WO2015102262A1 - X-연관 부신백질이영양증의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

X-연관 부신백질이영양증의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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WO2015102262A1
WO2015102262A1 PCT/KR2014/012263 KR2014012263W WO2015102262A1 WO 2015102262 A1 WO2015102262 A1 WO 2015102262A1 KR 2014012263 W KR2014012263 W KR 2014012263W WO 2015102262 A1 WO2015102262 A1 WO 2015102262A1
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ald
alkyl
hydrogen
chain fatty
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PCT/KR2014/012263
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김동욱
박영환
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연세대학교 산학협력단
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Definitions

  • the present invention was made by the task number 2012M3A9B4028631 under the support of the Ministry of Science, ICT and Future Planning, the research and management institution of the project is Yonsei University Industry-Academic Cooperation Group, the research project name is “Bio medical technology development project”, and the research title is “Pluripotent stem cell Development of the source technology for the treatment of neurological diseases cells through the development of efficient differentiation of dopamine neurons in the middle cerebral cortex. "The host institution is Yonsei University Industry-Academic Cooperation Group. The research period is 2012.06.01 ⁇ 2017.05.31.
  • the present invention is made by the task number A120254 under the support of the Ministry of Health and Welfare, the research and management institution of the project is Yonsei University Industry-Academic Cooperation Group, the research project name is "health medical research and development project”, the research project title "the efficiency of embryonic stem cells Development of core technology for clinical application of Parkinson's disease and spinal cord injury through neuronal cell differentiation. (Comparative evaluation of safety efficacy using dedifferentiated stem cell-derived cells as a control group), The lead organization is Yonsei University Industry-Academic Cooperation Group. 31.
  • the present invention is supported by the Korean people ⁇ Ministry of Education, Science and Technology
  • 2012M3A9C7050126 the research management specialized organization for the above-mentioned project is Yonsei University Industry-Academic Cooperation Group, the research project name is “Bio medical technology development project”, and the research title is "Patient-derived dedifferentiation stem cell utilization disease model development and medicinal effect as a neural system Development of Toxicity Assessment Platform ", the lead organization is Yonsei University. Industry-University Cooperation Group, research period is from October 10, 2012 to September 30, 2017.
  • the present invention relates to a composition for the prophylaxis or treatment of X-linked adrenal protein dystrophy, which contains an amylolide derivative compound as an active ingredient.
  • X-linked adrenal protein dystrophy (X-1 inked adreno leukodystrophy, X-ALD) is a recessive hereditary disease associated with a low prevalence of peroxisom, affecting one in 17,000-20,000 men ( Singh I. et al., Brain Pathol, 20: 838-844 (2010)).
  • X-ALD is caused by various genetic variations located in the ABCD1 gene located at Xq28 or the massive loss of one or more axons (Kemp S. et al., Hum Mutat, 18: 499-515 (2001)).
  • ABCD1 ATP-bind ng cassette (ABC) transporter subfamily D member 1
  • AAC ATP-bind ng cassette
  • ALD adrenoleukodystrophy protein
  • APN adrenoleukodystrophy protein
  • the CCALD type is an early onset (3-10 years old), usually showing rapid inflammatory demyelination ((1 ⁇ 0 ⁇ 011) in the brain, leading to death in a vegetative state within 2-5 years (Kemp). S. et al., Bri J Pharm, 164: 1753-1766 (2011)). There is no known correlation between clinical phenotypes and mutated genotypes in the ABCD1 gene (Smith KD. Et al., Neurochew Res, 24).
  • ABCD1 protein also called ALD protein
  • VLCFAs chain fatty acids
  • Abcdl mutant mice are known to reduce VLCFA ⁇ oxidation and accumulate VLCFAs in tissues such as fibroblasts and brain, spinal cord and adrenal cortex. Yamada T. et al., Cell Bio Bio, 32: 239-246 (2000); Forss-Petter S. et al., J Neu Res 50: 829 (1997); obayashi T. et al., BBRC, 232: 631 (1997); Lu JF. Et al., WAS 94: 9366 (1997)). Recently, the present inventors confirmed that VLCFAs accumulated in neurons and oligodendrocytes differentiated from induced pluripotent stem cells (iPSCs) obtained in the X-ALD model. (Jang J.
  • ABCD2 encodes ABCD2 protein, also called ALDRP (ALD-related protein), and ABCD2 protein has high homology with ABCD1 (Holzinger A. et al., BBRC, 239: 261-264 (1997)).
  • ALDRP has a functional similarity to ALDP.
  • ABCD2 induction has been reported as a promising target of X-ALD treatment (Berger J. et al., Brain Pathol 20: 845-856 (2010)).
  • some compounds have been investigated to induce some gene expression (Kemp S. et al., Nat Med 4: 1261-1268 (1998); Singh J. et al., J Lipid Res 52: 2056-2069 (2011)), no drug has been identified that is effective enough to cover the clinical treatment of X-ALD.
  • HTSC high-throughput screening assays have been used as a tool to identify compounds that modulate various cellular functions and pathways (Inglese J. et al., Nat Che Bio 3: 466-479 (2007)). Lucifer erase reporters are widely used in HTS due to their sensitivity and ease of detection (Michelini E. et al., Anal Bioanal Chew 398: 227 (2010)).
  • the present inventors searched for compounds that regulate the promoter activity of two genes in fibroblasts of X-ALD patients using the two-perase enzyme reporter system, and discovered an amyloide derivative compound having a specific structure. Furthermore, administration of a compound of the present invention to fibroblasts of X-ALD patients resulted in VLCFA. By observing the levels return to normal in a concentration and time dependent manner, it was confirmed that the compounds of the present invention are novel therapeutic compositions which are very efficient for X-ALD treatment.
  • the present inventors have made extensive efforts to develop an effective therapeutic agent for various diseases caused by intracellular overaccumulation of long-chain fatty acids (VLCFAs) including X-linked adrenal protein dystrophy.
  • VLCFAs long-chain fatty acids
  • the compound of Formula 1 increases the expression of ABCD2 gene which can replace the function of ABCD1 protein involved in the degradation of VLCFAs, thereby promoting the degradation of VLCFAs and consequently greatly improving the accumulation of long chain fatty acids.
  • an object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the prophylaxis or treatment of long chain fatty acid excess disease.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prophylaxis or treatment of a long chain fatty acid excess disease comprising a compound represented by the following formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient:
  • Z is N and Y when is a double bond (ArA 4 are each independently bovine or dC 3 alkyl); ⁇ when is a single bond
  • ⁇ and ⁇ are each independently hydrogen or d-Cs alkyl
  • Ri and R 2 are each independently hydrogen or Cr ′′ C 3 alkyl; X is halogen; R 3 and R 4 are each independently hydrogen or Cr: 4 alkyl, or R 3 and are linked to each other R 3 and Together with N to which 3 ⁇ 4 binds to form an N-comprising heterocycloalkyl of each 5-7 ring.
  • VLCFAs long chain fatty acids
  • X-linked adrenal protein dystrophy X-linked adrenal protein dystrophy.
  • the compound of Formula 1 increases the expression of ABCD2 gene, which can replace the function of ABCD1 protein involved in the degradation of VLCFAs, thereby promoting the degradation of VLCFAs and consequently greatly improving the accumulation of long chain fatty acids.
  • long chain fatty acid overdose is abnormal due to a deficiency or dysfunction of the adrenal protein-trophic protein (ALDP), which functions to assist in the transport and degradation of long chain fatty acids (VLCFAs) of C26: 0 and C24: 0.
  • ADP adrenal protein-trophic protein
  • VLCFAs long chain fatty acids
  • Adrenal insufficiency which is a condition in which adrenal hormones such as adrenaline and cortisol decrease, causing blood pressure, heart rate, sexual development and fertility problems
  • the long-chain fatty acid hypertrophy prevented or treated with the present invention and the composition is X-linked adrenal protein dystrophy (X- li nked adreno l eukodyst rophy, X-ALD), Zehlwewe syndrome syndrome and Ref sum's di sease
  • the long-chain fatty acid excess disease prevented or treated with the composition of the present invention is X-linked adrenal protein dystrophy. More specifically, the X-linked adrenal dystrophy is pediatric cerebral cerebral form X-ALD (Cal dhood Cerebral form ALD, CCALD) or adrenomyeluropathy (AN) X-ALD.
  • X-ALD Cal dhood Cerebral form ALD, CCALD
  • AN adrenomyeluropathy
  • treatment means (a) inhibiting the development of a disease, disease or condition; (b) alleviation of diseases, diseases or symptoms; Or (c) removing the disease, disease or condition.
  • the composition of the present invention serves to inhibit, eliminate or alleviate the symptoms of long-chain fatty acid excess disease, whereby the term “treatment” or “therapeutic” means “treatment adjuvant” or “treatment adjuvant”. It includes.
  • prevention means that it has never been diagnosed as having a disease or condition, but inhibits the occurrence of the disease or condition in a subject who is likely to suffer from the disease or condition.
  • alkyl refers to a straight or branched saturated hydrocarbon group, including, for example, methyl, ethyl, propyl, isopropyl and the like.
  • Ci-C 3 alkyl means an alkyl group having an alkyl unit having 1 to 3 carbon atoms, and when d-C 3 alkyl is substituted, the carbon number of the substituent is not included.
  • halogen refers to a halogen group element and includes, for example, F, CI, Br and I.
  • N-containing heterocycloalkyl refers to a cyclic alkyl molecule containing nitrogen as the hetero atom.
