WO2015037578A1 - 蛍光染色による芽胞の迅速な検出方法 - Google Patents

蛍光染色による芽胞の迅速な検出方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2015037578A1
WO2015037578A1 PCT/JP2014/073792 JP2014073792W WO2015037578A1 WO 2015037578 A1 WO2015037578 A1 WO 2015037578A1 JP 2014073792 W JP2014073792 W JP 2014073792W WO 2015037578 A1 WO2015037578 A1 WO 2015037578A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
spores
spore
staining
fluorescent
auramine
Prior art date
Application number
PCT/JP2014/073792
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
宏治 高松
利津子 桑名
藤田　康弘
智之 木ノ内
Original Assignee
学校法人常翔学園
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 学校法人常翔学園 filed Critical 学校法人常翔学園
Priority to JP2015536581A priority Critical patent/JPWO2015037578A1/ja
Publication of WO2015037578A1 publication Critical patent/WO2015037578A1/ja

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria

Definitions

  • the present invention relates to a method for rapidly detecting spores by fluorescent staining. More specifically, the present invention relates to a method for quickly detecting only spores by distinguishing spores and vegetative cells by staining a sample with a fluorescent stain that stains spores but not vegetative cells. .
  • a spore is a highly durable cell structure that forms when some bacteria deteriorate in nutritional state and growth environment.
  • the spore is a core (core), cortex (cortex), and spore shell ( (Spoor coat). Bacteria that form spores divide and multiply in an environment where vegetative cells are suitable for growth. On the other hand, when the nutritional state or growth environment deteriorates, the vegetative cells divide into mother cells and pre-spores due to unequal division, and the pre-spores become forespores when the engulfment is completed. The spore is released out of the cell by lysis.
  • spores or spore-forming bacteria include Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, tetanus, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, and Bacillus anthracis. Spores are highly resistant to heat, ultraviolet rays, chemicals, etc., and can remain dormant for a long time even in an environment that is depleted of nutrients. .
  • Non-Patent Document 1 a spore staining method observed with visible light
  • Non-Patent Document 2 a method of fluorescently staining germinated spores
  • the Wirtz method for staining a smear with malachite green and observing spores with visible light the Moeller method for staining a smear with methylene blue and observing spores with visible light, and the like.
  • the method is not a simple and rapid detection method.
  • spores detectable by the above method are limited to germinating spores. Since the dormant spores are not exposed to the cell membrane or DNA, it is difficult to permeate the fluorescent stain.
  • the above method is not a general-purpose method because it requires skill to accurately distinguish the cells with the naked eye, and automatic measurement is difficult.
  • Non-patent Document 1 a method of damaging spores and staining DNA present in the core with a fluorescent reagent.
  • This method is an excellent method capable of confirming sterilization or bacteriostatic action on various sterilized spores without culturing spore bacteria.
  • this method requires a step of damaging spores.
  • Non-patent Documents 3 and 4 a method of fluorescent staining with thioflavin T without damaging the spores has been disclosed (Non-patent Documents 3 and 4). This method can detect spores rapidly by being able to perform fluorescent staining.
  • An object of the present invention is to provide a method for rapidly detecting only spores by staining a sample with a fluorescent stain that stains spores but not vegetative cells, and performs fluorescence observation. Furthermore, an object of the present invention is to provide a kit for detecting spores with the fluorescent stain, the stained spores, and the like.
  • the present inventors do not stain vegetative cells, and there is a fluorescent stain that can specifically stain spores.
  • the inventors have found that only spores can be detected rapidly, and have completed the present invention.
  • the present invention relates to the following [1] to [6].
  • [1] A method for detecting spores in a method for detecting spores in a sample, comprising staining the sample with a fluorescent stain that stains spores but not vegetative cells, and performs fluorescence observation.
  • the sample is stained with a fluorescent stain that stains spores but not vegetative cells, and further, the sample is decolored with a decolorizing agent, and then fluorescence observation is performed.
  • Fluorescent stains that stain spore but not vegetative cells are alizarin red S, auramine O, auramine S, berberine sulfate, calcoflor white, congo red, 5-dodecanoylaminofluorescein, eosin Y, Erythrosin B, Evans Blue, Malachite Green, Mitotracker TM Green FM, Nile Blue, Pararose Aniline Hydrochloride, Phloxine B, 6-propionyl-2-dimethylaminonaphthalene, Pyronin Y, Rose Bengal, Sulforhodamine 101, Ubitech
  • the method for detecting a spore according to [1] or [2], which is at least one member of the group consisting of 2B, xylenol orange, and salts or free forms thereof.
  • the spore detection method of the present invention can detect only spores rapidly by staining spore specifically without staining vegetative cells.
  • the method of the present invention can detect spores having germination ability.
  • the spore inspection is required at the production site, medical site, etc. of foods, pharmaceuticals, cosmetics and the like, and the present invention capable of detecting spores with high accuracy and speed can greatly contribute to various fields.
  • a sample is stained with a fluorescent stain that stains spores but not vegetative cells, and fluorescence observation is performed. When fluorescence is observed, the spore is determined to be included in the sample. Provide a method. Further, a spore detection kit containing the fluorescent stain and a spore stained with the fluorescent stain are also provided.
  • Spores are highly durable cell structures that some bacteria form when their nutritional state and growth environment deteriorate. Spores that cover the core (core), cortex (cortex), and cortex It is composed of a shell (spoor coat). Furthermore, the spore shell is composed of two layers of a spore inner shell and a spore outer shell in order from the inside. In the spore state, bacteria cannot newly divide and their metabolism is limited. Such spores are called dormant cells. On the other hand, when the bacterium is placed in an environment suitable for growth, the spore germinates to produce a microbial cell having growth / metabolism ability. This is called a vegetative cell in contrast to a spore.
  • the spore bacterium targeted in the present invention may be a bacterium that forms a spore.
  • Bacillus genus, Clostridium genus, Sporolactobacillus genus, Geobacillus genus, Paenibacillus genus, Alicyclobacillus genus, Thermonerobacter genus, Thermonerobacterium genus, Morella genus examples include bacteria belonging to the genus Alicyclobacillus, Desulphotomacrum genus and Lysinibacillus, preferably Bacillus genus, Clostridium genus, Geobacillus genus, Paenibacillus genus, Thermonerobacter genus, Alicyclobacillus genus, Morella genus Examples include bacteria.
  • bacteria belonging to the genus Bacillus include, for example, Bacillus subtilis, Bacillus anthracis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus atrophaeus, Bacillus cereus, Bacillus circulans, Bacillus halodurans, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus mycoides, Bacillus mycoides pseudo Bacillus pseudolide ), Bacillus pumilis, Bacillus safensis, Bacillus sphaericus, Bacillus brevis, Bacillus thuringiensis , Bacillus coagulans (Bacillus coagulans), although Bacillus Koafuirenshisu (Bacillus coagarnsis), and the like, without limitation.
  • Bacillus subtilis Bacillus subtilis
  • Bacillus anthracis Bacillus amyloliquefaciens
  • Bacillus atrophaeus Bacillus cereus
  • bacteria belonging to the genus Clostridium include Clostridium sporogenes, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Clostridium thermosaccharo However, it is not limited to these.
  • examples of the bacterium belonging to the genus Sporolactobacillus include, but are not limited to, Sporolactobacillus inulinus.
  • Examples of bacteria belonging to the genus Geobacillus include, but are not limited to, Geobacillus kaustophilus and Geobacillus stearothermophilus.
  • bacteria belonging to the genus Paenibacillus include, but are not limited to, Paenibacillus polymyxa and Paenibacillus thiaminolyticus.
  • bacteria belonging to the genus Alicyclobacillus include, but are not limited to, Alicyclobacillus acidoterrestris and Alicyclobacillus acidocaldarius.
  • Thermoneerobacter include, for example, Thermoanaerobacter mathranii, Thermoanaerobacter acetoethylicus, Thermoanaerobacter subsp. Bactii subsp.
  • Thermonerobacterium examples include, for example, Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum, Thermoanaerobacterium aciditolerans, Thermoanaerobacterium aotearoense. , Thermoanaerobacterium polysaccharolyticum, Thermoanaerobacterium saccharolyticum, Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes, Thermonererobacterium xylanority Examples include Cam (Thermoanaerobacterium xylanolyticum), Thermoanaerobacterium zeae, etc. But it is not limited to.
  • Examples of bacteria belonging to the genus Morella include Moorella thermoacetica, Moorella glycerini, Moorella mulderi, and Moorella thermoautotrophica. However, it is not limited to these.
  • Examples of the bacterium belonging to the genus Desul Photomacrum include, for example, Desulfotomaculum nigrificans, Desulfotomaculum thermoacetoxidans, Desulfotomaculum thermoacetoxidans, Desulfotomaculum thermobenzoicum subsp. Benzoycum (Desulfotomaculum thermobenzoicum subsp. Thermobenzoicum), Desulfotomaculum thermobenzoicum subsp.
  • Thermosyntrophicum, Desulfotomaculum thermocisternum, Desulfotomaculum thermocisternum Examples include, but are not limited to, thermosapovorans (Desulfotomaculum thermosapovorans), desulfatomaculum thermosubterraneum (Desulfotomaculum thermosubterraneum), and the like.
  • thermosapovorans Desulfotomaculum thermosapovorans
  • desulfatomaculum thermosubterraneum Desulfotomaculum thermosubterraneum
  • the bacterium belonging to the genus Ricinibacillus include, but are not limited to, Lysinibacillus sphaericus.
  • the present invention can also target dormant spores that maintain germination ability.
  • the above-mentioned spore bacteria can be classified by using the heat-resistant temperature of the spore as an index.
  • thermophilic groups whose heat limit is around 120 ° C (for example, Clostridium thermosaccharolyticum, Geobacillus stearothermophilus, Moorella thermoacetica, Thermoanaerobacter mathranii, etc.), low and medium temperature groups (Bacillus subtilis, Clostridium ⁇ perfring, botulinum etc.).
  • it can also classify
  • Fluorescent stain used in the present invention may be any stain that specifically stains spores without staining vegetative cells. Moreover, it is preferable that the fluorescent staining agent has a low staining property for dead cells. Specifically, Alizarin Red S, Auramine O, Auramine S, Berberine Sulfate, Calcoflor White, Congo Red, 5-Dodecanoylaminofluorescein, Eosin Y, Erythrosin B, Evans Blue, Malachite Green, Mito Tracker (trademark) Green FM, Nile blue, Pararose aniline hydrochloride, Phloxine B, 6-propionyl-2-dimethylaminonaphthalene, Pyronin Y, Rose Bengal, Sulforhodamine 101, Ubitex 2B or Xylenol orange.
  • the fluorescent staining agent used in the present invention may be a salt or a free form thereof as long as the characteristic of staining only spores without staining vegetative cells is maintained.
  • Examples of the salt include salts with acids (eg, inorganic acids and organic acids) and salts with bases (eg, alkali metals, alkaline earth metals, etc.).
  • Examples of the salt with inorganic acid include salts with hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid and the like
  • examples of the salt with organic acid include acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid.
  • the free form can be converted into an appropriate salt by a known method or a method analogous thereto, and conversely, when obtained as a salt, the salt is converted into a known method. Alternatively, it can be converted into a free form or other salt by a method according to it.
  • a plurality of (two or more) fluorescent staining agents may be used in combination. Examples of combinations include auramine O or auramine S and Congo red, auramine O or auramine S and Nile blue, auramine O or auramine S and phloxine B, auramine O or auramine S and sulforhodamine 101, auramine O or auramine S and ubitec. 2B or the like, but is not limited thereto.
  • the above-mentioned fluorescent stain is used, for example, by the present inventor.
  • the method described in Patent Document 1 developed by them, that is, sterilization or bacteriostasis of spore-forming bacteria utilizing the increase in the permeability of a fluorescent staining reagent into the spore by sterilization treatment such as heating and chemical treatment of the spore It can also be applied to a method for evaluating the action.
  • the spore dyed with the fluorescent stain can be used as an index (control) in various products such as beverages, foods, pharmaceuticals, cosmetics, and various spore tests in water quality tests.
  • the number or concentration of spores can be detected using the spores stained in the present invention.
  • Samples targeted by the present invention include, but are not limited to, foods, beverages, pharmaceuticals (medical drugs, general drugs, or quasi drugs), disposable medical devices, cosmetics, and the like.
  • Examples of foods include rice, breads, noodles, canned foods, spices, lunch boxes, prepared foods, dairy products, Japanese and Western confectionery (including refrigerated products and frozen products), seasonings, nutritional supplements (supplements, etc.) , Processed meat products (ham, sausage, bacon, etc.), processed fishery products (kneaded products, etc.), and the like, but are not limited thereto.
  • beverages include, but are not limited to, various soft drinks (drinkable liquids that do not contain alcohol (less than 1% alcohol) and have a taste and aroma), alcoholic beverages, and the like.
  • various soft drinks include coffee beverages (coffee: coffee beans with a content of 5 g or more in 100 g content, coffee beans: coffee beans in a content of 100 g in terms of raw beans , 2.5 g or more and less than 5 g, soft drinks with coffee: 100 g of coffee beans with a content of 1 g or more and less than 2.5 g in terms of green beans, carbonated drinks (carbonated water-soda water, cola carbonated drinks, Transparent carbonated drinks, carbonated drinks with fruit juice, carbonated drinks with fruits, carbonated drinks with milk, carbonated drinks with nutrition drinks, fruit drinks (natural juices, fruit drinks, fruit drinks, mixed drinks with fruit juices, carbonated drinks with fruit juices, fruit juices) Near water, aids, fruit syrups, etc.), tea beverages (oolong tea beverages, tea beverages
