WO2015093301A1 - ポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルおよび当該ゲルを備えた電気泳動装置 - Google Patents

ポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルおよび当該ゲルを備えた電気泳動装置 Download PDF

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    • G01N27/44795—Isoelectric focusing

Definitions

  • the present invention relates to a polyacrylamide gel electrophoresis gel and an electrophoresis apparatus including the gel, and more particularly, a polyacrylamide gel including a concentrated gel and a separation gel adjusted to a pH different from that of the concentrated gel.
  • the present invention relates to an electrophoresis gel and an electrophoresis apparatus including the gel.
  • SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis
  • the general gels used in SDS-PAGE As one of the general gels used in SDS-PAGE, it is composed of two layers having different gel concentrations and different pH values of the containing buffer, and as described in Non-Patent Document 1, a pH of 6.8 is set upstream of the electrophoresis. There is a two-layer gel having a gel containing a tricine buffer solution and having a gel containing a tricine buffer solution of pH 8.8 on the downstream side of the gel migration.
  • the protein sample (SDS-protein complex) is concentrated without separation of the protein in the gel of pH 6.8 upstream of the electrophoresis. Therefore, the gel having a pH of 6.8 on the upstream side of electrophoresis is referred to as “concentrated gel” (sometimes referred to as “stacking gel”).
  • concentration gel sometimes referred to as “stacking gel”.
  • the protein is separated by molecular weight, and thus the gel is referred to as a “separation gel”.
  • the separation in the separation gel is improved, and a sharp band can be detected in the separation gel.
  • the buffer solution contained in the concentrated gel and the separation gel has a charge under the pH condition described above, it moves when a voltage is applied. Thereby, a high current value is detected in the gel, which causes heat generation. The exotherm causes the gel to swell and worsens the electrophoretic separation pattern.
  • the inventors of the present application have developed a polyacrylamide gel that can improve the sustainability of the concentration effect and suppress the heat generation during electrophoresis while the protein sample is concentrated before being introduced into the separation gel.
  • the gel for electrophoresis was successfully developed and the present invention was completed.
  • the present invention provides a gel for polyacrylamide gel electrophoresis that realizes improvement of the persistence of the concentration effect and suppression of heat generation during electrophoresis, and also provides an electrophoresis apparatus including the gel. It is said.
  • a polyacrylamide gel electrophoresis gel according to one embodiment of the present invention includes a concentrated gel and a separation gel adjusted to a pH different from that of the concentrated gel, An acrylamide buffer is covalently bonded to at least one of the concentrated gel and the separation gel.
  • an electrophoresis apparatus includes a polyacrylamide gel electrophoresis gel, a cathode, and the cathode for the polyacrylamide gel electrophoresis.
  • An anode arranged on the opposite side and a cathode buffer added to the cathode side of the polyacrylamide gel electrophoresis gel are provided.
  • an acrylamide buffer is immobilized on a polyacrylamide gel, thereby preventing diffusion of the acrylamide buffer over time and improving the persistence of the concentration effect in the concentration gel.
  • a polyacrylamide gel electrophoresis gel in which heat generation is suppressed and resolution is improved due to a decrease in the amount of movement of the acrylamide buffer.
  • the electrophoresis apparatus provided with the said gel which improved the sustainability of the concentration effect and suppressed the heat_generation
  • FIG. 1 schematically shows an embodiment of a gel for polyacrylamide gel electrophoresis according to the present invention, and shows a state where an acrylamide buffer is covalently bonded to the gel. It is a figure which shows the automated two-dimensional electrophoresis apparatus which is one Embodiment of the electrophoresis apparatus which concerns on this invention.
  • Embodiment 1 An embodiment of a polyacrylamide gel electrophoresis gel according to the present invention, a method for producing the gel, and an embodiment of an electrophoresis apparatus including the gel will be described below.
  • polyacrylamide gel electrophoresis gel The polyacrylamide gel electrophoresis gel according to the present invention is adjusted to a concentration gel (stacking gel) that undergoes concentration without protein separation and a pH different from the concentration gel. And a separation gel for protein separation.
  • the gel for polyacrylamide gel electrophoresis in this invention can contain another gel (layer) other than a concentration gel and a separation gel.
  • protein is described as a sample to be separated by electrophoresis, but the sample is not limited to protein, and a plurality of unique samples that can be separated using gel electrophoresis. Or a substance localized at a certain position in the gel after gel electrophoresis is performed instead of a plurality of molecular species.
  • Specific examples of the sample include a preparation from a biological material (for example, an individual organism, a body fluid, a cell line, a tissue culture, or a tissue fragment), a commercially available reagent, or the like.
  • a polypeptide or polynucleotide is mentioned.
  • the polyacrylamide gel electrophoresis gel in Embodiment 1 is a denaturing gel containing SDS as a surfactant.
  • this invention is not limited to the modified
  • denatured gel containing substances for example, urea, formaldehyde, etc.
  • the polyacrylamide gel electrophoresis gel according to the present invention may be a non-denaturing gel.
  • Non-denaturing gel refers to a gel for polyacrylamide gel electrophoresis that does not contain a denaturing agent.
  • Non-denaturing gels ie, native gels) are used in native gel electrophoresis, where the running buffer and sample buffer do not contain denaturing agents.
  • polyacrylamide gel electrophoresis gel in the first embodiment is a gel used for electrophoresis by SDS-PAGE electrophoresis.
  • the present invention is not limited to SDS-PAGE, and can be applied to all polyacrylamide gel electrophoresis including SDS-PAGE.
  • the size of the polyacrylamide gel electrophoresis gel in Embodiment 1 is not limited.
  • the thickness of the polyacrylamide gel electrophoresis gel in Embodiment 1 is defined along the z direction, and the xy plane is defined by the x direction and the y direction perpendicular to the z direction.
  • the size of the gel for polyacrylamide gel electrophoresis according to the present invention is, for example, from a relatively small size having an xy plane size of about 10 cm ⁇ 10 cm and a thickness of about 1 mm to an xy plane size. Can be selected as appropriate according to the application of electrophoresis and the size of the electrophoresis apparatus, up to a relatively large size of about 30 cm ⁇ 30 cm and a thickness of about 1 mm.
  • the polyacrylamide gel electrophoresis gel according to the first embodiment is arranged between a pair of electrodes of an electrophoresis apparatus described later, and a current flows inside when a voltage is applied.
  • the direction in which the current flows that is, the sample migration direction is the y direction. That is, one electrode (cathode) of the pair of electrodes is arranged on the upstream side in the y direction with respect to the polyacrylamide gel electrophoresis gel in Embodiment 1, and the other electrode (anode) is more than the gel. It arrange
  • concentration gel and separation gel which are contained in the polyacrylamide gel electrophoresis gel in this Embodiment 1 are located in the electrophoresis direction upstream rather than a separation gel. Both gels have an interface along the direction perpendicular to the migration direction (x direction).
  • the polyacrylamide gel electrophoresis gel according to Embodiment 1 is characterized in that an acrylamide buffer is covalently bonded to the concentrated gel and the separation gel. Therefore, for other polyacrylamide gel electrophoresis gel conditions (for example, the volume of the concentrated gel, the volume of the separation gel, the position of the boundary surface in the gel, etc.), a conventionally known SDS-PAGE gel is used. It can be appropriately selected with reference.
  • the polyacrylamide of the polyacrylamide gel electrophoresis gel in this specification refers to a mixture of an acrylamide monomer and N, N′-methylenebisacrylamide (bis or bisacrylamide), and the acrylamide and bis are crosslinked.
  • the polyacrylamide gel electrophoresis gel has a branched molecular structure.
  • the covalently bonded acrylamide buffer is an acrylamide derivative having a buffering action.
  • the concentrated gel contained in the polyacrylamide gel electrophoresis gel in Embodiment 1 has a pH adjusted to a range of pH 6.0 to pH 8.8. More preferably, the pH is adjusted in the range of 6.6 to 7.5, and as an example, the pH is adjusted to 6.8. In such a concentrated gel whose pH conditions are adjusted, proteins are concentrated without being separated. In addition, since the principle of concentration is well-known, description here is abbreviate
  • an acrylamide buffer is covalently bound to the concentrated gel. Since the acrylamide buffer has a vinyl group, the acrylamide monomer can be immobilized on the gel by a covalent bond.
  • the acrylamide buffer Since the acrylamide buffer is covalently bonded to the concentrated gel, the acrylamide buffer does not move from the concentrated gel to the separation gel. Therefore, the concentration effect of the concentrated gel does not decrease with the passage of time as described above, and heat generation during migration does not occur.
  • the acrylamide buffer to be covalently bonded to the concentrated gel may be selected from acrylamide derivatives with known pKa. For example, but not limited to these, one or a plurality of buffers represented by the following general formula may be selected.
  • an acrylamide buffer having a pKa in the range of 1.0 to 12.0 is covalently bound to the concentrated gel. More preferably, an acrylamide buffer having a pKa in the range of 6.2 to 8.5 is covalently bound.
  • the acrylamide buffer in this range is covalently bound to the concentrated gel, so that the protein is sandwiched between chloride ions, which are the leading ions, and glycine, which is the trailing ions, and concentrates on the chloride ion boundary. .
  • the acrylamide buffer covalently bonded to the concentrated gel is a buffer adjusted to the same pH as the pH buffer contained in the concentrated gel.
  • the concentration of the acrylamide buffer covalently bonded to the concentrated gel is preferably in the range of 50 to 200 mM, more preferably in the range of 100 to 150 mM. By being in this range, it is possible to have a preferable buffer capacity and to concentrate the protein.
  • the composition of the conventionally known concentrated gel can be applied to other compositions, and additives can be added as long as the function of the concentrated gel is not impaired.
  • the separation gel contained in the polyacrylamide gel electrophoresis gel in Embodiment 1 has a pH adjusted to a range of 8.0 to 9.2. More preferably, the pH is adjusted to a range of 8.4 to 8.8, and as an example, the pH is adjusted to 8.8.
  • the separation gel whose pH conditions are adjusted in this way, separation of the protein sample concentrated by the concentration gel occurs. Since the principle of separation is well known, description thereof is omitted here.
  • the acrylamide buffer since the acrylamide buffer is cross-linked to the separation gel, the acrylamide buffer does not move from the separation gel to the concentrated gel. For this reason, a decrease in the concentration effect of the concentrated gel with the passage of time is suppressed, and heat generation during migration is also suppressed.
  • an acrylamide buffer having a pKa in the range of 1.0 to 12.0 is covalently bound to the separation gel. More preferably, an acrylamide buffer having a pKa in the range of 8.5 to 9.3 is covalently bound.