  • 5 N-containing heterocycloalkyl of each -7 ring is the case of from 5 to 7 nitrogen and carbon atoms constituting a cyclic ring.
  • ⁇ ⁇ ⁇ 4 in formula 1 of the present invention is hydrogen.
  • -3 ⁇ 4 of formula 1 of the present invention is hydrogen.
  • R 2 in formula 1 of the present invention is hydrogen.
  • X in formula 1 of the present invention is C1.
  • the N-containing heterocycloalkyl of the formula (1) of the present invention is N-cyclonuclear methylene.
  • the compound represented by the formula (1) of the present invention is a compound represented by the following formula (2) or
  • the compounds of the present invention may be used in the form of pharmaceutically acceptable salts, and acid salts formed by pharmaceutically acceptable free acids are useful as salts.
  • acid salts formed by pharmaceutically acceptable free acids are useful as salts.
  • Inorganic acids and organic acids can be used as the free acid.
  • pharmaceutically acceptable salts of the compounds of the present invention are hydrochloride, bromate, sulfate, phosphate, citrate, acetate, trifluoroacetate, lactate, tartarate, maleate, fumarate, gluconate , Methanesulfonate, glyconate, succinate, 4-luluenesulfonate, gluturonate, embonate, glutamate, or aspartate, but may be selected from the group consisting of, but not limited to All salts formed using various inorganic and organic acids are used.
  • the compounds of the invention may also exist in the form of solvates (eg hydrates). According to a specific embodiment of the invention, the composition of the invention increases the promoter activity of the ABCD2 gene.
  • composition of the present invention may be provided in the form of a pharmaceutical composition for preventing or treating a long chain fatty acid excess disease, comprising: (a) a pharmaceutically effective amount of the compound of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof; And (b) a pharmaceutically acceptable carrier.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to achieve the efficacy or activity of the composition of the present invention described above.
  • Pharmaceutically acceptable carriers included in the pharmaceutical compositions of the present invention are those commonly used in the preparation of lactose, dextrose, sucrose sorbbi, mannitle, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin , Silicic acid silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyridone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methyl hydroxybenzoate, propylhydroxy banzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a humectant, a sweetener flavoring agent, an emulsifier, a suspending agent, a preservative, and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally: in the case of parenteral administration, it may be administered by intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, transdermal administration, ventricular administration, and the like. For example, by intracerebroventr i cular inj ect ion.
  • Suitable dosages of the pharmaceutical compositions of the present invention vary depending on factors such as formulation method, mode of administration, age, weight, sex, morbidity, food, time of administration, route of administration, rate of excretion and response sensitivity of the patient. Typically, the skilled practitioner can readily determine and prescribe a dosage effective for the desired treatment or prophylaxis. According to a preferred embodiment of the present invention, the daily dose of the pharmaceutical composition of the present invention is 0.001-1000 mg / kg.
  • compositions of the present invention are prepared in unit dose form by formulating with a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to methods which can be easily carried out by those skilled in the art.
  • the formulation may be in the form of a solution, suspension or emulsion in an oil or aqueous medium, or may be in the form of extracts, powders, granules, tablets, capsules or gels (e.g. hydrogels), and additionally formulates a dispersing or stabilizing agent.
  • the present invention provides a long chain fatty acid comprising administering to the subject (subj ect) a composition comprising a compound represented by the following formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient
  • a composition comprising a compound represented by the following formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient
  • NH and Y is ( ⁇ ⁇ 3 ⁇ 4 are each independently hydrogen or d-Cs alkyl); And 3 ⁇ 4 are each independently hydrogen or d_C 3 alkyl; X is halogen; R 3 and R 4 are each independently hydrogen or dC 4 alkyl, or and R 4 are connected to each other to form an N-containing heterocycloalkyl of each 5 -7 each ring together with R 3 and N to which it is attached.
  • the method for preventing or treating a long-chain fatty acid excess disease of the present invention is carried out using the compound described above, and the common content between the two is omitted in order to avoid excessive complexity of the present specification. [effect]
  • the present invention provides an amidoleide derivative compound as an effective therapeutic composition for long chain fatty acid hypertrophy, in particular X-linked adrenal protein dystrophy.
  • composition of the present invention significantly increases the activity of the ABCD2 gene promoter having a compensatory effect on the ABCD1 protein involved in long chain fatty acid degradation, and levels of C26: 0 and C24: 0 long chain fatty acids. While reducing the concentration dependently, and also significantly lower the ratio of C26: 0 / C22: 0 provides a fundamental treatment method such as X-linked adrenal protein dystrophy, a refractory disease.
  • FIG. 1 is a diagram showing the results of high-throughput screening (HTS) analysis and screening.
  • FIG. La shows the results of electroporation (el ectroporat i on) of CCALD fibroblasts with the indicated reporter plasmid (800 luc or 800 ⁇ 21uc) and Renilla luciferase plasmid using a microporator.
  • electroporation el ectroporat i on
  • reporter plasmid 800 luc or 800 ⁇ 21uc
  • Renilla luciferase plasmid using a microporator.
  • Two days after electroporation cells were treated with the indicated concentrations of lovastatin (Lova) or 4-PBA with reference compounds. After 24 hours luciferase activity was measured and normalized to Renilla luciferase activity. Data values are expressed as the mean (temporal error) for the three experimental values.
  • Figure lb is a CCALD fibroblast 800 X 21uc and Renilla luciferase plasmid electroporation a 96-well back to the - primary heat compound (64), seeded and after 24 hours the plates were treated with a final concentration of 5 ⁇ ⁇ The figure shows the result. After 24 hours, cells were collected and the light emission signal was measured. The data shows the relative luciferase activity of nine secondary hit compounds, each showing the results of one of three independent experiments. 4- ⁇ (4P; ImM) compound was used as a reference compound.
  • FIG. Lc shows the results of measuring VLCFA concentrations after seeding cells in 6-well plates and treating nine secondary heat compounds at 3 ⁇ M concentration for 4 days. Each data shows the results of one of three independent experiments.
  • Figure Id is a diagram showing the chemical structure of HMA purchased from Sigma-Aldr i ch.
  • Figure 2 shows that HMA reduces VLCFA in a dose dependent manner in ALD fibroblasts.
  • Figure 2a is a diagram showing the results of treatment with 4-PBA (4P; 2mM) or HMA to normal human skin fibroblasts or CCALD fibroblasts. After 4 days of treatment, cells were harvested and the VLCFA concentration was measured. Data values are expressed as the mean (standard error) for the three experimental values. 0.001; DMS0 treated ALD fibroblasts vs. HMA treated ALD fibroblasts.
  • Figure 2b is a diagram showing the results of measuring the ABCD2 mRNA expression level by qPCR 2 days after treatment with 4-PBA (4P, 2 mM) or HMA CCALD fibroblasts. GAPDH mRNA was used for standardization. Data values are expressed as the mean (standard error) for the three experimental values. All experiments were repeated three times independently.
  • FIG. 3 shows that HMA decreases VLCFA over time in ALD fibroblasts.
  • Figure 3a is a diagram showing the results of treatment of DMS0 or HMA to CCALD fibroblasts. After treatment, cells were collected and the VLCFA concentration was measured. Data values are expressed as the mean (standard error) for the three experimental values. * p ⁇ 0.001; DMS0 treated ALD fibroblasts vs. HMA treated ALD fibroblasts.
  • Figure 3b is a diagram showing the results of measuring the mRNA expression by qPCR treated with CCALD fibroblasts DMS0 or HMA. GAPDH mRNA was used for standardization. Data values are expressed as the mean (standard error) for the three experimental values. All experiments were repeated three times independently. 4 shows the effect of HMA on cell viability.
  • CCALD fibroblasts were seeded in 96-well plates and after 24 hours treatment with DMS0 or HMA and incubated for 1-2 days. The formazan produced by intracellular ⁇ was then quantified. Data values are expressed as the mean (temporal error) for the three experimental values. * ⁇ 0.05; DMS0 treated cells vs ⁇ treated cells.
  • 5 is a diagram showing the effect of EIPA on the reduction of VLCFA concentration.
  • Figure 5a is a diagram showing the results of measuring VLCFA concentration after treatment with DMSO (DM) or EIPA in CCALD fibroblasts. Data values are expressed as the mean (temporal error) for the three experimental values. * ⁇ 0.001; DMS0 treated cells vs EIPA treated cells.
  • Figure 5b is a diagram showing the chemical structure of EIPA purchased from Sigma-Al dr i ch.
  • FIG. 6 is a flow chart of high-throughput screening (HTS) for 1280 compounds. Electroporated cells were seeded in 96-well-plates and incubated for 24 hours, followed by compound treatment, followed by another 24 hours. Luciferase activity was measured from the lysate of the collected cells. Secondary screening was carried out for 64 primary heat compounds, and the secondary heat compounds were selected through activity comparison with 4-PBA.
  • HTS high-throughput screening
  • FIG. 7 is a diagram showing ⁇ ⁇ mRNA induction by treatment with 9 hit compounds.
  • CCALD fibroblasts were treated with DMSO (DM), 4-PBA (4P, 2 mM) or 9 secondary heat compounds, and mRNA was isolated 2 days later. mRNA expression was measured by qPCR and ⁇ mRNA was used for standardization. Data values are expressed as the mean (standard error) for the three experimental values.
  • Figure 8 shows that HMA regulates VLCFA concentration and 3 ⁇ 42 mRNA expression in AMN-type fibroblasts.