  • alcoholic beverages include, but are not limited to, beer, wine, strawberry high, liqueur, sake, shochu, brandy, whiskey and the like.
  • forms containing foods and beverages include, but are not limited to, cans, bottles, plastic bottles, trays, and pouches.
  • Examples of pharmaceuticals include, but are not limited to, ordinary tablets, powders, capsules, suspensions, emulsions, syrups and the like.
  • Disposable medical devices include, but are not limited to, syringes, injection needles, contact lenses, and the like.
  • Cosmetics include, but are not limited to, lotion, emulsion, cleansing, foundation, eyeliner, eye shadow, mascara, face powder, blusher, lipstick, nail polish and the like.
  • the staining method of the present invention can be performed by conventional cell fluorescence staining.
  • a fluorescent stain is diluted with a stock solution or diluted and mixed with a sample and stained at a final concentration of 0.0001 to 0.01% (W / V) (preferably 0.001 to 0.01% (W / V)) for several minutes to several hours. Thereafter, the sample is washed, decolored, and observed with a microscope.
  • the dyeing time at that time can be appropriately adjusted in consideration of temperature, dyeing conditions, and the like.
  • the temperature is not particularly limited as long as the spores are fluorescently stained, and examples thereof include 0 to 100 ° C., more preferably 15 to 30 ° C.
  • Washing is performed after the dyeing process to remove the fluorescent stain attached to the contaminants mixed in due to food fragments, etc. in the vegetative cells and the sample, and it is washed 1 to several times (2 to 4 times). It is preferable to carry out with.
  • the washing at that time can be performed with a buffer solution such as a Tris-HCl buffer (eg, Tris HCl pH 7.6), a phosphate buffer, or a combination thereof.
  • the pH at the time of washing is not particularly limited as long as it removes the fluorescent stain adhering to vegetative cells and contaminants, and examples thereof include pH 4 to 10, more preferably pH 6 to 8.
  • the depigmenting agent is not particularly limited as long as it removes the fluorescent stain attached to vegetative cells and impurities, and examples thereof include alcohols (for example, lower alcohols such as ethanol and isopropanol). Preferably it is ethanol, more preferably 70% ethanol.
  • the depigmenting agent can be appropriately selected according to the sample and the fluorescent staining agent. In order to more efficiently remove the fluorescent stain attached to vegetative cells more reliably, it is more preferable to wash with alcohol (for example, 70% ethanol) at least once.
  • Fluorescence microscope observation can be performed with an optical microscope equipped with a fluorescence observation apparatus, an objective lens, a camera adapter lens, a CCD camera, and the like.
  • the quantity of fluorescently stained spores can be automatically confirmed by using an automatic measuring instrument such as a flow cytometer or Bioproroller (registered trademark).
  • a heat treatment or a surfactant treatment may be performed at the time of dyeing.
  • the heating temperature is not particularly limited as long as it enhances the spore stainability, but the heating temperature is, for example, 40 to 100 ° C., more preferably 65 to 80 ° C.
  • the surfactant is, for example, Triton X-100, dodecyl Examples thereof include sodium sulfate, sodium lauryl sulfate, and Tween® 80, and Triton® X-100 is more preferable. These processes may be performed in combination.
  • an enzyme treatment, a surfactant treatment, a chelating agent treatment, a concentration washing treatment, or the like may be performed in advance.
  • Kit The present invention provides a spore detection kit containing the fluorescent staining agent. Moreover, as one aspect
  • Example 1 Discrimination between spores and vegetative cells of various fluorescent reagents for Bacillus subtilis 168 trpC2 strain ( test strain) Bacillus subtilis 168 trpC2 was used as a test strain.
  • LB medium and Schaeffer medium were used as the medium. Vegetative cells were cultured in L-broth at 37 ° C. for 6 hours, collected by centrifugation, washed with 10 mM Tris HCl pH 7.6, and then stained at 37 ° C. for 1 hour. Spores were obtained by inoculating cells cultured overnight in LB medium at 1% in Schaeffer liquid medium and culturing at 37 ° C. for 24 hours. Spore samples were stained in Schaeffer medium or centrifuged and washed twice with 10 mM Tris HCl pH 7.6, and then stained in 10 mM Tris HCl pH 7.6 buffer at 37 ° C. for 1 hour.
  • Bacillus subtilis 168 trpC2 strain is inoculated on LB agar medium and cultured at 37 ° C for 24 hours, then the cells are collected and suspended in auramine S staining solution for 5 minutes. Stained.
  • Table 1 shows the fluorescent stains used and their manufacturers / distributors.
  • the powdery fluorescent staining agent was dissolved in purified water or DMSO so as to have a concentration of 0.1% or 1 mM to prepare a stock solution.
  • the liquid fluorescent stain was used as it was as a storage solution. These stock solutions were added directly to the medium or diluted with 10 mM Tris HCl pH 7.6 (10 mM Tris HCl pH 7.0 for Auramin S) before use for staining.
  • Table 1 also shows the use concentrations of various fluorescent stains.
  • the stained cells are 1) unwashed, 2) washed twice with 10 mM Tris HCl pH 7.6, 3) decolorized with 70% ethanol aqueous solution and washed with 10 mM Tris HCl pH 7.6 alternately twice. After that, each was microscopically examined.
  • the excitation filter transmits light with a wavelength of 540-590 nm
  • the absorption filter transmits light with a wavelength of 610-700 nm.
  • Table 1 shows the fluorescent mirror units used for the respective fluorescent stains. The exposure time was set such that no background fluorescence was observed from unstained spores of Bacillus subtilis without using a neutral density filter (maximum 1-2 seconds). If the stained cells were too fluorescent and overexposed, exposure was adjusted using a 5% or 25% neutral density filter.
  • the phase contrast microscope observation image and the fluorescence microscope observation image were taken with a CCD camera, and a superimposed image was created using image processing software RS ImageExpress (manufactured by Nippon Roper).
  • a fluorescence index of 2.5 or more is considered to have staining properties.
  • (*) indicates that the staining property for damaged vegetative cells or dead cells is increased as compared with live cells.
  • the increase in staining property means that the discharge function of the fluorescent stain of the cell is reduced or lost due to damage or death of the cell, and the fluorescent stain tends to accumulate in the cell, resulting in damaged vegetative cells or The increase in fluorescence emitted by dead cells.
  • Alizarin Red S Alizarin Red S
  • Calcoflor White Calcofluo White
  • Eosin Y Eosin Y
  • Erythrosine B Evans Blue
  • Pararoseaniline Hydrochloride Fuchsine
  • the spores are decolorized with 70% ethanol, but they are not decolorized by washing with 10 mM Tris HCl, and the affinity for the spores is moderate, and the vegetative cells are stainable. ( ⁇ ).
  • the reason why a specific fluorescent stain does not stain vegetative cells but stains spores specifically is considered as follows.
  • the structure of the spore has been clarified by observation with an electron microscope, and cortex and spore coat are known as main spore-specific structures.
  • the fluorescent stain was considered to have a high affinity for the whole structure or a specific substance contained in the structure and a low affinity for vegetative cells or dead cells.
  • mutant strains that cause abnormal formation of cortex and spore coat are known, and the staining sites of various fluorescent stains were confirmed based on the difference in staining properties for these mutant spores. For example, calcoflor white has decreased staining in cortex-deficient spores, and auramin O, Congo red, sulforhodamine 101 and the like have decreased staining in spore coat-deficient spores.
  • Calcoflor white is used for detecting fungi because it has an affinity for polysaccharides contained in the cell walls of fungi.
  • spore cortex also contains polysaccharides such as peptidoglycan, which was thought to be stained with calcoflor white.
  • fluorescent stains other than calcoflor white can be applied to spore staining if they have an affinity for cortex-specific components.
  • cortex-specific fluorescent stains can be used to stain spores with an undeveloped spore coat or spores that have been damaged. Limited.
  • Ubitex B2 is also used for fungal detection because it binds to polysaccharides in fungal cell walls. Ubitex B2, unlike Calcoflor White, showed reduced staining in spores that lack mutant spores. The spore coat is a multilayer structure containing various substances such as proteins, carbohydrates and lipids. Ubitex B2 was thought to stain spore coat-specific polysaccharides.
  • a fluorescent stain that has an affinity for any of the proteins, carbohydrates, lipids, and metal ions accumulated in the spore coat of the spore coat is considered to be applicable to spore staining.
  • Auramin and Nile Blue are basic dyes with one NH 2 group, and Pararose aniline is a three NH 2 group. These are considered to have an affinity for the acidic component of the spore coat. In fact, in Nile Red, where NH 2 groups were lost from Nile Blue, the staining specificity for spores decreased, suggesting the importance of NH 2 groups in spore staining.
  • Alizarin Red S is a staining agent having one SO 3 Na group, sulforhodamine 101 has two SO 3 H groups, and xylenol orange has four COOH groups. These are considered to show affinity for the basic component of the spore coat.
  • Congo Red has two SO 3 Na groups and two NH 2 groups, and Evans Blue is a stain with two NH 2 groups and four SO 3 groups. These may have an affinity for both acidic and basic components of the spore coat.
  • Phloxin B and rose bengal are fluorescent stains containing Cl and Br or I, and erythrosine is I. Although the substances to be dyed by fluorescent dyes containing these halogens are unknown, it is presumed that they have an affinity for some component of spores.
  • FIG. 1 a fluorescence micrograph of auramine O with the highest staining suitability is shown in FIG.
  • Bacillus subtilis spores obtained by culturing in Schaeffer medium looked white with a phase-contrast microscope, and spores stained with auramine O showed green fluorescence under a fluorescence microscope.
  • Bacillus subtilis vegetative cells obtained by culturing in LB medium appeared black by phase contrast microscopy, and vegetative cells did not show green fluorescence by fluorescence microscopy.
  • a fluorescence micrograph of auramine S is shown in FIG. When blue light was irradiated under a fluorescence microscope, green fluorescence was observed around the spores.
  • Example 2 About spore staining of auramine O against various spore bacteria ( test strain) The test strains shown in Table 3 were used. Twenty-eight spore bacteria and 28 strains, which are problematic in food and beverages, were used.
  • Example 3 Congo-red and Nile blue spore staining for various spore bacteria ( test strain) The test strains shown in Table 4 were used.
  • the spore was prepared by inoculating the above-mentioned test strain on an agar medium (Table 4) and culturing at 30 ° C. for 2 days or 4 days.
  • Example 4 Spore detection kit The following combination kit was prepared as a spore detection kit for use in spore detection and quantity measurement.
  • Solution A 1% auramine O DMSO solution
  • Solution B 0.01% auramine O, 10 mM Tris-HCL pH 7.0 aqueous solution
  • Diluent 10mM Tris-HCL pH7.0 aqueous solution
  • aqueous solution containing spores When inspecting an aqueous solution containing spores, 1/100 volume of solution A is added and suspended, and left at room temperature for 5 minutes, and then observed with a fluorescence microscope or the like. Stained spores emit green fluorescence when irradiated with blue light.
  • a particulate sample or a pellet of bacterial cells obtained by centrifugation add an appropriate amount of Solution B, suspend it, leave it at room temperature for 5 minutes, and observe it with a fluorescence microscope or the like. Stained spores emit green fluorescence when irradiated with blue light. If the number of spores is too large to be observed, the aqueous solution, sample or pellet may be diluted with a diluent.
  • Spore and vegetative cell detection kit The following combination of kits was prepared as a spore detection kit for detecting spores and vegetative cells separately or for measuring the number of spores and vegetative cells.
  • Solution C 1% auramine O DMSO solution
  • Solution D 1% Hoechst 33342 aqueous solution
  • Solution E 0.01% auramine O, 0.01% Hoechst 33342, 10 mM Tris-HCL pH7.0 aqueous solution
  • Diluent (10mM Tris-HCL pH7.0 aqueous solution)
  • Bacterial vegetative cells emit blue fluorescence when DNA is stained and irradiated with ultraviolet light, and stained spores emit green fluorescence when irradiated with blue light. If the number of spores is too large to be observed, the aqueous solution, sample or pellet may be diluted with a diluent.
  • a colony obtained by cultivating Bacillus subtilis 168 in LB agar medium at 37 ° C for 24 hours is suspended in the above dilution (10 mM Tris-HCL pH 7.0 aqueous solution), and then solution C and solution D are added. And stained. The result of the fluorescence microscope observation is shown in FIG. When superimposed images were created using the image processing software RS ImageExpress (manufactured by Nippon Roper), vegetative cells and spores were clearly identified.
  • RS ImageExpress manufactured by Nippon Roper
  • the spore detection method of the present invention can rapidly detect only spores by specifically staining spores instead of vegetative cells.
  • the spore inspection is required at the production site, medical site, etc. of foods, pharmaceuticals, cosmetics and the like, and the present invention capable of detecting spores with high accuracy and speed can greatly contribute to various fields.
  • This application is based on Japanese Patent Application No. 2013-191121 (filing date: September 13, 2013) filed in Japan, the contents of which are incorporated in full herein.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

