WO2015065097A1 - 췌장암 진단용 조성물 및 이를 이용한 췌장암 진단방법 - Google Patents

췌장암 진단용 조성물 및 이를 이용한 췌장암 진단방법 Download PDF

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    • G01N2333/924—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)

Definitions

  • Pancreatic cancer diagnostic composition and pancreatic cancer diagnostic method using same Field of the Invention can be used to determine the onset or possibility of the development of pancreatic cancer, an agent for measuring the expression level of a specific protein or the expression level of mRNA of the gene encoding the protein. It relates to a pancreatic cancer diagnostic composition and kit comprising, and a pancreatic cancer diagnostic method using the same.
  • Background of the Invention In the major diseases of modern people, studies on the treatment and diagnosis of cancer are relatively active, especially in the high incidence of lung cancer, liver cancer, gastric cancer. However, studies on esophageal cancer, colorectal cancer and pancreatic cancer with low incidence are relatively low.
  • pancreatic cancer does not feel much at first, but after such general metastasis, pain and weight loss usually occur, and the healing rate is relatively low, so regular diagnosis is very important. Most clinical symptoms are slow onset, prone to weakness with loss of appetite, and weight loss. Pancreatic cancer is a deadly cancer with a 5-year survival rate of only 1-4%. The pancreatic cancer has the worst prognosis among cancers of the human body.
  • the effectiveness of several anticancer drugs, including 5-fluorouracil, gemcitabine, and tarceva, which are known to be effective against pancreatic cancer to date, are extremely low, and the response to chemotherapy is about 15%. This fact suggests that the development of more effective early diagnosis and treatment is urgently needed to improve the prognosis of pancreatic cancer patients.
  • Pancreatic cancer has been diagnosed by blood tests (CA19-9), X-ray imaging of the stomach and duodenum, biliary tract imaging through the skin and liver, and retrograde endoscopic cholangiography. Computerized tomography is most commonly used. When disease lesions are found by these methods, a more accurate biopsy may be performed to obtain relatively accurate test results. However, the method of diagnosis may be inconvenient due to poor accuracy or pain in the patient. The subjects are reluctant to do this. Therefore, the development of a test method for diagnosing pancreatic cancer simply and quickly has been required.
  • Korean Patent No. 10-0819122 discloses a technique using matrilin, transthyretin and stratifin as a pancreatic cancer marker
  • Korean Patent Application Publication No. 2012-0082372 Techniques using various pancreatic cancer markers are disclosed.
  • Korean Patent Application Publication No. 2009-0003308 discloses a method for diagnosing pancreatic cancer by detecting the expression level of REG4 protein in a blood sample of an individual
  • Korean Patent Application Publication No. 2012-0009781 discloses information necessary for diagnosing pancreatic cancer in an individual. Assay method for measuring the expression level of XIST RNA in cancer tissues isolated from the individual to provide a, Korean Patent Application Publication No.
  • 200119 0119250 is a novel gene LBFL313 expressed differently in human pancreatic cancer tissue compared to normal human pancreatic tissue A family is disclosed and US Patent Application Publication No. 2011/0294136 discloses a method for diagnosing pancreatic cancer using biomarkers such as keratin 8 protein.
  • biomarkers such as keratin 8 protein.
  • each marker shows a large difference in its diagnostic efficiency and accuracy, it is necessary to find a marker that is more effective.
  • the present inventors have completed the present invention by finding a protein that specifically increases or decreases in pancreatic cancer, and confirms that the pancreatic cancer can be easily diagnosed using the result of the intensive efforts to develop a marker useful for early diagnosis of pancreatic cancer. . Summary of the Invention
  • pancreatic cancer diagnostic composition that can easily diagnose early onset of pancreatic cancer.
  • Another object of the present invention to provide a pancreatic cancer diagnostic kit comprising the composition.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for diagnosing pancreatic cancer using the pancreatic cancer diagnostic composition or kit.
  • the present invention is for pancreatic cancer diagnosis comprising a preparation for measuring the expression level of ABAT (4-aminobutyrate aminotransferase; GenBank Accession No: NP_001120920.1) protein or mRNA of the mRNA encoding the ABAT protein To provide a composition.
  • ABAT 4-aminobutyrate aminotransferase; GenBank Accession No: NP_001120920.1
  • the present invention provides an expression level of the ABAT protein or mRNA expression level of the gene encoding the ABAT protein, and CHI3Ll (Chitinase-3-like protein 1 precursor; GenBank Accession No: NP_001267.2) protein or CHI3L1 protein. It provides a pancreatic cancer diagnostic composition comprising an agent for measuring the expression level of mRNA of the gene encoding.
  • the present invention provides a pancreatic cancer diagnostic kit comprising the composition.
  • the present invention comprises the steps of (a) obtaining a sample from a subject to diagnose whether the pancreatic cancer; (b) measuring the expression level of ABAT (4-aminobutyrate aminotransferase; GenBank Accession No: NP—001120920.1) protein or the mRNA expression level of a gene encoding ABAT protein from the sample; (c) comparing the expression level of the ABAT protein or the mRNA expression level of a gene encoding the ABAT protein with the expression level in a normal control sample; And (d) comparison of step (c) Results Pancreatic cancer comprising determining that the pancreatic cancer is more likely to develop if the expression level of ABAT protein or mRNA expression level of gene encoding ABAT protein in subject to be diagnosed with pancreatic cancer is higher than that of normal control group. It provides a diagnostic method.
  • the present invention comprises the steps of (a) obtaining a sample from a subject to diagnose whether or not pancreatic cancer; (b) the expression level of the ABAT protein or the mRNA expression level of the gene encoding ABAT protein from the sample, and the expression level of the CHI3Ll (Chi inase-3-l ike protein 1 precursor; GenBank Accession No: NP_001267.2) protein Or measuring the mRNA expression level of a gene encoding a CHI3L1 protein; (c) comparing the expression level of the ABAT protein or the mRNA expression level of the gene encoding ABAT protein and the expression level of the CHI3L1 protein or the mRNA expression level of the gene encoding CHI3L1 protein with the expression level in a normal control sample.
  • step; And (d) the comparison result of step (c) indicates that the expression level of ABAT protein or the mRNA expression level of the gene encoding ABAT protein in the subject to be diagnosed with pancreatic cancer is higher than the expression level in the normal control sequence, It provides a method for diagnosing pancreatic cancer, comprising determining that the pancreatic cancer is more likely to develop when the expression level of the CHI3L1 protein or the mRNA expression level of the gene encoding the CHI3L1 protein is lower than the expression level in the normal control group.
  • the present invention can significantly predict or understand the incidence of pancreatic cancer, early diagnosis, and degree of disease, and can be utilized for tumorigenesis research of pancreatic cancer.
  • the diagnostic method of the present invention can non-invasively diagnose early pancreatic cancer simply from blood or the like.
  • 1 is a graph showing the relative concentration of ABAT in the control group and pancreatic cancer patient group by MRM quantitative analysis.
  • 2 is a Receiver Operating Characteristic (ROC) graph showing pancreatic cancer diagnostic performance (AUC) of ABAT.
  • FIG. 3 is a ROC graph showing pancreatic cancer diagnostic performance (AUC) of CA19-9, known as a conventional pancreatic cancer blood marker.
  • FIG. 4 is a ROC graph comparing pancreatic cancer diagnostic performance (AUC) of ABAT and CA19-9.
  • FIG. 5 is a ROC graph showing pancreatic cancer diagnostic performance (AUC) when ABAT and CA19-9 are used simultaneously.
  • FIG. 6 is a ROC graph comparing pancreatic cancer diagnostic performance (AUC) when ABAT and CA19-9 are used simultaneously and pancreatic cancer diagnostic performance when ABAT black CA19-9 is used, respectively.
  • FIG. 7 is a graph showing the relative concentration of CHI3L1 in the control group and pancreatic cancer patient group by MRM quantitative analysis.
  • FIG. 8 is a ROCCReceiver Operating Character i st i c) graph showing pancreatic cancer diagnostic performance (AUC) of a combination of ABAT and CHI3L1.
  • FIG. 9 is a R0C graph comparing the combination of ABAT and CHI3L1 with pancreatic cancer diagnostic performance (AUC) of CA19-9.
  • FIG. 10 is a R0C graph showing pancreatic cancer diagnostic performance (AUC) when a combination of ABAT and CHI3L1 and CA19-9 are used simultaneously.
  • AUC pancreatic cancer diagnostic performance
  • FIG. 11 is a R0C graph comparing pancreatic cancer diagnostic performance (AUC) when using a combination of ABAT and CHI3L1 and CA19-9 simultaneously and pancreatic cancer diagnostic performance when using a combination of ABAT and CHI3L1 or CA19-9, respectively.
  • AUC pancreatic cancer diagnostic performance
  • the term "diagnosis” refers to determining the susceptibility of a subject to a particular disease or disorder, determining whether the subject currently has a particular disease or disorder, a particular disease or disorder Determining the prognosis (eg, identifying a metastatic or metastatic cancer state, determining the stage of the cancer, or determining the responsiveness of the cancer to treatment), or therametrics (eg, therapeutic efficacy) Monitoring the state of an object to provide information about it). For the purposes of the present invention, the diagnosis is to determine whether pancreatic cancer develops or the likelihood (risk).
  • the prognosis eg, identifying a metastatic or metastatic cancer state, determining the stage of the cancer, or determining the responsiveness of the cancer to treatment
  • therametrics eg, therapeutic efficacy
  • pancreatic cancer refers to a cancer that originates in pancreatic cells. There are many types of pancreatic cancer. Pancreatic adenocarcinoma of the pancreatic ducts accounts for about 90% of the pancreatic cancer. In addition, cystic cancer (cystic adenocarcinoma), endocrine tumors and the like.
  • the terms “marker”, “biomarker” or “diagnostic marker” means a marker capable of distinguishing a normal or pathological condition or predicting a therapeutic response and measuring objectively.
  • the protein expression level or gene expression level is significantly increased or decreased in an individual having pancreatic cancer or having a pancreatic cancer risk (risk) as compared to the normal control group (non-pancreatic cancer).
  • Organic biomolecules such as polypeptides or nucleic acids (eg mRNA), lipids, glycolipids, glycoproteins, sugars (monosaccharides, disaccharides, oligosaccharides, etc.).
  • the present invention provides a pancreatic cancer diagnostic composition
  • a pancreatic cancer diagnostic composition comprising an agent for measuring the expression level of the ABAT (4-aminobutyrate aminotransferase; GenBank Accession No: NP_001120920.1) protein or the mRNA level of the mRNA encoding the ABAT protein.
  • the present invention is characterized by effectively using ABAT as a marker for diagnosing pancreatic cancer to effectively diagnose whether or not pancreatic cancer develops from a subject.
  • the present inventors confirmed that by using ABAT as a diagnostic marker for pancreatic cancer, a highly sensitive and reliable result of pancreatic cancer can be obtained from a subject. Specifically, the present inventors analyzed plasma samples of pancreatic cancer patients, intraductal papillary mucinous neoplasm (IPMN) patients, and chronic cholecystitis patients to discover ABAT as a biomarker that is overexpressed in pancreatic cancer. In addition, plasma samples from normal controls (non-pancreatic cancer subjects) were analyzed to establish the effectiveness of the excavated biomarkers.
  • IPMN intraductal papillary mucinous neoplasm
  • the present invention is the expression level of the ABAT protein or the mRNA expression level of the gene encoding the ABAT protein, and the expression of CHI3Ll (Chi inase-3-l ike protein 1 precursor; GenBank Accessi on No: NP_001267.2) protein
  • CHI3Ll Cho inase-3-l ike protein 1 precursor; GenBank Accessi on No: NP_001267.2
  • the present invention is characterized by effectively diagnosing whether pancreatic cancer develops or is probable by using a combination of ABAT and CHI3L1 as a marker for diagnosing pancreatic cancer.
  • ABAT used as a diagnostic marker for pancreatic cancer in the present invention is as described above, CHI3Ll (Chi t inase-3-1 ike protein 1 precursor; GenBank Accessi on No: NP_001267.2 used as another diagnostic marker for pancreatic cancer in the present invention) ) Is also known as Cartilage glycoprotein 39 and belongs to the family of glycosyl hydrolase 18.
