドを、mRNAディスプレイ（Nemoto, N. et al., FEBS Lett. 1997, 405－408; Roberts, R.W. and Szostak, J.W. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94,12297－12302）に応用することができる。
（スクリーニング方法）
　本発明は、アゾールペプチドライブラリを用いて、標的物質に結合するアゾールペプチドを同定するスクリーニング方法も包含する。
　一態様において、本発明のスクリーニング方法は、本発明に係る方法で製造されたアゾールペプチドライブラリと、標的物質を接触させてインキュベートする工程を含む。
　本明細書において「標的物質」は特に限定されず、低分子化合物、高分子化合物、核酸、ペプチド、タンパク質、糖、脂質等とすることができる。特に、本発明のライブラリによれば、標的物質がプロテアーゼ活性を有するタンパク質である場合にも用いることができる。
　標的物質は、固相担体に固定して、本発明のライブラリと接触させてもよい。本明細書において、「固相担体」は、標的物質を固定できる担体であれば特に限定されず、ガラス製、金属性、樹脂製等のマイクロタイタープレート、基板、ビーズ、ニトロセルロースメンブレン、ナイロンメンブレン、PVDFメンブレン等が挙げられ、標的物質は、これらの固相担体に公知の方法に従って固定することができる。
　標的物質と、ライブラリは、適宜選択された緩衝液中で接触させ、pH、温度、時間等を調節して相互作用させる。
　本発明のスクリーニング方法は、次に、標的物質と結合したアゾールペプチドを選択する工程をさらに含む。標的物質への結合は、例えば、ペプチドを検出可能に標識する公知の方法に従って標識しておき、上記インキュベート工程の後、緩衝液で固相担体表面を洗浄し、標的物質に結合している化合物を検出して行う。
　検出可能な標識としては、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等の酵素、125I、131I、35S、3H等の放射性物質、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ダンシルクロリド、フィコエリトリン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、近赤外蛍光材料等の蛍光物質、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、エクオリン等の発光物質、金コロイド、量子ドットなどのナノ粒子が挙げられる。酵素の場合、酵素の基質を加えて発色させ、検出することもできる。また、ペプチドにビオチンを結合させ、酵素等で標識したアビジン又はストレプトアビジンを結合させて検出することもできる。
　単に結合の有無又は程度を検出・測定するのみでなく、標的物質の活性の亢進又は阻害を測定し、かかる亢進活性又は阻害活性を有するアゾールペプチドを同定することも可能である。このような方法により、生理活性を有し、医薬として有用なヘテロ環化合物の同定も可能となる。
　mRNA－アゾールペプチド複合体ライブラリによれば、mRNAディスプレイ法を応用してスクリーニングを行うことができる。
　例えば、mRNA－アゾールペプチド複合体ライブラリと、当該ライブラリと固相単体に固定した標的物質とを接触させる。標的物質に結合したmRNA結合アゾールペプチドを回収し、そのmRNA部分から、逆転写反応によりcDNA群を得る。cDNA群を適宜増幅し、各cDNAの3'末端にピューロマイシンを結合して翻訳すると、mRNA－アゾールペプチド複合体ライブラリを再び得ることができる。このライブラリは、標的物質に対する親和性がより高いmRNA－アゾールペプチド複合体を含む。したがって、この工程を繰り返すことにより、標的物質への親和性が高いアゾールペプチドを濃縮することができる。
　また、別の態様として、mRNA－アゾールペプチド複合体ライブラリに対して逆転写反応を行った後、当該ライブラリと固相単体に固定した標的物質とを接触させる。標的物質に結合する複合体を回収し、このDNAをPCRで増幅する。このDNAを用いて、再度作製したmRNA－アゾールペプチド複合体ライブラリは、標的物質に対する親和性がより高いmRNA－アゾールペプチド複合体を含む。したがって、この工程を繰り返すことにより、標的物質への親和性が高いアゾールペプチドを濃縮することができる。
　また、濃縮されたmRNA－アゾールペプチド複合体から逆転写反応でcDNAを得れば、cDNAの塩基配列は常法により決定できるので、標的物質に結合するアゾールペプチドの配列を容易に知ることができる。
（スクリーニング用キット）
　本発明は、アゾールペプチドライブラリのスクリーニング用キットも提供する。
　本発明のスクリーニング用キットの一態様は、本発明に係る製造方法で製造されたアゾールペプチドライブラリを含む。
　本発明のスクリーニング用キットは、他に、標的物質とアゾールペプチドとの結合を検出するのに必要な試薬及び装置を含んでいてもよい。かかる試薬及び装置としては、例えば、固相担体、緩衝液、標識用試薬、酵素、酵素反応停止液、マイクロプレートリーダーが挙げられるがこれらに限定されない。
　本明細書において引用されるすべての特許文献及び非特許文献の開示は、全体として本明細書に参照により組み込まれる。
　以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。当業者は、本発明の意義を逸脱することなく様々な態様に本発明を変更することができ、かかる変更も本発明の範囲に含まれる。
１．基質ペプチドをコードするDNAの作製、及び基質ペプチドの翻訳合成
　特許文献１と同様の方法で、以下のアミノ酸配列を有する基質ペプチドをコードするDNAを作製した。
MNKKNILPQQGQPVIRLTAGQLSSQLAELSEEALGDAGLEASVXAYDGVEPS（配列番号：１７）
　Xは、以下の式中、X1がOH、X2がIであるアミノ酸の残基である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
  