　本発明は、芽胞は染色されるが、栄養細胞は染色されない蛍光染色剤で試料を染色して蛍光観察を行うことを特徴とする芽胞を検出する方法等を提供する。

Description

蛍光染色による芽胞の迅速な検出方法
　本発明は、蛍光染色による芽胞の迅速な検出方法に関する。より詳細には、芽胞は染色されるが、栄養細胞は染色されない蛍光染色剤で試料を染色して蛍光観察を行い、芽胞と栄養細胞とを識別して芽胞のみを迅速に検出する方法等に関する。
　芽胞（spore）とは、一部の細菌が栄養状態や生育環境が悪化すると形成する極めて耐久性の高い細胞構造であり、芯部（コア）、皮層（コルテックス）、皮層を覆う芽胞殻（スポアコート）から構成される。芽胞を形成する細菌は、栄養細胞が生育に適した環境では分裂・増殖する。一方、栄養状態や生育環境が悪化すると、栄養細胞が不等分裂により母細胞と前芽胞を生じ、前芽胞はエンガルフメントが完了するとフォアスポアとなり、フォアスポアが成熟して芽胞になると母細胞の自己溶解により芽胞が細胞外に放出される。芽胞を形成する菌（以下、芽胞菌または芽胞形成菌という）は、クロストリジウム属のボツリヌス菌、ウェルシュ菌、破傷風菌、バチルス属の枯草菌、セレウス菌、炭疽菌等が知られている。芽胞は、熱・紫外線・化学薬品等に対して高い抵抗性を示し、栄養源の枯渇した環境下でも長期間休眠状態を維持できるため、食品、医薬品または化粧品等の危害菌として知られている。
　食品や飲料に対する消費者ニーズが多様化し、さらにグローバル化により海外での工場生産が拡大する現状において、安全性の高い製品を低コストで供給するためには、芽胞に対する製品管理技術の向上が求められている。
　従来、芽胞検出法としては、可視光で観察する芽胞染色法（非特許文献１）や発芽した芽胞を蛍光染色する方法（非特許文献２）等が知られている。例えば、塗抹標本をマラカイトグリーンで染色し芽胞を可視光で観察するWirtz法、塗抹標本をメチレンブルーで染色し芽胞を可視光で観察するMoeller法等である。
　しかし、可視光で観察するためには、十分に培養した上で菌体を加熱固定してから染色することが必要となり、培養装置等も必要な上に、培養時間も必要であるため、当該方法は簡便で迅速な検出法とは言い難い。
　また前記の方法によって検出可能な芽胞は、発芽芽胞に限られ、休眠中の芽胞は細胞膜やＤＮＡが露出していないために蛍光染色剤を浸透させることは困難である上に、芽胞とそれ以外の細胞を肉眼で正確に区別するには熟練を要し、自動計測も困難であるなど、前記の方法は汎用的な方法でもない。
　本発明者らは、芽胞の殺菌処理の効果を確認するために、芽胞を損傷させ、コア内部に存在するＤＮＡを蛍光試薬で染色する方法を開発した（特許文献１）。当該方法は、芽胞菌を培養することなく、各種殺菌処理済の芽胞に対する殺菌若しくは静菌作用を確認することができる優れた方法である。しかし、該方法は芽胞を損傷させる工程等が必要である。
　一方、芽胞を損傷処理させることなくチオフラビンＴにより、蛍光染色させる方法が開示されている（非特許文献３、４）。該方法は、蛍光染色できることにより芽胞を迅速に検出することができる。しかし、これらの従来知られている方法では、芽胞が蛍光染色されるものの、栄養細胞も同時に染色されるために、芽胞と栄養細胞の識別ができず、芽胞のみを検出することができなかった。
　よって、迅速かつ簡便な芽胞検出方法を開発することが望まれている。
特開2013-27379号公報
J Gen Microbiol. 1991. 137:607-613 Cytometry A. 2007. 71:143-153 J Clin Microbiol. 2011. 49:2966-2975 34th Annual International conference of the IEEE EMBS 2012. 2012:499-502
　本発明は、芽胞は染色されるが、栄養細胞は染色されない蛍光染色剤で試料を染色して蛍光観察を行い、芽胞のみを迅速に検出する方法を提供することを課題とする。さらに本発明は、前記蛍光染色剤で芽胞を検出するキット、該染色された芽胞等を提供することを課題とする。
　本発明者らは、上記課題を達成すべく鋭意工夫を重ねた結果、栄養細胞は染色せず、芽胞を特異的に染色可能な蛍光染色剤が存在すること、当該蛍光染色剤を使用すれば、芽胞のみを迅速に検出することができることを見出し、本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本発明は下記［１］～［６］に関するものである。
［１］試料中の芽胞を検出する方法において、芽胞は染色されるが、栄養細胞は染色されない蛍光染色剤で試料を染色して蛍光観察を行うことを特徴とする芽胞を検出する方法。
［２］試料中の芽胞を検出する方法において、芽胞は染色されるが、栄養細胞は染色されない蛍光染色剤で試料を染色し、更に試料を脱色剤で脱色後、蛍光観察を行うことを特徴とする芽胞を検出する方法。
［３］芽胞は染色されるが、栄養細胞は染色されない蛍光染色剤が、アリザリンレッドＳ、オーラミンＯ、オーラミンＳ、硫酸ベルベリン、カルコフロールホワイト、コンゴーレッド、５-ドデカノイルアミノフルオレセイン、エオシンＹ、エリスロシンＢ、エバンスブルー、マラカイトグリーン、ミトトラッカー（商標）グリーンFM、ナイルブルー、パラローズアニリン塩酸塩、フロキシンＢ、6-プロピオニル-2-ジメチルアミノナフタレン、ピロニンＹ、ローズベンガル、スルホローダミン１０１、ユビテックス２Ｂ、キシレノールオレンジおよびそれらの塩または遊離体からなる群の少なくとも１種である［１］または［２］に記載の芽胞を検出する方法。
［４］脱色剤がアルコールである、［２］または［３］に記載の方法。
［５］［１］～［４］のいずれかに記載の蛍光染色剤を含む、芽胞検出キット。
［５－１］［１］～［４］のいずれかに記載の蛍光染色剤および［２］または［４］に記載の脱色剤を含む、芽胞検出キット。
［６］［１］～［４］のいずれかに記載の方法で染色された芽胞。
　本発明の芽胞の検出方法は、栄養細胞は染色せず、芽胞を特異的に染色することで、芽胞のみを迅速に検出することができる。しかも、本発明の方法は、発芽能を有した芽胞をも検出することができる。芽胞検査は食品、医薬品、化粧品等の製造現場や医療現場等において必要とされており、高精度かつ迅速に芽胞を検出することができる本発明は、様々な分野に大きく貢献することができる。
芽胞と栄養細胞との染色の相違を示す顕微鏡画像である。Schaeffer培地またはLB培地で培養した供試菌株にオーラミンＯを加えて検鏡した結果を示す。 芽胞と栄養細胞との染色の相違を示す顕微鏡画像である。LB寒天培地で培養した供試菌株にオーラミンＳを加えて検鏡した結果を示す。 芽胞と栄養細胞との染色の相違を示す顕微鏡画像である。培養した供試菌株にHoechst 33342及びオーラミンＯを加えて検鏡した結果を示す。
　本発明は、芽胞は染色されるが、栄養細胞は染色されない蛍光染色剤で試料を染色して蛍光観察を行い、蛍光が観察された場合に芽胞が試料中に含まれると判定する芽胞の検出方法を提供する。また、当該蛍光染色剤を含む芽胞の検出キット、及び当該蛍光染色剤で染色された芽胞も提供する。
　芽胞菌
　芽胞（spore）とは、一部の細菌が栄養状態や生育環境が悪化すると形成する極めて耐久性の高い細胞構造であり、芯部（コア）、皮層（コルテックス）、皮層を覆う芽胞殻（スポアコート）から構成される。さらに、芽胞殻は、内側から順に芽胞内殻及び芽胞外殻の二層から構成される。芽胞の状態では細菌は新たに分裂することはできず、その代謝も限られており、このような芽胞は休眠細胞と呼ばれる。一方、前記細菌が増殖に適した環境に置かれると、芽胞が発芽して増殖・代謝能を有する菌体が作られる。これを芽胞と対比して、栄養細胞と呼ぶ。
　本発明において対象とする芽胞菌は、芽胞を形成する菌であればよい。具体的には、限定されるわけではないが、バチルス属、クロストリジウム属、スポロラクトバチルス属、ゲオバチルス属、パエニバチルス属、アリシクロバチルス属、サーモアネロバクター属、サーモアネロバクテリウム属、モーレラ属、アリシクロバチルス属、デスルフォトマキュラム属およびリシニバチルス属に属する細菌などが挙げられ、好ましくは、バチルス属、クロストリジウム属、ゲオバチルス属、パエニバチルス属、サーモアネロバクター属、アリシクロバチルス属、モーレラ属に属する細菌などが挙げられる。バチルス属に属する細菌としては、例えば、枯草菌（Bacillus subtilis）、炭疽菌（Bacillus anthracis）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・アトロフィウス（Bacillus atrophaeus）、セレウス菌（Bacillus cereus）、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バチルス・ハロデュランス（Bacillus halodurans）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バチルス・ミコイデス（Bacillus mycoides）、バチルス・シュードミコイデス（Bacillus pseudomycoides）、バチルス・プミリス（Bacillus pumilis）、バチルス・サフェンシス（Bacillus safensis）、バチルス・スファエリクス（Bacillus sphaericus）、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）、バチルス・コアグランス（Bacillus coagulans）、バチルス・コアフイレンシス（Bacillus coahuilensis）等が挙げられるが、これらに限定されない。クロストリジウム属に属する細菌としては、例えば、クロストリジウム・スポロゲネス（Clostridium sporogenes）、ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）、破傷風菌（Clostridium tetani）、クロストリジウム・テルモサッカロリティクム（Clostridium thermosaccharolyticum）等が挙げられるが、これらに限定されない。スポロラクトバチルス属に属する細菌としては、例えば、スポロラクトバチルス・イヌリナス（Sporolactobacillus inulinus）が挙げられるが、これに限定されない。ゲオバチルス属に属する細菌としては、例えば、ゲオバチルス・カウストフィラス（Geobacillus kaustophilus）、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Geobacillus stearothermophilus）が挙げられるが、これに限定されない。