  • CHI3L1 is a type of glycoprotein that is excreted outside the cell and is known to increase its expression in cancer cells such as breast cancer, colon cancer, prostate cancer, ovarian cancer, auditory cancer, lung cancer and liver cancer.
  • ABAT and CHI3L1 can be used as a biomarker for diagnosing pancreatic cancer.
  • the present inventors confirmed that by using a combination of ABAT and CHI3L1 as a marker for diagnosing pancreatic cancer, a highly sensitive and reliable result of pancreatic cancer or its likelihood can be obtained from an individual. Specifically, the present inventors analyzed plasma samples of pancreatic cancer patients, intraductal papillary mucinous neoplasm (IPMN) patients, and chronic cholecystitis patients, and expressed ABAT and low expression as biomarkers overexpressed in pancreatic cancer. As a biomarker, CHI3L1 was excavated, and plasma samples of normal controls (individuals not pancreatic cancer) were analyzed to establish the effectiveness of the combination of the biomarkers.
  • IPMN intraductal papillary mucinous neoplasm
  • the term "measurement of expression level of protein” refers to a process of confirming the presence and expression level of a pancreatic cancer diagnostic marker (protein) or a gene encoding the same in a biological sample for diagnosing pancreatic cancer.
  • the agent for measuring the expression level of ABAT protein, or the agent for measuring the expression level of CHI3L1 protein is an antibody, oligopeptide, ligand, PNA that specifically binds to ABAT protein or CHI3L1 protein (peptide nucleic acid) or aptamer (aptamer).
  • antibody refers to a substance that specifically binds to an antigen and results in an antigen-antibody reaction.
  • an antibody refers to an antibody that specifically binds to a protein of ABAT or CHI3L1.
  • Antibodies of the invention include all polyclonal antibodies, monoclonal antibodies and recombinant antibodies, The antibodies may be readily prepared using techniques well known in the art. Functional fragments of antibody molecules, as well as complete forms having two full length light chains and two full length heavy chains, A functional fragment of an antibody molecule means a fragment having at least antigen binding function, Fab, F (ab '), F (ab') 2 and Fv.
  • PNA Peptide Nucleic Acid
  • DNA has a phosphate-ribose sugar backbone
  • PNA has a repeated N- (2-aminoethyl) -glycine backbone linked by peptide bonds, which greatly increases binding and stability to DNA or RNA, leading to molecular biology. , Used for diagnostic analysis and antisense therapies. PNAs are described in Nielsen PE, Egholm M, Berg RH, Buchardt 0 (December 1991).
  • aptamers in the present invention are oligonucleic acid or peptide molecules, the general contents of aptamers are described in Bock LC et al, Nature 355 (6360): 5646 (1992); Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine ". J Mol Med. 78 (8): 42630 (2000); Cohen BA, Colas P, Brent R. "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library”. Proc Natl Acad Sci USA.
  • the term "measurement of expression level of mRNA” used in the present invention means measuring the amount of mRNA by confirming the presence and expression level of mRNA of genes encoding the pancreatic cancer diagnostic protein in a biological sample in order to diagnose pancreatic cancer.
  • Analytical methods for this purpose include reverse transcriptase polymerase reaction (RT-PCR), competitive reverse transcriptase polymerase reaction (Competitive RT-PCR), real-time reverse transcriptase polymerase reaction (Real-time RT-PCR), RNase protection assay (RPA; RNase protection). assays, Northern blotting, DNA chips, and the like.
  • an agent for measuring the expression level of mRNA of a gene encoding ABAT or CHI3L1 protein comprises a primer, probe or antisense nucleotide that specifically binds to mRNA of a gene encoding ABAT or CHI3L1 protein.
  • a primer, probe or antisense nucleotide that specifically binds to mRNA of a gene encoding ABAT or CHI3L1 protein.
  • the term "probe” refers to a substance that can specifically bind to a target substance to be detected in a sample, and means a substance that can specifically confirm the presence of the target substance in the sample through the binding. do.
  • the type of probe is a material commonly used in the art, but is not limited.
  • the probe may be PNA (tide nucleic acid), LNAClocked nucleic acid (PENA), peptide, polypeptide, protein, RNA or DNA. Is PNA.
  • the term “antisense” refers to a nucleotide in which an antisense oligomer is generalized with a target sequence in RNA by Watson-Crick base pairing, thereby allowing the formation of mRNA and RNA: oligomeric heterodimers typically within the target sequence.
  • the composition for diagnosing pancreatic cancer according to the present invention may further comprise an agent for measuring the expression level of a CA19-9 (Carbohydrate Antigen 19-9) protein or the mRNA level of a gene encoding a CA19-9 protein. Can be.
  • the pancreatic cancer diagnostic composition according to the present invention includes an agent for measuring the expression level of the ABAT and CA19-9 protein or the mRNA level of the gene encoding the ABAT and CA19-9 protein.
  • the pancreatic cancer diagnostic composition according to the present invention encodes the expression level of ABAT, CHI3Ll (Chitinase-3; like protein 1 precursor; GenBank Accession No: NP_001267.2) and CA19-9 protein or ABAT, CHI3L1 and CA19-9 protein It includes an agent for measuring the expression level of mRNA of the gene.
  • the CA19-9 protein is known as a conventional pancreatic cancer marker [Safi F.
  • composition of the present invention provides a more effective and more accurate method of pancreatic cancer by combining two markers, i.e., measurements of ABAT and CA19-9, or by combining three markers, i.e., ABAT, CHI3L1 and CA19 ⁇ 9. Enable diagnosis.
  • the present invention provides a pancreatic cancer diagnostic kit comprising the pancreatic cancer diagnostic composition.
  • the kit may be an RT-PCR kit, a DNA chip kit, an ELISA kit, a protein chip kit, a rapid kit, or a multiple reaction monitoring (MRM) kit.
  • MRM multiple reaction monitoring
  • the pancreatic cancer diagnostic kit may further include one or more other component compositions, solutions or devices suitable for the analysis method.
  • the diagnostic kit may further include essential elements necessary to perform reverse transcriptase.
  • the reverse transcriptase polymerase reaction kit includes primer pairs specific for the gene encoding the marker protein.
  • the primer is a nucleotide having a sequence specific to the nucleic acid sequence of the gene, it may have a length of about 7 bp to 50 bp, more preferably about 10 bp to 30 bp. It may also include primers specific for the nucleic acid sequence of the control gene.
  • reverse transcriptase kits include test tubes or other suitable containers, reaction buffers (pH and magnesium concentrations vary), enzymes such as deoxynucleotides (dNTPs), Taq-polymerases and reverse transcriptases, DNases, RNase inhibitors. DEPC-water, sterile water, and the like.
  • the diagnostic kit of the present invention may include the necessary elements necessary to perform the DNA chip.
  • DNA chip kits correspond to genes or fragments thereof It may include a substrate to which cDNA or oligonucleotide is attached, and reagents, preparations, enzymes, and the like for preparing a fluorescent label probe.
  • the substrate may also comprise cDNA or oligonucleotide corresponding to the control gene or fragment thereof.
  • the diagnostic kit of the present invention may include essential elements necessary for performing ELISA.
  • the ELISA kit includes an antibody specific for the protein.
  • the antibody is an antibody having high specificity and affinity for a marker protein and having little cross reaction to other proteins.
  • the antibody is a monoclonal antibody, a polyclonal antibody, or a recombinant antibody.
  • the ELISA kit can also include antibodies specific for the control protein.
  • Other ELISA kits include reagents that can detect bound antibodies, such as labeled secondary antibodies, chromophores, enzymes (e.g., conjugated with antibodies) and substrates or antibodies that can bind to them. Other materials and the like.
  • the present invention provides a method for diagnosing pancreatic cancer.
  • step (d) comparison of step (c) shows that pancreatic cancer develops when the expression level of ABAT protein or the mRNA expression level of the gene encoding ABAT protein is higher than that of the normal control group. Determining that the probability is high.
  • the diagnostic method according to another embodiment of the present invention comprises the following steps:
  • step (d) As a result of the comparison of step (c), the expression level of the ABAT protein or the mRNA expression level of the gene encoding the ABAT protein in the subject to be diagnosed with pancreatic cancer is higher than that in the normal control group, and the CHI3L1 protein Determining that the probability of developing pancreatic cancer is high when the expression level of or the mRNA expression level of the gene encoding the CHI3L1 protein is lower than that of the normal control group.
  • sample means a biological sample, such as tissues, cells, blood, serum, plasma, saliva, cerebrospinal fluid or urine, which differ in protein expression level or gene expression level due to pancreatic cancer.
  • sample means blood, serum or plasma.
  • the expression level of the ABAT protein or the gene encoding the protein is characterized in that the expression level in the pancreatic cancer patients is increased compared to the expression level in the normal control group, the expression of the ABAT protein in the subject to diagnose whether the pancreatic cancer If the mRNA expression level of the level or gene encoding the ABAT protein is higher than the expression level of the protein or gene in the normal control, it may be determined that pancreatic cancer is more likely to develop.
  • the mRNA level of the ABAT protein or the gene encoding the protein has an expression level in pancreatic cancer patients and expression level in a normal control group.
  • the mRNA of the CHI3L1 protein or the gene encoding the CHI3L1 protein has a characteristic of decreasing in comparison with the expression level in the pancreatic cancer patients compared with the normal control group.
  • the expression level of the ABAT protein in the subject or the mRNA expression level of the gene encoding the ABAT protein is higher than the expression level of the protein or gene in the normal control and at the same time the expression level of the CHI3L1 protein or the mRNA expression level of the gene encoding the CHI3L1 protein. If the expression level of the protein or gene in the normal control group is lower, it may be determined that pancreatic cancer is more likely to develop.
  • the expression level of the ABAT protein or the mRNA expression level of the gene encoding the ABAT protein in the subject to be diagnosed with pancreatic cancer is higher than the expression level in the normal control group, as measured by various methods.
  • the expression level of the ABAT protein or the mRNA expression level of the gene encoding the ABAT protein in the subject to be diagnosed is more than 1.0 times, more than 1.5 times, more than 2 times, and more than 3 times that of the normal control group. , More than 5 times or more than 10 times.
  • the expression level of the CHI3L1 protein or the mRNA expression level of the gene encoding the CHI3L1 protein in the subject to diagnose the development of pancreatic cancer is lower than the expression level in the normal control group when measured by various methods
  • the expression level of the CHI3L1 protein or the mRNA expression level of the gene encoding the CHI3L1 protein in the subject to be diagnosed is less than 1.0 times, less than 1.5 times, less than 2 times, less than 3 times, 5 times that of the normal control group. It means less than 10 times or less than 10 times.
  • the 'determining the high likelihood of developing pancreatic cancer' may be performed using a pancreatic cancer diagnostic function.
  • pancreatic cancer diagnostic function include the following formula (1):
  • the function is derived from a support vector machine (SVM).
  • SVM is an algorithm that adds a function that satisfies a given condition based on the Lagrangian optimization theory. Among them, the SVM supports the classification of a classification analysis method using the maximum margin classifier. It is called (Support Vector Classification, SVC).
  • SVC Support Vector Classification
  • the function was quantified by ABAT or MRM (Multiple Reaction Monitoring) of ABAT and CHI3L1. When a relative measurement value of SIM (Selected Ion Monitoring) is substituted, a value of 1 diagnoses a high probability of developing pancreatic cancer, and a value of -1 diagnoses a normal condition.
  • the method of the present invention can immediately determine the possibility of developing pancreatic cancer by substituting the expression level of ABAT protein or its mRNA or the expression level of ABAT and CHI3L1 protein or its mRNA into a pancreatic cancer diagnostic function. , No clinical judgment of the doctor is necessary.
  • the diagnostic function is constructed by SVM, but it can be implemented by various kinds of discriminant analysis methods, including various machine learning methods such as Neural Network and Random Forest, depending on the purpose.
  • the protein expression level can be measured and compared using an antibody that specifically binds the protein.
  • the antibody and the protein of interest in the biological sample to form an antigen-antibody complex and to detect the I use it.
  • the term "antigen-antibody complex” refers to a combination of a protein antigen and an antibody that recognizes it to identify the presence or absence of the gene of interest in a biological sample.
  • the detection of the antigen-antibody complex can be detected using methods as known in the art, such as spectroscopic, photochemical, biochemical, immunochemical, electrical, absorbing, chemical and other methods.