　まず、I-Thr-DBEを製造した（DBE＝dinitro benzyl ester）。概略を図１に示す。続いて、Gotoらの方法（Nat. Protocols 6, 779-790（2011））にしたがって、Flexizymeにより、I-ThrをtRNAに結合させた。条件は、Flexizyme 25μM、microhelix 25μM、MgCl2 600mM、I-Thr-DBE 3mMとした。
　基質ペプチドの翻訳には、以下に示した配列のDNAを用いた。5'-GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAACAAGGAGAAAAAC[ATGAACAAGAAAAACATCCTGCCCCAACAAGGTCAACCGGTTATCCGCTTAACCGCAGGACAGTTGAGCTCGCAACTCGCCGAACTGTCTGAAGAAGCACTGGGCGACGCGGGGTTGGAGGCAAGCGTT"TGT"GCGTACGATGGCGTTGAGCCATCT]TAAGCTTCG-3'（配列番号：１８）5'-CGAAGCTTAAGATGGCTCAACGCCATCGTACGCACAAACGCTTGCCTCCAACCCCGCGTCGCCCAGTGCTTCTTCAGACAGTTCGGCGAGTTGCGAGCTCAACTGTCCTGCGGTTAAGCGGATAACCGGTTGACCTTGTTGGGGCAGGATGTTTTTCTTGTTCATGTTTTTCTCCTTGTTAAAGTTAACCCTATAGTGAGTCGTATTACGCC-3'（配列番号：１９）。
　センス鎖の配列のうち、[ ]に挟まれた配列はコーディング領域に、""に挟まれたTGTコドンはI-Thrを割り当てたコドンに、それぞれ相当する。
　次に、Kawakamiらの方法（Kawakami et al., Chemistry & Biology 15, 32-42 (2008)）に従って5.0μlスケールの無細胞タンパク質発現系で転写・翻訳した後（37℃、1時間）。
　c-18 tip（日京テクノス）を用いて、Wash Buffer（4% MeCN, 0.5% AcOH, 95.5%H2O）にてペプチドの脱塩を行い、Elute Buffer（80% MeCN, 0.5% AcOH, 19.5%H2O）にて脱塩後のペプチドを抽出した。抽出したペプチドは、Matrixとしてα-cyano-4-hydroxycinnamic acid もしくはsinapinic acidを用いて、MALDI-TOF-MSで質量を測定した。
　結果を図２に示す。
２．PatD酵素反応
　翻訳後の反応液（5μL）に、PatD、ATP、及びDTTを、それぞれ終濃度が、6μM、0.5mM、7.5mMとなるように加えて全量10μLとし、25℃で16時間反応させた。
　上述の方法で、質量を測定した結果を図３に示す。
　1分子の脱水に相当する分子量の減少が見られ、アゾリン誘導体骨格が導入されたことが確認された。
３．塩基性条件下での加熱
　次に、反応液に以下の塩基性緩衝液として500mM CAPS KOH (pH11)を加えて塩基性に調節し、95℃で1時間反応させた。
　上述の方法で、質量を測定した結果を図４に示す。
　HIの脱離に相当する分子量の減少が見られ、アゾール環が形成されものと解された。
４．脱離反応の条件の検討（１）
　上記３．において、以下の塩基性緩衝液を加えて、加熱反応を行った。
　　500mM CHES KOH (pH9)
　　500mM CAPS KOH (pH11)
　上述の方法で、質量を測定した結果を図５に示す。
　pH11の場合にHIの脱離に相当する分子量の減少が見られ、アゾール環が形成されものと解された。
５．脱離反応の条件の検討（２）
　上記３．において、温度を、95℃、60℃、及び42℃に変えて加熱反応を行ったが、60℃及び42℃では、HIの脱離に相当する分子量の減少は見られなかった。60℃の結果のみ、図６に示す。
６．脱離反応の条件の検討（３）
　上記３．において、500mM CAPS KOH (pH11)に代えて、ジアザビシクロウンデセン（DBU）の10mM、100μM、または1μM溶液10μLを加え、95℃で30分反応させた。
　結果を図７に示す。アゾリン誘導体骨格の導入は確認されたが、アゾール誘導体骨格には変換されなかった。Xとして、X2にBr又はClを含むアミノ酸でも同様の実験を行ったが、アゾール環は形成されなかった（データ示さず）。
７．脱離反応の条件の検討（４）
　上記３．において、500mM CAPS KOH (pH11)に代えて、10mM Ag+を10μL加え、pHを7.5、9、又は10に調節し、温度を95℃又は37℃として30分反応させた。95℃の結果を図８に示す。アゾール環の形成は認められなかった。37℃でも同様にアゾール環は形成されず、また、Xとして、X2にBr又はClを含むアミノ酸でも同様の実験を行ったが、アゾール環は形成されなかった（データ示さず）。
参考例：PatG酵素反応
　上記３．に代えて、PatG変異体による酵素反応を行った。PatD反応時に、PatGを加え、PatD、PatGの終濃度をそれぞれ1μM、2.9μMから5.3μMとして 25℃で16時間反応させた。続いて、終濃度1％となるようにトリフルオロ酢酸を加え、95℃で5分反応させた。
　上述の方法で、質量を測定した結果を図９に示す。PatGの反応による分子量の減少や、トリフルオロ酢酸による加水分解条件に耐性をもつピークは見られず（データ示さず）、アゾール環の形成は認められなかった。
　配列番号：１～４は、アゾリン骨格導入酵素の基質ペプチドにおけるリーダー配列のアミノ酸配列を示す。
　配列番号：５及び６は、アゾリン骨格導入酵素の基質ペプチドにおける認識配列1のアミノ酸配列を示す。
　配列番号：７～１６は、アゾリン骨格導入酵素の基質ペプチドにおける認識配列2のアミノ酸配列を示す。
　配列番号：１７は、実施例で用いた基質ペプチドのアミノ酸配列を示す。
　配列番号：１８及び１９は、基質ペプチドの翻訳に用いたセンス鎖及びアンチセンス鎖のアミノ酸配列を示す。