パエニバチルス属に属する細菌としては、例えば、パエニバチルス・ポリミキサ（Paenibacillus polymyxa）、パエニバチルス・チアミノリティカス（Paenibacillus thiaminolyticus）が挙げられるが、これに限定されない。アリシクロバチルス属に属する細菌としては、例えば、アリシクロバチルス・アシドテレストリス（Alicyclobacillus acidoterrestris）、アリシクロバチルス・アシドカルダリウス（Alicyclobacillus acidocaldarius）等が挙げられるが、これらに限定されない。サーモアネロバクター属に属する細菌としては、例えば、サーモアネロバクター・マスラニイ（Thermoanaerobacter mathranii）、サーモアネロバクター・アセトエチリカス（Thermoanaerobacter acetoethylicus）、サーモアネロバクター・ブロキイsubsp.ブロキイ（Thermoanaerobacter brockii subsp. brockii）、サーモアネロバクター・ブロキイsubsp.フィンニ（Thermoanaerobacter brockii subsp. finni）、サーモアネロバクター・ブロキイsubsp.ラクチエチリカス（Thermoanaerobacter brockii subsp. lactiethylicus）、サーモアネロバクター・セルロリティカス（Thermoanaerobacter cellulolyticus）、サーモアネロバクター・エタノリカス（Thermoanaerobacter ethanolicus）、サーモアネロバクター・イタリカス（Thermoanaerobacter italicus）、サーモアネロバクター・キブイ（Thermoanaerobacter kivui）、サーモアネロバクター・シデロフィラス（Thermoanaerobacter siderophilus）、サーモアネロバクター・スルフロフィラス（Thermoanaerobacter sulfurophilus）、サーモアネロバクター・サーモコプリエ（Thermoanaerobacter thermocopriae）、サーモアネロバクター・サーモヒドロスルフリカス（Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus）、サーモアネロバクター・ウィエジェリイ（Thermoanaerobacter wiegelii）等が挙げられるが、これらに限定されない。サーモアネロバクテリウム属に属する細菌としては、例えば、サーモアネロバクテリウム・サーモサッカロリティカム（Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum）、サーモアネロバクテリウム・アシジトレランス（Thermoanaerobacterium aciditolerans）、サーモアネロバクテリウム・アオテアロエンス（Thermoanaerobacterium aotearoense）、サーモアネロバクテリウム・ポリサッカロリティカム（Thermoanaerobacterium polysaccharolyticum）、サーモアネロバクテリウム・サッカロリティカム（Thermoanaerobacterium saccharolyticum）、サーモアネロバクテリウム・サーモスルフリゲネス（Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes）、サーモアネロバクテリウム・キシラノリティカム（Thermoanaerobacterium xylanolyticum）、サーモアネロバクテリウム・ゼアエ（Thermoanaerobacterium zeae）等が挙げられるが、これらに限定されない。モーレラ属に属する細菌としては、例えば、モーレラ・サーモアセティカ（Moorella thermoacetica）、モーレラ・グリセリニ（Moorella glycerini）、モーレラ・ムルデリ（Moorella mulderi）、モーレラ・サーモオートトロフィカ（Moorella thermoautotrophica）等が挙げられるが、これらに限定されない。デスルフォトマキュラム属に属する細菌としては、例えば、デスルフォトマキュラム・ニグリフィカンス（Desulfotomaculum nigrificans）、デスルファトマキュラム・サーモアセトキシダンス（Desulfotomaculum thermoacetoxidans）、デスルファトマキュラム・サーモベンゾイカムsubsp.サーモベンゾイカム（Desulfotomaculum thermobenzoicum subsp. thermobenzoicum）、デスルファトマキュラム・サーモベンゾイカムsubsp.サーモシントロフィカム（Desulfotomaculum thermobenzoicum subsp. thermosyntrophicum）、デスルファトマキュラム・サーモシステルナム（Desulfotomaculum thermocisternum）、デスルファトマキュラム・サーモサポボランス（Desulfotomaculum thermosapovorans）、デスルファトマキュラム・サーモサブテラネウム（Desulfotomaculum thermosubterraneum）等が挙げられるが、これらに限定されない。リシニバチルス属に属する細菌としては、例えば、リシニバチルス・スフェリカス（Lysinibacillus sphaericus）等が挙げられるが、これに限定されない。
　本発明は、発芽能を維持した休眠状態の芽胞も対象とすることができる。
　上記芽胞菌は、芽胞の耐熱性の温度を指標に分類することができる。例えば120℃前後が耐熱限度である好熱性グループ（例えば、Clostridium thermosaccharolyticum、Geobacillus stearothermophilus、Moorella thermoacetica、Thermoanaerobacter mathranii等）、100℃前後が耐熱限度である低、中温性グループ（Bacillus subtilis、Clostridium perfringens、Clostridium botulinum等）等とすることができる。さらに、染色パターンの違いを利用してグループ毎に分類することもできる。
　蛍光染色剤
　本発明で使用する蛍光染色剤としては、栄養細胞は染色せず、芽胞のみを特異的に染色するものであればよい。また、前記蛍光染色剤は死細胞に対する染色性が低いことが好ましい。
　具体的には、アリザリンレッドＳ、オーラミンＯ、オーラミンＳ、硫酸ベルベリン、カルコフロールホワイト、コンゴーレッド、５-ドデカノイルアミノフルオレセイン、エオシンＹ、エリスロシンＢ、エバンスブルー、マラカイトグリーン、ミトトラッカー（商標）グリーンFM、ナイルブルー、パラローズアニリン塩酸塩、フロキシンＢ、6-プロピオニル-2-ジメチルアミノナフタレン、ピロニンＹ、ローズベンガル、スルホローダミン１０１、ユビテックス２Ｂまたはキシレノールオレンジ等が挙げられる。好ましくは、アリザリンレッドＳ、オーラミンＯ、オーラミンＳ、カルコフロールホワイト、コンゴーレッド、エオシンＹ、エリスロシンＢ、エバンスブルー、ナイルブルー、パラローズアニリン塩酸塩、フロキシンＢ、ローズベンガル、スルホローダミン１０１、ユビテックス２Ｂまたはキシレノールオレンジであり、より好ましくはオーラミンＯ、オーラミンＳ、コンゴーレッド、ナイルブルー、フロキシンＢ、ローズベンガル、スルホローダミン１０１またはユビテックス２Ｂである。
　また、本発明で使用する蛍光染色剤は、栄養細胞は染色せず、芽胞のみを特異的に染色するという特性が維持される限り、それらの塩または遊離体であってもよい。塩としては、酸(例:無機酸、有機酸) との塩や塩基(例:アルカリ金属、アルカリ土類金属など)との塩が挙げられる。無機酸との塩としては、例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸などとの塩が挙げられ、有機酸との塩としては、例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸などとの塩が挙げられる。また、遊離体である場合には、該遊離体を公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩として得られた場合には、該塩を公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
　また、前記蛍光染色剤を複数（２種以上）組み合わせて使用することもできる。組み合わせとしては、例えば、オーラミンＯまたはオーラミンＳとコンゴーレッド、オーラミンＯまたはオーラミンＳとナイルブルー、オーラミンＯまたはオーラミンＳとフロキシンＢ、オーラミンＯまたはオーラミンＳとスルホローダミン１０１、オーラミンＯまたはオーラミンＳとユビテックス２Ｂ等が挙げられるが、これらに限定されない。
　また、芽胞の生理状態（分裂可能な状態か休眠状態か、あるいは、死菌か生菌か、等）を識別することは実用上重要であるため、上記蛍光染色剤を、例えば、本発明者らの開発した特許文献１に記載の方法、すなわち、芽胞の加熱・薬剤処理といった殺菌処理により芽胞内部への蛍光染色試薬の浸透性が増すことを利用した芽胞形成細菌の芽胞の殺菌もしくは静菌作用を評価するための方法等に適用することもできる。
　さらに、上記蛍光染色剤で染色された芽胞は、飲料、食品、医薬品、化粧品等様々な製品や水質検査等における各種芽胞検査における指標（コントロール）として用いることができる。あるいは、本発明で染色された芽胞を利用して、芽胞の数または濃度を検出することもできる。
　試料
　本発明が対象とする試料は、食品、飲料、医薬品（医療用医薬品、一般医薬品、または医薬部外品）、使い捨て医療用器具、化粧品等が挙げられるが、これらに限定されない。
　食品としては、例えば、米類、パン類、麺類、缶詰類、スパイス、弁当類、惣菜食品、乳製品、和洋菓子（冷蔵品、冷凍品も含む）、調味料、栄養補助食品（サプリメント等）、食肉加工品（ハム、ソーセージ、ベーコン等）、水産加工品（練り製品等）等を挙げることができるが、これらに限定されない。
　飲料としては、例えば、各種清涼飲料水（アルコール分を含まない（アルコール分1％未満）飲用の液体物で、味や香りがある飲料水）、アルコール飲料等が挙げられるが、これらに限定されない。