  • a high-resolution separation result can be obtained.
  • the acrylamide buffer covalently bonded to the separation gel is a buffer adjusted to the same pH as the pH buffer solution contained in the separation gel.
  • the concentration of the acrylamide buffer covalently bonded to the separation gel is preferably in the range of 50 to 200 mM, more preferably in the range of 100 to 150 mM. By being in this range, it is possible to have a preferable buffer capacity and to separate proteins.
  • the acrylamide buffer covalently bonded to the separation gel may be selected from acrylamide derivatives having a known pKa.
  • acrylamide derivatives having a known pKa For example, but not limited to these, one or a plurality of buffers represented by the following general formula may be selected.
  • the composition of the separation gel known in the art can be applied to the other composition, and the separation gel can contain additives as long as the sample separation of the separation gel is not inhibited.
  • FIG. 3 schematically shows a gel in which an acrylamide buffer is covalently bonded.
  • R in FIG. 3 is a carboxyl group or a tertiary amine.
  • an acrylamide buffer is crosslinked (covalently bonded) where acrylamide and bisacrylamide are crosslinked to form a branched molecular structure.
  • the polyacrylamide gel electrophoresis gel in Embodiment 1 exists in a state where the concentrated gel and the separated gel containing the buffer solutions having different pHs are in contact with each other.
  • the buffers are not mixed with each other. Therefore, there is no fear that the concentration effect of the concentrated gel is reduced by the buffer solution of the separation gel with the passage of time, and a polyacrylamide gel electrophoresis gel excellent in storage stability can be realized.
  • the buffer solution contained in the concentrated gel and the separation gel has a charge under the pH conditions described above, but according to the first embodiment, the acrylamide buffer, which is a buffer contained in the buffer solution, is covalently bonded. Therefore, the buffer solution does not move in the gel due to voltage application. As a result, the current does not flow excessively in the gel, and undesired heat generation does not occur. Therefore, it is possible to provide a polyacrylamide gel electrophoresis gel capable of detecting a good electrophoretic separation pattern without causing gel expansion.
  • the polyacrylamide gel electrophoresis gel in the first embodiment which is an SDS-PAGE gel, is prepared by providing a conventionally known method for preparing an SDS-PAGE gel. can do.
  • FIG. 1 and FIG. 2 are perspective views of instruments used for producing a polyacrylamide gel electrophoresis gel in the first embodiment.
  • FIG. 1 shows a state in which two gel plates 1 made of an insulating material are arranged so that the respective gel-forming surfaces are on the inside and are fastened with clips 2.
  • a spacer (not shown) is provided between the two gel plates 1 to provide a gap corresponding to the thickness of the polyacrylamide gel electrophoresis gel in the first embodiment.
  • the gap is filled with the gel solution using the tube 3.
  • the spacers are disposed on the side portions and the lower portion of the two gel plates 1 and are not disposed on the upper portions of the two gel plates 1. As a result, the gel solution can be filled into the gap between the two gel plates 1 from above the two gel plates 1 via the tube 3.
  • the gel solution is prepared as a separation gel solution and a concentrated gel solution, respectively.
  • the separation gel solution is a conventionally known separation gel preparation acrylamide monomer solution (composition: 9.7% acrylamide, 0.3% bisacrylamide, 375 mM Tris-HCl (pH 8.8), 0.1% TEMED, 0.05% APS) and an acrylamide buffer (pKa 8.8) added to a concentration of 100 mM.
  • the concentrated gel solution is a conventionally known concentrated acrylamide monomer solution (composition: It is prepared by adding acrylamide buffer (pKa 6.8) to a concentration of 100 mM to 2.91% acrylamide, 0.09% bisacrylamide, 0.05% TEMED, 0.03% APS).
  • the separation gel solution is filled in the gap between the two gel plates 1.
  • a polymerization initiator is added and filled.
  • the filling amount is adjusted so that the liquid surface (upper surface) of the filled solution for separation gel is lower than the upper portions of the two gel plates 1.
  • the solution is allowed to stand for a predetermined time to gel the separated gel solution.
  • distilled water (not shown) is overlaid on the surface of the separation gel solution by a conventionally known method.
  • the gelled state is shown in FIG. 2 (separation gel 4).
  • the separation gel solution is gelled, the overlying distilled water is removed, and the concentrated gel solution is overlaid on the surface of the separation gel solution.
  • a polymerization initiator is added and filled.
  • the solution is allowed to stand for a predetermined time to gel the separated gel solution.
  • the gelled state is shown in FIG. 2 (concentrated gel 5).
  • the liquid surface (upper surface) of the concentrated gel solution is lower than the upper part of the gel plate 1, but the present invention is not limited to this, and the liquid of the concentrated gel solution After matching the surface (upper surface) and the upper part of the gel plate 1, a conventionally known comb for creating a well for sample application may be inserted.
  • the solution is left for a predetermined time to gel the concentrated gel solution.
  • the polyacrylamide gel electrophoresis gel in Embodiment 1 can be prepared by the above procedure.
  • Electrophoresis Apparatus Next, an automated two-dimensional electrophoresis apparatus 400 will be described as an example of an electrophoresis apparatus according to the present invention.
  • FIG. 4 shows a main configuration of the automated two-dimensional electrophoresis apparatus 400 according to the first embodiment.
  • FIG. 4 is a perspective view showing a main part configuration of the automated two-dimensional electrophoresis apparatus 400.
  • FIG. 4B shows a configuration in which the isoelectric focusing gel 200 is coupled to the support arm 431 via the holding unit 440.
  • (C) in FIG. 4 is a cross-sectional view and a top view showing a configuration of a second-dimensional electrophoresis unit 420 used in the automated two-dimensional electrophoresis apparatus 400.
  • the automated two-dimensional electrophoresis apparatus 400 includes a first-dimensional electrophoresis unit (first electrophoresis unit) 410 including an isoelectric focusing instrument on a fixing unit 401 serving as a base, and an SDS-PAGE.
  • first electrophoresis unit first electrophoresis unit
  • second electrophoretic unit second electrophoretic unit
  • driving unit 404 that moves the fixing unit 401 and / or the supporting arm 431 to change the relative positions of both.
  • the sample is first separated in the first direction (Y direction in FIG. 4) by the first-dimensional electrophoresis unit 410, and after the buffer solution is equilibrated, the second-dimensional electrophoresis is performed.
  • the part 420 separates in the second direction (X direction in FIG. 4). This is realized by the driving means 404 holding the support arm 431 so as to be movable in the X-axis direction and the Z-axis direction.
  • the first-dimensional electrophoresis unit 410 is provided with a plurality of tanks. The first-dimensional electrophoresis unit 410 will be further described with reference to FIG.
  • FIG. 5 is a sectional view of the automated two-dimensional electrophoresis apparatus 400.
  • the first-dimensional electrophoresis unit 410 has a configuration in which a plurality of tanks 411 and 412 are provided in a single insulator.
  • the first reagent tank 411 is for storing reagents necessary for the process until the first-dimensional separation
  • the second reagent tank 412 is after the first-dimensional separation and before the second-dimensional separation. It is for storing necessary reagents.
  • the first reagent tank 411 includes a gel arrangement tank 411a, a sample tank 411b, a swelling tank 411c, and a first separation tank 411d as an isoelectric focusing instrument.
  • the second reagent tank 412 includes a first equilibration tank 412a, a staining tank 412b, a washing tank 412c, and a second equilibration tank 412d.
  • the first equilibration tank 412a is preferably provided to store a buffer solution for replacing the buffer solution used for the first direction separation and increasing the efficiency of staining performed after the first direction separation.
  • the washing tank 412c is preferably provided for storing a buffer solution for washing excess fluorescent dye attached in the staining tank 412b in which the fluorescent dye is stored.
  • the second equilibration tank 412d stores a reagent preferable for performing the second direction separation.
  • a reagent for reducing the protein of the isoelectric focusing gel 200 and a reagent for converting the protein into SDS are stored.
  • a buffer solution, a surfactant, an enzyme, an interacting substance, or the like may be stored depending on the second direction separation method.
  • the driving means 404 first drives the support arm 431 to the desired X position of the gel placement tank 411a, and then lowers the support arm 431 to the desired Z position. Then, adsorption
  • the adsorption control to the support arm 431 can be automatically controlled by using, for example, an electromagnetic valve.
  • the drive unit 404 moves the holding body 40 with the gel adsorbed on the support arm 431 in the direction of the arrow 402 in FIG. 5, whereby the isoelectric focusing gel 200 is moved to the first-dimensional electrophoresis unit 410. In each of the tanks provided, a desired process is performed, and subsequently, it is transported to the second-dimensional electrophoresis unit 420.
  • the first-dimensional electrophoresis unit 410 a voltage is applied to the isoelectric focusing gel 200, the step of introducing the sample into the isoelectric focusing gel 200, the step of swelling the isoelectric focusing gel 200, and the isoelectric focusing gel 200.
  • the step of separating the sample in the first direction, the step of staining the separated sample in the isoelectric focusing gel 200, and the step of equilibrating to the environment in the second-dimensional electrophoresis unit 420 are performed.
  • the swelling speed can be improved by separately adding the sample to the isoelectric focusing gel and swelling the isoelectric focusing gel 200.
  • the first separation tank 411d which is an isoelectric focusing instrument, is filled with a buffer solution necessary for isoelectric focusing (first-dimensional separation). However, when the reagent stored in the swelling tank 411c contains a buffer solution necessary for the first-dimensional separation, the first separation tank 411d may not be filled with the buffer solution necessary for the first-dimensional separation.
  • the sample in the isoelectric focusing gel 200 is separated by applying a voltage to the pair of electrodes (not shown) by the first voltage applying unit 405.
  • the second-dimensional electrophoresis unit 420 includes the polyacrylamide gel electrophoresis gel (SDS-PAGE gel) 10 described above, and is transported from the first-dimensional electrophoresis unit 410 in the SDS-PAGE gel 10.
  • the separated sample contained in the isoelectric focusing gel 200 is further separated (SDS-PAGE) in a second direction different from the first direction.
  • the second-dimensional electrophoretic unit 420 includes a first buffer solution provided in the lower insulating unit through the upper insulating plate 422 on the insulating unit 420a obtained by superimposing the lower insulating plate 421 and the upper insulating plate 422, which are gel plates. It has a tank 428a and a second buffer tank 428b.
  • the lower insulating plate 421 is provided with a gel storage portion 10 ′ for covering and storing the SDS-PAGE gel 10 between the lower insulating plate 421 and the upper insulating plate 422.
