WO2015111838A1 - 세포 내에 물질을 전달하기 위한 전기 천공 디바이스, 이를 포함하는 전기 천공 장치 및 전기 천공 방법 - Google Patents

세포 내에 물질을 전달하기 위한 전기 천공 디바이스, 이를 포함하는 전기 천공 장치 및 전기 천공 방법 Download PDF

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WO2015111838A1
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electroporation
droplet
electrode
mixed
cell
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임도진
유병선
정수남
김동표
강인석
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부경대학교산학협력단
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    • H04M1/00—Substation equipment, e.g. for use by subscribers
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    • H04M1/04—Supports for telephone transmitters or receivers
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8206—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • G—PHYSICS
    • G03—PHOTOGRAPHY; CINEMATOGRAPHY; ANALOGOUS TECHNIQUES USING WAVES OTHER THAN OPTICAL WAVES; ELECTROGRAPHY; HOLOGRAPHY
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    • G03B17/00—Details of cameras or camera bodies; Accessories therefor
    • G03B17/56—Accessories

Definitions

  • the present invention relates to an electroporation device, an electroporation device and an electroporation method comprising the same, which can be used for delivering a substance into a cell. More specifically, the micro-droplets containing the cells and the material to be delivered into the cells using electricity are directly charged in the electroporation device, the filled droplets are merged and controlled using electrophoresis, and then electroporation is performed.
  • TECHNICAL FIELD The present invention relates to an electroporation device that can be used to perform, an electroporation device and an electroporation method comprising the same.
  • the method of delivering a substance into cells is divided into a method of using a virus and a method of not using a virus.
  • the use of viruses has the advantage of being able to deliver substances effectively.
  • there is an electroporation method in which a high voltage electric pulse is instantaneously applied to temporarily increase the permeability of the cell membrane to deliver a substance.
  • Electroporation method can be applied regardless of cell type, and among the methods that do not use virus because of the relatively high transfer efficiency, chemical is most widely used together with the method.
  • the current commercially available electroporation device has a disadvantage that the survival rate of the cells is very low because of the use of high voltage.
  • Electroporation devices using microfluidic technology have the advantage of small cell size, high cell viability, and the use of small amounts of samples, while exhibiting the same electroporation effect at low voltage.
  • the electroporation device using the present microfluidic technology since a small amount of cells are used, the number of cells that can be obtained at a time is small, and the device has a disadvantage in that user convenience is inferior.
  • Korean Laid-Open Patent Publication No. 2009-0018469 discloses an apparatus for analyzing electroporation effect of cells using a microelement and a method for analyzing electroporation effect of cells using the same.
  • the electroporation device proposed in this patent is poor in user convenience because the cell is perforated in the microchannel formed on the substrate.
  • biotechnological applications such as transferring materials in the cells and culturing the cells to which the materials have been delivered are impossible.
  • the present invention is designed to overcome the problems of the prior art as described above, and an object of the present invention is to provide an electroporation device, an electroporation device and an electroporation method comprising the same, which can be used to efficiently transfer materials into cells. It is.
  • the present invention provides an electroporation device, an electroporation device and an electroporation method including the same, which can achieve high dielectric material transfer efficiency while increasing cell survival rate.
  • a droplet driving electrode for generating a mixed droplet comprising a first droplet comprising a cell and a second droplet comprising a substance to be delivered into the cell;
  • An electroporation electrode to allow electroporation to cells in the mixed droplets
  • Electroporation device comprising a.
  • a droplet driving electrode for generating a mixed droplet comprising a first droplet comprising a cell and a second droplet comprising a substance to be delivered into the cell; And an electroporation electrode for allowing electroporation to the cells in the mixed droplet.
  • a first power supply unit applying a voltage to the droplet driving electrode
  • a second power supply unit applying a voltage to the electrode for electroporation
  • Electroporation device comprising a.
  • An electroporation step of electroporating the cells in the mixed droplets An electroporation step of electroporating the cells in the mixed droplets
  • Electroporation method comprising a.
  • An electroporation step of electroporating the cells in the droplets An electroporation step of electroporating the cells in the droplets
  • Electroporation method comprising a.
  • the electroporation device According to the electroporation device, the electroporation device and the electroporation method including the same according to the present invention can achieve the following effects.
  • Mass transfer efficiency and cell viability to cells are higher than that of commercialized devices or devices according to the prior art.
  • the simple structure and operation principle of the device facilitates automation through the integration of components, thereby increasing the consistency of the electroporation results.
  • the structure of the equipment is simple, so that people who are not familiar with the device can easily perform electroporation.
  • FIG 1 shows the main configuration of an electroporation apparatus according to one embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a side cross-sectional view of a process for performing electroporation in an electroporation device in accordance with one embodiment of the present invention.
  • FIG 3 illustrates a process in which electroporation and mass transfer to cells are performed within an electroporation device in which components are integrated and automated according to one embodiment of the present invention.
  • FIG. 4 illustrates an experimental procedure for demonstrating microdroplet driving, merging, and electroporation using an electroporation apparatus according to one embodiment of the present invention.
  • FIG 5 shows an example of an applied voltage used in electroporation.
  • FIG. 6 illustrates a flow distribution of current flowing through a droplet according to the voltage applied in FIG. 5.
  • FIG. 7 shows successful delivery of genetic material into cells using an electroporation method according to one embodiment of the invention.
  • A is a fluorescence micrograph of YFP protein expression showing yellow fluorescence
  • B is a micrograph at the same position.
  • C is a fluorescence micrograph showing YFP protein expression in single cells
  • D is a micrograph at the same location.
  • FIG. 8 illustrates mass transfer efficiency and cell viability when genetic material is transferred into cells by electroporation using an electroporation device and a commercialization device according to one embodiment of the present invention.
  • Control' is a case of supplying DNA but no electroporation method
  • 'commercialization device' is the result of the experiment under the same conditions as in the present invention using a commercialization device
  • the present invention' The experimental results obtained by performing electroporation with the apparatus and method according to the present invention are shown.
  • contact charging is the transfer of charge from the surface of a conductor when the conductive droplet contacts the electrode. Refers to the phenomenon of charging. The thus charged droplets move from the electrode to the opposite electrode by the electrophoretic phenomenon by the electrical repulsive force.
  • the direct charging and electrophoresis of such droplets since individual droplets can be driven using electricity, the respective droplets containing cells and substances to be delivered to the cells are controlled and electroporation is performed on the cells within the droplets. This enables the delivery of substances into cells.
  • the present invention relates to an electroporation device, an electroporation device and an electroporation method comprising the same, which can be used to conveniently and efficiently deliver a substance into a cell.
  • one aspect of the present invention provides a droplet drive electrode for generating a mixed droplet comprising a first droplet containing a cell and a second droplet containing a substance to be delivered into the cell; And an electroporation electrode for allowing electroporation to the cells in the mixed droplet. It relates to an electroporation device comprising a.
  • the droplet driving electrode contacts and charges the first droplet and the second droplet, respectively, so that the mixed droplet is generated by moving the first droplet and the second droplet by electrophoresis.
  • the electroporation device may include a plurality of droplet driving electrodes, in which case the plurality of droplet driving electrodes may be arranged perpendicular to the bottom surface on the bottom surface inside the electroporation device.
  • the plurality of droplet driving electrodes are each capable of applying a voltage independently.
  • At least one of the plurality of droplet driving electrodes may be configured to enable a high voltage to perform a function as an electrode for electroporation.
  • the electroporation electrode applies a voltage to the mixed droplet including the first droplet and the second droplet to allow electroporation to the cells in the mixed droplet.
  • the electroporation electrode may be disposed on a surface opposite to the bottom surface on which the droplet driving electrode is arranged in the electroporation device and spaced apart from and facing the droplet driving electrode.
  • the gap between the droplet driving electrode and the electroporation electrode may be configured to be adjustable.
  • One embodiment of the electroporation device according to the present invention may be one in which the droplet driving electrode and the electroporation electrode are arranged perpendicularly to the bottom surface on the bottom surface of the inside of the electroporation device.