  • Figure 8a is a figure showing the results of measuring the VIXFA concentration 4 days after treatment with DMSO (DM) or HMA to AMN-type fibroblasts. Data values are expressed as the mean (temporal error) for the three experimental values. * p 0.001; DMS0 treated cells vs HMA treated cells.
  • Figure 8b is a figure showing the results of measuring the ABCD2 mRNA expression by qPCR two days after treatment with AMN-type fibroblast DMSO (DM), 4-PBA (4P, 2 mM) or HMA. MRNA was used for standardization, and data values were expressed as minus mean (temporal standard error) for three experiments. All experiments were repeated three times independently.
  • a library of pharmacologically active agents for ABCD2 induced screening (Lopac 1280 TM library) was purchased from Sigma-Akir ich. Lovastatin was purchased from Calbiochem, 4-PBA (4-phenylbutyrate), HMA (5- (V, ⁇ i -hexamethylene) ami loride), EIPA (5- (yV-ethyl-yV-isopropyl) ami loride), Amyl Lauride hydrochloride hydrate and MTT [3- (4,5-dimethyl thiazol-2-yl) -2, 5-diphenyl tetrazolium bromide] were purchased from Sigma® Aldrich.
  • MEM Eagle's minimumessent ial medium
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • FBS Fe l bovine serum; HyClone TM
  • TRIzol and Lipof ectamine TM RNAiMAX reagents were purchased from Invitrogen.
  • Human X-ALD fibroblasts (CCALD type, GM04496; AMN type, GM17819) were purchased from Coriell Inst itute (ccr.coriell.org/), and human skin fibroblasts (HDF) were obtained from Invitrogen Cat #, O004-5C. Purchased. X-ALD fibroblasts were cultured in MEM containing 15% FBS, 1% penicillin and streptomycin, and HDF was cultured in DMEM containing 10% FBS, 1% penicillin and streptomycin. Plasmid
  • a phABCD2-800-luc plasmid comprising 800 bp upstream of the ABCD2 promoter was constructed by the method reported by the inventors (Park CY et al., 2013, PLOS One, vol8, e56242). 800 bp upstream of ABCD2 promoter
  • the sequence of the reporter construct was confirmed through DNA sequencing (Solgent, Korea). Drug Screening and Luciferase Reporter Assays
  • CCALD fibroblasts (2 ⁇ 10 6 ) were transferred to 3yg of phABCD2 using a conventionally reported method (Park CY et al. ( 2013, PLOS One, vol 8, e56242) using a microperforator transformation system (Neon TM, Invitrogen).
  • Transient cells were transiently transformed with lug's pRL-SV40 plasmid containing Ren800 luciferase gene regulated with -800 x 2-luc polasmid and Simianvirus 40 promoter
  • Transfected cells were seeded in 96-well plates and for 24 hours Each compound of the library plate was then treated to a final concentration of 10 tiM for the first screening
  • Firefly Renilla luciferase activity assays were performed on cells one day after the treatment vehicle (DMS0).
  • 64 primary heat compounds with 2.5 times more activity induction were selected and screening was repeated at a final concentration of 5 iiM for secondary screening. 1 mM concentration).
  • Luminescent signals were measured using a microplate luminometer (Berthold Technologies) and ReniUa luciferase activity was used for standardization.
  • X-ALD fibroblasts were cultured in MEM containing 15 3 ⁇ 4 FBS, 1% penicillin and streptomycin, and HDF was cultured in DMEM containing 10 3 ⁇ 4 FBS, 13 ⁇ 4 penicillin and streptomycin.
  • a phABCD2-800-luc plasmid comprising 800 bp upstream of the ABCD2 promoter was constructed by the method reported by the inventors (Park CY et al., 2013, PLOS One, vol8, e56242).
  • CCALD fibroblasts (2 ⁇ 10 6) were cultured using a microperforator transformation system (Neon TM, Invitrogen) (Park CY et al., 2013, PLOS One, vol8, e56242) to 3 ug of phABCD2-800 ⁇ Lyg's pRL-SV40 plasmid containing the Renilla luciferase gene regulated with 2-luc polasmid and Simianvirus 40 promoter was transiently transformed. Transformed cells were seeded in 96-well plates and incubated for 24 hours. Each compound of the library folate was then treated to a final concentration of 10 ⁇ for primary screening.
  • Neon TM, Invitrogen Park CY et al., 2013, PLOS One, vol8, e56242
  • RNA was isolated using TRIzol reagent according to the manufacturer's instructions.
  • cDNA was synthesized from Diag TM cDNA synthesis kit (SolGent, Korea) from lmg total RNA.
  • the synthesized cDNA was qPCR amplified using SYBR® PremixExTaq (Takara) and CFXConnect TM Real-Time PCR System (Bio-Rad) according to the manufacturer's instructions.
  • the primer sequences used are shown in Table 2.
  • X-ALD fibroblasts were collected via trypsin treatment and cell precipitates (2 ⁇ 10 5 cells) were lysed in PBS.
  • VLCFA analysis was performed at the Seoul Clinical Research Institute by a previously reported method (Paik MJ et al., 2001, / chromatogr B Biomed Sci Appl, vol 760, 149-157). VLCFA was measured via methyl ester formation as previously reported (Moser HW et al., 1980, Ann Neurol. Vol 7 542-549). In brief, heptacosanoic acid (C27: 0) was added to each sample as an internal standard.
  • luciferase reporter plasmid comprising one or two copies of the 800 bp upstream portion of the human ABCD2 promoter was first constructed.
  • the X-ALD therapeutic drugs lovastatin and .4-PBA induce promoter activity in both luciferase reporter systems (FIG. La).
  • the reporter activity was greater in the experimental group transformed with the reporter plasmid having two 800bp sites when treated with the X-ALD therapeutic drug compared to the case with one 800bp site (Fig. La .
  • the inventors performed HTS in CCALD fibroblasts to identify low molecular weight compounds having A 2 gene induction activity.
  • a total of 64 candidate compounds were identified through primary screening treated with 10 ⁇ concentration, and secondary screening at 5 ⁇ concentration was used to determine luciferase activity and 4-PBA ImM concentration.
  • Nine hit compounds showing the same or higher activity were identified (FIGS. Lb and 6).
  • HMA dose-dependently reduces VLCFA levels in ALD fibroblasts.
  • HMA HMA-induced VLCFA reduction and 3 ⁇ 42 mRNA expression in AMN-type patient cells
  • HMA was dosed in cultured AMN-type cells.
  • VLCFA was decreased and ABCD2 mRNA level was increased at all HMA concentrations (FIG. 8).
  • the effect of increasing ⁇ Z niRNA expression of HMA was found in normal fibroblasts as well as in ALD patient cells.
  • VLCFA levels of HMA r ALD fibroblasts decrease over time.
  • the level of intracellular VLCFA was confirmed after treatment with 3 ⁇ concentration of ⁇ .
  • VLCFA was significantly reduced in proportion to HMA treatment time (FIG. 3A).
  • the ABCD2 mRNA level increased in proportion to the HMA treatment time (Fig. 3b).

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Abstract

본 발명은 긴사슬지방산 과다질환, 특히 X-연관 부신백질이영양증에 대한 효율적인 치료제 조성물로서 아밀로라이드(amiloride) 유도체 화합물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 긴사슬지방산 분해에 관여하는 ABCD1 단백질에 대한 보상효과(compensatory effect)가 있는 ABCD2 유전자 프로모터 활성을 유의하게 증가시키고, C26:0 및 C24:0 긴사슬지방산의 수준을 농도 의존적으로 감소시키면서, 아울러 C26:0/C22:0의 비율도 유의하게 낮추어 난치성 질환인 X-연관 부신백질이영양증 등의 근본적인 치료방법을 제공한다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭]
X-연관 부신백질이영양증의 예방 또는 치료용 조성물 [기술분야】
본 발명은 대한민국 미래창조과학부의 지원 하에서 과제번호 2012M3A9B4028631에 의해 이루어진 것으로서， 상기 과제의 연구관리전문기관은 연세대학교 산학협력단, 연구사업명은 "바이오 의료기술개발사업" , 연구과제명은 "전분화능 줄기세포로부터 중뇌 혹질부 특이적 도파민 신경 세포의 효율적 분화법 개발을 통한 신경계 질환 세포치료 원천기술 개발" ， 주관기관은 연세대학교 산학협력단， 연구기간은 2012.06.01 ~ 2017.05.31이다.
본 발명은 대한민국 보건복지부의 지원 하에서 과제번호 A120254에 의해 이루어진 것으로서, 상기 과제의 연구관리전문기관은 연세대학교 산학협력단， 연구사업명은 "보건의료연구개발사업" ， 연구과제명은 "배아줄기세포의 고효율 신경세포분화법을 통한 파킨슨병과 척수손상 임상적용 핵심기술 개발 (역분화줄기세포 유래 세포를 대조군으로한 안전성 유효성 비교 평가) " , 주관기관은 연세대학교 산학협력단, 연구기간은 2012.08.01 ~ 2015.07.31이다.
본 발명은 대한민^ > 교육과학기술부의 지원 하에서 과제번호
2012M3A9C7050126에 의해 이루어진 것으로서, 상기 과제의 연구관리전문기관은 연세대학교 산학협력단， 연구사업명은 "바이오 의료기술개발사업" ， 연구과제명은 "환자유래 역분화 줄기세포 이용 질병 모델 개발 및 신경계 분화세포로 약효 독성 평가 플랫폼 개발" , 주관기관은 연세대학교 . 산학협력단， 연구기간은 2012. 10.01 ~ 2017.09.30이다.