  • the SDS-PAGE gel 10 accommodated in the gel accommodating portion 10 ′ is covered with an insulating portion 420 a composed of a lower insulating plate 421 and an upper insulating plate 422, and the first opening 425 and the second opening 426 have the insulating portion 420 a of the insulating portion 420 a. Can contact the outside.
  • the first opening 425 and the second opening 426 face the first buffer tank 428a and the second buffer tank 428b provided in the second-dimensional electrophoresis unit 420, respectively.
  • the first buffer tank 428a and the second buffer tank 428b include the SDS-PAGE gel 10 and the first opening 425 stored in the gel storage section 10 ′.
  • a first buffer solution and a second buffer solution (solution containing a cathode buffer) that are in contact with each other through the second opening 426 are filled.
  • the first buffer tank 428a and the second buffer tank 428b are provided with a first electrode 429a and a second electrode 429b, and SDS is applied by the second voltage applying means 406 via the first electrode 429a and the second electrode 429b.
  • SDS is applied by the second voltage applying means 406 via the first electrode 429a and the second electrode 429b.
  • a voltage is applied to the PAGE gel 10
  • a current flows from the first opening 425 toward the second opening 426.
  • the separated sample in the isoelectric focusing gel 200 and the molecular weight marker are developed / separated from the second opening 426 toward the first opening 425.
  • the cathode buffer of the solution containing the cathode buffer filled in the second buffer bath 428b includes front ions (for example, chlorine ions) and trailing ions (glycine, tricine, etc.).
  • front ions and trailing ions By including front ions and trailing ions in the cathode buffer, a band concentration effect can be obtained.
  • a buffer that does not contain front ions and trailing ions can also be used as a cathode buffer (for example, MOPS-based and MES-based buffers). Even a buffer that does not contain front ions and trailing ions has the above-described effect of suppressing heat generation.
  • a buffer containing front ions and trailing ions as a cathode buffer.
  • the buffer concentration of the cathode buffer is adjusted to a range of 25 to 50 mM.
  • the buffer concentration of the gel for polyacrylamide gel electrophoresis is adjusted to a range of 150 to 500 mM and setting it higher than the buffer concentration of the cathode buffer, zone electrophoresis becomes possible, and the protein band is sharpened. There is an effect to.
  • the width of the opening penetrating the upper insulating plate 422 in the second buffer solution tank 428b is the groove width of the corresponding lower insulating plate 421. Wider. Due to this difference, as shown in FIG. 5, the isoelectric focusing gel 200 of the gel-attached holding body 40 inserted from the second opening 426 and the SDS-PAGE gel 10 can be brought into close contact with each other. The sample in the isoelectric focusing gel 200 after the original electrophoresis can be successfully separated by SDS-PAGE.
  • the insulating portion 420a covering the SDS-PAGE gel 10 causes the isoelectric focusing gel 200 and the SDS-PAGE gel 10 to adhere to each other.
  • Such a portion may be the second opening 426, or a further opening 426 ′ may be provided between the first opening 425 and the second opening 426.
  • the SDS-PAGE gel 10 protrudes from the second opening 426. More preferably, the protruding SDS-PAGE gel 10 has no irregularities. In the case where the SDS-PAGE gel 10 does not protrude from the second opening 426, an adhesive member for bringing the isoelectric focusing gel 200 and the SDS-PAGE gel 10 into close contact with the second opening 426 ( (Not shown) may be provided.
  • Preferred adhesive members include, but are not limited to, agarose, low viscosity (about 1-3%) gels such as acrylamide, and high viscosity liquids such as glycerin, polyethylene glycol, and hydroxypropyl cellulose.
  • the fixing to these fixing means 401 is performed. It is preferable that it is detachable.
  • a pinch fixing mechanism, a magnetic force fixing mechanism, and an electrostatic adsorption mechanism can be cited in addition to the vacuum adsorption mechanism, but not limited thereto.
  • a cooling means 409 (for example, a heat radiating means) shown in FIG. 5 may be provided immediately below the fixing means 401.
  • the cooling means 409 By employing the cooling means 409, the temperature of the first-dimensional electrophoresis unit 410 and the second-dimensional electrophoresis unit 420 during electrophoresis can be kept constant.
  • an automated two-dimensional electrophoresis apparatus has been described as an electrophoresis apparatus.
  • the present invention is not limited to a two-dimensional electrophoresis apparatus, and an electrophoresis apparatus that performs only SDS-PAGE (general) Of course, a typical SDS-PAGE apparatus may also be included.
  • the automated two-dimensional electrophoresis apparatus described in the first embodiment has a form in which the SDS-PAGE gel 10 is disposed (horizontally placed) along a horizontal plane, but the SDS-PAGE gel is arranged along a vertical plane. May be arranged (vertically placed).
  • Embodiment 1 the mode in which the acrylamide buffer is covalently bonded to the gel in both the separation gel and the concentration gel has been described.
  • the present invention is not limited to this.
  • the acrylamide buffer is covalently bound to the gel only in the concentrated gel. That is, in Embodiment 3, the acrylamide buffer is not covalently bonded to the separation gel.
  • the acrylamide buffer covalently bonded to the concentrated gel does not move to the separated gel. Therefore, even if the time has elapsed, since the buffer having a predetermined pKa remains in the concentrated gel, it is possible to suppress the pH of the concentrated gel from fluctuating and suppress the reduction of the concentration effect in the concentrated gel. . Further, since the buffer does not move in the concentrated gel, heat generation can be suppressed.
  • Embodiment 1 the mode in which the acrylamide buffer is covalently bonded to the gel in both the separation gel and the concentration gel has been described.
  • the present invention is not limited to this.
  • the acrylamide buffer is covalently bonded to the gel only in the separation gel. That is, in Embodiment 3, the acrylamide buffer is not covalently bonded to the concentrated gel.
  • the acrylamide buffer covalently bonded to the separation gel does not move to the concentration gel. Therefore, even if time passes, the concentrated gel is not mixed with a buffer having a different pH from the separated gel, and the pH of the concentrated gel is prevented from fluctuating and the reduction of the concentration effect in the concentrated gel is suppressed. be able to. Moreover, since the buffer does not move in the separation gel, heat generation can be suppressed.
  • a polyacrylamide gel electrophoresis gel (SDS-PAGE 10) according to embodiment 1 of the present invention includes a concentrated gel 5 and a separation gel 4 that is adjusted to a pH different from that of the concentrated gel.
  • An acrylamide buffer is covalently bonded to at least one of the separation gels 4.
  • the acrylamide buffer is not released from the gel to which the acrylamide buffer is covalently bonded.
  • the covalently bonded acrylamide buffer is an acrylamide derivative having a buffering action.
  • the polyacrylamide gel electrophoresis gel according to the first aspect of the present invention can maintain the concentration effect even if time passes.
  • the gel can be loaded into the apparatus on the side where the electrophoresis apparatus is manufactured, which can contribute to the automation of electrophoresis.
  • the covalently bonded acrylamide buffer does not move in the gel even when a voltage is applied. For this reason, an excessive current does not flow in the gel, and no undesirable heat generation occurs. Therefore, it is possible to provide a polyacrylamide gel electrophoresis gel capable of detecting a good electrophoretic separation pattern without causing gel expansion.
  • the polyacrylamide gel electrophoresis gel of the present invention in which the above-mentioned problems are solved can be said to be superior to the conventional electrophoresis gel.
  • the polyacrylamide gel electrophoresis gel according to aspect 2 of the present invention is the above-described aspect 1, wherein the concentrated gel 5 is cross-linked with an acrylamide buffer having a pKa in the range of 6.2 to 8.5. preferable.
  • an acrylamide buffer having a pKa in the range of 6.2 to 8.5. preferable since the dissociation degree of glycine contained in the cathode buffer is low, the movement to the anode is delayed, and the protein that moves in the concentrated gel is concentrated.
  • the separation gel 4 is crosslinked with an acrylamide buffer having a pKa in the range of 8.5 to 9.3. It is preferable. By cross-linking the acrylamide buffer of pKa in this range, proteins moving in the separation gel are separated by the molecular sieving effect.
  • the polyacrylamide gel electrophoresis gel according to aspect 4 of the present invention is the above-described separation gel 4 wherein the pH of the concentrated gel 5 is adjusted in the range of 6.6 to 7.5 in the above aspect 1 or 3.
  • the pH is preferably adjusted to a range of 8.4 to 8.8.
  • the polyacrylamide gel electrophoresis gel according to Aspect 5 of the present invention can be a sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis gel according to Aspects 1 to 4.
  • An electrophoresis apparatus (automated two-dimensional electrophoresis apparatus 400) according to Aspect 6 of the present invention includes a polyacrylamide gel electrophoresis gel according to any one of Aspects 1 to 4, a cathode (second electrode 429b), and the above The anode (first electrode 429a) disposed on the opposite side of the cathode (second electrode 429b) with respect to the polyacrylamide gel electrophoresis gel, and the cathode side (first electrode) of the polyacrylamide gel electrophoresis gel And a cathode buffer added to the two buffer baths 428b).
  • the cathode buffer may include front ions and trailing ions.
  • the electrophoresis apparatus is the above-described aspect 6 or 7, wherein the buffer concentration of the cathode buffer is adjusted to a range of 20 to 50 mM, and the buffer concentration of the polyacrylamide gel electrophoresis gel is , May be adjusted to a range of 150 to 500 mM.
  • Zone electrophoresis is effective by setting the buffer concentration of the gel for polyacrylamide gel electrophoresis higher than that of the cathode buffer.
  • the electrophoretic device performs the first electrophoretic section (first-dimensional electrophoretic section 410) that performs the first-dimensional electrophoresis and the second-dimensional electrophoretic. It has a 2nd electrophoresis part (2D electrophoretic part 420), and the gel for electrophoresis of the above-mentioned 2nd electrophoresis part may be the above-mentioned polyacrylamide gel electrophoresis gel.
  • the polyacrylamide gel electrophoresis gel having the above-described effects is provided as the electrophoresis gel of the second electrophoresis section, and complete automation of two-dimensional electrophoresis can be realized.
  • the electrophoresis gel of the second electrophoresis section had to be prepared by the electrophoresis operator for the reasons described above. That is, even if a part of the two-dimensional electrophoresis apparatus can be automated, the preparation of the gel has to be performed by the person performing the electrophoresis. However, according to the above configuration, the gel can be placed in the apparatus before (much) the electrophoresis is performed. Therefore, the work performed by the practitioner is only sample adjustment, for example, and all operations relating to electrophoresis can be automated by the apparatus.