  • one end and the other end of the mixed droplet including the first droplet including the cell and the second droplet including the substance to be delivered into the cell are used for the electrode and the electroporation.
  • Each of the electrodes is connected to the electrodes, and a voltage is applied by a current passing through the mixed droplet through the droplet driving electrode and the electroporation electrode so that the cells in the mixed droplet are electroporated.
  • the electroporation electrode is in the shape of a needle having a hollow formed therein, it may have a structure that can be connected to the syringe existing outside the device. In this case, it is possible to connect the needle-shaped electroporation electrode and the syringe to collect the cells to which the substance has been delivered by electroporation.
  • a second aspect of the invention provides an electroporation device as described above; A first power supply unit applying a voltage to the droplet driving electrode; And a second power supply unit applying a voltage to the electrode for electroporation.
  • the polarity and the applied voltage of the droplet driving electrode may be adjusted through a control unit for controlling the power of the first power supply unit as necessary.
  • the electroporation apparatus according to the present invention is stored by the algorithm and method for electrophoresis and electroporation of the droplets, it is controlled by a control computer that performs a function to control the respective components of the electroporation apparatus It is also possible to configure so that.
  • the control unit or the control computer is not an essential configuration of the electroporation apparatus according to the present invention.
  • a third aspect of the invention provides a droplet supply step of supplying a first droplet comprising a cell and a second droplet comprising a substance to be delivered into the cell into the electroporation device; A mixed droplet generating step of combining the first droplet and the second droplet to produce a mixed droplet; And an electroporation step of electroporating the cells in the mixed droplet.
  • the first droplet and the second droplet are contacted with each other to drive different droplet driving electrodes, and the mixed first droplet and the second droplet are moved by electrophoresis and merged with each other to generate a mixed droplet.
  • one end and the other end of the mixed droplets are respectively connected to the droplet driving electrode and the electroporation electrode in the electroporation device, and to the current passing through the mixed droplet through the droplet driving electrode and the electroporation electrode.
  • the voltage is applied to electroporation to the cells in the mixed droplets, thereby transferring the material into the cells.
  • droplets for collecting the electroporation mixed droplets may further include.
  • the electroporation method according to the invention is preferably carried out with the interior of the electroporation device being filled with insulating hydrophobic oil.
  • the first and second droplets each containing the cell and the substance to be delivered into the cell and the mixed droplets in which they are combined are present in the oil, so that the cell or the substance to be delivered into the cell can be handled without risk of contamination. Will be.
  • the electroporation method according to the present invention introduces a droplet comprising a cell and a substance to be delivered into the cell into the electroporation device according to any one of claims 1 to 13, and electroporing the cells within the droplet. It may also be carried out in a manner.
  • the electroporation method according to the present invention comprises introducing a droplet containing a cell and a substance to be delivered into the cell into the electroporation device according to any one of claims 1 to 13, and An electroporation step of electroporation of the cells. The electroporation step then proceeds in the same manner as described above.
  • a fourth aspect of the present invention is directed to electroporation of a first droplet comprising a cell and a second droplet comprising a substance to be delivered into the cell with an electroporation device according to the first aspect of the invention, whereby the substance is contained in the cell.
  • a substance to be delivered in a cell may be included in a droplet, and any substance that needs to be delivered in a cell may be used. Specific examples thereof may be one or more selected from the group consisting of genetic material, drug, and fluorescent material, but are not limited thereto.
  • the droplets each containing the cell and the substance to be delivered into the cells may be aqueous droplets or any kind of liquid which does not mix with the external oil.
  • the medium for the droplets include, but are not limited to, water, polyethylene glycol (PEG), buffered solutions, ionic liquids, and the like.
  • the electroporation device according to the present invention includes an electroporation device 100, a first power supply 200 and a second power supply 300 as illustrated in FIG. 1.
  • the electroporation device 100 shown in FIG. 1 thus corresponds to one embodiment of the electroporation device according to the invention.
  • an electroporation device according to a first aspect of the present invention will be described with reference to FIGS. 2 to 4.
  • One embodiment of the electroporation device according to the present invention includes a droplet driving electrode 110 and an electroporation electrode 120 as shown in FIG. 1.
  • the droplet driving electrode 110 may include a first droplet 10 including cells injected from the outside using a pipette or a syringe, and a second droplet 20 including a substance to be transferred into the cell, for example, a genetic material. ) Directly fills the first droplet 10 and the second droplet 20. The filled first and second droplets are respectively moved by electrophoresis and merged and mixed to produce a mixed droplet 30.
  • the cell and the substance to be delivered within the cell may be introduced into the electroporation device in a single mixed droplet state in advance.
  • a plurality of droplet driving electrodes 110 may be provided, and the plurality of droplet driving electrodes 110 may be arranged perpendicularly to the bottom surface of the electroporation device 100.
  • the mixed droplet 30 generated by the droplet driving electrode 110 is transferred to the electroporation electrode 120 for electroporation.
  • the interior of the electroporation device 100 is preferably filled with insulating hydrophobic oil to minimize the gravity applied to the droplet and the friction between the droplet and the bottom surface of the device. It is desirable to use oils of low viscosity to minimize the resistance generated during the movement of the droplets. For example, it can be used in a variety of viscosity from 1/2 to the viscosity of water to a few to several hundred times, and is not limited to a specific oil as long as it meets the object of the present invention.
  • oil is filled in the interior of the electroporation device 100, there is an advantage that the contact of the cells with the external solid surface of the device is minimized, thereby preventing contamination of the cells.
  • the electrode 120 for electroporation has a droplet driving electrode 110 on a surface opposite to the bottom surface of the electroporation device 100 in which the droplet driving electrode 110 is arranged. It may be arranged to face away from.
  • the second power source 300 applies a voltage for electroporation to the electroporation electrode 120. Electroporation of the cells inside the mixed droplet 30 is made.
  • the gap between the droplet driving electrode 110 and the electroporation electrode 120 can be adjusted according to the size of the injected droplet, and adjusted so that the mixed droplet 30 can be connected between the two electrodes through electrophoretic driving. It is desirable to.
  • the electroporation process for the cells in the mixed droplet 30 can be observed. have.
  • the mixed droplet 30 is collected after being electroporated through a current through the droplet and used for further analysis through culturing.
  • the inside of the electroporation electrode 120 is formed into a hollow needle shape, and one end thereof is connected to an external syringe 600 to allow the electroporation process to complete the mixed droplets through the hollow.
  • the oil may be collected by the syringe 600 together with the oil.
  • an electroporation electrode 13 may be disposed on the bottom surface of the electroporation device 100 to favor integration of the electroporation device 100.
  • the electroporation is one end and the other end of the droplet is directly connected to the integrated electroporation electrode 120 and the droplet driving electrode 110 located on the bottom surface of the electroporation device 100 to penetrate the current through the droplets. Electroporation can be achieved by direct charging and electrophoresis of the droplets, as well as the way the voltage is applied.
  • At least one of the configuration may be configured to enable high voltage, so that the electroporation may be performed only by electrophoresis.
  • the electroporation apparatus includes an electroporation device 100, a first power supply 200, and a second power supply 300.
  • the first power supply unit 200 performs a function of applying a voltage to the droplet driving electrode 110
  • the second power supply unit 300 performs a function of applying a voltage to the electrode for electroporation 120.
  • the electroporation apparatus of the present invention may include a controller 400 as necessary.
  • the controller 400 controls the polarity of the droplet driving electrode 110 to generate an electrophoretic phenomenon, and controls the power of the first power source 200 to adjust the applied voltage of the droplet driving electrode 110. Perform the function.
  • the controller 400 and the first power supply unit 200 may perform a function of controlling the plurality of droplet driving electrodes 110 to independently apply voltage. Can be.
  • the electroporation apparatus stores an algorithm and a method for performing the electrophoresis and electroporation process of the above-described droplets, if necessary, the control computer for performing the function of controlling each component of the electroporation apparatus 500 can be controlled.