　より具体的には、各種清涼飲料水としては、コーヒー飲料（コーヒー：生豆換算で、内容量100g中コーヒー豆を5g以上使用したもの、コーヒー飲料：生豆換算で、内容量100g中コーヒー豆を2.5g以上5g未満使用したもの、コーヒー入り清涼飲料：生豆換算で、内容量100g中コーヒー豆を1g以上2.5g未満使用したもの）、炭酸飲料（炭酸水－ソーダ水、コーラ炭酸飲料、透明炭酸飲料、果汁入り炭酸飲料、果実着色炭酸飲料、乳類入り炭酸飲料、栄養ドリンク炭酸飲料等）、果実飲料（天然果汁、果汁飲料、果肉飲料、果汁入り混合飲料、果汁入り炭酸飲料、果汁系ニアウォーター、エード、フルーツシロップ等）、茶系飲料（ウーロン茶飲料、紅茶飲料、緑茶飲料、むぎ茶飲料、ブレンド茶飲料等）、ミネラルウォーター、豆乳類、野菜飲料（トマトジュース、人参ジュース、野菜ジュース）、スポーツ飲料、その他（ドリンクスープ、ぜんざいドリンク、汁粉ドリンク、甘酒、ゼリー飲料、味噌汁等）、牛乳、乳飲料等が挙げられるが、これらに限定されない。
　アルコール飲料としては、ビール、ワイン、酎ハイ、リキュール、清酒、焼酎、ブランデー、ウィスキー等が挙げられるが、これらに限定されない。
　また、食品や飲料が含まれる形態としては、缶、瓶、ペットボトル、トレー、パウチ等が挙げられるが、これらに限定されない。
　医薬品としては、通常の錠剤、散剤、カプセル剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤等が挙げられるが、これらに限定されない。
　使い捨て医療用器具としては、注射器、注射針、コンタクトレンズ等が挙げられるが、これらに限定されない。
　化粧品としては、化粧水、乳液、クレンジング、ファンデーション、アイライナー、アイシャドー、マスカラ、フェイスパウダー、頬紅、口紅、マニキュア等が挙げられるが、これらに限定されない。
　染色と観察
　本発明の染色方法は、常法の細胞蛍光染色で行うことができる。例えば、蛍光染色剤を、原液あるいは希釈して試料と混合し、終濃度0.0001～0.01%(W/V)(好ましくは0.001～0.01%(W/V))で数分～数時間染色させた後、試料を洗浄、脱色して顕微鏡観察を行う。その際の染色時間は、温度、染色具合等を考慮し、適宜調整することができる。温度は、芽胞が蛍光染色されるものであれば特に制限されないが、例えば、０～１００℃、より好ましくは１５～３０℃が挙げられる。
　洗浄は、栄養細胞や試料中に食品片等由来により混在する夾雑物に付着した蛍光染色剤を効率的に除去するため、染色工程後に洗浄し、１～数回（２～４回）脱色剤で行うことが好ましい。その際の洗浄は、トリス塩酸緩衝液（例Tris HCl pH7.6）、リン酸緩衝液等の緩衝液及びこれらの組み合わせにより行うことができる。洗浄の際のpHは栄養細胞や夾雑物に付着した蛍光染色剤を除去するものであれば特に制限されず、例えば、pH４～１０、より好ましくはpH６～８が挙げられる。
　脱色剤は、栄養細胞や夾雑物に付着した蛍光染色剤を除去するものであれば特に制限されず、例えば、アルコール（例えば、エタノール、イソプロパノール等の低級アルコール）が挙げられる。好ましくはエタノール、より好ましくは70%エタノールである。脱色剤は、試料や蛍光染色剤に合わせて適宜選択することができる。より確実に栄養細胞に付着した蛍光染色剤を効率的に除去するためには、少なくとも１回はアルコール（例えば、70%エタノール）で洗浄することがより好ましい。
　蛍光顕微鏡観察は、蛍光観察装置、対物レンズ、カメラアダプタレンズ、CCDカメラ等を装着した光学顕微鏡により行うことができる。また、蛍光染色された芽胞は、フローサイトメーター、バイオプローラ（登録商標）等の自動計測機器を用いることにより、自動で数量を確認することもできる。
　さらに、芽胞の染色性を高めるためには、染色時に加熱処理、または界面活性剤処理等を行ってもよい。芽胞の染色性を高めるものであれば、特に制限されないが、加熱温度としては、例えば、４０～１００℃、より好ましくは６５～８０℃、界面活性剤としては、例えば、Triton X-100、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、Tween 80が挙げられるが、より好ましくはTriton X-100である。これらの処理は組み合わせて行ってもよい。また本発明の検査対象とする試料によっては、予め酵素処理、界面活性剤処理、キレート剤処理、濃縮洗浄処理等を行ってもよい。
　上記試料の試料調製、蛍光染色、洗浄、顕微鏡観察などの一連の工程を自動化させて行うこともできる。
　キット
　本発明は、上記蛍光染色剤を含む芽胞検出キットを提供する。
　また一態様として、キットには蛍光染色剤とともに、脱色剤、希釈液、使用説明書等を含むことができる。
　以下、本発明を実施例及び参考例によって具体的に説明する。なお、これらの実施例等は、本発明を説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
　［実施例１］
　各種蛍光試薬のBacillus subtilis 168 trpC2株に対する芽胞と栄養細胞の識別性について
　（供試菌株）
　Bacillus subtilis 168 trpC2を供試菌株として用いた。
　（菌液の調製）
　培地はLB培地とSchaeffer培地を用いた。栄養細胞はL-brothで37℃、6時間培養したものを遠心回収し、10mM Tris HCl pH7.6で洗浄してから37℃で1時間染色した。芽胞はLB培地で一晩培養した細胞をSchaeffer液体培地に1%植菌し、37℃、24時間培養して得た。芽胞サンプルはSchaeffer培地中で染色するか、遠心回収してから10mM Tris HCl pH7.6で2回洗浄後、10mM Tris HCl pH7.6緩衝液中37℃で1時間染色した。また、オーラミンＳの染色性を評価する場合は、LB寒天培地にBacillus subtilis 168 trpC2株を植菌し、37℃で24時間培養した後、細胞を回収してオーラミンＳ染色液に懸濁し５分間染色した。
　（蛍光試薬染色と洗浄処理）
　使用した蛍光染色剤とそれらの製造・販売元を表１に示す。粉末状の蛍光染色剤は、濃度　0.1%または1mMとなるよう精製水またはDMSOに溶解し、保存溶液とした。液状の蛍光染色剤はそのまま保存溶液として用いた。これらの保存溶液を直接培地に加えるか、10mM Tris HCl pH7.6（オーラミンＳの場合、10mM Tris HCl pH7.0）で希釈してから染色に用いた。各種蛍光染色剤の使用濃度も表１に示す。染色後の細胞は、１）無洗浄のまま、２）10mM Tris HCl pH7.6で2回洗浄後、３）70%エタノール水溶液による脱色と10mM Tris HCl pH7.6による洗浄を交互に2回繰り返した後、それぞれ検鏡した。
　（蛍光顕微鏡条件）
　顕微鏡観察にはOLYMPUS社製の位相差装置付蛍光顕微鏡BX51を用いた。対物レンズは×100オイルレンズを用いた。CCDカメラは日本ローパー社のCoolSNAP ESを用いた。蛍光観察時にはOLYMPUS社製の蛍光ミラーユニットU-MNUA2（NUA）、U-MGFPHQ（GFP）、U-MRFPHQ（RFP）、HcRed（特注品）を用いた。
　HcRed（特注品）はオリンパス社の空キューブ（フィルター未装着品）に、OMEGA OPTICAL社製のフィルターセットXF102-2を組み込んで用いた。フィルターセットXF102-2は励起フィルターと吸収フィルターで構成されており、励起フィルターは540-590nmの波長の光を透過し、吸収フィルターは610-700nmの波長の光を透過する。
　それぞれの蛍光染色剤に対して使用した蛍光ミラーユニットを表１に示す。露光時間は、減光フィルターを用いない状態で枯草菌の無染色芽胞からバックグランド蛍光が観察されない条件に設定した（最長１～２秒）。染色した細胞の蛍光が強すぎて露光過剰になる場合は、5%または25%減光フィルターを用いて露光調整した。位相差顕微鏡観察像及び蛍光顕微鏡観察像はCCDカメラで撮影し、画像処理ソフトRS ImageExpress（日本ローパー社製）を用いて重ね合わせ画像を作成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　（結果１）
　結果一覧を表２に示す。各種蛍光染色剤で染色した後、洗浄・脱色を行わなかったサンプル、10mM Tris HClで洗浄したサンプル、および70％エタノールで脱色したサンプルについて、それぞれ適切なフィルターキューブユニットを用いて蛍光顕微鏡観察し、結果をCCDカメラで撮影した。得られた画像について、（ａ）細胞が存在しない任意の場所における平均的な蛍光の値と、（ｂ）栄養細胞、あるいは（ｃ）芽胞における蛍光の最大値を、Image Express（ローパー社製ソフトウェア）を用いて測定した。ｂ÷ａ＝栄養細胞の染色指数として、ｃ÷ａ＝芽胞の染色指数として表し、染色指数が大きいほど染色性が良いと判断した。本実施例では、目視による染色の識別が可能な値として、蛍光指数2.5未満では目視により染色が確認できないため、蛍光指数2.5以上を染色性有りとした。なお、（＊）は、損傷した栄養細胞または死細胞に対する染色性が生細胞に比べて増大したことを示す。ここで、染色性の増大とは、細胞の損傷または死滅によって、細胞の蛍光染色剤の排出機能が低下または喪失し、蛍光染色剤が細胞内に蓄積しやすくなり、結果として損傷した栄養細胞または死細胞の発する蛍光が増大することをいう。
　各種蛍光染色剤の染色性の違いについて、以下の（×）～（◎）の条件で検討した。
　染色後、洗浄又はエタノール脱色を行わないサンプルについて、芽胞の染色指数が2.5未満または栄養細胞に対する染色指数が2.5以上の場合、芽胞特異的染色の適性なしとみなし、総合判定を（×）とした。
　染色後、洗浄又はエタノール脱色を行わないサンプルについて、芽胞の染色指数が2.5以上、栄養細胞に対する染色指数が2.5未満の場合、限定された条件で芽胞特異的染色の適性ありとみなし、総合判定を（△）とした。
　染色後、10mM Tris HClで水洗したサンプルについて、芽胞の染色指数が2.5以上、栄養細胞に対する染色指数が2.5未満の場合、検査対象物の種類や染色方法によっては芽胞特異的染色の適性ありとみなし、総合判定を（○）とした。
　染色後、70%エタノールで脱色したサンプルについて、芽胞の染色指数が2.5以上、栄養細胞に対する染色指数が2.5未満の場合、多様な検査対象物に対して芽胞特異的染色の適性ありとみなし、総合判定を（◎）とした。
　なお、損傷細胞や死細胞に対する染色性の増大が認められた蛍光染色剤について、使用条件により芽胞検出の実用性を損なう可能性があるものは、それぞれ等級を下げて、（◎）を（○）に、（○）を（△）に、（△）を（×）とした。
　なお、カルコフロールホワイトについては、成熟芽胞に対する染色性が低かったが、形成途中の芽胞を強く染めたことから、使用条件によっては有効と判断し、（○）とした。
　42種類の蛍光染色剤のうち、オーラミンＯ（Auramine O）、オーラミンＳ（Auramine S）、コンゴーレッド（Congo Red）、ナイルブルー（Nile blue (Basic Blue 12)）、フロキシンＢ（Phloxine B）、ローズベンガル（Rose Bengal）、スルホローダミン101（Sulforodamine 101）およびユビテックス２Ｂ（Uvitex 2B）の８種に関しては、芽胞と強い親和性を示し、かつ栄養細胞に染色性を示さず、最も適した染色剤であった（◎）。