  • the protein expression level measurement or comparative analysis methods include protein chip analysis, immunoassay, ligand binding assay, Matrix Assisted Laser Desorption / Ionization Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF) analysis, SELDI-TOF (Sulface Enhanced Laser Desorption / Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) analysis, radioimmunoassay, radioimmunoassay, oukteroni immunodiffusion, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, complement fixation assay, two-dimensional electrophoresis analysis, liquid phase chromatography-mass spectrometry, but snout (liquid chromatography-mass Spectrometry, LC- MS), LC- MS / MSGiquid chromatography- mass Spectrometry / mass Spectrometry), Western block 3 ⁇ 4 "and ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) are not limited to .
  • MALDI-TOF Matrix Assisted
  • the LC-MRM method was used to measure and compare the protein expression levels of ABAT and CHI3L1 itself.
  • the LC analysis column was passed through a concentration gradient of 5% to 85% with a solution of 95% acetonitrile and 0.1% formic acid for 50 minutes. Since the resolution of a specific substance may vary depending on the solution mixing ratio, a concentration gradient was performed, and the range was selected for an optimal range for simultaneously separating various proteins.
  • mass spectrometry MRM, the MS / MS mode, uses ions generated by struting once in the source portion of the mass spectrometer, whereas MRM selects a specific ion one more time from one broken ions, Once the sauce It is a method of using the ions obtained therein after further passing the layer stones.
  • the selected quantitative ion may interfere with the quantification when the selected quantitative ion is an ion that is also detected in plasma.
  • MRM even if ions with the same mass are broken once more, the molecular structure is different and tends to be differentiated. Can be obtained. Therefore, by using the MRM mode in the mass spectrometry it was possible to simultaneously analyze the desired materials with better analysis sensitivity.
  • the measurement or comparison of the mRNA expression level of the gene encoding the ABAT protein or the mRNA expression level of the gene encoding the CHI3L1 protein may be reverse transcriptase polymerase reaction, competitive reverse transcriptase polymerase reaction, real time reverse transcriptase. Polymerase reactions, RNase protection assays, northern blotting or DNA chips can be used, but are not limited thereto.
  • the present invention also provides a method for diagnosing pancreatic cancer by combining CA19-9 known as a pancreatic cancer marker in addition to the ABAT and CHI3L1 markers according to the present invention.
  • step (d) As a result of the comparison of step (c), the expression level of the ABAT protein or the mRNA expression level of the gene encoding the ABAT protein in the subject to diagnose pancreatic cancer is higher than the expression level in the normal control group, CA19 ⁇ 9 determining that the pancreatic cancer is more likely to develop if the expression level of the protein or the mRNA expression level of the gene encoding the CA19-9 protein is higher than the expression level in the normal control group. Furthermore, another embodiment of the diagnostic method comprises the following steps:
  • step (d) As a result of the comparison of step (c), the expression level of the ABAT protein or the mRNA expression level of the gene encoding the ABAT protein in the subject to be diagnosed with pancreatic cancer is higher than that in the normal control group, and the CHI3L1 protein Expression level of the gene encoding the CHI3L1 protein or the expression level of the CA19-9 protein or the mRNA expression level of the gene encoding the CA19-9 protein is lower than that of the normal control group. Expression Determining that pancreatic cancer is more likely if levels are higher.
  • the present invention to provide information for a method for diagnosing pancreatic cancer, the method comprising: (a) obtaining a sample from a subject to diagnose whether or not pancreatic cancer develops; (b) measuring the expression level of ABAT (4—aminobutyrate aminotransferase; GenBank Accession No: NP —001120920.1) protein or the mRNA expression level of a gene encoding ABAT protein from the sample; And (c) comparing the expression level of the ABAT protein or the mRNA expression level of the gene encoding the ABAT protein with the expression level in a normal control sample.
  • ABAT aminobutyrate aminotransferase
  • the present invention also provides a method for diagnosing pancreatic cancer, the method comprising: (a) obtaining a sample from a subject to diagnose whether pancreatic cancer develops; (b) measuring the expression levels of ABAT and CA19-9 proteins or the mRNA expression levels of genes encoding ABAT and CA19-9 proteins, respectively, from the sample; And (c) comparing the expression level of the ABAT and CA19-9 protein or the mRNA expression level of the gene encoding the ABAT and CA19-9 protein with the expression level in a normal control sample.
  • a detection method is provided.
  • the present invention also provides a method for diagnosing pancreatic cancer, the method comprising the steps of: (a) obtaining a sample from a subject to diagnose whether or not pancreatic cancer develops; (b) measuring the expression levels of ABAT and CHI3L1 proteins or the mRNA expression levels of genes encoding ABAT and CHI3L1 proteins, respectively, from the sample; And (c) comparing the expression levels of the ABAT and CHI3L1 proteins or the mRNA expression levels of the genes encoding the ABAT and CHI3L1 proteins with the expression levels in normal control samples.
  • the present invention provides a method for diagnosing pancreatic cancer, the method comprising the steps of: (a) obtaining a sample from a subject to diagnose whether or not pancreatic cancer develops; (b) expression levels of ABAT, CHI3L1 and CA19-9 proteins, or ABAT, CHI3L1, respectively, from the sample; Measuring the mRNA expression level of a gene encoding a CA19-9 protein; And (c) comparing the expression levels of the ABAT, CHI3L1 and CA19-9 proteins or the mRNA expression levels of genes encoding ABAT, CHI3L1 and CA19-9 proteins with the expression levels in normal control samples.
  • the present invention will be described in more detail with reference to Examples. However, the following examples are intended to illustrate the present invention, and the present invention is not limited by these examples.
  • Example 1 discovery and performance analysis of pancreatic cancer and low or low expression protein
  • pancreatic cancer patients As in 1, blood was collected from 50 pancreatic cancer patients, 10 malignant pancreatic mucus papillary tumor patients, 22 chronic cholecystitis patients and 25 normal controls. Among them, the normal control group and chronic cholecystitis samples were classified into normal group, and pancreatic cancer and malignant pancreatic mucous papillary tumor samples were classified into pancreatic cancer group.
  • each blood sample is passed through a MARS (Multiple Affinity Removal System) column (Agilent, USA)
  • the lyophilized peptide was dissolved in Solution A (98% distilled water, 2% acetonitrile, 0.1% formic acid), and 5 fmol of the internal standard beta-galactosidase peptide was added thereto, followed by MRM analysis. .
  • a peptide having a characteristic charge-to-mass ratio (m / z) of a specific protein was selected (Q1), and several fragment ionic buildups occurred when the peptide was electrically fragmented into layers. Fragment ions with characteristic m / z were selected (Q3).
  • This combination of Q1 and Q3 is a combination of ions specific to a particular protein, termed a transition, and is a quantitative information on the signal obtained by sequentially passing ions through this characteristic Q1 and Q3 in a triple-quadrupole mass spectrometer. In quantitative analysis was performed.
  • the ms / ms data is based on the peptide tandem mass spectra of the National Institute of Standards and Technology (NIST) library using an open software called SKYLine developed by MacCoss team at the University of Washington.
  • NIST National Institute of Standards and Technology
  • Peptides were selected from a minimum of 7 amino acids and a maximum of 24 amino acids.
  • peptides containing the following amino acids or having specific motifs are excluded because they are known to have poor signal values as follows:
  • ROS reactive in vivo
  • Missed cleavage may occur if proline is present after R or ⁇ that can be cut by trypsin in the peptide.
  • Precursor charges were selected for peptides with a + divalent charge, ionic charges with a + monovalent charge, and ionic type y-ion.
  • Unique transitions and peptides were selected using Protein Blast P and Skyline programs, and the final selected transitions were only those that were within the predicted retention time (RT) range. In order to predict the RT, 600 SIS peptide MRM analyzes were performed, and a calibration curve based on the hydrophobicity scale and the RT chromatogram was calculated.
  • the LC used a 1260-capillary LC from Agilent, and used a column of capillary RR 0.5 150 3.5 um for separation of peptides.
  • the sample was injected with 5, and the flow rate was set to 20 / min.
  • Peptides were eluted through a concentration gradient of 85% for 5 minutes, up to 85%.
  • the 6490-QQQ instrument was used to monitor the MRM mode for the transitions to the selected proteins. Each sample to compensate for deviations between batches. The spiked 5 fmol beta-galactosidase peptide ⁇ 0 ⁇ 1 ⁇ 151 ⁇ [ ( : 131 ⁇ 15], 547.3 / 646.4) was also monitored simultaneously.
  • the internal standard peptide beta-galactosidase peptide (GDFQFNISR [C13N15], 547.3 / 646.4 m / z) was converted to 0.09, 0.27, 0.82, 2.5, 7.4 '22.2, 66.7 and 200 fmol, respectively.
  • 10 ug of plasma was added to the matrix under the same conditions as the target peptide analysis, and the analysis was performed. Also included in the analysis was not included the internal standard peptide for the purpose of confirming the endogenous signal, and the standard curve was determined by quantitative MRM three times at all nine concentration points.
  • the individual MRM results were generated using the Skyline (MacCoss Lab, verl.4.1) to generate the Extraction Ion Chromatography (XIC) for the MRM transitions, calculating the peak area of each transition, and then recalculating them over time. Schematic accordingly.
  • the area of each XIC peak was normalized to the XIC peak area of the internal standard beta-galactosidase peptide (GDFQFNISR [C13N15], 547.3 / 646.4 m / z) and the relative quantitative analysis was performed for each protein with this value. .
  • SVM Small Vector Machine
  • SVM is an algorithm that estimates a function that satisfies a given condition based on the Lagrangian optimization theory, which uses a classification analysis method that uses the maximum margin classifier. The case is called Support Vector Classification (SVC).
  • SVC Support Vector Classification
  • pancreatic cancer diagnostic function was constructed using SVC that maximizes the difference between two groups (normal and cancer patients):
  • a value of 1 is determined to be pancreatic cancer, and a value of -1 is normal.
  • pancreatic cancer diagnostic function the performance of ABAT as a pancreatic cancer diagnostic marker is represented by AUC on the ROC graph.
  • the R0C graph represents the relationship between sensitivity and specificity on a two-dimensional plane. The larger the area under the R0C graph (AUC; 0 ⁇ AUC ⁇ 1), the more accurate it is. .
  • the ABAT according to the present invention was found to have a very good performance as a diagnostic marker for pancreatic cancer with an AUC of 0.838 (FIG. 2).
  • the AUC of the commercial pancreatic cancer marker CA19-9 is 0.825 (FIG. 3)
  • the ABAT of the present invention was confirmed to have better pancreatic cancer diagnosis performance than that of CA19-9 (FIG. 4).
  • Example 2 Identification and Performance Analysis of Pancreatic Cancer and / or Low Expression Proteins
  • MRM quantitative analysis was performed after performing steps (1) to (4).
  • FIG. Compared with the normal group, the pancreatic cancer patients were specifically reduced, and CHI3L1 was selected as a diagnostic marker for pancreatic cancer.
  • SVM Small Vector Machine
  • SVM is an algorithm that estimates a function that satisfies a given condition based on Lagrangi an opt imizat ion theory, which uses a classification analysis method using the maximum margin classi bomb. The case is called Support Vector Class ifi cat ion (SVC).
  • SVC Support Vector Class ifi cat ion
  • pancreatic cancer diagnostic function was constructed using SVC that maximizes the difference between two groups (normal and cancer patients):
  • a value of 1 is determined to be pancreatic cancer, and a value of -1 is normal.
  • the function was used to determine pancreatic cancer.
  • the performance as a pancreatic cancer diagnostic marker of the combination of ABAT and CHI3L1 is represented by AUC of the R0C graph.
  • the R0C graph is a representation of the relationship between sensitivity (sensi t ivi ty) and specificity (speci f ici ty) on a two-dimensional plane. The area under the R0C graph (AUC; 0 ⁇ AUC ⁇ 1) increases You can judge that it is correct.
  • the combination of ABAT and CHI3L1 according to the present invention was shown to have a very good performance as a pancreatic cancer diagnostic marker with an AUC of 0.956 (FIG. 8).
  • AUC of commercial pancreatic cancer marker CA19 ′ 9 is 0.825 (FIG. 3)
  • the combination of ABAT and CHI3L1 of the present invention was confirmed to have better pancreatic cancer diagnosis performance than CA19-9 (FIG. 9).