  • Sample protein was prepared from mouse liver tissue. First, 0.4 g of a sample was weighed from mouse liver tissue while avoiding blood vessels and blood pools as much as possible, and placed in a 5 mL glass Teflon (registered trademark) homogenizer cooled on ice. Add 5-6 volumes (2 mL) of lysis buffer (50 mM Tris HCl (pH 7.6), 20% glycerol, 0.3 M NaCl) and protease inhibitor cocktail cooled to 4 ° C. to the sample in the homogenizer, Triturated on ice (3000-4000 rpm). Thereafter, it was centrifuged at 1000 ⁇ g for 10 minutes at 4 ° C. After collecting the supernatant, it was centrifuged at 16000 ⁇ g for 30 minutes at 4 ° C. The supernatant was collected again, protein quantification was performed, the concentration was calculated, and stored at ⁇ 80 ° C.
  • lysis buffer 50 mM Tris HCl (pH 7.6), 20%
  • the protein was purified by desalting and concentration by acetone precipitation.
  • a protein solution sample obtained from mouse liver tissue was placed in a 1.5-2.0 mL microtube.
  • 8 to 9 times the amount of cold acetone ( ⁇ 20 ° C.) was added and kept at ⁇ 20 ° C. for about 2 hours.
  • the supernatant (acetone fraction) was discarded, and the tube was left for 2 to 3 minutes with the lid of the tube open, to blow off the acetone.
  • a gel for SDS-PAGE (10) was prepared using a gel preparation device as shown in FIG. First, two glass plates (1) sandwiching a 1 mm spacer and packing were fixed with a clip (2). From the injection tube (3), between the glass plates, an acrylamide monomer solution (9.7% acrylamide, 0.3% bisacrylamide, 375 mM Tris-HCl (pH 8.8), 0.1) containing Tris buffer at pH 8.8. % TEMED, 0.05% APS) was added to fill about 70%, and then the surface layer was overlaid with water and polymerized at room temperature for 30 minutes to form a separation gel.
  • an acrylamide monomer solution (9.7% acrylamide, 0.3% bisacrylamide, 375 mM Tris-HCl (pH 8.8), 0.1) containing Tris buffer at pH 8.8. % TEMED, 0.05% APS
  • acrylamide monomer solution containing acrylamide buffer of pKa 6.8 (2.91% acrylamide, 0.09% bisacrylamide, 100 mM acrylamide buffer (pKa 6.8), 0.05, % TEMED, 0.03% APS) and covering with a flat comb, the surface of the acrylamide monomer solution is polymerized for about 2 hours at room temperature to form a concentrated gel 5 did.
  • a double-layered SDS-PAGE gel having a concentrated gel and a separation gel was prepared (see FIG. 2).
  • Two-dimensional electrophoresis Contrast with one-layer gel
  • Two-dimensional electrophoresis was performed with Auto2D manufactured by Sharp Manufacturing System. Examples include: As a comparative example, a commercially available single layer (pH 8.8) SDS-PAGE gel prepared in consideration of storage stability was used.
  • two-dimensional electrophoresis was performed using an antibody (Trastuzumab) as a sample.
  • the first-dimensional electrophoresis conditions were as follows. Step 1: 200V, 5 minutes constant Step 2: 1000V, 5 minutes linear gradient Step 3: 1000V, 5 minutes constant Step 4: 4000V, 10 minutes linear gradient Step 5: 4000V, 10 minutes constant Step 6: 7000V, 10 minutes linear gradient Step 7: 7000V, 20 Fixed for a minute Thereafter, two-dimensional electrophoresis was performed as follows. Step 1: 10 mA, 10 minutes constant Step 2: 20 mA, 35 minutes Two-dimensional electrophoresis results are shown in FIG. In the SDS-PAGE gel according to the comparative example ((b) in FIG.
  • the present invention can be used for an electrophoresis apparatus that performs SDS-PAGE and a two-dimensional electrophoresis apparatus, and can also be used for, for example, drug discovery research and development, and can also be applied to medical equipment for diagnosis. Is possible.

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Abstract

　濃縮効果の持続性を向上させるとともに泳動時の発熱抑制を実現したポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルと、当該ゲルを備えた電気泳動装置を提供する。本発明に係るポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルは、濃縮ゲルおよび当該濃縮ゲルとは異なるｐＨに調整されている分離ゲルを含み、濃縮ゲルおよび上記分離ゲルのうちの少なくとも一方には、アクリルアミドバッファーが共有結合されている。

Description

ポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルおよび当該ゲルを備えた電気泳動装置
　本発明は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲル、および当該ゲルを備えた電気泳動装置に関し、より詳細には、濃縮ゲルおよび当該濃縮ゲルとは異なるｐＨに調整されている分離ゲルを含むポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルと、これを備えた電気泳動装置に関する。
　ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）は、界面活性剤であるＳＤＳでタンパク質を処理するとＳＤＳがタンパク質の分子量に応じた量比（１：１．４）で結合することを利用したタンパク質の分析方法である。ＳＤＳが結合したＳＤＳ－タンパク質複合体は、ＳＤＳ分子を構成する親水性イオンのＳＯ４ ２－基によって負の電荷を持つため、ポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲル（以下、単にゲルを記載することがある）に電流を流すと、当該ゲル中のＳＤＳ－タンパク質複合体は陽極に泳動する。また、当該ゲル中をＳＤＳ－タンパク質複合体が通過するときに分子ふるい効果が発生するために、分子量の小さいタンパク質ほど早く移動する。そのため、その移動度から見かけの分子量を割り出すことが可能である。
　ＳＤＳ－ＰＡＧＥで用いられる一般的なゲルの一つとして、ゲル濃度および含有緩衝液のｐＨが異なる２層から構成され、非特許文献１に記載されていように、泳動上流側にｐＨ６．８のトリシン緩衝液を含むゲルを有し、このゲルの泳動下流側にｐＨ８．８のトリシン緩衝液を含むゲルを有してなる２層のゲルがある。
　タンパク質サンプル（ＳＤＳ－タンパク質複合体）は、泳動上流側のｐＨ６．８のゲルではタンパク質の分離は起こらずに濃縮を受ける。そのため、泳動上流側のｐＨ６．８のゲルは「濃縮ゲル」と称される（「スタッキングゲル」と称されることもある）。一方、泳動下流側のｐＨ８．８のゲルではタンパク質が分子量により分離されるため、当該ゲルは「分離ゲル」と称される。
　ｐＨ６．８の濃縮ゲル中では、泳動が早い（ゲル内を早く移動する）順に、陰極側の泳動用緩衝液の陰極バッファーに含まれる塩素イオン、タンパク質サンプル、当該陰極バッファーに含まれるグリシンの順番で泳動される。陰極バッファーに含まれるグリシンはｐＨ６．８の緩衝液を含む濃縮ゲル中で１０％程度の解離度であるために陽極への移動が遅くなる。一方、陰極バッファーに含まれる塩素イオンは陽極に早く移動する。このとき、塩素イオンとグリシンとの間が他よりも高抵抗になるため電圧が上昇し、塩素イオンとグリシンとの間で泳動されるタンパク質サンプルが先端の塩素イオンの境界に濃縮される。
　このように濃縮ゲルにおいてタンパク質サンプルを濃縮することにより、分離ゲルでの分離が良好となり、分離ゲルにおいてシャープなバンドを検出することができる。
羊土社「改訂第３版　タンパク質実験ノート　下　分離同定から機能解析へ」、岡田雅人・宮崎香　編
　しかしながら、上述のようにｐＨが異なる緩衝液を含有したゲル同士が接触してなる電気泳動用ゲルの場合、時間の経過により互いの緩衝液が混合するという問題がある。時間の経過により、分離ゲルの緩衝液が濃縮ゲルに混入することによって、濃縮ゲルの濃縮効果が失われ、タンパク質サンプルの分離解像度が著しく低下する。そのため、泳動実施者が泳動毎にゲルを作製しているという実情がある。したがって、時間が経過しても濃縮ゲルが濃縮効果を維持することができるポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルの開発が求められている。