　アリザリンレッドS（Alizarin Red S）、カルコフロールホワイト（Calcofluo White）、エオシンＹ（Eosin Y）、エリスロシンＢ（Erythrosine B）、エバンスブルー（Evans Blue）、パラローズアニリン塩酸塩（Pararosaniline Hydrochloride (Fuchsine)）、キシレノールオレンジ（Xylenol Orange）の７種に関しては、70%エタノールで芽胞は脱色されるが、10mM Tris HClの洗浄では脱色されず、芽胞への親和性は中程度あり、かつ栄養細胞に染色性を示さなかった（○）。
　硫酸ベルベリン（Berberine Sulfate Hydrate）、5-ドデカノイルアミノフルオレセイン（5-dodecanoylaminofluorecein）、マラカイトグリーン（Malachite Green）、ミトトラッカー（商標）グリーン FM（Mito TrackerTM Green FM）、6-プロピオニル-2-ジメチルアミノナフタレン(6-propionyl-2-dimethylaminonaphthalene (prodan))、ピロニンＹ（Pyronin Y）の６種に関しては、芽胞と栄養細胞の染色性において、芽胞の方がやや親和性が高く、極限られた条件によっては、芽胞の識別が可能と考えられた（△）。
　特定の蛍光染色剤が栄養細胞は染色せず、芽胞に対し特異的に染色する理由については以下と考えられる。
　芽胞の構造は電子顕微鏡観察などによって明らかにされており、主な芽胞特異的構造体としてコルテックスとスポアコートが知られている。上記蛍光染色剤は、これらの構造体全体または構造体に含まれる特定の物質に対する親和性が高く、栄養細胞または死細胞に対する親和性が低いと考えられた。枯草菌においては、コルテックスやスポアコートの形成異常を生じる変異株が知られており、これらの変異芽胞に対する染色性の違いを基に、各種蛍光染色剤の染色部位を確認した。例えば、カルコフロールホワイトはコルテックス欠損芽胞において染色性が低下し、オーラミンＯ、コンゴーレッド、スルホローダミン101などはスポアコート欠損芽胞において染色性が低下した。
　カルコフロールホワイトは真菌の細胞壁に含まれる多糖に親和性を示すことから、真菌の検出用に用いられる。一方、芽胞のコルテックスにもペプチドグリカンなどの多糖が含まれており、それがカルコフロールホワイトによって染色されると考えられた。カルコフロールホワイト以外の蛍光染色剤であっても、コルテックス特異的な成分に親和性を示すものは芽胞染色に適用できる。ただし、スポアコートの存在によりコルテックス内への高分子の浸透性が制限されるため、コルテックス特異的な蛍光染色剤はスポアコートが未発達な芽胞か、スポアコートが損傷した芽胞の染色に限定される。ユビテックスB2も真菌の細胞壁に含まれる多糖に結合するため真菌検出に用いられる。ユビテックスB2はカルコフロールホワイトと異なり、スポアコートの欠損変異芽胞において染色性が低下した。スポアコートはタンパク質、糖質、脂質など多様な物質を含む多層構造体である。ユビテックスB2はスポアコート特異的な多糖を染色すると考えられた。
　芽胞のスポアコートを構成するタンパク質、糖質、脂質や、スポアコートに集積する金属イオンのいずれかに親和性を示す蛍光染色剤は、芽胞染色に適応可能と考えられる。オーラミンとナイルブルーは１つのNH2基を、パラローズアニリンは３つのNH2基を持つ塩基性染色剤である。これらはスポアコートの酸性成分に親和性を示すと考えられる。実際、ナイルブルーからNH2基が失われたナイルレッドでは、芽胞に対する染色特異性が低下したことから、芽胞染色におけるNH2基の重要性が示唆された。アリザリンレッドSは１つのSO3Na基を、スルホローダミン101は２つのSO3H基を、キシレノールオレンジは４つのCOOH基を持つ染色剤である。これらはスポアコートの塩基性成分に親和性を示すと考えられる。コンゴーレッドはSO3Na基とNH2基を２つずつ持ち、エバンスブルーは２つのNH2基と４つのSO3基を持つ染色剤である。これらはスポアコートの酸性・塩基性成分の両方に親和性を示す可能性がある。フロキシンBとローズベンガルはClと、BrまたはIを、エリスロシンはIを含む蛍光染色剤である。これらのハロゲンを含む蛍光染色剤の染色対象物質については不明であるが、芽胞の何らかの成分に対して親和性を示すと推定される。
　参考として、最も染色適正の高いオーラミンＯに関して蛍光顕微鏡写真を図１に示す。Schaeffer培地で培養して得た枯草菌の芽胞は位相差顕微鏡で白く見え、オーラミンＯで染色した芽胞は蛍光顕微鏡で緑色蛍光を示した。一方、LB培地で培養して得た枯草菌の栄養細胞は位相差顕微鏡観察で黒く見え、蛍光顕微鏡観察で栄養細胞は緑色蛍光を示さなかった。また、オーラミンSに関して蛍光顕微鏡写真を図２に示す。蛍光顕微鏡下で青色光を照射したところ、芽胞周辺部に緑色蛍光が観察された。また、栄養細胞はほとんど染色されなかった。この結果はオーラミンＯを用いた染色とほぼ同じであった。染色していない芽胞では同じ条件で緑色蛍光が観察されなかった。このように、○～◎の１５種の試薬を用いれば、迅速、簡便に芽胞特異的染色が可能である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　［実施例２］
　各種芽胞菌に対するオーラミンＯの芽胞染色性について
（供試菌株）
　表３に示す供試菌株を使用した。食品や飲料中で問題となる芽胞菌24菌種、28株を用いた。
　（芽胞の調製と精製）
　芽胞の調製は、それぞれの菌株に適した芽胞形成培地を用いた。芽胞形成培地と精製法は、スポア実験マニュアル（技報堂出版、1995年）に従った。
　（染色と顕微鏡観察）
　実施例１の方法に従い、染色と顕微鏡観察を行った。
　（結果２）
　（オーラミンＯの芽胞染色剤適応菌種について）
　芽胞への親和性が極めて高く、栄養細胞への親和性の低かったオーラミンＯに関して、食品や飲料中で問題となる各種芽胞菌24菌種、28株について、芽胞が染色されるか確認した。結果も表３に示す。すべての菌株で芽胞を染色することが確認でき、芽胞染色剤として、ユニバーサルな効果があることが確認できた。また、28株に全て対して、栄養細胞には染色性を示さなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
　［実施例３］
　各種芽胞菌に対するコンゴ―レッドおよびナイルブルーの芽胞染色性について
（供試菌株）
　表４に示す供試菌株を使用した。
　（芽胞の調製）
　芽胞の調製は、上記の供試菌株を寒天培地に植菌し（表４）、30℃で２日間または４日間培養することで行った。
　（染色と顕微鏡観察）
　実施例１の方法に従い、染色と顕微鏡観察を行った。
　（結果３）
　（コンゴ―レッドおよびナイルブルーの芽胞染色剤適応菌種について）
　どちらの蛍光染色剤も枯草菌（Bacillus subtilis 168）の芽胞に対する染色性は良好であったが、他の菌種の芽胞に対しては染色性・特異性がやや劣る結果となった（表４）。コンゴーレッドはB. sphaericus NBRC 3526を除いた成熟芽胞（72時間サンプル）に対して良好な染色性を示した。一方、ナイルブルーはコンゴーレッドと異なる染色性を示した。以上の結果から、コンゴーレッドおよびナイルブルーは特定菌種の芽胞を検出・同定するために単独または組み合わせることにより、有効に用いることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
　［実施例４］
　芽胞検出キット
　芽胞の検出や数量計測に用いるための芽胞検出キットとして、以下の組み合わせのキットを作成した。
溶液Ａ（1％ オーラミンＯ DMSO溶液）
溶液Ｂ（0.01％ オーラミンＯ、10mM Tris-HCL pH7.0水溶液）
希釈液（10mM Tris-HCL pH7.0水溶液）
　芽胞を含む水溶液を検査する場合は、溶液Ａを1/100量加えて懸濁し、室温で５分放置してから蛍光顕微鏡などで観察する。染色芽胞は青色光を照射すると緑色蛍光を発する。
　粒子状のサンプルまたは遠心分離によって得られた菌体のペレットを検査する場合は、溶液Ｂを適量加えて懸濁し、室温で５分放置してから蛍光顕微鏡などで観察する。染色芽胞は青色光を照射すると緑色蛍光を発する。芽胞数が多すぎて観察しにくい場合は、希釈液を用いて水溶液、サンプルまたはペレットを希釈すればよい。
　芽胞および栄養細胞検出キット
　芽胞及び栄養細胞を別々に検出する場合や、芽胞と栄養細胞の数量計測に用いるための芽胞検出キットとして、以下の組み合わせのキットを作成した。
溶液Ｃ（1％ オーラミンＯ DMSO溶液）
溶液Ｄ（1％ ヘキスト33342水溶液）
溶液Ｅ（0.01％ オーラミンＯ、0.01％ ヘキスト33342、10mM Tris-HCL pH7.0水溶液）
希釈液（10mM Tris-HCL pH7.0水溶液）
　芽胞を含む水溶液を検査する場合は、溶液ＣとＤをそれぞれ1/100量ずつ加えて懸濁し、室温で５分放置してから蛍光顕微鏡などで観察する。細菌の栄養細胞はDNAが染色されて紫外線を照射すると青色蛍光を、染色芽胞は青色光を照射すると緑色蛍光を発する。
　粒子状のサンプルまたは遠心分離によって得られた菌体のペレットを検査する場合は、溶液Ｅを適量加えて懸濁し、室温で５分放置してから蛍光顕微鏡などで観察する。細菌の栄養細胞はDNAが染色されて紫外線を照射すると青色蛍光を、染色芽胞は青色光を照射すると緑色蛍光を発する。芽胞数が多すぎて観察しにくい場合は、希釈液を用いて水溶液、サンプルまたはペレットを希釈すればよい。
　枯草菌（Bacillus subtilis 168）をLB寒天培地で37℃、24時間培養して得られたコロニーを、上記希釈液（10mM Tris-HCL pH7.0水溶液）に懸濁し、溶液Ｃ及び溶液Ｄを加えて染色した。蛍光顕微鏡観察の結果を図３に示す。画像処理ソフトRS ImageExpress（日本ローパー社製）を用いて重ね合わせ画像を作成したところ、栄養細胞と芽胞が明確に識別された。
　本発明を好ましい態様を強調して説明してきたが、好ましい態様が変更され得ることは当業者にとって自明である。
　ここで述べられた特許及び特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
　本発明の芽胞の検出方法は、栄養細胞ではなく芽胞を特異的に染色することで、芽胞のみを迅速に検出することができる。芽胞検査は食品、医薬品、化粧品等の製造現場や医療現場等において必要とされており、高精度かつ迅速に芽胞を検出することができる本発明は、様々な分野に大きく貢献することができる。
　本出願は、日本で出願された特願２０１３－１９１１２１（出願日：平成２５年９月１３日）を基礎としており、その内容はすべて本明細書に包含されるものとする。