  • the AUC is 0.984 (Fig. 10), which is much better than the combination of ABAT and CHI3L1 or CA19-9 alone ( 11).

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Abstract

본 발명은 췌장암의 발병 가능성 여부의 판단을 위해 사용될 수 있는, 단백질 또는 이의 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 췌장암 진단용 조성물, 키트, 이를 사용한 췌장암 진단방법에 관한 것으로서, 본 발명은 췌장암의 진단 마커를 제공함으로써, 췌장암의 발병 가능성, 조기 진단 및 질병 정도를 유의적으로 예측 또는 파악할 수 있으며, 췌장암의 종양형성 연구에 활용될 수 있다. 또한, 본 발명의 진단방법은 비침습적으로 혈액 등으로부터 간단하게 췌장암을 조기 진단할 수 있다.

Description

명세서
췌장암진단용조성물및 이를 이용한췌장암진단방법 발명의 분야 본 발명은 췌장암의 발병 또는 발병 가능성의 판단에 사용될 수 있는， 특정 단백질의 발현 수준 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 췌장암 진단용 조성물과 키트， 및 이를 이용한 췌장암 진단방법에 관한 것이다. 발명의 배경 현대인의 주요 질환 증에서， 암의 치료방법과 진단방법에 관한 연구는 발병빈도가 높은 폐암， 간암， 위암 등을 중심으로 비교적 활발히 진행되고 있다. 그러나， 발병빈도가 낮은 식도암, 대장암， 췌장암 등에 대한 연구는 상대적으로 저조한 실정이다. 특히 췌장암은 초기에는 별로 증세를 느끼지 못하다가， 이미 전신전이가 일어난 후에 통증과 체중감소 등의 증세가 나타나는 것이 보통이어서， 치유율이 상당히 낮은 편이므로 정기적인 진단이 매우 중요하다. 임상 증세는 대부분이 서서히 발병하고， 식욕감퇴를 동반하여 허약해지기 쉬우며， 체중감소를 나타낸다. 췌장암은 5년 생존율이 1-4%에 불과할 정도로 치명적인 암으로서 인체의 암 중에서 가장 불량한 예후를 보이므로, 그 어떤 인체 암보다도 조기 진단법 개발이 절실히 요망되고 있다. 현재까지 췌장암에 효과가 있다고 알려진 5-플루오로유라실， 젬시타빈 (gemcitabine), 타르세바 (tarceva)를 포함한 몇 가지 항암제의 치료 효과는 지극히 저조하며, 항암치료에 대한 반응을은 15% 내외에 불과하고 이러한 사실은 췌장암 환자의 예후를 향상시키기 위해서는 보다 효과적인 조기 진단법 및 치료법의 개발이 절실히 요구되고 있음을 시사한다. 췌장암의 진단은 혈액검사 (CA19-9), 위， 십이지장의 X선 조영검사， 피부 및 간을 통한 담도촬영 (膽道撮影)과 역행성 내시경 담도촬영술 등에 의해 시행되어 왔으나， 최근에 초음파촬영 및 전산화 단층촬영이 가장 많이 사용되고 있다. 이들 방법에 의해 질병의 병변이 발견되는 경우， 보다 정밀한 조직검사를 수행하여 비교적 정확한 검사결과를 얻을 수도 있으나， 상기의 진단방법은 정확도가 떨어지거나， 환자에게 고통이 따르는 등 그 수행방법이 매우 불편하여 피검자들이 이를 꺼려하는 실정이다. 따라서, 간편하고 신속하게 췌장암 여부를 진단할 수 있는 검사방법의 개발이 요구되어 왔다.
이와 관련하여， 대한민국 특허 제 10-0819122호는 마트릴린 (matrilin), 트랜스티레틴 (transthyretin) 및 스트라티핀 (stratifin)을 췌장암 마커로 이용한 기술을 개시하고 있으며, 대한민국 출원공개 제 2012-0082372호는 여러 가지 췌장암 마커를 이용한 기술을 개시하고 있다. 또한， 한국 출원공개 제 2009-0003308호는 개체의 혈액 시료에서 REG4 단백질의 발현량을 검출하여 췌장암을 진단하는 방법을 개시하고 있으며, 한국 출원공개 제 2012-0009781호는 개체의 췌장암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 개체로부터 분리한 암 조직 중 XIST RNA의 발현량을 측정하는 분석방법을， 한국 출원공개 제 200그 0119250호는 정상 인간의 췌장 조직과 비교하여 인간 췌장암 조직에서 다르게 발현된 신규 유전자 LBFL313 패밀리를 개시하고 있고， 미국 출원공개 제 2011/0294136호는 케라틴 8 단백질 등의 바이오 마커들을 이용한 췌장암 진단방법을 개시하고 있다. 하지만， 마커마다 그 진단 효율 및 정확성에서 큰 차이를 나타내므로, 효과가 더 우수한 마커를 발굴할 필요가 있다. 본 발명자들은 췌장암의 조기 진단에 유용한 마커를 개발하기 위해 예의 노력한 결과， 췌장암에서 특이적으로 증가 또는 감소하는 단백질을 발굴하고， 이를 이용하여 췌장암을 손쉽게 진단할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다. 발명의 요약
따라서， 본 발명의 목적은 췌장암의 발병 가능성을 간편하게 조기 진단할 수 있는 신규 췌장암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 췌장암 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 췌장암 진단용 조성물 또는 키트를 이용하여 췌장암을 진단하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 ABAT(4-aminobutyrate aminotransferase; GenBank Accession No: NP_001120920.1) 단백질의 발현 수준 또는 ABAT 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 췌장암 진단용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 ABAT 단백질의 발현 수준 또는 ABAT 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준， 및 CHI3Ll(Chitinase-3-like protein 1 precursor; GenBank Accession No: NP_001267.2) 단백질의 발현 수준 또는 CHI3L1 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 췌장암 진단용 조성물을 제공한다.
상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 췌장암 진단용 키트를 제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 췌장암 발병 여부를 진단하고자 하는 대상으로부터 시료를 얻는 단계; (b) 상기 시료로부터 ABAT(4-aminobutyrate aminotransferase; GenBank Accession No: NP— 001120920.1) 단백질의 발현 수준 또는 ABAT 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계; (c) 상기 ABAT 단백질의 발현 수준 또는 상기 ABAT 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 정상 대조군 시료에서의 발현 수준과 비교하는 단계; 및 (d) 상기 단계 (c)의 비교 결과 췌장암 발병 여부를 진단하고자 하는 대상에서의 ABAT 단백질의 발현 수준 또는 ABAT 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준이 정상 대조군에서의 발현 수준보다 높은 경우 췌장암 발병 가능성이 높다고 판정하는 단계를 포함하는, 췌장암의 진단방법을 제공한다.
또한， 본 발명은 (a) 췌장암 발병 여부를 진단하 i자 하는 대상으로부터 시료를 얻는 단계; (b) 상기 시료로부터 ABAT 단백질의 발현 수준 또는 ABAT 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준， 및 CHI3Ll(Chi t inase-3-l ike protein 1 precursor ; GenBank Accession No : NP_001267.2) 단백질의 발현 수준 또는 CHI3L1 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계; (c) 상기 ABAT 단백질의 발현 수준 또는 ABAT 단백질올 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준, 및 상기 CHI3L1 단백질의 발현 수준 또는 CHI3L1 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 정상 대조군 시료에서의 발현 수준과 비교하는 단계; 및 (d) 상기 단계 (c)의 비교 결과， 췌장암 발병 여부를 진단하고자 하는 대상에서의 ABAT 단백질의 발현 수준 또는 ABAT 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준이 정상 대조순에서의 발현 수준보다 높고， CHI3L1 단백질의 발현 수준 또는 CHI3L1 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준이 정상 대조군에서의 발현 수준보다 낮은 경우 췌장암 발병 가능성이 높다고 판정하는 단계를 포함하는， 췌장암의 진단방법을 제공한다.
본 발명은 췌장암의 진단 마커를 제공함으로써， 췌장암의 발병 가능성， 조기 진단 및 질병 정도를 유의적으로 예측 또는 파악할 수 있으며, 췌장암의 종양형성 연구에 활용될 수 있다. 또한, 본 발명의 진단방법은 비침습적으로 혈액 등으로부터 간단하게 췌장암을 조기 진단할 수 있다. 도면의 간단한설명 도 1은 MRM 정량 분석에 의한 대조군 및 췌장암 환자군에서의 ABAT의 상대 농도를 나타낸 그래프이다. 도 2는 ABAT의 췌장암 진단 성능 (AUC)을 나타낸 ROC(Receiver Operating Characteristic) 그래프이다.
도 3은 기존의 췌장암 혈액 마커로 알려진 CA19-9의 췌장암 진단 성능 (AUC)을 나타낸 ROC 그래프이다.
도 4는 ABAT와 CA19—9의 췌장암 진단 성능 (AUC)을 비교한 ROC 그래프이다.
도 5는 ABAT와 CA19-9를 동시에 사용했을 때의 췌장암 진단 성능 (AUC)을 나타낸 ROC 그래프이다.
도 6은 ABAT와 CA19-9를 동시에 사용했을 때의 췌장암 진단 성능 (AUC)과 ABAT 흑은 CA19-9를 각각 사용했을 때의 췌장암 진단 성능을 비교한 ROC 그래프이다.
도 7은 MRM 정량 분석에 의한 대조군 및 췌장암 환자군에서의 CHI3L1의 상대 농도를 나타낸 그래프이다.
도 8은 ABAT 및 CHI3L1의 조합의 췌장암 진단 성능 (AUC)을 나타낸 ROCCReceiver Operat ing Character i st i c) 그래프이다.
도 9는 ABAT 및 CHI3L1의 조합과 CA19-9의 췌장암 진단 성능 (AUC)을 비교한 R0C 그래프이다.
도 10은 ABAT 및 CHI3L1의 조합과 CA19-9를 동시에 사용했을 때의 췌장암 진단 성능 (AUC)을 나타낸 R0C 그래프이다.
도 11은 ABAT 및 CHI3L1의 조합과 CA19-9를 동시에 사용했을 때의 췌장암 진단 성능 (AUC)과 ABAT 및 CHI3L1의 조합 혹은 CA19-9를 각각 사용했을 때의 췌장암 진단 성능을 비교한 R0C 그래프이다. 발명의 상세한설명 이하 본 발명에 사용된 용어를 정의한다. 본 발명에서 사용된 용어 "진단 "은 특정 질병 또는 질환에 대한 대상 (subject)의 감수성 (susceptibility)을 판정하는 것， 대상이 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것， 특정 질병 또는 질환에 걸린 대상의 예후 (prognosis) (예컨대， 전-전이성 또는 전이성 암 상태의 동정， 암의 단계 결정 또는 치료에 대한 암의 반응성 결정)를 판정하는 것， 또는 테라메트릭스 (therametrics) (예컨대， 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링하는 것)을 포함한다. 본 발명의 목적상， 진단은 췌장암 발병 여부 또는 발병 가능성 (위험성)을 확인하는 것이다.
본 발명에서 용어 "췌장암 (pancreatic cancer)"이란 췌장 세포에서 기원하는 암을 의미한다. 췌장암에는 여러 가지 종류가 있는데 췌관세포에서 발생한 췌관 선암종이 90% 정도를 차지하고 있어 일반적으로 췌장암이라고 하면 췌관 선암종을 의미한다. 그 외에 낭종성암 (낭선암)， 내분비종양 등이 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "마커"， "바이오 마커" 또는 "진단용 마커' '란 정상이나 병적인 상태를 구분할 수 있거나 치료반응을 예측할 수 있고 객관적으로 측정할 수 있는 표지자를 의미한다. 특히， 본 발명에서 췌장암과 관련해서는， 정상 대조군 (췌장암이 아닌 개체)에 비해 췌장암을 갖거나 췌장암 발병 가능성 (위험성)이 있는 개체에서 단백질 발현 수준 또는 유전자 발현 수준이 유의적으로 증가하거나 감소하는 양상을 보이는， 폴리펩타이드 또는 핵산 (예: mRNA 등)， 지질， 당지질, 당단백질， 당 (단당류， 이당류， 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 의미한다.