ᅵ본 특허출원은 2013 년 12 월 31 일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제 10-2013-0168849 호에 대하여 우선권을 주장하며， 상기 특허출원의 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 본 발명은 아밀로라이드 (ami lor ide) 유도체 화합물올 유효성분으로 포함하는 X-연관 부신백질이영양증의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 【발명의 배경이 되는 기술】
X-연관 부신백질이영양증 (X-1 inked adr eno leukodystrophy, X-ALD)은 열성 유전질환으로, 17,000-20,000 명의 남성중 1 명 꼴로 발병하는 낮은 유병를을 보이는 과산화소체 (peroxisom)와 관련된 질환이다 (Singh I. et al. , Brain Pathol, 20： 838-844(2010) ) . X-ALD 는 Xq28 에 위치한 ABCD1 유전자 내 위치한 다양한 유전적 변이 또는 하나 또는 들 이상의 액손의 대량 소실을 원인으로 한다 (Kemp S. et al., Hum Mutat, 18： 499-515(2001) ) . ABCD1 유전자는 ALDP(adrenoleukodystrophy protein)라고도 불리는 ABCD1 ( ATP-b i nd i ng cassette(ABC) transporter subfamily D member 1)을 인코딩한다 (Mosser J. et al . , Nature, 361:726-730(1993)). X-ALD 환자의 임상적인 증상으로 볼 때 치명적인 소아형 대뇌형 (Childhood Cerebral form ALD, CCALD)과 상대적으로 온화한 성인형인 부신척추 신경병형 (adrenomyeloneuropathy, AMN)이 가장 흔한 표현형들이며 (70¾ 이상)， 소수 다른 표현형들도 있다 (Berger J. et al . , BBA, 1763： 1721- 1732(2006)； Moser HW et al . , Nat Clin Pract Neurol, 3:140—151(2007)). 그 중 CCALD 타입은 일찍 (3-10 세 ) 발병하는 타입으로 대개 뇌에서 빠르게 진행하는 염증성 탈수초화((1∞ 0^ 011)를 보여 2-5 년 내에 식물인간 상태가 되어 죽음에 이른다 (Kemp S. et al .， Bri J Pharm, 164： 1753- 1766(2011)). 임상적인 표현형과 ABCD1 유전자 내 변이된 유전자형 간의 일관된 상관관계는 없다고 알려져 있다 (Smith KD. et al .， Neurochew Res, 24:521-535(1999)). X-ALD 의 생화학적인 특성은 ABCD1 단백질 (ALD 단백질이라고도 불리는)의 기능 이상으로 인한 혈장 및 조직， 특히 뇌 및 부신피질 내 긴사슬지방산 (또는 긴꼬리지방산， very long chain fatty acids, VLCFAs)의 과다축적이다 (Kemp S. et al . , brain pat hoi, 20 :831- 837(2010)).
Abcdl 변이 마우스는 VLCFA β산화가 감소하고 섬유아세포 및 뇌， 척수 및 부신피질 등의 조직에서 VLCFAs 가 축적되는 것으로 알려져 있다 (Yamada T. et al., Cell Bio Bio, 32： 239-246(2000)； Forss-Petter S. et al., J Neu Res 50:829(1997); obayashi T. et al . , BBRC, 232： 631(1997)； Lu JF. et al . , WAS 94:9366(1997)) . 최근에， 본 발명자들은 X-ALD 모델에서 수득한 유도만능줄기세포 (induced pluripotent stem cell, iPSC)로부터 분화한 뉴런 및 희돌기교세포 (또는 희소돌기아교세포, oligodendrocytes)에 VLCFAs 가 누적되어 있음을 확인하였다 (Jang J. et al . , Ann Neurol 70:402-409(2011)). 현재， 로렌조 오일 (Lorenzo's oil)은 뇌 MRI 사진 결과가 정상인， 증세가 발견되기 전의 소년 환자에게서 보존적 효과를 보이기는 하지만 현재로서 X-ALD 에 대한 성공적인 치료제는 개발되어 있지 않다 (Moser HW. et al . , J Mol Neu, 33:105-113(2007)). ABCD2 는 ALDRP(ALD-related protein)라고도 불리는 ABCD2 단백질을 인코딩하며， ABCD2 단백질은 ABCD1 과 높은 상동성을 보인다 (Holzinger A. et al. , BBRC, 239:261-264(1997)). 아울러， ALDRP 는 ALDP 와 기능적 유사성을 가진다. 이런 면에서， ABCD2 단백질의 인위적 발현은 ABCD1 결핍을 대체하여 생체 외 (Kemp S. et al . , Nat Med 4:1261-1268(1998)) 뿐 아니라 생체내 (puj0l A. et al., Hum Mol Genet 13:2997-3006(2004)) VLCFAs 수준을 정상화시킬 수 있다. 따라서， ABCD2 유도는 X-ALD 치료의 유망한 타겟으로 보고된 바 있다 (Berger J. et al . , Brain Pathol 20： 845- 856(2010)). 사실, 몇몇 화합물들이 유전자의 발현을 다소 유도하는 것으로 조사되기는 하였으나 (Kemp S. et al . , Nat Med 4:1261-1268(1998)； Singh J. et al., J Lipid Res 52:2056-2069 (2011)), X-ALD 의 임상적인 치료를 담보할 만큼 효율적인 의약은 아직 동정된 바가 없다.
HTSCHigh-throughput screening) 분석은 다양한 세포 기능 및 경로를 조절하는 화합물을 동정하기 위한 도구로 사용되어 왔다 (Inglese J. et al .， Nat Che Bio 3:466-479(2007)). 루시퍼라아제 (Lucif erase) 리포터 (Reporter)는 민감성과 검출의 편리성으로 인하여 HTS 에서 널리 사용된다 (Michelini E. et al. , Anal Bioanal Chew 398:227(2010)). 본 발명자들은 투시퍼라아제 리포터 시스템을 이용하여 X-ALD 환자의 섬유아세포에서 2 유전자의 프로모터 활성을 조절하는 화합물을 탐색한 결과 특정 구조의 아밀로라이드 (amiloride) 유도체 화합물을 발굴하였다. 나아가, 본 발명의 화합물을 X-ALD 환자의 섬유아세포에 투여하자 VLCFA 수준이 농도 및 시간 의존적으로 정상으로 회복됨을 관찰함으로써， 본 발명의 화합물이 X-ALD 치료에 매우 효율적인 신규 치료제 조성물임이 확인되었다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
【발명의 내용】
【해결하고자 하는 과제】
본 발명자들은 X-연관 부신백질이영양증을 비롯한 긴사술지방산 (Very l ong chain fatty aci ds , VLCFAs )의 세포내 과다 축적을 원인으로 하는 다양한 질환의 효과적인 치료제를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 하기 화학식 1 화합물이 VLCFAs 를 분해하는 데에 연관된 ABCD1 단백질의 기능을 대체할 수 있는 ABCD2 유전자 발현을 증가시키고， 이에 따라 VLCFAs 의 분해가 촉진되어 결과적으로 긴사슬지방산의 축적을 크게 개선시킨다는 사실을 발견함으로써， 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 긴사슬지방산 과다질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다. 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명， 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다. 【과제의 해결 수단】
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 화학식 1 로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 긴사슬지방산 과다질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다: 화학식 1
Figure imgf000006_0001
상기 화학식에서 는 단일결합 또는 이중결합을 나타내며;
가 이중결합일 때 Z 는 N 이고 Y
Figure imgf000006_0002
(ArA4 는 각각 독립적으로 소 또는 d-C3 알킬)이며; 가 단일결합일 때 τ
Η이고 Υ
Figure imgf000006_0003
(BrBs는 각각 독립적으로 수소 또는 d-Cs 알킬)이고;
Ri 및 R2는 각각 독립적으로 수소 또는 Cr"C3 알킬이며 ; X는 할로겐이고; R3 및 R4 는 각각 독립적으로 수소 또는 Cr :4 알킬이거나, 또는 R3 및 는 서로 연결되어 R3 및 ¾ 이 결합하는 N 과 함께 5 각 -7 각 고리의 N-포함 헤테로사이클로알킬을 이룬다.
본 발명자들은 X-연관 부신백질이영양증을 비롯한 긴사슬지방산 (Very long chain fatty acids , VLCFAs)의 세포내 과다 축적을 원인으로 하는 다양한 질환의 효과적인 치료제를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과， 상기 화학식 1 화합물이 VLCFAs 를 분해하는 데에 연관된 ABCD1 단백질의 기능을 대체할 수 있는 ABCD2 유전자 발현을 증가시키고, 이에 따라 VLCFAs 의 분해가 촉진되어 결과적으로 긴사슬지방산의 축적을 크게 개선시킨다는 사실을 발견하였다.
본 명세서에서 용어 "긴사슬지방산 과다질환" 은 C26 : 0 및 C24 : 0 인 긴사슬 지방산 (VLCFAs )의 수송 및 분해를 돕는 기능을 하는 부신백질이영양증 단백질 (ALDP)의 결핍 또는 기능 이상으로 인하여 비정상적으로 높은 수준의 V1XFA 가 생성 및 축적되고, 이에 의해 신경계 백질 및 부신피질이 손상되어 시각， 청각 및 운동장애가 오고， 부신기능부전이 발생하며， 아드레날린과 코티솔과 같은 부신 호르몬 감소가 일어나 혈압， 심박수， 성적 발달 및 생식능력의 이상을 유발하는 모든 질환을 의미한다
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면， 본 발명와 조성물로 예방 또는 치료되는 긴사슬지방산 과다질환은 X-연관 부신백질이영양증 (X- l i nked adreno l eukodyst rophy , X-ALD) , 젤웨거 증후군 (Ze l lweger syndrome) 및 레프섬병 (Ref sum ' s di sease)으로 구성된 군으로부터 선택된다
본 발명의 보다 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물로 예방 또는 치료되는 긴사슬지방산 과다질환은 X-연관 부신백질이영양증이다. 보다 구체적으로는， 상기 X-연관 부신백질이영양증은 소아형 대뇌형 X-ALD (Chi l dhood Cerebral form ALD , CCALD) 또는 부신척추신경병형 (adrenomyel oneuropathy , A N) X-ALD 이다.