  • the first droplet 10 including the cells and the second droplet 20 containing the substance to be delivered into the cell are supplied into the electroporation device 100, and the first droplet ( 10) and the second droplet 20 is contact-filled with the droplet driving electrode 110 included in the electroporation device 100 to generate a mixed droplet 30, and then to the mixed droplet 30 Perform the perforation.
  • the substance is delivered to the cells in the mixed droplet in the present invention.
  • one end and the other end of the mixed droplet 30 are connected to the droplet driving electrode 110 and the electroporation electrode 120, respectively, and the mixed droplet 30 is formed by the electroporation electrode 120. Electroporation is performed to the mixed droplets 30 by applying a voltage through a current passing through the.
  • the mixed droplets which are electroporated, may be collected by a syringe 600 that is externally connected to the needle-shaped electroporation electrode 120 that is connectable to the syringe 600 and has a hollow formed therein.
  • FIG. 4 illustrates a microdroplet driving, merging and electroporation process according to the electroporation method according to the present invention.
  • an electroporation device is used for a first droplet 10 including a cell and a second droplet 20 including a substance to be delivered into a cell using a pipette or a syringe.
  • the first droplet 10 and the second droplet 20 are electrophoretic. Move and merge with each other to produce a mixed droplet 30.
  • the mixed droplet 30 allows the cells and the dielectric material to be well mixed by the electrophoretic phenomenon and then transferred to the electroporation electrode 120 through polarity control of the driving electrode. do.
  • the transferred droplets are electroporated through a current passing through the mixed droplets 30, as shown in D and E of FIG. 4, followed by connecting the syringe 600 to the end of the needle-shaped electroporation electrode 120. Collected with oil.
  • the droplets may contain hundreds of thousands to millions of cells while the droplets are several microliters or less. Because of the small size of the droplets, it is possible in the present invention to apply the magnitudes of voltage and current for electroporation to several tens of volts or less and several tens of milliamps or less, respectively. Therefore, since expensive equipment for supporting high voltage and high current is not required for the electroporation, the manufacturing cost of the electroporation device and the device can be reduced.
  • YFP yellow fluorescent protein
  • An electroporation experiment was performed using 200,000 microalgae cells and 14 billion DNA in a cell culture medium (Tris-Acetate-Phosphate, TAP medium) of about 1 microliter (diameter 1 mm in size) using the electroporation device according to the present invention. It was. The spacing between the electrode for electrode movement and the electrode for electroporation disposed on the bottom of the electroporation device was maintained at 1 mm, the size of the droplet. The device is filled with silicone oil. The electric field strength was set to 480 V / cm for the electroporation, equally set for the commercial electroporation device (192 V / 4 mm spacing) and the electroporation device of the present invention (48 V / 1 mm spacing). Voltage pulses were applied eight times with a length of 50 ms, and the time interval between pulses was set equal to 100 ms.
  • a cell culture medium Tris-Acetate-Phosphate, TAP medium
  • FIG. 7 is a photograph illustrating the presence of a fluorescent protein generated in a cell by introducing a gene for synthesizing a yellow fluorescent protein into a cell according to the electroporation procedure shown in FIG. 4.
  • FIGS. 7 (B) and 7 (D) are images in which light is outlined in a light at the same position.
  • 7 (A) and (C) show that the genetic material capable of producing a fluorescent protein was successfully delivered inside the cell to express the protein.
  • FIGS. 7 (B) and 7 (D) of Figure 7 it can be sure that the protein is normally expressed inside the cell by the genetic material delivered in the cell.
  • FIG. 8 compares mass transfer efficiency and cell viability when genetic material is delivered into cells according to the electroporation procedure shown in FIG. 4 with results obtained using a commercially available electroporation apparatus (Bio-Rad, Gene Pulser Xcell).
  • a commercially available electroporation apparatus Bio-Rad, Gene Pulser Xcell.
  • 'control' is a case where DNA is supplied but no electroporation method is applied
  • 'commercialization device' is a result of performing the same experiment using a commercialization device
  • 'invention' is an apparatus and method of the present invention.
  • the experimental results obtained by performing electroporation using The same electric field strength (480 V / cm) was used in both the commercial device and the present invention. As shown in FIG.
  • the cell viability was low due to the high voltage (192 V) and the high current (2.8 A) (82%), and the dielectric material transfer efficiency was only 1.1%.
  • the device since the device is small, the same electric field can be applied even at low voltage (48 V) and low current (0.02A), resulting in high cell viability (92%) and high dielectric mass transfer efficiency (16.5%). appear.
  • the electroporation device, apparatus, and method according to the present invention can be applied to a device for delivering a substance into a cell, such as a small cell incubator, a cell engineering device, and thus used in various chemistry, biology, medicine, and pharmaceutical fields using microfluidics. This is possible.

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Abstract

본 발명은 세포를 포함하는 제 1액적 및 세포 내에 전달하고자 하는 물질을 포함하는 제 2액적과 접촉 충전하여 상기 제 1액적 및 상기 제 2액적을 병합시켜 혼합 액적을 생성하는 액적 구동용 전극; 및 상기 혼합 액적에 전압을 인가하여 상기 혼합 액적 내부에서 전기 천공이 이루어지도록 하는 전기 천공용 전극을 포함하는 전기 천공 디바이스, 상기 전기 천공 디바이스를 포함하는 전기 천공 장치, 및 상기 디바이스를 이용하는 전기 천공 방법 및 세포 내에 물질을 전달하는 방법에 관한 것이다.

Description

세포 내에 물질을 전달하기 위한 전기 천공 디바이스, 이를 포함하는 전기 천공 장치 및 전기 천공 방법
본 발명은 세포 내에 물질을 전달하는 데에 사용될 수 있는 전기 천공 디바이스, 이를 포함하는 전기 천공 장치 및 전기 천공 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 전기를 이용하여 세포 및 세포 내에 전달하고자 하는 물질이 포함된 미세 액적을 전기 천공 디바이스 내에서 직접 충전시키고, 충전된 액적을 전기영동 현상을 이용하여 병합하고 제어한 후, 전기 천공을 수행하는 데에 사용될 수 있는 전기 천공 디바이스, 이를 포함하는 전기 천공 장치 및 전기 천공 방법에 관한 것이다.
세포 내에 유전 물질을 전달하여 원하는 형질을 나타내게 하는 기술은 유전공학 분야의 핵심 기술이다. 세포 내에 물질을 전달하는 방식은 크게 바이러스를 사용하는 방법과 바이러스를 사용하지 않는 방법으로 구분된다. 바이러스를 이용하는 방법은 물질을 효과적으로 전달할 수 있다는 장점이 있다. 그러나 생체 내에서 바이러스가 나타낼 수 있는 위험성과 부작용이 있고, 개개의 세포 종류에 따라 적합한 바이러스를 디자인해야 하는 어려움이 있다. 바이러스를 이용하지 않는 방법 중에는 고 전압의 전기 펄스를 순간적으로 인가하여 세포막의 투과성을 일시적으로 높여 물질을 전달하는 전기 천공 방법이 있다. 전기 천공 방법은 세포의 종류에 상관없이 적용이 가능하고, 전달 효율이 비교적 높아서 바이러스를 이용하지 않는 방법 중에서는 화학적이 방법과 함께 더불어 가장 널리 사용된다. 하지만, 현재 상용화된 전기 천공 장치는 고 전압을 사용하기 때문에 세포의 생존율이 매우 낮은 단점이 있다.
상용화된 전기 천공 장치는 전기 천공 중에 세포의 오염 문제가 발생할 수 있고, 높은 전압에서 수 암페어의 전류 흐름을 유지할 수 있는 고가의 전원 공급 장치를 필요로 하며, 관련된 소모품 역시 비싸다는 단점이 있다. 또한, 전기 천공 장치가 비교적 크기 때문에 실험 결과의 편차가 상대적으로 크다는 단점이 존재한다.