　また、濃縮ゲルおよび分離ゲルに含有される緩衝液は、上述したｐＨ条件下で電荷を有するため、電圧印加により移動する。これにより、ゲル内に高い電流値が検出され、発熱の原因となる。発熱は、ゲルの膨張を引き起こして電気泳動分離パターンを悪化させる。
　そこで、本願発明者らは、分離ゲルに導入されるまでにタンパク質サンプルが濃縮される形態でありながら、濃縮効果の持続性を向上させるとともに泳動時の発熱を抑制することができるポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルの開発に成功し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、濃縮効果の持続性の向上と、泳動時の発熱抑制とを実現したポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルを提供するとともに、当該ゲルを備えた電気泳動装置を提供することを目的としている。
　具体的には、上記の課題を解決するために、本発明の一態様に係るポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルは、濃縮ゲルおよび上記濃縮ゲルとは異なるｐＨに調整されている分離ゲルを含み、上記濃縮ゲルおよび上記分離ゲルのうちの少なくとも一方には、アクリルアミドバッファーが共有結合されていることを特徴としている。
　上記の課題を解決するために、本発明の一態様に係る電気泳動装置は、上記ポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルと、陰極と、上記ポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルに対して、上記陰極とは反対側に配置された陽極と、上記ポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルの上記陰極側に添加される陰極バッファーと、を備えていることを特徴としている。
　本発明の一態様によれば、アクリルアミドバッファーがポリアクリルアミドゲルに固定化されることにより経時的なアクリルアミドバッファーの拡散を防ぎ、濃縮ゲルにおける濃縮効果の持続性が向上するポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルを提供することができる。また、本発明の一態様によれば、アクリルアミドバッファーの移動量の減少により発熱が抑制され分解能が向上するポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルを提供することができる。そして、本発明の一態様によれば、濃縮効果の持続性を向上させ、且つ泳動時の発熱を抑制した当該ゲルを備えた電気泳動装置を提供することができる。
本発明に係るポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルの一実施形態を作製するための器具を示す斜視図である。 図１に示す器具に本発明の一実施形態におけるポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルを作製している様子を示す斜視図である。 本発明に係るポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルの一実施形態を模式的に示したものであり、アクリルアミドバッファーがゲルに共有結合されている様子を示す図である。 本発明に係る電気泳動装置の一実施形態である自動化二次元電気泳動装置を示す図である。 本発明に係る電気泳動装置の一実施形態である自動化二次元電気泳動装置を示す図である。 本発明に係るポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルの一実施形態を用いた実施例および比較例において得られる分離パターンを示す図である。 本発明に係るポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルの一実施形態を用いた実施例および比較例において得られる分離パターンを示す図である。
　〔実施形態１〕
　本発明に係るポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルおよび当該ゲルの作製方法の一実施形態、並びに当該ゲルを備えた電気泳動装置の一実施形態を以下に説明する。
　〔１〕ポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲル
　本発明に係るポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルは、タンパク質の分離は起こらず濃縮を受ける濃縮ゲル（スタッキングゲル）と、当該濃縮ゲルとは異なるｐＨに調整されたタンパク質の分離がおこなわれる分離ゲルとを含有する。なお、本発明におけるポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルは、濃縮ゲルおよび分離ゲルのほかに他のゲル（層）を含み得る。
　なお、本実施形態１では電気泳動によって分離をおこなうサンプルとして、タンパク質を挙げて説明するが、サンプルはタンパク質に限定されるものではなく、ゲル電気泳動を使用して分離することができる複数の独特の分子種の混合物であるか、もしくは複数ではなくゲル電気泳動がおこなわれた後にゲル内の或る位置に局在する物質である。サンプルの具体例としては、生物材料（例えば、生物個体、体液、細胞株、組織培養物、もしくは組織断片）からの調製物、または、市販の試薬などが挙げられる。例えば、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドが挙げられる。
　本実施形態１におけるポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルは、界面活性剤としてＳＤＳを含む変性ゲルである。なお、本発明はＳＤＳを含む変性ゲルに限定されるものではなく、変性作用を有する界面活性剤としてＳＤＳ以外の界面活性剤を含むものであってもよい。また、界面活性剤以外の変成作用を有する物質（例えば尿素やホルムアルデヒドなど）を含む変性ゲルであってもよい。更には、本発明に係るポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルは、非変性ゲルであってもよい。非変性ゲルは、変性剤を含有しないポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルをいう。非変性ゲル（すなわち未変性ゲル）は、未変性ゲル電気泳動において使用され、この場合、ランニング緩衝液および試料緩衝液にも変性剤を含まない。
　また、本実施形態１におけるポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動法による電気泳動に用いられるゲルである。しかしながら、本発明はＳＤＳ－ＰＡＧＥに限定されるものではなく、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを含むポリアクリルアミドゲル電気泳動全般に適用することができる。
　また、本実施形態１におけるポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルは、そのサイズは問わない。ここで、本実施形態１におけるポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルの厚さをｚ方向に沿って定義し、ｚ方向に対して垂直であるｘ方向およびｙ方向によって定義されるｘ－ｙ平面をする。本発明に係るポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルのサイズは、例えば、ｘ－ｙ平面のサイズが１０ｃｍ×１０ｃｍ程度であって厚さが１ｍｍ程度の比較的小型のサイズから、ｘ－ｙ平面のサイズが３０ｃｍ×３０ｃｍ程度であって厚さが１ｍｍ程度の比較的大型のサイズのものまで、電気泳動の用途や電気泳動装置の大きさに応じて適宜選択すること可能である。
　本実施形態１におけるポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルは、後述する電気泳動装置の一対の電極間に配置され、電圧印加によって内部に電流が流れる。ここで、本実施形態では、電流の流れる方向、すなわちサンプルの泳動方向をｙ方向とする。すなわち、一対の電極の一方の電極（陰極）は、本実施形態１におけるポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルよりもｙ方向に沿って上流側に配置され、他方の電極（陽極）は当該ゲルよりもｙ方向に沿って下流側に配置される。そして、本実施形態１におけるポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルに含有される濃縮ゲルと分離ゲルとは、濃縮ゲルが分離ゲルよりも泳動方向上流側に位置する。そして、両ゲルは泳動方向に対して垂直方向（ｘ方向）に沿って界面を有する。
　なお、本実施形態１に係るポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルは、濃縮ゲルおよび分離ゲルにアクリルアミドバッファーが共有結合されている点に特徴がある。よって、それ以外のポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルの条件（例えば、濃縮ゲルの体積、分離ゲルの体積、ゲル内での当該境界面の位置等）については、従来周知のＳＤＳ－ＰＡＧＥ用ゲルを参考にして適宜選択することができる。
　なお、本願明細書におけるポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルのポリアクリルアミドとは、アクリルアミドモノマーとＮ，Ｎ’－メチレンビスアクリルアミド（ビスまたはビスアクリルアミド）との混合物をいい、このアクリルアミドおよびビスが、架橋されて分枝状の分子構造を形成したものが本願明細書におけるポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルである。また、本願明細書における、共有結合されているアクリルアミドバッファーとは、緩衝作用を有するアクリルアミド誘導体である。
　・濃縮ゲル
　本実施形態１におけるポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルに含有される濃縮ゲルは、ｐＨが、ｐＨ６．０～ｐＨ８．８の範囲に調整されている。より好ましくは、ｐＨ６．６～ｐＨ７．５の範囲に調整され、一例としてｐＨ６．８に調整されている。このようにｐＨ条件が調整された濃縮ゲルでは、タンパク質は分離されずに濃縮を受ける。なお、濃縮の原理は周知であるため、ここでの説明は省略する。
　また、濃縮ゲルには、アクリルアミドバッファーが共有結合されている。アクリルアミドバッファーはビニル基を有しているため、アクリルアミドモノマーを共有結合でゲルに固定化することができる。
　濃縮ゲルにアクリルアミドバッファーが共有結合されていることにより、アクリルアミドバッファーが濃縮ゲルから分離ゲルに移動することがない。そのため、先述した時間経過による濃縮ゲルの濃縮効果の低下が生じず、また、泳動中の発熱も生じない。
　濃縮ゲルに共有結合されるアクリルアミドバッファーは、ｐＫａが既知であるアクリルアミド誘導体から選択すればよい。例えば、これらに限定するものではないが、下記一般式で表すバッファーの中の１つまたは複数から選択すればよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　また、濃縮ゲルには、ｐＫａが１．０～１２．０の範囲であるアクリルアミドバッファーが共有結合されている。より好ましくは、ｐＫａが６．２～８．５の範囲であるアクリルアミドバッファーが共有結合されている。この範囲であるアクリルアミドバッファーが濃縮ゲルに共有結合されていることにより、タンパク質が先行イオンである塩素イオンとトレイリングイオンであるグリシンとの間に挟まれて塩素イオン境界に濃縮される効果が生じる。
　なお、濃縮ゲルに共有結合されたアクリルアミドバッファーは、濃縮ゲルに含有されたｐＨ緩衝液と同じｐＨに調整された緩衝剤である。
　濃縮ゲルに共有結合されているアクリルアミドバッファーの濃度は、５０～２００ｍＭの範囲であることが好ましく、１００～１５０ｍＭの範囲とすることがより好ましい。この範囲であることにより、好ましい緩衝能を有することができ、タンパク質の濃縮が可能となる。
　濃縮ゲルは、アクリルアミドバッファーが共有結合されていれば、その他の組成は従来周知の濃縮ゲルの組成を適用することができるほか、濃縮ゲルの機能を阻害しない範囲で添加剤を含有し得る。