본 명세서에서 용어 "치료" 는 (a)질환， 질병 또는 증상의 발전의 억제; (b)질환， 질병 또는 증상의 경감; 또는 (c)질환, 질병 또는 증상올 제거하는 것을 의미한다. 본 발명의 조성물은 긴사슬지방산 과다질환의 증상을 억제하거나， 이를 제거하거나 또는 경감시키는 역할을 하며， 이에 본 명세서에서 용어 "치료" 또는 "치료제" 는 "치료 보조" 또는 "치료 보조제" 의 의미를 포함한다.
본 명세서에서， 용어 "예방" 은 질환 또는 질병을 보유하고 있다고 진단된 적은 없으나， 이러한 질환 또는 질병에 걸릴 가능성이 있는 대상체에서 질환 또는 질병의 발생을 억제하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 용어 "알킬" 은 직쇄 또는 분쇄의 포화 탄화수소기를 의미하며, 예를 들어， 메틸, 에틸， 프로필， 이소프로필 등을 포함한다. Ci- C3알킬은 탄소수 1 내지 3의 알킬 유니트를 가지는 알킬기를 의미하며 , d- C3 알킬이 치환된 경우 치환체의 탄소수는 포함되지 않은 것이다.
본 명세서에서 용어 "할로겐" 은 할로겐족 원소를 나타내며， 예컨대, F , CI , Br 및 I를 포함한다.
본 명세서에서 용어 "N-포함 헤테로사이클로알킬" 은 헤테로 원자로서 질소를 포함하는 환형의 알킬분자를 의미한다. 5 각 -7 각 고리의 N-포함 헤테로사이클로알킬은 환형 고리를 이루는 질소 및 탄소 원자의 수가 5개 내지 7개인 경우이다. 본 발명의 구체적인 구현예에 따르면， 본 발명의 화학식 1 의 ΑΓ·Α4는 수소이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면， 본 발명의 화학식 1 의 -¾는 수소이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면， 본 발명의 화학식 1 의 및 R2는 수소이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면， 본 발명의 화학식 1 의 X 는 C1이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면， 본 발명의 화학식 1 의 N-포함 헤테로사이클로알킬은 N-사이클로핵사메틸렌이다. 본 발명의 구체적인 구현예에 따르면， 본 발명의 화학식 1 로 표시되는 화합물은 하기의 화학식 2 또는 3으로 표시되는 화합물이다
화학식 2화학식 3
Figure imgf000008_0001
본 발명의 화합물은 약제학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있으며， 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산 ( free ac i d)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 유리산으로는 무기산과 유기산을 사용할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 화합물의 약제학적 허용 가능한 염은 염산염， 브름산염， 황산염， 인산염， 구연산염， 아세트산염, 트리플루오로아세트산염， 젖산염, 주석산염, 말레인산염， 푸마린산염， 글루콘산염， 메탄설폰산염， 글리콘산염, 숙신산염, 4-를루엔설폰산염， 글루투론산염， 엠본산염, 글루탐산염， 또는 아스파트산염으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으나， 이에 제한되지 않고 당업계에서 통상적으로 사용되는 다양한 무기산 및 유기산을 이용하여 형성되는 염이 모두 포함된다. 또한， 본 발명의 화합물은 용매화물 (예를 들면 수화물)의 형태로도 존재할 수 있다. 본 발명의 구체적인 구현예에 따르면， 본 발명의 조성물은 ABCD2 유전자의 프로모터 활성을 증가시킨다. "
본 발명의 조성물은 긴사슬지방산 과다질환을 예방 또는 치료하기 위한 약제학적 조성물의 형태로 제공될 수 있으며, (a) 상술한 본 발명의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "약제학적 유효량" 은 상술한 본 발명의 조성물의 효능 또는 활성을 달성하는 데 층분한 양을 의미한다 .
본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서 , 락토스 , 덱스트로스 , 수크로스 솔비를, 만니틀, 전분， 아카시아 고무, 인산 칼슘， 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슴， 미세결정성 셀를로스， 폴리비닐피를리돈， 셀를로스, 물， 시럽， 메틸 셀를로스， 메틸히드록시벤조에이트， 프로필히드록시밴조에이트, 활석， 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나， 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구：투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우 정맥내 주입, 피하 주입， 근육 주입， 복강 주입， 경피 투여 및 뇌실투여 등으로 투여할 수 있고， 구체적으로는， 예를 들어 뇌실 투여 ( intracerebroventr i cular inj ect ion)에 의해 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법， 투여 방식， 환자의 연령， 체중, 성, 병적 상태， 음식， 투여 시간， 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감웅성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.001-1000 mg/kg이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라， 약제학적으로 허용되는 담체 및 /또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액， 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제， 분말제, 과립제, 정제， 캅셀제 또는 젤 (예컨대, 하이드로젤) 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 식
포함할 수 있다. 에 본 발명의 다른 양태에 따르면， 본 발명은 유효성분으로서 다음 화학식 1 로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 조성물을 대상 (subj ect )에 투여하는 단계를 포함하는 긴사슬지방산 과다질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다:
화학식 1
Figure imgf000010_0001
는 단일결합 또는 이중결합을 나타내며;
^ 가 이중결합일 때 Z 는 N 이고 Y 는
Figure imgf000010_0002
(A!-A4 는 각각 독립적으로 d-C3 알킬)이며; 가 단일결합일 때 Z 는
NH이고 Y는
Figure imgf000010_0003
(Β厂 ¾는 각각 독립적으로 수소 또는 d-Cs 알킬)이고; 및 ¾는 각각 독립적으로 수소 또는 d_C3 알킬이며 ; X 는 할로겐이고; R3 및 R4 는 각각 독립적으로 수소 또는 d-C4 알킬이거나， 또는 및 R4 는 서로 연결되어 R3 및 이 결합하는 N 과 함께 5 각 -7 각 고리의 N-포함 헤테로사이클로알킬을 이룬다. 본 발명의 긴사슬지방산 과다질환의 예방 또는 치료 방법은 상술한 화합물을 이용하여 실시하는 것으로서, 이 둘 사이의 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다. [효과]
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 긴사슬지방산 과다질환， 특히 X-연관 부신백질이영양증에 대한 효율적인 치료제 조성물로서 아밀로라이드 (ami lor ide) 유도체 화합물올 제공한다.
(b) 본 발명의 조성물은 긴사슬지방산 분해에 관여하는 ABCD1 단백질에 대한 보상효과 (compensatory ef fect )가 있는 ABCD2 유전자 프로모터 활성을 유의하게 증가시키고, C26 : 0 및 C24 : 0 긴사슬지방산의 수준을 농도 의존적으로 감소시키면서, 아울러 C26 : 0/C22 : 0 의 비율도 유의하게 낮추어 난치성 질환인 X-연관 부신백질이영양증 등의 근본적인 치료방법을 제공한다.
【도면의 간단한 설명】
도 1 은 HTS(High-throughput screening) 분석 및：스크리닝 결과를 나타낸 그림이다. 도 la 는 CCALD 섬유아세포를 지시된 리포터 플라스미드 (800 luc 또는 800 X 21uc) 및 Renilla 루시퍼라아제 플라스미드로 마이크로포레이터를 이용하여 전기천공 (el ectroporat i on)한 결과를 나타낸 그림이다. 전기천공 2 일 후， 세포에 지시된 농도의 로바스타틴 (Lova) 또는 4-PBA 를 기준 화합물로 처리하였다. 24 시간 후 루시퍼라아제 활성을 측정하고 Renilla 루시퍼라아제 활성으로 표준화하였다. 데이터 값은 3 번의 실험값에 대한 평균 (士표준오차)으로 나타내었다. 도 lb 는 CCALD 섬유아세포를 800 X 21uc 및 Renilla 루시퍼라아제 플라스미드로 전기천공한 뒤 96-웰 -플레이트에 씨딩하고 24 시간 후 1 차 히트 화합물 (64 개)을 5 μ Μ 의 최종농도로 처리한 결과를 나타낸 그림이다. 24 시간 후， 세포를 채집하여 발광신호를 측정하였다. 데이터는 9 개의 2 차 히트 화합물의 상대적 루시퍼라아제 활성을 나타내는 것으로， 각 데이터는 3 개의 독립된 실험 중 하나의 결과를 보여준다. 4-ΡΒΑ (4P ; ImM) 화합물이 기준 화합물로 이용되었다. 도 lc 는 세포를 6-웰 플레이트에 씨딩하고 9개의 2차 히트 화합물을 3 μ Μ 농도로 4일간 처리한 후 VLCFA 농도를 측정한 결과를 나타낸 그림이다. 각 데이터는 3 개의 독립된 실험 중 하나의 결과를 보여준다. 도 Id 는 Sigma-Aldr i ch 에서 구입한 HMA의 화학구조를 나타낸 그림이다.