본 발명은 ABAT(4-aminobutyrate aminotransferase; GenBank Accession No: NP_001120920.1) 단백질의 발현 수준 또는 ABAT 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 췌장암 진단용 조성물을 제공한다. 본 발명은 ABAT를 췌장암 진단용 마커로서 활용함으로써 대상으로부터 췌장암의 발병 여부 또는 발병 가능성 여부를 효과적으로 진단하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 췌장암 진단용 마커로서 사용되는 ABAT(4-aminobutyrate aminotransferase)는 GABA 트랜스아미나아제 또는 4ᅳ아미노부티레이트 트랜스아미나아제라고도 불리며， 중추신경계에서 중요한 억제성 신경전달물질인 감마-아미노부티르산 (GABA)을 석시닉 세미알데하이드로 분해시키는데 관여하는 효소이다. 상기 활성 효소는 피리독살 -5-포스페이트와 복합된 50 kD 서브유닛의 호모다이머 (homodimer)이다. ABAT의 결핍은 정신 지체， 근력 저하， 과다 반사， 무기력, 고질적 발작 및 뇌파 이상을 보인다. 하지만， ABAT가 췌장암 진단을 위한 바이오마커로 사용될 수 있음을 개시한 종래 기술은 전혀 알려진 바 없다.
본 발명자들은 ABAT를 췌장암 진단용 마커로 사용함으로써 개체로부터 췌장암의 발병 또는 그 가능성에 대해 민감도 및 신뢰도가 높은 결과를 얻을 수 있음을 확인하였다. 구체적으로， 본 발명자들은 췌장암 환자， 췌관내 점액성 유두종양 (Intraductal papillary mucinous neoplasm, IPMN) 환자 및 만성 담낭염 (chronic cholecystitis) 환자 개체의 혈장 시료를 분석하여 췌장암에서 과발현되는 바이오마커로서 ABAT를 발굴하였고， 정상 대조군 (췌장암이 아닌 개체)의 혈장 시료를 분석하여 상기 발굴한 바이오마커의 유효성을 확립하였다. 또한， 본 발명은 ABAT 단백질의 발현 수준 또는 ABAT 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준, 및 CHI3Ll(Chi t inase-3-l ike protein 1 precursor ; GenBank Accessi on No : NP_001267.2) 단백질의 발현 수준 또는 CHI3L1 단백질을 암호화하는 유전자 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 췌장암 진단용 조성물을 제공한다. 본 발명은 ABAT 및 CHI3L1의 조합을 췌장암 진단용 마커로서 활용함으로써 대상으로부터 췌장암의 발병 여부 또는 발병 가능성 여부를 효과적으로 진단하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 췌장암 진단용 마커로서 사용되는 ABAT는 전술한 바와 같으며， 본 발명에서 또 다른 췌장암 진단용 마커로서 사용되는 CHI3Ll(Chi t inase-3-1 ike protein 1 precursor； GenBank Accessi on No : NP_001267.2)은 연골 당단백 39(Cart i lage glycoprotein 39)로도 알려져 있으며， 글라이코실 하이드를라아제 (glycosyl hydrolase) 18 패밀리에 속한다. CHI3L1은 세포 밖으로 배출되는 당단백의 일종으로 유방암， 대장암， 전립선암， 난소암， 감상선암， 폐암， 간암 등의 암세포에서 그 발현이 증가되는 것으로 알려져 있다. 하지만， 상기 ABAT 및 CHI3L1의 조합이 췌장암 진단을 위한 바이오마커로 사용될 수 있음을 개시한 종래 기술은 전혀 알려진 바 없다.
본 발명자들은 ABAT 및 CHI3L1의 조합을 췌장암 진단용 마커로 사용함으로써 개체로부터 췌장암의 발병 또는 그 가능성에 대해 민감도 및 신뢰도가 높은 결과를 얻을 수 있음을 확인하였다. 구체적으로， 본 발명자들은 췌장암 환자， 췌관내 점액성 유두종양 (Intraductal papillary mucinous neoplasm, IPMN) 환자 및 만성 담낭염 (chronic cholecystitis) 환자 개체의 혈장 시료를 분석하여 췌장암에서 과발현되는 바이오마커로서 ABAT와 저발현되는 바이오마커로서 CHI3L1을 발굴하였고， 정상 대조군 (췌장암이 아닌 개체)의 혈장 시료를 분석하여 상기 발굴한 바이오마커의 조합의 유효성을 확립하였다. 본 발명에 사용된 용어， "단백질의 발현 수준 측정"이란 췌장암을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 췌장암 진단용 마커 (단백질) 또는 이를 암호화하는 유전자의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정을 의미한다. 상기 단백질의 발현 수준 측정 또는 비교 분석 방법으로는 단.백질 칩 분석, 면역측정법， 리간드 바인딩 어세이， MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석， SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석， 방사선 면역분석， 방사 면역 확산법， 오우크테로니 면역 확산법， 로케트 면역전기영동， 조직면역 염색, 보체 고정 분석법， 2차원 전기영동 분석， 액상 크로마토그래피―질량분석 (liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블¾ "팅 및 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay) 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 췌장암 진단용 조성물에서， ABAT 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제， 또는 CHI3L1 단백질의 할현 수준을 측정하는 제제는 ABAT 단백질 또는 CHI3L1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체， 을리고펩타이드， 리간드， PNA(peptide nucleic acid) 또는 앱타머 (aptamer)를 포함할 수 있다. 본 발명에 사용된 용어 "항체''는 항원과 특이적으로 결합하여 항원 -항체 반응을 일으키는 물질을 가리킨다. 본 발명의 목적상， 항체는 ABAT 또는 CHI3L1의 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미한다. 본 발명의 항체는 다클론 항체， 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 상기 항체는 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조될 수 있다. 또한， 본 발명의 항체는 2개의 전장의 경쇄 및 2개의 전장의 중쇄를 갖는 완전한 형태뿐만 아니라， 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란， 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며， Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다.
본 발명에 사용된 용어 "PNA(Peptide Nucleic Acid)"는 인공적으로 합성된， DNA 또^ RNA와 비슷한 중합체를 가리키며， 1991년 덴마크 코펜하겐 대학교의 Nielsen, Egholm, Berg와 Buchardt 교수에 의해 처음으로 소개되었다. DNA는 인산-리보스당 골격을 갖는데 반해， PNA는 펩타이드 결합에 의해 연결된 반복된 N-(2-아미노에틸) -글리신 골격을 가지며， 이로 인해 DNA 또는 RNA에 대한 결합력과 안정성이 크게 증가되어 분자 생물학， 진단 분석 및 안티센스 치료법에 사용되고 있다. PNA는 문헌 [Nielsen PE, Egholm M, Berg RH, Buchardt 0 (December 1991). "Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymineᅳ substituted polyamide". Science 254 (5037): 1497- 1500]에 상세하게 개시되어 있다. 본 발명에서 "앱타머 "는 올리고핵산 또는 펩타이드 분자이며， 앱타머의 일반적인 내용은 문헌 [Bock LC et al, Nature 355(6360)：5646(1992)； Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med. 78(8)：42630(2000)； Cohen BA, Colas P, Brent R. "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA. 95(24): 142727(1998) ]에 상세하게 개시되어 있다. 본 발명에 사용된 용어 "mRNA의 발현 수준 측정"이란 췌장암을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 췌장암 진단용 단백질을 암호화하는 유전자들의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA의 양을 측정하는 것을 의미한다. 이를 위한 분석 방법으로는 역전사 중합효소반웅 (RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응 (Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반웅 (Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법 (RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅 (Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 췌장암 진단용 조성물에서， ABAT또는 CHI3L1 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는 ABAT 또는 CHI3L1 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명에 따른 ABAT 단백질 또는 CHI3L1 단백질의 정보는 UniProt 등에 알려져 있으므로, 당업자라면 이를 바탕으로 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머， 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 용이하게 디자인할 수 있을 것이다. 본 발명에서 사용된 용어 "프라이머"는 표적 유전자 서열을 인지하는 단편으로서， 정방향 및 역방향의 프라이머 쌍을 포함하나, 바람직하게는， 특이성 및 민감성을 가지는 분석 결과를 제공하는 프라이머 쌍이다.
본 발명에서 사용된 용어 "프로브"란 시료 내의 검출하고자 하는 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하며， 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 표적 물질의 존재를 확인할 수 있는 물질을 의미한다. 프로브의 종류는 당업계에서 통상적으로 사용되는 물질로서 제한은 없으나， 바람직하게는 PNA (卿 tide nucleic acid), LNAClocked nucleic acid), 펩타이드， 폴리펩타이드， 단백질， RNA 또는 DNA 일 수 있으며, 가장 바람직하게는 PNA이다.
본 발명에서 사용된 용어 "안티센스"는 안티센스 올리고머가 왓슨 -크릭 염기쌍 형성에 의해 RNA 내의 표적 서열과 흔성화되어， 표적서열 내에서 전형적으로 mRNA와 RNA:올리고머 헤테로이중체의 형성을 허용하는， 뉴클레오티드 염기의 서열 및 서브유닛간 백본을 갖는 올리고머를 의미한다. 을리고머는 표적 서열에 대한 정확한 서열 상보성 또는 근사 상보성을 가질 수 있다. 일 실시양태에서， 본 발명에 따른 췌장암 진단용 조성물은 CA19-9 (Carbohydrate Antigen 19-9) 단백질의 발현 수준 또는 CA19—9 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함할 수 있다. 즉， 본 발명에 따른 췌장암 진단용 조성물은 ABAT 및 CA19-9 단백질의 발현 수준 또는 ABAT 및 CA19-9 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함한다. 또한， 본 발명에 따른 췌장암 진단용 조성물은 ABAT, CHI3Ll(Chitinase-3ᅳ like protein 1 precursor; GenBank Accession No: NP_001267.2) 및 CA19-9 단백질의 발현 수준 또는 ABAT, CHI3L1 및 CA19-9 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함한다. 상기 CA19-9 단백질은 종래 췌장암 마커로서 문헌 [ [Safi F. et al., "Diagnostic importance of the tumor marker CA 19-9 in pancreatic cancer", Dtsch Med Wochenschr 109(49): 1869— 73(1984); Wang FM et. al., "The significance of CA19-9 tumor antigen in the serum of patients with carcinomas". Proc Natl Sci Counc Repub China B, Apr 9(2): 119— 25(1985) ]에 공지되어 있다. 본 발명의 조성물은 2종의 마커, 즉 ABAT 및 CA19-9의 측정값을 조합함으로써, 또는 3종의 마커， 즉 ABAT, CHI3L1 및 CA19ᅳ 9의 측정값을 조합함으로써 보다 효과적이고 보다 정확한 췌장암의 진단을 가능하게 한다. 또한， 본 발명은 상기 췌장암 진단용 조성물을 포함하는 췌장암 진단용 키트를 제공한다. 바람직하게, 상기 키트는 RT-PCR 키트， DNA 칩 키트, ELISA 키트， 단백질 칩 키트， 래피드 (rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트일 수 있다.
상기 췌장암 진단용 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함할 수 있다. 바람직하게， 상기 진단용 키트는 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 더 포함할 수 있다. 역전사 증합효소반웅 키트는 마커 단백질을 암호화하는 유전자에 대해 특이적인 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 상기 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오타이드로서, 약 7 bp 내지 50 bp의 길이， 보다 바람직하게는 약 10 bp 내지 30 bp의 길이를 가질 수 있다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그 외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 용기, 반응 완층액 (pH 및 마그네슘 농도는 다양)， 데옥시뉴클레오타이드 (dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소， DNase, RNase 억제제 DEPC-수 (DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
또한， 본 발명의 진단용 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드 (oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표지 프로브를 제작하기 위한 시약， 제제， 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
또한， 본 발명의 진단용 키트는 ELISA 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. ELISA 키트는 상기 단백질에 대해 특이적인 항체를 포함한다ᅳ 항체는 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반웅성이 거의 없는 항체로， 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약， 예를 들면, 표지된 2차 항체， 발색단 (chromophores), 효소 (예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다. 나아가， 본 발명은 췌장암을 진단하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 췌장암 진단 방법의 일 실시양태는 하기의 단계를 포함한다:
(a) 췌장암 발병 여부를 진단하고자 하는 대상으로부터 시료를 얻는 단계;
(b) 상기 시료로부터 ABAT(4— aminobutyrate aminotransferase; GenBank Accession No: NP_001120920.1) 단백질의 발현 수준 또는 ABAT 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계;
(c) 상기 ABAT 단백질의 발현 수준 또는 상기 ABAT 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 정상 대조군 시료에서의 발현 수준과 비교하는 단계; 및
(d) 상기 단계 (c)의 비교 결과， 췌장암 발병 여부를 진단하고자 하는 대상에서의 ABAT 단백질의 발현 수준 또는 ABAT 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준이 정상 대조군에서의 발현 수준보다 높은 경우 췌장암 발병 가능성이 높다고 판정하는 단계. 본 발명의 또 다른 실시양태에 따른 진단방법은 하기의 단계를 포함한다:
(a) 췌장암 발병 여부를 진단하고자 하는 대상으로부터 시료를 얻는 단계;
(b) 상기 시료로부터 각각 ABAT 및 CHI3L1 단백질의 발현 수준 또는 ABAT 및 CHI3L1 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계;
(c) 상기 ABAT 및 CHI3L1 단백질의 발현 수준 또는 ABAT 및 CHI3L1 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 정상 대조군 시료에서의 발현 수준과 비교하는 단계 ; 및
(d) 상기 단계 (c)의 비교 결과, 췌장암 발병 여부를 진단하고자 하는 대상에서의 ABAT 단백질의 발현 수준 또는 ABAT 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준이 정상 대조군에서의 발현 수준보다 높고, CHI3L1 단백질의 발현 수준 또는 CHI3L1 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준이 정상 대조군에서의 발현 수준보다 낮은 경우 췌장암 발병 가능성이 높다고 관정하는 단계.