상용화된 전기 천공 장치의 위와 같은 단점을 극복하기 위해, 미세 유체 기술을 이용한 전기 천공 장치가 개발되고 있다. 미세 유체 기술을 이용하는 전기 천공 장치는 크기가 작기 때문에 낮은 전압에서 동일한 전기 천공 효과를 나타내면서도 세포의 생존율이 높고, 적은 양의 시료를 사용한다는 장점이 있다. 하지만, 현재의 미세 유체 기술을 이용하는 전기 천공 장치의 경우 미량의 세포를 사용하기 때문에 한 번에 수득할 수 있는 세포의 수가 적고, 미세 소자 형태로 구성되어 있어서 사용자 편의성이 떨어진다는 단점이 있다.
한국공개특허공보 제2009-0018469호는 미세 소자를 이용한 세포의 전기 천공효과 분석 장치 및 이를 이용한 세포의 전기 천공 효과 분석 방법을 개시하고 있다. 그러나, 이 특허에서 제시하는 전기 천공 장치는 기판 위에 형성된 미세 유로 내에서 세포의 천공이 이루어지기 때문에 사용자 편의성이 나쁘다. 또한 미세 소자의 유로에 도입되는 유체 내에 포함될 수 있는 세포의 수는 극히 적기 때문에 세포 내에 물질을 전달하고, 물질이 전달된 세포를 배양하여 이용하는 것과 같은 생명공학적 응용이 불가하다.
따라서 상용화된 전기 천공 장치나, 미세 유체 기술을 이용하는 전기 천공 장치의 단점을 극복함과 동시에, 두 가지 방법의 장점을 이용할 수 있는 새로운 전기 천공 디바이스를 개발하는 것이 필요하다.
본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 극복하기 위해 고안된 것으로서, 세포 내에 물질을 효율적으로 전달하는 데에 사용할 수 있는 전기 천공 디바이스, 이를 포함하는 전기 천공 장치 및 전기 천공 방법을 제공하는 것을 목적으로 하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 세포와 세포 내에 전달하고자 하는 물질을 하나의 미세 액적 내에 포함시켜 직접 충전하고, 전기영동 현상을 이용하여 병합하여 액적 내에서 전기 천공을 수행할 수 있도록 함으로써 낮은 전압으로 전기 천공을 이루어 세포의 생존율을 높이면서도 높은 유전물질 전달 효율을 달성할 수 있는 전기 천공 디바이스, 이를 포함하는 전기 천공 기기 및 전기 천공 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 해결 과제는 이상에서 언급된 것들에 한정되지 않으며, 언급되지 아니한 다른 해결 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해되어 질 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적은 다음과 같은 것에 의해 달성될 수 있다.
1. 세포를 포함하는 제 1액적과, 세포 내에 전달하고자 하는 물질을 포함하는 제 2액적을 포함하는 혼합 액적을 생성시키는 액적 구동용 전극; 및
상기 혼합 액적 내의 세포에 전기 천공이 이루어지도록 하는 전기 천공용 전극;
을 포함하는 전기 천공 디바이스.
2. 세포를 포함하는 제 1액적과, 세포 내에 전달하고자 하는 물질을 포함하는 제 2액적을 포함하는 혼합 액적을 생성시키는 액적 구동용 전극; 및 상기 혼합 액적 내의 세포에 전기 천공이 이루어지도록 하는 전기 천공용 전극;을 포함하는 전기 천공 디바이스;
액적 구동용 전극에 전압을 인가하는 제 1전원부; 및
전기 천공용 전극에 전압을 인가하는 제 2전원부;
를 포함하는 전기 천공 장치.
3. 세포를 포함하는 제 1액적과 세포 내에 전달하고자 하는 물질을 포함하는 제 2액적을 전기 천공 디바이스 내부로 공급하는 액적 공급 단계;
상기 제 1액적 및 제 2액적을 병합시켜 혼합 액적을 생성시키는 혼합 액적 생성 단계; 및
상기 혼합 액적 내의 세포를 전기 천공하는 전기 천공 단계;
를 포함하는 전기 천공 방법.
4. 세포 및 세포 내에 전달하고자 하는 물질을 포함하는 액적을 제 1항 내지 제 13항 중 어느 하나의 항에 따른 전기 천공 디바이스 내에 도입하는 단계와,
상기 액적 내의 세포를 전기 천공하는 전기 천공 단계;
를 포함하는 전기 천공 방법.
5. 세포를 포함하는 제 1액적 및 세포 내에 전달하고자 하는 물질을 포함하는 제 2액적을, 제 1항 내지 제 13항 중 어느 하나의 항에 따른 전기 천공 디바이스로 전기 천공하여 상기 물질을 세포 내에 전달하는 것을 포함하는, 세포 내에 물질을 전달하는 방법.
본 발명에 따른 전기 천공 디바이스, 이를 포함하는 전기 천공 장치 및 전기 천공 방법에 의하면 아래와 같은 효과를 달성할 수 있다.
1. 상용화된 장치나 선행 기술에 따른 장치에 비해 세포에 대한 물질 전달 효율 및 세포 생존율이 높다.
2. 상용화된 장치나 선행 기술에 따른 장치에 비해 낮은 전압 및 전류로 전기 천공이 가능하므로, 기기 제작 비용을 획기적으로 낮출 수 있다.
3. 상용화된 전기 천공 장치에서 다룰 수 있는 정도인 수 백 만개 이상의 세포를 한 번에 다루면서도 높은 세포 생존율 및 수율을 달성할 수 있다.
4. 액적 내의 세포나 세포 내에 전달되는 물질이 전기 천공 디바이스 내에 충진된 오일 내에서 다루어지므로 세포가 직접 기기 표면에 닿지 않게 되어 세포의 오염을 최소화할 수 있다.
5. 기기의 구조 및 작동 원리가 단순하여 구성 요소 집적화를 통한 자동화가 용이하고, 이를 통해 전기 천공 결과의 일관성을 높일 수 있다.
6. 기기의 구조가 단순하여 장치에 익숙하지 않은 사람도 손쉽게 전기 천공을 수행할 수 있는 편의성이 높다.
본 발명의 효과는 이상에서 언급된 것들에 한정되지 않으며, 언급되지 아니한 다른 효과들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자자에게 명확하게 이해될 것이다.
도 1은 본 발명의 한 가지 구체례에 따른 전기 천공 장치의 주요 구성을 도시한 것이다.
도 2는 본 발명의 한 가지 구체례에 따른 전기 천공 디바이스 내에서 전기 천공을 수행하는 과정의 측단면도이다.
도 3은 본 발명의 한 가지 구체례에 따라 구성 요소들을 집적화 및 자동화한 전기 천공 디바이스 내에서 전기 천공 및 세포에 대한 물질 전달이 이루어지는 과정을 도시한 것이다.
도 4는 본 발명의 한 가지 구체례에 따른 전기 천공 장치를 이용하여 미세 액적 구동, 병합 및 전기 천공 과정을 시연하는 실험 과정을 도시한 것이다.
도 5는 전기 천공 시 사용되는 인가 전압의 예를 도시한 것이다.
도 6은 도 5에서 인가된 전압에 따라 액적을 통해 흐른 전류의 흐름 분포를 도시한 것이다.
도 7은 본 발명의 한 가지 구체례에 따른 전기 천공 방법을 이용하여 세포 내에 유전 물질이 성공적으로 전달되었다는 것을 보여주는 도면이다. (A)는 노란색 형광을 나타내는 YFP 단백질 발현의 형광 현미경 사진이고, (B)는 동일 위치에서의 현미경 사진이다. (C)는 단일 세포에서 YFP 단백질 발현을 나타내는 형광 현미경 사진이고, (D)는 동일 위치에서의 현미경 사진이다.
도 8은 본 발명의 한 가지 구체례에 따른 전기 천공 장치 및 상용화 기기를 이용한 전기 천공으로 세포 내에 유전 물질을 전달한 경우에 물질 전달 효율 및 세포 생존율을 도시한 것이다. '대조군'은 DNA를 공급하지만 어떠한 전기 천공 방법도 가하지 않은 경우이고, '상용화 장치'는 상용화 장치를 이용하여 본 발명에서와 동일한 조건으로 실험을 수행한 결과이고, '본 발명'은 본 발명에 따른 장치 및 방법으로 전기 천공을 수행하여 얻은 실험 결과를 나타낸다.