　・分離ゲル
　本実施形態１におけるポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルに含有される分離ゲルは、ｐＨが８．０～９．２の範囲に調整されている。より好ましくは、ｐＨが８．４～８．８の範囲に調整され、一例としてｐＨ８．８に調整されている。このようにｐＨ条件が調整された分離ゲルでは、濃縮ゲルによって濃縮されたタンパク質サンプルの分離が起こる。なお、分離の原理は周知であるためここでの説明は省略する。
　また、分離ゲルには、アクリルアミドバッファーが架橋されているため、当該アクリルアミドバッファーが分離ゲルから濃縮ゲルに移動することがない。そのため、先述した時間経過による濃縮ゲルの濃縮効果の低下が抑制され、また、泳動中の発熱も抑制される。
　具体的には、分離ゲルには、ｐＫａが１．０～１２．０の範囲であるアクリルアミドバッファーが共有結合されている。より好ましくは、ｐＫａが８．５～９．３の範囲であるアクリルアミドバッファーが共有結合されている。この範囲においてアクリルアミドバッファーが分離ゲルに共有結合されていることにより、解像度の高い分離結果を得ることができる。
　なお、分離ゲルに共有結合されたアクリルアミドバッファーは、分離ゲルに含有されたｐＨ緩衝液と同じｐＨに調整された緩衝剤である。
　分離ゲルに共有結合されているアクリルアミドバッファーの濃度は、５０～２００ｍＭの範囲であることが好ましく、１００～１５０ｍＭの範囲とすることがより好ましい。この範囲であることにより、好ましい緩衝能を有することができ、タンパク質の分離が可能となる。
　分離ゲルに共有結合されるアクリルアミドバッファーは、ｐＫａが既知であるアクリルアミド誘導体から選択すればよい。例えば、これらに限定するものではないが、下記一般式で表すバッファーの中の１つまたは複数から選択すればよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　分離ゲルは、アクリルアミドバッファーが共有結合されていれば、その他の組成は従来周知の分離ゲルの組成を適用することができるほか、分離ゲルのサンプル分離を阻害しない範囲で添加剤を含有し得る。
　図３に、アクリルアミドバッファーが共有結合されているゲルを模式的に示す。なお、図３中のＲはカルボキシル基または３級アミン等である。図３に示すポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルは、アクリルアミドおよびビスアクリルアミドが、架橋されて分枝状の分子構造を形成しているところに、アクリルアミドバッファーが架橋（共有結合）されている。
　以上のように本実施形態１におけるポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルは、ｐＨが異なる緩衝液を含有した濃縮ゲルおよび分離ゲルが互いに接触した状態で存在しているが、これら濃縮ゲルおよび分離ゲルのそれぞれにおいて、ｐＨ緩衝液に含まれるアクリルアミドバッファーが共有結合されているため、互いの緩衝液が混合することがない。よって、時間の経過により分離ゲルの緩衝液によって濃縮ゲルの濃縮効果が低減する虞がなく、保存性に優れたポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルを実現することができる。
　また、濃縮ゲルおよび分離ゲルに含有される緩衝液は上述したｐＨ条件下で電荷を有するが、本実施形態１によれば、当該緩衝液に含まれる緩衝剤であるアクリルアミドバッファーが共有結合されているため、電圧印加によりゲル内を緩衝液が移動することがない。これにより、ゲル内に電流が過剰に流れることがなく、不都合な発熱を発生することがない。したがって、ゲルの膨張を引き起こすことがなく、良好な電気泳動分離パターンを検出することができるポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルを提供することができる。
　〔２〕ポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルの作製方法
　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ用ゲルである本実施形態１におけるポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルは、従来周知のＳＤＳ－ＰＡＧＥ用ゲルの作製方法を提供して作製することができる。
　図１および図２は、本実施形態１におけるポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルの作製に用いる器具の斜視図である。図１には、２枚の絶縁材からなるゲル板１をそれぞれのゲル形成面が内側になるようにして配置し、クリップ２で止めている様子を示している。このとき、２枚のゲル板１の間にはスペーサー（不図示）を配設して本実施形態１におけるポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルの厚さに相当する分の隙間を設けている。そして、この隙間に、チューブ３を用いてゲル用溶液を充填する。スペーサーは、２枚のゲル板１の側部と下部とに配置されており、２枚のゲル板１の上部には配置しない。これにより、２枚のゲル板１の上部からチューブ３を介してゲル用溶液を２枚のゲル板１の隙間に充填することができる。
　ゲル用溶液は、分離ゲル用溶液と濃縮ゲル用溶液とをそれぞれ準備する。分離ゲル用溶液は、従来周知の分離ゲル作製用のアクリルアミドモノマー溶液（組成は、９．７％アクリルアミド、０．３％ビスアクリルアミド、３７５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、０．１％ＴＥＭＥＤ、０．０５％ＡＰＳ）に、アクリルアミドバッファー（ｐＫａ８．８）を１００ｍＭの濃度になるように添加して作製し、濃縮ゲル用溶液は、従来周知の濃縮ゲル作製用のアクリルアミドモノマー溶液（組成は、２．９１％アクリルアミド、０．０９％ビスアクリルアミド、０．０５％ＴＥＭＥＤ、０．０３％ＡＰＳ）に、アクリルアミドバッファー（ｐＫａ６．８）を１００ｍＭの濃度になるように添加して作製する。
　まず分離ゲル用溶液を２枚のゲル板１の隙間に充填する。充填に際して、重合開始剤を添加して充填する。また、このとき、充填された分離ゲル用溶液の液面（上面）が２枚のゲル板１の上部よりも下になるように充填量を調整する。
　充填が完了したら所定時間放置して分離ゲル用溶液をゲル化させる。ゲル化に際して、従来周知の方法で分離ゲル用溶液の液面上に蒸留水（不図示）を重層する。ゲル化した状態を図２に示している（分離ゲル４）。
　分離ゲル用溶液がゲル化した後、重層していた蒸留水を除去し、分離ゲル用溶液の液面上に濃縮ゲル用溶液を重層する。充填に際して、重合開始剤を添加して充填する。充填が完了したら所定時間放置して分離ゲル用溶液をゲル化させる。ゲル化した状態を図２に示している（濃縮ゲル５）。なお、図２では濃縮ゲル用溶液の液面（上面）がゲル板１の上部よりも下になっているが、本発明はこれに限定されるものではなく、また、濃縮ゲル用溶液の液面（上面）とゲル板１の上部とを一致させたのちに、従来周知のサンプルアプライ用のウエルを作成するためのコームを挿し込んでも良い。充填が完了したら所定時間放置して濃縮ゲル用溶液をゲル化させる。
　以上の手順によって本実施形態１におけるポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルを作製することができる。
　〔３〕電気泳動装置
　次に、本発明に係る電気泳動装置の一実施形態として、自動化二次元電気泳動装置４００を例に挙げて説明する。
　図４は、本実施形態１における自動化二次元電気泳動装置４００の要部構成を示す。
　図４中の（ａ）は自動化二次元電気泳動装置４００の要部構成を示す斜視図である。図４中の（ｂ）は、等電点電気泳動ゲル２００が保持部４４０を介して支持アーム４３１に結合される構成を示す。図４中の（ｃ）は、自動化二次元電気泳動装置４００において用いられる二次元目電気泳動部４２０の構成を示す断面図および上面図である。
　本実施形態１における自動化二次元電気泳動装置４００は、台座としての固定手段４０１の上に、等電点電気泳動器具を含む一次元目電気泳動部（第一泳動部）４１０と、ＳＤＳ－ＰＡＧＥをおこなうための二次元目電気泳動部（第二泳動部）４２０と、上記支持アーム４３１と、固定手段４０１および／または支持アーム４３１を移動して双方の相対位置を変更させる駆動手段４０４とを有している。
　自動化二次元電気泳動装置４００では、サンプルが、まず一次元目電気泳動部４１０にて第１方向（図４中Ｙ方向）に分離され、緩衝液の平衡化を経た後に、二次元目電気泳動部４２０にて第２方向（図４中Ｘ方向）に分離される。これは、駆動手段４０４が支持アーム４３１をＸ軸方向およびＺ軸方向へ移動可能に保持していることにより実現される。
　（一次元目電気泳動部）
　一次元目電気泳動部４１０には、複数の槽が設けられている。一次元目電気泳動部４１０について、図５を用いて更に説明する。
　図５は、自動化二次元電気泳動装置４００の断面図である。一次元目電気泳動部４１０は、単一の絶縁体に複数の槽４１１・４１２が設けられた構成を有している。
　そのうちの第一試薬槽４１１は、一次元目分離を行うまでの工程に必要な試薬を格納するためのものであり、第２試薬槽４１２は、一次元目分離後で二次元目分離前に必要な試薬を格納するためのものである。具体的には、第一試薬槽４１１は、ゲル配置槽４１１ａ、サンプル槽４１１ｂ、膨潤槽４１１ｃ、等電点電気泳動器具としての第一分離槽４１１ｄからなる。
　また、第２試薬槽４１２は、第１平衡化槽４１２ａ、染色槽４１２ｂ、洗浄槽４１２ｃ、第２平衡化槽４１２ｄからなる。第１平衡化槽４１２ａは、第１方向分離に用いた緩衝液を置換させて、第１方向分離後に行う染色の効率を上げるための緩衝液を格納するために設けられることが好ましい。洗浄槽４１２ｃは、蛍光色素を格納した染色槽４１２ｂにて付着した過剰な蛍光色素を洗浄する緩衝液を格納するために設けられることが好ましい。第２平衡化槽４１２ｄは、第２方向分離を行うために好ましい試薬が格納されており、例えば、等電点電気泳動ゲル２００のタンパク質を還元する試薬、該タンパク質をＳＤＳ化する試薬が格納されている。また、第２方向分離の方法に応じて、緩衝液、界面活性剤、酵素、相互作用物質などが格納されてもよい。
　ここで、駆動手段４０４による支持アーム４３１の移動について説明する。駆動手段４０４は、まず、支持アーム４３１をゲル配置槽４１１ａの所望のＸ位置まで駆動し、次いで支持アーム４３１を所望のＺ位置まで下降させる。続いて、ゲル配置槽４１１ａに配置したゲル付き保持体４０を、制御手段により支持アーム４３１への吸着を制御する。支持アーム４３１への吸着の制御は、例えば電磁弁を用いれば自動制御され得る。駆動手段４０４は、支持アーム４３１に吸着させたゲル付き保持体４０を図５中の矢印４０２の方向へ移動し、これにより、等電点電気泳動ゲル２００は、一次元目電気泳動部４１０に設けられた各槽において所望の処理が施され、引き続き二次元目電気泳動部４２０へ搬送される。
　すなわち、一次元目電気泳動部４１０では、サンプルを等電点電気泳動ゲル２００に導入する工程、等電点電気泳動ゲル２００を膨潤させる工程と、等電点電気泳動ゲル２００に電圧を印加してサンプルを第１方向に分離する工程と、等電点電気泳動ゲル２００中の分離サンプルを染色する工程と、二次元目電気泳動部４２０での環境に平衡化する工程とがおこなわれる。このように一次元目電気泳動部４１０では、等電点電気泳動ゲルへのサンプルの添加と等電点電気泳動ゲル２００の膨潤とを別々に行うことにより、膨潤速度を向上させることができる。
　なお、等電点電気泳動器具である第一分離槽４１１ｄには、等電点電気泳動（一次元目分離）に必要な緩衝液が充填される。ただし、膨潤槽４１１ｃ内に格納される試薬が一次元目分離に必要な緩衝液を含む場合は、第一分離槽４１１ｄ内に一次元目分離に必要な緩衝液を充填しなくてもよい。第一分離槽４１１ｄでは、一対の電極（不図示）に第１電圧印加手段４０５により電圧を印加されることにより、等電点電気泳動ゲル２００中のサンプルが分離される。
　（二次元目電気泳動部）
　二次元目電気泳動部４２０には、上述したポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲル（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ用ゲル）１０が具備されており、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ用ゲル１０において、一次元目電気泳動部４１０から搬送された等電点電気泳動ゲル２００に含まれた分離サンプルが、第１方向と異なる第２方向にさらに分離（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）される。