상기 방법에서 "시료 "란 생물학적 시료 (biological sample)로서 췌장암 발병에 의해 단백질 발현 수준 또는 유전자 발현 수준이 차이가 나는 조직， 세포， 혈액， 혈청， 혈장， 타액， 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 의미하며, 바람직하게는 혈액， 혈청 또는 혈장을 의미한다.
상기 ABAT 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA는 췌장암 환자에서의 발현 수준이 정상 대조군에서의 발현 수준과 비교하여 증가하는 특징을 가지므로， 췌장암 발병 여부를 진단하고자 하는 대상에서의 ABAT 단백질의 발현 수준 또는 ABAT 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준이 정상 대조군에서의 상기 단백질 또는 유전자의 발현 수준보다 높으면 췌장암 발병 가능성이 높다고 판정할 수 있다.
또한， 상기 ABAT 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA는 췌장암 환자에서의 발현 수준이 정상 대조군에서의 발현 수준과 비교하여 증가하는 특징을 가지고， CHI3L1 단백질 또는 CHI3L1 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA는 췌장암 환자에서의 발현 수준이 정상 대조군에서의 발현 수준과 비교하여 감소하는 특징을 가지므로， 췌장암 발병 여부를 진단하고자 하는 대상에서의 ABAT 단백질의 발현 수준 또는 ABAT 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준이 정상 대조군에서의 상기 단백질 또는 유전자의 발현 수준보다 높고 동시에 CHI3L1 단백질의 발현 수준 또는 CHI3L1 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준이 정상 대조군에서의 상기 단백질 또는 유전자의 발현 수준보다 낮으면 췌장암 발병 가능성이 높다고 판정할 수 있다.
상기 '췌장암 발병 여부를 진단하고자 하는 대상에서의 ABAT 단백질의 발현 수준 또는 ABAT 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준이 정상 대조군에서의 발현 수준보다 높다'는 것은 다양한 방법에 의해 측정될 때 췌장암 발병 여부를 진단하고자 하는 대상에서의 ABAT 단백질의 발현 수준 또는 ABAT 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준이 정상 대조군에서의 발현 수준보다 1.0배를 초과， 1.5배를 초과， 2배를 초과， 3배를 초과, 5배를 초과 또는 10배를 초과하는 것을 의미한다.
또한， 상기 '췌장암 발병 여부를 진단하고자 하는 대상에서의 CHI3L1 단백질의 발현 수준 또는 CHI3L1 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준이 정상 대조군에서의 발현 수준보다 낮다'는 것은 다양한 방법에 의해 측정될 때 췌장암 발병 여부를 진단하고자 하는 대상에서의 CHI3L1 단백질의 발현 수준 또는 CHI3L1 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준이 정상 대조군에서의 발현 수준보다 1.0배 미만, 1.5배 미만， 2배 미만， 3배 미만， 5배 미만 또는 10배 미만인 것을 의미한다.
하나의 구현예에서, 상기 '췌장암 발병 가능성이 높다고 판정하는 것'은 췌장암 진단 함수를 이용하여 수행될 수 있다. 상기 췌장암 진단 함수의 예로는 하기 함수식 1을 들 수 있다:
〈함수식 1> f(x) aili <비 > +b)
Figure imgf000018_0001
상기 식에서， 는 ABAT 또는 ABAT와 CHI3L1의 신규 측정값을， !:는 SVM에서의 라그랑주 승수를， ^^는 정상군 /췌장암군의 구분자를， ^는 기준 측정값을， 그리고 는 보정치를 의미한다.
상기 함수는 SVM(Support Vector Machine)으로부터 도출된다. SVM은 라그랑주 최적화 이론 (Lagrangian optimization theory)에 기반하여 주어진 조건을 만족하는 함수를 추 하는 알고리즘으로, 이 중에서 최대 마진 분류자 (Maximum margin classifier)를 사용하는 분류분석 방법을 적용하는 경우를 서포트 백터 분류 (Support Vector Classification, SVC)라 한다. 상기 함수에 ABAT 또는 ABAT와 CHI3L1의 MRM(Multiple reaction monitoring)으로 정량을 실시하였다. SIM(Selected Ion Monitoring) 상대 측정값을 대입하였을 때， 함수 값이 1이면 췌장암 발병 가능성이 높은 것으로 진단하고， 함수 값이 - 1이면 정상으로 진단한다.
본 발명의 방법은 췌장암 발병 가능성을 ABAT 단백질 또는 이의 mRNA의 발현 수치, 또는 ABAT와 CHI3L1 단백질 또는 이의 mRNA의 발현 수치를 췌장암 진단 함수에 대입하여 그 결과로 췌장암 발병 가능성을 즉각적으로 판정할 수 있는바， 의사의 임상학적 판단이 필요하지 않다.
본 연구에서는 진단 함수를 SVM으로 구축하였으나, 이는 용도에 따라 Neural Network, Random Forest 등의 여러 기계학습법 (Machine Learning)을 비롯한 여러 종류의 판별함수 구축법 (Discriminant Analysis)으로 구현될 수 있다. 본 발명의 방법에서, 상기 단백질 발현 수준은 해당 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 측정 및 비교할 수 있다. 상기 항체와 생물학적 시료 내의 해당 단백질이 항원 -항체 복합체를 형성하도록 하고, 이를 검출하는 방법을 이용한다.
본 발명에서 사용된 용어 "항원ᅳ항체 복합체"는 생물학적 시료 중의 해당 유전자의 존재 또는 부존재를 확인하기 위한 단백질 항원과 이를 인지하는 항체의 결합물을 의미한다. 상기 항원 -항체 복합체의 검출은 당업계에 공지된 바와 같은 방법， 예를 들어 분광학적， 광화학적， 생물화학적， 면역화학적， 전기적， 흡광적, 화학적 및 기타 방법을 이용하여 검출할 수 있다.
본 발명의 목적상， 상기 단백질 발현 수준 측정 또는 비교 분석 방법으로는 단백질 칩 분석， 면역측정법， 리간드 바인딩 어세이， MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석， SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석， 방사선 면역분석， 방사 면역 확산법， 오우크테로니 면역 확산법， 로케트 면역전기영동， 조직면역 염색， 보체 고정 분석법， 2차원 전기영동 분석， 액상 크로마토그래피-질량분석 (liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC— MS), LC— MS/MSGiquid chromatography— Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블¾" 및 ELISA(enzyme linked immunosorbent assay) 둥이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 구체적인 실시예에서， ABAT 및 CHI3L1의 단백질 발현 수준 자체를 측정 및 비교하기 위해서， LC-MRM 방법을 사용하였다.
구체적으로 생물학적 시료 중의 단백질을 부피 % 기준으로 5% 증류수，
95% 아세토니트릴 및 0.1% 포름산의 용액으로 50분간 5%에서 85%까지 농도구배를 하면서 LC 분석 컬럼을 통과시켰다. 용액 흔합 비율에 따라 특정 물질에 대한 분해능이 달라질 수 있기 때문에 농도 구배를 실시하였고， 상기 범위는 다양한 단백질들을 동시에 분리하기 위한 최적 범위를 선정한 것이다. 질량 분석에서는 MS/MS 모드인 MRM이 질량분석기의 소스 부분에서 한 번 층돌하여 생긴 이온을 이용하는 방법인 반면， MRM은 한 번 깨진 이온 중에서 특정 이온을 한 번 더 선택하여 연속적으로 연결된 또 다른 MS의 소스를 한 번 더 통과시켜 층돌시킨 후 이 중에서 얻은 이온들을 이용하는 방법이다.
SIM에서는 선택한 정량이온이 혈장에서도 검출되는 이온인 경우에 정량에 방해가 될 수 있다는 문제점이 있다. 반면， MRM을 이용하는 경우, 같은 질량을 가진 이온이라도 한 번 더 깨지면 분자구조가 달라지면서 차별화된 경향을 나타내므로， 이를 정량이온으로 사용하게 되면 백그라운드에서 방해되는 피크가 제거되어 한 층 더 깨끗한 베이스 라인을 얻을 수 있다. 따라서， 질량 분석 시에 MRM 모드를 사용함으로써 보다 우수한 분석 감도에서 원하는 물질들을 동시에 분석할 수 있었다.
상기 분석 방법들을 통하여， 정상 대조군 에서의 단백질 발현 수준과 췌장암 개체에서의 단백질 발현 수준을 비교할 수 있고， 췌장암 마커 유전자에서 단백질로의 유의한 발현량 증감여부를 판단하여， 췌장암 발병 가능성 여부를 진단할 수 있다. 또한， 본 발명의 방법에서, ABAT 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 CHI3L1 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준의 측정 또는 비교는 역전사효소 중합효소반응， 경쟁적 역전사효소 중합효소반웅， 실시간 역전사효소 중합효소반응， RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 또는 DNA 칩 등을 사용할 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 측정 방법들을 통하여 정상 대조군 에서의 mRNA 발현량과 췌장암 발병 여부를 진단하고자 하는 대상의 mRNA 발현량을 확인할 수 있고， 이들 발현량 정도를 비교함으로써 췌장암 발병 가능성 여부를 진단 또는 예측할 수 있다. 또한， 본 발명은 본 발명에 따른 ABAT 및 CHI3L1 마커 외에 종래 췌장암 마커로서 알려진 CA19-9를 조합하여 췌장암을 진단하는 방법을 제공한다.
상기 진단방법의 하나의 실시양태는 하기의 단계를 포함한다:
(a) 췌장암 발병 여부를 진단하고자 하는 대상으로부터 시료를 얻는 단계;
(b) 상기 시료로부터 각각 ABAT 및 CA19-9 단백질의 발현 수준 또는 ABAT 및 CA19-9 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계;
(c) 상기 ABAT 및 CA19-9 단백질의 발현 수준 또는 상기 ABAT 및 CA19-9 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 정상 대조군 시료에서의 발현 수준과 비교하는 단계; 및
(d) 상기 단계 (c)의 비교 결과， 췌장암 발병 여부를 진단하고자 하는 대상에서의 ABAT 단백질의 발현 수준 또는 ABAT 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준이 정상 대조군에서의 발현 수준보다 높고, CA19ᅳ 9 단백질의 발현 수준 또는 CA19-9 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준이 정상 대조군에서의 발현 수준보다 높은 경우 췌장암 발병 가능성이 높다고 판정하는 단계. 나아가， 진단방법의 또 다른 실시양태는 하기의 단계를 포함한다:
(a) 췌장암 발병 여부를 진단하고자 하는 대상으로부터 시료를 얻는 단계;
(b) 상기 시료로부터 각각 ABAT, CHI3L1 및 CA19-9 단백질의 발현 수준 또는 ABAT, CHI3L1 및 CA19-9 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계 ;
(c) 상기 ABAT, CHI3L1 및 CA19-9 단백질의 발현 수준 또는 ABAT, CHI3L1 및 CA19— 9 단백질을 암호화하는 유전자의 riiRNA 발현 수준을 정상 대조군 시료에서의 발현 수준과 비교하는 단계 ; 및
(d) 상기 단계 (c)의 비교 결과, 췌장암 발병 여부를 진단하고자 하는 대상에서의 ABAT 단백질의 발현 수준 또는 ABAT 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준이 정상 대조군에서의 발현 수준보다 높고, CHI3L1 단백질의 발현 수준 또는 CHI3L1 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준이 정상 대조군에서의 발현 수준보다 낮으며， CA19-9 단백질의 발현 수준 또는 CA19-9 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준이 정상 대조군에서의 발현 수준보다 높은 경우 췌장암 발병 가능성이 높다고 판정하는 단계 . 한편， 본 발명은 췌장암 진단방법을 위한 정보를 제공하기 위하여， (a) 췌장암 발병 여부를 진단하고자 하는 대상으로부터 시료를 얻는 단계; (b) 상기 시료로부터 ABAT(4— aminobutyrate aminotransferase; GenBank Accession No: NP_001120920.1) 단백질의 발현 수준 또는 ABAT 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 ABAT 단백질의 발현 수준 또는 상기 ABAT 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 정상 대조군 시료에서의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는， 췌장암 마커의 검출 방법을 제공한다.