전극과의 직접 접촉에 의한 액적의 충전 현상 (본 발명에서는 이 현상을 "접촉 충전"이라고 표현하기도 함)은 전극에 전도성 액적이 접촉할 때 도체 표면으로부터 전하를 전달받아 전극과 같은 극성으로 액적이 충전되는 현상을 지칭한다. 이렇게 충전된 액적은 전극으로부터 전기적 반발력에 의한 전기영동 현상에 의해 반대편 전극으로 이동한다. 이러한 액적의 직접 충전 및 전기영동 현상을 이용하는 경우, 전기를 이용하여 개개의 액적을 구동시킬 수 있으므로, 세포 및 세포 내에 전달하고자 하는 물질을 포함하는 액적을 각각 제어하고 액적 내의 세포에 전기 천공을 수행함으로써 세포 내에 물질을 전달할 수 있게 된다. 본 발명은 이와 같은 원리를 적용함으로써, 세포 내에 물질을 편리하고 효율적으로 전달하는 데에 사용될 수 있는 전기 천공 디바이스, 이를 포함하는 전기 천공 장치 및 전기 천공 방법에 관한 것이다.
따라서 본 발명의 한 가지 관점은 세포를 포함하는 제 1액적과, 세포 내에 전달하고자 하는 물질을 포함하는 제 2액적을 포함하는 혼합 액적을 생성시키는 액적 구동용 전극; 및 상기 혼합 액적 내의 세포에 전기 천공이 이루어지도록 하는 전기 천공용 전극; 을 포함하는 전기 천공 디바이스에 관한 것이다.
상기 액적 구동용 전극은 제 1액적 및 제2 액적을 각각 접촉 충전하여 상기 제 1액적 및 제 2액적이 전기영동 현상에 의해 이동함으로써 혼합 액적이 생성되도록 한다.
본 발명에 따른 전기 천공 디바이스는 복수 개의 액적 구동용 전극을 포함할 수 있고, 이 경우 복수 개의 액적 구동용 전극은 전기 천공 디바이스 내부의 바닥면에 바닥면과 수직으로 배열되어 있는 것일 수 있다. 또한, 상기 복수 개의 액적 구동용 전극은 각각 독립적으로 전압을 인가할 수 있는 것이다. 상기 복수 개의 액적 구동용 전극 중 적어도 하나는 고전압 인가가 가능하도록 구성되어, 전기 천공용 전극으로서의 기능을 수행하게 할 수 있다.
상기 전기 천공용 전극은 제 1액적과 제 2액적을 포함하는 혼합 액적에 전압을 인가하여 혼합 액적 내의 세포에 전기 천공이 이루어지도록 한다.
전기 천공용 전극은 전기 천공 디바이스 내부에 액적 구동용 전극이 배열된 바닥면과 대향되는 면에 위치하여 액적 구동용 전극과 이격되어 마주보도록 배치될 수 있다. 이 경우 액적 구동용 전극과 전기 천공용 전극 사이의 간격은 조절이 가능하도록 구성될 수 있다.
본 발명에 따른 전기 천공 디바이스의 한 가지 구체례는 상기 액적 구동용 전극과 전기 천공용 전극은 각각 전기 천공 디바이스 내부의 바닥면에 바닥면과 수직으로 배열되어 있는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 전기 천공 디바이스를 사용하는 경우 세포를 포함하는 제 1액적과 세포 내에 전달하고자 하는 물질을 포함하는 제 2액적을 포함하는 혼합 액적의 일단 및 타단이 상기 액적 구동용 전극과 전기 천공용 전극에 각각 연결되고, 액적 구동용 전극과 전기 천공용 전극을 통해 혼합 액적을 관통하는 전류에 의해 전압이 인가되어 혼합 액적 내의 세포에 전기 천공이 이루어지게 된다.
본 발명에 있어서, 상기 전기 천공용 전극은 내부에 중공이 형성된 바늘 형상으로 되어 있어서, 디바이스 외부에 존재하는 주사기와 연결 가능한 구조를 가질 수 있다. 이 경우, 바늘 형상의 전기 천공용 전극과 주사기를 연결하여 전기 천공에 의해 물질이 전달된 세포를 수거하는 것이 가능하게 된다.
본 발명의 두 번째 관점은 상술한 것과 같은 전기 천공 디바이스; 액적 구동용 전극에 전압을 인가하는 제 1전원부; 및 전기 천공용 전극에 전압을 인가하는 제 2전원부를 포함하는 전기 천공 장치에 관한 것이다.
본 발명에 따른 전기 천공 장치를 이용하여 전기 천공을 수행함에 있어서는 필요에 따라 상기 제 1전원부의 전원을 제어하는 제어부를 통해 액적 구동용 전극의 극성 및 인가 전압을 조절할 수 있다. 또한, 필요한 경우, 본 발명에 따른 전기 천공 장치는 액적의 전기영동 및 전기 천공을 위한 알고리즘 및 방법이 저장되어 있으며, 이를 통해 전기 천공 장치의 각 구성들을 제어하는 기능을 수행하는 제어용 컴퓨터에 의해 제어되도록 구성하는 것도 가능하다. 그러나, 상기 제어부나 제어용 컴퓨터는 본 발명에 따른 전기 천공 장치의 필수 구성은 아니다.
본 발명의 세 번째 관점은 세포를 포함하는 제 1액적과 세포 내에 전달하고자 하는 물질을 포함하는 제 2액적을 전기 천공 디바이스 내부로 공급하는 액적 공급 단계; 상기 제 1액적 및 제 2액적을 병합시켜 혼합 액적을 생성시키는 혼합 액적 생성 단계; 및 상기 혼합 액적 내의 세포를 전기 천공하는 전기 천공 단계를 포함하는 전기 천공 방법에 관한 것이다.
상기 혼합 액적 생성 단계에서는 제 1액적과 제 2액적이 각각 서로 다른 액적 구동용 전극에 접촉하여 충전되고, 충전된 제 1액적 및 제 2액적이 전기영동으로 이동하여 서로 병합됨으로써 혼합 액적이 생성된다.
상기 전기 천공 단계에서는 혼합 액적의 일단 및 타단이 전기 천공 디바이스 내에서 액적 구동용 전극과 전기 천공용 전극에 각각 연결되고, 상기 액적 구동용 전극과 전기 천공용 전극을 통해 혼합 액적을 관통하는 전류에 의해 전압이 인가되어 혼합 액적 내의 세포에 전기 천공이 이루어지고, 이로써 세포 내에 물질이 전달된다.
본 발명에 따른 전기 천공 방법은, 전기 천공 단계 이후에, 내부에 중공이 있는 바늘 형상을 갖는 전기 천공 전극의 중공을 통해 외부에서 도입된 주사기를 이용하여, 전기 천공이 이루어진 혼합 액적을 수거하는 액적 수거 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 전기 천공 방법은 전기 천공 디바이스의 내부가 절연성의 소수성 오일로 충진되어 있는 상태에서 수행되는 것이 바람직하다. 이 경우 세포 및 세포 내에 전달하고자 하는 물질을 각각 포함하는 제 1액적 및 제 2 액적과, 이들이 병합된 혼합 액적이 모두 오일 내에 존재하게 되므로 세포나 세포 내에 전달하고자 하는 물질을 오염의 위험 없이 다룰 수 있게 된다.
본 발명에 따른 전기 천공 방법은 세포와 세포 내에 전달하고자 하는 물질을 포함하는 액적을 제 1항 내지 제 13항 중 어느 하나의 항에 따른 전기 천공 디바이스 내에 도입하고, 상기 액적 내의 세포를 전기 천공하는 방법으로 수행될 수도 있다. 이 경우, 본 발명에 따른 전기 천공 방법은 세포 및 세포 내에 전달하고자 하는 물질을 포함하는 액적을 제 1항 내지 제 13항 중 어느 하나의 항에 따른 전기 천공 디바이스 내에 도입하는 단계와, 상기 액적 내의 세포를 전기 천공하는 전기 천공 단계를 포함한다. 이 때 전기 천공 단계는 앞에서 설명한 것과 동일한 방식으로 진행된다.