　二次元目電気泳動部４２０は、ゲル板である下部絶縁板４２１と上部絶縁板４２２とを重ね合わせた絶縁部４２０ａに、上部絶縁板４２２を貫いて下部絶縁部に設けられた第１緩衝液槽４２８ａおよび第２緩衝液槽４２８ｂを有している。また、下部絶縁板４２１には、上部絶縁板４２２との間にＳＤＳ－ＰＡＧＥ用ゲル１０を覆いかつ収納するためのゲル収納部１０’が設けられている。ゲル収納部１０’に収納されたＳＤＳ－ＰＡＧＥ用ゲル１０は下部絶縁板４２１および上部絶縁板４２２からなる絶縁部４２０ａに覆われ、第１開口部４２５および第２開口部４２６において絶縁部４２０ａの外部と接触可能である。
　第１開口部４２５および第２開口部４２６は、二次元目電気泳動部４２０に設けられた第１緩衝液槽４２８ａおよび第２緩衝液槽４２８ｂにそれぞれ面している。第２方向へのサンプル分離を実行するために、第１緩衝液槽４２８ａおよび第２緩衝液槽４２８ｂには、ゲル収納部１０’に収納されたＳＤＳ－ＰＡＧＥ用ゲル１０と第１開口部４２５および第２開口部４２６を介して接する第１緩衝液および第２緩衝液（陰極バッファーを含有する溶液）がそれぞれ充填される。第１緩衝液槽４２８ａおよび第２緩衝液槽４２８ｂには第１電極４２９ａおよび第２電極４２９ｂが設けられており、第１電極４２９ａおよび第２電極４２９ｂを介して第２電圧印加手段４０６によってＳＤＳ－ＰＡＧＥ用ゲル１０に電圧が印加されると、第１開口部４２５から第２開口部４２６に向かって電流が流れる。このとき、等電点電気泳動ゲル２００中の分離サンプルと、分子量マーカーとが第２開口部４２６から第１開口部４２５に向かって展開／分離される。
　ここで、第２緩衝液槽４２８ｂに充填される陰極バッファーを含有する溶液の陰極バッファーは、フロントイオン（例えば、塩素イオンなど）およびトレイリングイオン（グリシン、トリシンなど）を含む。フロントイオンおよびトレイリングイオンが陰極バッファーに含まれていることにより、バンドの濃縮効果を奏することができる。なお、本発明では、フロントイオンとトレイリングイオンを含まないバッファーを陰極バッファーとして用いることも可能である（例えばＭＯＰＳ系、ＭＥＳ系のバッファー）。フロントイオンとトレイリングイオンを含まないバッファーであっても上述した発熱の抑制効果はある。しかしながら、トレイリングイオンを含む系以外では濃縮効果がないため、フロントイオンおよびトレイリングイオンが含まれているバッファーを陰極バッファーとすることが好ましい。また、陰極バッファーのバッファー濃度は、２５～５０ｍＭの範囲に調整されている。ここで、ポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルのバッファー濃度を１５０～５００ｍＭの範囲に調整して、陰極バッファーのバッファー濃度よりも高く設定することにより、ゾーン電気泳動が可能となり、タンパク質のバンドをシャープにする効果がある。
　また、図４中の（ｃ）に示すように、第２開口部４２６の形状に関して、第２緩衝液槽４２８ｂにおいて上部絶縁板４２２を貫く開口の幅は、対応する下部絶縁板４２１の溝幅より広い。この差分によって、図５に示すように、第２開口部４２６から挿入したゲル付き保持体４０の等電点電気泳動ゲル２００と、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ用ゲル１０とを密着させ得、その結果、一次元目電気泳動を終えた等電点電気泳動ゲル２００中のサンプルのＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分離を首尾よくおこない得る。
　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ用ゲル１０に等電点電気泳動ゲル２００を接着させるために、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ用ゲル１０を覆う絶縁部４２０ａは等電点電気泳動ゲル２００とＳＤＳ－ＰＡＧＥ用ゲル１０とを密着させる部位を有していなければならない。このような部位は第２開口部４２６であっても、第１開口部４２５と第２開口部４２６との間にさらなる開口部４２６’が設けられてもよい。
　また、等電点電気泳動ゲル２００とＳＤＳ－ＰＡＧＥ用ゲル１０とを密着させるために、第２開口部４２６からＳＤＳ－ＰＡＧＥ用ゲル１０が突出していることが好ましく、密着度を増すためには突出したＳＤＳ－ＰＡＧＥ用ゲル１０に凹凸がないことがより好ましい。なお、第２開口部４２６からＳＤＳ－ＰＡＧＥ用ゲル１０が突出していない場合は、第２開口部４２６に等電点電気泳動ゲル２００とＳＤＳ－ＰＡＧＥ用ゲル１０とを密着させるための接着部材（図示せず）が設けられていればよい。好ましい接着部材としては、アガロース、低粘度（１～３％程度）のアクリルアミドなどのゲル、グリセリン、ポリエチレングリコール、ヒドロキシプロピルセルロースなどの高粘調液が挙げられるが、これらに限定されない。
　なお、一次元目電気泳動部４１０、二次元目電気泳動部４２０およびゲル付き保持体４０を、サンプルごとに交換して用いる場合があることを想定して、これらの固定手段４０１への固定は着脱可能でかたちであることが好ましい。そのための機構としては、真空吸着機構以外に、挟固定機構、磁力固定機構および静電吸着機構が挙げられるが、これらに限定されない。また、真空吸着機構を採用する場合は、真空吸着プレートを介して固定することが好ましい。
　また、固定手段４０１の直下には、図５に示す冷却手段４０９（例えば、放熱手段）が設けられてもよい。冷却手段４０９を採用することにより、電気泳動時の一次元目電気泳動部４１０および二次元目電気泳動部４２０の温度を一定に保つことができる。
　なお、本実施形態１では、電気泳動装置として自動化二次元電気泳動装置を説明したが、本発明は二次元電気泳動装置に限定されるものではなく、ＳＤＳ－ＰＡＧＥのみをおこなう電気泳動装置（一般的なＳＤＳ－ＰＡＧＥ装置も含む）であっても勿論良い。
　また、本実施形態１において説明した自動化二次元電気泳動装置は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ用ゲル１０を水平面に沿って配設（横置き）した形態であるが、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ用ゲルを垂直面に沿って配設（縦置き）した形態であってもよい。
　〔実施形態２〕
　本発明の他の実施形態を説明すれば、以下のとおりである。なお、説明の便宜上、前記実施形態にて説明した部材と同じ機能を有する部材については説明を省略する。
　上述の実施形態１では、分離ゲルおよび濃縮ゲルの双方においてアクリルアミドバッファーがゲルに共有結合した態様を説明した。しかしながら、本発明はこれに限定されるものではない。例えば、本実施形態３では、濃縮ゲルのみにおいてアクリルアミドバッファーがゲルに共有結合している。すなわち、本実施形態３では、分離ゲルにアクリルアミドバッファーは共有結合していない。
　このように、分離ゲルおよび濃縮ゲルのうちの濃縮ゲルのみにおいてアクリルアミドバッファーを共有結合させた態様であっても、濃縮ゲルに共有結合されたアクリルアミドバッファーが分離ゲルに移動することはない。そのため、時間が経過したとしても、濃縮ゲルには、所定のｐＫａを有するバッファーが残存するため、濃縮ゲルのｐＨが変動することを抑制し、濃縮ゲルでの濃縮効果の低減を抑えることができる。また、濃縮ゲルにおいてバッファーが移動しないため、発熱を抑えることができる。
　〔実施形態３〕
　本発明の他の実施形態を説明すれば、以下のとおりである。なお、説明の便宜上、前記実施形態にて説明した部材と同じ機能を有する部材については説明を省略する。
　上述の実施形態１では、分離ゲルおよび濃縮ゲルの双方においてアクリルアミドバッファーがゲルに共有結合した態様を説明した。しかしながら、本発明はこれに限定されるものではない。例えば、本実施形態３では、分離ゲルのみにおいてアクリルアミドバッファーがゲルに共有結合している。すなわち、本実施形態３では、濃縮ゲルにアクリルアミドバッファーは共有結合していない。
　このように、分離ゲルおよび濃縮ゲルのうちの分離ゲルのみにおいてアクリルアミドバッファーを共有結合させた態様であっても、分離ゲルに共有結合されたアクリルアミドバッファーが濃縮ゲルに移動することはない。そのため、時間が経過したとしても、濃縮ゲルには、分離ゲルから異なるｐＨのバッファーが混入することがなく、濃縮ゲルのｐＨが変動することを抑制し、濃縮ゲルでの濃縮効果の低減を抑えることができる。また、分離ゲルにおいてバッファーが移動しないため、発熱を抑えることができる。
　〔まとめ〕
　本発明の態様１に係るポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲル（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ用１０）は、濃縮ゲル５および上記濃縮ゲルとは異なるｐＨに調整されている分離ゲル４を含み、上記濃縮ゲル５および上記分離ゲル４のうちの少なくとも一方には、アクリルアミドバッファーが共有結合されていることを特徴としている。
　上記の構成によれば、アクリルアミドバッファーが共有結合されているゲルから当該アクリルアミドバッファーが遊離することがない。なお、共有結合されているアクリルアミドバッファーとは、緩衝作用を有するアクリルアミド誘導体である。
　これにより、時間の経過により濃縮ゲルおよび分離ゲルの各々のバッファーが混合することを抑制することができる。そのため、本発明の態様１に係るポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルは、時間が経過しても濃縮ゲルが濃縮効果を維持することができる。
　そのため、泳動実施者が泳動毎にゲルを作製する必要がなく、例えば電気泳動装置を製造する側で装置にゲルを装填することが可能であり、電気泳動の自動化に寄与することができる。
　また、共有結合されているアクリルアミドバッファーは電圧印加によってもゲル内を移動することがない。そのため、ゲル内に電流が過剰に流れることがなく、不都合な発熱を発生することがない。したがって、ゲルの膨張を引き起こすことがなく、良好な電気泳動分離パターンを検出することができるポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルを提供することができる。
　よって、分離ゲルに導入されるまでにタンパク質サンプルが濃縮される形態でありながら、濃縮効果の持続性を向上させるとともに泳動時の発熱抑制を実現したポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルを提供することができる。
　なお、仮に２層をなさない中性ゲルを電気泳動用ゲルとして用いた場合、２層構成であることに起因した上述の問題点は解消される。しかしながら、本発明のように分離ゲルと濃縮ゲルの２層構成のゲルのほうが、上記濃縮効果が高い為に分離が良く、シャープなバンドが検出することができる。したがって、２層構成であることのメリットに加えて、上述の問題点が解消された本発明のポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルは、従前の電気泳動用ゲルに比べて優位であるといえる。
　本発明の態様２に係るポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルは、上記態様１において、上記濃縮ゲル５に、ｐＫａが、６．２～８．５の範囲であるアクリルアミドバッファーが架橋されていることが好ましい。これにより、陰極バッファーに含まれるグリシンの解離度が低い為に陽極への移動が遅くなり、濃縮ゲル中を移動するタンパク質が濃縮される。
　本発明の態様３に係るポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルは、上記態様１または２において、上記分離ゲル４に、ｐＫａが、８．５～９．３の範囲であるアクリルアミドバッファーが架橋されていることが好ましい。この範囲のｐＫａのアクリルアミドバッファーが架橋されていることにより、分離ゲル中を移動するタンパク質が分子ふるい効果によって分離される。
　本発明の態様４に係るポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルは、上記態様１または３において、上記濃縮ゲル５のｐＨが、６．６～７．５の範囲に調整されており、上記分離ゲル４のｐＨが、８．４～８．８の範囲に調整されていることが好ましい。これにより、濃縮ゲルではタンパク質を分離せずに濃縮し、濃縮したタンパク質を分離ゲルにおいて良好に分離することができる。