또한， 본 발명은 췌장암 진단방법을 위한 정보를 제공하기 위하여， (a) 췌장암 발병 여부를 진단하고자 하는 대상으로부터 시료를 얻는 단계; (b) 상기 시료로부터 각각 ABAT 및 CA19-9 단백질의 발현 수준 또는 ABAT 및 CA19-9 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계; 및 · (c) 상기 ABAT 및 CA19-9 단백질의 발현 수준 또는 상기 ABAT 및 CA19-9 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 정상 대조군 시료에서의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 췌장암 마커의 검출 방법을 제공한다.
또한， 본 발명은 췌장암 진단방법을 위한 정보를 제공하기 위하여, (a) 췌장암 발병 여부를 진단하고자 하는 대상으로부터 시료를 얻는 단계; (b) 상기 시료로부터 각각 ABAT 및 CHI3L1 단백질의 발현 수준 또는 ABAT 및 CHI3L1 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 ABAT 및 CHI3L1 단백질의 발현 수준 또는 ABAT 및 CHI3L1 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 정상 대조군 시료에서의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 췌장암 마커의 검출 방법을 제공한다.
나아가， 본 발명은 췌장암 진단방법을 위한 정보를 제공하기 위하여， (a) 췌장암 발병 여부를 진단하고자 하는 대상으로부터 시료를 얻는 단계; (b) 상기 시료로부터 각각 ABAT, CHI3L1 및 CA19-9 단백질의 발현 수준 또는 ABAT, CHI3L1 및 CA19-9 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 ABAT , CHI3L1 및 CA19-9 단백질의 발현 수준 또는 ABAT , CHI3L1 및 CA19-9 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 정상 대조군 시료에서의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는， 췌장암 마커의 검출 방법을 제공한다. 이하， 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나， 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로， 본 발명이 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다. 실시예 1: 췌장암과발현또는저발현 단백질의 발굴및 성능분석
(1) 혈액 시료 전처리
췌장암에서 과발현 또는 저발현되는 단백질을 발굴하기 위해 하기 표
1에서와 같이 췌장암 환자 50명， 악성 췌관내 점액성 유두종양 환자 10명， 만성 담낭염 환자 22명 및 정상 대조군 25명으로부터 각각 혈액을 채취하였다. 이 중 정상 대조군과 만성 담낭염 시료는 정상군으로， 췌장암과 악성 췌관내 점액성 유두종양 시료는 췌장암군으로 분류하여 실험 및 분석을 진행하였다.
【표 1】
Figure imgf000023_0001
각 혈액 시료 40 ^를 MARS(Multiple Affinity Removal System) 컬럼 (Agilent, USA)에 통과시켜 혈액에서 가장 많은 비율을 차지하고 있는
14개의 단백질을 결실시키고， 3 kDa 필터로 농축한 후， BCA 정량을 수행하여 이중 200 ； 에 해당하는 혈장을 취해 6 M 우레아 (urea)로 변성시키고， 20 mM DTT 및 50 mM 이오도아세트산 (iodoacetic acid)을 사용하여 환원 및 알킬화시켰다. 여기에 트립신을 50: 1(단백질：트립신， w/w)의 비율로 37 °C에서 16시간 동안 처리하여 단백질을 펩타이드로 만든 후， 상기 펩타이드를 C18 OASIS 컬럼 (Waters, USA)을 사용하여 탈염하고 동결건조하였다. 상기 동결건조된 펩타이드를 용액 A(98% 증류수， 2% 아세토니트릴， 0.1% 포름산)에 녹이고 여기에 내부 표준인 베타-갈락토시다아제 펩타이드 5 fmol을 추가한 후, 이에 대하여 MRM 분석을 수행하였다.
(2) 트랜지션 선정
MRM 분석을 수행하기 위해， 특정 단백질의 특징적인 전하 대 질량비 (m/z)를 가지는 펩타이드를 선정하고 (Q1), 이 펩타이드를 전기적인 층격으로 단편화시켰을 때 발생하는 여러 절편 이온 증 해당 펩타이드에 대해 특징적인 m/z를 가지는 단편 이온을 선정하였다 (Q3). 이 Q1과 Q3의 조합은 특정 단백질에 특이적인 이온들의 조합으로서 이를 트랜지션이라 명칭하며, 고분해능 (triple quadrupole) 질량 분광 분석기에서 이 특징적인 Q1과 Q3로 이온들을 순차적으로 통과시켰을 때 얻어지는 신호를 정량적 정보로 환산하여 정량 분석을 수행하였다. 미국 워싱턴 대학교의 MacCoss 연구팀에서 개발한 스카이라인 (SKYLine)이라는 공개 소프트웨어를 이용하여 NIST(National Institute of Standards and Technology) 라이브러리의 펩타이드 탠덤 질량 스펙트럼 (peptide tandem mass spectra)을 기반으로 ms/ms 데이터가 존재하는 펩타이드에 대해， 총 강도가 높은 순으로 1개의 단백질당 최대 10개의 펩타이드를 선정하였다. 펩타이드의 길이는 아미노산 최소 7개부터 최대 24개로 선정하였다.
단， 트립신에 의해 절단되어 생성될 수 있는 전체 펩타이드 중에서 아래에 해당되는 아미노산을 포함하거나 특정 모티프 (motif)를 갖고 있는 펩타이드는 다음과 같이 신호 값이 좋지 않다고 알려져 있어서 제외하였다:
® 해당 펩타이드 내에 메티오닌이 존재할 경우， 생체 내 ROS(reactive oxygen species)에 의해 산화가 발생하여 질량 값이 32Da 증가;
® 해당 펩타이드 내에 히스티딘이 존재할 경우， R-그룹의 양전하로 인해 해당 펩타이드의 전하 상태가 바¾ ;
© 해당 펩타이드 내에 NxS/T 모티프가 존재할 경우， N-당화가 발생하여 질량 값이 이동 (shift)함;
® 해당 펩타이드 내에 트립신에 의해 잘릴 수 있는 R이나 Κ 다음에 프롤린이 존재하는 경우, 미절단 (missed cleavage)이 발생할 수 있음. 전구체 (precursor) 전하는 + 2가 전하를 갖는 펩타이드를 선정하고， 이온 전하는 + 1가 전하， 이온 타입은 y-이온을 사용하였다. 단백질 블라스트 (Protein Blast) P 및 스카이라인 (Skyline) 프로그램을 이용하여 독특한 트랜지션 및 펩타이드를 선별하고, 최종 선별된 트랜지션은 예측하는 정체 시간 (Retention time, RT) 범위 내에 속한 것들만 사용하였다. RT 예측을 위해， 600개의 SIS 펩타이드 MRM 분석을 진행하고， 이를 통하여 소수성 도표 (hydrophobicity scale)와 RT 크로마토그램에 기초한 검량선 (calibration curve)을 계산하였다.
(3) LC 및 MRM
LC는 애질런트사의 1260-모세관 LC를 사용하고， 펩타이드의 분리를 위해 모세관 RR 0.5 150 3.5 um의 컬럼을 사용하였다. 시료는 5 를 주입하였고， 유속은 20 /분으로 설정하였다. 우선 컬럼을 Sol A(95% 증류슈， 5% 아세토니트릴， 0.1% 포름산)으로 10분간 평형화한 후 Sc)ᅵ B(5% 증류수, 95% 아세토니트릴， 0.1% 포름산)로 50분간 5%에서 85%까지， 5분간 85%의 농도 구배를 통해 펩타이드를 용출하였다.
질량분석기 (Mass spectrometer)로서 애질런트사의 triple quadrupole
6490-QQQ 장비를 이용하여 선정 단백질들에 대한 트랜지션에 대해 MRM 모드로 모니터링하였다. 배치 (Batch) 간 편차를 보정하기 위해 각 시료에 스파이킹 (spiking)된 5 fmol 베타-갈락토시다아제 펩타이드^0 ^ 1^151^[(：131^15] , 547.3/646.4)도 동시에 모니터링하였다.
(4) 데이터 정량 분석
정량성을 확인하기 위해， 내부 표준 펩타이드인 베타-갈락토시다아제 펩타이드 (GDFQFNISR [C13N15] , 547.3/646.4 m/z)를 0.09, 0.27, 0.82, 2.5， 7.4' 22.2, 66.7 및 200 fmol로 각각 희석한 다음， 여기에 표적 펩타이드 분석 조건과 동일하게 혈장 10 ug을 매트릭스로 넣어서 분석을 진행하였다. 또한 내인성 (endogenous) 신호를 확인할 목적으로 내부 표준 펩타이드를 넣지 않은 경우도 분석에 포함시켰으며， 모든 9개의 농도 점에서 3회 반복하여 MRM 정량하여 표준 곡선 (standard curve)을 결정하였다.
각 개인별 MRM 결과는 스카이라인 (MacCoss Lab, verl.4.1)을 사용하여 해당 MRM 트랜지션의 이온 추출 크로마토그래피 (XIC, Extract ion chromatography)를 생성하였으며， 각 트랜지션의 피크 면적을 계산하고 이를 다시 시간 경과에 따라 도식화하였다. 각 XIC된 피크의 면적을 내부 표준인 베타—갈락토시다아제 펩타이드 (GDFQFNISR[C13N15 ] , 547.3/646.4 m/z)의 XIC된 피크 면적으로 정규화하고 이 값으로 각 단백질 별로 상대 정량 분석을 수행하였다.
상기 MRM 정량 분석 결과， 도 1에서 보는 바와 같이 ABAT 단백질의 발현이 정상군에 비해 췌장암 환자군에서 특이적으로 증가됨을 확인할 수 있었고， 상기 ABAT를 췌장암 진단용 마커로 선발하였다.
(5) 데이터 통계 분석
통계 분석을 위해서 SVM(Support Vector Machine)을 이용하였다. SVM은 라그랑주 최적화 이론 (Lagrangian optimization theory)에 기반하여 주어진 조건을 만족하는 함수를 추정하는 알고리즘으로， 이 중에 최대 마진 분류기 (Maximum margin classifier)를 사용하는 분류 분석방법을 사용하는 경우를 서포트 백터 분류 (Support Vector Classification, SVC)라고 한다. 본 실시예에서는 두 집단 (정상 집단과 암환자 집단) 간의 차이를 최대로 하는 SVC를 이용하여 아래와 같은 췌장암 진단 함수를 구성하였다:
〈함수식 1>
Figure imgf000027_0001
상기 식에서， 함수 값이 1이면 췌장암으로, -1이면 정상으로 판단한다. 상기 함수를 이용하여 췌장암 여부를 판단하였다. 3명의 정상 대조군으로부터 ABAT의 MRM 상대 측정값으로서 각각 0.000100328, 0.000252726 및 0.000301919를 얻었고， 이를 상기 진단 함수에 대입한 결과, 함수 값이 각각 f(0.000100328) = _ 1， f(0.000252726) =—1， f(0.000301919) = -1로 계산되어 상기 대상을 정상으로 판별할 수 있었다. 또한, 3명의 췌장암 환자로부터 ABAT의 MRM 상대 측정값으로서 각각 0.087803242， 0.039893973 및 0.038009273을 얻었고, 이를 상기 진단 함수에 대입한 결과, 함수 값이 각각 f(0.087803242) = 1， f(0.039893973) = 1 및 f(0.038009273) = 1로 계산되어 상기 대상을 췌장암으로 판별할 수 있었다. 한편， 췌장암 진단 함수를 사용한 경우 ABAT의 췌장암 진단 마커로서의 성능을 ROC 그래프의 AUC로 나타내었다. R0C 그래프는 민감도 (sensitivity)와 특이도 (specificity)가 어떤 관계를 갖고 변하는지를 이차원 평면 상에 표현한 것인데， R0C 그래프 아래의 면적 (AUC; 0 < AUC < 1)이 넓을수록 정확하다고 판단할 수 있다.