본 발명의 네 번째 관점은 세포를 포함하는 제 1액적 및 세포 내에 전달하고자 하는 물질을 포함하는 제 2액적을, 본 발명의 상기 첫 번째 관점에 따른 전기 천공 디바이스로 전기 천공하여, 물질을 세포 내에 전달하는 것을 포함하는, 세포 내에 물질을 전달하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 세포 내에 전달하고자 하는 물질은 액적 내에 포함될 수 있는 것이고, 세포 내에 전달이 필요한 어떤 물질이든 가능하다. 그 구체적인 예로는 유전 물질, 약물 및 형광 물질로 구성된 군에서 1종 이상 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 세포 및 세포 내에 전달하고자 하는 물질을 각각 포함하는 액적은 수용 액적일 수도 있고 외부 오일과 섞이지 않는 어떤 종류의 액체도 가능하다. 액적을 위한 매질의 구체적인 예로는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 물, Polyethylene Glycol(PEG), 완충 용액, 이온성 액체 등을 들 수 있다.
이하에서는 상기와 같은 본 발명의 구체례를 첨부의 도면을 참고하여 설명한다.
도 1은 본 발명에 따른 전기 천공 장치의 한 가지 구체례의 주요 구성을 도시한 것이다. 본 발명에 따른 전기 천공 장치는 도 1에 예시된 것과 같은 전기 천공 디바이스(100), 제 1전원부(200) 및 제 2전원부(300)를 포함한다. 따라서 도 1에 표시된 전기 천공 디바이스(100)는 본 발명에 따른 전기 천공 디바이스의 한 가지 구체례에 해당한다. 이하에서는 도 2 내지 도 4를 참조하여 본 발명의 첫 번째 관점에 따른 전기 천공 디바이스에 대해 설명한다.
전기 천공 디바이스
본 발명에 따른 전기 천공 디바이스의 한 가지 구체례는 도 1에 도시된 것과 같은 액적 구동용 전극(110) 및 전기 천공용 전극(120)을 포함한다.
액적 구동용 전극(110)은 파이펫이나 주사기 등을 이용하여 외부에서 투입된 세포를 포함하는 제 1액적(10) 및 세포 내에 전달하고자 하는 물질, 예를 들면 유전 물질을 포함하는 제 2액적(20)과 직접 접촉되어, 제 1액적(10) 및 제 2액적(20)을 충전한다. 충전된 제 1액적과 제 2액적은 각각 전기영동 현상에 의해 이동하여 병합 및 혼합되어 혼합 액적(30)을 생성한다.
다른 한 가지 구체례로서 세포와 세포 내에 전달하고자 하는 물질은 사전에 혼합된 단일 액적 상태로 전기 천공 디바이스에 투입되는 것도 가능하다.
도 1에서 보는 것과 같이 액적 구동용 전극(110)은 복수 개가 구비되고, 전기 천공 디바이스(100)의 바닥면에 상기 바닥면과 수직하게 배열되는 것이 바람직하다.
도 3에 도시된 것과 같이, 상기 액적 구동용 전극(110)에 의해 생성된 혼합 액적(30)은 전기 천공을 위해 전기 천공 전극(120)으로 이송된다.
이때 전기 천공 디바이스(100)의 내부는 액적에 가해지는 중력 및 액적과 디바이스 바닥면 사이의 마찰력을 최소화하기 위해 절연성의 소수성 오일로 충진되는 것이 바람직하다. 오일은 점도가 낮은 것을 사용하여 액적의 이동 중에 발생되는 저항을 최소화하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 물의 점도에 비해 점도가 1/2인 것부터 수 내지 수백 배에 이르기까지 다양하게 사용할 수 있고, 본 발명의 목적에 부합되는 한 특정 오일로 제한되지는 않는다. 전기 천공 디바이스(100)의 내부에 오일을 충진시키는 경우, 디바이스의 외부 고체 면과 세포의 접촉이 최소화되어 세포의 오염 문제가 방지될 수 있다는 장점이 있다.
도 2 및 도 4에 도시된 것과 같이, 전기 천공용 전극(120)은 액적 구동용 전극(110)이 배열된 전기 천공 디바이스(100)의 바닥면과 대향되는 면에 액적 구동용 전극(110)과 이격되어 마주보도록 배치될 수 있다. 이 경우, 혼합 액적(30)이 액적 구동용 전극(110)과 전기 천공용 전극(120) 사이로 이송되면 제 2전원(300)에서 전기 천공에 필요한 전압을 전기 천공용 전극(120)에 인가함으로써 혼합 액적(30) 내부의 세포에 대한 전기 천공이 이루어지게 된다. 액적 구동용 전극(110)과 전기 천공용 전극(120) 사이의 간격은 투입된 액적의 크기에 따라 조절이 가능하며, 전기영동 구동을 통해 두 전극 사이에 혼합 액적(30)이 연결될 수 있을 정도로 조절하는 것이 바람직하다.
액적 구동용 전극(110)에 전류계(130)를 연결하고, 연결된 전류계(130)를 통해 전기 천공 과정 중 전류의 흐름 변화를 감지함으로써 혼합 액적(30) 내의 세포에 대한 전기 천공 과정을 관찰할 수 있다.
혼합 액적(30)은 액적을 관통하는 전류를 통해 전기 천공된 후에 수거되어 배양을 통해 추가적인 분석 등에 활용된다. 전기 천공된 혼합 액적을 수거하기 위해 전기 천공용 전극(120)의 내부를 중공이 있는 바늘 형상으로 만들고, 그 일단을 외부의 주사기(600)와 연결시켜 전기 천공 과정이 완료된 혼합 액적을 중공을 통해 오일과 함께 주사기(600)로 수거할 수 있다.
도 3은 본 발명에 따른 전기 천공 디바이스의 한 가지 구체례로서 각 구성요소들을 집적화시키고 자동화시킨 예를 도시한 것이다. 도 3에 도시된 바와 같이, 전기 천공 디바이스(100)의 집적화에 유리하도록 전기 천공용 전극(13)을 전기 천공 디바이스(100)의 바닥면에 배치시킬 수 있다. 또한 세포에 대한 물질의 전달 상태를 관찰부(140)를 통해 확인하여, 추가적인 전기 천공이 필요한 것으로 판단되면 반복적으로 전기 천공을 수행할 수 있도록 구성하는 것이 바람직하다. 이 경우, 전기 천공은 전기 천공 디바이스(100)의 바닥면에 위치한 집적화된 전기 천공용 전극(120)과 액적 구동용 전극(110)에 액적의 일단과 타단이 직접 연결되어 액적을 관통하는 전류를 통해 전압이 인가되는 방식뿐 아니라, 액적의 직접 충전 및 전기영동 현상만으로도 전기 천공이 이루어질 수 있다.
본 발명에 따른 전기 천공 디바이스의 다른 한 가지 구체례로서, 별도의 전기 천공용 전극(120)을 구비하지 않고, 전기 천공 디바이스(100)의 바닥면에 배열된 복수 개의 액적 구동용(110) 전극 중 적어도 하나는 고전압 인가가 가능하도록 구성함으로써, 전기영동 현상만으로 전기 천공이 이루어지도록 할 수도 있다.
전기 천공 장치
본 발명에 따른 전기 천공 장치는, 도 1에 도시된 바와 같이, 전기 천공 디바이스(100), 제 1전원부(200) 및 제 2전원부(300)를 포함한다. 상기 제 1전원부(200)는 액적 구동용 전극(110)에 전압을 인가하는 기능을 수행하고, 제 2전원부(300)는 전기 천공용 전극(120)에 전압을 인가하는 기능을 수행한다.
본 발명의 전기 천공 장치는 필요에 따라 제어부(400)를 포함할 수 있다. 제어부(400)는 액적 구동용 전극(110)의 극성을 조절하여 전기영동 현상을 발생시키는 것과, 액적 구동용 전극(110)의 인가 전압을 조절하기 위하여 제 1전원부(200)의 전원을 제어하는 기능을 수행한다.