　本発明の態様５に係るポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルは、上記態様１から４において、ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルとすることができる。
　上記の構成によれば、濃縮効果の持続性を向上させるとともに、泳動時の発熱抑制を実現して、時間が経過しても高い分離解像度を維持したＳＤＳ－ＰＡＧＥ用ゲルを提供することができる。
　本発明の態様６に係る電気泳動装置（自動化二次元電気泳動装置４００）は、上記態様１から４の何れに記載のポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルと、陰極（第２電極４２９ｂ）と、上記ポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルに対して、上記陰極（第２電極４２９ｂ）とは反対側に配置された陽極（第１電極４２９ａ）と、上記ポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルの上記陰極側（第２緩衝液槽４２８ｂ）に添加される陰極バッファーと、を備えていることを特徴としている。
　上記の構成によれば、上述したポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルの効果を享受した電気泳動装置を提供することができる。
　本発明の態様７に係る電気泳動装置は、上記態様６において、上記陰極バッファーは、フロントイオンおよびトレイリングイオンを含むことができる。
　本発明の態様８に係る電気泳動装置は、上記態様６または７において、上記陰極バッファーのバッファー濃度が、２０～５０ｍＭの範囲に調整されており、上記ポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルのバッファー濃度が、１５０～５００ｍＭの範囲に調整されていてもよい。ポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルのバッファー濃度を、陰極バッファーよりも高い濃度とすることにより、ゾーン電気泳動が奏効する。
　本発明の態様９に係る電気泳動装置は、上記態様６から８において、一次元目の電気泳動をおこなう第一泳動部（一次元目電気泳動部４１０）と、二次元目の電気泳動をおこなう第二泳動部（二次元目電気泳動部４２０）とを有し、上記第二泳動部の電気泳動用ゲルが上記ポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルであってもよい。
　上記の構成によれば、上述した効果を奏するポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルを第二泳動部の電気泳動用ゲルとして具備しており、二次元電気泳動の完全な自動化を実現することができる。
　従前では、上述した理由から第二泳動部の電気泳動用ゲルは泳動実施者によって作製する必要があった。すなわち、二次元電気泳動装置の一部を自動化することはできても、当該ゲルの準備は泳動実施者自らがおこなわなくてはならなかった。しかしながら、上記の構成によれば、泳動を実施する（遥か）前からゲルを装置内に設置することが可能となる。そのため、泳動実施者がおこなう作業といえば例えばサンプルの調整のみであり、電気泳動に関する操作の一切を装置によって自動化することが可能である。
　本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。さらに、各実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を組み合わせることにより、新しい技術的特徴を形成することができる。
　（１．試料タンパク質の前処理）
　マウス肝臓組織から試料タンパク質を調製した。まず、マウス肝臓組織から、血管および血液溜をなるべく避けて０．４ｇの試料を秤取り、氷上で冷却した５ｍＬガラステフロン（登録商標）ホモジナイザーに入れた。ホモジナイザー内の試料に、４℃に冷却した５～６倍量（２ｍＬ）の溶解バッファー（５０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．６）、２０％グリセロール、０．３Ｍ　ＮａＣｌ）およびプロテアーゼ阻害剤カクテルを添加し、氷上で摩砕した（３０００～４０００ｒｐｍ）。その後、１０００×ｇで１０分間、４℃で遠心分離した。上清を回収した後、１６０００×ｇで３０分間、４℃で遠心分離した。再度上清を回収し、タンパク質定量を行い、濃度を算定した後、－８０℃で保存した。
　続いて、アセトン沈殿による脱塩および濃縮によりタンパク質を精製した。まず、マウス肝臓組織から得られたタンパク質溶液試料を１．５～２．０ｍＬのマイクロチューブに入れた。マイクロチューブ内の試料に、８～９倍量の冷アセトン（－２０℃）を添加し、－２０℃にて約２時間保温した。続いて、１４０００×ｇで１０分間、４℃で遠心分離した。上清（アセトン画分）を廃棄し、チューブのフタを空けたまま２～３分間放置し、アセトンを飛ばした。
　（２．バッファーが共有結合したＳＤＳ－ＰＡＧＥ用ゲル１０の作製）
　図１に示すようなゲル作製器具を用いて、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ用ゲル（１０）を作製した。まず、１ｍｍのスペーサーおよびパッキンを挟んだ２枚のガラス板（１）をクリップ（２）によって固定した。注入管（３）から、ガラス板の間に、ｐＨ８．８のトリス緩衝液を含むアクリルアミドモノマー溶液（９．７％アクリルアミド、０．３％ビスアクリルアミド、３７５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、０．１％ＴＥＭＥＤ、０．０５％ＡＰＳ）を添加して、約７割まで充填した後、表層に水を重層して、３０分間室温にて重合を行い、分離ゲルを形成した。
　次に、水を除いて、分離ゲル上に、ｐＫａ６．８のアクリルアミドバッファーを含むアクリルアミドモノマー溶液（２．９１％アクリルアミド、０．０９％ビスアクリルアミド、１００ｍＭ アクリルアミドバッファー（ｐＫａ６．８）、０．０５％ＴＥＭＥＤ、０．０３％ＡＰＳ）を充填し、平坦なコームを被せることにより、アクリルアミドモノマー溶液の表面が空気に触れないようにして、約２時間室温にて重合させて、濃縮ゲル５を形成した。これにより、濃縮ゲルおよび分離ゲルを備えた二層のＳＤＳ－ＰＡＧＥ用ゲルを作製した（図２参照）。
　（３．二次元電気泳動：一層のゲルとの対比）
　シャープマニファクチュアリングシステム社製のＡｕｔｏ２Ｄにより二次元電気泳動を行なった。実施例としては、２．において作製した二層のＳＤＳ－ＰＡＧＥ用ゲルを用い、比較例としては、保存性を考慮して作製されている市販の一層（ｐＨ８．８）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ用ゲルを用いた。
　まず、１．においてマウス肝臓から調製した可溶性のタンパク質を試料として二次元電気泳動を行なった。陰極バッファーとしては、２５ｍＭトリス塩基、１９２ｍＭグリシン、０．１％ＳＤＳＤを含む水溶液を用いた。結果を図６に示す。実施例に係るＳＤＳ－ＰＡＧＥ用ゲル（図６の（ａ））では、比較例に係るＳＤＳ－ＰＡＧＥ用ゲル（図６の（ｂ））に比べて、分子量方向のスポットをシャープに検出することができた。
　また、抗体（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）を試料として二次元電気泳動を行った。一次元目の電気泳動条件は、次の通りとした。
Ｓｔｅｐ１：２００Ｖ，５分間一定
Ｓｔｅｐ２：１０００Ｖ，５分間リニアグラジエント
Ｓｔｅｐ３：１０００Ｖ，５分間一定
Ｓｔｅｐ４：４０００Ｖ，１０分間リニアグラジエント
Ｓｔｅｐ５：４０００Ｖ，１０分間一定
Ｓｔｅｐ６：７０００Ｖ，１０分間リニアグラジエント
Ｓｔｅｐ７：７０００Ｖ，２０分間一定
　その後、２次元電気目電気泳動は、次の通りとした。
Ｓｔｅｐ１:１０ｍＡ、１０分間一定
Ｓｔｅｐ２：２０ｍＡ、３５分間
　二次元電気泳動結果を図７に示す。比較例に係るＳＤＳ－ＰＡＧＥ用ゲル（図７の（ｂ））では、スポットが縦に伸びる現象が発生していた。これは、非還元条件下の抗体が約１６０ｋＤａと非常に大きな分子であることに起因する。一方、実施例に係るＳＤＳ－ＰＡＧＥ用ゲル（図７の（ａ））では、濃縮ゲルにおいて濃縮効果が得られるため、抗体を試料とした場合でも、スポットが縦に伸びる現象を抑制することができた（図７の（ａ））。
　本発明は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥをおこなう電気泳動装置や、二次元電気泳動装置に利用することができる他、例えば創薬研究開発にも利用可能であり、また診断用医療関係機器へ応用することも可能である。
１　ゲル板
２　クリップ
３　チューブ
４　分離ゲル
５　濃縮ゲル
１０　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ用ゲル（ポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲル）
１０’　ゲル収納部
４０　ゲル付き保持体
２００　等電点電気泳動ゲル
４００　自動化二次元電気泳動装置
４１０　一次元目電気泳動部（第一泳動部）
４１１　第一試薬槽
４１２　第２試薬槽
４２０　二次元目電気泳動部（第二泳動部）
４２１　下部絶縁板
４２２　上部絶縁板
４２８ａ　第１緩衝液槽
４２８ｂ　第２緩衝液槽
４２９ａ　第１電極
４２９ｂ　第２電極

Claims (9)

  1. 　濃縮ゲルおよび上記濃縮ゲルとは異なるｐＨに調整されている分離ゲルを含み、
    　上記濃縮ゲルおよび上記分離ゲルのうちの少なくとも一方には、アクリルアミドバッファーが共有結合されていることを特徴とするポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲル。
  2. 　上記濃縮ゲルに、ｐＫａが、６．２～８．５の範囲であるアクリルアミドバッファーが架橋されていることを特徴とする請求項１に記載のポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲル。
  3. 　上記分離ゲルに、ｐＫａが、８．５～９．３の範囲であるアクリルアミドバッファーが架橋されていることを特徴とする請求項１または２に記載のポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲル。
  4. 　上記濃縮ゲルのｐＨは、６．６～７．５の範囲に調整されており、
    　上記分離ゲルのｐＨは、８．４～８．８の範囲に調整されていることを特徴とする請求項１～３の何れか一項に記載のポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲル。
  5. 　ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルであることを特徴とする請求項１から４までの何れか１項に記載のポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲル。
  6. 　請求項１～５の何れか一項に記載のポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルと、
    　陰極と、
    　上記ポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルに対して、上記陰極とは反対側に配置された陽極と、
    　上記ポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルの上記陰極側に添加される陰極バッファーと、を備えている電気泳動装置。
  7. 　上記陰極バッファーは、フロントイオンおよびトレイリングイオンを含んでいることを特徴とする請求項６に記載の電気泳動装置。
  8. 　上記陰極バッファーのバッファー濃度は、２０～５０ｍＭの範囲に調整されており、
    　上記ポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルのバッファー濃度は、１５０～５００ｍＭの範囲に調整されていることを特徴とする請求項６または７に記載の電気泳動装置。
  9. 　一次元目の電気泳動をおこなう第一泳動部と、二次元目の電気泳動をおこなう第二泳動部とを有し、
    　上記第二泳動部の電気泳動用ゲルが上記ポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルであることを特徴とする請求項６から８までの何れか１項に記載の電気泳動装置。
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