Claims (20)

  1. 　主鎖にアゾール誘導体骨格を有するペプチドの製造方法であって：
    　アゾリン骨格導入酵素の基質ペプチドであって、その被修飾領域に以下のいずれかのアミノ酸を少なくとも1つ含むペプチドを合成する工程と
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
      
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
      
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
      
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
      
    〔いずれの化合物においても、
    　X1はSH、OH、NH2、SR1、OR1、NHR1、及びN3からなる群より選択される基を表し（R1は保護基を表す）、
    　X2は、脱離しやすい基を表し、
    　X3は、水素、又は置換基を有していてもよい炭素数1～10のアルキル基又はアリール基を表す。〕；
    　前記基質ペプチドと、アゾリン骨格導入酵素とを反応させてアゾリン誘導体骨格を有するペプチドを得る工程と；
    　前記アゾリン誘導体骨格を有するペプチドを、X2基のHX2脱離反応を誘導することにより、アゾリン誘導体骨格をアゾール誘導体骨格に変換する工程と；
    を含む方法。
  2. 　前記X2は、Cl、Br、I、OTs、OMs、及びN+R2 3（R2は、水素、又は置換基を有していてもよい炭素数1～10のアルキル基及びアリール基から、それぞれ独立に選択される。）からなる群より選択される基である、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記アミノ酸が、下記式で表されるものである、請求項１に記載の方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
      
    〔式中、X1はOHであり、X2はCl、Br、又はIである。〕
  4. 　前記脱離反応条件は、pH＞9である、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　前記脱離反応は、80℃以上で行われる、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　さらに、ペプチドを大環状化する工程を含む、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 　前記基質ペプチドが、リーダー配列を含まない、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 　前記基質ペプチドが、被修飾領域又は被修飾領域以外の領域に、少なくとも１つの非タンパク質性アミノ酸をさらに含む、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 　主鎖にアゾール誘導体骨格を有するペプチドライブラリの製造方法であって：
    　被修飾領域の配列が異なるアゾリン骨格導入酵素の基質ペプチドを2以上含む基質ペプチドライブラリであって、各基質ペプチドがその被修飾領域に以下のいずれかのアミノ酸を少なくとも1つ含む基質ペプチドライブラリをコードするmRNAライブラリを製造する工程と
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
      