도 2 는 HMA 가 ALD 섬유아세포에서 용량 의존적으로 VLCFA 를 감소시킴을 보여주는 그림이다. 도 2a는 정상의 인간 피부 섬유아세포 또는 CCALD 섬유아세포에 4— PBA(4P ; 2mM) 또는 HMA 를 처리한 결과를 나타낸 그림이다. 처리 4 일 후, 세포를 채집하여 VLCFA 농도를 측정하였다. 데이터 값은 3 번의 실험값에 대한 평균 (土표준오차)로 나타내었다. * 0.001； DMS0 처리된 ALD 섬유아세포 vs HMA 처리된 ALD섬유아세포. 도 2b 는 CCALD 섬유아세포를 4-PBA (4P , 2 mM) 또는 HMA로 처리하고 2일 후 qPCR로 ABCD2 mRNA 발현량올 측정한 결과를 나타낸 그림이다. 표준화를 위해 GAPDH mRNA 가사용되었다. 데이터 값은 3 번의 실험값에 대한 평균 (土표준오차)로 나타내었다. 모든 실험은 독립적으로 3번 반복되었다.
도 3 은 HMA 가 ALD 섬유아세포에서 시간 경과에 따라 VLCFA 를 감소시킴을 보여주는 그림이다. 도 3a 는 CCALD 섬유아세포에 DMS0 또는 HMA 를 처리한 결과를 나타낸 그림이다. 처리 후， 세포를 채집하여 VLCFA 농도를 측정하였다. 데이터 값은 3 번의 실험값에 대한 평균 (土표준오차)로 나타내었다. *p< 0.001； DMS0 처리된 ALD 섬유아세포 vs HMA 처리된 ALD 섬유아세포. 도 3b 는 CCALD 섬유아세포를 DMS0 또는 HMA 로 처리하고 qPCR 로 mRNA 발현량을 측정한 결과를 나타낸 그림이다. 표준화를 위해 GAPDH mRNA 가 사용되었다. 데이터 값은 3 번의 실험값에 대한 평균 (土표준오차)로 나타내었다. 모든 실험은 독립적으로 3번 반복되었다. 도 4 는 HMA 가 세포의 생존성에 미치는 영향을 보여주는 그림이다.
CCALD 섬유아세포를 96-웰 플레이트에 씨딩하고 24 시간 후 DMS0 또는 HMA를 처리한 뒤 1-2 일간 배양하였다. 이후 세포 내 Μπ 에 의해 생성되는 포르마잔을 정량화하였다. 데이터 값은 3 번의 실험값에 대한 평균 (士표준오차)로 나타내었다. * < 0.05； DMS0 처리된 세포 vs ΗΜΑ 처리된 세포. 도 5는 EIPA가 VLCFA 농도의 감소에 미치는 영향을 나타낸 그림이다. 도 5a 는 CCALD 섬유아세포에 DMSO(DM) 또는 EIPA 를 .처리한 뒤 VLCFA 농도를 측정한 결과를 나타낸 그림이다. 데이터 값은 3 번의 실험값에 대한 평균 (士표준오차)로 나타내었다. *ι 0.001； DMS0 처리된 세포 vs EIPA 처리된 세포. 도 5b 는 Sigma-Al dr i ch 에서 구입한 EIPA 의 화학구조를 나타낸 그림이다.
도 6 은 1280 개 화합물에 대한 HTS (High-Throughput screeni ng)의 플로우챠트를 나타낸 그림이다. 전기천공된 세포를 96-웰 -플레이트에 씨딩하고 24 시간 동안 배양한 뒤 화합물을 처리한 후 다시 24 시간을 배양하였다. 채집한 세포의 파쇄물로부터 루시퍼라아제 활성을 측정하였다. 2 차 스크리닝은 64 개 1 차 히트 화합물을 대상으로 실시하였으며， 2 차 히트 화합물은 4-PBA와의 활성비교를 통해 선정하였다.
도 7 은 9 개 히트 화합물 처리에 의한 ^ ^ mRNA 유도를 보여주는 그림이다. CCALD 섬유아세포에 DMSO(DM) , 4-PBA(4P , 2 mM) 또는 9 개 2 차 히트 화합물올 처리하고 2 일 뒤 mRNA 를 분리하였다. qPCR 로 mRNA 발현량을 측정하였으며， 표준화를 위해 ¥ mRNA 가 사용되었다. 데이터 값은 3번의 실험값에 대한 평균 (土표준오차)로 나타내었다.
도 8 은 HMA 가 AMN 형 섬유아세포에서도 VLCFA 농도 및 ¾2 mRNA 발현량을 조절함을 보여주는 그림이다. 도 8a 는 AMN 형 섬유아세포에 DMSO(DM) 또는 HMA를 처리하고 4 일 뒤 VIXFA 농도를 측정한 결과를 나타낸 그림이다. 데이터 값은 3 번의 실험값에 대한 평균 (士표준오차)로 나타내었다. *p 0 .001； DMS0 처리된 세포 vs HMA 처리된 세포. 도 8b 는 AMN형 섬유아세포 DMSO(DM) , 4-PBA (4P , 2 mM) 또는 HMA를 처리하고 2일 뒤 qPCR 로 ABCD2 mRNA 발현량을 측정한 결과를 나타낸 그림이다. 표준화를 위해 mRNA 가 사용되었으며， 데이터 값은 3 번의 실험값에 대한 - 평균 (士표준오차)로 나타내었다. 모든 실험은 독립적으로 3번 반복되었다.
【발명을 실시하기 위한 구체적인 내용】
이하， 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 , 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다. 실시예
실험 방법
실험재료
ABCD2 유도 스크리닝을 위한 약리학적 활성물질의 라이브러리 (Lopac1280™ library)는 Sigma-Akir ich 에서 구입하였다. 로바스타틴은 Calbiochem 에서 구입하였으며， 4-PBA(4-phenylbutyrate)， HMA(5-(V, \i-hexamethylene)ami loride) , EIPA(5-(yV-ethyl-yV-isopropyl) ami loride), 아밀로라이드 하이드로클로라이드 수화물 및 MTT[3-(4,5- di methyl thiazol-2-yl )-2, 5-diphenyl tetrazol ium bromide]는 Sigmaᅳ Aldrich 에서 구입하였다. MEM(Eagle' s minimumessent ial medium) 및 DMEM(Dulbecco' s modified Eagle' s medium)은 Gibco-BRL Life Technologies 에서 구입하였다. FBS(Fe l bovine serum; HyClone™)은 Thermo Scientific 에서 구입하였으며， 이중-루시퍼라아제 리포터 어세이 시스템은 Promega 에서 구입하였다. TRIzol 및 Lipof ectamine™ RNAiMAX 시약은 Invitrogen에서 구입하였다. 세포배양
인간 X-ALD 섬유아세포 (CCALD 형， GM04496; AMN 형 , GM17819)은 Coriell Inst itute(ccr .coriell .org/)에서 구입하였고， 인간 피부 섬유아세포 (HDF)는 Invitrogen Cat #, O004-5C)에서 구입하였다. X-ALD 섬유아세포는 15 % FBS 와 1 % 페니실린 및 스트렙토마이신을 함유하는 MEM 에서 배양하였으며， HDF 는 10 % FBS 와 1 % 페니실린 및 스트렙토마이신을 함유하는 DMEM에서 배양하였다. 플라스미드
ABCD2 프로모터의 800bp 업스트림을 포함하는 phABCD2-800-luc 플라스미드는 본 발명자들에 의해 보고된 방법으로 제작하였다 (Park CY et al., 2013, PLOS One, vol8, e56242) . ABCD2 프로모터의 800 bp 업스트림 부위를 두 카피 포함하는 phABCD2-800 x 2-luc 플라스미드를 제작하기 위하여, 추가적인 800bp 절편을 HDF 지놈 DNA 를 주형으로 하여 증폭하고， PCR 산물을 phABCD2-800-luc 백터의 Xho\ 사이트에 서브클로닝하였다. 리포터 컨스트럭트의 서열은 DNA 시퀀싱 (Solgent, Korea)을 통해 확인하였다. 약물 스크리닝 및 루시퍼라아제 리포터 어세이
미세천공기 형질전환 시스템 (Neon™, Invitrogen)을 이용하여 종래에 보고된 방법 (Park CY et al . ( 2013, PLOS One, vol 8, e56242)으로 CCALD 섬유아세포 (2 x 106)를 3yg 의 phABCD2-800 x 2-luc 폴라스미드 및 Simianvirus 40 프로모터로 조절되는 Renilla 루시퍼라아제 유전자를 포함하는 lug 의 pRL-SV40 플라스미드로 일시적 형질전환하였다. 형질전환시킨 세포를 96-웰 플레이트에 씨딩하고 24 시간 동안 배양하였다. 이후, 1차 스크리닝을 위해 라이브러리 플레이트의 각각의 화합물을 10 tiM 의 최종 농도로 처리하였다. 처리 1 일 후， 세포에 대한 Firefly Renilla 루시퍼라아제 활성 분석을 실시하였다. 대조군인 비이클 (DMS0)에 비해 2.5 배 이상의 활성 유도를 보이는 1 차 히트 화합물 (64 개)를 선정하고 2차 스크리닝을 위하여 5 iiM의 최종농도에서 스크리닝을 반복하였다. 9개 화합물이 4-PBA 1 mM 농도)와 유사하거나 더 높은 활성을 가지는 것으로 확인되었다. 발광 신호를 마이크로플레이트 발광분석기 (Berthold Technologies)를 이용하여 측정하였고, 표준화를 위해 ReniUa 루시퍼라아제 활성을 이용하였다. 세포배양