Claims (6)

  1. 　試料中の芽胞を検出する方法において、芽胞は染色されるが、栄養細胞は染色されない蛍光染色剤で試料を染色して蛍光観察を行うことを特徴とする芽胞を検出する方法。
  2. 　試料中の芽胞を検出する方法において、芽胞は染色されるが、栄養細胞は染色されない蛍光染色剤で試料を染色し、更に試料を脱色剤で脱色後、蛍光観察を行うことを特徴とする芽胞を検出する方法。
  3. 　芽胞は染色されるが、栄養細胞は染色されない蛍光染色剤が、アリザリンレッドＳ、オーラミンＯ、オーラミンＳ、硫酸ベルベリン、カルコフロールホワイト、コンゴーレッド、５-ドデカノイルアミノフルオレセイン、エオシンＹ、エリスロシンＢ、エバンスブルー、マラカイトグリーン、ミトトラッカー（商標）グリーンFM、ナイルブルー、パラローズアニリン塩酸塩、フロキシンＢ、6-プロピオニル-2-ジメチルアミノナフタレン、ピロニンＹ、ローズベンガル、スルホローダミン１０１、ユビテックス２Ｂ、キシレノールオレンジおよびそれらの塩または遊離体からなる群の少なくとも１種である、請求項１または２に記載の芽胞を検出する方法。
  4. 　脱色剤がアルコールである、請求項２または３に記載の芽胞を検出する方法。
  5. 　請求項１～４のいずれか１項に記載の蛍光染色剤を含む、芽胞検出キット。
  6. 　請求項１～４のいずれか１項に記載の方法で染色された芽胞。
PCT/JP2014/073792 2013-09-13 2014-09-09 蛍光染色による芽胞の迅速な検出方法 WO2015037578A1 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2015536581A JPWO2015037578A1 (ja) 2013-09-13 2014-09-09 蛍光染色による芽胞の迅速な検出方法