액적 구동용 전극(110)이 복수 개가 구비되는 경우, 제어부(400) 및 제 1전원부(200)는 복수 개의 액적 구동용 전극(110)이 각각 독립적으로 전압 인가가 가능하도록 제어하는 기능을 수행할 수 있다.
본 발명에 따른 전기 천공 장치는 필요에 따라 상술한 액적의 전기영동 및 전기 천공 과정의 수행을 위한 알고리즘 및 방법이 저장되어 있고, 이를 통해 전기 천공 장치의 각 구성들을 제어하는 기능을 수행하는 제어용 컴퓨터(500)에 의해 제어될 수 있다.
전기 천공 방법 및 물질 전달 방법
본 발명의 전기 천공 방법에서는, 세포를 포함하는 제 1액적(10) 및 세포 내에 전달하고자 하는 물질을 포함하는 제 2액적(20)을 전기 천공 디바이스(100) 내에 공급하고, 상기 제 1액적(10) 및 상기 제 2액적(20)을 상기 전기 천공 디바이스(100)에 포함된 액적 구동용 전극(110)으로 접촉 충전시켜 혼합 액적(30)을 생성시킨 다음, 상기 혼합 액적(30)에 전기 천공을 수행한다. 이러한 전기 천공에 의해 본 발명에서는 혼합 액적 내의 세포에 물질이 전달된다.
전기 천공은 상기 혼합 액적(30)의 일단 및 타단이 상기 액적 구동용 전극(110)과 상기 전기 천공용 전극(120)에 각각 연결되고, 전기 천공용 전극(120)에 의해 상기 혼합 액적(30)을 관통하는 전류를 통해 전압이 인가됨으로써 상기 혼합 액적(30)에 전기 천공이 이루어진다.
전기 천공이 이루어진 혼합 액적은, 주사기(600)와 연결 가능하고 내부에 중공이 형성된 바늘 형상의 전기 천공용 전극(120)에 외부에서 연결된 주사기(600)로 수거될 수 있다.
도 4는 본 발명에 따른 전기 천공 방법에 따른 미세 액적 구동, 병합 및 전기 천공 과정을 도시한 것이다.
도 4의 A 및 B에 도시된 바와 같이, 세포를 포함하는 제 1액적(10)과 세포 내에 전달하고자 하는 물질을 포함하는 제 2액적(20)을 파이펫이나 주사기 등을 이용하여 전기 천공 디바이스(100)에 공급한 후, 전기 천공 디바이스(100)의 바닥면에 형성된 액적 구동용 전극(110)의 극성을 제어하면, 제 1액적(10)과 제 2액적(20)이 전기영동 현상으로 이동하여 서로 병합되어 혼합 액적(30)을 생성한다.
이후, 도 4의 C에 도시된 바와 같이, 혼합 액적(30)은 전기영동 현상에 의해 세포와 유전물질이 잘 혼합되도록 한 후 전기 천공용 전극(120)으로 구동용 전극의 극성 제어를 통해 이송된다.
이송된 액적은 도 4의 D 및 E에 도시된 바와 같이, 혼합 액적(30)을 관통하는 전류를 통해 전기 천공되고, 이어서 바늘 형상의 전기 천공용 전극(120) 끝에 주사기(600)를 연결하여 오일과 함께 수거된다.
본 발명에서는 액적의 크기를 수 마이크로 리터 이하로 하면서도, 액적 내에 수십만 내지 수백만 개의 세포를 포함시킬 수 있다. 액적의 크기가 작기 때문에 본 발명에서는 전기 천공을 위한 전압 및 전류의 크기를 각각 수십 볼트 이하 및 수십 밀리암페어 이하로 적용하는 것이 가능하다. 따라서, 전기 천공을 위해 고전압 및 고전류를 지원하는 고가의 장비가 필요하지 않으므로, 전기 천공 디바이스 및 장치의 제작 단가를 줄일 수 있는 효과가 있다.
또한 작은 크기의 액적으로도 충분히 많은 양의 세포에 전기 천공을 통해 물질을 전달할 수 있으므로, 적은 양의 세포와 세포 내에 전달하고자 하는 물질로도 고농도의 실험을 수행할 수 있어서, 높은 물질 전달 효율 달성이 가능하다.
나아가, 수십만에서 수백만에 이르는 다량의 세포를 다룰 수 있게 됨으로써 기존 미세유체 전기 천공 디바이스의 문제점인 상용화 기기 대비 낮은 수율 문제를 해결하는 것이 가능해진다.
실시예
이하에서는 본 발명에 따른 장치 및 방법에 따라 세포에 대한 전기 천공을 실시하여 세포 내 물질 전달 실험을 수행한 절차 및 결과를 설명한다.
세포는 세포벽이 있는 단세포 미세 녹조류로서 클라미도모나스 라인하르티(Chlamydomonas reinhardtii)를 사용하였다. 이 세포는 세포벽이 두껍기 때문에 기존 상용화 장치로는 잘 전달되지 않는 종이다. 유전 물질로는 노란색 형광 단백질 (YFP)을 생성할 수 있는 플라스미드 DNA를 사용하였다.
본 발명에 따른 전기 천공 장치를 사용하여 약 1 마이크로 리터 (직경 1 mm 크기)의 세포 배양액 (Tris-Acetate-Phosphate, TAP medium)에 미세 녹조류 세포 20만개와 DNA 140억개를 넣어서 전기 천공 실험을 수행하였다. 전기 천공 디바이스 바닥면에 배치된 전극 이동용 전극과 전기 천공용 전극 사이의 간격은 액적의 크기인 1 mm로 유지하였다. 디바이스 내부에는 실리콘 오일을 충진하였다. 전기 천공을 위해 전기장의 세기를 480 V/cm로, 상용화 전기 천공 장치 (192 V/ 4 mm 간격)와 본 발명의 전기 천공 장치 (48 V/ 1 mm 간격)에 동일하게 설정하였다. 전압 펄스는 50 ms 길이로 8회 인가하였고, 펄스 간 시간 간격은 100 ms로 동일하게 설정하였다.
도 7 및 8에 제시된 장치를 활용해 실제 세포에 유전 물질 전달 효율 및 세포 생존율을 비교한 실험 결과를 제시하였다.
도 7은 도 4에 도시된 전기 천공 절차에 따라 세포 내에 노란색 형광 단백질을 합성하는 유전자를 도입하고, 세포 내에 생성된 형광 단백질의 존재를 확인한 사진이다.
도 7의 (A)와 (C)는 각각 암실 조건에서의 형광 이미지이고, 도 7의 (B)와 (D)는 동일한 위치에서 빛을 주어 세포의 윤곽을 나타나도록 한 이미지이다. 도 7의 (A) 및 (C)는 형광을 나타내는 단백질을 생성할 수 있는 유전 물질이 세포 내부에 성공적으로 전달되어 단백질이 발현되었다는 것을 보여준다. 한편, 도 7의 (B) 및 (D)에서 보는 것과 같이, 세포 내에 전달된 유전 물질에 의해 세포 내부에서 단백질이 정상적으로 발현되었음을 확실하게 확인할 수 있다.
도 8은 도 4에 도시된 전기 천공 절차에 따라 세포 내에 유전 물질을 전달한 경우의 물질 전달 효율 및 세포 생존율을, 상용화된 전기 천공 장치 (Bio-Rad, Gene Pulser Xcell)를 사용하여 얻은 결과와 비교한 그래프이다. 도 8에서, '대조군'은 DNA를 공급하지만 어떠한 전기 천공 방법도 가하지 않은 경우이며, '상용화 장치'는 상용화 기기를 이용해 동일한 실험을 수행한 결과이고, '본 발명'은 본 발명의 장치 및 방법을 이용해 전기 천공을 수행하여 얻은 실험 결과를 나타낸다. 상용화 기기와 본 발명에서 모두 동일한 전기장 세기 (480 V/cm) 를 사용하였다. 도 8 에서 보는 것과 같이, 상용화 기기의 경우, 고전압 (192 V)과 고전류 (2.8 A)로 인해 세포 생존율이 낮고 (82%) 유전 물질 전달 효율은 1.1%에 불과했다. 이에 비해, 본 발명에서는 장치의 크기가 작아서 저전압 (48 V) 및 저전류 (0.02A)로도 동일한 전기장 인가가 가능하였기 때문에, 세포 생존율이 높고 (92%), 유전 물질 전달 효율도 16.5%로 높게 나타났다.