인간 X-ALD 섬유아세포 (CCALD 형， GM04496; AMN 형， GM17819)은
Coriell Institute(ccr.coriell .org/)에서 구입하였고， 인간 피부 섬유아세포 (HDF)는 Invitrogen(Cat #, C-004-5C)에서 구입하였다. X-ALD 섬유아세포는 15 ¾ FBS 와 1 % 페니실린 및 스트렙토마이신을 함유하는 MEM 에서 배양하였으며， HDF 는 10 ¾ FBS 와 1 ¾ 페니실린 및 스트렙토마이신을 함유하는 DMEM에서 배양하였다 · 폴라스미드
ABCD2 프로모터의 800bp 업스트림을 포함하는 phABCD2-800-luc 플라스미드는 본 발명자들에 의해 보고된 방법으로 제작하였다 (Park CY et al. , 2013, PLOS One, vol8, e56242) . ABCD2 프로모터의 800 bp 업스트림 부위를 두 카피 포함하는 phABCD2-800 x 2-luc 플라스미드를 제작하기 위하여 , 추가적인 800bp 절편을 HDF 지놈 DNA 를 주형으로 하여 증폭하고, PCR 산물을 phABCD2-800-luc 백터의 Xhol 사이트에 서브클로닝하였다. 리포터 컨스트럭트의 서열은 DNA 시뭔싱 (Solgent, Korea)을 통해 확인하였다 약물 스크리닝 및 루시퍼라아제 리포터 어세이
미세천공기 형질전환 시스템 (NeonTM, Invitrogen)을 이용하여 종래에 보고된 방법 (Park CY et al., 2013， PLOS One, vol8, e56242)으로 CCALD 섬유아세포 (2 x 106)를 3ug 의 phABCD2-800 x 2-luc 폴라스미드 및 Simianvirus 40 프로모터로 조절되는 Renilla 루시퍼라아제 유전자를 포함하는 lyg 의 pRL-SV40 플라스미드로 일시적 형질전환하였다. 형질전환시킨 세포를 96-웰 플레이트에 씨딩하고 24 시간 동안 배양하였다. 이후， 1차 스크리닝을 위해 라이브러리 폴레이트의 각각의 화합물을 10 μΜ 의 최종 농도로 처리하였다. 처리 1 일 후， 세포에 대한 Firefly 및 Renilla 루시퍼라아제 활성 분석올 실시하였다. 대조군인 비이클 (DMS0)에 비해 2.5배 이상의 활성 유도를 보이는 1차 히트 화합물 (64개)를 선정하고, 2 차 스크리닝을 위하여 5 μΜ 의 최종농도에서 스크리닝을 반복하였다. 9 개 화합물이 4-PBA 1 mM 농도)와 유사하거나 더 높은 활성을 가지는 것으로 확인되었다. 발광 신호를 마이크로플레이트 발광분석기 (Berthold Technologies)를 이용하여 측정하였고， 표준화를 위해 Renilla 루시퍼라아제 활성을 이용하였다.
【표 11
L0PAC스크리닝으로 동정된 9개 화합물
Figure imgf000016_0001
1 5-(N,N-
311.7766 Na+/ H+ 안티포터 억제자 hexamet hy 1 ene ) am i lor ide
2
Rhodblock 6 215.2569 Rho 카이네이즈 경로 억제자
3 미토콘드리아 알데하이드
Daidzein 254.2446
디하이드로게나아제 억제자
4 N-Met hy 1 h i s t apr od i fen HI 히스타민 수용체
499.5252
dioxalate salt 아고니스트
5
Mibef radi 1 dihydrochlor ide 568.5649 T-형 Ca2+ 채널 블로커
6 PPARY길항제인 GW9662 와
T0070907 277.6689
구조 및 활성이 매우 유사.
7 C0X 억제자
Resveratrol 228.2499
선택적 히스톤 메틸
8 BIX 01294 trihydrochloride
600.037 트랜스퍼라아제 억제자 hydrate raGlu5 대사성 글루타메이트
9
SIB 1893 195.2664 수용체의 선택적 /비경쟁적 길항제 정량적 PCR (qPCR) 분석
qPCR 분석을 위해, 제조사의 설명서에 따라 TRIzol 시약을 이용하여 총 RNA 를 분리하였다. cDNA 는 lmg 총 RNA 로부터 DiaStar™ cDNA 합성 킷 (SolGent, Korea)으로 합성하였다. 합성된 cDNA 를 제조사의 설명서에 따라 SYBR® PremixExTaq(Takara) 및 CFXConnect™ 실시간 PCR 시스템 (Bio- Rad)을 이용하여 qPCR 증폭을 하였다. 사용된 프라이머 서열은 표 2 에 나타내었다.
【표 2】
실시간 PCR에 사용된 프라이머 서열
프라이머 서열 ABCD2 정방향 5' -GAACTGCTGTCATTCAAGAATCTG-3 '
ABCD2 역방향 5' -TGCCAATGTGTCACTGAGAGG-3'
GAPDH 정방향 5' -CCCCTCMGGGCATCCTGGGCTA-3 '
GAPDH 역방향 5' -GAGGTCCACCACCCTGTTGCTGTA-3 '
긴사슬지방산 (VLCFAs) 분석
트립신 처리를 통해 X-ALD 섬유아세포를 채집하고， 세포 침전물 (2 X 105 cells)을 PBS 에 용해시켰다. VLCFA 분석은 이전에 보고된 방법 (Paik MJ et al., 2001， / chromatogr B Biomed Sci Appl , vol 760, 149-157)으로 서울임상연구소에서 수행하였다. VLCFA 는 종래에 보고된 방법대로 메틸 에스터 형성을 통해 측정하였다 (Moser HW et al .， 1980， Ann Neurol. Vol 7 542-549). 간단히 기술하면， 헵타코산산 (heptacosanoic acid, C27:0)을 내부 표준물로서 각 시료에 첨가하였다. 이후 메탄을에 용해된 메틸렌 클로라이드 및 아세틸 클로라이드를 첨가하고 시료를 1 시간 동안 75°C에서 가열하여 메틸 에스터가 형성되도록 하였다. 이를 넁각한 후， 탄산칼륨 용액을 첨가함으로써 중화를 통해 반응을 억제하였다. 수득한 지방산 메틸 에스터를 헥산 용액으로 추출하고， 이후 극성 화합물을 제거하기 위하여 아세토니트릴로 추출하였다. 헥산 층을 취하여 온화한 질소 기체 하에서 건조될 때까지 기화시켰다. 건조된 잔기는 기체 크로마토그래피 분석을 위해 핵산에서 복원시켰다. 인 비트로 세포 생존성 분석
인 비트로 세포 생존성은 ΜΊΤ 분석을 통해 측정하였다. 웰당 5000 개의 CCALD 섬유아세포를 96-웰 조직배양 플레이트에 씨딩하였다. 24 시간 뒤 세포에 DMS0 또는 HMA 를 처리하고， 살아있는 세포의 미토콘드리아 활성을 보여주는 MT 정량 비색분석 (colorimetric assay)으로 세포 생존성을 조사하였다. 처리 후 1-2 일 동안 세포 내 MTT 에 의해 생성되는 포르마잔을 Mol ecul ar Devi ces 마이크로플레이트 리더를 이용하여 540 nm에서의 0D값을 측정함으로써 정량화하였다. 통계적 분석
데이터는 평균 (土표준오차)로 나타냈다. 통계 분석을 위해 스튜던트의 _검정을 이용하였으며， ^0.05 인 경우 통계적 유의성이 있는 것으로 간주하였다. 실험 결과
NTS 분석 및 스크리닝 결과
¾2 유도는 X-ALD 치료에 있어 유망한 접근으로 여겨지고 있어， 본 발명자들은 치료 조성물의 스크리닝에 이러한 개념을 적용하였다. 리포터 기반 세포 스크리닝 시스템을 구축하기 위하여, 우선 인간 ABCD2 프로모터의 800bp 업스트림 부위를 1 카피 또는 2 카피 포함하는 루시퍼라아제 리포터 플라스미드를 제작하였다. 본 발명자들은 X-ALD 치료약물인 로바스타틴 및 .4-PBA 가 두 개의 루시퍼라아제 리포터 시스템에서 모두 프로모터 활성을 유도함을 확인하였다 (도 la) . 또한 예상했던 바와 같이， X-ALD 치료약물을 처리하였을 때 800bp 부위를 두개를 가지고 있는 리포터 플라스미드를 형질전환한 실험군에서 800bp 부위 하나를 가지는 경우와 비교해 리포터 활성이 더 큰 것을 확인할 수 있었다 (도 la) .
다음으로， 본 발명자들은 A 2 유전자의 유도 활성을 가지는 저분자 화합물을 동정하기 위하여 CCALD 섬유아세포에서 HTS 를 수행하였다. 먼저 10 μ Μ 농도로 처리한 1 차 스크리닝을 통해 총 64 개의 후보 화합물을 확인하였고， 이들을 이용하여 5 μ Μ 농도에서 2 차 스크리닝을 수행한 결과 4-PBA ImM 농도에서 확인되는 루시퍼라아제 활성과 같거나 높은 활성을 보이는 9개의 히트 화합물을 동정하였다 (도 lb 및 도 6) .