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2013191121 2013-09-13
JP2013-191121 2013-09-13

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2015037578A1 true WO2015037578A1 (ja) 2015-03-19

Family

ID=52665681

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2014/073792 WO2015037578A1 (ja) 2013-09-13 2014-09-09 蛍光染色による芽胞の迅速な検出方法

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JPWO2015037578A1 (ja)
WO (1) WO2015037578A1 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110487615A (zh) * 2019-08-29 2019-11-22 沈阳农业大学 一种鉴定十子花科植物根肿病的复合荧光染色方法
CN116296703A (zh) * 2023-05-17 2023-06-23 广州盛安医学检验有限公司 一种用于检测的荧光染色液

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000210099A (ja) * 1999-01-22 2000-08-02 Mitsubishi Electric Corp 微生物の計測方法
JP2011239749A (ja) * 2010-05-20 2011-12-01 Josho Gakuen 芽胞表面抗原タンパク質と抗体の特異的反応を利用した芽胞の検出法と同定法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000210099A (ja) * 1999-01-22 2000-08-02 Mitsubishi Electric Corp 微生物の計測方法
JP2011239749A (ja) * 2010-05-20 2011-12-01 Josho Gakuen 芽胞表面抗原タンパク質と抗体の特異的反応を利用した芽胞の検出法と同定法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ARSECULERATNE S. N. ET AL.: "The assessment of the viability of the endospores of Rhinosporidium seeberi with MTT (3-[4,5- dimethyl-2-thiazolyl]-2, 5-diphenyl-2H- tetrazolium bromide", MYCOLOGICAL RESEARCH, vol. 108, no. 12, 2004, pages 1423 - 1430, XP022443488, DOI: doi:10.1017/S0953756204001595 *
DHOLPURIA S.: "Production and Purification of alkali stable xylanase from Bacillus sp.", INT. J. CURR. MICROBIOL. APP. SCI, vol. 3, no. 3, March 2014 (2014-03-01), pages 365 - 377 *
SCHAEFFER A. B. ET AL.: "SCIENTIFIC APPARATUS AND LABORATORY METHODS, A SIMPLIFIED METHOD OF STAINING ENDOSPORES", SCIENCE, vol. 77, 1933, pages 194 *
STRUGGER S.: "Der gegenwartige stand der forschung auf dem gebiet der fluoreszenzmikroskopischen untersuchung der BAKTERIEN", MIKROSKOPIE, vol. 3, no. 1-2, 1948, pages 23 - 38 *
TERUO ITOI ET AL.: "Fushin Hakushoku Funmatsu kara no Saikin Kenshutsu no Tameno Gram Senshoku, Gaho Senshoku Kensaho no Yuyosei", REPORTS OF NATIONAL RESEARCH INSTITUTE OF POLICE SCIENCE , RESEARCH ON FORENSIC SCIENCE, vol. 56, no. 1, 2006, pages 13 - 18 *
YONEMOTO Y. ET AL.: "Resistance of Yeast and Bacterial Spores to High Voltage Electric Pulses", JOURNAL OF FERMENTATION AND BIOENGINEERING, vol. 75, no. 2, 1993, pages 99 - 102, XP025752800, DOI: doi:10.1016/0922-338X(93)90217-V *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110487615A (zh) * 2019-08-29 2019-11-22 沈阳农业大学 一种鉴定十子花科植物根肿病的复合荧光染色方法
CN110487615B (zh) * 2019-08-29 2022-05-17 沈阳农业大学 一种鉴定十字花科植物根肿病的复合荧光染色方法
CN116296703A (zh) * 2023-05-17 2023-06-23 广州盛安医学检验有限公司 一种用于检测的荧光染色液
CN116296703B (zh) * 2023-05-17 2023-07-28 广州盛安医学检验有限公司 一种荧光染色液在制备阴道炎检测试剂中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2015037578A1 (ja) 2017-03-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Rasmussen et al. Optical tweezers cause physiological damage to Escherichia coli and Listeria bacteria
CA2500464C (fr) Procede de detection et de comptage de microorganismes dans un echantillon
Doherty et al. Use of viability staining in combination with flow cytometry for rapid viability assessment of Lactobacillus rhamnosus GG in complex protein matrices
Nicolo et al. Viable but nonculturable state of foodborne pathogens in grapefruit juice: a study of laboratory
US20080305514A1 (en) Method for detecting microbes
Bridier et al. Fluorescence-based tools for single-cell approaches in food microbiology
JP7007298B2 (ja) デジタル微生物学
Wallace et al. Culturing mycobacteria
US20140342386A1 (en) Method for measuring cells, and reagent for cell measurement
Dart Microbiology for the analytical chemist
CN101970682B (zh) 检测和/或鉴别艰难梭状芽孢杆菌的方法
Ríos-Castillo et al. Detection of Salmonella Typhimurium and Listeria monocytogenes biofilm cells exposed to different drying and pre-enrichment times using conventional and rapid methods
WO2015037578A1 (ja) 蛍光染色による芽胞の迅速な検出方法
EP2478112B1 (fr) Procede d'identification de bacteries du groupe bacillus cereus
WO2019010647A1 (en) RAPID APPROACH FOR THE DETECTION OF BACTERIAL SPORES
CN102725418B (zh) 联用荧光底物和pH-敏感性荧光团用于荧光法检测微生物的生长培养基
NL1030525C2 (nl) Werkwijze voor het met luminescentie detecteren van ATP in een monster en een computerprogramma daarvoor.
EP3714897B1 (en) Artificial sputum, method of producing an artificial sputum
EP2981619A1 (fr) Utilisation d'au moins un substrat de phosphatase chromogène et/ou fluorogène pour la détection et/ou le dénombrement d'entérobactéries dans un échantillon
Ogodo et al. Principles of applied microbiology and biotechnology: Technique for the screening of antimicrobial herbs
Shinozaki et al. Rapid detection of bacteria in green tea using a novel pretreatment method in a bioluminescence assay
Tebaldi et al. Detection of Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli in bean seeds by flow cytometry, immunostaining and direct viable counting
Singh Microbial assay techniques
JP6153461B2 (ja) 微生物の回収方法
Sundaresan et al. Elucidating bacterial spore dynamics through lanthanide-enhanced live imaging

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 14844836

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

DPE2 Request for preliminary examination filed before expiration of 19th month from priority date (pct application filed from 20040101)
ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2015536581

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 14844836

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1