본 명세서에서 설명되는 실시예와 첨부된 도면은 본 발명에 포함되는 기술적 사상의 일부를 예시적으로 설명하는 것에 불과하다. 따라서 본 명세서에 개시된 실시예들은 본 발명의 기술적 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이므로, 이러한 실시예에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것이 아님은 자명하다. 본 발명의 명세서 및 도면에 포함된 기술적 사상의 범위 내에서 당해 기술분야에 있어서의 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 유추할 수 있는 변형 예와 구체적인 실시예는 모두 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.
본 발명에 따른 전기 천공 디바이스, 장치 및 방법은 소형 세포 배양기, 세포 공학용 기기 등 세포 내에 물질을 전달하기 위한 기기에 적용할 수 있으므로, 미세 유체 역학을 이용하는 다양한 화학, 생물학, 의학, 약학 분야에서 이용이 가능하다.
[도면 부호의 설명]
10: 제 1액적
20: 제 2액적
30: 혼합 액적
100: 전기 천공 디바이스
110: 액적 구동용 전극
120: 전기 천공용 전극
130: 전류계
140: 관찰부
200: 제 1전원부
300: 제 2전원부
400: 제어부
500: 제어용 컴퓨터
600: 주사기

Claims (24)

  1. 세포를 포함하는 제 1액적과, 세포 내에 전달하고자 하는 물질을 포함하는 제 2액적을 포함하는 혼합 액적을 생성시키는 액적 구동용 전극; 및
    상기 혼합 액적 내의 세포에 전기 천공이 이루어지도록 하는 전기 천공용 전극;
    을 포함하는 전기 천공 디바이스.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 액적 구동용 전극은 제 1액적 및 제2 액적을 각각 접촉 충전함으로써 상기 제 1액적 및 제 2액적이 전기영동에 의해 이동하여 혼합 액적이 생성되도록 하는 것인 전기 천공 디바이스.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 액적 구동용 전극은 복수 개로 이루어지고, 전기 천공 디바이스 내부의 바닥면에 바닥면과 수직으로 배열되어 있는 것인 전기 천공 디바이스.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 복수 개의 액적 구동용 전극은 각각 독립적인 전압의 인가가 가능한 것인 전기 천공 디바이스.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 복수 개의 액적 구동용 전극 중 적어도 하나는 전기 천공을 위한 고전압의 인가가 가능한 것인 전기 천공 디바이스.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 전기 천공용 전극은 제 1액적과 제 2액적을 포함하는 혼합 액적에 전압을 인가하여 혼합 액적 내의 세포에 전기 천공이 이루어지도록 하는 것인 천공 디바이스.
  7. 제3항에 있어서,
    전기 천공용 전극은 전기 천공 디바이스 내부에 액적 구동용 전극이 배열된 바닥면과 대향되는 면에 위치하여 액적 구동용 전극과 이격되어 마주보도록 배치되는 것인 전기 천공 디바이스.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 액적 구동용 전극과 전기 천공용 전극 사이의 간격은 조절이 가능한 것인 전기 천공 디바이스.
  9. 제7항에 있어서,
    혼합 액적의 일단 및 타단이 상기 액적 구동용 전극과 전기 천공용 전극에 각각 연결되고, 액적 구동용 전극과 전기 천공용 전극을 통해 혼합 액적을 관통하는 전류에 의해 전압이 인가되어 혼합 액적 내의 세포에 전기 천공이 이루어지는 것인 전기 천공 디바이스.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 액적 구동용 전극과 전기 천공용 전극이 각각 전기 천공 디바이스 내부의 바닥면에 바닥면과 수직으로 배열되어 있는 것인 전기 천공 디바이스.
  11. 제10항에 있어서,
    혼합 액적의 일단 및 타단이 상기 액적 구동용 전극과 전기 천공용 전극에 각각 연결되고, 액적 구동용 전극과 전기 천공용 전극을 통해 혼합 액적을 관통하는 전류에 의해 전압이 인가되어 혼합 액적 내의 세포에 전기 천공이 이루어지는 것인 전기 천공 디바이스.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 전기 천공용 전극은 내부에 중공이 형성된 바늘 형상을 가지며, 디바이스 외부에 존재하는 주사기와 연결 가능한 구조를 갖는 것인 전기 천공 디바이스.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 세포 내에 전달하고자 하는 물질은 유전 물질, 약물 및 형광 물질로 구성된 군에서 1종 이상 선택되는 것인 전기 천공 디바이스.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 따른 전기 천공 디바이스;
    액적 구동용 전극에 전압을 인가하는 제 1전원부; 및
    전기 천공용 전극에 전압을 인가하는 제 2전원부;
    를 포함하는 전기 천공 장치.
  15. 세포를 포함하는 제 1액적과 세포 내에 전달하고자 하는 물질을 포함하는 제 2액적을 전기 천공 디바이스 내부로 공급하는 액적 공급 단계;
    상기 제 1액적 및 제 2액적을 병합시켜 혼합 액적을 생성시키는 혼합 액적 생성 단계; 및
    상기 혼합 액적 내의 세포를 전기 천공하는 전기 천공 단계;
    를 포함하는 전기 천공 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 혼합 액적 생성 단계에서는 제 1액적과 제 2액적이 각각 서로 다른 액적 구동용 전극에 접촉하여 충전되고, 충전된 제 1액적 및 제 2액적이 전기영동으로 이동하여 서로 병합됨으로써 혼합 액적이 생성되는 것인 전기 천공 방법.
  17. 제15항에 있어서,
    상기 전기 천공 단계에서는 혼합 액적의 일단 및 타단이 전기 천공 디바이스 내에서 액적 구동용 전극과 전기 천공용 전극에 각각 연결되고, 상기 액적 구동용 전극과 전기 천공용 전극을 통해 혼합 액적을 관통하는 전류에 의해 전압이 인가되어 혼합 액적 내의 세포에 전기 천공이 이루어지는 것인 전기 천공 방법.
  18. 제15항에 있어서,
    상기 전기 천공 단계 이후에, 내부에 중공이 있는 바늘 형상을 갖는 전기 천공 전극의 중공을 통해 외부에서 도입된 주사기를 이용하여, 전기 천공이 이루어진 혼합 액적을 수거하는 액적 수거 단계를 더 포함하는 것인 전기 천공 방법.
  19. 제16항에 있어서,
    전기 천공 디바이스 내부에 절연성의 소수성 오일이 충진되어 있는 상태에서 전기 천공이 이루어지는 것인 전기 천공 방법.
  20. 제16항에 있어서,
    상기 세포 내에 전달하고자 하는 물질은 유전 물질, 약물 및 형광 물질로 구성된 군에서 1종 이상 선택되는 것인 전기 천공 방법.
  21. 세포 및 세포 내에 전달하고자 하는 물질을 포함하는 액적을 제 1항 내지 제 13항 중 어느 하나의 항에 따른 전기 천공 디바이스 내에 도입하는 단계와,
    상기 액적 내의 세포를 전기 천공하는 전기 천공 단계;
    를 포함하는 전기 천공 방법.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 세포 내에 전달하고자 하는 물질은 유전 물질, 약물 및 형광 물질로 구성된 군에서 1종 이상 선택되는 것인 전기 천공 방법.
  23. 세포를 포함하는 제 1액적 및 세포 내에 전달하고자 하는 물질을 포함하는 제 2액적을, 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 따른 전기 천공 디바이스로 전기 천공하여 상기 물질을 세포 내에 전달하는 것을 포함하는, 세포 내에 물질을 전달하는 방법.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 세포 내에 전달하고자 하는 물질은 유전 물질, 약물 및 형광 물질로 구성된 군에서 1종 이상 선택되는 것인, 세포 내에 물질을 전달하는 방법.
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