이렇게 탐색한 9 개의 히트 화합물들에 대한 VLCFA 감소 효과를 확인한 결과， 1 번 약물과 8 번 약물올 처리하였을 때 VLCFA 감소 효과가 가장 큰 것을 확인하였다 (도 lc) . 이들 두 약물 중에 1 번 약물은 DMS0 처리군에 비해 C22 값에는 큰 영향을 미치지 않았고， C24 값과 C26 값만 감소시킴을 확인하였다. 하지만 8번 약물은 DMS0 처리군과 비교해 C22 , C24 및 C26 값을 약 3 배 가량 증가시키는 것이 확인되어 이후 실험에서 1 번 약물에 집중하여 실험을 하였다. 뿐만 아니라, 9 개 히트 화합물을 CCALD 섬유아세포에 처리한 후 세포 내 (endogeneous ) ABCD2 mRNA 수준을 확인한 결과 약물에 따라 정도의 차이는 있지만 ABCD2 mRNA 를 증가시킴을 확인하였다 (도 7) . 이러한 결과를 통해 프로모터 활성을 통한 약물 검색법이 실제 mRNA 수준을 간접적으로 신뢰도 있게 반영하고 있음을 알 수 있었다. 1 번 화합물 해당하는 HMA 화합물의 화학구조는 도 Id 에 나타내었으며, 검색된 9 개의 약물에 대한 정보는 하기의 표 3 에 표시하였다.
【표 3】
L0PAC 스크리닝으로 동정된 9개 화합물
Figure imgf000020_0001
구조 및 활성이 매우유사.
7
Resveratrol 228.2499 COX 억제자 선택적 히스톤 메틸
BIX 01294 tr ihydrochl or ide
8
600.037 트랜스퍼라아제 억제자 hydrate 1 5 대사성 글루타메이트
9
SIB 1893 195.2664 수용체의 선택적 /비경쟁적 길항제
HMA는 ALD섬유아세포의 VLCFA 수준을 용량의존적으로 감소시킨다.
CCALD 섬유아세포에서 HMA 약물에 의한 VLCFA 감소 효과를 확인하기 위해 HMA 용량올 달리하여 처리해 본 결과， 약물의 농도 의존적으로 VLCFA 가 유의적으로 감소함을 확인하였다 (도 2a ) . 홍미롭게도 2mM 농도로 처리한 4-PBA 실험군에서는 VLCFA 가 DMS0 처리군과 비교해 차이를 보이지 않았지만, HMA 는 3 μ Μ 농도로 처리하여도 VLCFA 감소 효과가 있음을 확인하였다 (도 2a) . 다음으로 HMA 처리에 의한 :Z mRNA 수준을 조사한 결과， HMA 농도 의존적으로 ABCD2 mRNA 수준이 증가되는 것을 확인할 수 있었다 (도 2b) . 뿐 아니라 ALD 환자의 또 다른 타입인 AMN 형 환자세포에서 HMA 에 의한 VLCFA 감소 효과 및 ¾2 mRNA 발현증가 효과를 확인하고자 배양된 AMN 형 세포에 HMA 를 용량별로 처리하였다. 그 결과 모든 HMA 농도에서 VLCFA 가 감소하고 ABCD2 mRNA 수준이 증가함을 확인할 수 있었다 (도 8) . HMA의 ^Z niRNA 발현 증가 효과는 ALD 환자 세포에서 뿐만 아니라 정상 섬유아세포에서도 확인되었다.
HMA r ALD섬유아세포의 VLCFA 수준을시간의 경과에 따라 감소시킨다. CCALD 섬유아세포에서 HMA 약물에 의한 VLCFA 감소 효과가 처리시간 의존적으로 나타나는지를 확인하기 위해 3 μ Μ 농도의 ΗΜΑ 를 처리한 후 시간별로 세포내 VLCFA 수준을 확인하였다. 그 결과 HMA 처리 시간에 비례하여 VLCFA 가 유의적으로 감소됨을 확인할 수 있었다 (도 3a) . 뿐 아니라 ABCD2 mRNA 수준도 HMA 처리 시간에 비례하여 증가하는 것이 확인되었다 (도 3b) . 이러한 결과를 통해 HMA 가 CCALD 섬유아세포 세포에 처리 농도와 시간에 비례하여 효과적으로 VLCFA 를 감소시키는 것을 알 수 있었다. HM가세포 독성에 미치는 영향
다음으로 HMA 약물에 의한 세포독성여부를 확인하기 위해 ΜΊΤ 분석을 수행하였다. CCALD 섬유아세포에 HMA 를 용량별로 처리한 후 2 일째까지 24 시간 단위로 살아있는 세포의 상대적인 양을 확인한 결과， 3 y M 및 6 μ Μ 농도에서는 2 일째까지 세포의 생존에 큰 영향을 미치지 않음을 확인하였다 (도 4) .
ΕΙΡΑ가 VLCFA 농도 감소에 미치는 영향
마지막으로 HMA 와 유사한 구조를 가지면서 약물의 작용점이 같은 EIPA 약물에 의한 VLCFA 감소 효과를 조사하였다. 도 5a 에서 확인할 수 있는 바와 같이, EIPA 약물올 처리할 경우 농도 증가와 비례하여 VLCFA 가 감소함이 확인되었다 (도 5a) . EIPA의 화학구조는 도 5b에 표시하였다. 이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바， 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며， 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서， 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

【특허청구범위】
[청구항 1】
다음 화학식 1 로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 긴사슬지방산 과다질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물:
화학식
Figure imgf000023_0001
상기 화학식에서 는 단일결합 또는 이중결합을 나타내며;
가 이중결합일 때 Ζ 는 Ν 이고 Υ 는
Figure imgf000023_0002
(A1-A4 독립적으로 수소 또는 C厂 C3 알킬)이며; 단일결합일
NH이고 Y는
Figure imgf000023_0003
(B -¾는 각각 독립적으로 수소 또는 d-C3 알킬)이고;
Ri 및 R2는 각각 독립적으로 수소 또는 (：广(：3 알킬이며 ; X는 할로겐이고; ¾ 및 R4 는 각각 독립적으로 수소 또는 C厂 C4 알킬이거나， 또는 ¾ 및 ¾ 는 서로 연결되어 R3 및 이 결합하는 N 과 함께 5 각 -7 각 고리의 N-포함 헤테로사이클로알킬을 이룬다.
【창구항 2】
거 1 1 항에 있어서， 상기 화학식 1 의 ΑΓ·Α4는 수소인 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 3】 제 1 항에 있어서, 상기 화학식 1 의 는 수소인 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 4】
제 1 항에 있어서， 상기 화학식 1 의 및 f¾ 는 수소인 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 5】
제 1 항에 있어서， 상기 화학식 1 의 X 는 C1 인 것을 특징으로 하는 조성물. '
【청구항 6】
제 1 항에 있어서， 상기 N-포함 헤테로사이클로알킬은 N- 사이클로핵사메틸렌인 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 7】
제 1 항에 있어서, 상기 화학식 1 로 표시되는 화합물은 하기의 화학식 2 또는 3으로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 하는 조성물:
화학식 2
Figure imgf000024_0001
【청구항 8]
제 1 항에 있어서， 상기 긴사슬지방산 과다질환은 X-연관 부신백질이영양증 (X- 1 inked adreno l eukodyst rophy , X-ALD) , 젤웨거 증후군 (Zel lweger syndrome) 및 레프섬병 (Ref sum ' s di sease)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 9】 제 8 항에 있어서， 상기 긴사슬지방산 과다질환은 X-연관 부신백질이영양증 (X-1 inked adreno leukodyst rophy, X-ALD)인 것을 특징으로 하는 조성물.
[청구항 10】
제 9 항에 있어서， 상기 X-연관 부신백질이영양증 (X-1 inked adreno l eukodystrophy, X-ALD)은 소아형 대뇌형 (Chi ldhood Cerebral form ALD , CCALD) X-ALD 또는 부신척추 신경병형 (adrenomyeloneuropathy, AMN) X-ALD인 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 11】
제 1 항에 있어서， 상기 조성물은 Z 유전자의 프로모터 활성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 12】
유효성분으로서 다음 화학식 1 로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 조성물을 대상 (subj ect )에 투여하는 단계를 포함하는 긴사슬지방산 과다질환의 예방 또는 치료 방법: 화학식 1
Figure imgf000025_0001
상기 화학식에서 단일결합 또는 중결합을 나타내며;
가 이중결합일 때 Z 는 N 이고 Y 는
Figure imgf000025_0002
-A4 는 각각 독립적으로 수소 또는 d-Cs 알킬)이며; 단일결합일 때 Z 는 NH이고 Y는
Figure imgf000026_0001
( -¾는 각각 독립적으로 수소 또는 (：厂(：3 알킬)이고;
Ri 및 R2는 각각 독립적으로 수소 또는 d-C3 알킬이며 ; X 는 할로겐이고; ¾ 및 R4 는 각각 독립적으로 수소 또는 d-C4 알킬이거나, 또는 및 는 서로 연결되어 R3 및 R4 이 결합하는 N 과 함께 5 각 -7 각 고리의 N-포함 헤테로사이클로알킬을 이룬다.
【청구항 13]
제 12 항에 있어서 , 상기 화학식 1 의 ArA4는 수소인 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 14】
제 12 항에 있어서, 상기 화학식 1 의 는 수소인 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 15】
제 12 항에 있어세 상기 화학식 1 의 및 R2 는 수소인 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 16】
제 12 항에 있어서, 상기 화학식 1 의 X는 C1 인 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 17】
제 12 항에 있어서， 상기 N-포함 헤테로사이클로알킬은 N- 사이클로핵사메틸렌인 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 18] 제 12 항에 있어서, 상기 화학식 1 로 표시되는 화합물은 하기의 화학식 2 또는 3으로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 하는 방법 :
화학식 2
Figure imgf000027_0001
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