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
      
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
      
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
      
    〔いずれの化合物においても、
    　X1はSH、OH、NH2、SR1、OR1、NHR1、及びN3からなる群より選択される基を表し（R1は保護基を表す）、
    　X2は、脱離しやすい基を表し、
    　X3は、水素、又は置換基を有していてもよい炭素数1～10のアルキル基又はアリール基を表す。〕；
    　前記mRNAライブラリを無細胞翻訳系で翻訳し、基質ペプチドライブラリを得る工程と；
    　前記基質ペプチドライブラリと、アゾリン骨格導入酵素とを反応させてアゾリン誘導体骨格を有するペプチドライブラリを得る工程と；
    　前記アゾリン誘導体骨格を有するペプチドライブラリを、X2基の脱離反応を誘導することにより、アゾリン誘導体骨格をアゾール誘導体骨格に変換してアゾール誘導体骨格を有するペプチドのライブラリを得る工程と
    を含む方法。
  10. 　前記X2は、Cl、Br、I、OTs、OMs、及びN+R2 3（R2は、水素、又は置換基を有していてもよい炭素数1～10のアルキル基及びアリール基から、それぞれ独立して選択される。）からなる群より選択される基である、請求項９に記載の方法。
  11. 　前記アミノ酸が、下記式で表されるものである、請求項９に記載の方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
      
    〔式中、X1はOHであり、X2はCl、Br、又はIである。〕
  12. 　前記脱離反応条件は、pH＞9である、請求項９から１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 　前記加熱は、80℃以上で行われる、請求項９から１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 　さらに、ペプチドを大環状化する工程を含む、請求項９から１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 　前記基質ペプチドが、リーダー配列を含まず、前記アゾリン骨格導入酵素にリーダー配列が結合している、請求項９から１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 　前記基質ペプチドが、被修飾領域又は被修飾領域以外の領域に、少なくとも１つの非タンパク質性アミノ酸をさらに含む、請求項９から１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 　前記mRNAライブラリを製造する工程において、前記mRNAライブラリの各mRNAの3'末端にピューロマイシンを結合させる工程を含み、
    　前記基質ペプチドライブラリを得る工程で、mRNA結合基質ペプチドライブラリを得る、請求項９から１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. 　標的物質に結合する、アゾール誘導体骨格を有するペプチドを同定するスクリーニング方法であって、
    　請求項９から１７のいずれか１項に記載の方法で製造されたアゾール誘導体骨格を有するペプチドライブラリと、標的物質とを接触させてインキュベートする工程と、
    　前記標的物質に結合したアゾール誘導体骨格を有するペプチドを選択する工程と、を含む方法。
  19. 　標的物質に結合する、アゾール誘導体骨格を有するペプチドを同定するスクリーニング方法であって、
    　請求項１７に記載の方法で製造されたアゾール誘導体骨格を有するmRNA結合ペプチドライブラリと、標的物質とを接触させてインキュベートする工程と、
    　前記標的物質に結合したアゾール誘導体骨格を有するmRNA結合ペプチド群を回収する工程と、
    　回収されたmRNA結合ペプチド群のmRNA部分から、逆転写反応によりcDNA群を得る工程と、
    　前記cDNA群の3'末端にピューロマイシンを結合して翻訳し、mRNA結合ペプチドのライブ
    ラリを得る工程と、
    を1回以上繰り返して、標的物質に結合する、アゾール誘導体骨格を有するペプチドを濃縮する工程と、を含む方法。
  20. 　標的物質に結合する、アゾール誘導体骨格を有するペプチドを同定するスクリーニング方法であって、
    　請求項１７に記載の方法で製造されたアゾール誘導体骨格を有するmRNA結合ペプチドライブラリから、逆転写反応によりアゾール誘導体骨格を有するDNA結合ペプチドライブラリを得る工程と、
    　前記アゾール誘導体骨格を有するDNA結合ペプチドライブラリと標的物質とを接触させてインキュベートする工程と、
    　前記標的物質に結合したアゾール誘導体骨格を有するDNA結合ペプチド群を回収する工程し、DNA部分を増幅する工程と、
    　前記増幅したDNA群の3'末端にピューロマイシンを結合して翻訳し、mRNA結合ペプチドのライブラリを得る工程と、
    を1回以上繰り返して、標的物質に結合する、アゾール誘導体骨格を有するペプチドを濃縮する工程と、を含む方法。
     
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