본 발명에 따른 ABAT는 AUC가 0.838로서 췌장암 진단 마커로서의 성능이 매우 우수한 것으로 나타났다 (도 2). 특히， 상용 췌장암 마커인 CA19-9의 AUC가 0.825임을 고려할 때 (도 3)， 본 발명의 ABAT는 CA19-9보다 췌장암 진단 성능이 더 우수함을 확인할 수 있었다 (도 4).
또한， ABAT를 CA19-9와 동시에 사용할 경우， AUC가 0.972로서 (도 5)， ABAT 또는 CA19-9를 단독으로 사용할 때보다 훨씬 우수한 성능을 나타냄을 확인할 수 있었다 (도 6).
상기 결과는 본 발명에 따른 ABAT가 췌장암 진단 마커로서 유용하게 사용될 수 있음을 보여준다. 실시예 2: 췌장암과발현 또는저발현 단백질의 발굴및 성능분석 실시예 1에서와 마찬가지로 단계 (1) 내지 (4)를 수행한 후 MRM 정량 분석 결과， 도 7에서 보는 바와 같이， CHI3L1 단백질의 발현이 정상군에 비해 췌장암 환자군에서 특이적으로 감소됨을 확인할 수 있었고， 상기 CHI3L1을 췌장암 진단용 마커로 선발하였다.
(1) 데이터 통계 분석
통계 분석을 위해서 SVM(Support Vector Machine)을 이용하였다. SVM은 라그탕주 최적화 이론 (Lagrangi an opt imizat ion theory)에 기반하여 주어진 조건을 만족하는 함수를 추정하는 알고리즘으로， 이 중에 최대 마진 분류기 (Maximum margin classi f ier)를 사용하는 분류 분석방법을 사용하는 경우를 서포트 백터 분류 (Support Vector Class i f i cat ion, SVC)라고 한다. 본 실시예에서는 두 집단 (정상 집단과 암환자 집단) 간의 차이를 최대로 하는 SVC를 이용하여 아래와 같은 췌장암 진단 함수를 구성하였다:
<함수삭 1>
n
= sgn^ a^ < Xf Xi > +b)
i=l
상기 식에서， 함수 값이 1이면 췌장암으로, -1이면 정상으로 판단한다. 상기 함수를 이용하여 췌장암 여부를 판단하였다. 3명의 정상 대조군으로부터 ABAT 및 CHI3L1의 MRM 상대 측정값으로서 각각 0.000100328와
0.14771372 , 0.000252726과 0.260673196 및 0.000301919와 0. 190724435를 얻었고, 이를 상기 진단 함수에 대입한 결과， 함수 값이 각각 f (0.000100328， 0. 14771372) = -1， f (0.000252726， 0.260673196) = -1 , f (0.000301919, 0. 190724435) = -1로 계산되어 상기 대상을 정상으로 판별할 수 있었다. 또한， 3명의 췌장암 환자로부터 ABAT 및 CHI3L1의 MRM 상대 측정값으로서 각각 0.037046485와 0.023796806 , 0.039893973과 0.092394263 및 0.039590355와 0.071735919를 얻었고, 이를 상기 진단 함수에 대입한 결과, 함수 값이 각각 f ( 0.037046485， 0.023796806) = 1， f (0.039893973 , 0.092394263) = 1 , f (0.039590355 , 0.071735919) = 1로 계산되어 상기 대상을 췌장암으로 판별할 수 있었다. 한편， 췌장암 진단 함수를 사용한 경우 ABAT 및 CHI3L1의 조합의 췌장암 진단 마커로서의 성능을 R0C 그래프의 AUC로 나타내었다. R0C 그래프는 민감도 (sensi t ivi ty)와 특이도 (speci f ici ty)가 어떤 관계를 갖고 변하는지를 이차원 평면 상에 표현한 것인데 , R0C 그래프 아래의 면적 (AUC ; 0 < AUC < 1)이 넓을수록 정확하다고 판단할 수 있다.
본 발명에 따른 ABAT 및 CHI3L1의 조합은 AUC가 0.956으로서 췌장암 진단 마커로서의 성능이 매우 우수한 것으로 나타났다 (도 8) . 특히, 상용 췌장암 마커인 CA19ᅳ 9의 AUC가 0.825임을 고려할 때 (도 3) , 본 발명의 ABAT 및 CHI3L1의 조합은 CA19-9보다 췌장암 진단 성능이 더 우수함을 확인할 수 있었다 (도 9) . 또한, ABAT 및 CHI3L1의 조합을 CA19-9와 동시에 사용할 경우， AUC가 0.984로서 (도 10)， ABAT 및 CHI3L1의 조합 또는 CA19-9를 단독으로 사용할 때보다 훨씬 우수한 성능을 나타냄을 확인할 수 있었다 (도 11) .
상기 결과는 본 발명에 따른 ABAT 및 CHI3L1의 조합이 췌장암 진단 마커로서 유용하게 사용될 수 있음을 보여준다.

Claims

허청구범위: 청구항 1. ABAT(4ᅳ aminobutyrate aminotransferase; GenBank Accession No: NP_001120920.1) 단백질의 발현 수준 또는 ABAT 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 췌장암 진단용 조성물. 청구항 2. 게 1항에 있어서， CA19-9 단백질의 발현 수준 또는 CA19-9 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는， 췌장암 진단용 조성물. 청구항 3. ABAT 단백질의 발현 수준 또는 ABAT 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준， 및 CHI3Ll(Chitinase-3-like protein 1 precursor; GenBank Accession No: NP_001267.2) 단백질의 발현 수준 또는 CHI3L1 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 췌장암 진단용 조성물. 청구항 4. 제 3항에 있어서， CA19-9 단백질의 발현 수준 또는 CA19-9 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는， 췌장암 진단용 조성물. 청구항 5. 게 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제가 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체， 올리고펩타이드, 리간드， PNA(pepdde nucleic acid) 또는 앱타머 (aptamer)를 포함하는 것을 특징으로 하는， 췌장암 진단용 조성물. 청구항 6. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서， 상기 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제가 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머， 프로브 또는 안티센스 뉴클레오타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는， 췌장암 진단용 조성물. 청구항 7. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는， 췌장암 진단용 키트. 청구항 8. 제 7항에 있어서， 상기 키트가 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction) 키트， DNA 칩 키트, ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay) 키트， 단백질 칩 키트， 래피드 (rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트인 것을 특징으로 하는 췌장암 진단용 키트. 청구항 9. (a) 췌장암 발병 여부를 진단하고자 하는 대상으로부터 시료를 얻는 단계;
(b) 상기 시료로부터 ABAT(4-aminobutyrate aminotransferase； GenBank Accession No: NP_001120920.1) 단백질의 발현 수준 또는 ABAT 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계;
(c) 상기 ABAT 단백질의 발현 수준 또는 상기 ABAT 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 정상 대조군 시료에서의 발현 수준과 비교하는 단계; 및
(d) 상기 단계 (c)의 비교 결과， 췌장암 발병 여부를 진단하고자 하는 대상에서의 ABAT 단백질의 발현 수준 또는 ABAT 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준이 정상 대조군에서의 발현 수준보다 높은 경우 췌장암 발병 가능성이 높다고 판정하는 단계
를 포함하는， 췌장암의 진단방법. 청구항 10. (a) 췌장암 발병 여부를 진단하고자 하는 대상으로부터 시료를 얻는 단계;
(b) 상기 시료로부터 각각 ABAT 및 CA19-9 단백질의 발현 수준 또는 ABAT 및 CA19-9 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계; (c) 상기 ABAT 및 CA19-9 단백질의 발현 수준 또는 상기 ABAT 및 CA19-9 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 정상 대조군 시료에서의 발현 수준과 비교하는 단계; 및
(d) 상기 단계 (c)의 비교 결과 췌장암 발병 여부를 진단하고자 하는 대상에서의 ABAT 단백질의 발현 수준 또는 ABAT 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준이 정상 대조군에서의 발현 수준보다 높고， CA19-9 단백질의 발현 수준 또는 CA19-9 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준이 정상 대조군에서의 발현 수준보다 높은 경우 췌장암 발병 가능성이 높다고 판정하는 단계
를 포함하는， 췌장암의 진단방법. 청구항 11. (a) 췌장암 발병 여부를 진단하고자 하는 대상으로부터 시료를 얻는 단계;
(b) 상기 시료로부터 각각 ABAT 및 CHI3Ll(Chi t inase-3-l ike protein 1 precursor ; GenBank Accession No : NP_001267.2) 단백질의 발현 수준 또는 ABAT 및 CHI3L1 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계;
(c) 상기 ABAT 및 CHI3L1 단백질의 발현 수준 또는 ABAT 및 CHI3L1 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 정상 대조군 시료에서의 발현 수준과 비교하는 단계 ; 및
(d) 상기 단계 (c)의 비교 결과， 췌장암 발병 여부를 진단하고자 하는 대상에서의 ABAT 단백질의 발현 수준 또는 ABAT 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준이 정상 대조군에서의 발현 수준보다 높고, CHI3L1 단백질의 발현 수준 또는 CHI3L1 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준이 정상 대조군에서의 발현 수준보다 낮은 경우 췌장암 발병 가능성이 높다고 판정하는 단계
를 포함하는， 췌장암의 진단방법. 청구항 12. (a) 췌장암 발병 여부를 진단하고자 하는 대상으로부터 시료를 얻는 단계;
(b) 상기 시료로부터 각각 ABAT, CHI3L1 및 CA19-9 단백질의 발현 수준 또는 ABAT, CHI3L1 및 CA19-9 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계 ;
(c) 상기 ABAT, CHI3L1 및 CA19-9 단백질의 발현 수준 또는 ABAT, CHI3L1 및 CA19-9 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 정상 대조군 시료에서의 발현 수준과 비교하는 단계 ; 및
(d) 상기 단계 (c)의 비교 결과， 췌장암 발병 여부를 진단하고자 하는 대상에서의 ABAT 단백질의 발현 수준 또는 ABAT 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준이 정상 대조군에서의 발현 수준보다 높고， CHI3L1 단백질의 발현 수준 또는 CHI3L1 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준이 정상 대조군에서의 발현 수준보다 낮으며， CA19-9 단백질의 발현 수준 또는 CA19ᅳ 9 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준이 정상 대조군에서의 발현 수준보다 높은 경우 췌장암 발병 가능성이 높다고 판정하는 단계
를 포함하는， 췌장암의 진단방법 . 청구항 13. 제 9항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시료가 혈액， 혈청 또는 혈장인 것을 특징으로 하는, 췌장암의 진단방법. 청구항 14. 제 9항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서， 상기 단백질 발현 수준 측정이 해당 단백질에 특이적으로 결합하는 항체， 올리고펩타이드， 리간드， PNA(peptide nucleic acid) 또는 앱타머 (aptamer)를 이용하는 것을 특징으로 하는, 췌장암의 진단방법. 청구항 15. 제 9항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 발현 수준 측정 또는 비교가 단백질 칩 분석， 면역측정법， 리간드 바인딩 어세이， MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석， SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석， 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법， 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동， 조직면역 염색 보체 고정 분석법， 2차원 전기영동 분석， 액상 크로마토그래피-질량분석 (liquid chromatography-Mass Spectrometry, LOMS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏 및 ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는， 췌장암의 진단방법. 청구항 16. 제 9항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 mRNA 발현 수준 측정이 역전사효소 중합효소 반웅, 경쟁적 역전사효소 중합효소반웅， 실시간 역전사효소 중합효소반웅， RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 또는 DNA 칩에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는， 췌장암의 진단방법.
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